Генетические характеристики катакомбных захоронений Бронзового века (XXV-XXIII в до н.э.)

Ольга Арамова

Генетические характеристики катакомбных захоронений Бронзового века (XXV-XXIII в до н.э.)

Данная работа посвящена выявлению особенностей STR-маркеров аутосомной ДНК и Y-хромосомы, а также их популяционных характеристик у скелетов из наиболее монолитных в культурно-хронологическом отношении курганных групп Ергенинской возвышенности эпохи ранней бронзы. Работа была проведена на фрагментах скелетов 22 людей эпохи ранней бронзы. Была разработана и апробирована методика выделения аутентичной древней ДНК в условиях повышенной вероятности загрязнения древнего костного материала современной ДНК, позволяющая избавиться от чужеродного ДНК-содержащего биологического материала в составе клеток за счет дополнительного разрушения мембран, что позволяет получать достоверные результаты молекулярно-генетического исследования. Анализ частот генотипов исследуемой древней микропопуляции и современных популяций свидетельствует о том, что носители восточно- маныческой катакомбной культуры эпохи ранней бронзы, могли мигрировать на территорию современной Европы и Азии и являться одними из предков современных носителей европейской и азиатской популяции. Это доказывает и тот факт, что костные останки мужчин, исследованных в работе, предположительно имеют гаплогруппу R1b, современная концентрация которой максимальна на территориях Западной Европы.

Биология

Дипломы

Вуз: Южный федеральный университет (ЮФУ)

ID: 5f2bd2dfcd3d3e0001b410a3

UUID: 7872c640-b9f8-0138-1285-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: больше 2 лет назад

Просмотры: 990

30.6

Ольга Арамова

Южный федеральный университет (ЮФУ)

Комментировать 15

Рецензировать 0

Скачать - 1,8 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Южный федеральный университет» Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского кафедра генетики Арамова Ольга Юрьевна ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАТАКОМБНЫХ ЗАХОРОНЕНИЙ БРОНЗОВОГО ВЕКА (XXV-XXIII ВВ. ДО Н.Э.) ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА по направлению 06.04.01 Биология Научный руководитель Профессор кафедры биохимии и микробиологии Академии биологии и биотехнологии Д.И. Ивановского, д.б.н. Корниенко Игорь Валериевич Рецензент ведущий научный сотрудник Южного научного центра Российской академии наук, к.б.н. Титов Вадим Владимирович Ростов-на-Дону – 2020

РЕФЕРАТ Объем работы – 106 страниц, 12 рисунков, 12 таблиц, 91 использованный источник. ДРЕВНЯЯ ДНК, КОНТАМИННАЦИЯ, АУТОСОМНЫЕ STR- МАРКЕРЫ, STR-МАРКЕРЫ Y ХРОМОСОМЫ, МИКРОПОПУЛЯЦИЯ ЭПОХИ БРОНЗЫ Цель работы – выявление особенностей STR-маркеров аутосомной ДНК и Y-хромосомы, а также их популяционных характеристик у скелетов из наиболее монолитных в культурно-хронологическом отношении курганных групп Ергенинской возвышенности эпохи ранней бронзы. Работа была проведена на фрагментах скелетов 22 людей эпохи ранней бронзы Ергенинской возвышенности (46°19′00″ с. ш., 44°16′00″ в. д.). Была разработана и апробирована методика выделения аутентичной древней ДНК в условиях повышенной вероятности загрязнения древнего костного материала современной ДНК, позволяющая избавиться от чужеродного ДНК-содержащего биологического материала в составе клеток за счет дополнительного разрушения мембран, что позволяет получать достоверные результаты молекулярно-генетического исследования. В результате анализа аутосомных STR-локусов выявлена низкая активность ДНК-матрицы, были установлены наиболее полиморфны локусы: D7S820, D18S51, vWA, D21S11. Отсутствие ампликонов «длинных» аутосомных локусов (размер, которых превышает 250-300 нуклеотидных пар) D1S1656, D10S1248, D22S1045, CSF1PO, SE33, D2S1338 вероятно связано с деградацией древней ДНК-матрицы и вследствие этого мутацией (мутациями) в месте (местах) специфического отжига праймеров или разрыва данного фрагмента. Было выявлено 12 мужчин и 4 женщины. В четырех образцах определить половую принадлежность не удалось, вследствие не активной ДНК матрицы. 2

STR анализ Y хромосомы выявил родство исследуемых скелетов Ергененинский 1981 курган 2 погребение 1 и Ергенинский 1981 курган 4 погребение 5 по патрилинии с достоверностью 99,70%. Родство в других исследуемых 18 скелетах не установлено. Наблюдаемая гетерозиготность исследуемых аутосомных локусов D3S1358, TH01, D12S391, D2S441, D7S820, FGA, TPOX, D18S51, D16S539, D8S1179, vWA, D21S11, D19S433 значительно выше ожидаемой гетерозиготности. Однако, наблюдаемая гетерозиготность локуса D13S317 равна ожидаемой гетерозиготности. Установлено, что общий наблюдаемый гетерозиготный вариант аллелей исследуемой микропопуляции меньше общей ожидаемой гетерозиготности на 18 %. Наиболее полиморфный локус D18S51 имеет наибольшую величину вероятности дискриминации неродственных индивидов (PD) 0,91. Наименьшая величина 0,760 соответствует менее полиморфному локусу TPOX. Вероятность случайного совпадения гаплотипов (MP) в целом показывает примерно равные величины, в виду неполных генетических профилей. Локус TPOX с наименьшим вариативным рядом аллелей показывает набольшее значение MD – 0,240. Локус D18S51 имеет значение информационного содержания полиморфизма (PIC) 0,87, что подтверждает его вариабельность в исследуемой микропопуляции. Локус D13S317 имеет наибольшее значение индекса отцовства (PI) и – 4,00. Анализ частот генотипов исследуемой древней микропопуляции и современных популяций свидетельствует о том, что носители восточноманыческой катакомбной культуры эпохи ранней бронзы, могли мигрировать на территорию современной Европы и Азии и являться одними из предков современных носителей европейской и азиатской популяции. Это доказывает и тот факт, что костные останки мужчин Ергенинский 1981 курган 2 погребение 1 и Ергенинский 1981 курган 4 погребение 5 предположительно 3

имеют гаплогруппу R1b, современная концентрация которой максимальна на территориях Западной Европы. 4

ОГЛАВЛЕНИЕ РЕФЕРАТ ................................................................................................................. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ........................................................................................................ 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..................................................................................... 7 ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 8 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 10 1.1 Мировой опыт работы с древней ДНК ...................................................... 10 1.2 Особенности работы с древней ДНК ......................................................... 14 1.3 Археологические характеристики курганных групп Ергенинской возвышенности................................................................................................... 27 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................ 35 2.1 Материалы иссследования .......................................................................... 37 2.2 Пробоподготовка и декальцинация костного материала ........................ 37 2.3 Выделение ДНК ........................................................................................... 38 2.4 Типирование микросателлитных локусов аутосомной ДНК по системе COrDIS «Эксперт» ............................................................................................. 40 2.5 Типирование микросателлитных локусов аутосомной ДНК по системе Identifier Plus ....................................................................................................... 42 2.6 Типирование исследуемых образцов по системе COrDIS-Y .................. 43 2.7 Генотипирование исследуемых образцов по системе Yfiler ................... 44 2.8 Анализ продуктов амплификации.............................................................. 45 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ................................................................... 49 3.1 Разработка методики выделения аутентичной древней ДНК в условиях повышенной вероятности загрязнения древнего костного материала современной ДНК .............................................................................................. 49 3.2 Полиморфные аутосомные STR-маркеры древней микропопуляции эпохи бронзы ...................................................................................................... 54 3.3 Анализ генетических и популяционных характеристик древней микропопуляции эпохи бронзы ........................................................................ 62 5

3.4 Определение возможной кровнородственной связи скелетов курганной группы Малые Дербенты II, Улан-Зуха и Ергенинский ................................ 74 ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 80 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ........................................... 82 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 .................................................................................................. 91 6

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дДНК – древняя ДНК мтДНК – митохондриальная ДНК ПЦР – полимеразная цепная реакция т.п.н. — тысяч пар нуклеотидов УФ – ультрафиолетовое излучение STR (Short tandem repeats) – микросателлиты ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота SDS – додецилсульфата натрия dNTP – дезоксинуклеотидтрифосфат MP – matching probability, вероятность случайного совпадения гаплотипов PD – power of discrimination, вероятность дискриминации неродственных индивидов PE – power of exclusion, исключающая способность PI – paternity index, индекс отцовства PIC – polymorphisminformationcontent, информационное содержание полиморфизма 7

ВВЕДЕНИЕ Изучение экспансии и миграции древних трансконтинентальных популяций является одной из областей применения палеогенетических анализов в биологии. Палеогенетика, или изучение прошлого путем исследования сохранившегося генетического материала из останков древних организмов, может пролить свет на кровную и родственную иерархию, а также социальные отношения, которые существовали внутри родовых и локальных человеческих микропопуляций (Вагайцева, 2015). Подходящими источниками для палеогенетических исследований являются курганные группы в целом, а также каждый отдельно взятый курган. Погребальные памятники, в свою очередь, отражают представления о структуре мироздания древней микропопуляции в целом и загробного мира в частности. Именно для погребальных сооружений, как сакральных объектов, строго соблюдалась традиционная характерная для этого этноса ориентация погребального сооружения и кровнородственная иерархия (Очир-Горяева, 2008). Костный материал, найденный в подобных некрополях, используется для анализа ДНК, необходимого в реконструкции пространственных представлений, семейно-родственных, иерархических связей между различными древними группами населения. Наиболее богата некрополями эпохи ранней бронзы, относящихся к катакомбной археологической культуре, является Ергенинская возвышенность (46°19′00″ с. ш., 44°16′00″ в. д.) (Шилов, 1985; Шилов, Цуцкин, 1986; Шишлина, 2007). Подавляющее большинство впускных погребений, особенностью которых является могильная яма, выкопанная в уже имеющейся насыпи старого кургана с поздними захоронениями, относятся к восточно-манычскому варианту катакомбной культуры. Именно это обстоятельство позволяло предполагать, что курганы были возведены одним кровнородственным кланом в сравнительно короткий (жизнь нескольких поколений) хронологический период. В силу этой особенности 8

специалистами по эпохе бронзы мало внимания уделялось реконструкции курганных групп или отдельных курганов как усыпальниц родственных общин. Изучение молекулярно-генетических характеристик катакомбных захоронений Бронзового века имеет большой научный потенциал (Allentoft et al., 2015). Оно направлено на исследование и понимание внутренней структуры древней популяции эпохи бронзы, в том числе, кровнородственных связей, также оно позволяет разработать новые методики работы с древней ДНК при проведении палеогенетического анализа. Целью исследования является выявление особенностей STR-маркеров аутосомной ДНК и Y-хромосомы, а также их популяционных характеристик у скелетов из наиболее монолитных в культурно-хронологическом отношении курганных групп Ергенинской возвышенности эпохи ранней бронзы. Задачи исследования: 1) Разработать методику выделения аутентичной древней ДНК в условиях повышенной вероятности загрязнения древнего костного материала современной ДНК. 2) Изучить полиморфные микросателлитные аутосомные маркеры древней микропопуляции эпохи бронзы и провести анализ полученных данных. 3) Выявить половую принадлежность и возможную кровнородственную связь скелетов курганной группы Малые Дербенты II, Улан-Зуха и Ергенинский с использованием полиморфных аутосомных STR-маркеров и микросателлитов Y-хромосомы. 4) Изучить популяционные характеристики ряда полиморфных генетических маркеров исследуемых костных останков для определения возможных путей миграции членов древней микропопуляции эпохи бронзы. 9

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Мировой опыт работы с древней ДНК Древняя ДНК произвела революцию в археологии и в нашем понимании человеческой предыстории. На данный момент нет четкого определения дДНК, принято, что это высоко деградированная ДНК под действием времени и других физических и химических факторов. В общем понимании исследования древней ДНК, принято считать, как поиск последовательностей ДНК из археологических находок, музейных образцов, ископаемых останков и других необычных источников ДНК. (Paabo et al., 2004). Впервые ДНК из древнего объекта была выделена и охарактеризована в 1984 году профессором Расселом Хигучи и коллегами, которые идентифицировали нуклеиновые кислоты из музейного образца вымершей в 1883 году квагги (подвид бурчелловой зебры, обитавшей на территории Южной Африки). Объектом исследования являлась высушенная мышца Equus quagga. Исследователям удалось выделить ДНК относительно низкой молекулярной массы и секвенировать два фрагмента мтДНК размером 229 нуклеотидных пар. Эти последовательности, отличались на 12 нуклеотидных оснований от соответствующих последовательностей мтДНК горной зебры, существующего члена рода Equus. Количество, природа и расположение замен подразумевают, что посмертная модификация последовательностей ДНК квагги была незначительной или отсутствовала, и что эти два вида имели общего предка 3–4 млн. лет назад, что согласуется с ископаемыми данными о возрасте рода Equus. Таким образом, ученые показали филогенетическое сродство с современными зебрами. Доктор Хигучи и его коллеги предполагали, что, если долгосрочное сохранение ДНК оказывается общим явлением, то это может быть полезно для нескольких областей, включая палеонтологию, эволюционную биологию, археологию и криминалистику (Higuchi et al., 1984). Их предположения оказались правы. 10

Через тридцать лет, полный геном этой исчезнувшей группы зебры был почти полностью секвенирован (Jónsson et al., 2014). Через год (1985) биолог Сванте Паабо получил данные о нуклеотидной последовательности египетской мумии ребенка возрастом 2400 лет. Шведский ученый искал остатки генетического материала в 23 мумиях, так как считал, что условия климата Египта и хранения останков благоприятны для сохранения ДНК. В итоге ему удалось найти дезоксирибонуклеиновую кислоту, которая могла бы, по его мнению, быть молекулярно клонирована в плазмидном векторе (Paabo, 1985). Стоит отметить, что результат удивил даже его самого, так как полученный фрагмент ДНК был достаточно большого размера (3,4 т. п. н.), что не характерно для древней ДНК. Позже он признал, что полученные данные результат контаминации эндогенной ДНК, однако продолжил исследовать древние образцы. В это же время начинает свое развитие основной метод молекулярной биологии, а именно полимеразная цепная реакция (Mullis, Faloona, 1989; Saiki et al., 1988). Благодаря возможности реплицировать небольшой фрагмент деградированной ДНК, ученые начали извлекать и характеризировать генетический материал, полученный из древних останков людей и животных всевозможных географических локаций (Miller et al., 2008). Появляются исследования нуклеиновых кислот, извлеченных из древних (возрастом до 5000 лет) образцов пшеницы (Brown et al., 1994), кукурузы (Goloubinoff et al., 1993) и семян ячменя и редьки (Dicks et al., 1996). Подобные работы открывают значительные перспективы в понимании проблем палеоэкологии и развития ботаники (Evershed et al., 1997). Исследования дДНК достигли огромного прогресса, несмотря на свою короткую историю. Усовершенствование методов выделения и анализа нуклеиновых кислот позволило перейти к реконструкции целых геномов древних останков. В 2008 году был собран черновой вариант митохондриального генома, вымершего 20 000 лет назад вида – шерстистого 11

мамонта (Mammuthus primigenius), останки которого были найдены в вечной мерзлоте Сибири. Учеными обнаружены различия между мамонтом и африканским слоном (Loxodonta africana) в аминокислотных положениях, которые остаются неизменными в течение нескольких миллионов лет совместной эволюции млекопитающих (Miller et al., 2008). Исследования установили, что приблизительное время расхождения Азиатских слонов и мамонтов произошло 4–6 миллионов лет назад в Африке (Shoshani et al.,2005, Orlando et al., 2007). Однако митохондриальная ДНК современного африканского слона имеет сходство около 95,5 % с мтДНК шерстистого мамонта. К настоящему времени секвенировано и проанализировано уже несколько митохондриальных геномов шерстистых мамонтов в том числе и российскими учеными. Так И.В. Корниенко и соавторы впервые проаннотировали основные элементы некодирующего района мтДНК шерстистого мамонта, найденного на острове Малый Ляховский Новосибирского архипелага. Учеными показана возможная функциональная роль повторяющихся нуклеотидных мотивов, локализованных между консервативными локусами, отвечающих за терминацию транскрипции митохондриального генома (Корниенко и др., 2019). Таким образом, исследования древней ДНК проливают свет не только на сами организмы, вымершие десятки тысяч лет назад, но и позволяют изучать эволюционные изменения видов. Несмотря на успех экстракции нуклеиновых кислот из останков древних животных, растений и микроорганизмов, актуальным оставался вопрос о молекулярно-генетическом анализе предков человека. Извлечение дДНК из останков людей является достаточно сложным и трудоемким процессом, требующим особую пробоподготовку исследуемого объекта, так как велик риск контаминации исследуемого образца. Первые фрагменты древнего человеческого геном были секвенированы в 2010 году. Образцами исследования послужили волосы возрастом около 12

