АНАЛИЗ СЕТЕЙ В ИССЛЕДОВАНИЯХ СЛОЖНЫХ СООБЩЕСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Георгий Лиходеевский

АНАЛИЗ СЕТЕЙ В ИССЛЕДОВАНИЯХ СЛОЖНЫХ СООБЩЕСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Анализ сетей - мощный инструмент исследования взаимосвязей компонентов экологических сообществ. Особую сложность для анализа взаимоотношений в сообществах микроорганизмов представляет их многокомпонентность и композиционность данных. В данной работе на основе анализа данных ДНК-метабаркодирования показано 30–40% снижение разнообразия почвенных грибов лесов в градиентах промышленного загрязнения на Южном и Среднем Урале. Эктомикоризные грибы – устойчивая к загрязнению группа. В ходе анализа сетей показана недопустимость оценки совместной встречаемости с помощью стандартных коэффициентов корреляции и необходимость использования методов, предназначенных для композиционных данных. Анализ сетей позволил оценить конкурентные взаимоотношения или разделение экологических ниш между функционально сходными группами грибов, а также взаимоотношения паразит-хозяин.

Биология

Дипломы

Вуз: Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина (УрФУ)

ID: 60439acfccefde00014e1572

UUID: a9c29c40-60bb-0139-2c23-0242ac180002

Язык: Русский

Опубликовано: около 3 лет назад

Просмотры: 4

14.08

Георгий Лиходеевский

Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина (УрФУ)

Комментировать 0

Рецензировать 1

Скачать - 6,5 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина ИНСТИТУТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК И МАТЕМАТИКИ Кафедра экспериментальной биологии и биотехнологий АНАЛИЗ СЕТЕЙ В ИССЛЕДОВАНИЯХ СЛОЖНЫХ СООБЩЕСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ Специальность 06.04.01 «Биология» Зав. кафедрой: Дипломная работа к.б.н., доцент И. С. Киселёва Лиходеевского _________________________ Георгия Александровича ______________________ Нормоконтролер: Научный руководитель от предприятия: ассистент кафедры к.б.н. В. С. Микрюков экспериментальной биологии и _____________________ биотехнологии Научный руководитель от УрФУ: О. В. Воропаева к.б.н., доцент И. С. Киселёва _________________________ __________________ Екатеринбург 2020

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина ИНСТИТУТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК И МАТЕМАТИКИ УТВЕРЖДАЮ Руководитель образовательной программы ____________________ (_______________) «____» _________________ 20__г. Код, наименование направления: 06.04.01 Наименование программы Биология Группа: МЕНМ-280606 ЗАДАНИЕ на выполнение выпускной квалификационной работы студента Лиходеевского Георгия Александровича (Фамилия, имя, отчество) Квалификация: Магистр (бакалавр, специалист, магистр) Провести научное исследование по теме: Анализ сетей в исследованиях сложных сообществах микроорганизмов Срок представления работы научному руководителю: «___» _______ 20___ г. Научный руководитель от предприятия _______________ (Микрюков В. С.) (Подпись) (И.О. Фамилия) Научный руководитель от УрФУ ______________________(Киселёва И. С.) (Подпись) Задание принял к исполнению _________________ (Подпись) 2 (И.О. Фамилия)

Реферат Анализ сетей - мощный инструмент исследования взаимосвязей компонентов экологических сообществ. Особую сложность для анализа взаимоотношений в сообществах микроорганизмов представляет их многокомпонентность и композиционность данных. В данной работе на основе анализа снижение данных разнообразия ДНК-метабаркодирования почвенных грибов показано лесов в 30–40% градиентах промышленного загрязнения на Южном и Среднем Урале. Эктомикоризные грибы – устойчивая к загрязнению группа. В ходе анализа сетей показана недопустимость оценки совместной встречаемости с помощью стандартных коэффициентов корреляции и необходимость использования методов, предназначенных для композиционных данных. Анализ сетей позволил оценить конкурентные взаимоотношения или разделение экологических ниш между функционально сходными группами грибов, а также взаимоотношения паразит-хозяин. Число страниц 102. Количество рисунков 19, таблиц 10, формул 7 и приложений 5. Количество источников литературы 236, в том числе 20 русскоязычных и 216 англоязычных. Ключевые слова: грибные сообщества, метабаркодинг, анализ сетей, загрязнение. 3 экологические сети,

Abstract Network analysis is a powerful tool for studying the relationships between components of ecological communities. Multicomponent and compositional data are the main challenges in the analysis of the relationships within microbial communities. In this work, based on the analysis of DNA metabarcoding data, we showed that the diversity of forest soil fungi decreased by 30–40% in the gradients of industrial pollution in the Southern and Middle Urals. Ectomycorrhizal fungi were found as a pollution resistant group. We demonstrated that the usage of standard correlation coefficients is unacceptable in co-occurrence estimation for compositional data while specialized methods should be used. Network analysis made possible the evaluation of competitive relationships and the separation of ecological niches between functionally similar fungal groups, as well as the hostparasite relationships. The number of pages is 102. There are 19 figures, 10 tables, 7 formulas and 5 supplements. The number of literature sources is 236, including 20 references in Russian and 216 in English. Key words: fungal communities, ecological networks, metabarkoding, network analysis, pollution. 4

Место выполнения работы Лаборатория экотоксикологии популяций и сообществ Института экологии растений и животных Уральского отделения Российской академии наук, город Екатеринбург. 5

Содержание Обозначения и сокращения 8 Введение 9 Основная часть 13 1 Обзор литературы 13 1.1 Изучение микробных сообществ 13 1.1.1 Метагеномика 13 1.1.2 Метабаркодинг 15 1.1.3 Технологии секвенирования в метагеномике 16 1.1.4 Биоинформационный анализ в метагеномике 21 1.2 Биологические сети и методы их анализа 24 1.2.1 История представления сетей в естественных науках 24 1.2.2 Экологические сети 25 1.2.3 Особенности биоинформационного анализа при работе с сетями 26 1.2.4 Основные параметры сети 29 1.3 Грибы 36 1.3.1 Общая характеристика грибов 36 1.3.2 Филогения грибов 37 1.3.3 Метабаркодинг в изучении сообществ грибов 40 2 Материалы и методы 43 2.1 Исследуемые территории 43 2.2 Отбор почвенных образцов 43 2.3 Молекулярно-генетический анализ 44 2.4 Биоинформационный анализ 46 2.5 Статистический анализ 47 3 Результаты 49 3.1 Разнообразие сообществ 49 3.2 Сравнение методов построения сетей 54 3.3 Кластеризованность сетей 56 3.4 Экологические сети в сообществах эктомикоризных грибов 61 6

3.5 Подсети с участием грибов-микопаразитов 68 Выводы 73 Список использованных источников и литературы 74 Приложения 99 7

Обозначения и сокращения ПО – программное обеспечение ПП – пробная площадь рРНК – рибосомная РНК (rRNA, ribosomal RNA) ITS – внутренний транскрибируемый спейсер рРНК (internal transcribed spacer) MAG – полный геном вида, собранный на основе метагеномных данных (metagenome-assembled genome) NGS – секвенирование следующего поколения (next generation sequencing) OTU – операциональная таксономическая единица (operational taxonomic unit) 8

Введение Грибы – одни из основных агентов деструкции растительного опада в почвах бореальной зоны, где они формируют большую часть почвенной микробной биомассы [Frostegård, 1996; Högberg, 2007]. Несмотря на это, в настоящее время существуют значительные пробелы в знаниях о метагеноме почвенных грибов, т.к. большинство работ сосредоточено на изучении сообществ бактерий и архей. Разложение таких сложных органических полимеров как целлюлоза, хитин, фенольные соединения, кератин и пр. представляет каскад превращений, за каждое из которых ответственна та или иная группа организмов [Звягинцев, 1987]. Последовательность реакций, в которой субстратом, необходимым для последующих деструкторов, служат продукты предыдущих превращений, определяет сложную систему взаимоотношений в сообществах почвенного сапротрофного комплекса. Огромный вклад в функционировании сообществ играют конкурентные взаимоотношения. Также сложно переоценить регуляторную роль отношений паразит-хозяин. Таким образом, функционирование сообщества зависит не столько от количества видов, сколько от количества связей между ними, другими словами, от системы взаимоотношений в сообществе. Изучение взаимосвязей в таких многокомпонентных системах как сообщества микроорганизмов – особенно сложная задача, которая до недавнего времени была практически невыполнима. Большие возможности в этой области исследований предоставляет анализ сетей (network analysis) в совокупности с высокопроизводительным секвенированием. В естественных науках анализ сетей успешно зарекомендовал себя при выявлении и описании взаимодействий в таких сложных системах как метаболические сети [Brohée, 2008], генетические регуляторные сети [Crombach, 2008], микробиом человека [Greenblum, 2012], морские и пресноводные сообщества одно- и многоклеточных организмов [Woodward, 2012], бактериальные и грибные сообщества почв [Barberán, 2012; Zheng, 2017]. Для анализа биотических 9

