Штрих-код ДНК, химический состав и антимикробная активность эфирного масла Tinomiscium petiolare (Menispermaceae) из Вьетнама

Буй Бао Тхинь

Штрих-код ДНК, химический состав и антимикробная активность эфирного масла Tinomiscium petiolare (Menispermaceae) из Вьетнама

Вьетнам расположен в тропическом муссонном климате с жарким и влажным климатом и богатыми разнообразными растительными ресурсами. Кроме того, Вьетнамское этническое сообщество имеет большой опыт использования лекарственных растений, в том числе Tinomiscium petiolare Hook.f. et Thomson. T. petiolare является лекарственным растением и распространен в тропических странах Азии, включая Вьетнам. Это растение произрастает в естественных условиях в смешанных лесах на высоте от 200 до 600 м. Согласно традиционной медицине, T. petiolare останавливает кровотечение, лечит боли в костях и суставах, зубную боль и насморк. Фитохимические исследования T. petiolare все еще очень ограничены. Сырье стебля и корня содержит незначительное количество алкалоидов, включая тетрагидропротобербериновый 1-изокорипальмин, апорфиновый магнофлор и бисбензилизохинолиновый гомоаромалиновый алкалоид. Кроме того, корень также содержит тинофиллон, горькое вещество, связанное с клероданом дитерпен колумбин, а экстракт ветвей T. petiolare проявляет антибактериальную активность в отношении золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus). В настоящее время T. petiolare широко используется в лечебных целях. Точная и быстрая идентификация T. petiolare имеет решающее значение для их систематики, разведения, использования и сохранения генетических ресурсов. Идентификация этого вида на основе морфологических особенностей изучена, однако, если образец был неполный или раздробленный, морфологическая идентификация его затруднительна и не дает высокой точности. В связи с этим для преодоления недостатков морфологической биологической систематики изучаются и разрабатываются методы идентификации, основанные на генетическом материале. В методах молекулярной классификации баркодирование ДНК является инструментальной поддержкой метода классификации, основанного на морфологии. Это современный метод, в котором используются короткие последовательности ДНК для стандартизации различий между видами. Он стал новым инструментом, эффективно обслуживающим экспертизу, классификацию, оценку генетических взаимоотношений, управление качеством и выяснением источников происхождения продуктов из организмов. У высших растений некоторые участки генов хлоропластов (такие как matK, rbcL, psbA-trnH, atpF-atpH...) и участки ядерных генов (такие как ITS-rDNA, 18S...) широко применяются в исследованиях филогенетических отношений, таксономии и идентификации видов. Однако, для каждой отдельной группы объектов классификационная особенность этих участков генов различна. До настоящего времени не проводилось исследований по анализу баркодирования ДНК T. petiolare во Вьетнаме, изучения химического состава и антимикробной активности эфирного масла этого вида. Целью работы является анализ последовательностей двух локусов баркодирования ДНК, ITS и matK T. petiolare для получения новых данных о баркодировании ДНК T. petiolare во Вьетнаме. Одновременно предполагалось провести анализ химическиого состава и антимикробной активности эфирного масла T. petiolare. Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи: Провести анализ и сравнение последовательностей двух локусов баркодирования ДНК T. petiolare, то есть ITS и matK; Уточнить химический состав эфирных масел листьев и стеблей T. petiolare методом газохроматографического анализа; Дать оценку антимикробной активности эфирных масел листьев и стеблей T. petiolare с помощью метода микроразбавления бульона. По результатам исследования подготовлено 2 статьи, из которых 1 статья принята к публикации в журнале, индексируемом в базе цитирования Scopus (https://elpub.vir.nw.ru/jour/index) и 1 статья принята к публикации в журнале, индексируемом в базе цитирования WoS (https://doi.org/10.1080/0972060X.2021.1936206). Кроме того, опубликованы 8 генетических последовательностей на GenBank с кодами MW147627, MW147628, MW147629, MW147630, MW123076, MW123077, MW123078 и MW123079 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Биология

Диссертации

Вуз: Дальневосточный федеральный университет (ДВФУ)

ID: 60d5bcbce4dde5000108c124

UUID: b74c9ad0-b7d5-0139-3510-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: почти 2 года назад

Просмотры: 253

15.64

Буй Бао Тхинь

Дальневосточный федеральный университет (ДВФУ)

Комментировать 4

Рецензировать 0

Скачать - 1,4 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК Кафедра биоразнообразия и морских биоресурсов Буй Бао Тхинь ШТРИХ-КОД ДНК, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФИРНОГО МАСЛА TINOMISCIUM PETIOLARE (MENISPERMACEAE) ИЗ ВЬЕТНАМА МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени магистра биологии по направлению 06.04.01 – Биология образовательная программа «Сохранение биоразнообразия» Студент группы М8119-06.04.01сбио ______________________ (подпись) Руководитель: доцент каф. биоразнообразия и морских биоресурсов ДВФУ, канд. биол. наук, доцент ____________________ Р.В. Дудкин г. Владивосток 2021

Автор работы ____________ подпись «_____» ________________ 2021 г. Назначен рецензент д.б.н., профессор, академик РАН ( ученое звание) Горовой Петр Григорьевич (фамилия, имя, отчество) Защищена в ГАК с оценкой ___________ «Допустить к защите» Заведующий кафедрой _____________________ Секретарь ГАК ( ученое звание) ____________ подпись _________________ И.О.Фамилия «_____» ________________ 2021 г. В работе отсутствуют сведения, содержащие государственную тайну. Эксперт ШЕН, доцент кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов ________________О.И. Дащенко ________________ (подпись) _______________________ (и. о.ф) «______»________________ 2021 г

Оглавление ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 1 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................ 3 1.1 Особенности Tinomiscium petiolare ......................................................................... 3 1.2 Баркодирование ДНК ................................................................................................ 4 1.2.1 Основные характеристики баркодирования ДНК .............................................. 4 1.2.2 Некоторые локусы, используемые в баркодировании ДНК растений ............. 8 1.2.2.1 Ядерный геном, кодирующий рибосомы ......................................................... 8 1.2.2.2 Хлоропластный геном ........................................................................................ 9 1.2.3 Применение баркодирования ДНК в идентификации видов ...................... 14 1.3 Общая информация об эфирных маслах и эфиромасличных растений .......... 17 1.3.1 Понятие эфиромасличных растениях ............................................................... 17 1.3.2 Свойства и химический состав эфирных масел............................................... 18 1.3.3 Естественное состояние и распространение .................................................... 19 1.3.4 Ценность использования, важность эфирных масел и сырья, содержащих эфирные масла ............................................................................................................... 20 1.4 Характеристики исследуемого района ................................................................. 21 1.4.1 Национальный парк Бенэн ................................................................................. 21 1.4.2 Заповедник Пулуонг ............................................................................................ 23 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................................... 25 2.1 Материалы исследования ....................................................................................... 25 2.2 Молекулярно-биологические методы исследования........................................... 26 2.2.1 Метод выделения общей ДНК ............................................................................ 26 2.2.2 Метод амплификации генов с помощью ПЦР .................................................. 27 2.2.3 Метод очистки продуктов ПЦР .......................................................................... 28 2.2.4 Метод определения нуклеотидной последовательности ................................. 29 2.3 Методы изучения химического состава эфирных масел .................................... 30 2.3.1 Гидродистилляция эфирных масел .................................................................... 30 2.3.2 Количественный метод эфирных масел............................................................. 30 2.3.3 Метод анализа химического состава эфирных масел ...................................... 31

2.4 Метод определения антимикробной активности ................................................. 32 2.5 Методы обработки данных..................................................................................... 32 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................... 33 3.1 Анализ последовательностей ITS и matK Tinomiscium petiolare ........................ 33 3.1.1 Экстракция общей ДНК и амплификация фрагментов генов ......................... 33 3.1.2 Определение последовательностей .................................................................... 34 3.1.3 Анализ последовательности ................................................................................ 37 3.1.3.1 Анализ последовательностей ITS .................................................................... 37 3.1.3.2 Анализ последовательностей matK ................................................................. 43 3.2 Анализ химического состава эфирного масла Tinomiscium petiolare ................ 50 3.3 Антимикробная активность эфирного масла Tinomiscium petiolare .................. 54 ВЫВОДЫ ....................................................................................................................... 57 Рекомендации ................................................................................................................ 58 Список литературы ....................................................................................................... 59 Приложение А ............................................................................................................... 67 Приложение Б ................................................................................................................ 68

ВВЕДЕНИЕ Вьетнам расположен в тропическом муссонном климате с жарким и влажным климатом и богатыми разнообразными растительными ресурсами. Кроме того, Вьетнамское этническое сообщество имеет большой опыт использования лекарственных растений, в том числе Tinomiscium petiolare Hook.f. et Thomson. T. petiolare является лекарственным растением и распространен в тропических странах Азии, включая Вьетнам. Это растение произрастает в естественных условиях в смешанных лесах на высоте от 200 до 600 м. Согласно традиционной медицине, T. petiolare останавливает кровотечение, лечит боли в костях и суставах, зубную боль и насморк. Фитохимические исследования T. petiolare все еще очень ограничены. Сырье стебля и корня содержит незначительное количество алкалоидов, включая тетрагидропротобербериновый 1-изокорипальмин, апорфиновый магнофлор и бисбензилизохинолиновый гомоаромалиновый алкалоид. Кроме того, корень также содержит тинофиллон, горькое вещество, связанное с клероданом дитерпен колумбин, а экстракт ветвей T. petiolare проявляет антибактериальную активность в отношении золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus). В настоящее время T. petiolare широко используется в лечебных целях. Точная и быстрая идентификация T. petiolare имеет решающее значение для их систематики, разведения, использования и сохранения генетических ресурсов. Идентификация этого вида на основе морфологических особенностей изучена, однако, если образец был неполный или раздробленный, морфологическая идентификация его затруднительна и не дает высокой точности. В связи с этим для преодоления недостатков морфологической биологической систематики изучаются и генетическом баркодирование разрабатываются методы материале. методах ДНК В является идентификации, молекулярной инструментальной основанные на классификации поддержкой метода классификации, основанного на морфологии. Это современный метод, в котором 1

используются короткие последовательности ДНК для стандартизации различий между видами. Он стал новым инструментом, эффективно обслуживающим экспертизу, классификацию, оценку генетических взаимоотношений, управление качеством и выяснением источников происхождения продуктов из организмов. У высших растений некоторые участки генов хлоропластов (такие как matK, rbcL, psbA-trnH, atpF-atpH...) и участки ядерных генов (такие как ITS-rDNA, 18S...) широко применяются в исследованиях филогенетических отношений, таксономии и идентификации видов. Однако, для каждой отдельной группы объектов классификационная особенность этих участков генов различна. До настоящего времени не проводилось исследований по анализу баркодирования ДНК T. petiolare во Вьетнаме, изучения химического состава и антимикробной активности эфирного масла этого вида. Целью работы является анализ последовательностей двух локусов баркодирования ДНК, ITS и matK T. petiolare для получения новых данных о баркодировании ДНК T. petiolare во Вьетнаме. Одновременно предполагалось провести анализ химическиого состава и антимикробной активности эфирного масла T. petiolare. Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи: - Провести анализ и сравнение последовательностей двух локусов баркодирования ДНК T. petiolare, то есть ITS и matK; - Уточнить химический состав эфирных масел листьев и стеблей T. petiolare методом газохроматографического анализа; - Дать оценку антимикробной активности эфирных масел листьев и стеблей T. petiolare с помощью метода микроразбавления бульона. 2

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Особенности Tinomiscium petiolare Tinomiscium petiolare Hook.f. et Thomson – это лекарственное растение семейства Menispermaceae (Ho, 1999; Christenhusz, 2016). Hook. f. et Thomson впервые описали его в 1855 году. Этот вид произрастает в Китае, Индии, Индонезии, Малайзии, Мьянме, Папуа-Новой Гвинее, Филиппинах, Таиланде и Вьетнаме (Forman, 1988; Ho, 1999; Van Valkenburg, 2001). В естественных условиях вид произрастает в смешанных лесах на высотах от 200 до 600 м над ур. м. (Van Valkenburg, 2001). В традиционной медицине ряда стран T. petiolare применяется для лечения некоторых заболеваний благодаря его разнообразным лекарственным свойствам. В Малайзии корень T. petiolare используется для облегчения боли в суставах и при насморке, а латекс, изготавливаемый из него для снятия грибковых заболеваний и во время лихорадки (Tomita, 1967; Ahmad, 1995). В Индонезии листья T. petiolare используются для лечения тяжелых порезов. Измельченные стебли, смешанные с рисом, применяют в качестве яда, а измельченная кора используется для одурманивания рыбы (Grosvenor, 1995a). На Филиппинах молочно-белая смола, разбавленная водой, используется для промывания глаз, а плоды используются как рыбный яд (Quisumbing, 1978). Во Вьетнаме каучуковый латекс, получаемый из T. petiolare, применяется для лечения кариеса (Van Valkenburg, 2001; Chi, 2012). Классификация: Царство: Plantae Ряд: Ranunculales Семейство: Menispermaceae Род: Tinomiscium Вид: Tinomiscium petiolare Hook.f. et Thomson Описание: Древесная лиана. Стебли покрыты трещиноватой корой рыжего цвета; веточки и черешки продольно-бороздчатые, на срезе выделяют белый латекс; молодые ветви багровые-с войлочным опушением. Черешок 5–12 см, 3

опушенный или голый; листовая пластинка широкояйцевидная, 10–25 (-29) × 9– 14 (-20) см, тонкокожистая, в основании почти усеченная или слегка сердцевидная, край цельный или неравномерно зубчатый, на вершине остро заостренный, реже остроконечная, пальчатая с 3–5 жилками и 1–3 парами выступающих боковых жилок. Кистевидные соцветия формируются по несколько штук из цветочных почек на старых стеблях, часто висячие, 5–12 см, пурпурножелезистые, перистые. Мужские цветки: чашелистики наружного круга мелкие, внутреннего круга 6 (-8), узко обратнояйцевидно-эллиптические до эллиптических, 3–4,5 (-5) мм, голые, кроме папиллозных краев; лепестков венчика шесть, они обратнояйцевидно-эллиптические до эллиптических, 2–2,5 (3,5) мм, глубоко выемчатые. Тычинок 6, 1,4–2,5 (-3) мм, они удлиненные и вогнутые. Женские цветки: чашелистики и лепестки как у мужских; тычинки линейно-продолговатые, около 3 мм; плодолистиков три. Цветоножка 1–2 см дл. Костянки сначала зеленые с белыми пятнами, затем от белых до желтых (или оранжевых), с белым латексом, сжатые эллиптические, ок. 4 × 1,7–2 × 1,3–1,5 см, в основании округлые, с коротким стеблем; эндокарпий сжатый, эллипсовидный, 2–3,5 × 1–2 см, поверхность неясно или сильно морщинистая или морщинистая, вершина более-менее острая. Семядоли крайне неравномерные, более крупные, двухчастные, основание - ушкообразное. 1.2 Баркодирование ДНК 1.2.1 Основные характеристики баркодирования ДНК Технология ДНК-штрихкодирования (баркодирование ДНК) была впервые использована в 1993 году (Fazekas, 2008), но не получила особого внимания со стороны научного сообщества. С развитием науки и технологий в последние годы термин «ДНК баркодинг» не только часто упоминается, но и широко используется в исследованиях молекулярной таксономии. По сути, этот метод основан на использовании последовательности ДНК размером около 400-800 п.н. в качестве стандарта для быстрой и точной идентификации и определения филогенетических взаимоотношений организмов. Таким образом, технология 4