4000 лет, найденные в вечной мерзлоте Гренландии. В результате были определены гаплотипы мтДНК и Y-хромосомы, типичные для северовосточной Азии. Также была показана близкая связь генома древней микропопуляции с геномами современной северо-восточной сибирской популяции (Rasmussen et al., 2010, Pilav et al., 2017). До этого момента общее понимание заключалось в том, что человеческих останков последовательность ДНК, из анатомически невозможно в связи с извлечь деградацией современных аутентичную и загрязнением современным генетическим материалом (Haak et al., 2008; McVicker et al., 2009). Тем не менее, в результате модификации методик работы с древними образцами, в середине 2016 года были частично проанализированы геномы 500 древних людей, включая лиц верхнего палеолита (Fu et al., 2014; SeguinOrlando et al., 2014; Jones et al., 2015), доисторических и исторических индейцев (Malaspinas et al., 2014; Rasmussen et al., 2015), мезолитических охотников-собирателей (Lazaridis et al., 2014; Olalde et al., 2014; Jones et al., 2015; Fu et al., 2014), неолитических охотников-собирателей (Gamba et al., 2014; Lazaridis et al., 2014; Mathieson et al., 2015; Cassidy et al., 2016), а также евразийцев бронзового века (Gamba et al., 2014; Cassidy et al., 2016). Помимо людей анатомически современного вида, или неоантропов, были предприняты попытки экстракции и последующего анализа ДНК ахраичных гоминид. Итак, в 2010 году были исследованы геномы трех индивидуумов вида неандерталец (Homo neanderthalensis), самого близкого эволюционного родственника современных людей, жившего в большей части Европы и Западной Азии 30 000 лет назад. Анализ неандертальского генома установил, что современные люди в Евразии имеют в своем геноме регионы, тесно связанные с неандертальцами и далекие от других современных людей. Данные предполагают, что от 1 до 4 % геномов людей в Евразии происходят от неандертальцев (Green et al., 2010). Таким образом, полученные данные 13

свидетельствуют о том, что было не менее трех эпизодов скрещивания между неандертальцами и различными группами человека разумного (Vernot et al., 2016). Ученые продолжали находить новые неизвестные останки по всему миру. Фрагменты зубов и фаланга пальца, обнаруженные российскими археологами в «Денисовской пещере» Алтайского края Российской Федерации также были проанализированы с помощью молекулярногенетических методов. В результате определения нуклеотидной последовательности древней ДНК было выявлено общее происхождение с неандертальцами и их эволюционное расхождение около 640 тысяч лет назад. Предположено широкое распространение данного вида в Азии в эпоху позднего плейстоцена. Однако, найденные зубы не имели общих морфологических признаков с неандертальцами или современными людьми (Reich et al., 2010). Генетический анализ показал, что отличие мтДНК образца из Денисовской пещеры отличается от мтДНК современного человека по 385 нуклеотидам. Тем самым подтверждая эволюционное открытие нового подвида или вида людей Homo denisovensis. С 2009 года область исследований дДНК становилась все более успешной благодаря внедрению модифицированных методов исследования и индивидуального подхода к каждому образцу. Мировой опыт работы с дДНК показывает возрастающий интерес к данной научной области, развивая молекулярно-генетические технологии путем разработки новых более чувствительных методик для решения различных научных задач (Haak et al., 2008). 1.2 Особенности работы с древней ДНК Молекулярно-генетический анализ археологических образцов становится все более распространенным инструментом для решения антропологических и палеогенетических 14 задач. Однако, часто

исследователям не удается выделить ДНК из древних биологических объектов, а при получении результата корректно проанализировать имеющиеся данные. При работе с генетическим материалом подобных объектов, нужно учитывать ряд методических особенностей, связанных со структурными изменениями молекулы ДНК с течением времени. Подобные изменения зависят от многих факторов, такие как климатические условия окружающей среды и вида захоронения, уровень влажности, содержание солей в окружающей среде, физико-химические особенности почв, где найден объект, показатели pH среды, а также наличие микроорганизмов, способных разрушать биологический материал. Установлено, что в аэрированных почвах грибы и бактерии зачастую колонизируют губчатые пространства костей и начинают распад минерализованных тканей в течение нескольких лет (Jans et al., 2004). Считается, что генетический материал в минерализованном коллагене костей и зубов гипотетически подвергается замедленной скорости разложения из-за его адсорбции на гидроксиапатит (Lindahl, 1993; Collins et al., 1995), а мумификация отдельных клеток и физическое исключение микробов и других внешних загрязнителей также могут играть положительную роль в сохранении ДНК (O'Rourke et al., 1996). Понимание состава кости и ее особенностей имеет решающее значение для определения местоположения ДНК в древней кости и, следовательно, для выбора подходящих образцов и методов извлечения генетического материала. В структуре кости выделяют компактное и губчатое вещество. Компактное вещество состоит из твердого, однородного межклеточного материала, внутри или на котором можно найти ряд характерных типов клеток, включая остеогенные клетки, дающие начало остеобластам, то есть остеоцитам, остеокласты и клетки выстилки костей (неактивные остеобласты) (рисунок 1). Эти клетки покрывают все доступные поверхности кости, точный тип клетки в зависимости от физиологической функции 15

костной ткани. Остеобласты представляют собой одноядерные незрелые костные клетки, ответственные за формирование кости (рисунок 1). Остеобласты выделяют минерализуется белковую смесь, нестехиометрическим которая впоследствии карбонизированным гидроксиапатитом, превращаясь в твердое вещество, которое является костным минералом. Остеобласты также продуцируют гормоны, такие как простагландины и щелочную фосфатазу – фермент, минерализующий кости (Jans et al., 2004). Остеоциты являются зрелыми костными клетками в форме звезды, которые возникают, когда остеобласты оказаться в ловушке собственного костного матрикса. Такие места в кости, известны как лакуны (рисунок 1). Остеокласты – это крупные многоядерные клетки, расположенные на костных поверхностях в так называемых лакунах Ховипса, которые отвечают за резорбцию кости – процесс разрушения костной ткани путем растворения ее минерализованного матрикса (Nijweide et al., 1986; Jans et al., 2004). Компактная часть кости пронизана взаимосвязанной сетью пор, представленной гаверсовыми каналами и каналами Фолькмана, в которых проходят кровеносные сосуды и нервы, и канальцы цитоплазматических процессов, соединяющих соседние остеоциты (рисунок 1). Большая часть кости состоит из костного матрикса. Он состоит как из неорганической фракции, которая представляет собой криптокристаллический карбонатный гидроксиапатита (с которым ДНК может адсорбироваться (Lindahl, 1993), так и из органической фракции, состоящей преимущественно из коллагена типа I, а также различных неколлагеновых белков и гликопротеинов, таких как гликозаминогликаны, остеокальцин, остеонектин, остепонтин и сиалопротеин кости (Gilbert et al., 2005). Упрощенный взгляд на отношения между коллагеном и гидроксиапатитом приведены на рисунке 2. Остеоид, который представляет собой черновой вариант минерализованных тканей, формируется внеклеточной самоагрегацией молекул коллагена и тропоколлагена. 16

Рисунок 1 – Гистологическое строение компактного вещества кости (Gilbert et al., 2005) Эти «коллагеновые триплеты» выстраиваются и переплетаются, образуя фибриллы. Зоны разрыва и зоны перекрытия придают коллагеновым фибриллам исчерченный вид, повторяющийся каждые 67 нм. В зонах разрыва фибриллы менее тесно выровнены и более разупорядочены, чем в зонах перекрытия. Фибриллы полностью увлажнены связанной водой и окружены внеклеточной жидкостью, содержащей неколлагеновые белки, протеогликаны, гликозаминогликаны и, возможно, остатки клеток, включая ДНК. Минерализация начинается в зонах разрыва и на поверхности фибрилл. При прогрессивной минерализации тромбоциты заполняют зону разрыва и проходят вдоль каналов внутри фибрилл между соседними молекулы тропоколлагена. На заключительных этапах минерализации кристаллы апатитов растут и заполняют межфибриллярные пространства, стоит отметить, что минералы растут за счет содержания воды. 17

Следовательно, основная масса минерала лежит в межфибриллярных пространствах. Высушенные, полностью зрелые костные ткани содержат примерно 46 % коллагена, 46 % биологического апатита и 8 % воды (Gilbert et al., 2005). Рисунок 2 – Упрощенный взгляд на взаимодействия между коллагеном и гидроксиапатитом (HAP) (Gilbert et al., 2005) Несмотря на то, что были опубликованы некоторые свидетельства того, что ДНК может адсорбироваться на гидроксиапатитах и влиять на рост кристаллов (Lindahl, 1993; Okazaki, 2002), природа взаимодействий коллаген/ДНК до конца неясна и редко изучается. Однако теоретические модели (Svintradze et al., 2005; Nielsen, 2014) и эксперименты in vitro (Gilbert et al., 2005) убедительно свидетельствуют о том, что ядерная ДНК не только связывается с коллагеном, но может действовать как каркас или матрица в агрегации молекул коллагена в фибриллы (фибриллогенез). Однако имеется мало доказательств того, что длинные нити ДНК включаются в минерализованный коллаген, поскольку это нарушит 18

правильную структуру фибрилл (Svintradze et al., 2005). С другой стороны, нельзя исключать возможность попадания коротких фрагментов ядерной ДНК и мтДНК в агрегирующие или минерализующиеся фибриллы. Кроме того, возможно, что зоны разрыва, которые являются более разупорядоченными, чем области перекрытия, также могут быть участками, где меньшие фрагменты ДНК могут быть связанными с молекулами коллагена. Затем они могут быть заключены в кристаллиты гидроксиапатита в процессе минерализации. Вполне возможно, что во время резорбции и образования кости большое количество мтДНК высвобождается в формирующийся остеоидный матрикс после апоптоза остеокластов или остеобластов. В этом случае фрагменты ДНК будут доступны для связывания с внешними поверхностями коллагеновых фибрилл в минерализующемся остеоиде или с поверхностями развивающихся кристаллитов апатита. Конечно, в исследованиях дДНК картина становится еще более сложной изза потенциального высвобождения продуктов разложения тканей, включая фрагменты ДНК и коллагена, выделяемые в результате химической и / или микробной деградации неминерализованного остеоида. Предложенные выше механизмы сохранения ДНК в кости, то есть связывание с: минералом и коллагеном, имеют важное значение для понимания того, как наиболее эффективно извлечь ДНК, учитывая, что большинство протоколов экстракции генетического материала включают удаление минеральной фазы (Schultz, 2001). По данным лаборатории идентификации ДНК вооруженных сил США при равных условиях окружающих факторов, наибольшее количество активной ДНК матрицы можно выделить из подвздошных костей и длинных трубчатых костей нижних конечностей. При использовании плоских костей черепа, ключицы и ребер шансы получить ДНК, пригодную для дальнейшего анализа минимальны (рисунок 3) (Leney, 2006). 19

Рисунок 3 – Процентное соотношение успешных амплификаций дДНК, выделенной из различных типов костей скелета (Leney, 2006) Следующая трудность, с которой можно столкнуться при изучении дДНК – это ее высокая степень деградации. После смерти клетки генетический материал может быть сильно фрагментирован. Вследствие этого средний размер, полученных фрагментов, не превышает несколько сотен пар нуклеотидов. Для понимания сущности процесса, обратимся к основам компактизации генетического материала в ядре клетки. Молекула ДНК компактизована в нуклеосомы – основной структурной единицей хроматина. Нуклеосомы соединяются линейными участками ДНК, которые называются линкерами. Эти межнуклеосомные участки наиболее не стабильны. В исследованиях отмечено, что при обработке линкерных участков эндонуклеазой, гидролизу подвергаются линейные участки, при том, что сама нуклеосома остается нетронутой (Elliot et al., 2002; Nielsen, 2014). Таким образом можно предположить, что под действием неблагоприятных факторов среды и с течением времени молекула дДНК 20

разрывается в межнуклеосомных участках и дает специфический размер нуклеотидный последовательности в результате процессов гидролиза фосфодиэфирных связей под действием эндонуклеаз или окисления (рисунок 4) (Lindahl, 1993; Ivanov et al., 1995). Фрагменты нуклеиновых кислот, размер которых превышает несколько сотен п.н. могут быть расценены как результат контаминации и ложноположительного результата. Гидролиз N-гликозидных связей (рисунок 4) между основанием и дезоксирибозой приводит к депуринизации и депиримидинизации молекул ДНК. Если основание является пуриновым (аденин или гуанин), то гидролиз N-гликозидной связи происходит примерно в 20 раз быстрее по сравнению пиримидиновыми основаниями (цитозином и тимином) (O’Rourke et al., 2000). Кроме того, на стабильность связей внутри молекулы оказывает влияние уровень pH окружающей среды. По имеющимся данным, водородные связи в молекуле ДНК остаются стабильными при 4-10 значениях pH, а фосфодиэфирные связи в пределах 3-12. Поэтому при низких температурах окружающей среды, нейтральном или слабощелочном рН, быстром обезвоживании биологических объектов, высокой концентрации солей, а также отсутствии микроорганизмов генетический материал может сохраняться длительное время. По данным исследований предполагаемый полный гидролиз ДНК в физиологическом растворе соли, нейтральном pH и температуре 15 °C может занять около ста тысяч лет (Lindahl, 1993; Pilipenko, 2014). 21

Рисунок 4 – Пути гидролиза древней ДНК (Корниенко, Харламов, 2012) Молекулярные повреждения ДНК могут быть вызваны и химическими модификациями нуклеиновых кислот. В ядре клетка in vivo находятся под строгим контролем механизмов репарации ДНК в процессе репликации. Но после смерти организма с течением времени клетка начинает накапливать различные химические модификации. Генетический материал захороненных останков также разрушается микроорганизмами биоты почв. Деградация ДНК в древних костных останках не является простой темой, поскольку множественные химические процессы могут действовать по-разному, например, сшивать и фрагментировать химические основания молекулы, или нуклеотидные основания могут быть удалены или изменены (Paabo, 1989; Lindahl,1993; Dabney et al., 2017). Подобные изменения меняют структуру ДНК, которая была на момент смерти, что ведет к ложным результатам. Источники повреждений молекулы, которые могут привести к химическим модификациям ДНК различны. Выделяют физические, такие как УФ излучение или ионизирующее излучение, механические повреждения ДНК, а 22

также химические источники повреждения, например, воздействие окисляющих веществ (в том числе и свободных радикалов), алкилирующих веществ, а также химических мутагенов. Важно отметить, что модификации оснований могут происходить спонтанно (Dabney et al., 2017). Одной из наиболее значимых химических модификаций дДНК является дезаминирование. Скорость гидролитического дезаминирования оснований пиримидинов (цитозин, тимин), примерно в 40 раз превышает скорость дезаминирования пуринов (аденин, гуанин) Остатки цитозина способны самопроизвольно терять свою аминогруппу в результате гидролиза и превращаться в остатки урацила, которые обычно характеры для молекулы РНК. Получившийся урацил образует две водородные связи с аденином по принципу комплиментарности. В процессе ПЦР эта модификация приводит к замене пары гуанина-цитозина на аденин-тимин, что может привести к недостоверным результатам. Наконец, дезаменирование аденина в результате дает гипоксантин, который образовывает две водородные связи с цитозином, что также может сказаться на результатах секвенирования дДНК. Это особенно критично, если исследователь работает с единичными копиями ДНК. Определить дезаминирование возможно путем обработки препарата ДНК урацил-N-гликозилазой. Данный фермент способен удалять продукты дезаминирования цитозина. Далее определение верной нуклеотидной последовательности происходит путем многократного секвенирования исследуемого участка (O’Rourke et al., 2000). Еще одна химическая модификация, которой может быть подвержена дДНК это метилирование. В общем понимании метилирование это важный эпигенетический регулятор экспрессии генов эукариот. Процесс реакции включает в себя присоединение метильной группы к углероду в позиции С5 цитозинового кольца. Чаще всего метелирование происходит в последовательностях богатых цитозином и гуанином, так называемых CpGостровках. По имеющимся данным, цитозин метилируется значительно чаще, 23

чем аденин и эта реакция чаще всего происходит спонтанно. В результате этого, метелирование в молекулах древней ДНК изучен крайне мало. К сожалению, детектировать модификации дДНК довольно сложно. Одним из методов определения метелированного цитозина является обработка ДНК бисульфитом, который превращает цитозин в урацил. При этом, если цитозин подвергнулся метилированию, то модификации его в урацил не произойдет. Существуют и другие модификации, ведущие к ложному и не воспроизводимому результату, например, тиминовые сшивки, образование димеров молекулы, а также дезаминирование метелированного цитозина (Lindahl, 1993; Ye et al., 2011). Помимо химических модификаций, совместно с дДНК могут быть выделены гуминовые и фульвовые кислоты. По имеющимся данным эти соединения могут ингибировать ПЦР даже в маленьких концентрациях (около 100 нг) (Корниенко, Харламов 2012). Выявить наличие данных ингибиторов можно путем УФ-спектроскопии. Другими серьезными ингибиторами Taq-полимеразы являются продукты реакции Майара (Liang et al., 2013). Идентифицировать подобные соединения можно по светлокоричневому цвету препаратов выделенной ДНК. Установлено, что детекцию ингибиторов ПЦР можно проводить во время визуализации ДНК в агарозном геле (Paabo, 1990; Janica, 2006). Позже была выявлена корреляция между интенсивностью флуоресценции агарозного геля и активностью ингибиторов (Liang et al., 2013). Также вероятность ингибирования дДНК, можно определить путем внесения в положительный контроль разведенного экстракта дДНК перед постановкой ПЦР. При этом, в случае отсутствия ампликонов, можно однозначно говорить о ингибировании. Безусловно, данная проблема критична при исследованиях древнего биологического материала, так как зачастую исследованиям приходится работать с единичными копиями фрагментированных молекул (Kornienko et al., 2002). 24