отношений в сообществах, как ни странно, могут быть полезны территории, прилегающие к крупным металлургическим предприятиям. Некоторые из них представляют собой однородные фитоценозы, произрастающие в протяженном градиенте промышленного загрязнения. Уже давно помимо целей восстановления загрязненных земель они привлекают внимание исследователей в качестве длительных и крупномасштабных полевых экспериментов, дающих возможность проверки эволюционных и экологических теорий, главным образом касающихся адаптации биоты к стрессу [Воробейчик, 2012]. Из-за избытка тяжелых металлов в почве и повышенной кислотности загрязненные участки характеризуются сниженным разнообразием сообществ микроорганизмов-деструкторов, и как следствие, замедленным разложением органического вещества [Strojan, 1978; Воробейчик, 1997; Dulya, 2019], и поэтому в полной мере могут быть использованы для экспериментальной проверки последствий потери тех или иных видов и групп видов для функционирования микоценозов. Данная работа представляет собой логическое продолжение исследований связи между разнообразием и функционированием почвенных микробоценозов в лесных сообществах южной тайги Среднего и Южного Урала в зонах с разной степенью нарушенности, вызванной длительным (70– 100 лет) загрязнением промышленными выбросами. Благодаря повышенной кислотности и 10–100-кратному увеличению концентраций тяжелых металлов в верхних горизонтах почвы на загрязненных территориях снижается разнообразие и продуктивность травянистых растений (вплоть до почти полного их исчезновения) [Трубина, 2012; Mikryukov, 2015] и древесного яруса [Хантемирова, 1994], сильно уменьшается обилие дождевых червей [Воробейчик, 1998] и других групп почвенной фауны [Воробейчик, 2007 и 2012; Бельская, 2008], снижается разнообразие эктомикориз [Веселкин, 2004 и 2006], почвенных грибов и бактерий [Mikryukov, 2018, 2020]. О значительном снижении функциональной активности почвенной микобиоты в градиентах загрязнения свидетельствуют 10

мощный слой лесной подстилки, торможение деструкции целлюлозы, [Воробейчик, 1991, 2003 и 2011; Mikryukov 2017] и снижение почвенной эмиссии CO2 [Сморкалов, 2012]. Цель работы – исследование закономерностей формирования сообществ почвенных грибов в условиях сильного токсического стресса на основе анализа сетей. Для достижения цели поставлены следующие задачи. 1. Сравнение подходов к построению сетей на примере сообществ почвенных грибов. 2. Исследование конкурентных взаимоотношений в сообществах эктомикоризных грибов и отношений паразит-хозяин в сообществах грибов-микопаразитов с помощью анализа сетей. 3. Проверка предположений, касающихся реакции грибных сообществ на промышленное загрязнение с точки зрения: 1) состава и разнообразия сообществ, 2) взаимоотношений между их компонентами. В первую группу входят следующие гипотезы:  В градиенте загрязнения ожидается уменьшение гамма-разнообразия, представленного как общее количество OTU почвенных грибов на участке;  С увеличением экосистемной нагрузки происходит снижение альфа- разнообразия почвенных грибов. С помощью анализа экологических сетей проведено тестирование следующих гипотез второй группы:  При значительном снижении видового богатства сообществ грибов с увеличением нагрузки ожидается упрощение экологических сетей, то есть снижение значений мер центральности;  Ранее зарегистрированное многократное снижение функционирования почвенных сапротрофов на сильно загрязненных территориях предполагает выпадение целых функциональных блоков сообществ почвенных грибов, что выражается в виде снижения количества модулей в сетях; 11

 При этом высокая пространственная гетерогенность загрязнения почвы ведет к увеличению модулярности сетей. 12

Основная часть 1 Обзор Литературы 1.1 Изучение микробных сообществ До расцвета молекулярной биологии полная оценка видового разнообразия микробных сообществ была недостижима в экологических исследованиях, что связано в первую очередь с невозможностью культивировать большую часть микроорганизмов [Nannipieri, 2003]. С появлением секвенирования нового поколения (NGS) [Metzker, 2010] стал доступен совершенно новый подход к изучению микробиоты труднодоступных местообитаний и сложных сред [Sleator, 2008]. Сегодня разработаны методики исследования микробиома почв [Burke, 2009], морских глубинных вод [Venter, 2004], кишечника животных [Tokuda, 2007; Eckburg, 2005; Kurokawa, 2007] и даже поверхности морских макроводорослей [Burke, 2009]. 1.1.1 Метагеномика Карл Вёзе и Джордж Фокс в 1977 году впервые предлагают использовать рибосомную РНК (16S и 18S рРНК) в качестве маркеров филогенетических отношений между видами [Woese, 1977]. В том же году Сенгер публикует метод секвенирования ДНК с использованием терминаторов [Sanger, 1977]. В 1986 году Норман Пейс с соавторами описывает использование рРНК для идентификации и подсчёта организмов в природных популяциях, а также описывает методику выделения, клонирования, секвенирования и филогенетического анализа для 5S и 16S РНК [Pace, 1986]. Затем в 1991 году Пейс с командой проводит исследование разнообразия пикопланктона в северо-центральной части Тихого океана близ Гавайев (ALOHA Global Ocean Flux Study site), применив метод дробовика [Schmidt, 1991]. Через четыре года была показана возможность работы с последовательностями ДНК, кодирующими белок (целлюлазы и другие гидролазы) из термофильных анаэробных бактерий, выделенных из сложной лабораторной культуры 13

[Healy, 1995]. Для обозначения набора геномов в образце предложен термин “метагеном” [Handelsman, 1998]. Эти первые работы знаменуют собой появление нового метода в исследовании сообществ микроорганизмов – метагеномики. Метагеномный подход позволяет работать с нуклеиновыми кислотами всего множества организмов в субстрате, оценивая таким образом их популяционное и функциональное разнообразие. В силу того, что более 99% всех микроорганизмов, обитающих в природе и вносящих наибольший вклад в разнообразие и функционирование сообществ [Amann, 1995, Hugenholtz, 1998], не могут быть культивированы, метагеномика оказалась наиболее востребованным инструментом микроорганизмов. Основное при требование работе для с анализа сообществами – на этапе пробоподготовки из образца исследуемого субстрата необходимо выделить в достаточном количестве репрезентативную ДНК высокого качества для дальнейшего формирования ДНК-библиотеки и секвенирования [Thomas, 2012; Head, 2014]. В одной из первых метагеномных работ с некультивируемыми морскими вирусными сообществами в 200 литрах воды было обнаружено более 5000 типов вирусов (бактериофагов и паразитов водорослей); более 65% из них ранее не были описаны [Breitbart, 2002]. Крейг Вентер с группой исследователей обнаружили более 1800 видов (148 видов ранее неизвестных) микроорганизмов в Саргассовом море, а также выявили порядка миллиона новых генов [Venter, 2004]. В глобальном исследовании разнообразия грибов по всему миру обнаружено около миллиона уникальных операциональных таксономических единиц (ОТU), принадлежащих царству Грибы; из которых только у 9,4% последовательностей была установлена видовая принадлежность [Tedersoo, 2013]. Помимо описания биоразнообразия, изучение метагенома важно, например, для описания “метафенома” почв как совокупной функциональности микробных геномов/протеомов и факторов среды [Jansson, 2018]. 14

1.1.2 Метабаркодинг Один из метагеномных подходов состоит в секвенировании методом дробовика и анализе суммарных микробных геномов, содержащихся в образце окружающей среды (рисунок 1.1). Он включает в себя сбор образцов, выделение тотальной ДНК, подготовку библиотеки ДНК (клонирование) и секвенирование полученной случайной библиотеки или проведении ПЦР для получения целевых фрагментов и последующей работы с ними [Riesenfeld, 2004]. Второй подход заключается в высокопроизводительном секвенировании всего множества организмов из образца окружающей среды, используя тотальную и часто деградированную ДНК [Taberlet, 2012]. Из образца выделяется метагеномная ДНК, с помощью ПЦР нарабатывается библиотека ампликонов, которая может быть секвенирована. Эти ампликоны, представляющие собой фрагменты разных участков генома, и есть баркоды. При работе с бактериальными сообществами чаще используют 16S регион, для большинства эукариотических организмов – 18S, для грибов – ITS [Abdelfattah, 2017]. Затем данные обрабатываются биоинформационными методами. Полученные разнообразия путём принято метабаркодинга называть данные микробиота, таксономического совокупные данные секвенированные методом дробовика – микробиом [Ursell, 2012]. История метабаркодинга – это история поиска наиболее универсального маркера для самого широкого спектра организмов. Первым стал митохондриальный ген субъединицы 1 цитохром с-оксидазы (cytochrome c oxidase subunit 1, CO1), успешно применяющийся для биологической идентификации животных [Hebert, 2003]. Использование CO1 для классификации растений оказалось не эффективным, показав низкую вариабельность этого сайта, что потребовало поиска новых решений. Одним из успешных решений стало использование двухмаркерного метода, основанного на хлоропластных генах большой субъединицы рибулозо-1-515

бифосфат карбоксилазы/оксигеназы и матуразы, из интрона гена trnK [Hollingsworth, 2009; Kress, 2009]. Рисунок 1.1 – Схема последовательности исследования 16 работ метагеномного

Использование CO1 в метабаркодировании с целью оценки разнообразия грибов столкнулось с рядом следующих проблем. Слишком высокая изменчивость фрагментов внутри вида; множественные копии различной длины; одинаковые последовательности у разных видов [Schoch, 2012]; необходимость использования вырожденных праймеров, которые могут стать причиной проблем с амплификацией [Gilmore, 2009]; и наконец, отсутствие митохондрий у некоторых клад (например, у облигатных анаэробов отдел Neocallimastigomycota) [Webster, 2007]. Всё это делает невозможным применение маркеров CO1 в исследованиях грибов. Сегодня в работе с грибными сообществами наиболее часто используют два гипервариабельных участка ITS1 и ITS2, при этом оба дают сопоставимые результаты [Blaalid, 2013]. Тем не менее, регион ITS имеет недостаточную генетическую изменчивость, что затрудняет или в некоторых случаях делает невозможным разделение близкородственных таксонов [Schena, 2006]. Эта проблема может быть решена использованием более широкого спектра праймеров [Bellemain, 2010]. И всё же, главное преимущество этого сайта состоит в лёгкой и продуктивной амплификации. К примеру, можно провести до 100% удачных ПЦР при изучении представителей подотдела Saccharomycotina и отдела Basidiomycota, и до 65% – для подотделов Mucoromycotina, Blastocladiomycotina и отдела Chytridiomycota, что выше значений других кандидатных маркеров [Schoch, 2012]. 1.1.3 Технологии секвенирования в метагеномике Секвенирование методом Сенгера (Sanger sequencing) сыграло большую роль в становлении метагеномики, но начиная с 2010-х в метагеномике его полностью заменили технологии секвенирования следующего поколения (NGS, next generation sequencing). В целом NGS методики характеризуются высокой производительностью и меньшей стоимостью секвенирования в пересчёте на нуклеотид. 17