ДНК-штрихкодирования не только помогает систематикам в области таксономии и идентификации видов, но также улучшает их способность контролировать, понимать и использовать биоразнообразие (Kress, 2005; Kress, 2017). Кроме того, этот метод имеет перспективы для исследований и применения в науках о жизни, судебной медицине, общей медицине, медицинско-фармацевтических исследованиях, производстве продуктов питания и при контроле их качества. Фактически, баркодирование ДНК начало оказывать влияние благодаря исследованиям Хеберта и др. (2003), результаты исследовательской группы показали, что особей из коллекции 200 близкородственных видов, принадлежащих к отряду Чешуекрылые, можно идентифицировать со 100% точностью с использованием митохондриальной ДНК цитохромоксидазы (cytochrome c oxidase) субъединицы I (COI) (Hebert, 2003). После этого многие исследования по идентификации видов с помощью ДНК-маркеров были успешно применены на таких животных, как птицы, рыбы, тигровые каури, пауки и некоторые насекомые отряда жуков. Недавно были созданы системы маркеров ДНК для других групп организмов, таких как растения, водоросли, грибы, простейшие и бактерии. Они показали выдающеюся эффективность. Для продвижения изучения использования баркодирования ДНК для всех эукариот, живущих на этой планете, в мае 2004 года был создан CBOL (Консорциум штрих-кода жизни), в который вошли более 120 организаций из 45 стран. Первоначальной целью этого Консорциума являлось создание онлайнбиблиотеки последовательностей баркодирования для всех неизвестных видов, которая могла бы служить таксономическим стандартом для любого образца ДНК. При поддержке CBOL баркодирование ДНК все больше развивается и становится новым методом таксономии и идентификации новых видов. Быстрое экономическое развитие, последствия изменения окружающей среды и климата, нерациональная эксплуатация природных биологических ресурсов человека вносят глубокие изменения во флору и фауну разных стран, поэтому быстрая и точная идентификация видов необходима для оценки биоразнообразия этих территорий с целью защиты редких и эндемичных 5

организмов, находящихся под угрозой исчезновения. Однако, баркодирование ДНК не может заменять таксономию, но это полезный инструмент для предоставления информации о неизвестных таксонах. В настоящее время в мире этот метод используется в основном систематиками и многими учеными в других областях, таких как археология, биоиндустрия и пищевая промышленность. Метод морфологической классификации имеет долгую историю развития и позволил построить относительно полную и всеобъемлющую систему классификации организмов в целом и растений в частности. Этот метод классификации основан на различиях в морфологии органов растительного тела, особенно репродуктивных органов (цветков). Однако, он сталкивается со многими трудностями при идентифицикации образцов, которые находятся в стадии развития (еще не цветущие) и тех образцов, которые имеют аналогичные характеристики из-за одинаковой адаптации к условиям окружающей среды или трудно распознаются из-за того, что они имеют много общего у более видов и подвидов. Особенно затруднительна классификация гомоморфных или близкородственных видов морфологическими методами (Kim, 2009). С конца двадцатого века с молниеносным развитием биологической науки в целом и молекулярной биологии в частности, родился новый метод исследования в области таксономии - метод молекулярной таксономии. Он основан на информационных данных о геноме (ДНК) внутри и вне ядра или их продуктах (белках). В зависимости от цели или объекта исследования могут выбирать разные гены (фрагменты ДНК) или разные продукты генома (Hollingsworth, 2011). Молекулярная таксономия дала довольно точные результаты, помогая открывать новые виды, разрешать сомнения относительно таксономического положения, полностью оценивать генетическое разнообразие, филогенез и эволюцию многих видов животных, растений и микроорганизмов. По сравнению с морфологическими маркерами, ДНК-маркеры обладают высокой точностью независимо от факторов окружающей среды. Для растений обычно используются две основные группы генов – это ядерная область и хлоропластные геномы (хпДНК), которые являются очень консервативными генами в эволюции. 6

Для животных митохондриальный геном с наследуемыми по материнской линии характеристиками, высокой частотой мутаций, в основном заменяющими мутациями в кодирующих, контрольных и нерекомбинантных областях, рассматривается как эффективный инструмент в изучении происхождения видов. С другой стороны, митохондриальная ДНК имеет большое количество копий в клетке и стабильна очень долгое время, тысячи лет, в то время как ядерная ДНК имеет только одну копию и быстро разлагается в окружающей среде. В связи с этим в большинстве исследований в качестве ДНК-маркера используется короткий участок ДНК митохондриального гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы (COI). Хотя есть несколько исключений, COI считается типичным и общим ДНК-маркером для животных (Van De Wiel, 2009; Vijayan, 2010). Для растений подходящих для хлоропластный ДНК-маркеров геном и имеет ядерных много геномов, характеристик, участок ДНК, расположенный между генами или ITS (внутренний транскрибируемый спейсер), часто используется в качестве ДНК-маркера в ряде исследований (Berg, 2000; Borsch, 2003; Shaw, 2007). В последние годы многие участки генов были изучены и предложены в качестве ДНК-маркеров для растений (matK, rpoC1...) (Hebert, 2003; Chase, 2005; Taberlet, 2007; Kress, 2017). Согласно Таберлету и др. (2007), идеальная система штрих-кодирования ДНК должна отвечать следующим требованиям (Taberlet, 2007): - Во-первых, участок ДНК-маркера должен быть достаточно вариабельным для того, чтобы различать виды, но не должен сильно различаться между особями одного и того же вида. - Во-вторых, система идентификации ДНК должна быть стандартизирована с использованием одного и того же участка ДНК для разных таксонов. - В-третьих, филогенетической участок ДНК-маркера информации для должен легкой таксономическим группам (роды, семейства, ...). 7 содержать идентификации достаточно видов по

- В-четвертых, существует возможность применения к необработанным образцам с высококонсервативными геномными праймерами, которые легко выполняют реакции амплификации и считывают последовательности ДНК. 1.2.2 Некоторые локусы, используемые в баркодировании ДНК растений Ожидается, что последовательности баркодирования, клонированные из родительской ядерной геномной ДНК, предоставят больше информации о видах, которые необходимо идентифицировать. Однако, при этом возникают трудности при ПЦР-амплификации ядерных генов, потому что ядерные гены в основном моногенные или имеют низкие копии генов, особенно из деградации и качества геномной ДНК, а также способности различать подвиды из-за сохранения функциональных генов, это может быть причиной, по которой ограничено количество ядерных генов, возможных тестировать при идентификации видов с помощью метода баркодирования ДНК (Vijayan, 2010; Yao, 2010). 1.2.2.1 Ядерный геном, кодирующий рибосомы Ген рДНК представляет собой полигенную систему, кодирующую РНКчасть рибосомы. Гены рибосомной ДНК (рДНК) несут последовательности, которые одновременно консервативны и достаточно разнообразны для различия близкородственных видов. В клетке рДНК расположена в виде случайно повторяющихся единиц, состоящих из 18S, 5.8S, 28S рибосомной ДНК и перемежающихся с некодирующими последовательностями ITS1, ITS2 (внутренние транскрибируемые спейсеры), расположенными в двух сторонах 5.8S области. Кодирующие области трех генов рДНК более консервативны, чем ITSобласти. Единицы рДНК повторяются тысячи раз и располагаются в больших областях хромосомы. Одной из наиболее примечательных особенностей рДНК является то, что каждая единица полигенной системы не развивается независимо, вместо этого все они координируются между собой таким образом, так что рДНК достигает более высокого уровня стабильности внутри видов, но различается между ними. 8

В настоящее время ITS-область ядерного генома считается одним из наиболее полезных инструментов для филогенетической оценки как растений, так и животных, поскольку она широко распространена в природе, унаследована от родителей и сильно варьируется из-за малых функциональных ограничений. Некоторые недавние исследования на растениях, воспроизводимых половым и бесполым путем, показали некоторую степень вариации в количестве копий последовательностей ITS1 и ITS2 из-за множества причин, таких как инбридинг, расщепление и рекомбинация, высокая частота мутаций и образование псевдогенов функциональных генов, которые приводят к таким изменениям. На этой основе рДНК может использоваться для точной и эффективной идентификации растений одного и того же вида с разными характеристиками истории жизни (однолетний, многолетний, наземный, водный) и эволюционным происхождением (Vijayan, 2010; Yao, 2010). 1.2.2.2 Хлоропластный геном Клетки высших растений содержат три генетических органоида: ядро, митохондрии и пластиды. Каждый из этих органоидов включает в себя свой уникальный геном. Наследование митохондриальных и хлоропластных геномов не подчиняется закону Мендена. В настоящее время внимание ученых сосредоточено на хлоропластах. Рис и Плаут (1962) были первыми, кто обнаружил присутствие хлоропластной ДНК при микроскопическом наблюдении за зелеными водорослями Chlamydomonas moewusii (Ris, 1962). Хлоропластный геном высших растений представляет собой кольцевую молекулу ДНК размером примерно 120–165 т.п.н. и содержит около 130 генов, в зависимости от разновидности, в среднем примерно 150 т.п.н., в случае табака хлоропластный геном имеет размер около 160 т.п.н., разделен на две большие и малые области, копии генома присутствуют во всех клетках и в различных типах пластидов, таких как дифференцированные препластиды, фотохлоропласты, хромопласты, содержащие каротиноиды. Выдающейся особенностью генома пластид является чрезвычайно высокая плоидность. Клетки табачного листа могут содержать 100 9

хлоропластов, каждый из которых содержит около 100 копий пластидного генома. Таким образом, существует около 10000 пластидных геномов на клетку (Sandelius, 2008). Пластиды содержат хлорофилл, также известный как хлоропласты, который придает растениям зеленый цвет. Хлоропласты имеют сложную структуру и играют важную роль в фотосинтезе, красные или желтые пластиды, называемые хромопластами в кожуре цветов и фруктов, бесцветные пластиды или лейкопласты, где образуется крахмал. Хлоропласты являются одним из трех типов пластидов, обнаруживаемых только в фотосинтетических клетках у растений. Хлоропласты обычно имеют овальную форму, каждый хлоропласт окружен двойной мембраной, внутри находятся бесцветные субстраты, называемые стромами, содержащими гидрофильные белки и мелкие частицы. Количество хлоропластов в каждой клетке неодинаково, в зависимости от условий освещения окружающей среды и вида. Хлоропласты являются местом фотосинтеза в растительной клетке и создания энергии для нее. Под электронным микроскопом мы видим, что каждая маленькая грана имеет форму стопки монет, состоящих из плоских карманов, называемых тилакоидами, на поверхности мембраны расположены пигментные и ферментные системы, упорядоченные и образующие многочисленные сферические базовые единицы в виде сферических гранул размером от 10 до 20 нм, которые называются фотосинтетическими единицами. В хлоропласте содержится много ДНК и рибосом, поэтому он способен синтезировать для себя необходимые белки. Хлоропласты содержат много ферментов, что указывает на то, что в них протекает множество различных метаболических реакций. Эти ферменты: инвектаза, амилаза, протеаза, каталаза, и др., а также ферментные комплексы, которые осуществляют реакцию фосфорилирования, синтез пептидных связей, связей жирных кислот и синтез фосфора и липидов. Хлоропласт не только полноценный фотосинтетический аппарат, но также имеет свою собственную систему синтеза белка. Мембрана хлоропласта осуществляет обмен веществ и метаболизирует биоплазму между стромой и цитоплазмой, и даже генетическую информацию в виде ДНК хлоропласта. В настоящее время ученые секвенировали более 100 сортов 10

геномной ДНК пластид. Например, Маршанция изменчивая (liverwort) - 121024 п.н., табак - 155939 п.н., кукуруза - 140387 п.н., картофель - 155371 п.н., ряска малая - 165955 п.н ... (Serino, 1998). Существование хлоропластной ДНК было впервые обнаружено в 1962 году, а первая последовательность была опубликована в 1986 году, когда японская группа исследователей секвенировала хлоропластную ДНК табака и Маршанции изменчивой. С тех пор были секвенированы миллионы хлоропластных ДНК, но в основном они представлены наземными растениями и водорослями. Наследование цитоплазматических пластидных генов также включает гены, называемые внеядерными, внехромосомными или цитоплазматическими. Химическая природа этого гена также является ДНК, которая присутствует в плазмидах бактерий, в пластидах эукариотических клеток. Количество ДНК в пластиде намного меньше, чем ДНК в ядре. Пластид содержит двухцепочечную голую кольцевую молекулу ДНК, похожую на бактериальную ДНК. Гены в пластиде также имеют способность к мутации. Например, в ДНК хлоропластов есть мутация, которая способствует потери способность к синтезу хлорофилла, создавая белые хлоропласты. Белые хлоропласты вновь образуют белые хлоропласты. В связи с этим, в одной клетке листа могут быть как зеленые, так и белые хлоропласты. Случайное и неравномерное распределение этих двух типов в ходе митоза приводит к появлению листьев с белыми пятнами, а иногда и к большим участкам листовых клеток без хлорофилла, как в листьях диффенбахии пятнистой. При наследовании хлоропластный геном обозначается хпДНК (хлоропластная ДНК) или цтДНК (Sandelius, 2008; van Doorn, 2010), хпДНК и содержит гены, кодирующие рРНК и многие пластидные тРНК. Он также кодирует ряд рибосомных белков, белков пластидной мембраны, необходимых для передачи электронов во время фотосинтеза. Наследование пластид – это цитоплазматическая или материнская наследственность, выявленная у разных объектов. Например, при опылении обычной кукурузы, имеющей зеленые листья, с кукурузой, имеющей зеленые листья с белыми пятнами, все потомство будет иметь нормальные зеленые листья. А когда кукуруза с пятнистыми листьями 11