Несмотря на ряд трудностей и методических проблем при изучении древнего биологического материала, самой неприятной проблемой с которой может столкнуться исследователь – это контаминация (Paabo et al., 2004). Под контаминацией в молекулярно-генетической лаборатории понимают загрязнение исследуемого образца эндогенной полученный генетический профиль не ДНК. является В результате достоверным. При исследовании древней ДНК, это особенно критично, в связи с крайне малым количеством генетического материала и его фрагментацией. ДНК матрица древних образцов менее активна, чем современных, поэтому при попадании даже одной молекулы результат окажется ложным. Во избежание амплификации матриц, не имеющих отношения к исследуемому объекту, необходимо принимать специальные меры, направленные на устранение контаминации и выявление результатов возможной контаминации. Особое внимание следует уделить молекулярно-генетической лаборатории, в которой производятся исследования древнего биологического материала. В идеале, такие лаборатории должны быть как можно дальше от лабораторий, где проводится работа с современной ДНК. Все экстракционные работы должны проводиться сотрудниками в защитной одежде, а именно чистый халат с длинными рукавами, перчатки, медицинская шапочка, медицинская маска (Paabo, 1989; Wolfgang et al., 2008). Рабочие поверхности лабораторий, включая все столы, ПЦР-боксы и инструменты регулярно должны очищаться в несколько этапов: вначале при помощи влажной лабораторной салфеткой для избегания механического загрязнения, затем с помощью окислителей, таких как раствор хлора от возможного биологического загрязнения, и в конце снова водой, для того чтобы смыть используемый окислитель, т.к. подобные соединения ингибируют ПЦР. Полы в молекулярно-генетической лаборатории древней ДНК дезинфицируются концентрированным раствором хлора или другого мощного химического реагента. В конце рабочего дня сотрудник включает 25

УФ облучение для полного разрушения оставшегося генетического материала (Burge et al., 2006). Лаборатория, проводящая исследования древнего биологического материала как минимум должна состоять из нескольких изолированных помещений. Первичная обработка и гомогенизация образца, а также процессы экстракции ДНК (где исследователь работает с крайне малым количеством генетического материала) помещениях, изолированных от тех, должны в которых осуществляться проводится в ПЦР- амплификация и последующая работа с уже амплифицированной ДНК, представленной в виде миллионов копий молекул (Lindahl at al., 1993; Athey, 2005, Emmerova et al., 2917). Для контроля и успешных результатов молекулярно-генетического анализа рекомендуется проводить экстракцию ДНК из разных частей исследуемого объекта несколько раз. Если полученный генетический профиль совпадает, то вероятнее всего это аутентичная ДНК. Для определения чистоты реагентов рекомендуется постановка ПЦР с отрицательным контролем, т.е. используемых реагентов без исследуемой ДНК (Wolfgang et al., 2008; Корниенко, Харламов, 2012). Одним из основных правил работы с древней ДНК является использование стерильных реагентов и пластика. Так как в них может содержаться следовое количество эндогенной ДНК матрицы, но при этом давать амплификацию лишь в одной из нескольких проб. Однако, постановка положительного контроля опасна из-за риска загрязнения. Кроме того, рекомендуется клонирование продуктов амплификации и проведении амплификации коротких перекрывающихся фрагментов. Для подтверждения воспроизводимости полученных данных рекомендуется повторного проведение генетического анализа в другой независимой лаборатории (Paabo at al., 2004; Wolfgang et al., 2008; Endicott at al., 2009). Не смотря на усиленные меры по борьбе с загрязнением, контаминация представляет особенно опасную проблему при исследовании древних 26

останков человека или микроорганизмов, поскольку человеческая и бактериальная ДНК всегда присутствуют в лаборатории, и последовательности привнесенной ДНК в этих случаях труднее отличить от аутентичных последовательностей, чем при исследовании вымерших или редких видов (Paabo et al., 1990; Skoglund et al., 2014). Исследования ДНК являются не только трудоемкими, но и дорогостоящими. В случае с древним генетическим материалом это особенно актуально, так как многие образцы сильно деградированы и при неудачной попытке экстракции дДНК есть вероятность потерять или уничтожить уникальный и невосполнимый образец. Нерешенных задач в данной области изучения дДНК достаточно много. Однако интерес и практическая значимость развивают эту область достаточно быстро. Дальнейшие исследования должны быть направлены на улучшение качества препаратов ДНК путем решения основных проблем работы с древним материалом. 1.3 Археологические характеристики курганных групп Ергенинской возвышенности На юго-востоке европейской части России находится Ергенинская возвышенность (46 19′00″ с. ш., 44°16′00″ в. д.). Длина платформы составляет приблизительно 350 км, а ширина около 50 км. Гора Шаред является наивысшей точкой возвышенности (около 222 м над уровнем моря) и находится в ее южной части. Стоит отметить, что даже такая относительно небольшая высота над уровнем моря выполняет роль климатической границы и влияет на климат Нижнего Поволжья. Северная часть Ергенинской возвышенности располагается в Волгоградской области, часть западного склона в Ростовской области, но ее основная восточная часть находится на территории Калмыкии (Мильков, Гвоздецкий, 1986). Климатические особенности, а также свойства и характер почв Ергенинской возвышенности определяют 27 сохранность курганных

захоронений эпохи бронзы. Климат резко континентальный, характерный для полупустынь. Осадки выпадают около 300 мл в год. Для Ергени характерно наличие небольших рек, питающихся подземными и грунтовыми водами и вследствие этого не пересыхающих летом. Данные палинологического анализа, а также исследование сапропелевых речных отложений доказали, что географическая среда Ергенинской возвышенности не претерпела существенных изменения со времен энеолита, бронзы и раннего железного века. По мнению ученых, которые активно занимаются реконструкцией древних природных условий волго-манычских степей, такие климатические особенности и условия среды являлись важным фактором для ведения оседлого образа жизни (Шилов, 1985). Эпоха бронзы характеризуется аридизацией степной зоны, которая продолжалась и в раннем периоде железного века. Формирование структуры почвенных покровов пустынных и сухих степей завершилось в эпоху раннего железа. Сравнительный анализ археологических объектов показывает, что структура почвенного покрова этой эпохи была практически идентична современной (Очир-Горяева, 2008, Андреева 2014). Ергенинская возвышенность известна наиболее многочисленными и наиболее богатыми некрополями эпохи ранней бронзы, относящихся к катакомбной археологической культуре, датирующейся по данным последних радиокарбонных дат в пределах XXV - XX вв. до н.э. (вторая половина III тысячелетия) (Шилов, 1985). По данным раскопок, которые проводились с 1929 г. по 1977 г. количество найденных погребений эпохи бронзы в 3,2 раза превышают количество памятников эпохи железа и примерно в 7,6 раз превосходят находки Средних веков. Этот факт доказывает стабильное проживание достаточно многочисленного населения эпохи бронзы в волго-манычских степях (Очир-Горяева, 2018). 28

Курганная группа Малые Дербенты II. Археологические раскопки северного микрорегиона Ергенинской возвышенности, протяженностью около 80 км, проводились в 2007 г. В ходе исследований данного региона было найдено несколько курганных групп, в том числе Малые Дербенты II. Данная курганная группа состояла из 5 курганов, расположенных вдоль западного берега р. Пришиб. В настоящей работе исследована большая часть погребений курганов 1 и 2. Курган 1 находился вблизи проселочной дороги. Высота кургана с южной стороны 29 м, с северной 41 м; диаметр кургана около 26 м. Погребение 2 было обнаружено в восточной части от центра кургана. Общая длина погребения около 225 см, а ширина около 105 см. На глубине 165 см были найдены останки мужчины приблизительно 30-40 лет. Погребение 6 обнаружено на глубине 95 см в восточной части кургана. В центре могильного пятна были найдены костные останки человека. Характерным является тот факт, что по всей площади могильной ямы были без упорядоченно разбросаны кости женщины возраста более 50 лет, а также кости и фрагменты черепа ребенка, которому было приблизительно 2 года. Погребение 7 (рисунок 5) представляло собой могильное пятно, расположенное восточной части кургана на глубине 93 см. При дальнейшем исследовании было обнаружен вход в катакомбу. Раскопки выявили в юговосточном углу ямы фрагменты коленного сустава человека и женский скелет 30-45 лет в северной части катакомбной камеры, скелет ребенка 7 лет в средней части, а также еще один скелет подростка 14 лет в южной части. Погребение 9 являлось основным захоронением. В западной части в центре кургана было обнаружено могильное пятно на глубине 106 см. Исследователями было замечено, что произошло наложение нескольких могил. В катакомбной камере были обнаружены костные останки женщины возрастом приблизительно 45 лет. 29

Рисунок 5 – Курган 1 (Малые Дербенты II). Погребение 7. Общий вид. Фото (Очир-Горяева, 2017) Курган 2 группы Малые Дербенты II находится на севере от первого кургана и расположен на склоне русла реки Пришиб. Приблизительный диаметр составляет 40 м, высота на юге 83 см, на севере 109 см. Погребение 1 было найдено в центральной части кургана на глубине 136. В восточной стороне ямы был найден скелет молодой женщины около 25 лет. Погребение 5 найдено на западе кургана. Могильная яма имела длину 135 см, ширину 115 см, глубину 171 см. На дне ямы были найдены костные останки женщины возрастом 20 лет. Археологические исследования свидетельствуют о том, то женщина была бремена, т.к. под бедренной костью располагался череп младенца (7 месяцев). Погребение 7 является основным погребением данного кургана и располагалось в его центральной части. Погребение представляет собой катакомбу, на глубине 353 см были обнаружены кости взрослого мужчины возрастом приблизительно 45 лет. Стоит отметить, что данное погребение разрушено и костные останки располагались по всей могильной камере. 30

Археологические и палеонтологические наблюдения свидетельствуют о том, что курганы 1 и 2 из курганной группы Малые Дербеты II являлись усыпальницей патриархальной семьи, а возможно и большого клана катакомбной культуры эпохи бронзы. Следует отметить, что в обоих курганах погребения женщин располагались со стороны юга-запада. Курганная группа Улан-Зуха. Могильник Улан-Зуха представлял собой курганы, которые располагались цепочкой с юга-востока на северо-запад на въезде в п. Шатта. Погребение 1 кургана 1 расположено на глубине 154 см в юго-западной части ямы были найдены человеческие останки, а на дне 188 см находился неполный скелет взрослого мужчины. По мнению археологов данное захоронение датируется серединой V – IV в. до н.э. Погребение 3 найдено в южной части ямы, глубиной 179 см. На дне ямы найдены костные останки человека. Курган 3 один из наиболее крупных курганов группы Улан-Зуха. Курган правильной сферической формы, диаметром 21 м и высотой 64 см. Погребение 8 располагалось в центральной части кургана на глубине 72 см, где были обнаружены останки взрослого человека, предположительно мужчины. Курганная группа «Ергенинский» расположена в центральной части Ергенинской возвышенности. «Ергенинский» является одним из примечательных памятников восточно-манычского варианта катакомбной культуры. В 1981-1986 годах здесь были проведены археологические раскопки 12 курганов известным ученым В.П. Шиловым (Шилов, 1985; Шилов, Цуцкин 1986). Им была установлена по составу погребального инвентаря вероятная половая принадлежность погребенных. Однако антропологические определения во время раскопок сделаны не были, а в настоящее время в большинстве случаев провести полноценные антропологические исследования не представляется возможным, в силу 31

фрагментарности сохранившихся после нескольких переездов архива костных материалов из курганов данной группы. Исследуемый курган 2 был расположен в восточной части. Насыпь кургана слегка вытянута по оси север-юг, в южную сторону. Находок в насыпи не было обнаружено. Верхний слой насыпи представлен слоем современного дерна мощностью 0,10-0,15 м. Пятно могильной ямы (погребение 1) было обнаружено на границе юго-восточного и северозападного секторов, между отметками 1,50 м и 3,20 м на юг от центрального репера. Размеры могильной ямы: длина – 1,73 м, ширина – 1,10 м, глубина – 2,57 м. В западной стенке ямы сделан подбой (катакомба). На дне катакомбы лежал скелет мужчины зрелого возраста, на левом боку, головой ориентирован на северо-запад (рисунок 6). Рисунок 6 – Курган 2 (Ергенинский 1981). Погребение 1. Общий вид. Фото (Очир-Горяева, 2017) 32

Курган 4 имел диаметр по линии с севера на юг – 23 м, запада на восток – 27,5 м, высота от уровня погребенной почвы – 0,50 м. Могильная яма погребения 5 в кургане 4 обнаружена на границе северо-западного и северо-восточного секторов. Длинной осью яма была ориентирована по линии север-юг. В восточной стенке входной ямы обнаружена овальная катакомба, длиной – 2,63 м, шириной – 1,04 м и глубиной 2,57 м. На дне обнаружен скелет мужчины зрелого возраста. Курган 13 Погребение 10 (А-В) представляет собой прямоугольную яму. В западной стене ямы на глубине 494 см была выкопана камера, в которой было совершено сопровождающее захоронение подростка 8 лет. Инвентарь его состоял из небольшого реповидного сосуда и камня с желобком. На дне простой прямоугольной ямы был погребен ребенок 5-5,5 лет с богатым сопровождающим инвентарем (рисунок 7). Погребенный ребенок располагался поперек ямы, в ее центре. Кости ребенка были плохой сохранности, лицевые кости черепа были раздавлены. На всех костях ребенка, но особенно на черепе и костях фиксировались отпечатки ткани. Рисунок 7 – Курган 13 (Ергенинский 08). Погребение 10 (А-В). Общий вид. Фото (Очир-Горяева, 2017) 33

Курган 14 был насыпан над погребением 2, которое было совершено в катакомбе. Катакомбное основное погребение находилось в центре кургана. Вход был обрушен, но удалось замерить наиболее высокую точку входа на глубине –109 от уровня погребенной почвы. На дне камеры, у восточной стенки лежал скелет ребенка 3-4 лет. Сохранились кости фаланг правой руки. In situ сохранились кости ступней. У всех исследованных скелетов имелось характерное расположение погребенной на левом боку и в скорченной позе, которое определяет их, как захоронение катакомбной культуры эпохи бронзы. Изучение древних захоронений, таких как грунтовый могильник или огромный курган должны быть направленны на установление внутренней структуры древних популяций, и прежде всего, кровнородственной и социальной иерархии внутри родовых и локальных микропопуляций, а также всевозможных миграций и расселения древних людей. Комбинация археологических и молекулярно-генетических методик дает потенциал по истине революционных открытий ( Tillmar, 2010; Brundin et al., 2013). 34

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы исследования Объектом исследования служили фрагменты скелетов 22 людей эпохи ранней бронзы Ергенинской возвышенности (таблица 1). В качестве биологического материала использовали костный материал. Работа проводилась на базе научной лаборатории Идентификация объектов биологического происхождения Академии биологии и биотехнологии имени Д.И. Ивановского Южного федерального университета и молекулярно-генетической лаборатории Южного научного центра Российской академии наук. Таблица 1 – Исследуемые костные останки Ергенинской возвышенности эпохи бронзы Номер образца Название памятника Название кости 1 Ерген 82 К6 П2 Плечевая левая, большеберцовая правая 2 Ерген 81 К3 П1 плечевая левая, бедренная левая 3 Ерген 82 К6 П3 Правая лучевая, левая плечевая 4 Ерген 82 К5 П8 большеберцовая правая, плечевая правая 5 Ерген 81 К3 П4 Бедренная правая, большеберцовая правая 6 Ерген 81 К4 П3 Бедренная правая, правая большеберцовая 7 Ерген 06 К14 G2 Фрагменты черепа: височная, теменная кость, бедренная правая, бедренная левая 35

8 Ерген 08 К13 П10А бедренная левая, бедренная правая, большеберцовая левая 9 Ерген 08 К10 П10В Бедренная правая, бедренная левая, большеберцовая левая, фрагмент нижней челюсти левая дуга 10 Ерген 81 К4 П5 Большеберцовая левая, плечевая правая 11 Ерген 81 К2 П1 Плечевая правая, бедренная правая 12 Малый Дербент II 07 К1 Большеберцовая П9 правая, бедренная правая, левая плечевая 13 Малый Дербент II 07 К2 Правая бедренная, П5 правая плечевая 14 Малый Дербент II 07 К1 Бедренная левая, П2 плечевая левая 15 Улан-Зуха 90 К1 П3 16 Малый Дербент II 07 К1 Плечевая правая, П7 бедренная правая 17 Малый Дербент II 07 К2 К2 П1: Большеберцовая П1, Малый Дербент II левая, большеберцовая 07 К2 П1 II правая Большеберцовая правая, левая плечевая К2 П1 II: бедренная правая, плечевая правая 18 Малый Дербент II 07 К2 Большеберцовая левая, П6 большеберцовая правая 19 Малый Дербент II 07 К1 Большеберцовая П6 правая, бедренная левая 36