Всего выделяют три поколения секвенирования. Первое поколение – метод терминаторов или метод Сенгера, позволяющий получить прочтения длинной до 1000 п.н. Реакции секвенирования проводят с последующим капиллярным электрофорезом. Несмотря на то, что секвенирование по Сенгеру до сих пор считается эталоном по качеству прочтения ДНК, его стоимость достаточно велика. Так, например, стоимость секвенирования небольшого бактериального генома может составлять до 50 000 американских долларов, причем сумма будет примерно поровну разделена между получением сырых данных и завершением генома [Land, 2015]. Секвенирование второго поколения значительно снизило стоимость чтения ДНК, однако, последовательности, оно длина позволяет которых не получить только превышает 300 короткие п.н. Такое ограничение требует значительного увеличения количества прочтений ДНК, чтобы секвенируемые фрагменты были в достаточной мере покрыты для сборки геномов [Land, 2015]. Технологии второго поколения в погоне за снижением цены и высокой производительностью секвенирования вынуждены идти на компромиссы, связанные с уменьшением длины чтения и частотой ошибок. В отличие от метода терминаторов существуют трудности работы с гомополимерными областями [Escobar-Zepeda, 2015]. И хотя цена секвенирования была значительно снижена (сегодня может потребоваться менее одного доллара на создание чернового бактериального генома), стоимость чистового генома требует больших временных затрат и может составлять более 95% от общей суммы [Land, 2015]. Первым во втором поколении методов секвенирования было предложено пиросеквенирование (pyrosequencing) или технология 454, позже известная как Roche 454. Её принцип состоит в последовательном добавлении нуклеотидов с присоединённым пирофосфатом, который в процессе полимеризации ДНК высвобождается, преобразуясь в световой сигнал. Секвенатор детектирует этот сигнал, испускаемый миллионами микроячеек, содержащих данный фрагмент ДНК и записывает результат в виде 18

нуклеотидной последовательности с соответствующим значением качества прочтения каждого основания [Margulies, 2005]. Уже в 2006 в метагеномном анализе было применено пиросеквенирование в работе с образцами тканей ископаемого мамонта [Poinar, 2006]. Однако на сегодняшний день платформа устарела и компания Roche, владелец технологии 454, более не поддерживает её [Karow, 2013]. В 2007 году корпорация Illumina приобретает компанию Solexa, которая годом ранее выпустила геномный анализатор (Solexa GA) [Liu, 2012]. В результате становится доступной технология секвенирования, использующая четыре нуклеотида, модифицированных флуоресцентным красителем и блокирующей группой. В процессе присоединения такого нуклеотида флуоресцентная молекула возбуждается лазером, и сигнал регистрируется машиной. В конце цикла флуорофор или не присоединённый нуклеотид вымываются. Данная технология обладает возможностью одно- или парноконцевого секвенирования (single-end/pair-end sequencing) с максимальной длиной считывания до 300 п.н. и улучшенным качеством прочтения ДНК (в особенности гомополимерных участков) [Bennett, 2004]. На данный момент для метагеномных исследований широко используются два инструмента Illumina – MiSeq и HiSeq. Первый чаще применяется при секвенировании ампликонов 16S, 18S, ITS1 и ITS2 [Nowinski, 2019; Sessou, 2019; Mbareche, 2020], второй – для анализа метабиома среды [Nowinski, 2019], в том числе для выявления функциональных групп генов сообщества [Hassa, 2018] или для сборок генома отдельных представителей сообщества (MAGs, metagenome-assembled genomes) [Frank, 2016]. Другая технология секвенирования – ионное полупроводниковое секвенирование (Ion semiconductor sequencing) – выпущено в 2010 году [Liu, 2012], оно регистрирует изменение водородного потенциала, происходящее при высвобождении протона после добавления нуклеотида в реакции полимеризации [Rothberg, 2011]. Этот подход также может использоваться в 19

метагеномных исследованиях микробных сообществ из-за своей низкой стоимости, высокой производительности и простой масштабируемости [Whiteley, 2012], однако, качество получаемых с помощью наиболее популярного прибора Ion Torrent PGM прочтений ДНК уступает технологии Illumina. К третьему поколению технологий определения последовательности ДНК относятся методы секвенирования молекул в реальном времени с возможностью получения длинных прочтений, составляющих до нескольких десятков тысяч п.н. [Land, 2015]. В настоящее время представлены две технологии – PacBio RS от Pacific Bioscience [Fichot, 2013] и Oxford Nanopore [Kasianowicz, 1996], которые решают проблемы коротких чтений и сокращают время и экономические затраты на секвенирование. Однако частота ошибок секвенирования у данных методов еще уступает другим технологиям [Hardwick, 2018; Sevim, 2019]. Так, технология Illumina в сравнении с PacBio показала лучший результат при секвенировании метагенома 16S библиотек микробиоты кишечника человека [Whon, 2018] и при метабаркодировании грибов по сайту SSU+ITS+LSU с использованием длинных (>3000 п.н.) ампликонов [Tedersoo, 2017]. Проверка Illumina, PacBio и Oxford Nanopore (ONT) на синтетическом микробном сообществе из 12 штаммов бактерий показала, что сборка каждого отдельного генома на основе Illumina даёт хорошее покрытие с небольшим числом ошибок, а совместное использование Illumina+ONT и Illumina+PacBio приводит к неправильным сборкам из-за близкородственных видов [Sevim, 2019]. Однако при работе с последовательностями до 1500 п.н. качество сборки в связке HiSeq+PacBio значительно увеличивается [Frank, 2016]. Главное преимущество второго и третьего поколений секвенирования над первым заключается в отсутствии необходимости клонирования исследуемой ДНК в векторы, что существенно упрощает процесс работы с ДНК-библиотекой и уменьшает загрязнение образца метагенома [EscobarZepeda, 2015]. 20

1.1.4 Биоинформационный анализ в метагеномике Полученная в результате секвенирования информация хранится в формате FASTQ. Файл FASTQ содержит в первой строке идентификатор прочтения ДНК, начинающийся с “@”, его нуклеотидную последовательность во второй строке, строка три, начинающаяся с символа “+”, может дублировать идентификатор, любое описание или оставаться пустой и в четвёртой – оценка качества прочтения (рисунок 1.2). Рисунок 1.2 – Пример FASTQ-файла Основные этапы биоинформационного анализа метагеномных данных включают: 1. Фильтрацию последовательностей ДНК с низким качеством прочтения; 2. Удаление вспомогательных последовательностей (адаптеров, баркодов, участков, комплементарных праймерам); 3. Коррекцию ошибок секвенирования; 4. Сборку парно-концевых чтений; 5. Дерепликацию (объединение одинаковых последовательностей в одну с сохранением информации об их общем количестве). 6. Объединение прочтений в OTU на основе сходства их последовательностей; 7. Удаление химерных последовательностей (артефактов, возникших в результате преждевременной терминации ПЦР); 8. Таксономическую или функциональную последовательностей и подсчёт их обилий. 21 классификацию

В Таблице 1.1 представлен перечень основных инструментов, используемых для биоинформационного анализа метагеномных данных. Сам анализ может быть построен путём объединения специализированных программ в единый конвейер (“пайплайн”, pipeline), или основываться на использовании многофункциональных программных пакетов, таких как QIIME2 [Bolyen, 2019], mothur [Schloss, 2009], AMPtk [Palmer, 2018] и др. Для выявления взаимоотношений между видами в сообществе может быть проведен анализ экологических сетей. Для этого на основе таблицы обилий OTU рассчитывают матрицу смежности (adjacency matrix), которая представляет собой один из способов отображения графа. Анализ сетей, как правило, не входит в многофункциональные пакеты QIIME2 или mothur, но может быть реализован с использованием специализированных утилит в среде программирования R (Таблица 22 1.1) [R Core Team, 2020].

Таблица 1.1 – Основное программное обеспечение, используемое для биоинформационного анализа метагеномных данных и последующего анализа экологических сетей Этапы анализа Фильтрация данных секвенирования Фильтрация и исправление Удаление вспомогательных последовательностей Сборка парно-концевых прочтений Удаление химерных последовательностей Дерепликация Кластеризация OTU Классификация и подсчёт обилий Создание сетей и работа с ними Коррекция ошибок секвенирования Таксономическая классификация Нормализация данных Создание матрицы смежности Аннотация сети Визуализация сети Отдельные инструменты qrqc, MultiQC, PRINSEQ, ConDeTri, NGS QC Toolkit, FASTX-Toolkit Trimmomatic, Atropos, PRINSEQ, FASTX-Toolkit, CutPrimers PEAR, SeqPrep, COPE, FLASH, PANDAseq, Stitch AMPtk VSEARCH, BLAST make.contigs* amptk illumina*, amptk ion*, amptk SRA*, Amptk 454* Cutadapt trim.seqs* pcr.seqs → align.seqs USEARCH, VSEARCH UPARSE USEARCH, SWARM, CD-HIT Starcode, CLUSTOM, Hc-OTU USEARCH RACER, SGA-EC, BFC DADA2 BLAST amptk taxonomy* phyloseq, metagMisc, metagenomSeq CCREPE, SparCC, SPIEC-EASI, метод Пирсона, метод Спирмена igraph Gephi, Cytoscape amptk filter –normalize* 23 mothur USEARCH USEARCH CD-HIT * собственные функции пакета Пакеты анализа QIIME2 VSEARCH DADA2, Deblur qiime featureclassifier* DESeq, rarefy* - VSEARCH, UCHIME, chimera.perseus* unique.seqs* cluster* dist.seqs* seq.error* classify.seqs*, classify.otu* rarefaction.single* - - - -