опыляется обычной кукурузой с зелеными листьями, у потомства будет несколько растений с зелеными, несколько растений с пятнистыми листьями и несколько полностью альбиносных растений. Хлоропластная ДНК кольцеобразная, двойная, обычно имеет около 120–170 тысяч п.н., около 30–60 пм в длину и около 80–130000000 дальтон по массе (Sandelius, 2008). Большинство хлоропластных геномов растений существует в виде большого двойного кольца. Однако, у некоторых видов, таких как водоросли динофитов, хлоропластный геном разделен на множество небольших плазмид, каждая из которых имеет 2000–10000 п.н., но не имеет кодирующих ДНК (Hebert, 2003). Хлоропластный геном состоит примерно из 100 генов, у наземных растений последовательности генов практически идентичны, они кодируют 4 типа рибосомных РНК, 30–31 тРНК, 21 робосомный белок и 4 субъединичные РНКполимеразы. Хлоропластный консервативная часть. геном Она имеет небольшую содержит часть, стабильную известную как последовательность нуклеотидов, у которой физические и химические агенты трудно вызывают мутацию, поэтому этот нуклеотидный фрагмент практически не изменяется в процессе эволюции. Таким образом, ученые были заинтересованы в изучении и использовании фрагментов генов у разных видов растений для технологии штрихкодирования ДНК, тем самым анализируя нуклеотидную последовательность для рассмотрения взаимосвязи между видами в современном мире. Многие участки генов в хлоропластном геноме были использованы для штрих-кодирования ДНК, такие как matK, rpoC1, ... (Hollingsworth, 2011). Эта последовательность Maturase K была успешной для идентификации лекарственных средств растительного происхождения "Dahuang", полученных из Rheum palmatum L. (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf, R. officinale Baill., и близкородственного Rheum sp. L. с высокой степенью внутривидовой и межвидовой изменчивости. Поэтому ее часто используют для 12

идентификации растительных ингредиентов в разных географических регионах (Hebert, 2003; Hollingsworth, 2011). Гены rpoB, rpoC1, rpoC2 кодируют три из 4 субъединиц РНК-полимеразы хлоропластов. Изучая семейство Dipterocarpaceae, Цумура и др. (1996) было обнаружено, что ген rpoB подходит для филогенетических исследований (Tsumura, 1996). В настоящее время rpoB является широко используемым геном в филогенетических исследованиях и идентификации видов бактерий, особенно при изучении близкородственных штаммов. Вместе с геном 16S рРНК, rpoB используется во многих исследованиях для идентификации новых видов бактерий, поэтому эти гены были предложены в качестве отдельных маркеров баркодирования или в сочетании с некоторыми другими генами. Однако, в исследовании Лю и др. (2010) показано, что rpoC1 является очень полезным маркером при использовании для различения видов Бриофитов (Bryophytes) (Liu, 2010). Следовательно, необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы доказать пригодность использования rpoB и rpoC1 в качестве маркеров баркодирования в исследованиях по идентификации видов (Wu, 2006; Vijayan, 2010). Изменения в хлоропластной ДНК (хпДНК) были использованы и используются для эволюционных, экологических и филогенетических исследований у растений. ХпДНК имеет консервативную степень в замещении нуклеотидов. Это облегчает сравнение широкомасштабных изменений в систематике растений. Некоторые маркеры хпДНК, такие как хлоропластные микросателлиты, некоторые некодирующие области, некоторые фрагменты больших одиночных цепей (trnC-trnD, trnD-trnT, psaA-trnS, petB-petD, trnH-psaA, trnD-trnT) и некоторые межгенные буферные зоны (trnL-trnF) были использованы при изучении генетического разнообразия и филогенетики растений (Fazekas, 2008; Seberg, 2009). 13

1.2.3 Применение баркодирования ДНК в идентификации видов Применение баркодирования ДНК не только быстро идентифицирует образцы, но и расширяет исследования, организованные в группы таинственных, расплывчатых или сложных видов (Kress, 2005). В экосистемах баркодирование ДНК полезно в поиске взаимосвязей между образцами, хотя они почти не похожи морфологически. Экологический анализ растений ведется интенсивно для понятия особенностей питания или миграции животных. Баркодирование ДНК также применяется на таможне для помощи в определении происхождения живых организмов или импортных продуктов с целью предотвращения незаконного перемещения через границу редких и ценных растений и животных. В области судебной экспертизы очень небольшое количество пробы, даже несколько следов, оставленных на месте преступления, могут помочь полиции отследить источник. В последнее время база данных баркодирования ДНК используется судебно-медицинскими ведомствами многих стран для своей работы. В сельском хозяйстве одна из самых тревожных вещей – это борьба с патогенами растений, стоимость которой составляет миллиарды долларов в год. Использование баркодирования ДНК поможет быстро идентифицировать виды, вызывающие болезни, на латентной стадии (личиночная стадия), поддерживая программу борьбы с вредителями для защиты сельскохозяйственных культур. На данный момент в основном завершено баркодирование ДНК для идентификации вредителей фруктовых деревьев по всему миру и передано оборудование и технологии таможенным служащим многих стран для того, чтобы они могли определить и предотвращать распространение фруктов, зараженных вредителями. Продажи сельскохозяйственной продукции будут стимулироваться и, таким образом, сократится время, что приведет к борьбе с вредителями. Баркодирование ДНК также используется для идентификации переносчиков болезней. Для ученых, которые не являются систематиками и паразитологами, баркодирование ДНК ускорило процесс идентификации видов, 14 являющихся переносчиками

болезней, которые передаются от человека к животному и наоборот; в то же время предоставляет дополнительные научные данные об инфекционных заболеваниях, а также быстрых эффективных методах лечения. Таким образом, баркодирование ДНК патогенных хозяев разрабатывается и распространяется в среде организаций и учреждений общественного здравоохранения как эффективный инструмент и метод для предотвращения и ограничения роста мух и уничтожения насекомых. Тревожным фактом является то, что биоразнообразие в мире постоянно ухудшается, поэтому многие редкие виды находятся под угрозой исчезновения, особенно неконтролируемое явление охоты на редких животных в некоторых регионах Африки, что приводит к сокращению этих видов примерно на 90%. Целью охоты является обеспечение продуктами питания естественного происхождения или лекарственными препаратами животного происхождения по очень высокой цене. Однако, существует много случаев открытой продажи пищевых продуктов и лекарственных трав домашнего животного происхождения, но с ―маркировкой‖ натуральности, поэтому очень трудно определить, является ли мясо частью туши редких диких животных или нет. Аналогичным образом, в некоторых странах Юго-Восточной Азии, включая Вьетнам, помимо незаконной охоты растет неизбирательная эксплуатация редких и ценных лекарственных трав. Многие люди для непосредственной выгоды создали неизвестные источники лекарственных трав для продажи или прикрепили ―маркировку‖ ценных лекарственных растений с целью получения незаконной прибыли. Для решения этой проблемы, баркодирование ДНК может помочь компетентным органам идентифицировать пищевые и лекарственные травяные ресурсы, происходящие от исчезающих видов, предотвратить браконьерство и незаконную эксплуатацию биологических ресурсов, а также помочь сохранить биоразнообразие и экологический баланс. Недавно объявленный всемирный стратегический проект баркодирования ДНК направлен на создание библиотеки баркодирования 15

исчезающих видов. Баркодирование ДНК не только помогает предотвращать болезни, контролировать охоту и незаконную эксплуатацию находящихся под угрозой исчезновения видов животных и растений, но также применяется в сельском и лесном хозяйстве. Ряд стран с ресурсозависимой экономикой, включая Вьетнам, сталкиваются с чрезмерной эксплуатацией сельскохозяйственных, морских и лесных ресурсов, что приводит к их сокращению или даже исчезновению многих редких видов. Для контроля за добычей властям необходимо создать эффективную систему управления для контроля торговли сельскохозяйственной, морской и лесной продукцией. Существует как минимум два проекта по баркодированию для рыб (Fish-BOL) и деревьев (Tree-BOL) для содействия управлению и защите природных ресурсов (Kool, 2012). Фактически, жизнь живых существ в целом и человека в частности зависит от воды. В настоящее время пресная вода стала ценным ресурсом, который необходимо беречь в каждой стране. Важно определить источники загрязненной воды для принятия мер по профилактике и очистке. Некоторые простые организмы в воде считаются зараженными (например, личинки комаров). Однако, чем выше загрязнение, тем сложнее определить показатели загрязнения. В связи с этим в настоящий момент ученые пытаются создать библиотеку баркодирования ДНК для этих «разплывчатых индикаторов». Это позволяет менеджерам по охране окружающей среды стандартизировать показатели при оценке водных ресурсов и наладить более эффективный процесс оценки водных стандартов в каждой стране. С другой стороны, в современном мире растения, используемые в качестве фитопрепаратов, всегда нуждаются в идентификации на уровне видов, повидов, поэтому выявление точных видов и видовых взаимоотношений отдельных особей является важным шагом для обеспечения качества продукции, и имеет особое значение при изучении особенностей генетического разнообразия, филогенетики и возникновения географических регионов, а также для защиты исчезающих видов. Наряду с развитием рынка лекарственных трав, подделка 16

растительных ингредиентов также стала глобальной проблемой. Эти лекарственные растительные ингредиенты могут быть заменены другими близкими травами, даже из поддельного сырья. Фальсификация растительных ингредиентов обычно происходит по следующим причинам: сырье не отличается по морфологическим характеристикам; сырье с похожими названиями; замена экономически ценного сырья другими более дешевыми материалами. Однако, точная идентификация растительных лекарственных ингредиентов традиционными методами, такими как органолептическая оценка и химические методы, иногда бывает затруднительной, особенно для сырья растительного происхождения, которые частично обработаны или находятся в форме порошка. Поэтому метод с использованием молекулярных маркеров, очевидно, более точен и популярен. Идентификация растительных лекарственных ингредиентов с помощью баркодирования ДНК может защитить пользователей от вредного воздействия поддельных лекарств, которое во многих случаях может быть опасным для жизни (Hollingsworth, 2011). 1.3 Общая информация об эфирных маслах и эфиромасличных растений 1.3.1 Понятие эфиромасличных растениях Хотя эфиромасличные растения использовались в течение долгого времени, до сих пор не существовало единого понимания эфиромасличных растений. К 1968 году Николаев дал определение: эфиромасличные растения – это растения, которые отличаются от других растений тем, что из них можно получать из них эфирные масла (Oyen, 1999). Сегодня, при углубленном изучении секреции и физиологической активности растений, ученые ясно увидели различие в природе эфиромасличных видов, поэтому их можно определить как растения, содержащие специализированные структуры, отвечающие за выделение и накопление эфирных масел. 17

1.3.2 Свойства и химический состав эфирных масел Под эфирными маслами понимаются смеси органических соединений со сложной молекулярной структурой, нерастворимые в воде, летучие и обладающие характерными ароматами. Эфирные масла обладают следующими свойствами: - Вязкая жидкость, часто имеет оптическую преломляемость больше, чем вода, что вызывает явление преломления света. - Не растворимы или очень мало растворимы в воде, растворимы в неполярных растворителях. - Большинство эфирных масел легче воды (d < 1), некоторые тяжелее воды (d > 1). - Эфирные масла часто летучие и имеют характерный аромат для каждого вида растений, группы растений. По химической молекулярной структуре эфирные масла классифицируются на следующие основные группы (Oyen, 1999): - Циклические терпеновые углеводороды с открытой цепью и их кислородсодержащие производные (спирты, альдегиды, сложные эфиры, простые эфиры и т.д.). Это большая группа, обычно встречающаяся в растениях. Терпены состоят из изопрена (C5H8)n; при n=2 (монотерпен), n=3 (сесквитерпен), и т.д. - Производные бензила: В эту группу включаются производные бензола или бензоиды, которые содержат характерное бензольное кольцо и обычно выражаются как кольцо C6 с тремя чередующимися двойными связями с одинарными связями между атомами углерода в кольце. - Другие ингредиенты: некоторые азотсодержащие соединения, обладающие весьма характерными свойствами, хотя и в очень малых концентрациях (обычно менее 0,1%), но обладающие эффектом усиления привлекательного вкуса многих видов эфирных масел, даже в их сыром виде. 18

1.3.3 Естественное состояние и распространение В природе эфирные масла находятся в скрытом или свободном состоянии. Эфирные масла, находящиеся в скрытом состоянии, не являются нормальным составом у растений, а появляются только при определенных условиях. Эфирные масла в свободном состоянии у растений могут образовываться и концентрироваться в клетках, которые выглядят как нормальные клетки растения или более крупные клетки (растения семейства Лавровые). Однако, эфирные масла в свободном состоянии обычно расположены в выделительных органах растения, таких как железистые трихомы у растений, принадлежащих к семействам Яснотковые (Lamiaceae) и Астровые (Asteracae); экскреторные мишки у растений семейства Миртовые (Myrtaceae); выводные протоки у растений семейства Сосновые (Pinaceae) и Зонтичные (Apiaceae). По распространению эфирные масла встречаются во всем царстве растений, но особенно присутствуют во многих семействах, таких как: сосновые (Pinaceae), апельсиновые (Rutaceae), (Lauraceae), Имбирь (Zingiberaceae), (Apiaceae), Магнолиецветные Миртовые Астровые (Magnoliaceae), (Myrtaceae), (Asteraceae), Анноновые Лавровые Зонтичные (Annonaceae), Перечные (Piperaceae). Все органы растения могут иметь эфирные масла, чаще всего в верхушках с цветками (мята), но также и в корнях (вертивер), в корневищах (имбирь, куркума, дианелла, ...), в коре (корица), в древесине (коричник камфорный, фокиения), в плодах (перец, апельсин, лимон, помело, ...), в семенах (мускатный орех, ...). Особенность заключается в том, что у одного и того же вида состав эфирных масел разных частей может быть разным в зависимости от экологических условий и сбора. В тропическом климате содержание эфирных масел в растениях обычно выше, чем в другом климате. 19

1.3.4 Ценность использования, важность эфирных масел и сырья, содержащих эфирные масла Эфирные масла имеют множество применений, таких как нервная стимуляция, антисептическое, противовоспалительное, сильное антибактериальное действие. В течение долгого времени люди использовали их в повседневной жизни, а также в фармацевтической, пищевой промышленности, косметике и т.д. (Bakkali, 2008). Многие растения, содержащие эфирные масла, стали популярными культурами, а большинство масел имеют высокую экономическую ценность. Самая старая отрасль, использующая эфирные масла, а также отрасль, потребляющая эфирные масла и сырье, содержащее наибольшее количество эфирных масел, - это пищевая промышленность. В данной сфере эфирные масла используются в качестве приправ, пищевых консервантов и ликеров. Многие виды растений, содержащие эфирные масла, используются в качестве приправ, таких как лемонграсс, имбирь, корица, анис, перец черный, галангал, мускатный орех, гвоздика и т.д., это небольшие, но эффективные приправы для стимуляции пищеварения, повышения аппетита. Некоторые специи обладают бактерицидным действием, продлевая срок хранения продуктов. В парфюмерной и косметической промышленности эфирные масла используются в парфюмерии, косметике, мыле и других продуктах; кроме того, они применяются в качестве сырья для разделения, преобразования или синтеза многих важных ароматических веществ, широко используемых в промышленности. В медицине эфирные масла и сырье, содержащее эфирные масла, используют в качестве лекарственных средств. Некоторые из них содержат азулен, который обнаружен в полыни, и обладают сильными антибактериальными свойствами; многие эфирные масла (камфорное, сосновое, коричное) используются в массаже, обладают противовоспалительным действием. Эфирное масло мяты, эфирное масло аниса, эфирное масло 20