20 Малый Дербент II 07 К2 Плечевая правая П7 21 Улан-Зуха 90 К3 П8 Бедренная левая, плечевая правая 22 Улан-Зуха 90 К1 П1 Большеберцовая левая, плечевая правая *Примечания: К – курган, П – погребение 2.2 Пробоподготовка и декальцинация костного материала Древние костные останки очищали от остатков почвы и других загрязнений с помощью сухой салфетки, затем снимали верхний (загрязненный) слой при помощи мини-дрели Hammer Flex MD135A с использованием стерильного сверла диаметром 0,3 см. Гомогенизация костного материала осуществлялась при помощи этой же мини-дрели с использованием новой стерильной насадки. Более мелкие образцы (фрагменты до 2 см) измельчали при помощи вибрационной шаровой мельницы для измельчения костей и зубов Retsch MM 200 в течение 3 минут при скорости 1,5 тыс. об/мин. Получали приблизительно 1-2 г костной стружки. Костный порошок каждого объекта помещали в стерильные пробирки 50 мл. Затем в пробирку вносили 25 мл разработанного раствора для деконтаминационной обработки (Корниенко и др., 2019) встряхивали на вортексе 30 секунд и инкубировали 15 минут 200 оборотов/мин при помощи шейкер-инкубатора с универсальной платформой SI-300 (Jeio Tech). Центрифугировали полученный раствор при помощи настольной рефрижераторной центрифуги Eppendorf Centrifuge 5804/5804R в течение 5 минут при 1500 g. Полученную надосадочную жидкость сливали в отдельный пластиковый лабораторный стакан. К полученному осадку добавляли 20-25 мл 5М ЭДТА и встряхивали на вортексе в течение 30 секунд, далее 37

центрифугировали 5 минут при 1500 g. Надосадок декантировали. Затем к осадку добавили 20-25 мл 5М ЭДТА с добавлением 0,5 % лаурил саркозина. Вортексировали полученный раствор 30 секунд и центрифугировали 5 мин при 1500 g. Аккуратно декантировали надосадочную жидкость из пробирки и добавили 20-25 мл 5М ЭДТА. Вортексировали 40 секунд и центрифугировали 8 мин при 1500g. Надосадоную жидкость тщательно слили в лабораторный стакан, не потеряв костный осадок. В пробирку с осадком добавляли по 4, 5 мл лизирующего раствора (10 мМ трис-HCl, pH 8 10мМ Na2ЭДТА, 2 % SDS, 50 мМ NaCl), 150 мкл раствора протеиназы K (10 мг/мл) и 75 мкл 2М дитиотрейтола. Вортексировали образцы по 10 секунд и инкубировали в термостат-шейкере при температуре 43 °C 160 оборотов/мин в течение суток. После инкубации получали лизат и нерастворенный осадок костного порошка. Деконтаминационная обработка биологического материала, а также поверхностей лабораторного инструментария и оборудования от посторонней ДНК осуществлялась с помощью разработанной инновационной методики, находящейся на стадии патентования. 2.3 Выделение ДНК Работа с древней ДНК должна производится в стерильных ПЦР-боксах или ламинарных шкафах. Все лабораторные поверхности и оборудование, используемое для разработанным выделения раствором для ДНК, предварительно удаления чужеродного обрабатывали генетического материала или 7 мМ NaOCl, а затем промывали дистиллированной водой. Перед проведением эксперимента обрабатывали УФ лампой ПЦР-бокс и используемое оборудование. Стоит отметить, что экстракция генетического материала из древних костных останков стандартными методиками малоэффективна. 38

Экстрагирование ДНК из полученного лизата проводили при помощи смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25/24/1) со следующими этапами: 1) Инкубированный лизат центрифугировали 1 минуту со скоростью 3500 g при помощи центрифуги Harmle Labortechnik GmbH Z300K (Германия). 2) В каждую пробирку с лизатом вносили по 5 мл смеси фенол/хлороформным/изоамиловый спирт (25/24/1). Смесь интенсивно перемешивали на вортексе в течение 40 секунд, затем центрифугировали 8 минут с ускорением 3750 g. 3) Верхнюю водную фазу, не захватывая нижний слой фенол/хлороформ/изоамилол, межфазный слой и неосевшие частицы, переносили в новые пробирки на 15 мл типа «Costar», в которые предварительно внесли по 5 мл смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25/24/1). Смесь интенсивно перемешивали на вортексе в течение 40 секунд, затем центрифугировали 8 минут с ускорением 3750 g. 4) Верхнюю водную фазу, не захватывая нижний слой фенол/хлороформа, межфазный слой и неосевшие частицы, переносили в новые пробирки на 15 мл типа «Costar», в которые предварительно внесли по 4,2 мл хлороформа. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе в течение 40 секунд, затем центрифугировали 8 минут со скоростью 3750 g. 5) Верхнюю водную фазу, не захватывая нижний слой хлороформа, межфазный слой и неосевшие частицы, переносили в устройство «Amicon Ultra-4, ultracel30k» для дополнительной очистки и концентрации ДНК, куда предварительно добавили 400 мкл стерильной дионизованной воды. «Amicon Ultra-4, ultracel30k» центрифугировали при 2750 g в течение 35 минут. Полученный фильтрат удаляли. 6) Очистку деонизованной водой проводили дважды. Для этого в устройство «Amicon Ultra-4, ultracel30k» 39 добавляли по 3950 мкл

деионизованной воды, пипетировали и центрифугировали колонки при 2750 g в течение 35 минут. Полученный фильтрат удаляли. 7) Очистку TE-буфером (10 мМ Трис-HCl 1мМ ЭДТА), проводили один раз. Для этого в устройство «Amicon Ultra-4, ultracel30k» добавляли по 3950 мкл TE-буфера и центрифугировали колонки при 2750 g в течение 35 минут. 8) Полученные препараты ДНК объемом 60-100 мкл переносили в отдельные стерильные пробирки типа «Эппендорф» для дальнейшего исследования. Недлительное хранение препаратов с выделенной ДНК осуществляется в холодильнике на +4/+6 °C. Длительное хранение осуществляли при температуре –20 °C и -70 °C. Экстракцию ДНК проводили в нескольких независимых параллелях для получения достоверных данных. 2.4 Типирование микросателлитных локусов аутосомной ДНК по системе COrDIS «Эксперт» Генотипирование выделенной ДНК исследуемых образцов проводилось с использованием системы COrDIS «Эксперт» производства «Гордиз» (Россия), в соответствии с руководством пользователя (аутосомные локусы STR: D3S1358, TH01, D12S391, D1S1656, D10S1248, D22S1045, D2S441, D7S820, D13S317, FGA, TPOX, D18S51, D16S539, D8S1179, CSF1PO, D5S818, vWA, D21S11, SE33, и локус Amelogenin, определяющему половую принадлежность). Локус амелогенина не является STR-маркером, однако продукты амплификации этого локуса для половых хромосом X и Y отличаются по длине. Для проведения ПЦР предварительно готовили реакционную смесь, состоящую из компонентов, входящих в состав набора. В каждую пробирку вносили по 2,5 мкл раствора активатора (содержащего MgCl2), 5 мкл реакционной смеси (содержащей фермент Taq-полимеразу, флуоресцентно40

меченные праймеры, dNTPs), 5 мкл экстракта ДНК. Для проверки чистоты реактивов и эксперимента в пробирку с отрицательным контролем вместо препаратов ДНК добавляли 5 мкл стерильной деионизированной воды. Амплификацию ДНК осуществляли методом ПЦР с помощью термоциклера «GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) в режиме эмуляции «9600» (таблица 2). Таблица 2 – Параметры проведения ПЦР по системе COrDIS «Эксперт» 94 ºС 3 мин 98 ºС 30 сек 59 ºС 120 сек 4 цикла 72 ºС 90 сек 94 ºС 30 сек 59 ºС 120 сек 6 циклов 72ºС 90 сек 90ºС 30 сек 20-22 59ºС 120 сек циклов 72ºС 75 сек 68ºС 10 мин 15ºС ∞ *Примечание: скорость нагрева с 59 ºС до 72 ºС – 0,3 ºС/1 сек. Для оценки специфичности реакции амплификации использовали положительный контроль (ДНК МК1 из используемого набора) в конечной концентрации 0,5 нг/мкл). Электрофорез ампликонов проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, США) в соответствии с руководством пользователя. Идентификацию аллелей проводили по внутреннему размерному стандарту S450 относительно аллельного леддера, прилагаемого к набору COrDIS «Эксперт». 41

2.5 Типирование микросателлитных локусов аутосомной ДНК по системе Identifier Plus Генотипирование выделенной ДНК исследуемых образцов проводилось с использованием набора Identifier Plus PCR Amplification Kit (США), в соответствии с руководством пользователя (аутосомные локусы STR: D8S117, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA и локус Amelogenin, определяющему половую принадлежность). Локус амелогенина не является STR-маркером, однако продукты амплификации этого локуса для половых хромосом X и Y отличаются по длине. Для проведения ПЦР предварительно готовили реакционную смесь, состоящую из компонентов, входящих в состав набора. В каждую пробирку вносили смесь, состоящую из 7,5 мкл реакционной смеси (содержащей фермент Taq-полимеразу, dNTPs, 0,04 % азид натрия) и 5 мкл флуоресцентно-меченных праймеров. Затем добавляли 5 мкл экстракта ДНК. Общий объем 25 мкл. Для проверки чистоты реактивов и эксперимента в пробирку с отрицательным контролем вместо образца ДНК добавляли 5 мкл стерильной деионизированной воды. Амплификацию ДНК осуществляли методом ПЦР с помощью термоциклера «GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) в режиме эмуляции «9600» (таблица 3). Таблица 3 – Параметры проведения ПЦР по системе Identifier Plus PCR Amplification Kit 95 ºС 11 мин 94 ºС 20 сек 30-32 циклов 59 ºС 180 сек 60 ºС 10 мин 4 ºС ∞ *Примечание: скорость нагрева с 59 ºС до 72 ºС – 0,3 ºС/1 сек. 42

Для оценки специфичности реакции амплификации использовали положительный контроль (1 мкл контрольной ДНК 9947A из используемого набора в конечной концентрации 0,04 нг/мкл). Электрофорез ампликонов проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, США) в соответствии с руководством пользователя. Идентификацию аллелей проводили по внутреннему размерному стандарту LIZ 500 относительно аллельного леддера, прилагаемого к набору Identifiler Plus PCR Amplification Kit (США). 2.6 Типирование исследуемых образцов по системе COrDIS-Y Генотипирование выделенной ДНК исследуемых образцов проводилось с использованием системы COrDIS-Y производства «Гордиз» (Россия), в соответствии с руководством пользователя (локусы STR: DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS385 a, DYS385 b, DYS438, DYS439, DYS437, DYS447, DYS576, DYS449, DYS456, DYS448 и DYS635). Для проведения ПЦР предварительно готовили реакционную смесь из компонентов, входящих в состав набора: 2,5 мкл активатора (содержащего MgCl2), 5 мкл реакционной смеси (содержащей фермент Taq-полимеразу, флуоресцентно-меченные праймеры, dNTPs), 5 мкл экстракта ДНК В пробирку с отрицательным контролем добавляли 5 мкл деионизированной воды. Амплификацию ДНК осуществляли методом ПЦР с помощью термоциклера «GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) в режиме эмуляции «9600» (таблица 4). Для оценки специфичности реакции амплификации использовали положительный (1 мкл контрольной ДНК МК1). Электрофорез ампликонов проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США) в соответствии с руководством пользователя Идентификацию 43 аллелей проводили по

размерному стандарту S450 относительно аллельного леддера, прилагаемого к набору COrDIS-Y. Таблица 4 – Параметры проведения ПЦР по системе COrDIS-Y «Гордиз» 94 ºС 3 мин 98 ºС 30 сек 60 ºС 120 сек 72 ºС 90 сек 94 ºС 30 сек 60 ºС 120 сек 72 ºС 90 сек 90 ºС 30 сек 60 ºС 120 сек 72 ºС 75 сек 68 ºС 30 мин 10 ºС ∞ 4 цикла 6 циклов 20-22 циклов *Примечание: скорость нагрева с 59 °С до 72 °С – 0,3 °С/1 сек. 2.7 Генотипирование исследуемых образцов по системе Yfiler Генотипирование выделенной ДНК исследуемых образцов проводилось с использованием набора AmpFlSTR Yfiler PCR Reagents «Applied Biosystems» (США) в соответствии с руководством пользователя (локусы STR локусы: DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS458, DYS19, DYS385 a/b, DYS393, DYS391, DYS439, DYS635, DYS392, YGATA H4, DYS437, DYS438, DYS448). 44

Для проведения ПЦР предварительно готовили реакционную смесь из компонентов, входящих в состав набора: 4,6 мкл реакционной смеси, содержащей MgCl2 и dNTPs, 2,5 мкл раствора флуоресцентно-меченных праймеров, 0,4 мкл фермента Taq-полимеразы Gold (конечная концентрация 2 Ед), 5 мкл экстракта ДНК В пробирку с отрицательным контролем добавляли 5 мкл деионизированной воды. Амплификацию ДНК осуществляли методом ПЦР с помощью термоциклера «GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) в режиме эмуляции «9600» (таблица 5). Для оценки специфичности реакции амплификации использовались положительный (проба мужской ДНК 007 из набора реагентов AmpFlSTR Yfiler PCR Reagents) контроль. Электрофорез ампликонов проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США) в соответствии с руководством пользователя. аллелей проводили по размерному стандарту Идентификацию LIZ500 относительно аллельного леддера, прилагаемого к набору Yfiler. Таблица 5 – Параметры проведения ПЦР по системе AmpFlSTR Yfiler PCR Reagents «Applied Biosystems» 95 ºС 11 мин 94 ºС 1 мин 61 ºС 1 мин 72 ºС 1 мин 60 ºС 80 мин 15 ºС ∞ 30-32 циклов 2.8 Анализ продуктов амплификации Анализ продуктов амплификации проводили путем электрофореза ампликонов с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3130xl 45

(Applied Biosystems, США) в соответствии с руководством пользователя. В процессе электрофореза информация о сканировании геля лазером и детекции флуоресценции автоматически передавалась на управляющий компьютер и обрабатывалась программой «Run 3130 Data Collection» (v.3.0). Обработка результатов и идентификация, и размер аллелей проходила автоматически с помощью программы «GeneMapper ID» (v.3.2). Размер ПЦР продукта каждого STR локуса учитывали в качестве аллельного варианта локуса. Для оценки генетического разнообразия исследуемой микропопуляции исследовали частоту встречаемости в популяции гетерозигот путем расчета частоты гетерозиготных особей по каждому исследуемому локусу. Затем полученные данные усредняли по количеству изучаемых локусов: где Hi – исследуемый локус; N – количество изучаемых локусов. Ожидаемую гетерозиготность Hожид для каждого локуса исследовали по частотам его аллелей. Согласно выполнению условий случайного ожидаемого скрещивания на основании соотношения Харди-Вайнберга и сумма гомо- и гетерозигот будет равна единице, следовательно, ожидаемая гетерозиготность рассчитывается по формуле: [ ] где f – частота встречаемости определенного аллеля в локусе (Гаевский, 2002). Для оценки информативности STR локусов использовали величину информационного полиморфизма (Polymorphism Information Content (PIC)). Индекс PIC рассчитывали по формуле: где Pi – частота каждого аллеля локуса. 46

На основе выявленных аллельных вариантов определяли полиморфизм популяции в зависимости от идентифицированных аллелей и распределения их частот в образцах (Botstein et al., 1980). Величина PIC зависит от числа известных или установленных аллелей и распределения их частот. Данный показатель эквивалентен генному разнообразию. Значение PIC равное 0,5 характеризует доминантный маркер. Важно отметить, что при приблизительно равном распределении частот внутри популяции значение PIC выше, при множественных аллелях и распределении их частот PIC принимает еще большие значения данного показателя. Вероятность случайного совпадения гаплотипов (matching probability, (MP)) рассчитывали по формуле: ∑ где fi – частота встречаемости i-го гаплотипа (Allendorf, Luikart, 2007). Показатель исключающей способности (Power of exclusion (PE)), отражает. какая доля индивидуумов в популяции, в отношении которых был проведен анализ на основе системы локусов, установил бы исключение родственных связей минимум по одному локусу. PE рассчитывали по формуле: где H – наблюдаемая частота гомозигот; h – наблюдаемая частота гетерозигот (Степанов и др., 2014). Частоты аллелей и другие популяционные характеристики, рассчитывали с помощью программного пакета GenAlEx 6.5 (Peakall, Smouse, 2012), а также PowerStats Ver 1.2. Статистический анализ выявленных гаплотипов проводили с использованием базы данных «YHRD» (Y chromosome haplotype reference database, https://yhrd.org) (Willuweit, Roewer, 2015). 47

Вероятность принадлежности гаплотипа к одной отцовской линии рассчитывали по формуле: где LR – отношение правдоподобия, которое вычисляется по формуле: где p – частота гаплотипа по базе «YHRD». Данная величина показывает отношение вероятности события, что данная группа является действительно родственной группой, к вероятности события, что идентифицируемый объект не имеет родства с этой группой, но случайно подходит к ней по своему профилю ДНК. 48