1.2 Биологические сети и методы их анализа 1.2.1 История использования сетей в естественных науках Впервые идея представить взаимоотношения объектов графически была выдвинута социологом Якобом Леви Морено в его работе 1934 года “Who Shall Survive? A new Approach to the Problem of Human Interrelations”. Морено предложил использовать ориентированный граф, в котором вершинами были объекты наблюдения (люди и/или социальные группы), а направленными рёбрами – некоторые типы их взаимодействий (рисунок 1.3). Рисунок 1.3 – Пример иллюстрации социальных связей в виде графа из книги Якоба Морено “Who Shall Survive?”. Узлы соответствуют членам группы, рёбра социальным контактам [Moreno, 1934] Широкое применение подобный подход отображения взаимоотношений нашёл в естественнонаучных дисциплинах – при работе с цепями питания [Paine, 1966; Gotelli, 2006], генетической регуляцией [Kauffman, 1971; Zupan, 2003], в филогенетике (рисунок 1.4) [Ward, 1972], иммунологии [Urbain, 1976], в исследованиях онтогенеза [Wolpert, 1975], при анализе социальных связей между животными [Simonds, 1974]. В 1966 году Гарольд Моровиц 24

попытался применить такой же подход к описанию круговорота углерода (рисунок 1.5) [Morowitz, 1966]; в 1974 году он перенёс идеи графов для описания химических реакций [Morowitz, 1974]. Рисунок 1.4 – Пример иллюстрации филогенетических отношений и генетических растояний между членами племени Яномама в виде графа [Ward, 1972] Рисунок 1.5 – Пример иллюстрации превращения углеродсодержащих соединений (A, B и C) в виде графа; k1–k6 – равновестные концентрации [Morowitz, 1966] 1.2.2 Экологические сети Необходимо сразу оговорить, что в русскоязычном информационном пространстве под природоохранная термином экологическая концепция, сеть больше предполагающая известна организацию пространственно-связанных охраняемых территорий. В данной работе я буду придерживаться терминологии, согласно которой экологическая сеть (ecological network) – это способ отображения взаимоотношений видов в 25

сообществе. Экологическая сеть представляет собой граф, в котором узлы – это виды, а рёбра – связи, обозначающие взаимоотношения пары видов и представляющие собой меры их совместной встречаемости. Для видов, встречающихся (преимущественно) совместно, связи положительны и могут отражать симбиотические взаимоотношения или сходные экологические предпочтения. Соответственно, при отрицательной связи между встречаемостью видов, можно ожидать их антибиоз или разделение экологических ниш. Отсутствие связи между парой узлов, подразумевает, что между встречаемостью данных видов не обнаружено статистически значимой положительной или отрицательной связи. Сеть – удобное средство визуализации межвидовых взаимоотношений. Вместе с тем сама по себе сеть вряд ли может представлять формализованную характеристику сообщества, особенно в случае многовидовых микробиомов. Однако на основе сетей можно рассчитать описательные параметры сообществ и их компонентов, используя специализированный математический аппарат [Glass, 1975; McCann, 1997] и информационные подходы [Liang, 1998; Akutsu, 1999]. 1.2.3 Особенности анализа сетей на метагеномных данных Метагеном – совокупная генетическая информация, полученная из образца среды [Handelsman, 1998]. Анализ метагеномных данных, наряду с отбором проб и выделением тотальной ДНК из природных образцов (environmental DNA) – одна из важнейших составляющих описания микробных сообществ. секвенирования – их Главная особенность композиционность. данных метагеномного Композиционные данные, представляют собой количественные значения частей некоторого целого и содержат лишь информацию об относительной представленности отдельных компонентов [Aitchison, 1986]. Неотъемлемое свойство композиционных данных – ограничение постоянной суммы (constant sum constraint, CSC) которое обусловливает взаимзависимость всех компонентов целого. Проще говоря, увеличение доли одного компонента влечет снижение доли остальных 26

компонентов, и наоборот. Композиционность метагеномных данных обусловлена фиксированной производительностью высокопроизводительных секвенаторов. Например, количество чтений ДНК (ридов; sequence reads), получаемых миллионов, секвенатором которые Illumina MiSeq, распределяются составляет между примерно молекулами 20 ДНК пропорционально их обилию в образце. Таким образом полученные данные сводятся к вероятности наблюдения рида при заданной глубине секвенирования. Различные платформы для секвенирования имеют разные пределы количества чтений. Кроме того, методические и технические трудности при загрузке равных молярных количеств ДНК-библиотек (DNA library) отдельных образцов приводят к отличиям в объемах получаемых данных у изучаемых образцов. Всё это приводит к сложности в сборе одинаковых количеств прочтений для каждого образца [Gloor, 2017]. Суммарное число наблюдаемых ридов (часто называемое глубиной секвенирования или покрытием; sequencing depth, coverage) – основополагающий фактор, влияющий на расчеты [McMurdie, 2014]. Анализ подобных относительных данных, как если бы они были абсолютными, с высокой вероятностью даст ошибочные результаты при нормализации, вычислении матрицы расстояний или несходства, а также корреляционном анализе [Quinn, 2019]. В первую очередь это обусловлено тем, что многие статистические модели предполагают независимость между компонентами, а в метагеномных данных связи прямые [van den Boogaart, 2008]. Также в случае если компоненты статистически независимы, они могут казаться взаимосвязанными [Pearson, 1896]. Помимо этого, расстояния между образцами могут быть чувствительны к произвольному включению или исключению из анализа отдельных компонентов [Aitchison, 2000] (например, контаминантов секвенированной из-за или ДНК недостаточной праймеров). 27 других групп специфичности организмов, используемых

Все эти причины предполагают необходимость использования специальных методов анализа. Для расчёта матрицы смежности (adjacency matrix) используют: коэффициенты линейной корреляции Спирмена [Spearman, 1904] и Пирсона [Pearson, 1909], MPLasso [Lo, 2017], REBACCA [Ban, 2015], SPRING [Yoon, 2019], CCREPE [Schwager, 2020], SPIEC-EASI [Kurtz, 2015], SparCC [Friedman, 2012]. Как я уже указывал, полученные с помощью методов Пирсона и Спирмена результаты подвержены значительным искажениям из-за композиционности данных и содержат большое число ложных связей. Поэтому остановимся подробнее на описании трёх последних методов. CCREPE (Compositionality Corrected by Renormalization and Permutation; Schwager, 2020) это пакет языка программирования R, разработанный для анализа композиционных данных. Корреляция между признаками рассчитывается на основе коэффициентов Пирсона или Спирмена, однако, главная особенность метода заключается в использовании метрики NC-Score (N-dimensional checkerboard score) [Stone and Roberts, 1990] – меры сходства, которая особенно подходит для композиционных данных [Schwager, 2020]. Этот метод использовался для построения сетей совместной встречаемости на основе данных микробного секвенирования [Gevers, 2014; Vazquez-Baeza, 2016]. В алгоритме SPIEC-EASI (Sparse InversE Covariance estimation for Ecological Association and Statistical Inference; Kurtz, 2015) для работы с композиционными данными матрицы обилия OTU применяется преобразование централизованным логарифмическим отношением (centered log-ratio или clr-transformation) [Aitchison, 1981]. Для построения сети используется один из методов: (1) выбор разреженной обратной ковариации или GLASSO [Friedman, 2008] и (2) выбор окрестности (neighborhood selection) [Meinshausen, 2006] или MB. Главная особенность SPIEC-EASI при построении сети – концепция «условной независимости узла». Данный подход позволяет избегать обнаружения косвенной связи между OTU [Kurtz, 28

2015]. В отличие от метода выбора окрестностей (MB), у метода GLASSO выше вероятность ошибок первого рода, то есть он больше подвержен выявлению ложных связей [Schwager, 2017]. Метод SparCC [Friedman, 2012] основан на сравнении суммы дисперсий преобразованных обилий двух OTU и разницы суммы дисперсий с поправкой на корреляцию между ними. Обилия трансформируют с помощью логарифма отношения (log-ratio transformation). SparCC рекомендуется использовать в случае высокой композиционности данных [Weiss, 2016]. Но точность оценки может быть снижена из-за того, что SparCC не учитывает влияние ошибок в композиционных данных [Fang, 2015]. В 2018 году Уоттс с соавторами представил FastSpar – быструю и распараллеливаемую реализацию алгоритма SparCC [Watts, 2019]. Показано, что между результатами, полученными с использованием SparCC, SPIEC-EASI и метода Пирсона, не обнаруживается существенной разницы в эффективности оценки микробных экологических сетей в случае, если анализируемые численности видов были определены с помощью динамики популяции (уравнение GLV, generalized Lotka–Volterra) [Berry, 2014; Hirano, 2019]. Также в случае отрицательной связи двух узлов методы SparCC и SPIEC-EASI (MB) плохо обнаруживают истинную корреляцию [Schwager, 2017]. 1.2.4 Основные параметры сети Зная структуру сети можно рассчитать параметры, характеризующие отличительные черты топологии интересующей нас сети. В целом сеть можно описать с помощью таких простых мер как диаметр и радиус. Наиболее полную информацию о топологии можно получить рассчитав модулярность, ассортативность и транзитивность сети. Так же важно, например, для поиска ключевых видов сообщества, оценивать особенности отдельных вершин (меры центральности). 29