эвкалипта применяют для лечения респираторных и пищеварительных заболеваний. Кроме того, сырье, содержащее эфирные масла, используют в восточной медицине для приготовления лекарств, пара, приготовления воды для ванн. 1.4 Характеристики исследуемого района 1.4.1 Национальный парк Бенэн Национальный парк Бенэн расположен на северо-западе уезда Нхытхань, в 46 км к западу от города Тханьхоа, с географическими координатами от 19°28' до 19°39' северной широты, от 105°20' до 105°35' восточной долготы (Van Hoang, 2008). На севере граничит с коммунами Суанханг (Нхытхань) и Хоакуи (Нхысуань). На юге граничит с коммунами Суанбинь (Нхусуан) и Суантхай (Нхытхань). На востоке граничит с коммунами Суанфук и Суантхай, уезд Нхытхань. На западе граничит с коммуной Суанькуи и лесным хозяйством Шонгчанг. Общая природная территория парка составляет 16634 га, включая 16 подзон, озеро Шонгмык и скалистую местность Хайван. Согласно научным документам Института исследования и планирования лесов (1995 г.), история геологического образования в регионе довольно сложна, но в основном это осадочные породы, образовавшиеся в триассовом периоде, и красные образования из юрско-мелового периода, такие как глинистые сланцы, песчаник. В Бенэн имеются следующие основные типы почв: аллювиальная почва рек и ручьев, красно-желтая ферраллитная почва, развитая на глинистых сланцах, бледно-желтая ферраллитная почва, развитая на песчаных скалах, выветренная почва на известняковых горах. Национальный парк Бенэн включает в себя такие типы местности, как холмы, горы, реки и озера, чередующиеся друг с другом. Центр - озеро Шонгмык с системой плавучих островов, покрытых лесом и множеством ответлений, окруженных скалистой и гористой местностью. На северо-востоке находится скалистый горный хребет, проходящий с северо-запада на юго-восток от Донгхона до Донгмыоя. На востоке находится хребет Даулон, проходящий от 21

Донгкинь до деревни Куанг. Самая высокая вершина - это гора Дам, высотой 497 м, остальные вершины имею высоту от 300–350 м, средний уклон - от 250 до 300 м, в некоторых местах - более 350 м. Местность этого типа довольно пересеченная, крутые склоны, внутри которых имеются известняковые горы с множеством пещер и лесных покровов. Местность включает невысокие холмы, реки, озера и долины (Van Hoang, 2008). В этом регионе имеются две основные речные системы: река Мык и река Чанг. Река Чанг находится на западе, а Мык - на востоке водораздела горного хребта Дам. Река Мык - крупный приток реки Йен, полностью расположенный на территории национального парка Бенэн. Весь водоем состоит из четырех крупных ручьев: ручей Хан, ручей Тхо, ручей Кок и ручей Тайтон. В целом речная система в регионе относительно регулярна и имеет воду круглый год. Озеро Бенэн имеет объем воды от 250 до 400 миллионов м 3, который является водоемом четырех вышеперечисленных ручьев. Озеро имеет воду круглый год, его средняя площадь составляет 2281 га, оно способно обеспечивать водой более 10000 га полей в двух уездах Нхытхань и Нонгконг. Как и в Северо-Центральном регионе Вьетнама, в национальном парке Бенэн субтропический климат. Зима холодная и сухая, лето жаркое и влажное, с июля по октябрь выпадает наибольшее количество осадков. Средняя температура равна 23,3°C; общее годовое количество осадков (в среднем за 30 лет) составляет 1790,0 мм. Климат делится на два сезона. Сезон дождей длится с апреля по ноябрь, что составляет 90% от общего количества осадков в году. С апреля по июнь часто бывают сухие юго-западные ветры, зима находится под влиянием северо-восточного муссона, что влияет на биологическую жизнь. Площадь лесных угодий в национальном парке Бенэн составляет 11738,07 га. Это природные ресурсы, имеющие высокую ценность. Так как в их составе есть лесные экосистемы, а также места обитания животных, то необходимо способствовать их сохранению. Площадь земельного участка без леса составляет 294,87 га (2,00% от общей площади), которая включает пастбища (IA), голые земли с разбросанными кустарниками и деревьями (IB, IC) (Van Hoang, 2008). 22

Хотя здесь нет леса, эта группа земель является местом кормления травоядных, копытных животных, таких как олени, кабаны, и местом обитания диких птиц и некоторых других мелких млекопитающих. Площадь нелесных земель составляет 2701,67 га, в том числе земли сельскохозяйственного производства, с водной поверхностью, земли под офисы и строительные работы, земли под жилую застройку и другие. 1.4.2 Заповедник Пулуонг Заповедник Пулуонг расположен на территории уездов Батхыок и Куанхоа, на северо-западе провинции Тханьхоа, Вьетнам, в 130 км к северозападу от города Тханьхоа. Примерно в 20 км от городка Каньнанг и примерно в 178 км от Ханоя на северо-западе. Заповедник Пулуонг был основан в 1999 году, его площадь составляет 17662 га, в том числе 13320 га - зона строгой охраны и 4343 га – зона экологического восстановления (Thin, 2013). Пулуонг - название тайской этнической группы, что означает «самая высокая гора в регионе». Пулуонг считается заповедником с научными, социально-экономическими и экологическими ценностями. Вместе с Пуху лес в регионе Пулуонг играет важную роль в защите в верховье реки Ма в провинции Тханьхоа. Заповедник Пулуонг находится в 25 км от национального парка Кукфыонг и соединен с национальным парком Кукфыонг двумя серо-известняковыми горами, идущими параллельно. В центре находятся рисовые долины. На севере и северо-востоке заповедника Пулуонг граничит с уездами провинции Хоабинь, такими как Майчау, Танлак и Лакшон. С запада на юг от заповедника тянется река Ма, от границы уезда Куанхоа с уездом Майчау (провинция Хоабинь) через территорию городка Хойсуан (Куанхоа) до близлежащей территории городка Каньнанг (Батхыок) (Thin, 2013). Девственный лес в заповеднике Пулуонг представляет собой сезонный вечнозеленый тропический закрытый лес. Пять основных подтипов образовалось на этой территории в результате разнообразия высоты и подстилающего 23

субстрата: низинные широколиственные леса на известняковых горах (60–700 м); низинные широколиственные леса на сланцах, песчаниках и глинах (60–1000 м); широколиственный лес у подножия известняковых гор (700–950 м); хвойный лес у подножия известняковых гор (700–850 м) и широколиственный лес у подножия горного базальта (1000–1650 м). В заповеднике также существует вторичный лесной покров, такой как бамбуковые леса, кустарники и сельскохозяйственные угодья. Расположенный недалеко от национального парка Кукфыонг, Пулуонг имеет большое сходство флоры и фауны по сравнению с Кукфыонг. В заповеднике богатая и разнообразная флора и фауна с 598 видами животных, относящимися к 130 семействам позвоночных, в том числе 51 редкий вид (из них 26 видов млекопитающих, 5 видов летучих мышей, 6 видов птиц, 5 видов пресноводных рыб, 6 видов рептилий). Что касается фауны позвоночных, то в одном докладе было зарегистрировано 84 вида млекопитающих (в том числе 24 вида летучих мышей), 162 вида птиц, 55 видов рыб, 28 видов рептилий и 13 видов земноводных. Фауна насекомых Пулуонга насчитывает не менее 158 видов бабочек, 96 видов наземных моллюсков, из которых 12 видов моллюсков могут быть эндемичными для этого региона. Раковина улитки Oospira duci была обнаружена в 2007 году в заповеднике Пулуонг. В этом заповеднике обитают дымчатые леопарды, кошки Темминка, пятнистые олени, гималайские медведи, серны, белозадые гульман и т.д. В системе карстовых скал известняковой горной экосистемы до сих пор сохранилось множество красивых пещер. Два места, которые могут быть использованы как курорт: Сонбамыой (коммуна Лунгкао) и вершина Пулуонг высотой 1700 м в районе коммуны Тханьшон. Помимо разнообразия природных ландшафтов, существует также разные типы культурной самобытности тайского сообщества. 24

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы исследования Для анализа баркодирования ДНК было собрано 4 образца T. petiolare из заповедника Пулуонг (PL1 и PL2) и национального парка Бенэн (BE1 и BE2) в провинции Тханьхоа, Вьетнам (таблица 1 и рисунок 1). 0,5 г свежих листьев на каждый образец растения немедленно сушили в силикагеле. Все образцы хранили при температуре -20°C до обработки. Т а б л и ц а 1 – Образцы для тестирования потенциальных штрих-кодов и инвентарных номеров в GenBank Номер образца PL1 PL2 BE1 BE2 Вид Tinomiscium petiolare Tinomiscium petiolare Tinomiscium petiolare Tinomiscium petiolare Место расположения Регистрационный номер GenBank ITS matK MW147627 MW123076 MW147628 MW123077 MW147629 MW123078 MW147630 MW123079 Пулуонг, Тханьхоа, Вьетнам Пулуонг, Тханьхоа, Вьетнам Бенэн, Тханьхоа, Вьетнам Бенэн, Тханьхоа, Вьетнам Для анализа эфирных масел было собрано по 5 кг листьев и стеблей T. petiolare в заповеднике Пулуонг, провинция Тханьхоа, Вьетнам (рисунок 1). 25

Рисунок 1 – Места сбора образцов Tinomiscium petiolare (провинция Тханьхоа, Вьетнам) Все образцы растений были собраны с мая 2019 г. по май 2020 г. и были идентифицированы к.б.н. Хоанг Ван Чинь (университет Хонгдык) на основе анализа морфологических характеристик. Гербарные образцы были депонированы в гербарии Университета Хонгдык, Вьетнам. 2.2 Молекулярно-биологические методы исследования 2.2.1 Метод выделения общей ДНК Общую ДНК выделили из листьев T. petiolare с помощью набора Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия) по следующему порядку: - Взяли образцы листьев из глубокой криоконсервации (-20°C) и измельчили их в жидком азоте (-196°C) в мелкий порошок. Набрали 100 мг порошка в эппендорф на 1,5 мл. - Добавили 400 μл буфера AP1 и 4 μл Рназы A. Хорошо перемешали на вортексе и инкубировали при 65°C в течение 10 минут. Во время инкубации перемешали 2-3 раза. 26

- Добавили 130 μл буфера AP2. Хорошо перемешали и инкубировали на льду в течение 5 минут. - Аспирировали лизис в колонку QIAshredder Mini. Центрифугировали при скорости 14000 об/мин в течение 2 мин. - Перенесли раствор через колонку в новый эппендорф на 1,5 мл без какихлибо перемешиваний. Добавили 1,5-кратный объем буфера AP3/E и хорошо перемешали. - Перенесли 650 μл суспензии в колонку Dneasy Mini. Центрифугировали при скорости 8000 об/мин в течение 1 мин. Удалили жидкость через колонку. Повторили этот шаг с оставшейся суспензией. - Поместили колонку в новую пробирку для сбора. Добавили 500 μл буфера AW и центрифугировали при скорости 8000 об/мин в течение 1 мин. Удалили жидкость через колонку. - Добавили 500 μл буфера AW. Центрифугировали при скорости 14000 об/мин в течение 2 мин. Удалили жидкость через колонку. - Перенесли колонку в промаркированный эппендорф объемом 1,5 мл. Добавили 100 μл буфера AE для растворения. Инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Центрифугировали 6000 об/мин в течение 1 мин. Повторили этот шаг, получили экстракт, содержащий общую ДНК и сохранили его при температуре -20°C. - Проверили концентрацию общей ДНК с помощью спектрометра NanoDrop (Thermo Scientific - США). 2.2.2 Метод амплификации генов с помощью ПЦР Амплификацию генов ITS и matK проводили на аппарате PCR systems 9700 с соответствующими праймерами, указанными в таблице 2. ПЦР-амплификацию проводили в 25 µл реакционной смеси, состоящей из 12,5 µл Master mix 2x (CWBIO, Китай), по 0,75 µл праймеров в прямом и обратном направлении (концентрация 10 пМ/µл), 10 µл деионизированной воды и 1 µл матричной ДНК. Термический цикл выглядел следующим образом: один цикл денатурации ДНК при температуре 94°C в течение 5 минут, затем 35 циклов по 1 мин при 27

температуре 94°C, 1 мин при температуре 52°C и 1 мин при температуре 72°C, продолжительность последнего периода составила 10 мин при температуре 72°C. Продукты ПЦР тестировали на 0,8% агарозном геле. Т а б л и ц а 2 – Праймеры, использованные для амплификации Ожидаемая Локус Название праймера Последовательности праймеров (5′−3′) длина продукта (п.н.) ITS matK ITS1F TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4R TCCTCCGTCTATTGATATGC 1RKIM-f ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 3FKIM-r CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 650 900 2.2.3 Метод очистки продуктов ПЦР После амплификации генов ITS и matK следующим шагом является получение гена в очищенной форме без агарозного геля. Процесс очистки проводился в соответствии с набором для очистки Thermo Scientific GenJET PCR Purification Kit, включая следующие этапы: Шаг 1: Электрофорез продукта амплификации гена, разрезать гелевую ленту и поместить ее в эппендорф объемом 1,5 мл. Шаг 2: Добавление связующего раствора (binding solution) в соотношении 1:1 по объему. Шаг 3: Инкубация при температуре 50-60°C до полного растворения геля. Шаг 4: Аспирация раствора в колонку с гелем, центрифугирование при скорости 12000 об/мин в течение 2 минут при 4°C, удаление раствора. Шаг 5: Добавление 700 µл промывочного раствора в колонку, центрифугирование при скорости 12000 об/мин в течение 2 минут, удаление раствора. 28