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Разработка методики выделения аутентичной древней ДНК в условиях повышенной вероятности загрязнения древнего костного материала современной ДНК С целью разработки методики выделения аутентичной дДНК в условиях повышенной вероятности загрязнения древнего костного материала современной ДНК был создан набор деконтаменирующих растворов, позволяющих химическим способом разрушить эндогенную ДНК (Корниенко и др., 2019). Для этого 1-1,5 г. костного порошка, полученного из древних останков (рисунок 8) специально контаминировали 1 мл суспензии клеточной линей HeLa (10 тыс. клеток) (рисунок 9). Далее проводили экстракцию ДНК при помощи стандартной (Корниенко, Харламов, 2012) (рисунок 10) и инновационной методики (рисунок 11). Разработанная методика позволяет успешно удалять чужеродную ДНК в составе археологического костного материала за счет разрушения клеток, в отличие от стандартных методик. Генетические профили, полученные из контаминированных проб, прошедших модифицированный способ очистки и экстракции ДНК полностью соответствуют своим контрольным (не контаминированным) профилям. Таким образом, в результате исследования при использовании новой разработанной методики выделения дДНК можно получить аутентичный генетический профиль индивидуума даже в условиях повышенного риска контаминации современным генетическим материалом. Данный факт играет важную роль в палеогенетических исследованиях человеческих останков, когда возможность загрязнения современным генетическим материалом людей, контактировавших с изучаемым образцом, чрезвычайно высока, а применение разработанной методики выделения дДНК позволяет получить достоверные и воспроизводимые результаты 49

молекулярно-генетических исследований. На данный момент методика апробирована и находится на стадии патентования. Рисунок 8 – Контрольная электрофореграмма – генетический профиль костного образца (проба без контаминации) 50

Рисунок 9 – Контрольная электрофореграмма – генетический профиль клеточной линии HeLa 51

Рисунок 10 – Стандартный метод выделения дДНК после контаминации– генетический профиль костного образца. Красным отмечены аллели HeLa 52

Рисунок 11 – Разработанный метод выделения дДНК после контаминации – аутентичный генетический профиль костного образца 53

3.2 Полиморфные аутосомные древней STR-маркеры микропопуляции эпохи бронзы В результате проведения множественного типирования исследуемых скелетов при помощи наборов COrDIS «ЭКСПЕРТ» «Гордиз» (Россия) (таблица 6, таблица 8) и Identifiler Plus PCR Amplification Kit (США) (таблица 7, таблица 8) получились следующие обобщенные данные аутосомных маркеров 22 скелетов, представленные в таблицах ниже. Образцы с крайне малым содержанием ДНК не исследовались по системе Identifiler Plus, так как получить интерпретируемый результат было маловероятно. В образцах Ерген 81 К3П1 и Ерген 81 К4П3 обнаружена контаминация эндогенной ДНК, следовательно, эти образцы не учитывались в дальнейшем анализе. В результате исследования образцов по локусу Amelogenin, определяющего половую принадлежность, был установлен пол большей части индивидуумов. Было выяллено12 мужчин (Ерген 82 К6 П2, Ерген 81 К3 П4, Ерген 06 К14 G2, Ерген 08 К13 П10А, Ерген 08 К10 П10В, Ерген 81 К4 П5, Ерген 81 К2 П1, Малый Дербент II 07 К1 П2, Малый Дербент II 07 К2 П6, Малый Дербент II 07 К2 П7, Улан-Зуха 90 К3 П8, Улан-Зуха 90 К1 П1) и 4 женщины(Малый Дербент II 07 К1 П9, Малый Дербент II 07 К2 П5, Малый Дербент II 07 К2 П1, Малый Дербент II 07 К1 П6). В четырех образцах, а именно Ерген 82 К6П3, Ерген 82 К5П8, Улан-Зуха 90 К1П3, Малый Дербент II 07 К1П7 определить половую принадлежность не удалось, вследствие не активной ДНК матрицы. Также прослеживается корреляция между размерами локусов и вероятностью получения ПЦР продукта при амплификации дДНК. В ходе проведения анализа аутосомных STR-локусов было выявлено отсутствие ампликонов локусов D1S1656, D10S1248, D22S1045, CSF1PO, SE33, D2S1338. Размер данных локусов варьирует от 240 до 400 п. н., что не характерно для древней и деградированной ДНК. Отсутствие данных локусов вероятно 54

связано с мутацией (мутациями) в месте (местах) специфического отжига праймеров или разрыва данного фрагмента. В связи с низкой концентрацией активной ДНК-матрицы частота аллелей и другие популяционные характеристики древней микропопуляции рассчитывали только по 14 аутосомным STR-локусам: D3S1358, TH01, D12S391, D2S441, D7S820, D13S317, FGA, TPOX, D18S51, D16S539, D8S1179, vWA, D21S11, D19S433. 55

Таблица 6 – Обобщенные результаты типирования STR-локусов аутосомной ДНК и локуса Amelogenin костей курганной группы Ергенинский по системе COrDIS «ЭКСПЕРТ» K6П2 K3П1 K6П3 K5П8 K3П4 K4П3 Ерген 82 Ерген 81 Ерген 82 Ерген 82 Ерген 81 Ерген 81 STR-локус Избавиться от контаминации не удалось Избавиться от контаминации не удалось D3S1358 16,? 15,17 - - - 15,16 TH01 9,? 8,9 - - - - D12S391 - 19,20 - - - 17,21 D1S1656 - 15,15 16,17 - - - D10S1248 - 15,? - - - - D22S1045 - - - - - - D2S441 - 10,11 - - - 11,15 D7S820 - 10,11 - - - 10,? D13S317 - 8,11 - - - - 56

FGA - 22,24 - - - - TPOX - 8,8 - 8,? - 8,12 D18S51 - 15,17 - - - - D16S539 - 9,14 - - - - D8S1179 - 11,12 - - - - CSF1PO - 9,14 - - - - D5S818 - 11,13 - - - - vWA - 14,16 9,? - 16,18 16,18 30,? 29,30 - - - 30,? - 25.2,? - - - - X,Y X,Y X,? - X,Y X,Y Мужской Мужской Мужской Вероятно мужской D21S11 SE33 Amelogenin ПОЛ Не определено Не определено *Примечания: 1. аллели обозначены номерами в соответствии с принятой номенклатурой; 2. «-» - означает отсутствие ПЦР-продукта; «?» - означает, что однозначно определить аллели и аллельные пары не представляется возможным в связи с низкой концентрацией активной ДНК-матрицы 57

Таблица 7 – Обобщенные результаты типирования STR-локусов аутосомной ДНК и локуса Amelogenin костей курганной группы Ергенинский по тест системам Cordis «Эксперт» и Identifiler Plus K14G2 К13П10А К13П10B К4 П5 К2 П1 Ерген 06 Ерген 08 Ерген 08 Ерген 81 Ерген 81 D3S1358 - - 16 16,17 15,16 TH01 - 6,? 6,? 8,9.3 9,9 D12S391 - - - 21,22 24,24 D1S1656 - - - - - D10S1248 - 14,? 14,? - - D22S1045 - - - - - D2S441 - - 10,11 11,11.3 11,11 D7S820 9.2,? - - 7,10 9,10 D13S317 11,? - 11,? - - FGA - 24- - 21,24 - TPOX 8,11 8- 8,11 8,11 - STR-локус 58

D18S51 - 11,24 12,? 12,16 13,13 D16S539 - - - - 11,11 D8S1179 - - 10,? - - CSF1PO - - - - - D5S818 - 13?- - - - vWA - - - 16,16 20,20.1 30,?28 - 30,? - 29,29 - - - - - D2S1338 16,? - - - - D19S433 - 14,? 14,? X,Y X,Y X,Y X,Y X,Y D21S11 SE33 Amelogenin ПОЛ Мужской Мужской Мужской Мужской Мужской *Примечания: 1. аллели обозначены номерами в соответствии с принятой номенклатурой; 2. «-» - означает отсутствие ПЦР-продукта; «?» - означает, что однозначно определить аллельные пары не представляется возможным в связи с низкой концентрацией активной ДНК-матрицы 59

Таблица 8 – Обобщенные результаты типирования костей по 21 STR-локусу аутосомной ДНК и локусу Amelogenin курганной группы Малые Дербенты II и Улан-Зуха по тест системам Cordis «Эксперт» и Identifiler Plus K1П9 STR-локус MД II 07 D3S1358 K2П5 MД II 07 K1П2 MД II 07 K1П3 УланЗуха 90 K1П7 MД II 07 K2П1 MД II 07 K2П6 MД II 07 K1П6 MД II 07 K2П7 MД II 07 K3П8 K1П1 Улан- УланЗуха 90 Зуха 90 15,17 15,17 15,15 - - 15,? 17,18 15,16 18,18 16,16 15,17 8,8 6,8 6,9.3 - - 7,8 7,9.3 6,7 9.3,9.3 8,9.3 6,9.3 D12S391 18,18 21,? 17,22 - - - 17.3,? 18,20 22,? 17,? 17.3,? D1S1656 - - 15.3,16 - - - - 11,16.3 - 12,14 14,15 D10S1248 - - - - - - - 14,16 - - - D22S1045 - - - - - - - 18,? - - - D2S441 11,11 10,14 10,14 - - 10,11 11,11 10,10 - 10,10 11,14 D7S820 10,10 8,9 10,11 - - - 10,10 9,12 9,10 8,10 8,8 D13S317 10,12 11,12 8,11 - - - 9,12 12,13 8,12 11,12 9,9 FGA 21,22 22,22 21,24 - - - 22,22 22,24 24,24 22,24 21,22 TPOX 8,9 8,8 11,11 - - - 8,10 8,8 8,8 9,10 8,8 TH01 60

D18S51 12,15 14,18 14,16 - - 12,14 17,18 17,17 10,16 10,14 13,17 D16S539 12,13 8,12 12,13 - - - - 12,12 9,12 9,11 9,12 D8S1179 11,13 13,13 13,14 - - - 14,14 13,14 12,12 10,13 12,13 CSF1PO 12,12 - - - - - - 11,11 - - 11,? D5S818 10,11 11,12 10,14 - - - 9,12 11,12 10,12 11,12 11,13 vWA 14,14 16,18 17,18 - - 19,? 16,17 17,17 18,18 14,17 16,16 D21S11 27,30 27,28 30,30 - - - 29,32.2 27,29 - 30,33.2 29,31 16,27.2 - - - - - 29.2,? 16,29.2 - 27.2,? 31.2,? D2S1338 17,17 - - - - - - 25,25 - - - D19S433 14,15 12,16 13,13 - - - 13,15 12,15 13,13 14,15.2 12,16 Amelogenin X,X X,X X,Y - - X,X X,Y X,X X,Y X,Y X,Y SE33 Пол Женский Женский Мужской Не Не определен определен Женский Мужской Женский Мужской Мужской Мужской *Примечания: 1. аллели обозначены номерами в соответствии с принятой номенклатурой; 2. «-» - означает отсутствие ПЦР-продукта; «?» - означает, что однозначно определить аллельные пары не представляется возможным в связи с низкой концентрацией активной ДНК-матрицы 61

3.3 Анализ генетических и популяционных характеристик древней микропопуляции эпохи бронзы В результате анализа частоты аллелей аутосомных локусов деградированной ДНК в исследуемой микропопуляции (таблица 9), выявлено что наиболее часто встречающийся аллель для локуса D3S1358 – 15 с частотой 0,35, для локуса TH01 – 9.3 с частотой 0,318, для локуса D12S391 характерно многообразие аллелей с примерно одинаковой частотой встречаемости, однако, аллель 18 выявлен с наибольшей частотой 0,25. В локусе D2S441 исследуемой микропопуляции чаще всего встречался аллель 11 (0,455). Локус D7S820 характеризуется многообразием аллельных вариантов, при этом чаще всего встречался аллель 10 (0,45). Локус D13S317 также имеет большое количество аллельных вариантов, при этом аллель 12 имеет частоту 0,375. В локусе FGA наиболее частым является аллель 22 (0,40), в локусе TPOX –аллель 8 (0,591). Локус D18S51 является наиболее вариабельным в исследуемой древней микропопуляции, чаще всего встречались 14 и 17 аллели (0,167). В локусе D16S539 – 12 аллель (0,438), локусе D8S1179 – 13 аллель 0,438. Локус vWA являлся одним из наиболее вариабельным, однако, аллель 16 встречался с частотой 0,318. Локус D21S11 также проявилл себя как наиболее вариабельный, при этом наиболее часто встречались аллели 29, 30 имея одинаковую частоту (0,278). Для вариабельного локуса D19S433 наиболее характерен аллель 13 (0,313). Разница в частотах аллелей варьирует по локусам от 0,05 до 59,1 %. Для локуса D3S1358 значение наблюдаемой гетерозиготности равно 0,70, что меньше ожидаемой (0,85). Значение вероятности дискриминации неродственных индивидов составляет 0,82, что коррелирует с величиной ожидаемой гетерозиготности данного локуса и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Величина вероятного случайного совпадения гаплотипов по локусу D3S1358 исследуемой древней микропопуляции имеет небольшое значение 0,18, что свидетельствует о 62

низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC локуса D3S1358 составляет 0,68 и показывает значение высокой информативности, что говорит о вариабельности данного локуса. Показатель исключающей способности равен 0,428 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Наблюдаемая гетерозиготность локуса TH01 составляет 0,72, что меньше ожидаемой гетерозиготности (0,89). Значение PD данного локуса составляет 0,876 и коррелирует с величиной ожидаемой гетерозиготности данного локуса. Величина MP исследуемого локуса составляет 0,124, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC локуса TH01 составляет 0,73, что говорит о большой информативности и вариабельности данного локуса. Значение PE составляет 0,472 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. PI составляет 1,83. Наблюдаемая гетерозиготность локуса D12S391 имеет значение 0,60, что существенно ниже ожидаемой величины гетерозиготности (0,81). Величина PD исследуемого локуса составляет 0,80 и коррелирует с величиной ожидаемой гетерозиготности данного локуса. Значение MP локуса D12S391 равно 0,20, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC данного локуса составляет 0,77, что говорит о большой информативности и вариабельности данного локуса. Значение PE составляет 0,291 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. PI составляет 1,25. Наблюдаемая гетерозиготность локуса D2S441 имеет значение 0,55, что существенно ниже ожидаемой величины гетерозиготности (0,77). Величина PD исследуемого локуса составляет 0,810 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Значение MP равно 0,19, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не 63

родственных индивидуумов. Величина PIC локуса D2S441 составляет 0,57, что свидетельствует о наименьшей вариабельности по сравнению с другими локусами. Значение PE составляет 0,230 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. PI составляет 1,10. Локус D7S820 имеет величину наблюдаемой гетерозиготности 0,70, что существенно ниже ожидаемой (0,91). Величина PD исследуемого локуса составляет 0,860 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Значение MP локуса D7S820 равно 0,14, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC составляет 0,66, что свидетельствует о высокой информативности и вариабельности данного локуса. Значение PE составляет 0,472 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. PI составляет 1,83. Наблюдаемая гетерозиготность локуса D13S317 составляет 0,86, что равно ожидаемой гетерозиготности (0,86). Значение PD составляет 0,844 и коррелирует с величиной ожидаемой гетерозиготности данного локуса. Величина MP составляет 0,156, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина локуса PIC D13S317 составляет 0,73, что говорит о большой информативности данного локуса. Значение PE составляет 0,745 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Однако, PI составляет максимальное значение во всех исследуемых локусов – 4,00. Исследуемый локус FGA характеризуется малым разнообразием аллелей. Величина наблюдаемой гетерозиготности составляет 0,66, что значительно ниже ожидаемой (0,85). Величина PD составляет 0,790 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Величина MP составляет 0,2, что свидетельствует о вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC 64

исследуемого локуса составляет 0,56, что говорит о небольшой вариабельности данного локуса в сравнении с другими исследуемыми локусами. Значение PE составляет 0,291 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Величина PI составляет 1,25. Наблюдаемая гетерозиготность локуса TPOX составляет 0,55, что значительно ниже ожидаемой гетерозиготности (0,90). Значение PD составляет 0,760 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Величина MP составляет 0,240, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC локуса TPOX составляет 0,53, что говорит о большой информативности данного локуса и низкой вариабельности по отношению к другим исследуемым локусам древней микропопуляции. Значение PE составляет 0,230 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Величина PI составляет 1,10. Исследуемый локус D18S51 один из наиболее вариабельных в древней микропопуляции. Наблюдаемая гетерозиготность локуса составляет 0,83, что значительно ниже ожидаемой гетерозиготности (0,91). Значение PD составляет 0,917 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Величина MP составляет 0,083, что свидетельствует о крайне низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC локуса составляет 0,87, что говорит о большой информативности данного локуса и высокой вариабельности по отношению к другим исследуемым локусам древней микропопуляции. Значение PE составляет 0,662 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Величина PI составляет 3,00, одна из наиболее высоких по равнению с исследуемыми локусами. 65