Диаметр, эксцентриситет и радиус Диаметром сети называют наибольшее расстояние между его вершинами. Эксцентриситет – это максимальный путь от одной вершин до любой другой, а радиусом – наименьший из эксцентриситетов сети [Омельченко, 2018]. Транзитивность Аналогично понятию транзитивности в математике, транзитивность (transitivity) в анализе сетей означает, что наличие связей между вершинами u и v, а также v и w, существует связь между u и w. Иначе, транзитивность дает количественную оценку утверждению «Друзья моих друзей - друзья» [Burk, 2007] и описывает неоднородность сети, количественно определяя степень, в которой узлы объединены. Транзитивность хорошо применима в отношении социальных сетей, например, описания взаимодействия особей внутри группы и социальной структуры сообщества как у животных [Ilany, 2013], так и человека [Ilany, 2016]. Она также может помочь в обнаружении новых связей в метаболитической сети полученной по данным метагеномного секвенирования [Buttigieg, 2013]. Транзитивность позволяет выявлять общие черты в таких сложных структурах, как пищевые цепи [Bramon, 2018]. Однако, данная мера не является информативной для микробиологических сетей. По причине того, что мы оперируем не истиной сетью взаимодействия, а лишь предполагаемой [Wang, 2016]. Ассортативность Анализ сетей позволяет количественно оценить такой широко известный феномен в социологии, психологии и популяционной генетике, как ассортативность (assortativity), то есть предпочтение объектов формировать связи со сходными с ним объектами [Newman, 2002]. В зависимости от задач исследования, произвольны параметры, по которым оценивается сходство объектов. Они могут быть количественными – например, степень сходства объектов по фенотипу, генотипу или сходство узлов по степени (числу их связей), а также качественными – например, принадлежность к какой-либо 30

таксономической или функциональной группе. Ассортативность принимает значения от –1 в дисассортативной сети, в которой узлы высокой степени преимущественно соединены с узлами низкой степени или связи сформированы в основном между объектами из разных групп, до 1 в сети с разобщенными группами сходных объектов. Для большинства биологических объектов (например, сетей белок-белкового взаимодействия, транскрипционных и нейронных сетей, сетей регуляции генов, а также цепей питания) характерна дисассортативность и, соответственно, большая уязвимость к удалению вершин высокого порядка [Newman, 2002; Piraveenan, 2012]. Модулярность Одна из важных количественных характеристик сетей – модулярность (M, modularity), описывающая степень разделения сети на подсети (кластеры, сообщества, группы или модули). Она представляет собой разность вероятности связи вершин определенной группы между наблюдаемой сетью и случайной сетью того же порядка (т.е. с тем же разделением вершин между кластерами, но случайными связями между вершинами), и определяется с помощью уравнения: ∑ ( ), (1.1) где eii - это доля рёбер между вершинами группы i от числа всех рёбeр в сети; ai2- доля рёбер, между вершинами из группы i в случайной сети. Значение модулярности может быть как положительным в кластеризованных сообществах (вероятность связи между вершинами одной группы выше, чем случайная), так и отрицательным (в случае, если степень структурированности сети меньше, чем в случайной сети) [Newman, 2004]. С помощью анализа модулярности выявлены особенности метаболических сетей бактерий, обусловленные стабильностью условий среды. Модулярность 31

метаболических сетей бактерий, живущих в меняющихся условиях, выше в сравнении с бактериями, живущими в более стабильных условиях [Kreimer, 2008]. Однако в сетях с большим числом узлов не удаётся достоверно выявить зависимость модулярности от окружающих условий [Takemoto, 2011; Deng, 2012]. Модулярность, пожалуй, один из самых многообещающих инструментов в исследованиях биологических и экологических сетей. В зависимости от целей исследования группы объектов могут быть выбраны произвольно (подробнее это рассмотрено в разделе про ассортативность). Однако, как правило, больший интерес представляет поиск групп тесно связанных объектов в исследуемых сетях. В терминологии анализа сетей такие группы принято называть сообществами или модулями. С учетом важности выявления модулей в сетях для эпидемиологии, медицины, социологии, в технических и многих других отраслях разработано множество алгоритмов поиска сообществ (community detection algorithms) [Yang, 2016] На примере сетей внутригруппового взаимодействия общественных животных, где фиксируется частота контактов особей друг с другом, модули могут иллюстрировать подгруппы внутри социальных групп. В таких подгруппах частота контактов особи выше с членами подгруппы, чем с особями остальной группы [Mourier, 2012, Sah; 2016]. Модули в социальных группах появляются в результате поведенческих, демографических, экологических и ландшафтных факторов [Sah, 2017]. Выявление модулей в социальных сетях помогает при изучении распространения болезней в сообществах [Salathe, 2010; Sah, 2017]. В экологических сетях принадлежность видов к тому или иному модулю может указывать на сходство их экологических ниш [Chaffron, 2010]. Разделение грибных и бактериальных сетей на подсети может зависеть от географического положения, а также факторов среды, например, содержания фосфора в почве [Bonito, 2019]. В фитопланктонных сообществах показано, 32

что модули сети соответствуют глубинам отбора проб, что также указывает на пространственное разделение экологических ниш [Fuhrman, 2015]. Центральность Центральность – это одна из мер, с помощью которой определяют ключевые узлы (v) в сети (V), то есть виды с наибольшим количеством взаимодействий в сообществе. В исследованиях наиболее часто используются следующие типы центральностей: центральность по степени (degree centrality), центральность по близости (closeness centrality), центральность по промежуточности (betweenness стресс-центральность centrality), (stress centrality), а также центральность по эксцентриситету (eccentricity centrality). Одна из самых простых мер центральности в сети – это степень узла (CD, node degree), которая представляет собой число связей (рисунок 1.6а), входящих и исходящих из данного узла [Newman, 2010]. Она рассчитывается по формуле: ( ) ( ), (1.2) где deg(v) – степень узла [Brandes, 2001]. Центральность по близости (CC) определяется как величина, обратная сумме кратчайших путей от узла до других узлов (рисунок 1.6б) и отвечает на вопрос: насколько один узел близок к другим узлам [Sabidussi,1966]: ( ) ∑ ( ) , (1.3) где dG(v, t) - это геодезическое (кратчайшее) расстояние между вершинами v и t [Brandes, 2001]. 33

Центральность по промежуточности (CB) показывает, как часто узел встречается на кратчайших путях между двумя другими узлами (рисунок 1.6в) и рассчитывается по формуле: ( ) ∑ , (1.4) где s, t и v узлы; σst – общее число кратчайших путей из узла s в узел t; σst(v) – число путей, проходящих через v [Brandes, 2001]. Стресс-центральность (CS) определена как число кратчайших путей между двумя узлами, которые проходят через третий; и используется для подсчёта геодезических путей проходящих через узел (рисунок 1.6г). ∑ ( ), (1.5) где s, t и v - вершины; σst(v) – число путей между s и t, проходящих через v [Brandes, 2005]. Центральность эксцентриситета (CEcc) представлена на рисунке 1.6д и рассчитывается как обратная величина к наибольшему (Max()) геодезическому расстоянию между узлами [Bouttier, 2003] следующим образом: ( ) ( ( )) , (1.6) где dist(v,t) – все возможные пути между вершинами v и t [Hage, 1995]. На примере белковой сигнальной сети, эксцентриситет узла можно интерпретировать как легкодоступность, с которой белок функционально 34

достигается всеми другими белками в сети. Так, белок с высоким эксцентриситетом, по сравнению со средним эксцентриситетом сети, зависит от активности большего числа других белков (белок подвержен сложной регуляции) или, наоборот, может непосредственно влиять на множество других белков [Scardoni, 2009]. Рисунок 1.6 – Визуализация центральности узлов одной и той же сети в зависимости от используемой меры: а. центральность по степени; б. центральность по близости; в. центральность по промежуточности; г. стрессцентральность; д. центральность по эксцентриситету. Чем темнее узел, тем выше значение центральности 35

1.3 Грибы 1.3.1 Общая характеристика грибов Грибы – это эукариотические гетеротрофные организмы, получающие питательные вещества только осмотрофным путём [Звягинцев, 2005]. На сегодняшний день описано порядка 100–250 тысяч видов [Федоров, 1976; Гарибова, 2005; Hawksworth, 2017]. Вместе с тем, считается, что это меньшая часть потенциального разнообразия грибов. Некоторые исследователи строят прогнозы, по которым насчитываться 1.5–5 миллионов [Choi, 2017], 2.2–3.8 миллионов видов, самые смелые предположения говорят о свыше 10 миллионов видов [Hawksworth, 2017; Nilsson, 2018]. Тело гриба представляет собой таллом, погруженный или находящийся на поверхности субстрата, при этом клеточная стенка гриба непосредственно касается его, что и определяет адсорбционный тип питания. Через клеточную стенку выделяются пищеварительные ферменты, разлагающие полисахариды: пектиназы – пектин; ксиланазы, целлобиазы и целлюлазы – целлюлозу и гемицеллюлозу; амилаза – крахмал. Грибы способны разрушать более прочные природные полимеры – некоторые древоразрушающие виды (например ряд представителей Polyporales, Agaricales) используют лигниназы для расщепления лигнина – наиболее прочного полимера растений; для паразитических грибов (например видов из родов Nectria, Puccinia) характерны кутиназы, расщепляющие кутикулярные воска растений [Schäfer, 1993]; паразиты животных и сапротрофы, питающиеся животными остатками (например представители Onygenales, Hypocreales) выделяют ферменты, разрушающие кератин и хитин беспозвоночных [Lange, 2016]. Питание такими растительными полимерами, как целлюлоза и лигнин, и подобный тип взаимодействия с субстратом обуславливает то, что подавляющее число грибов занимают экологическую нишу разлагателей органических веществ [Звягинцев, 2005; Дьяков, 2007]. Наиболее распространённые типы грибного таллома – амёбоидный, дрожжеподобный и мицелиальный. 36 Первые два типа представлены