Шаг 6: Перенос фильтрующей колонки в эппендорф на 1,5 мл, затем оставить при комнатной температуре и открыть крышку на 3 минуты для испарения спирта. Шаг 7: Добавление 25 µл деионизированной воды, затем оставить на 5 минут при комнатной температуре, центрифугирование при 12000 об/мин в течение 3 минут, удаление колонки, сбор очищенного продукта ДНК из нижнего раствора. Очищенные продукты ДНК исследовали электрофорезом на 0,8% агарозном геле в TAE 1X со стандартными маркерами и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Хранить очищенные продукты ДНК в шкафу при температуре равной -20°C. 2.2.4 Метод определения нуклеотидной последовательности Нуклеотидные последовательности фрагментов генов ITS и matK определяли на генетическом анализаторе ABI 3500 Genetic Analyzer по принципу Sanger с использованием набора BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc., США). Эти генные последовательности обрабатывали, анализировали и сравнивали с опубликованными GenBank последовательностями (таблица 3) с помощью программ Bioedit и BLAST (McGinnis, 2004; Hall, 2011). Генетические дистанции и филогенетические связи были рассчитаны и построены с использованием программного обеспечения MEGA 6 (Tamura, 2013). Т а б л и ц а 3 – Список последовательностей, использованных в исследовании, собранных на Genbank Вид Tinomiscium petiolare Регистрационный номер GenBank ITS matK HG004877, HG005005, KY365658 DQ478612 Orthogynium sp. KY365652 Burasaia madagascariensis KY365641 Paratinospora sagittata KY365666, KY365671, 29

Вид Регистрационный номер GenBank ITS matK KY365672, KY365673 Borismene japurensis KC494024 Burasaia apetala KC494025 Fibraurea tinctoria KC494035 Penianthus longifolius KC494046 Calycocarpum lyonii KC494026 Anamirta cocculus KC494022 2.3 Методы изучения химического состава эфирных масел 2.3.1 Гидродистилляция эфирных масел Перед экстракцией листья и стебли T. petiolare сушили при комнатной температуре (25°C) в течение 5 дней. Они были вручную отделены от мусора, камней и других предметов. Затем листья и стебли измельчили для получения 2 кг каждого соответственно и гидродистилляция в аппарате типа Клевенджера в соответствии с Вьетнамской фармакопеей при нормальном давлении в течение 5 часов для получения эфирного масла (Vietnamese Pharmacopoeia, 2009). Эфирные масла сушили безводным сульфатом натрия и помещали во флаконы янтарного цвета для хранения при температуре 4°C до проведения анализа. 2.3.2 Количественный метод эфирных масел Эфирные масла из различных частей были количественно определены в соответствии с методом I Вьетнамской фармакопеи (Vietnamese Pharmacopoeia, 2009). Содержание эфирного масла рассчитывается по формуле: (когда d < 1) или по формуле: (когда d > 1) Где: а - объем эфирного масла в мл. 30

b - масса образца в граммах. 2.3.3 Метод анализа химического состава эфирных масел Приготовление аналитических образцов для газовой хроматографии: растворить 1,5 мг эфирного масла, высушенного безводным Na2SO4, в 1 мл чистого гексана, использованного для газовой хроматографии. Анализ газовой хроматографией (ГХ) выполняли на приборе Agilent GC 7890A, присоединенном к детектору Agilent Technologies FID, США и установленном на хроматографическую колонку HP-5MS длиной 60 м, внутренний диаметр (ID) = 0,25 мм и толщина пленки 0,25 μм. Гелий являлся газом-носителем со скоростью потока 1,0 мл/мин. Температура на входе составила 250°C, а температура печи была запрограммирована от 60°C до 240°C со скоростью 4°C/мин, время выдержки составило 2 минуты. Соотношение фракционирования составило 100:1, а объем разбавленного эфирного масла (10% раствор н-гексана), вводимого в колонку, составил 1 μл. Температура поверхности составила 270°C, температура детектора - 260°C. Количественную оценку выполняли с использованием стандартных кривых, построенных на основе анализа репрезентативных стандартных соединений каждого класса. Хроматограф Agilent GC 7890A, оборудованный капилляром расплавленного диоксида кремния HP-5MS (60 м × 0,25 мм, толщина пленки 0,25 μм) и соединенный с масс-спектрометром (HP 5973 MSD), использовали для анализа эфирных масел методом газовой хроматографии (ГХ/МС). Условия, аналогичные описанным, были использованы для анализа ГХ с гелием (1,0 мл/мин) в качестве газа-носителя. Условия МС следующие: напряжение ионизации 70 эВ; ток эмиссии 40 мА; диапазон захвата и сканирования 35–450 а.е.м. с частотой дискретизации 1,0 сканирование/с. Определение компонентов эфирного масла T. petiolare из спектра ГХ/МС было выполнено на основе сравнения индексов удерживания (RI Exp.) Со ссылкой на гомологичную последовательность н-алкана (C4-C40) под тем же условием эксперимента. В некоторых случаях использовалась совместная инъекция с известными соединениями в тех же условиях ГХ. Образцы 31

фрагментации масс-спектрометрии (МС) были исследованы с образцами других эфирных масел с известным составом из недавно описанных в литературе (NIST, 2018; Ha, 2021; Huong, 2021). 2.4 Метод определения антимикробной активности Антимикробное действие эфирного масла T. petiolare было выполнено на двух грамположительных бактериях (Bacillus subtilis ATCC6633 и Staphylococcus aureus ATCC6538), двух грамотрицательных бактериях (Escherichia coli ATCC8739 и Pseudomonas aeruginosa ATCC9027) и возбудителях дрожжей Candida albicans ATCC10231 с использованием метода микроразбавления бульона, как сообщалось ранее (Sahm, 1991; EUCAST, 2003; Huong, 2021). Тестовые среды включали агар Мюллера-Хинтона (MHA) для бактерий и агар Сабуро (SA) для грибов. Для испытаний эфирные масла разбавляли ДМСО и загружали в микропланшет с каждым штаммом микроорганизмов. Затем планшет инкубировали в течение ночи при температуре 37°C. Сто микролитров культивируемых микроорганизмов с приблизительными размерами 1,0 x 106 КОЕ/мл добавляли во все лунки и инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов. Последний ряд, содержащий только серийные разведения образца, свободного от микробов, использовали в качестве отрицательного контроля. Стрептомицин использовали в качестве антибактериального стандарта, а нистатин стандарта. и циклогексимид Значение использовали минимальной в качестве ингибирующей противогрибкового концентрации (МИК) определяли как самую низкую концентрацию тестируемого образца, способную полностью ингибировать рост микробов (Andrews, 2001). Все измерения были выполнены при трех повторениях. 2.5 Методы обработки данных Данные были обработаны с помощью программы Microsoft Office Excel 2003. 32

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Анализ последовательностей ITS и matK Tinomiscium petiolare 3.1.1 Экстракция общей ДНК и амплификация фрагментов генов Общую ДНК экстрагировали из листьев T. petiolare с использованием набора Dneasy Plant Mini Kit для обеспечения высокой чистоты. Продукт общей ДНК после экстракции и очистки проверяли электрофорезом на 0,8% агарозном геле. Полученные образцы ДНК имели хорошее качество, на электрофорезе проявлена только одна полоса ДНК, яркая, имеющая высокую молекулярную массу, обеспечивающая качество для следующих этапов исследования (рисунок 2). Рисунок 2 – Результаты амплификации фрагментов ДНК для четырех исследуемых образцов со специфическими парами праймеров для локусов ITS и matK Общая ДНК образцов после определения степени поглощения ультрафиолета (OD) спектрофотометром была разбавлена до необходимой концентрации для использования в качестве матрицы для ПЦР с разработанными специфическими парами праймеров. Результаты электрофореза продуктов ПЦР на 0,8% агарозном геле показали, что пары праймеров ITS и matK были успешно 33

использованы при репликации и амплификации желаемых фрагментов гена из ДНК 4 исследуемых образцов. В частности, продукты ПЦР последовательностей ITS и matK 4 исследуемых образцов имели размер приблизительно 650 п.н. и 950 п.н. соответственно (рисунок 2). Согласно последовательности пар праймеров, они обладают достаточной надежностью для того, чтобы служить основой считывания последовательностей ITS и matK изучаемых образцов для использования в дальнейших исследованиях. 3.1.2 Определение последовательностей После очистки продуктов ПЦР было проводедено считывание последовательностей генов ITS и matK 4 изучаемых образцов на генетическом анализаторе ABI 3500 с помощью набора для циклической последовательности BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Затем фрагменты последовательностей генов ITS и matK были обработаны с помощью программного обеспечения BioEdit для корректировки областей зашумленного сигнала. Исходя из этого, последовательности ITS и matK для 4 изучаемых образцов были получены следующим образом: Последовательность ITS PL1 GTCGAATCGCAACCTTCTGGACGAGAGCCGGGCGGCCTCCGCCTTCCCCGGTGCCTCGG CCGAAACAACAAACCCCGGCGCGGCACGCGCCAAGGAAAACTCGAACGGAATTGGTGTG CCCGGACGATAGTGCATCGTCCCGGTGCCGCCGGTCTTCCGGGAAAATCTCGAATGACT CTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTT GGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGG CCACCCGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCGAACGCCGCTCCCGCCCCCTCG CAAGAGCGCGGACAGGAGCGAACGTTGGCCCCCCGTGACCCGGCTCACGGTCGGCTTAA AACGGATCCCCCCTCGTTGCCCCGCGACGCGATCGGTGGTGGTTGACGGCAACCCTTAC CCGCGATTGGACGACGCGACCGAGGGGCACGGGGGAAACGAACCCTTCGGAGAGAACTC CACGAGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCCACCCGCTGAGTTTAA Последовательность ITS PL2 GTCGAATCGCAACCTTCTGGACGAGAGCCGGGCGGCCTCCGCCTTCCCCGGTGCCTCGG CCGAAACAACAAACCCCGGCGCGGCACGCGCCAAGGAAAACTCGAACGGAATTGGTGTG 34

CCCGGACGATAGTGCATCGTCCCGGTGCCGCCGGTCTTCCGGGAAAATCTCGAATGACT CTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTT GGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGG CCACCCGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCGAACGCCGCTCCCGCCCCCTCG CAAGAGCGCGGACAGGAGCGAACGTTGGCCCCCCGTGACCCGGCTCACGGTCGGCTTAA AACGGATCCCCCCTCGTTGCCCCGCGACGCGATCGGTGGTGGTTGACGGCAACCCTTAC CCGCGATTGGACGACGCGACCGAGGGGCACGGGGGAAACGAACCCTTCGGAGAGAACTC CACGAGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCCACCCGCTGAGTTTAA Последовательность ITS BE1 GTCGAATCGCAACCTTCTGGACGAGAGCCGGGCGGCCTCCGCCTTCCCCGGTGCCTCGG CCGAAACAACAAACCCCGGCGCGGCACGCGCCAAGGAAAACTCGAACGGAATTGGTGTG CCCGGACGATAGTGCATCGTCCCGGTGCCGCCGGTCTTCCGGGAAAATCTCGAATGACT CTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTT GGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGG CCACCCGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCGAACGCCGCTCCCGCCCCCTCG CAAGAGCGCGGACAGGAGCGAACGTTGGCCCCCCGTGACCCGGCTCACGGTCGGCTTAA AACGGATCCCCCCTCGTTGCCCCGCGACGCGATCGGTGGTGGTTGACGGCAACCCTTAC CCGCGATTGGACGACGCGACCGAGGGGCACGGGGGAAACGAACCCTTCGGAGAGAACTC CACGAGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCCACCCGCTGAGTTTAA Последовательность ITS BE2 GTCGAATCGCAACCTTCTGGACGAGAGCCGGGCGGCCTCCGCCTTCCCCGGTGCCTCGG CCGAAACAACAAACCCCGGCGCGGCACGCGCCAAGGAAAACTCGAACGGAATTGGTGTG CCCGGACGATAGTGCATCGTCCCGGTGCCGCCGGTCTTCCGGGAAAATCTCGAATGACT CTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTT GGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGG CCACCCGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCGAACGCCGCTCCCGCCCCCTCG CAAGAGCGCGGACAGGAGCGAACGTTGGCCCCCCGTGACCCGGCTCACGGTCGGCTTAA AACGGATCCCCCCTCGTTGCCCCGCGACGCGATCGGTGGTGGTTGACGGCAACCCTTAC CCGCGATTGGACGACGCGACCGAGGGGCACGGGGGAAACGAACCCTTCGGAGAGAACTC CACGAGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCCACCCGCTGAGTTTAA Последовательность matK PL1 CTTTGCATTTATTGCGATTCTTTTTCTACGAGTATCATAATTGGAATAGGCTTATTACT CAAAAAAATAAATCCATTTCTGTTTTTTCAAAAAAAGAAAATCAAAGATTATTCTTGTT CCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCATATTAGTTTTTTTCCGTAAACAAT CTTTTTATTTACGATTAACATCTTCTAGAGCCTTTCTGGAGCGAACCCATTTCTATGGA 35

AAAATGGAACATCTTGTAGTAGTTTTTCAAAACGATTTTCAGTTTATCCTATGGTTGTT CAGGGAGCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCGAGGAAAATCCATTCTGGGTTCAAAGG GGACCCTTCTTCTGATGAATAAATGGAACTATTACCTTGTAAATTTCTGGCAATGTAAT TTTGACTTGTGGTCTCAACTGGATAGGATTTATATAACCCAATTAGCCAATCATTACTT CGATTTTTTGGACTATCTTTCAAGTGTACGACTAAATACTTCGGTAGTAAGGAGTCAAA TGTTAGATAATTCATTTATTATGGATATTGCGATTAAGAAGTTCGATAGTATAGTTCCA ATTATTTCTTTGATTGGATCATTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGTATCAGGGCATCC CATTAGTAAGCCGGCTCGGGCCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGATAGATTTGGGC GAATATACAAAAATCTTTCTCATTATTACAGCGGATCCTCAAAAAAAAATAGTTTGTAT CGAATAAAGTATATACTTCGACTTTCCTGTGCTAGAACTTTGG Последовательность matK PL2 CTTTGCATTTATTGCGATTCTTTTTCTACGAGTATCATAATTGGAATAGGCTTATTACT CAAAAAAATAAATCCATTTCTGTTTTTTCAAAAAAAGAAAATCAAAGATTATTCTTGTT CCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCATATTAGTTTTTTTCCGTAAACAAT CTTTTTATTTACGATTAACATCTTCTAGAGCCTTTCTGGAGCGAACCCATTTCTATGGA AAAATGGAACATCTTGTAGTAGTTTTTCAAAACGATTTTCAGTTTATCCTATGGTTGTT CAGGGAGCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCGAGGAAAATCCATTCTGGGTTCAAAGG GGACCCTTCTTCTGATGAATAAATGGAACTATTACCTTGTAAATTTCTGGCAATGTAAT TTTGACTTGTGGTCTCAACTGGATAGGATTTATATAACCCAATTAGCCAATCATTACTT CGATTTTTTGGACTATCTTTCAAGTGTACGACTAAATACTTCGGTAGTAAGGAGTCAAA TGTTAGATAATTCATTTATTATGGATATTGCGATTAAGAAGTTCGATAGTATAGTTCCA ATTATTTCTTTGATTGGATCATTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGTATCAGGGCATCC CATTAGTAAGCCGGCTCGGGCCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGATAGATTTGGGC GAATATACAAAAATCTTTCTCATTATTACAGCGGATCCTCAAAAAAAAATAGTTTGTAT CGAATAAAGTATATACTTCGACTTTCCTGTGCTAGAACTTTGG Последовательность matK BE1 CTTTGCATTTATTGCGATTCTTTTTCTACGAGTATCATAATTGGAATAGGCTTATTACT CAAAAAAATAAATCCATTTCTGTTTTTTCAAAAAAAGAAAATCAAAGATTATTCTTGTT CCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCATATTAGTTTTTTTCCGTAAACAAT CTTTTTATTTACGATTAACATCTTCTAGAGCCTTTCTGGAGCGAACCCATTTCTATGGA AAAATGGAACATCTTGTAGTAGTTTTTCAAAACGATTTTCAGTTTATCCTATGGTTGTT CAGGGAGCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCGAGGAAAATCCATTCTGGGTTCAAAGG GGACCCTTCTTCTGATGAATAAATGGAACTATTACCTTGTAAATTTCTGGCAATGTAAT TTTGACTTGTGGTCTCAACTGGATAGGATTTATATAACCCAATTAGCCAATCATTACTT CGATTTTTTGGACTATCTTTCAAGTGTACGACTAAATACTTCGGTAGTAAGGAGTCAAA TGTTAGATAATTCATTTATTATGGATATTGCGATTAAGAAGTTCGATAGTATAGTTCCA 36

ATTATTTCTTTGATTGGATCATTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGTATCAGGGCATCC CATTAGTAAGCCGGCTCGGGCCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGATAGATTTGGGC GAATATACAAAAATCTTTCTCATTATTACAGCGGATCCTCAAAAAAAAATAGTTTGTAT CGAATAAAGTATATACTTCGACTTTCCTGTGCTAGAACTTTGG Последовательность matK BE2 CTTTGCATTTATTGCGATTCTTTTTCTACGAGTATCATAATTGGAATAGGCTTATTACT CAAAAAAATAAATCCATTTCTGTTTTTTCAAAAAAAGAAAATCAAAGATTATTCTTGTT CCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCATATTAGTTTTTTTCCGTAAACAAT CTTTTTATTTACGATTAACATCTTCTAGAGCCTTTCTGGAGCGAACCCATTTCTATGGA AAAATGGAACATCTTGTAGTAGTTTTTCAAAACGATTTTCAGTTTATCCTATGGTTGTT CAGGGAGCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCGAGGAAAATCCATTCTGGGTTCAAAGG GGACCCTTCTTCTGATGAATAAATGGAACTATTACCTTGTAAATTTCTGGCAATGTAAT TTTGACTTGTGGTCTCAACTGGATAGGATTTATATAACCCAATTAGCCAATCATTACTT CGATTTTTTGGACTATCTTTCAAGTGTACGACTAAATACTTCGGTAGTAAGGAGTCAAA TGTTAGATAATTCATTTATTATGGATATTGCGATTAAGAAGTTCGATAGTATAGTTCCA ATTATTTCTTTGATTGGATCATTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGTATCAGGGCATCC CATTAGTAAGCCGGCTCGGGCCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGATAGATTTGGGC GAATATACAAAAATCTTTCTCATTATTACAGCGGATCCTCAAAAAAAAATAGTTTGTAT CGAATAAAGTATATACTTCGACTTTCCTGTGCTAGAACTTTGG Результаты нуклеотидного секвенирования показали, что фрагмент гена ITS, выделенный из 4 изучаемых образцов, имеет одинаковый размер и равен 574 п.н. Между тем, фрагмент гена matK, выделенный из 4 изучаемых образцов, также имеет такой же размер и составляет 810 п.н. Затем мы проводили анализ и сравнение с последовательностями ITS и matK, опубликованными в GenBank (NCBI, 1988-2021). 3.1.3 Анализ последовательности 3.1.3.1 Анализ последовательностей ITS После получения ITS-последовательностей мы провели анализ и сравнение между полученными ITS-последовательностями и ITS-последовательностями, опубликованными в GenBank, с использованием программного обеспечения BLAST и BioEdit (McGinnis, 2004; Hall, 2011). Результаты показаны на рисунках 3 и 4. 37

Рисунок 3 – Результаты анализа сходства между ITS-последовательностями 4 исследуемых образцов и некоторыми ITS-последовательностями в GenBank с использованием инструмента BLAST в NCBI Результаты сравнения сходства с использованием инструмента BLAST в NCBI между ITS-последовательностями 4 исследуемых образцов с ITSпоследовательностями в GenBank показали, что сходство с образцами T. petiolare составляло 99,46-99,48%, конкретно показано на рисунке 3. Сравнение с базой данных GenBank направлено на получение эталонного результата с группой видов, наиболее близких к запрашиваемой нуклеотидной последовательности. Результаты BLAST не являются окончательными в отношении них. В случаях BLAST с высоким охватом и сходством (99%) также невозможно определить название вида, потому что результаты BLAST показывают только наиболее похожую нуклеотидную последовательность, доступную в Genbank. 38

Рисунок 4 – Результаты сравнения ITS-последовательностей 4 исследуемых образцов с некоторыми ITS-последовательностями в GenBank Результаты на рисунке 4 показывают, что ITS-последовательности 4 исследуемых образцов, полученных нами в Бенэн и Пулуонг (Тханьхоа, Вьетнам), не различаются, что может подтвердить, что ITS-последовательности 4 исследуемых образцов относятся к одной и той же группе видов. В то же время 40

эти последовательности мало чем отличаются по сравнению с двумя ITS-последовательностями видов T. petiolare с кодами HG004877 и KY365658. Однако, полученные нами ITS-последовательности значительно отличаются от ITS-последовательностей, опубликованных в GenBank с кодами KY365652, KY365641, KY365673, KY365672, KY365671 и KY365666. Исходя из различия на рисунке 4 также можно понять, что у особей одного и того же вида, живущих в разных географических условиях, будут проявляться различия в таксономических последовательностях генов. Особи одного и того же вида, живущие в одних и тех же географических условиях, не будут иметь никаких различий или будут иметь очень небольшую разницу в своей таксономической последовательности. Это также подтверждает, что таксономическая последовательность очень консервативна, поэтому эти последовательности используются в качестве таксономических индикаторов в биологии в целом и ботанике в частности. Это различие также показано в таблице 4. Т а б л и ц а 4 – Коэффициенты диссоциации на основе ITS-последовательностей 4 исследуемых образцов с некоторыми ITS-последовательностями в GenBank 41

Результаты в таблице 4 показывают, что ITS-последовательности четырех исследуемых образцов, собранных в Бенэн и Пулуонг (Тханьхоа, Вьетнам), имеют 100% сходство и не имеют существенной разницы (0,13% и 0,40%) по сравнению с ITS-последовательностями видов T. petiolare, которые были опубликованы в GenBank под кодами HG004877 и KY365658. В то же время, разница полученных нами ITS-последовательностей по сравнению с ITS-последовательностями некоторых видов семейства Луносемянниковые (Menispermaceae), опубликованными в GenBank с кодами KY365652, KY365641, KY365673, KY365672, KY365671 и KY365666, относительно большая. Это показывает надежность при использовании баркодирования ДНК для определения генетической связи исследуемых образцов. Эта генетическая связь также показана на рисунке 5. Рисунок 5 – Древовидная диаграмма, показывающая генетические связи на основе ITS-последовательностей 4 исследуемых образцов с некоторыми ITSпоследовательностями в GenBank 42

Результаты на рисунке 5 показывают, что ITS-последовательности из четырех исследуемых образцов и ITS-последовательности T. petiolare (HG004877 и KY365658) относятся к одному и тому же виду. Эти последовательности и ITSпоследовательности, опубликованные в GenBank под кодами KY365652, KY365641, KY365673, KY365672, KY365671 и KY365666, имеют относительно большие коэффициенты генетической диссоциации. Следовательно, на филогенетической древовидной диаграмме существует разнообразие ветвлений, показывающее генетическое полученными нами, и расстояние между ITS-последовательностями, ITS-последовательностями некоторых видов, опубликованными в GenBank. Для подтверждения надежности использования баркодирования ДНК для определения генетической связи исследуемых образцов, мы дополнительно проанализировали последовательность matK. 3.1.3.2 Анализ последовательностей matK После получения последовательностей matK мы провели анализ и сравнили полученные последовательности matK с опубликованными последовательностями matK в GenBank с использованием программного обеспечения BLAST и BioEdit (McGinnis, 2004; Hall, 2011). Результаты показаны на рисунках 6 и 7. 43

Рисунок 6 – Результаты анализа сходства между последовательностями matK 4 исследуемых образцов с некоторыми последовательностями matK в GenBank с использованием инструмента BLAST в NCBI Результаты сравнения сходства с использованием инструмента BLAST в NCBI между последовательностями matK 4 исследуемых образцов с последовательностями matK в GenBank, показали, что уровень сходства с видами T. petiolare составляет 100%, что конкретно показано на рисунке 6. Однако, подобно результатам сравнения сходства с помощью инструмента BLAST между ITS-последовательностями, результаты BLAST не могут сделать точных выводов о видах. Они предназначены только для получения эталонного результата с наиболее сходной группой видов с нуклеотидной последовательностью в GenBank. Поэтому мы провели дальнейший анализ и сравнение полученных последовательностей matK. 44

Рисунок 7 – Результаты сравнения последовательностей matK 4 исследуемых образцов с некоторыми последовательностями matK в GenBank Результаты на рисунке 7 показывают, что нет никакой разницы в 4 последовательностях matK, которые мы получили в Бенэн и Пулуонг (Тханьхоа, Вьетнам); в то же время эти последовательности не имеют разницы при сравнении с последовательностями matK, опубликованными в GenBank с кодами HG005005 и DQ478612. Это еще раз подтверждает, что образцы, собранные нами в Бенэн и Пулуонг, принадлежат к одному виду с Tinomiscium petiolare. При сравнении последовательностей matK, полученных нами, с некоторыми последовательностями matK, опубликованными в GenBank (коды KC494024, KC494035, KC494025, KC494046, KC494026 и KC494022), особой разницы не было. Это также показано в таблице 5. 47

Т а б л и ц а 5 – Коэффициенты диссоциации на основе последовательностей matK 4 исследуемых образцов с несколькими последовательностями matK в GenBank Результаты в таблице 5 показывают, что последовательности matK исследуемых образцов, собранных в Бенэн и Пулуонг (Тханьхоа, Вьетнам), имеют 100% сходство и нет никакой разницы при сравнении с другими последовательностями matK, опубликованными в GenBank с кодами HG005005 и DQ478612. Таким образом, с точки зрения генетической связи 4 полученные нами последовательности matK и две опубликованные в GenBank последовательности matK с кодами HG005005 и DQ478612 относятся к одной и той же видовой группе. В то же время, разница между полученными нами последовательностями matK и последовательностями matK некоторых других видов семейства Луносемянниковые (Menispermaceae), опубликованными в GenBank с кодами KC494024, KC494035, KC494025, KC494046, KC494026 и KC494022 составляет 1,50%, 1,88%, 1,88 %, 1,26%, 2,41% и 2,77%, соответственно. Это генетическая связь также показана на рисунке 8. 48

Рисунок 8 – Древовидная диаграмма, показывающая генетические связи на основе последовательностей matK 4 исследуемых образцов с некоторыми последовательностями matK в GenBank Результаты на рисунке 8 показывают, что последовательности matK из 4 образцов, полученных нами в Бенэн и Пулуонг (Tханьхoa, Вьетнам), и последовательности matK Tinomiscium petiolare (коды HG005005 и DQ478612) имеют генетическую связь одного и того же вида. С другой стороны, полученные нами последовательности matK и последовательности matK, которые были опубликованы в GenBank с кодами KC494024, KC494035, KC494025, KC494046, KC494026 и KC494022, имеют низкие коэффициенты генетической диссоциации, но все же могут показывать генетическое расстояние между группами видов в филогенетической древовидной диаграмме. Эти результаты показали, что использование ДНК штрихкодирования является эффективным методом быстрой и точной идентификации лекарственных видов (Chen, 2010; Mishra, 2016). В мире было проведено множество исследований с использованием ДНК штрихкодирования для идентификации видов семейства Луносемянниковые (Menispermaceae) (Balasubramani, 2011; Yang, 49

2014; Osathanunkul, 2018; Wang, 2020). Однако, настоящее исследование является первым, в котором для идентификации T. petiolare из Вьетнама используется ДНК штрихкодирование. Среди двух исследуемых локусов ITS считается наиболее многообещающей тестовой областью для различения видов в этом исследовании. Одним из преимуществ области ITS является то, что ее можно амплифицировать на два меньших фрагмента (ITS1 и ITS2), и поэтому она особенно полезна для уже деградированных образцов (Hillis, 1991; Chen, 2010; Tripathi, 2013). ITS также была использована для определения видов растений с превосходными результатами в предыдущих исследованиях (Balasubramani, 2011; Selvaraj, 2012; Thinh, 2020). В то же время итоги этого исследования также вносят вклад в базу данных ДНК штрихкодирования при изучении видов T. petiolare во Вьетнаме. 3.2 Анализ химического состава эфирного масла Tinomiscium petiolare Листья и стебли T. petiolare собирали и сушили при комнатной температуре (25°C) перед экстракцией. Гидродистилляция листьев и стеблей T. petiolare получали светло-желтое эфирное масло. Выход эфирного масла составлял 0,06 (об./Мас., листья) и 0,04 (об./Мас., стебели) в пересчете на сухой вес. В таблице 6 представлены соединения, идентифицированные по порядку их элюирования на колонке HP-5MS, определенному с помощью ГХ/МС. Т а б л и ц а 6 – Состав эфирного масла (%) листьев и стеблей Tinomiscium petiolare Название компонентова RIб Содержание, % Листья Стебли 6-Метилгепт-5-ен-2-он 986 - 0,18 транс-Линалоол оксид (Фураноид) 1077 0,12 - Линалоол 1101 1,71 0,37 Изогераниаль 1184 - 0,14 α-Терпинеол 1197 0,24 - Метил салицилат 1203 0,18 - 50