Наблюдаемая гетерозиготность локуса D16S539 имеет значение 0,75, что существенно ниже ожидаемой величины гетерозиготности (0,84). Величина PD данного локуса составляет 0,813 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Значение MP равно 0,188, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC исследуемого локуса составляет 0,68, что свидетельствует о высокой информативности и вариабельности данного локуса. Значение PE составляет 0,510 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. PI составляет 2,00. Локус D8S1179 имеет величину наблюдаемой гетерозиготности 0,63, что значительно ниже ожидаемой (0,89). Величина PD составляет 0,844 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Значение MP равно 0,156, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC исследуемого локуса составляет 0,66, что свидетельствует о высокой информативности и вариабельности данного локуса. Значение PE составляет 0,322 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. PI составляет 1,33. Исследуемый локус vWA один из наиболее вариабельных в древней микропопуляции. Наблюдаемая гетерозиготность локуса составляет 0,58, что значительно ниже ожидаемой гетерозиготности (0,93). Значение PD составляет 0,876 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Величина MP составляет 0,124, что свидетельствует о крайне низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC локуса составляет 0,74, что говорит о большой информативности данного локуса и высокой вариабельности по отношению к другим исследуемым локусам древней микропопуляции. Значение PE составляет 66 0,223 и отражает долю

индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Величина PI составляет 1,10. Локус D21S11 также один из наиболее вариабельных в древней микропопуляции. Наблюдаемая гетерозиготность локуса составляет 0,78, что значительно ниже ожидаемой гетерозиготности (0,93). Значение PD составляет 0,875 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Величина MP составляет 0,111, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC локуса составляет 0,77, что говорит о большой информативности данного локуса и высокой вариабельности по отношению к другим исследуемым локусам древней микропопуляции. Значение PE составляет 0,559 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Величина PI составляет 2,25. Наблюдаемая гетерозиготность локуса D19S433составляет 0,75, что значительно ниже ожидаемой гетерозиготности (0,87). Значение PD составляет 0,776 и определяет вероятность различения между двумя несвязанными лицами. Величина MP составляет 0,188, что свидетельствует о низкой вероятности случайного совпадения гаплотипов не родственных индивидуумов. Величина PIC локуса составляет 0,77, что говорит о большой информативности данного локуса и высокой вариабельности по отношению к другим исследуемым локусам древней микропопуляции. Значение PE составляет 0,510 и отражает долю индивидуумов в популяции, у которых исключены родственные связи. Величина PI составляет 2,00. Вероятность случайного совпадения гаплотипов в целом показывает примерно равные величины в исследуемых локусах, в виду неполных генетических профилей. Однако, локус TPOX с наименьшим вариативным рядом аллелей свидетельствовать показывает о том, набольшее что значение исследуемая определенное разнообразие генотипов. 67 0,240. Это может микропопуляция имеет

Наибольшая гетерозиготность представлена у вариабельного локуса D13S317 и составляет 0,86 наименьшая наблюдается у локусов менее полиморфных по числу представленных аллелей локусам D2S441 и TPOX со значением 0,55. Усредненная гетерозиготность микропопуляции H = 0,69. Величина ожидаемой гетерозиготности имеет наибольший показатель 0,93 у локусов с наибольшей вариабельностью vWA и D21S11. Наименьшая ожидаемая гетерозиготность 0,77 установлена у наименее полиморфного локуса D2S44. Усредненная ожидаемая гетерозиготность микропопуляции Hожид = 0,87. Исходя из полученных данных, встречаемый гетерозиготный вариант аллелей меньше ожидаемого на 18 %. Однако, невозможно полностью утверждать данный факт, из-за возможного выпадения аллелей и не полных генетических профилей исследуемых индивидов. Стоит отметить, что при работе с древней и деградированной ДНК это не редкость и интерпретировать полученные результаты следует с долей вероятности. Такое расхождение полученных данных связано с малым объемом выборки. В дальнейшем при увеличении объема выборки, данные показатели будут скорректированы. Уровень вероятности дискриминации неродственных индивидов, отражающий вероятность несовпадения генотипов у неродственных индивидов, показывает примерно одинаковые величины, однако в наиболее полиморфном локусе D18S51 величина несовпадения генотипов наибольшая 0,917. Наименьшая величина 0,760 соответствует менее полиморфному локусу TPOX. Величина PIC зависит от числа известных или установленных аллелей и распределения их частот. Данный показатель эквивалентен генному разнообразию. В нашем исследовании PIC приблизительно равное 0,5 характерно для локусов D2S441 (0,57), FGA (0,56) и TPOX (0,53). При этом данные локусы не отличались большой вариабельностью и распределению частот, в то время как локус D18S51 имеет величину PIC 0,87, что 68

подтверждает его вариабельность в исследуемой микропопуляции эпохи бронзы. Величина PI показывает возможность того, как могли бы наследоваться локусы в микропопуляции. Локус D13S317 имеет наибольшее значение данной вероятности – 4,00. Частоты генотипов древней микропопуляции и мировых популяций представлены в приложении (таблица 1 12). Значение частот распространенных аллелей показали приблизительно одинаковое значение для большинства локусов в популяциях различной этнической принадлежности, однако есть локусы, в которых распределение частот отличается. Сочетание аллелей 15,17 локуса D3S1358 имеет большую частоту в исследуемой древней микропопуляции, которое чаще всего представлено в азиатской популяции (Shao et al., 2015; Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019). Генетические профили (6, 9.3) локуса TH01 наиболее часто встречаются в исследуемой древней микропопуляции, которые чаще представлены в европейской популяции (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019). Аллель 17.3 локуса D12S391, который наиболее часто встречается в исследуемой микропопуляции эпохи бронзы, чаще представлен в популяции европеоидного типа. Для локуса D2S441 характерно сочетание аллелей 11, 11, что соответствует частой встречаемости для азиатской популяции. Сочетание аллелей 10,10 локуса D7S820 часто встречаемое в исследуемой популяции, также имеет высокую частоту в африканской популяции. Для локуса D13S17 наиболее часто встречаются аллели 11,12, что характерно для азиатской популяции. В локусе FGA часто встречаются аллели 21,22, что характерно для европейской популяции. Сочетание аллелей 8,8 характерное для локуса TROX часто представлено в азиатской популяции. Разнообразное сочетание генотипов локуса D18S51 не позволяет провести сравнение с существующими 69

популяциями, т.к. различные генотипы встречались один раз. Сочетание аллелей 12,13 локуса D16S539 наиболее часто представлено в европейской популяции. Для локуса D8S1179 наиболее характерно сочетание аллелей 13,14, которое чаще всего представлено в африканской популяции. Для локуса vWA чаще всего характерны генотипы (16,16) и (16,18), что соответствует африканской популяции (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019). Для локуса D21S11 наиболее характерен аллель 30, что соответствует американской популяции (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018). Для локуса D19S433 наиболее характерно сочетание аллелей 13, 13 что характерно для азиатской популяции. В целом, для исследованной нами древней микропопуляций наиболее характерен спектр аллельных частот типичный для популяций Азии, Европы и Африки. Наиболее часто встречаются сочетания аллелей азиатской и европейской популяции. Полученные нами результаты позволяют предположить, что носители восточно маныческой катакомбной культуры эпохи ранней бронзы, чьи костные останки были исследованы в рамках данной работы, могли мигрировать на территорию современной Европы и Азии и являться одними из предков современных носителей европейской и азиатской популяции. 70

Таблица 9 – Генетические и популяционные характеристики микропопуляции эпохи бронзы Ергенинской возвышенности Локус Частоты аллелей 15 16 17 18 0,35 0,25 0,25 0,15 D3S1358 6 7 8 9 0,136 0,273 0,910 17.3 18 20 21 22 24 0,10 0,05 0,25 0,10 0,10 0,20 0,20 D12S391 10 11 11.3 14 0,364 0,455 0,045 0,136 D2S441 8 9 9.2 10 0,182 0,010 0,455 11 D13S317 8 9 10 11 MP PIC PE PI 0,70 0,85 0,820 0,180 0,68 0,428 1,67 0,72 0,89 0,876 0,124 0,73 0,472 1,83 0,60 0,81 0,800 0,200 0,77 0,291 1,25 0,55 0,77 0,810 0,190 0,57 0,230 1,10 0,70 0,91 0,860 0,140 0,66 0,472 1,83 0,86 0,86 0,844 0,156 0,73 0,745 4,00 12 D7S820 0,045 0,227 PD 0,318 17 7 Hожид 9.3 TH01 0,182 Hi 0,045 0,045 12 13 71

0,125 0,188 0,063 0,188 0,375 0,063 21 22 24 0,200 0,400 0,300 FGA 8 9 10 11 0,591 0,091 0,091 0,227 TPOX 10 D18S51 11 12 13 14 15 16 17 18 8 9 11 12 13 0,063 0,188 0,188 0,438 0,125 10 11 12 13 14 D16S539 D8S1179 vWA D21S11 0,063 0,188 0,438 0,85 0,790 0,200 0,56 0,291 1,25 0,55 0,90 0,760 0,240 0,53 0,230 1,10 0,83 0,91 0,917 0,083 0,87 0,662 3,00 0,75 0,84 0,813 0,188 0,68 0,510 2,00 0,63 0,89 0,844 0,156 0,66 0,322 1,33 24 0,0 0,0 0,12 0,12 0,16 0,0 0,12 0,16 0,0 0,0 83 42 5 5 7 42 5 7 83 42 0,063 0,66 0,25 9 14 16 17 18 19 20 20.1 0,01 0,13 6 0,31 8 0,22 7 0,22 7 0,01 0,0 45 0,045 0,58 0,93 0,876 0,124 0,74 0,230 1,10 27 28 32.2 33.2 0,78 0,93 0,875 0,111 0,77 0,558 2,25 29 30 31 72

0,167 D19S433 0,111 0,278 0,278 0,056 0,056 0,056 12 13 14 15 15.2 16 0,188 0,313 0,125 0,188 0,063 0,125 0,75 0,87 0,776 0,188 0,77 0,510 *Примечания: Hi – наблюдаемая гетерозиготность, Hожид – ожидаемая гетерозиготность, PD –вероятность дискриминации неродственных индивидов, MP – вероятность случайного совпадения гаплотипов, PIC – информационное содержание полиморфизма, PE – исключающая способность, PI – индекс отцовства 73 2,00

3.4 Определение возможной кровнородственной связи скелетов курганной группы Малые Дербенты II, Улан-Зуха и Ергенинский Оценка результатов исследования STR-локусов аутосомной ДНК костей скелетов Ерген 82 К6П2, Ерген 82 К6П3, Ерген 82 К5П8, Ерген 81 К3П4, Ерген 06 К14G2, Ерген 08 К13П10А, Ерген 08 К13П10В по системам COrDIS «Эксперт» и Identifiler Plus показала практическую нулевую концентрацию активной ДНК-матрицы, что является недостаточным для установления возможных кровнородственных связей данных скелетов. Оценка результатов исследования STR-локусов аутосомной ДНК костей скелетов Ерген 81 К3П1, Ерген 81 К4П3 по тест системам Cordis «Эксперт» и Identifiler Plus показала контаминацию эндогенной ДНК, вследствие этого данные образцы не учитывались при исследовании. Оценка результатов исследования STR-локусов аутосомной ДНК и локуса Amelogenin костей скелетов Ерген 81 К2П1 и Ерген 81 К4П5 по системам Cordis «Эксперт» и Identifiler Plus показала совпадение аллелей некоторых исследуемых локусов. В связи с низкой концентрацией активной ДНК-матрицы, устойчивый результат типирования скелета Ерген 81 К2П1 получен только по 9 аутосомным STR-локусам: D3S1358 – 15,16; TH01 – 9,9; D12S391 – 24,24; D2S441 – 11,11; D7S820 – 9,10; D18S51 – 13,13; D16S539 – 11,11; vWA – 20,20.1; D21S11 – 29,29. В связи с низкой концентрацией активной ДНК-матрицы, устойчивый результат типирования скелета Ерген 81 К4П5 получен также только по 9 аутосомным STR-локусам: D3S1358 – 16,17; TH01 – 8,9.3; D12S391 – 21,22; D2S441 – 11,11.3; D7S820 – 7,10; FGA – 21,24; TPOX – 8,11; D18S51 – 12,16; vWA – 16,16. Сравнительный молекулярно-генетический анализ по 7 аутосомным микросателлитным локусам системы COrDIS «ЭКСПЕРТ» и Identifiler Plus показал, что по 4 локусам (TH01, D12S391, D18S51, vWA) выявлены несовпадения в аллельных парах для скелетов Ерген 81 К2П1 и Ерген 81 К4П5 (таблица 10). Полученный результат позволяет исключить близкое родство

типа «отец-сын» между скелетами Ерген 81 К2П1и Ерген 81 К4П5. Совпадение аллелей делает возможным тот факт, что родство мужчин, чьи кости из скелетов Ерген 81 К2П1 и Ерген 81 К4П5 были исследованы, не исключено. Таблица 10 – Сравнительный молекулярно-генетический анализ по 7 аутосомным микросателлитным локусам системы COrDIS «Эксперт» и Identifiler Plus К4 П5 К2 П1 Ерген 81 Ерген 81 D3S1358 16,17 15,16 TH01 8,9.3 9,9 D12S391 21,22 24,24 D2S441 11,11.3 11,11 D7S820 7,10 9,10 D18S51 12,16 13,13 vWA 16,16 20,20.1 Локус *Примечания: 1. аллели обозначены номерами в соответствии с принятой номенклатурой; 2. серым обозначены несовпадающие аллели Результаты молекулярно-генетического исследования микросателлитных локусов Y-хромосомы исследуемых костей Ерген 81 К2П1 и Ерген 81 К4П5 представлены в таблице 11. В результате молекулярно-генетического исследования STR-локусов Yхромосомы скелетов Ерген 81 К2П1 и Ерген 81 К4П5 по 8 локусам (DYS456, DYS389I, DYS385 a, DYS385 b, DYS393, DYS391, DYS437, DYS448) установлено совпадение Y-гаплотипов. По одному локусу (DYS439) выявлено аллельное несовпадение. 75

Таблица 11 – Результаты исследования STR-локусов Y-хромосомы образцов Ерген 81 К4 П5 и Ерген К2 П1 Локусы Y-хромосомы К4 П5 К2 П1 Ерген 81 Ерген 81 DYS456 16 16 DYS389I 13 13 DYS390 24 - - 28 DYS458 16 - DYS19 14 - DYS385 a 11 11 DYS385 b 14 14 DYS393 12 12 DYS391 11 11 DYS439 12 13 DYS635 23 - DYS392 14 - - 13 DYS437 15 15 DYS438 12 - DYS448 19 19 DYS447 25 - DYS449 29 - DYS576 - - DYS389II YGATA H4 *Примечания: 1. Аллели обозначены номерами в соответствии с принятой номенклатурой. 2. «-» - обозначает отсутствие ампликонов. 3. Светлосерым выделены совпадающие аллели. 4. Темно-серым выделены несовпадающие аллели 76

В виду того, что для обоснованного вывода о безусловном исключении родства, аллели, не свойственные одному из скелетов (К2П1 или К4П5), должны быть зарегистрированы, как минимум, в двух локусах, патрилинейное родство между ними не исключается. Таким образом скелеты К2П1 и К4П5 могут принадлежать одной патрилинии, т.е. иметь родство по отцовской линии. Расчет вероятности случайного совпадения по STR-локусам Y- хромосомы производили при помощи базы YHRD (https://yhrd.org). Объем базы данных (N) составлял 52509 европейских гаплотипов. Таким образом, исходя из того, что из 52509 европейских гаплотипов в базе YHRD 159 имели гаплотип (DYS456 – 16; DYS389I -13; DYS385 a – 11; DYS385 b – 14; DYS393 – 12; DYS391 – 11; DYS437 – 15; DYS448 - 19), частота данного гаплотипа составляет 1 из 330 (доверительный интервал от 2,5 % до 97,5 % - 1 из 389 – 1 из 283), а вероятность принадлежности скелетов К2П1 и К4П5 к одной патрилинии (отцовской линии) составляет 99,70 %. Cогласно планиграфическому анализу, оба мужчины из курганов 2 и 4 могли происходить из одного кровнородственного клана, различаясь несколько в их социальном статусе. Статус погребенного из кургана 2, расположенного с восточной стороны, под собственной персональной насыпью, в глубокой погребальной камере, с ценными орудиями труда из бронзы и камня был явно выше статуса, погребенного из кургана 4, расположенного в западном конце цепочки курганов. Это наблюдение, основанное на пространственном анализе погребальных сооружений, подтверждается результатом ДНК-анализа, установившим их родство по отцовской линии. Стоит отметить, что мужчины, чьи кости из скелетов К2П1 и К4П5 представлены на исследование, предположительно имеют гаплогруппу R1b, которая характерна для современного населения Западной Европы. Согласно данным ресурса «YHRD» (Willuweit, Roewer, 2007) из всех зарегистрированных в Евразии восьмилокусных гаплотипов среди современного населения (DYS456 - 16; DYS389I - 13; DYS385a - 11; DYS385b 14; DYS393 - 12; DYS391 - 11; DYS437 - 15; DYS448 - 19) 72,2 % относится к 77