одноклеточными жизненными формами. Амебоидные клетки характерны для всех представителей филогенетически базальных групп, например, для Microsporidia. Дрожжеподобная жизненная форма встречается у многих представителей Ascomycota, Basidiomycota и Mucoromycotina [Kurtzman, 2010]. Многоклеточная, то есть, мицелиальная жизненная форма характерна для большинства видов грибов. И хотя, истинные ткани у грибов отсутствуют (исключением являются лабульбениевые аскомицеты), при прорастании плодовых тел мицелий формирует плектенхимы (ложные ткани) [Дьяков, 2007]. Грибы способны как к бесполому размножению с помощью конидий и спор, так и половому при котором происходит образование различных половых структур – зигоспор, сумок или базидий [Звягинцев, 2005]. 1.3.2 Филогения грибов Эволюционные взаимоотношения грибов и таксономический ранг тех или иных групп – предметы многочисленных дискуссий [Wainright, 1993; Berbee, 2017; Tedersoo, 2018]. Наиболее современные систематические сводки, основанные на филогенетическом анализе генетических последовательностей грибов, представлены в таких общедоступных базах данных как MycoBank (http://www.mycobank.org/), курируемой сотрудниками института грибного биоразнообразия им. Вестердейк (Утрехт, Нидерланды) и Index Fungorum (http://www.indexfungorum.org/) поддерживаемой ведущими научными организациями Британии, Китая и Новой Зеландии. На уровне крупных эволюционных клад согласно топологии филогенетического дерева эукариот клада Holomycota (грибы в широком понимании как группа сестринская к Holozoa) включает царство Cristidiscoidea (т.н. нуклеарии) и царство Fungi. Царство Fungi объединяет клады паразитических протистов, названные Aphelida, Rozellosporidia (внутриклеточные паразиты водорослей) [Karpov, 2017] и Microsporidia (паразиты беспозвоночных и позвоночных) [Han, 2017] с большим 37

количеством представителей, основная часть которых обнаружена только недавно с помощью секвенирования природных сред [Karpov, 2014]. Последняя, крупнейшая ветвь Holomycota – «настоящие грибы» (true fungi) в соответствии систематикой, предложенной Tedersoo et. al. 2018, включает 7 подцарств и 16 отделов. Представители отдела Blastocladiomycota обладают моно-центрическим или полицентрическим талломом, способны образовывать гифы. Для них характерны зооспоры с одним жгутиком и анизогамный половой процесс с подвижными гаметами [Tedersoo, 2018]. Blastocladiomycota – обитатели пресных водоёмов, ила и почв, где ведут сапротрофный образ жизни в качестве разлагателей растительных и животных остатков; встречаются паразиты членистоногих. Сегодня насчитывается приблизительно 200 описанных видов [Watkinson, 2008]. Подцарство Chytridiomyceta объединяет около 900 видов с многоядерным несептированным талломом амёбоидного типа; зооспора этих грибов с одним или большим (до 20) числом жгутиков; встречаются разнообразные формы полового процесса: изогамия, анизогамия с двумя подвижными гаметами, оогамия и соматогамия. Грибы отдела Chytridiomycota сапротрофы или паразиты наземных растений и водорослей, а также животных и грибов. Встречаются в почвах, в том числе сельскохозяйственных, морской и пресной воде. Monoblepharomycota – отдел в котором большая часть видов сапротрофы, но встречаются паразиты пресноводных водорослей (класс Sanchytriomycetes). Среди всего царства Fungi они уникальны благодаря оогамному половому процессу [Webster, 2007]. В отдел Neocallimastigomycota входят высокоспециализированные анаэробы, живущие в пищеварительном тракте травоядных млекопитающих [Webster, 2007; Watkinson, 2008; Tedersoo, 2018]. Отделы Olpidiomycota и Basidiobolomycota – широко известные паразиты растений и животных, соответственно. У видов отдела Olpidiomycota таллом моноцентрический, голокарпический или эукарпический; зооспоры задние, 38

унифлагеллатные. У видов Basidiobolomycota описан дрожжевидный или мицелиальный таллом, с правильными перегородками; зигоспоры с толстыми двухслойными стенками [Webster, 2007; Tedersoo, 2018]. Подцарство Zoopagomyceta объединяет грибы с мицелием, разделенным на клетки сплошными или одноперфорированными перегородками; половое размножение, если оно есть, осуществляется с помощью зигоспор. Подцарство разделено на три отдела. В отделе Kickxellomycota описаны сапротрофы почв, микопаразиты и кишечные симбионты членистоногих. Zoopagomycota – грибы, паразитирующие на простейших и нематодах. Большинство – паразиты Entomophthoromycota насекомых и других животных, а также десмидиевых водорослей и заростков папоротников, встречаются и сапротрофы обитающие в почве [Webster, 2007; Tedersoo, 2018]. Для видов подцарства Mucoromyceta характерен несептированный многоядерный мицелий, перегородка возникает только при формировании репродуктивных клеток; половое размножение осуществляется зигоспорами. Большинство представителей отделов Mortierellomycota, Mucoromycota, Calcarisporiellomycota – сапротрофные организмы, обитающие в почве и на непереваренных остатках, встречаются патогены мягких тканей растений. Особую группу эндомикоризных симбиотов растений, за редкими исключениями (пример хищничества Geosiphon pyriformis [Kluge, 2002]), формируют грибы из отряда Glomeromycota [Webster, 2007; Tedersoo, 2018]. В течение долгого времени Mortierellomycota, Mucoromycota, Entomophthoromycota, Kickxellomycota, Zoopagomycota объединяли в отдел Zygomycota [Watkinson, 2008]. Однако сейчас полифилетическое происхождение его представителей не вызывает сомнений. Наконец, подцарство Dikarya, которое включает три отдела грибов с септированным мицелием или дрожжеподобным талломом; клетки двуядерные, каждое ядро содержит гаплоидный набор хромосом. Известно приблизительно 64 тысячи представителей Ascomycota – отдела с самым 39

большим количеством видов во всем царстве [Beimforde, 2014]. В процессе полового размножения они образуют сумку с восемью аскоспорами. Это сапротрофные и некротрофные грибы, а также паразиты растений и животных, включая человека [Звягинцев, 2005; Дьяков, 2007; Webster, 2007]. Отдел Basidiomycota объединяет порядка 30000 видов, которые имеют в качестве структур полового размножения базидии. Встречаются морские и пресноводные формы, но большинство представителей ведут наземный образ жизни в качестве сапротрофов (играют важную роль в разрушении лигнина [Nagy, 2015]), микоризообразователей, патогенов растений [Webster, 2007]. Отдельного внимания заслуживают лишайники – суперорганизмы представляющие собой симбиотическую структуру гриба, водорослей и/или цианобактерий [Sanders, 2006]. В отделе Entorrhizomycota насчитывается около 14 видов паразитов, образующих галлы на корнях [Bauer, 2015]. 1.3.3 Метабаркодинг в изучении сообществ грибов Благодаря множеству методов, основанных на прямой изоляции из почвенных образцов и последующем анализе состава нуклеиновых кислот [Griffiths, 2000], белков [Nannipieri, 2006] и липидов [Hedrick, 2000], появилась возможность корректно оценивать структурное и функциональное разнообразие почвенного микробиома в целом. Новейшие молекулярные подходы, такие как метабаркодинг [Martin-Laurent, 2001], метагеномика [Huson, 2007], метапротеомика [Bastida, 2009], метатранскриптомика [Kellner, 2010] и протеогеномика [Banfield, 2005] особенно перспективны для оценки и характеристики гигантского разнообразия почвенных микроорганизмов. В течение последнего десятилетия метабаркодинг – наиболее широко используемый инструмент анализа разнообразия грибов в таких сложных средах как почва, древесина, донные отложения, филлосфера и многие другие. В результате секвенирования получают набор прочтений коротких (длинной в несколько сотен пар оснований) последовательностей ДНК, который после биоинформационного анализа (см. раздел 1.1.4) представляет 40

профиль сообществ в виде набора так называемых «операциональных таксономических идентификации единиц» (operational таксономической taxonomic unit, принадлежности OTU). OTU Для их последовательности могут быть сопоставлены с последовательностями известных видов грибов в различных базах данных, таких как Greengenes [DeSantis, 2006], SILVA [Pruesse, 2007], PR2 [Guillou, 2013], UNTIE [Kõljalg, 2005], ITSoneDB [Fosso, 2012] и др. Переход к метабаркодингу открыл неожиданно высокое разнообразие грибных сообществ в мельчайших единицах природных субстратов. В одном почвенном образце массой 250–500 мг, как правило, выявляется несколько сотен OTU грибов [Baldrian, 2012; Santalahti, 2016; Sun, 2015], множество которых некультивируемые. Появилась возможность изучения грибных сообществ экстремальных местообитаний [Zhang, 2015]. Высокая производительность и дешевизна метода дали возможность сравнения сообществ разных местообитаний в региональном, континентальном и даже глобальном масштабе, оценивать их временную динамику, пространственную структуру, зависимость от внешних факторов [Purahong, 2017; Tedersoo, 2018]. В крупномасштабном эксперименте по оценке разнообразия грибовдеструкторов древесины и определению их предпочтений в отношении древесных пород было обнаружено более высокое разнообразие этих грибов в лесах умеренного пояса и большая, чем считалось ранее, специфичность сапротрофов к определённым видам деревьев [Purahong, 2017]. Сильные различия в видовом богатстве и обилии грибов-сапротрофов наблюдаются между лиственной и хвойной древесиной, но различий между заболонью и сердцевиной не обнаруживается [Leonhardt, 2019]. Долгосрочное повышение концентраций CO2 незначительно изменяет общую структуру и видовое богатство сообщества грибов, однако увеличивает выравненность сообществ. Совместный анализ экологической сети показал, что повышение концентрации CO2 увеличивает сложность сети 41