Название компонентова RIб Содержание, % Листья Стебли Цитронеллол 1228 0,74 0,48 Нерол 1231 0,14 - Нераль 1245 2,05 1,21 Гераниол 1256 1,53 0,93 Гераниаль 1274 4,08 2,04 Цитронеллилацетат 1353 0,55 0,50 Геранилацетат 1384 6,12 5,77 α-Копаен 1389 1,87 1,36 н-Тетрадекан 1400 0,19 0,22 цис-β-Элемен 1403 0,62 0,56 цис-α-Бергамотин 1425 0,59 0,62 β-Копаен 1435 0,16 - (E)-Кариофиллен (=β-Кариофиллен) 1437 5,04 4,73 транс-α-Бергамотин 1446 6,52 6,61 α-Гуаиен 1452 0,39 0,41 Аромадендрен 1457 0,29 0,24 (Z)-β-Фарнезен 1460 2,14 2,28 α-Гумулен 1471 2,03 1,99 9-эпи-(E)-Кариофиллен 1479 0,45 0,45 γ- Мууролен 1490 1,98 2,10 α-Зингиберен 1498 3,85 4,50 β-Селинен 1501 - 1,27 δ-Селинен 1505 1,24 1,16 (Z)-α-Бисаболен 1510 1,08 0,99 (E,E)-α-Фарнезен 1512 4,54 4,65 α-Мууролен 1514 2,37 1,94 β-Бисаболен 1518 11,43 13,80 α-Бульнесен (=δ-Гуаиен) 1522 0,55 - Купарен 1524 1,09 1,18 51

Название компонентова RIб Содержание, % Листья Стебли γ-Кадинен 1530 3,56 3,93 δ-Кадинен 1537 4,10 5,27 (E)-γ-Бисаболен 1542 0,70 1,13 Кессан 1548 1,02 - (E)-α-Бисаболен 1551 1,08 1,23 α-Кадинен 1553 0,66 0,74 α-Калакорен 1560 0,81 1,01 Элемол 1564 - 0,66 (E)-Неролидол 1569 0,70 0,85 транс-Каламенен-10-ол 1580 0,31 - β-Калакорен 1580 - 0,36 Кариофиллениловый спирт 1591 0,29 0,37 10-эпи-Юненол 1602 - 0,50 Оксид кариофиллена 1604 0,30 0,33 Додецилацетат 1609 1,87 2,39 Кубебан-11-ол 1613 0,36 0,35 Гумулен эпоксид II 1631 0,23 0,47 1,10-ди-эпи-Кубенол 1639 2,27 2,64 10-эпи-γ-Еудесмол 1642 1,18 1,43 1-эпи-Кубенол 1646 0,22 0,26 γ-Еудесмол 1650 0,28 0,37 эпи-α-Кадинол (=τ-Кадинол) 1658 1,09 1,36 α-Мууролол (=δ-Кадинол) 1663 0,33 0,45 α-Кадинол 1672 0,83 1,21 нео-Интермедеол 1676 - 1,07 (Z)-3-Бутилиденфталид 1690 0,32 0,40 Кадален 1694 0,15 - Пентадеканал 1717 0,34 - (Z)-Лигустилид 1755 1,29 1,16 52

Название компонентова RIб Содержание, % Листья Стебли Нооткатон 1830 - 0,15 6,10,14-Триметилпентадекан-2-он 1848 0,36 - Метилпальмитат 1927 0,53 - м-Камфорен 1963 0,20 - н-Гексадекановая кислота 1968 - 0,54 Метиллинолеат 2098 0,19 - Метилолеат 2104 0,14 - Метиллиноленат 2106 0,17 - Фитол 2117 1,12 0,51 Оксигенированные монотерпены 17,28 11,44 Сесквитерпеновые углеводороды 59,29 64,51 Оксигенированные сесквитерпены 9,77 12,47 Жирные кислоты 1,03 0,54 Дитерпены 1,32 0,51 Другие компоненты 4,19 4,35 Всего 92,88 93,82 Примечание: аПорядок элюирования на колонке HP-5MS; RIб-Индексы удерживания на колонке HP-5MS; (-) неидентифицированный. Всего в эфирном масле T. petiolare было идентифицировано 73 компонента, что составляет 92,88 - 93,82% обоих компонентов эфирного масла (Таблица 6). Анализ ГХ/МС выявил присутствие 64 соединений в эфирном масле листьев, что составляет 92,88% от общего содержания эфирных масел. Сюда входят сесквитерпеновые углеводороды (59,29%), оксигенированные монотерпены (17,28%) и оксигенированные сесквитерпены (9,77%). Основными соединениями эфирного масла листьев являются β-бисаболен (11,43%), транс-α-бергамотен (6,52%), геранилацетат (6,12%), (E)-кариофиллен (5,04%), (E,E)-α-фарнезен (4,54%), δ-кадинен (4,10%), гераниаль (4,08%) и α-зингиберен (3,85%). На 57 соединений приходилось 93,82% от общего 53

содержания эфирных масел, обнаруженных в стебле растений, и в основном это были сесквитерпеновые углеводороды (64,51%), оксигенированные сесквитерпены (12,47%) и оксигенированные монотерпены (11, 44%). Кроме того, β-бисаболен (13,80%), транс-α-бергамотен (6,61%), геранилацетат (5,77%), δкадинен (5,27%), (4,73%), (E)-кариофиллен (E,E)-α-фарнезен (4,65%), α-зингиберен (4,50%) и-кадинен (3,93%) являются основными составляющими компонентами эфирного масла стеблей, аналогично эфирному маслу листьев. В целом, основные компоненты, идентифицированные из масел листьев и стеблей T. petiolare, были относительно схожими. Следует отметить, что монотерпеновые углеводороды нельзя идентифицировать у обоих эфирных маслах. Поскольку нет опубликованных работ по эфирным маслам для этого рода в целом и этого вида в частности, сравнение настоящих результатов с другими исследованиями было ограниченным. Можно сделать вывод, что данное исследование является первым отчетом о химическом составе эфирных масел из листьев и стеблей T. petiolare. 3.3 Антимикробная активность эфирного масла Tinomiscium petiolare Эфирные масла были исследованы на их антимикробную активность против 2 грамположительных, 2 грамотрицательных бактерий и патогенных дрожжей Candida albicans с помощью метода микроразбавления бульона. Данные в таблице 7 показывают, что эфирное масло листьев имеет умеренную активность против Pseudomonas aeruginosa со значением МИК 200 μг/мл и не проявляет активности против всех других протестированных микроорганизмов. Эфирное масло стеблей проявляло только умеренную антимикробную активность против роста Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus со значением МИК 200 μг/мл. Наблюдаемая антимикробная активность эфирного масла T. petiolare согласуется с предыдущей информацией о том, что эфирные масла из Вьетнама и других частей мира избирательно подавляют рост различных микроорганизмов (Dai, 2020; Huong, 2020; Ha, 2021; Huong, 2021). Соответственно, вещества со значениями МИК ≤ 100 μг/мл считаются обладающими хорошей антимикробной активностью, тогда как значения MИК 500-100 μг/мл считаются умеренными 54

(Holetz, 2002). Кроме того, значения MИК от 1000-500 μг/мл считаются слабо активными, в то время как значения MИК выше 1000 μг/мл не являются существенно активными. Таким образом, эфирное масло из листьев и стеблей T. petiolare обладает умеренной активностью против Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Считается, что компоненты, содержащиеся в изученных эфирных маслах, могли повлиять на наблюдаемую антимикробную активность экстракта T. petiolare против роста Staphylococcus aureus (Grosvenor, 1995b). Т а б л и ц а 7 – Антимикробная активность эфирных масел листьев и стеблей Tinomiscium petiolare Минимальная ингибирующая концентрация (MИК, μг/мл) Микроорганизмы Листья Стебли на на 200.0 ± 0.122 200.0 ± 0.226 Bacillus subtilis ATCC6633 на на Staphylococcus aureus ATCC6538 на 200.0 ± 0.271 Candida albicans ATCC10231 на на Escherichia coli ATCC8739 Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 на = нет активности. Предыдущие исследования показали, что антимикробная активность эфирных масел может варьироваться в зависимости от их основных соединений или синергии между основным компонентом и некоторыми второстепенными компонентами (Dai, 2020; Huong, 2020; Ha, 2021; Huong, 2021). Этот результат можно объяснить присутствием вторичных метаболитов, таких как сесквитерпены и монотерпены, включая β-бисаболен (Nascimento, 2007; Silvestri, 2010; Affonso, 2012; Lang, 2012), транс-α-бергамотен (Silvestri, 2010; Affonso, 2012; Lang, 2012), и геранилацетат (Kakarla, 2019), которые обладают антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательных патогенов у людей. Геранилацетат показал ингибирующую активность в 55

отношении золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) (Kakarla, 2019). Кроме того, ранее сообщалось, что несколько других соединений, идентифицированных в эфирном масле, включая (E)-кариофиллен (Montanari, 2011) и δ-кадинен (Pérez-López, 2011), проявляют антибактериальное действие против различного количества микроорганизмов. Следует отметить, что антимикробная активность эфирных масел во многом зависит от их химического состава и соотношения присутствующих в них различных химических компонентов. Кроме того, на эффекты также сильно повлияли морфологические особенности, такие как структура клеточной мембраны микроорганизмов, использованных в исследовании. Следовательно, бактерии, имеющие только внешний слой пептидогликана, будут более чувствительны, чем бактерии, окруженные мембранами, непроницаемыми для эфирных масел и компонентов. 56

ВЫВОДЫ 1. Размеры последовательностей ITS и matK, полученных нами, составляют 574 п.н. и 810 п.н. соответственно. Результаты исследования показали, что все 4 исследуемых образца были генетически связаны друг с другом и принадлежали одному виду - Tinomiscium petiolare. 2. Выход эфирного масла листа и стебля T. petiolare составлял 0,06% и 0,04% (об./Мас.) в пересчете на сухую массу, соответственно. Основные компоненты (процентное содержание соответственно), определенные для эфирных масел листьев и стеблей T. petiolare, были относительно схожими, включая β-бисаболен (11,43% и 13,80%), транс-α-бергамотин (6,52% и 6,61%), геранил ацетат (6,12% и 5,77%), (E)-кариофиллен (5,04% и 4,73%), δ-кадинен (4,10% и 5,27%), (E,E)-αфарнезен (4,54% и 4,65%) и α-цингиберен (3,85% и 4,50%). 3. Результаты исследования антимикробной активности показали, что эфирное масло стебля T. petiolare имело умеренную активность против Staphylococcus aureus ATCC6538 с минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) 200 μг/мл, в то время как оба эфирных масла подавляли рост Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 со значением МИК 200 μг/мл. 57

Рекомендации 1. Необходимо последовательностей продолжить изучение хлоропластных генов большего для количества установления ДНК штрихкодирования T. petiolare в мире в целом и во Вьетнаме в частности. 2. Необходимы более полные исследования по изучению содержания и состава эфирных масел на разных стадиях роста одного и того же растения в одном и том же месте, и одной и той же части в разных местах для выяснения способа аккумуляции эфирных масел T. petiolare. 58

Список литературы 1. Affonso, R.S. Chemical and Biological Aspects of the Essential Oil of Indian Cloves / R. S. Affonso, M. N. Renno, G. B. C. A. Slana, T. C. C. Franca // Rev. Virtual Quim. – 2012. – Vol. 4, № 2. – P. 146-161. 2. Ahmad, F.B. Medicinal plants of Terengganu State, Malaysia / F. B. Ahmad, D. K. Holdsworth // Pharm. Biol. – 1995. – Vol. 33, № 3. – P. 259-261. 3. Andrews, J.M. Determination of minimum inhibitory concentrations / J. M. Andrews // J. Antimicrob. Chemother. – 2001. – Vol. 48. – P. 5-16. 4. Bakkali, F. Biological effects of essential oils–a review / F. Bakkali, S. Averbeck, D. Averbeck, M. Idaomar // Food and Chemical Toxicology. – 2008. – Vol. 46, № 2. – P. 446-475. 5. Balasubramani, S.P. Molecular identification and development of nuclear DNA ITS sequence-based marker to distinguish Coscinium fenestratum Gaertn. (Menispermaceae) from its adulterants / S. P. Balasubramani, P. Venkatasubramanian // Current Trends in Biotechnology and Pharmacy. – 2011. – Vol. 5, № 2. – P. 1163-1172. 6. Berg, C. A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA / C. Berg, W. E. Higgins, R. L. Dressler, W. M. Whitten, A. Soto, A. Culham, M. W. Chase // Lindleyana. – 2000. – Vol. 15, № 2. – P. 96-114. 7. Borsch, T. Noncoding plastid trnT‐trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms / T. Borsch, K. W. Hilu, D. Quandt, V. Wilde, C. Neinhuis, W. Barthlott // Journal of Evolutionary Biology. – 2003. – Vol. 16, № 4. – P. 558-576. 8. Chase, M.W. Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals / M. W. Chase, N. Salamin, M. Wilkinson, J. M. Dunwell, R. P. Kesanakurthi, N. Haidar, V. Savolainen // Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. – 2005. – Vol. 360, № 1462. – P. 1889-1895. 59