Европе, а 27,8 % – к Азии. Наибольшее распространение указанных гаплотипов – 64,4 % наблюдается в центральной части Западной Европы: на территориях Польши, Австрии и Германии. При этом на долю Австрии (австрийцы) приходится максимальная частота этого гаплотипа в популяции – 1,78 %, тогда как по остальным регионам Европы средняя частота этого восьмилокусного гаплотипа составляет 0,33 %. В Азии тенденциально наибольшую частоту данный восьмилокусный гаплотип проявляет среди йеменских евреев в Йемене и среди иракцев в Ираке (рисунок 12). Рисунок 12 – Относительная (темные столбцы) и абсолютная (светлые столбцы) частоты гаплотипа (DYS456 – 16; DYS389I -13; DYS385a – 11; DYS385b – 14; DYS393 – 12; DYS391 – 11; DYS437 – 15; DYS448 - 19) в Евразии по данным ресурса «YHRD» Полученные нами результаты позволяют предположить, что носители восточно-манычского варианта катакомбной культуры эпохи ранней бронзы, чьи костные останки были подвергнуты анализу были представителями одной 78

кровнородственной группы. Родство их прослеживается по мужской линии. При этом по наличию гаплогруппы R1b они были родственны предкам современных носителей этой гаплогруппы в Центральной Европе. Оценка результатов исследования STR-локусов аутосомной ДНК костей скелетов Кургана 1 Малые Дербенты II 07 показала следующие данные: между K1П2 и K1П6 – близкое родство типа «отец-дочь» или «мать-сын» не обнаружено. Между K1P2 и K1P9– близкое родство типа «отец-дочь» или «мать-сын» не обнаружено. Между K1P6 и K1P9– близкое родство типа «матьдочь» или «дочь-мать» не обнаружено. Из представленного биоматериала K1П7 генетический профиль установить не удалось. Исследование кургана 2 курганной группы Малые Дербенты II 07 показало, что образец К2П1 имеет плохое качество препаратов аутосомной ДНК, что не позволяет проводить дальнейшие исследования. Между K2PП5 и K2П6 близкое родство типа «отецдочь» или «мать-сын» не обнаружено. Между K2П5 и K2П7 близкое родство типа «отец-дочь» или «мать-сын» не обнаружено. Между K2П6 и K2П7 близкое родство типа «отец-сын» или «сын-отец» не обнаружено. Оценка результатов исследования STR-локусов аутосомной ДНК костей скелетов Кургана 1 курганной группы Улан-Зуха 90 показала, что образец К1П3 имеет плохое качество препаратов аутосомной ДНК, что не позволяет проводить дальнейшие исследования и установить родство с К1П1 не представляется возможным. При исследовании кургана 3 курганной группы Улан-Зуха 90 выявлено, что скелет К3П8 представлен единичным образцом данного кургана и с К1П1 родства не имеет. 79

ВЫВОДЫ 1) Разработанная методика выделения аутентичной древней ДНК в условиях повышенной вероятности загрязнения древнего костного материала современной ДНК позволяет избавиться от чужеродного ДНК-содержащего биологического материала в составе клеток за счет дополнительного разрушения мембран, в отличие от стандартных методик, а также получить достоверные результаты молекулярно-генетического исследования. 2) Анализ аутосомных STR-локусов показал низкую активность ДНКматрицы, были выявлены наиболее полиморфны локусы: D7S820, D18S51, vWA, D21S11. Отсутствие ампликонов локусов D1S1656, D10S1248, D22S1045, CSF1PO, SE33, D2S1338 вероятно связано с деградацией древней ДНК-матрицы и мутацией (мутациями) в месте (местах) специфического отжига праймеров или разрыва данного фрагмента. 3) STR анализ образцов по локусу Amelogenin установил пол большей части индивидуумов. Было выявлено 12 мужчин (Ерген 82 К6П2, Ерген 81 К3П4, Ерген 06 К14G2, Ерген 08 К13П10А, Ерген 08 К10П10В, Ерген 81 К4 П5, Ерген 81 К2П1, Малый Дербент II 07 К1П2, Малый Дербент II 07 К2П6, Малый Дербент II 07 К2П7, Улан-Зуха 90 К3П8, Улан-Зуха 90 К1П1) и 4 женщины(Малый Дербент II 07 К1П9, Малый Дербент II 07 К2П5, Малый Дербент II 07 К2П1, Малый Дербент II 07 К1П6). В четырех образцах, а именно Ерген 82 К6П3, Ерген 82 К5П8, Улан-Зуха 90 К1П3, Малый Дербент II 07 К1П7 определить половую принадлежность не удалось, вследствие не активной ДНК матрицы. 4) STR анализ Y хромосомы выявил родство исследуемых скелетов Ерген 81 К2П1 и Ерген 81 К4П5 по отцовской линии с вероятностью 99,70 %. Родство среди других исследуемых 18 скелетах выявлено не было. 5) Общий встречаемый гетерозиготный вариант аллелей исследуемой микропопуляции меньше общего ожидаемого на 18 %. В наиболее полиморфном локусе D18S51 величина PD наибольшая 0,917. Наименьшая величина 0,760 соответствует менее полиморфному локусу TPOX. Величина 80

MD в целом показывает примерно равные величины, в виду неполных генетических профилей. Локус TPOX с наименьшим вариативным рядом аллелей показывает набольшее значение MD – 0,240. Локус D18S51 имеет величину PIC 0,87, что подтверждает его вариабельность в исследуемой микропопуляции эпохи бронзы. Локус D13S317 имеет наибольшее значение PI и – 4,00. 6) Анализ частот генотипов исследуемой древней микропопуляции и современных популяций свидетельствует о том, что носители восточноманыческой катакомбной культуры эпохи ранней бронзы, чьи костные останки были исследованы в рамках данной работы, могли мигрировать на территорию современной Европы и Азии и являться одними из предков современных носителей европейской и азиатской популяции. 7) Мужчины, чьи кости из скелетов Ерген 81 К2П1 и Ерген 81 К4П5 представлены на исследование, предположительно имеют гаплогруппу R1b, современная концентрация которой максимальна на территориях Западной Европы. 81

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Андреева М.В. Восточноманычская катакомбная культура. Анализ материалов погребальных памятников. – М.: Таус, 2014. – 272 с. 2. Вагайцева К.В. Генетическое разнообразие популяций северной Евразии по STR и SNP маркерам X-хромосомы и их ДНК-идентификационный потенциал: Дис… канд. биол. Наук. – Т., 2015. – 223 с. 3. Гаевский Н.А. Знакомство с эволюционной генетикой: Учеб. – метод. пособие. – Красноярск: Изд-во Краснояр. гос. ун-т, 2002. – 53 с. 4. Корниенко И.В, Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека: выделение ДНК, ее качественная и количественная оценка в аспекте судебномедицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения. – Ростов н/Д.: Изд-во ЮФУ, 2012. – 216 с. 5. Е.В., Корниенко И.В, Фалеева Т.Г., Орешкова Н.В., Григорьев Л.С., Григорьева Путинцева Ю.А., Крутовский K.В. Структурно-функциональная организация контрольного района митохондриальной ДНК шерстистого мамонта (Mammuthus primigenius) // Молекулярная биология. – 2019. – Т. 53, №. 4. – С. 627-637. 6. Корниенко И.В., Фалеева Т.Г., Махоткин М.А., Андриянов А.И., Арамова О.Ю. Инновационный метод выделения древней ДНК // Материалы Междунар. научной конф. «Азак и мир вокруг него» / Азов: Тез. докл. – 2019. – С. 268-271. 7. Мильков Ф.Н, Гвоздецкий Н.А, Физическая география СССР. М.: Мысль, 1976. – С. 263-264. 8. Очир-Горяева М.А. Археологические памятники волго-манычских степей: (свод памятников, исследованных на территории Республики Калмыкия в 1929–1997 гг.). Элиста: Герел, 2008. – 298 с. 9. Очир-Горяева М.А. Древние некрополи Ергенинской возвышенности. – Элиста: Директ-Медиа, 2017. – 420 с. 10. Очир-Горяева М.А., Кекеев Э.А., Буратаев Е.Г. Палеоантропологический и палеозоологический материалы из раскопок на территории Республики Калмыкия: сбор, изучение, хранение // Из истории культуры народов Северного 82

Кавказа. Научный альманах / под ред. Прокопенко Ю.А., Невской Т.А. – Ставрополь: Печатный Двор, 2018. - С. 127-137. 11. Степанов В.А., Харьков В.Н., Трифонова Е.А., Марусин А.В. Методы статистического анализа в популяционной и эволюционной генетике человека. – Томск: «Печатная мануфактура», 2014. – 100 с. 12. Шилов В.П. Курганный могильник у с. Цаца // Древности Калмыкии. Элиста: Калмыцкий НИИ истории, филологии и экономики при Совете Министров Калмыцкой АССР. - 1985. – С. 94–140. 13. Шилов В. П., Цуцкин Е. В. Исследования ВолгоДонской экспедиции // Археологические открытия. М.: Наука, 1986. – С. 125–161. 14. Шишлина Н.И. Северо-западный Прикаспий в эпоху бронзы (V-III тысячелетия до н.э.). Труды Государственного Исторического музея. Выпуск 165 М.: ГИМ, 2007. – 399 с. 15. Allendorf F. W., Luikart G. Conservation and the Genetics of Populations. – Madlen: Blackwell publishing, 2007. –642 p. 16. Allentoft M. E. et al. Population genomics of bronze age Eurasia // Nature. – 2015. – Vol. 522, №. 7555. – P. 167. 17. Alves C., Gusmão L., Damasceno A., Soares B., Amorim A. Contribution for an African autosomic STR database (AmpF/STR Identifiler and Powerplex 16 System) and a report on genotypic variations // Forensic science international. – 2004. – Vol. 139, №. 2-3. – P. 201-205. 18. Athey T.W. Haplogroup prediction from Y-STR values using an allele frequency approach // J. Genet. Geneal. – 2005. – Vol. 1, №. 2. – P. 1-7. 19. Botstein D., White R. L., Skolnick M., Davis R. W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // American journal of human genetics. – 1980. – Vol. 32, №. 3. – P. 314. 20. Brown T. A. Allaby R. G., Brown K. A., O'Donoghue K., Sallares R. DNA in wheat seeds from European archaeological sites // Experientia. – 1994. – Vol. 50, №. 6. – P. 571-575. 83

21. Brundin M., Figdor D., Sundqvist G., Sjögren U. DNA binding to hydroxyapatite: a potential mechanism for preservation of microbial DNA // Journal of endodontics. – 2013. – Vol. 39, №. 2. - P. 211-216. 22. Burge S., Parkinson G. N., Hazel P., Todd A. K., Neidle S. Quadruplex DNA: sequence, topology and structure // Nucleic acids research. – 2006. – Vol. 34, №. 19. – P. 5402-5415. 23. Cassidy L. M., Martiniano R., Murphy E. M., Teasdale M. D., Mallory J., Hartwell B., Bradley D. G. Neolithic and Bronze Age migration to Ireland and establishment of the insular Atlantic genome // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2016. – Vol. 113, №. 2. – P. 368-373. 24. Collins T. M., Naylor G. J. P., Brown W. M. Hydrophobicity and phylogeny // Nature. – 1995. – Vol. 373, №. 6515. – P. 565-566. 25. Curic G. V.Gasic, Pluzaric V., Smiljcic D. Genetic parameters of five new European Standard Set STR loci (D10S1248, D22S1045, D2S441, D1S1656, D12S391) in the population of eastern Croatia // Croatian medical journal. – 2012. – Vol. 53, №. 5. – P. 409. 26. Dabney J., Meyer M., Pääbo S. Ancient DNA damage // Cold Spring Harbor perspectives in biology. – 2013. – Vol. 5, №. 7. – P. a012567-a012673. 27. Dicks K. L., Webster L. M. I., McDowall I., Muya S. M., Hopper J., O'Donoghue P. Validation studies on dinucleotide STRs for forensic identification of black rhinoceros Diceros bicornis // Forensic Science International: Genetics. – 2017. – Vol. – P. e25-e27. 28. Elliot A. J., McGregor H. A., Thrash T. M. 16: The Need for Competence // Handbook of self-determination research. – 2002. – P. 361-388. 29. Emmerova B., Ehler E., Comas D., Votrubova J., Vanek D. Comparison of Y- chromosomal haplogroup predictors // Forensic Science International: Genetics Supplement Series. – 2017. – Vol. 6. – P. e145-e147. 30. Endicott P., Ho S. Y.W., Metspalu M., Stringer C. Evaluating the mitochondrial timescale of human evolution // Trends in ecology & evolution. – 2009. – Vol. 24, №. 9. – P. 515-521. 84

31. Evershed R., Mottram H., Harden S., Charters S., Stott A. W., Lawrence G., Gibson A., Conner A., Blinkhorn P., Reeves, V. New Criteria for the Identification of Animal Fats Preserved in Archaeological Pottery // Naturwissenschaften. – 1997. – Vol. 84. – P. 402-406. 32. Fu Q., Fu L., Paabo S. et al. Genome sequence of a 45,000-year-old modern human from western Siberia // Nature. – 2014. – Vol. 514, №. 7523. – P. 445-449. 33. Gamba C., Jones R., Teasdale M. D., McLaughlin R. L., Gonzalez-Fortes G., Mattiangeli V., Domboróczki L., Kővári I., Pap I., Anders A., Whittle A., Dani J., Raczky P., Higham T. F. G., Hofreiter M., Bradley D. G., Pinhasi R., Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory // Nature communications. – 2014. – Vol. 5. – P. 5257. 34. Gettings K. B., Borsuk L. A., Steffen C. R., Kiesler K. M., Vallone P. M. Sequence-based US population data for 27 autosomal STR loci // Forensic Science International: Genetics. – 2018. – Vol. 37. – P. 106-115. 35. Gilbert M.T. P., Bandelt H.J., Hofreiter M., Barnes I. Assessing ancient DNA studies // Trends in ecology & evolution. – 2005. – Vol. 20, №. 10. – P. 541-544. 36. Gilbert, M.T.P., Rudbeck, L., Willerslev, E., Hansen, A.J., Smith, C., Penkman, K.E.H., Prangenberg, K., Nielsen-Marsh, C.M., Jans, M.E., Arthur, P. Biochemical and physical correlates of DNA contamination in archaeological human bones and teeth excavated at Matera // J. Archaeol. Sci. – 2005. – Vol.32. – P. 785– 793. 37. Goloubinoff P., Paabo S., Wilson A. C. Evolution of maize inferred from sequence diversity of an Adh2 gene segment from archaeological specimens // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1993. – Vol. 90. – P. 1997-2001. 38. Green R. E., Krause J., Briggs A. W. et al. A draft sequence of the Neandertal genome // Science. – 2010. – Vol. 328, №. 5979. – P. 710-722. 39. Haak W, Brandt G, de Jong HN, Meyer C, Ganslmeier R, Heyd V, et al. Ancient DNA, Strontium isotopes, and osteological analyses shed light on social and kinship organization of the Later Stone Age // Proc Natl Acad Sci. – 2008. – Vol. 105. – P. 18226–18231 85

40. Higuchi R., Bowman B., Freiberger M., Ryder O. A., Wilson A. C. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family // Nature. – 1984. – Vol. 312, №. 5991. – P. 282-284. 41. Ivanov P., Gill P., Sullivan K., Kimpton С., Piercy R., Benson N., Tully G., Evett I., Mannuccia A. DNA testing of bone mate rial as a means of establishing the authenticity of the putative remains of tsar Nicolas II // Adv. Forens. Sci. – 1995. – Vol. 6. – P. 156-166. 42. Iyavoo S., Afolabi O., Boggi B., Bernotaite A., Haizel T.Population genetics data for 22 autosomal STR loci in European, South Asian and African populations using SureID® 23comp Human DNA Identification Kit // Forensic science international. – 2019. – Vol. 301. – P. 174-181. 43. Janica J. Genetic variation of STR loci D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX and FGA by GenePrint PowerPlex 16 in a Polish population // Forensic Science International. – 2006. – Vol. 159. – P. 241-243. 44. Jans M., Nielsen-Marsh C.M., Smith C., Collins M., Kars H. Characterisation of microbial attack on archaeological bone // Journal of Archaeological Science. – 2004. – Vol. 31, №. 1. – P. 87-95. 45. Jones E. R., Gonzalez-Fortes G. et al. Upper Palaeolithic genomes reveal deep roots of modern Eurasians // Nature communications. – 2015. – Vol. 6, №. 1. – P. 18. 46. Jónsson H. et al. Speciation with gene flow in equids despite extensive chromosomal plasticity // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2014. – Vol. 111, №. 52. – P. 18655-18660. 47. Kim S., Park H., Kim. J, Nam Y., Kim H. Y., Park J., Chung U., Lee J., Lee S., Park S. Allele frequency data of 20 STR loci in 2000 Korean individuals // Forensic Science International: Genetics Supplement Series. – 2017. – Vol. 6. – P. e65-e68. 48. Kornienko I. V., Vodolazhsky D. I., Ivanov P. L. Genetic variation of the nine Profiler Plus loci in Russians // Int. J Legal Med. – 2002. – Vol. 116. – P. 309-311. 86