грибных сообществ, но снижает количества связей доминирующих видов грибов [Tu, 2015]. Важное направление исследований грибных сообществ почвы лежит в таких прикладных областях как сельское хозяйство и биорекультвация. Так традиционное и беспахотное земледелие, в отличие от органического, снижают разнообразие, обилие грибных сообществ почвы и нарушают связи в них [Banerjee, 2019]. Органический способ обработки сельхозугодий учитывает ведущую роль микробиоты в круговороте питательных веществ, защите почвы от эрозии и агрокультур от вредителей и патогенов [Lori, 2017]. Даже в таких сравнительно простых фитоценозах как насаждения тополя (близ Орлеана, Франция) было обнаружено значительное разнообразие грибов в почве и корнях (5944 OTU) [Danielsen, 2012]. Вследствие перепашки пространственная гетерогенность сообществ по составу была ниже в почве, чем в корнях, что по мнению авторов является следствием вспашки. Доминирующими группами в почве были сапрофитные, патогенные и эндофитные грибы, тогда как эктомикоризные грибы доминировали в корнях. Также отмечено высокое разнообразие арбускулярной микоризы в почве, в отличие от корней. Для защиты культурных растений от патогенов на основе метабаркодинга предложена система мониторинга спор, содержащихся в воздухе [Chen, 2018]. А с помощью анализа сетей выявлены антагонистические связи видов Fusarium с бактериями Sphingomonas и грибов Sarocladium и Epicoccum, указывая на потенциальных агентов биоконтроля фузариоза пшеницы [Cobo-Díaz, 2019]. Показано, что применение органических удобрений и гашёной извести на териториях, подвергшихся антропогенному воздействию, повышает разнообразие эндомикоризный грибов и повышает степень микоризной колонизации корней молодых растений, что может ускорить процесс восстановления среды [Lee, 2012]. 42

2 Материалы и методы 2.1 Исследуемые территории Сбор материала проводили на двух территориях: в берёзово-сосновых лесах Южного Урала (окрестности Карабашского медеплавильного завода, КМЗ, АО «Карабашмедь») и елово-пихтовых лесах Среднего Урала (окрестности Среднеуральского медеплавильного завода, СМЗ). С приближением к источникам выбросов увеличивается содержание тяжелых металлов и кислотность почвы [Кайгородова, 1996], снижается разнообразие и продуктивность травянистого и древесного яруса [Хантемирова, 1994; Трубина, 2012], уменьшается обилие дождевых червей [Воробейчик, 1998] и других групп почвенной фауны [Воробейчик, 2007, 2012], герпетобионтных членистоногих [Бельская, 2008], разнообразие эктомикоризных грибов [Веселкин, 2004; Веселкин, 2006], тормозится деструкция органического вещества [Воробейчик, 1991, 2003 и 2011; Mikryukov 2017], снижается удельная дыхательная активность лесной подстилки [Сморкалов, 2012]. На каждой территории в соответствии со степенью деградации экосистем и уровнем загрязнения было выделено три зоны: фоновая – 32 км от КМЗ и 29 км от СМЗ, буферная – 11 км и 4 км, а также импактная – 5 км и 2.5 км. 2.2 Отбор почвенных образцов В каждой зоне заложено три треугольные пробные площади (ПП) с размером стороны 25 м. ПП были равноудалены друг от друга на 125 м и располагались в биотопах максимально сходных по составу древостоя и почвенному покрову. Внутри каждой ПП (рисунок 2.7) было заложено 10 микроплощадок, удаленных друг от друга на 5 м, на которых с помощью стерильных контейнеров производили отбор органогенного (A0) горизонта почвы. Всего отобрано 360 образцов. Растительность, химические и физические показатели почвы исследованных участков представлены в таблице 2.2. 43

Рисунок 2.7 – Схема отбора проб. Чёрными точками обозначены места отбора проб. 2.3 Молекулярно-генетический анализ Для выделения ДНК брали навеску воздушно-сухого образца массой 25 мг. Навески измельчали в течение 1 минуты при амплитуде 30 Гц в гомогенизаторе (Retsch Mixer Mill MM300, Германия). Экстракцию тотальной ДНК из почвы проводили с помощью набора FastDNA SPIN Kit for Soil DNA (MP BIOMEDICALS, США). Дополнительную очистку выделенной ДНК проводили с использованием набора КлинМаг (Евроген, Россия). Для получения метагеномной библиотеки ампликонов региона ITS2 проводили ПЦР в два этапа (таблица 2.3) в соответствии с протоколом «16S Metagenomic Sequencing Library Preparation» (Part # 15044223 Rev. B, Illumina). 44

Таблица 2.2 – Параметры растительного покрова исследуемых участков и физико-химические параметры верхнего горизонта почвы в зонах с разным уровнем промышленного загрязнения (Фон – фоновая, Буф – буферная, Имп – импактная территория) Параметр Окрестности KМЗ Окрестности СМЗ Фон Буф Имп Фон Буф Имп 32 11 5 30 4 2.5 6.9 ± 1.7 7.9 ± 2.2 0.1 ± 0.3 9.2 ± 2.4 2.0 ± 2.2 0.7 ± 0.7 Проективное покрытие травянокустарничкового яруса, % 67.8 ± 14.8 45.0 ± 19.3 0.9 ± 2.7 77.7 ± 20.7 20.5 ± 22.4 5.3 ± 6.6 Высота травяно-кустарничкового яруса, см 21.8 ± 8.0 27.3 ± 10.9 1.0 ± 3.3 19.2 ± 12.5 10.7 ± 11.7 10.6 ± 10.9 Мощность подстилки, см 1.29 ± 0.61 (0.5–3.0) 2.95 ± 1.64 (1.0–8.0) 3.83 ± 1.46 (2.0–7.5) 1.78 ± 1.09 (0.4–4.5) 6.32 ± 2.71 (3.0–13.0) 5.78 ± 2.18 (2.0–10.5) 2.9 ± 3.7 (0–15) 0.5 ± 1.4 (0–6) 2.3 ± 6.5 (0–30) 60.0 ± 34.21 (1–100) 28.0 ± 30.2 (0–90) 36.7 ± 37.4 (0–100) 0.89 ± 0.19 (0.59–1.29) 0.81 ± 0.30 (0.34–1.63) 0.97 ± 0.39 (0.26–2) 2.21 ± 0.72 (1.56–5.66) 2.33 ± 0.34 (1.74–2.92) 1.88 ± 0.30 (1.25–2.38) 88.78 ± 46.92 (39.63–275.87) 31.61 ± 12.91 (16.18–66.5) 108.53 ± 24.35 (31.42–165.39) 24.88 ± 7.93 (12.73–42.96) 39.81 ± 10.5 (19.23–62.8) 170.95 ± 73.31 (38.15–291.84) pH органогенных горизонтов 6.43 ± 0.03 6.18 ± 0.06 5.64 ± 0.03 5.5 ± 0.06 4.77 ± 0.05 4.74 ± 0.07 Cu, мкг/г 33.61 ± 1.17 368.92 ± 24.6 4292.89 ± 149.89 35.05 ± 6.15 1009.12 ± 72.02 3602.65 ± 299.69 Zn, мкг/г 277.99 ± 9.32 862.1 ± 44.89 3671.38 ± 182.65 158.85 ± 7.48 321.75 ± 25.21 862 ± 58.07 Cd, мкг/г 2 ± 0.06 6.65 ± 0.3 21.36 ± 0.96 2.28 ± 0.13 7.62 ± 0.56 28.94 ± 2.13 Pb, мкг/г 80.87 ± 2.62 376.9 ± 21.3 1599.25 ± 103.28 74.8 ± 6.66 877.3 ± 46.8 2533.31 ± 107.95 Fe, мкг/г 1292.42 ± 92.68 2124.97 ± 124.56 31539.86 ± 1982.17 1895.91 ± 170.12 3650.81 ± 270.34 8222.42 ± 907.28 Расстояние от источника выбросов, км Альфа-разнообразие травянокустарничкового яруса (количеств видов/площадку 0,5 х 0,5 м) Проективное покрытие мха, % Массовая доля влаги в органогенном горизонте Концентрация P2O5 в органогенном горизонте, мг/100 г Указаны средние значения ± станд. отклонение (n = 30), в скобках приведен размах (min – max). Данные взяты из (Mikryukov, 2020). 45

При проведении ПЦР-1 использовали пару локус-специфичных праймеров fITS7 [Ihrmark, 2012] и ITS4 [White, 1990], праймеры были дополнены последовательностями адаптеров (Illumina adapter overhang nucleotide sequences). Полученный в результате ПЦР-1 продукт разводили в десять раз и один микролитр разбавления выступал в качестве ДНК-матрицы для следующего этапа. На этапе ПЦР-2 использовали праймеры Nextera XT с уникальной для каждого образца комбинацией баркодов (N7XX, S5XX). В реакции использовали высокоточную Tersus полимеразу (Евроген, Россия). Таблица 2.3 – Условия проведения ПЦР Компоненты смеси Tersus полимераза Буфер Tersus Plus Смесь dNTP, мкмоль Праймеры, пмоль ДНК-матрица Объём реакции, мкл Этапы ПЦР Исходная денатурация Денатурация ДНК Отжиг ДНК-затравок Синтез ДНК ПЦР 1 1x 1x 200 5 10 нг 15 95 °C 95 °C 55 °C 72 °C ПЦР 2 1x 1x 200 5 1 мкл ПЦР 1 25 3 мин 20 с 20 с 40 с 95 °C 95 °C 20 55 °C циклов 72 °C 30 с 20 с 20 с 40 с 15 циклов 2.4 Биоинформационный анализ Файлы FASTQ были получены с помощью ПО MiSeq Reporter (Illumina). Сборку парно-концевых прочтений (paired-end assembly) производили c помощью ПО PEAR v.0.9.6 [Zhang, 2014]. Для удаления праймеров и адаптеров и использовали Cutadapt v.1.11 [Martin, 2011]. С помощью VSEARCH v.2.3.4, на основе качества прочтения каждого отдельного нуклеотида в последовательности (Phred quality score), рассчитывали ожидаемое количество ошибок прочтения (expected number of errors [Edgar, 2015]), описывающее качество всех данных и проводили фильтрацию. Затем дереплицировали последовательности и кластеризовали их в OTU с помощью 46