9. Chen, S. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species / S. Chen, H. Yao, J. Han, C. Liu, J. Song, L. Shi, Y. Zhu, X. Ma, T. Gao, X. Pang, K. Luo, Y. Li, X. Li, X. Jia, Y. Lin, C. Leon // PLoS One. –2010. – Vol. 5, № 1. – P. 1-8. 10. Chi, V.V. Dictionary of medicinal plants in Vietnam / V. V. Chi // Ha Noi: Medical Publishing House. – 2012. 11. Christenhusz, M.J. The number of known plants species in the world and its annual increase / M. J. Christenhusz , J. W. Byng // Phytotaxa. – 2016. – Vol. 261, № 3. – P. 201-217. 12. Dai, D.N. Antimicrobial activity, larvicidal efficacy and chemical composition of essential oil from the rhizome of Alpinia napoensis / D. N. Dai, L. T. Huong, H. V. Chinh, I. A. Ogunwande // J. Biol. Active Products from Nature. – 2020. – Vol. 10, № 3. – P. 220-232. 13. EUCAST. Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by broth dilution / EUCAST // Clin. Microbiol. Infect. – 2003. – Vol. 9, № 8. – P. 9-25. 14. Fazekas, A.J. Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well / A. J. Fazekas, K. S. Burgess, P. R. Kesanakurti, S. W. Graham, S. G. Newmaster, B. C. Husband, D. M. Percy, M. Hajibabaei, S. C. H. Barrett // PloS One. – 2008. – Vol. 3, № 7. – P. 1-12. 15. Forman, L.L. A synopsis of Thai Menispermaceae / L. L. Forman // Kew Bulletin. – 1988. – Vol. 43, № 3. – P. 369-407. 16. Grosvenor, P.W. Medicinal plants from Riau Province, Sumatra, Indonesia. Part 1: Uses / P. W. Grosvenor, P. K. Gothard, N. C. McWilliam, A. Supriono, D. O. Gray // J. Ethnopharmacol. – 1995a. – Vol. 45, № 2. – P. 75-95. 17. Grosvenor, P.W. Medicinal plants from Riau Province, Sumatra, Indonesia. Part 2: antibacterial and antifungal activity / P. W. Grosvenor, A. Supriono, D. O. Gray // J. Ethnopharmacol. – 1995b. – Vol. 45, № 2. – P. 97-111. 18. Ha, C.T. Composition and antimicrobial activity of essential oils from leaves and twigs of Magnolia hookeri var. longirostrata DX Li & RZ Zhou and Magnolia 60

insignis Wall. in Ha Giang Province of Vietnam / C. T. Ha, D. T. Thuy, V. Q. Nam, N. K. Tam, W. N. Setzer // Rec. Nat. Prod. – 2021. – Vol. 15, № 3. – P. 207-212. 19. Hall, T. BioEdit: an important software for molecular biology / T. Hall, I. Biosciences, C. Carlsbad // GERF Bulletin of Biosciences. – 2011. – Vol. 2, № 1. – P. 60-61. 20. Hebert, P.D. Biological identifications through DNA barcodes / P. D. Hebert, A. Cywinska, S. L. Ball, J. R. Dewaard // Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. – 2003. – Vol. 270, № 1512. – P. 313321. 21. Hillis, D.M. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference / D. M. Hillis, M. T. Dixon // The Quarterly Review of Biology. – 1991. – Vol. 66, № 4. – P. 411-453. 22. Ho, P.H. An illustrated flora of Vietnam. Vol. 1 / P. H. Ho // Ho Chi Minh, Vietnam: Young Publishing House. – 1999. 23. Holetz, F.B. Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases / F. B. Holetz, G. L. Pessini, N. R. Sanches, D. A. G. Cortez, C. V. Nakamura, B. P. Dias-Filho // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. – 2002. – Vol. 97, № 7. – P. 1027-1031. 24. Hollingsworth, P.M. Choosing and using a plant DNA barcode / P. M. Hollingsworth, S. W. Graham, D. P. Little // PloS One. – 2011. – Vol. 6, № 5. – P. 1-13. 25. Huong, L.T. Antimicrobial activity and chemical constituents of essential oils from the leaf and wood of Taxus chinensis (Rehder et E. H. Wilson) Rehder (Taxaceae) from Vietnam / L. T. Huong, N. T. H. Thuong, L. D. Chac, D. N.Dai, I. A. Ogunwande // J. Biol. Active Products from Nature. – 2020. – Vol. 10, № 1. – P. 8-17. 26. Huong, L.T. Antimicrobial activity of the essential oils from the leaves and stems of Amomum rubidum Lamxay et NS Lý / L. T. Huong, N. T. Viet, L. N. Sam, C. 61

N. Giang, N. H. Hung, D. N. Dai, I. A. Ogunwande // Bol. Latinoame Caribe Plantas Med. Aromát. – 2021. – Vol. 20, № 1. – P. 81-89. 27. Kakarla, S. Antimicrobial activity of essential oils of four lemon grass (Cynbopogon flexus Steud) varieties / S. Kakarla, D. Ganjewala // Med. Arom. Plant Sci. Biotech. – 2019. – Vol. 3, № 1. – P. 107-109. 28. Kim, S.W. Genetic discrimination of Catharanthus roseus cultivars by pyrolysis mass spectrometry / S. W. Kim, J. H. Kim, J. R. Liu // Journal of Plant Biology. – 2009. – Vol. 52, № 5. – P. 462-465. 29. Kool, A. Molecular identification of commercialized medicinal plants in Southern Morocco / A. Kool, H. J. de Boer, Å. Krüger, A. Rydberg, A. Abbad, L. Björk, G. Martin // PloS One. – 2012. – Vol. 7, № 6. – P. 1-12. 30. Kress, W.J. Plant DNA barcodes: Applications today and in the future / W. J. Kress // Journal of Systematics and Evolution. – 2017. – Vol. 55, № 4. – P. 291307. 31. Kress, W.J. Use of DNA barcodes to identify flowering plants / W. J. Kress, K. J. Wurdack, E. A. Zimmer, L. A. Weigt, D. H. Janzen // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2005. – Vol. 102, № 23. – P. 8369-8374. 32. Lang, G. A review on recent research results (2008-2010) on essential oils as antimicrobials and antifungals / G. Lang, G. Buchbaeur // Flav. Frag. J. – 2012. – Vol. 27, № 1. – P. 13-39. 33. Liu, Y. Evaluation of 10 plant barcodes in Bryophyta (Mosses) / Y. Liu, H. F. Yan, T. Cao, X. J. Ge // Journal of Systematics and Evolution. – 2010. – Vol. 48, № 1. – P. 36-46. 34. McGinnis, S. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools / S. McGinnis, T. L. Madden // Nucleic Acids Research. – 2004. – Vol. 32, Suppl 2. – P. 20-25. 35. Mishra, P. DNA barcoding: an efficient tool to overcome authentication challenges in the herbal market / P. Mishra, A. Kumar, A. Nagireddy, D. N. 62

Mani, A. K. Shukla, R. Tiwari, V. Sundaresan // Plant Biotechnology Journal. – 2016. – Vol. 14, № 1. – P. 8-21. 36. Montanari, R.M. Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from Verbenaceae species: Alternative sources of (E)-caryophyllene and germacrene-D / R. M. Montanari, L. C. Barbosa, A. J. Demuner, C. J. Silva, L. S. Carvalho, N. J. Andrade // Quím. Nova. – 2011. – Vol. 34, № 9. – P. 1550-1555. 37. Nascimento, A.M. Synergistic bactericidal activity of Eremanthus erythropappus oil or β-bisabolene with ampicillin against Staphylococcus aureus / A. M. Nascimento, M. G. Brandao, G. B. Oliveira, I. C. Fortes, E. Chartone-Souza // Antonie van Leeuwenhoek. – 2007. – Vol. 92, № 1. – P. 95-100. 38. NIST. National Institute of Science and Technology. NIST Chemistry Webbook / National Institute of Science and Technology // Data from NIST Standard Reference Database 69. – 2018. 39. NCBI. National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine. Bethesda, MD; 1988-2021. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ [accessed April 20, 2021]. 40. Osathanunkul, M. Species identification approach for both raw materials and end products of herbal supplements from Tinospora species / M. Osathanunkul, R. Osathanunkul, P. Madesis // BMC Complementary and Alternative Medicine. – 2018. – Vol. 18, № 1. – P. 111. 41. Oyen, L.P.A. Plant Resources of South East Asia, No 19 Essential Oil Plants / L. P. A. Oyen, , N. X. Dung // Backhuys Publishers, Leiden. – 1999. – P. 278. 42. Pérez-López, A. Activity against Streptococcus pneumoniae of the essential oil and δ-cadinene isolated from Schinus molle fruit / A. Pérez-López, A. T. Cirio, V. M. Rivas-Galindo, R. S. Aranda, N. W. de Torres // J. Essent. Oil Res. – 2011. – Vol. 23, № 5. – P. 25-28. 43. Quisumbing, E. Medicinal plants of the Philippines / E. Quisumbing // Katha Publishing Co., Quezon City, the Philippines. – 1978. – P. 1262. 63

44. Ris, H. Ultrastructure of DNA-containing areas in the chloroplast of Chlamydomonas / H. Ris, W. Plaut // The Journal of Cell Biology. – 1962. – Vol. 13, № 3. – P. 383-391. 45. Sahm, D.H. Antibacterial susceptibility tests: Dilution methods / D. H. Sahm, J. A. Washington // In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shamody HJ, Eds. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology: Washington, DC, USA. – 1991. 46. Sandelius, A.S. The chloroplast: interactions with the environment (Vol. 13) / A. S. Sandelius, H. Aronsson // Springer Science & Business Media. – 2008. 47. Seberg, O. How many loci does it take to DNA barcode a crocus? / O. Seberg, G. Petersen // PloS One. – 2009. – Vol. 4, № 2. – P. 1-6. 48. Selvaraj, D. DNA barcode ITS effectively distinguishes the medicinal plant Boerhavia diffusa from its adulterants / D. Selvaraj, D. Shanmughanandhan, R. K. Sarma, J. C. Joseph, R. V. Srinivasan, S. Ramalingam // Genomics, Proteomics and Bioinformatics. – 2012. – Vol. 10, № 6. – P. 364-367. 49. Serino, G. RNA Polymerase Subunits Encoded by the Plastid rpoGenes Are Not Shared with the Nucleus-Encoded Plastid Enzyme / G. Serino, P. Maliga // Plant Physiology. – 1998. – Vol. 117, № 4. – P. 1165-1170. 50. Shaw, J. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III / J. Shaw, E. B. Lickey, E. E. Schilling, R. L. Small // American Journal of Botany. – 2007. – Vol. 94, № 3. – P. 275-288. 51. Silvestri, J.D.F. Chemical composition and antioxidant and antibacterial activities of clove essential oil (Eugenia caryophyllata Thunb.) / J. D. F. Silvestri, N. Paroun, E. Czyewski, L. Lerin, I. Rotava, R. L. Cansian, A. Mossi, G. Toniazzo, D. Oliveira, H. Treichel // Revista Ceres. – 2010. – Vol. 57, № 5. – P. 589-594. 52. Taberlet, P. Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding / P. Taberlet, E. Coissac, F. Pompanon, L. Gielly, C. Miquel, A. Valentini, T. Vermat, G. Corthier, C. Brochmann, E. Willerslev // Nucleic Acids Research. – 2007. – Vol. 35, № 3. – P. 1-8. 64

53. Tamura, K. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 / K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar // Molecular Biology and Evolution. – 2013. – Vol. 30, № 12. – P. 2725-2729. 54. Thin, D.B. Diversity of vascular plants in Pu Luong nature reserve, Thanh Hoa province / D. B. Thin, P. H. Ban, N. N. Thin // Academia Journal of Biology. – 2013. – Vol. 35, № 3. – P. 293-300. 55. Thinh, B.B. Application of internal transcribed spacer (ITS) sequences for identifying Anoectochilus setaceus Blume in Thanh Hoa, Vietnam / B. B. Thinh, L. D. Chac, L. T. M. Thu // Proceedings on Applied Botany, Genetics and Breeding. – 2020. – Vol. 181, № 2. – P. 108-116. 56. Tomita, M. Studies on the alkaloids of Menispermaceous plants / M. Tomita, H. Furakawa // CCXXXIII. Yakugaku Zasshi. – 1967. – Vol. 87, № 7. – P. 881-882. 57. Tripathi, A.M. The internal transcribed spacer (ITS) region and trnH-psbA are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India / A. M. Tripathi, A. Tyagi, A. Kumar, A. Singh, S. Singh, L. Chaudhary, S. Roy // PLoS One. – 2013. – Vol. 8, № 2. – P. 1-11. 58. Tsumura, Y. Molecular phylogeny of Dipterocarpaceae in Southeast Asia using RFLP of PCR-amplified chloroplast genes / Y. Tsumura, T. Kawahara, R. Wickneswari, K. Yoshimura // Theoretical and Applied Genetics. – 1996. – Vol. 93, № 1-2. – P. 22-29. 59. Van De Wiel, C.C.M. DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides Lf), from non‐invasive relatives / C. C. M. Van De Wiel, J. Van Der Schoot, J. L. C. H. Van Valkenburg, H. Duistermaat, M. J. M. Smulders // Molecular Ecology Resources. – 2009. – Vol. 9, № 4. – P. 1086-1091. 60. van Doorn, W.G. Role of chloroplasts and other plastids in ageing and death of plants and animals: a tale of Vishnu and Shiva / W. G. van Doorn, K. Yoshimoto // Ageing Research Reviews. – 2010. – Vol. 9, № 2. – P. 117-130. 65

61. Van Hoang, S. Uses and conservation of plant species in a national park—a case study of Ben En, Vietnam / S. Van Hoang, P. Baas, P. J. Keβler // Economic Botany. – 2008. – Vol. 62, № 4. – P. 574-593. 62. Van Valkenburg, J.L.C.H. Medicinal and poisonous plants 2 / J. L. C. H. Van Valkenburg, N. Bunyapraphatsara // In: Plant Resources of South-East Asia. Vol 12(2). Leiden: Backhuys Publishers. – 2001. – P. 550-552. 63. Vietnamese Pharmacopoeia. Medical Publishing House, Hanoi, Vietnam. – 2009. 64. Vijayan, K. DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective / K. Vijayan, C. H. Tsou // Current Science. – 2010. – Vol. 99, № 11. – P. 1530-1541. 65. Wang, X. DNA barcodes for the identification of Stephania (Menispermaceae) species / X. Wang, J. Xue, Y. Zhang, H. Xie, Y. Wang, W. Weng, Y. Kang, J. Huang // Molecular Biology Reports. – 2020. – Vol. 47, № 3. – P. 2197-2203. 66. Wu, F. Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: a test case in the euasterid plant clade / F. Wu, L. A. Mueller, D. Crouzillat, V. Pétiard, S. D. Tanksley // Genetics. – 2006. – Vol. 174, № 3. – P. 1407-1420. 67. Yang, P. Molecular identification of Chinese materia medica and its adulterants using ITS2 and psbA-trnH Barcodes: a case study on Rhizoma Menispermi / P. Yang, X. Li, H. Zhou, H. Hu, H. Zhang, W. Sun, Y. Wang, H. Yao // Chinese Medicine. – 2014. – Vol. 5, № 4. – P. 1-8. 68. Yao, H. Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals / H. Yao, J. Song, C. Liu, K. Luo, J. Han, Y. Li, X. Pang, H. Xu, Y. Zhu, P. Xiao, S. Chen // PloS One. – 2010. – Vol. 5, № 10. – P. 1-9. 66

Приложение А Образцы листьев Tinomiscium petiolare 67

Приложение Б Хроматограмма Tinomiscium petiolare на колонке HP-5MS (60 м x 0,25 мм, толщина пленки 0,25 μм), газ-носитель гелий (1 мл/мин) 68

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

0.5

Нгок Линь

Качественная диссертация!

0.5

Кристина Блинова

Достойная работа. Читать было очень интересно. Представляю сколько времени и сил было вложено. Автор - молодец!

0.5

Elena

Очень качественная диссертация. На мой взгляд, очень интересный материал!

15.64

Буй Бао Тхинь

По результатам исследования подготовлено 2 статьи, из которых 1 статья принята к публикации в журнале, индексируемом в базе цитирования Scopus (https://elpub.vir.nw.ru/jour/index) и 1 статья принята к публикации в журнале, индексируемом в базе цитирования WoS (https://doi.org/10.1080/0972060X.2021.1936206). Кроме того, опубликованы 8 генетических последовательностей на GenBank с кодами MW147627, MW147628, MW147629, MW147630, MW123076, MW123077, MW123078 и MW123079 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).