49. Lazaridis I., Patterson N. et al. Ancient human genomes suggest three ancestral populations for present-day Europeans // Nature. – 2014. – Vol. 513, №. 7518. – P. 409-413. 50. Leney M. D. Sampling Skeletal Remains for Ancient DNA (aDNA): A Measure of Success // Historical Archaeology. – 2006. – Vol. 40, № 3. – P. 31-49. 51. Liang H., Severin N., Fugmann S., Sokolov I. M., Rabe J. P. Statistics of time- dependent rupture of single ds-DNA // The Journal of Physical Chemistry B. – 2013. – V. 117, №. 29. – P. 8875-8879. 52. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. – 1993. – Vol. 362, №. 6422. – P. 709-715. 53. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. – 1993. – Vol. 362, №. 6422. – P. 709-715. 54. Malaspinas A. S., Lao O. et al. Two ancient human genomes reveal Polynesian ancestry among the indigenous Botocudos of Brazil // Current Biology. – 2014. – Vol. 24, №. 21. – P. R1035-R1037. 55. Mathieson I., Lazaridis I. et al. Genome-wide patterns of selection in 230 ancient Eurasians // Nature. – 2015. – Vol. 528, №. 7583. – P. 499-503. 56. McVicker G., Gordon D., Davis C., Green P. Widespread genomic signatures of natural selection in hominid evolution // PLoS genetics. – 2009. – Vol. 5, №. 5. 57. Miller W., Drautz D. I., Ratan A., Pusey B., Qi J., Lesk A. M., Tomsho L. P., Packard M. D., Zhao F., Sher A., Tikhonov A., Raney B., Patterson N., Lindblad-Toh K., Lander E. S., Knight J. R., Irzyk G. P., Fredrikson K. M., Harkins T. T., Sheridan S., Pringle T., Schuster S. C. Sequencing the nuclear genome of the extinct woolly mammoth // Nature. – 2008. – Vol. 456. – P. 387–390. 58. Montelius K., Karlsson A. O., Holmlund G. STR data for the AmpFℓSTR Identifiler loci from Swedish population in comparison to European, as well as with non-European population // Forensic Science International: Genetics. – 2008. – Vol. 2, №. 3. – P. e49-e52. 87

59. Mullis K. B., Faloona F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Recombinant DNA Methodology. – Academic Press, 1989. – P. 189-204. 60. Nielsen H. B. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes // Nature biotechnology. – 2014. – Vol. 32, №. 8. – P. 822-828. 61. Nijweide P. J., Burger E. H., Feyen J. H. Cells of bone: proliferation, differentiation, and hormonal regulation // Physiological reviews. – 1986. – Vol. 66, №. 4. – P. 855-886. 62. Okazaki T. Okazaki furaguments and discontinuous replication // Seikagaku. The Journal of Japanese Biochemical Society. – 2002. – Vol. 74, №. 2. – P. 103-117. 63. Olalde I., Allentoft M. E. et al. Derived immune and ancestral pigmentation alleles in a 7,000-year-old Mesolithic European // Nature. – 2014. – Vol. 507, №. 7491. – P. 225-228. 64. Orlando L., Hänni C., Douady C. J. Mammoth and Elephant Phylogenetic Relationships: Mammut Americanum, the Missing Outgroup // Evol Bioinform Online. – 2007. – Vol. 3. – P. 45–51. 65. O'Rourke D. H., Carlyle S. W., Parr R. L. Ancient DNA: methods, progress, and perspectives // American Journal of Human Biology: The Official Journal of the Human Biology Association. – 1996. – Vol. 8, №. 5. – P. 557-571. 66. O'Rourke D. H., Hayes M. G., Carlyle S. W. Ancient DNA studies in physical anthropology // Annual Review of Anthropology. – 2000. – Vol. 29, №. 1. – P. 217242. 67. Paabo S. Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1989. – Vol. 86, №. 6. – P. 1939-1943. 68. Paabo S. Molecular cloning of ancient Egyptian mummy DNA // Nature. – 1985. – Vol. 314, №. 6012. – P. 644-645. 88

69. Paabo S., Irwin D. M., Wilson A. C. DNA damage promotes jumping between templates during enzymatic amplification // Journal of Biological Chemistry. – 1990. – Vol. 265, №. 8. – P. 4718-4721. 70. Paabo S., Poinar H., Serre D., Jaenicke-Després V., Hebler J., Rohland N., Kuch M., Krause J., Vigilant L., Hofreiter M. Genetic Analyses from Ancient DNA // Annu Rev Genet. – 2004. – Vol. 38, №. 1. – P. 645-679. 71. Peakall R., Smouse P. E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research – an update // Bioinformatics. – 2012. – Vol. 28, №. 19. – P. 2537–2539. 72. Pilav A., Pojskic N., Ahatovic A., Dzehverovic M., Cakar J., Marjanovic D. Allele frequencies of 15 STR loci in Bosnian and Herzegovinian population // Croatian medical journal. – 2017. – Vol. 58, №. 3. – P. 250-256. 73. Pilipenko A.S., Human paleogenetics // Russ J Genet. – 2014. – Vol. 4. – P. 281-291. 74. Rasmussen M. et al. Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo- Eskimo // Nature. – 2010. – Vol. 463, №. 7282. – P. 757-762. 75. Rasmussen S., Allentoft M. E. et al. Early divergent strains of Yersinia pestis in Eurasia 5,000 years ago // Cell. – 2015. – Vol. 163, №. 3. – P. 571-582. 76. Reich D., Paabo S. et al. Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia // Nature. – 2010. – Vol. 468, №. 7327. – P. 1053. 77. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B., Erlich H. A. Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA With a Thermostable DNA Polymerase // Science. – 1988. – Vol. 239, №. 4839. – P. 487491. 78. Schultz M. Paleohistopathology of bone: a new approach to the study of ancient diseases // American Journal of Physical Anthropology: The Official Publication of the American Association of Physical Anthropologists. – 2001. – Vol. 116, №. S33. – P. 106-147. 89

79. Seguin-Orlando A., Korneliussen T. S., Sikora M. et al. Genomic structure in Europeans dating back at least 36,200 years // Science. – 2014. – Vol. 346, №. 6213. – P. 1113-1118. 80. Shao C., Zhang Y., Zhou Y., Zhu W., Xu H., Liu Z., Tang Q., Shen Y., Xie J. Identification and characterization of the highly polymorphic locus D14S739 in the Han Chinese population // Croatian medical journal. – 2015. – Vol. 56, №. 5. – P. 482-489. 81. Shoshani J., Ferretti M., Lister A., Saegusa H., Agenbroad L. D., Mol D., Takahashi K. On the relationships within the Elephantinae using hyoid characters // Quaternary International. – 2007. – Vol. 169. – P. 174-185. 82. Skoglund P., Malmström H., Omrak A, Raghavan M., Valdiosera C., Günther T., Hall P., Tambets K., Parik J., Sjögren K., Apel J., Willerslev E., Storå J. , Götherström A., Jakobsson M. Genomic diversity and admixture differs for StoneAge Scandinavian foragers and farmers // Science. – 2014. – Vol. 344, №. 6185. – P. 747-750. 83. Soltyszewski I., Spolnicka M., Kartasinska E., Konarzewska M., Pepinski W., Janica J. Genetic variation of STR loci D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX and FGA by GenePrint PowerPlex 16 in a Polish population // Forensic Science International. – 2006. – Vol. 159. – P. 241-243. 84. Steffen C. R, Coble, M.D., Gettings, K.B., Vallone, P.M. US Population Data for 29 Autosomal STR Loci // Forensic Science International: Genetics. – 2013. – Vol. 7. – P. e82-e83. 85. Svintradze D. V., Mrevlishvili G. M. Fiber molecular model of atelocollagen– small interfering RNA (siRNA) complex // International journal of biological macromolecules. – 2005. – Vol. 37, №. 5. – P. 283-286. 86. Tillmar A. Populations and Statistics in Forensic Genetics. – Linköping: LiU Tryck, 2010. – 55 p. 90

87. Vernot B., Paabo S. et al. Excavating Neandertal and Denisovan DNA from the genomes of Melanesian individuals // Science. – 2016. – Vol. 352, №. 6282. – P. 235-239. 88. Willuweit S., Roewer L. The new Y chromosome haplotype reference database // Forensic Science International: Genetics. – 2015. – Vol. 15. – P. 43-48. 89. Willuweit S., Roewer L. Y chromosome haplotype reference database (YHRD): update // Forensic science international // Genetics. – 2007. – Vol. 1, №. 2. – P. 83-87. 90. Wolfgang H., Brand G., de Jong H. N., Meyer C., Gansmeyer R., Heyd V., Hawkesworth C., Pike A.W.G., Meller H., Alt K. W. Ancient DNA, Stronzium isotopes, and osteological analyses shed light on social and kinship organization of the Late Stone Age // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2008. – Vol. 105, №. 47. – P. 1822618231. 91. Ye M., Li B., Zhang Y., Li H., Wang X., Hu J. Confined Water Nanofilm Promoting Nonenzymatic Degradation of DNA Molecules // The Journal of Physical Chemistry B. – 2011. – Vol. 115, №. 12. – P. 2754-2758. 91

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Таблица 12 – Распределение частот генотипов исследуемых локусов в древней и мировых популяциях Популяция Древняя микропопуляция Распределение частот генотипов D3S1358 15, ? 15,15 15,16 15,17 16,? 16,16 16,17 17,18 18,18 0,066 0,066 0,205 0,266 0,133 0,066 0,066 0,066 0,066 0,283 0,080 0,115 0,111 0,199 0,040 0,078 0,060 0,023 0,303 0,092 0,230 0,105 0,380 0,144 0,131 0,016 0,022 0,397 0,157 0,242 0,140 0.306 0,094 0,108 0,024 0,010 Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019)

Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 0,305 0,093 0,172 0,124 0,283 0,080 0,116 0,044 0,022 2018) Распределение частот генотипов TH01 Древняя 6,? 6,7 6,8 6,9.3 7,8 7,9.3 8,8 8,9.3 9,? 9,9 9.3,9.3 0,143 0,071 0,071 0,143 0,071 0,071 0,071 0,143 0,071 0,071 0,071 0,248 0,083 0,095 0,178 0,031 0,121 0,008 0,065 0,123 0,015 0,129 0,127 0,087 0,076 0,012- 0,205 0,031 0,089 0,028 0,187 0,034 0,002 0,168 0,084 0,014 0,016 0,020 0,026 0,036 0,038 0,483 0,233 0,002 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) 93

Популяция США 0,196 0,116 0,050 0,080 0,074 0,122 0,032 0,052 0,169 0,029 0,042 (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D12S391 Древняя 17,? 17.3,? 17,22 18,18 18,20 21,? 21,22 22,? 24,24 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,129 0,020 0,026 0,030 0,035 0,101 0,020 0,101 0,001 0,227 0,004 0,030 0,052 0,058 0,049 0,006 0,065 0,0001 0,137 0,003 0,031 0,057 0,049 0,097 0,022 0,114 0,001 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция (Kim et al., 2017; Iyavoo 94

et al., 2019) Популяция США 0,125 0,013 0,017 0,044 0,053 0,101 0,013 0,066 0,001 (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D2S441 Древняя 10,10 10,11 10,14 11,11 11,11.3 11,14 0,181 0,181 0,181 0,272 0,090 0,090 0,030 0,129 0,095 0,138 0,312 0,203 0,004 0,039 0,040 0,097 0,026 0,204 0,075 0,236 0,084 0,187 0,042 0,133 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция 95

(Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США 0,041 0,138 0,092 0,116 0,033 0,154 (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D7S820 Древняя 7,10 8,8 8,9 8,10 9.2,? 9,10 9,12 10,10 10,11 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,18 0,09 0,18 0,09 0,011 0,027 0,061 0,082 – 0,091 0,054 0,062 0,095 0,003 0,035 0,043 0,146 – 0,091 0,016 0,153 0,160 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) 96

Азиатская популяция (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) 0,002 0,021 0,015 0,051 – 0,018 0,025 0,030 0,118 Популяция США 0,078 0,015 0,036 0,057 – 0,138 0,080 0,055 0,064 (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D13S317 Древняя 8,11 8,12 9,9 9,12 10,12 11,? 11,12 12,13 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,064 0,069 0,007 0,050 0,047 0,283 0,173 0,057 0,011 0,014 0,0004 0,016 0,016 0,299 0,230 0,151 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) 97

Азиатская популяция – – 0,020 0,007 0,050 0,232 0,061 0,009 0,056 0,059 0,008 0,054 0,036 0,291 0,177 0,071 (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов FGA Древняя 21,22 21,24 22,22 22,24 24,? 24,24 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,1 0,070 0,055 0,036 0,056 0,149 0,022 0,024 0,032 0,021 0,056 0,191 0,036 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; 98

Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция 0,043 0,041 0,035 0,066 0,177 0,031 0,058 0,040 0,039 0,054 0,137 0,019 (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов TROX Древняя 8,? 8,8 8,9 8,10 8,11 9,10 11,11 0,153 0,307 0,076 0,076 0,230 0,076 0,076 0,246 0,060 0,088 0,045 0,174 0,033 0,126 0,620 0,384 0,091 0,064 0,279 0,008 0,051 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019)) Африканская популяция 99

(Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция 0,4910 0,241 0,107 0,027 0,336 0,005 0,117 Популяция США 0,466 0,217 0,128 0,059 0,229 0,016 0,060 (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D18S51 Древняя 10,14 10,16 11,24 12,? 12,14 12,15 12,16 13,13 13,17 14,16 14,18 17,17 17,18 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 0,004 0,003 – 0,097 0,037 0,027 0,033 0,021 0,026 0,065 0,022 0,008 0,010 0,003 0,002 – 0,118 0,046 0,032 0,027 0,024 0,035 0,044 0,032 0,013 0,019 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; 100

Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция 0,0002 0,0001 – 0,051 0,020 0,016 0,011 0,051 0,029 0,047 0,024 0,004 0,007 0,001 0,001 – 0,094 0,024 0,031 0,028 0,011 0,028 0,038 0,023 0,018 0,023 (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D16S539 Древняя 8,12 9,11 9,12 11,11 12,12 12,13 0,125 0,125 0,25 0,125 0,125 0,25 0,005 0,045 0,070 0,104 0,078 0,093 0,017 0,116 0,078 0,091 0,041 0,048 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция 101

(Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция 0,025 0,099 0,054 0,106 0,047 0,051 0,006 0,083 0,045 0,066 0,019 0,032 (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D8S1179 Древняя 10,? 10,13 11,13 12,12 12,13 13,13 13,14 14,14 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,22 0,11 0,098 0,065 0,045 0,025 0,105 0,110 0.078 0,014 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) 102

Африканская популяция 0,011 0,005 0,004 0,026 0,068 0,045 0.135 0,102 0,124 0,057 0,041 0,023 0,070 0,053 0,079 0,030 0,0787 0,042 0,036 0,020 0,076 0,072 0,125 0,055 (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов vWA Древняя 9,? 14,14 14,17 16,16 16,17 16,18 17,17 17,18 18,18 19,? 20,20.1 0,077 0,077 0,077 0,154 0,077 0,154 0,077 0,077 0,077 0,077 0,077 – 0,010 0,050 0,040 0,102 0,088 0,066 0,114 0,049 0,093 – микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo 103

et al., 2019) Азиатская популяция – 0,043 0,113 0,034 0,101 0,075 0,075 0,050 0,041 0,091 – – 0,002 0,014 0,092 0,087 0,104 0,021 0,016 0,030 0,056 – – 0,009 0,050 0,053 0,121 0,083 0,014 0,006 0,012 – (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Популяция США 0,032 (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D21S11 Древняя 27,28 27,29 27,30 29,29 29,31 29,32.2 30,? 30,28 30,30 30,33.2 0,090 0,090 0,090 0,090 0,090 0,090 0,200 0,090 0,090 0,090 0,011 0,012 0,020 0,027 0,003 0,001 0,282 0,087 0,080 0,022 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; Soltyszewski et all., 2006; 104

Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция 0,052 – – – – – – – – – 0,0001 0,0007 0,001 0,051 0,043 0,011 0,358 0,033 0,128 0,082 0,013 0,016 0,019 0,042 0,033 0,037 0,248 0,082 0,061 0,016 (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) Распределение частот генотипов D19S433 Древняя 12,15 12,16 13,13 13,15 14,? 14,15 14,15.2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1 0,030 0,011 0,045 0,074 0,315 0,110 0,036 микропопуляция Европейская популяция (Montelius et all., 2004; 105

Soltyszewski et all., 2006; Curic et al., 2012; Iyavoo et al., 2019) Африканская популяция 0,017 – 0,105 0,032 0,229 0,022 0,013 0,003 0,001 0,099 0,033 0,278 0,029 0,075 0,020 0,004 0,061 0,058 0,304 0,072 0,035 (Alves et all., 2004; Iyavoo et al., 2019) Азиатская популяция (Kim et al., 2017; Iyavoo et al., 2019) Популяция США (смешанная) (Steffen et all., 2017; Gettings et all., 2018) 106

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

6329.04

Игорь Маслеников

Проныра, озорник, Любитель книг, Ловкач, игрок, Жизнь между строк. И потому Открыт ему Незримый путь В любую суть. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Подсыпать в душу яд Всегда он рад Всего за час Прочтёт он вас. Он волен взять И поменять Строку и с ней Смысл темы всей.Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Открыт роман Читатель пьян Разлив вино - Шагнул в окно. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения.

6329.04

Игорь Маслеников

Танец Злобного Гения КиШ

6329.04

Игорь Маслеников

А теперь я скину тексты своих любимых песен для этого:)

6329.04

Игорь Маслеников

и хорошего настроения

6329.04

Игорь Маслеников

удачи