SWARM v.2.1.12 [Mahe, 2015]. Удалением химерных последовательностей производили с применением алгоритма UCHIME2 [Edgar, 2016а]. Для обработки молекулярно-генетических данных также использовали GNU AWK v.4.1.3 и BioAwk v.20110810. Проведение параллельных вычислений выполнено с помощью GNU parallel v.20141022 [Tange, 2011]. Таксономическую принадлежность OTU устанавливали с помощью трех алгоритмов: глобального выравнивания с использованием VSEARCH, байесовского классификатора UTAX [Edgar, 2016б] и классификации на основе сходства состава k-меров SINTAX (SImple Non-Bayesian TAXonomy; Edgar, 2016в). Таксономическая классификация была проведена на основе сравнения полученных OTU с курируемой референсной базой данных UNITE v.7.1 [Kõljalg, выравнивания, 2013; https://unite.ut.ee/]. совпадение считали В результатах точным если глобального сходство с последовательностью из базы сос-тавляло более 97%. В противном случае использовали результат классификаторов SINTAX или UTAX, число достоверных таксономических уровней, которых, было определено выше (для обоих был задан порог достоверности равный 0.7). 2.5 Статистический анализ Весь статистический анализ данных выполнен в ПО R v.4.0 [R Core Team, 2020]. Для оперирования метагеномными данными использовали пакет phyloseq v.1.30.0 [McMurdie, 2013]. Визуализация полученных результатов была выполнена с использованием пакета ggplot2 v.3.3.1 [Wickham, 2009]. Для анализа альфа- и бета-разнообразия сообществ почвенных грибов, а также оценки их сходства с помощью анализа главных координат (PCoA, principal component analysis) использовали пакет vegan v.2.5-6 [Oksanen, 2017]. Сравнение разнообразия сообществ грибов с территорий с разным уровнем загрязнения проводили с помощью двухфакторного дисперсионного 47

анализа (ANOVA) в пакете car v.3.0-8. Парные сравнения проводили с помощью критерия Тьюки в пакете multcomp v.1.4-13. Построение экологических сетей проводили с использованием пакетов ccrepe v.1.24.0 [Schwager, 2020] и SpiecEasi v.1.0.7 [Kurtz, 2019]. Оценка основных параметров сетей выполнена в пакете igraph v.1.2.5 [Csardi, 2006]. Визуализация сетей проводилась в ПО Cytoscape v3.8.0 [Shannon, 2003]. Для оценки степени сходства топологии экологических сетей, построенных с использованием разных методов, использовали индекс Жаккара: , (2.7) где a – количество общих элементов (узлов или связей) в графах, построенных разными методами; b и с – количество уникальных элементов в графах. 48

3 Результаты 3.1 Разнообразие сообществ В результате секвенирования ДНК-библиотек всех образцов после фильтрации последовательностей по качеству прочтения, коррекции ошибок секвенирования, сборки парно-концевых прочтений, удаления химерных и негрибных последовательностей, а также их кластеризации получено 2005 OTU принадлежащих отделам Ascomycota, Basidiomycota, Mortierellomycota и Mucoromycota (Приложение 1). Общее количество OTU, выявленных в березово-сосновых лесах полигона КМЗ, на 26.2% ниже, чем в елово-пихтовых лесах полигона СМЗ (1533 и 2076 OTU, соответственно). В соответствии с этим, гаммаразнообразие нами (интерпретируемое как разнообразие сообщества биотопа) на фоновой территории КМЗ значительно ниже, чем на фоновой территории СМЗ (Таблица 3.4). Таблица 3.4 метагеномного – Общее количество секвенирования и OTU, полученное последующего в результате биоинформационного анализа Отдел Всего Фон 333 213 40 9 595 Всего Фон 467 323 73 14 877 Ascomycota Basidiomycota Mortierellomycota Mucoromycota Ascomycota Basidiomycota Mortierellomycota Mucoromycota КМЗ Буфер 325 209 36 8 578 СМЗ Буфер 322 222 39 12 595 49 Импакт 201 125 24 10 360 Импакт 327 214 37 26 604

Необходимо отметить, что прямое сравнение полученных оценок гаммаразнообразия с опубликованными результатами исследований почвы лесов с помощью высокопроизводительного секвенирования провести сложно, поскольку работы различаются количеством образцов, площадями биотопов, охваченными при отборе, методами выделения и секвенирования ДНК и подходами к биоинформационному анализу. Эти факторы обусловливают высокую изменчивость оценок разнообразия микоценозов биотопов. Так, в двух работах, выполненных с помощью Illumina MiSeq на сопоставимых с нашими выборках образцов из органогенного горизонта хвойных лесов, получено 1151 и 800 OTU грибов [Oliver, 2015; Toju, 2016]. В нескольких исследованиях почвы хвойных и широколиственных лесов, основанных на анализе 10–120 образцов с использованием разных платформ для высокопроизводительного секвенирования, получено от 313 до 3475 OTU грибов [Chen, 2016; Kadowaki, 2014; Sun, 2015; Santalahti, 2016]. В пределах полигона КМЗ гамма-разнообразие на буферной территории выше, чем на фоновой. Это не удивительно, с учетом большего альфаразнообразия и биомассы травянистого яруса, влажности почвы на буферной территории при не очень высоких (ниже губительных) концентрациях тяжелых металлов; на импактной территории видовое богатство в 1.5 ниже фонового уровня. Вблизи СМЗ максимальным уровнем разнообразия характеризуется фоновая зона, тогда как количество OTU на буферной и импактной территориях одинаково и ниже фонового 32.2% и 31.1%, соответственно. Альфа-разнообразие (т.е. среднее разнообразие в образце) изменялось от 80 до 386 OTU. Сравнение оценок альфа-разнообразия между разными исследованиями также затруднительно, как и в случае с гамма- разнообразием. Большой вклад в их изменчивость вносит масса навески образца, процедуры экстракции ДНК и биоинформационного анализа. Для обеспечения сопоставимости данных необходимо выполнить рарефикацию 50

прочтений до количества, использованного в других работах. Для сравнения таких высокоизменчивых объектов как сообщества почвенных микроорганизмов также необходимо соблюдать сходство условий и времени отбора, почвенного горизонта и типа биотопа. При соблюдении одинаковой глубины рарефикации нами получено значительно более высокое альфаразнообразие по сравнению с работой [Reazin, 2016], в которой проанализирована верхняя часть минерального горизонта (содержащего менее богатые грибные сообщества по сравнению с органогенными) в сосновых лесах северо-востока США. При этом получено намного меньше OTU и более низкий индекс Шеннона по сравнению с исследованиями, в биоинформационном анализе которых проводился менее строгий контроль качества полученных данных, например, отсутствовал этап подавления шума [Oliver, 2015] или выполнена менее консервативная фильтрация последовательностей по качеству прочтения. Между тем, величины разнообразия у КМЗ или СМЗ были сопоставимы с величинами, полученными во многих работах [Santalahti, 2016, Kadowaki, 2013; Sun, 2015, Toju, 2016; Baldrian, 2012]. Эти работы выполнены для почвы ненарушенных хвойных и широколиственных лесов с помощью пиросеквенирования на платформе 454 (Roche), секвенирования путем синтеза на платформе MiSeq (Illumina) и ионного полупроводникового секвенирования на платформе Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific). Изменение альфа-разнообразия (как богатства OTU, так и индекса Шеннона) вдоль градиентов загрязнения сходно с изменением гаммаразнообразия. На полигоне КМЗ альфа-разнообразие фоновых и буферных участков не различалось (Рисунок 3.8 и 3.9; Таблица 3.5) тогда как разнообразие на импактной территории значительно снижено (на 32.9% и 26.5% от фонового и буферного уровней, соответственно). Вблизи СМЗ альфа-разнообразие буферных и импактных участков одинаково и сильно 51

снижено по сравнению с фоновыми участками на 35% и 33.6% для буферного и импактного участков, соответственно). Выявленные закономерности изменения разнообразия в градиентах загрязнения хорошо согласуются с изменением химических параметров почвы (pH, концентрации тяжелых металлов, нутриентов см. Таблица 2.2), а также состоянием растительности. Они также подтверждают реакцию других групп биоты на загрязнение, исследованную на данных территориях [Mikryukov, 2017]. Вместе с тем, чувствительность грибных сообществ почвы на загрязнение ниже по сравнению с сообществами животных, травянистых растений, эпифитных лишайников. Возможно, что способность многих видов грибов (в основном представителей Agaricomycetes) вступать в симбиоз с древесными растениями, предпочтение кислой среды, а также наличие множества механизмов металлоустойчивости, делают эту группу биоты одной из наименее чувствительных к промышленному загрязнению. Рисунок 3.8 – Количество OTU грибов верхних горизонтов почвы на территориях с разным уровнем загрязнения. Показаны средние значения и 95% доверительный интервал 52

Рисунок 3.9 – Разнообразие сообществ грибов верхних горизонтов почвы на территориях с разным уровнем загрязнения. Показаны средние значения и 95% доверительный интервал Таблица 3.5 – Результаты сравнения разнообразия грибов верхних горизонтов почвы елово-пихтовых и березово-сосновых лесов с разным уровнем загрязнения. Показаны p-значения для критерия Тьюки Парные сравнения СМЗ Фон - Буфер Фон - Импакт Буфер - Импакт КМЗ Фон - Буфер Фон - Импакт Буфер - Импакт КМЗ - СМЗ КМЗ Фон - СМЗ Импакт КМЗ Буфер - СМЗ Буфер КМЗ Буфер - СМЗ Импакт КМЗ Импакт - СМЗ Буфер КМЗ Импакт - СМЗ Импакт Количество OTU Индекс Шеннона < 0.01 < 0.01 0.99 < 0.01 0.06 1.00 0.61 < 0.01 < 0.01 1.00 < 0.01 0.05 0.02 0.39 0.60 0.11 0.05 0.55 0.29 0.47 0.97 0.88 КМЗ Фон - СМЗ Фон < 0.01 0.03 КМЗ Фон - СМЗ Буфер КМЗ Буфер - СМЗ Фон КМЗ Импакт - СМЗ Фон < 0.01 < 0.01 < 0.01 0.36 0.05 < 0.01 53

3.2 Сравнение методов построения сетей Чтобы избежать ложных корреляций, в сравнительный анализ методов построения сетей вошли отфильтрованные данные. Мы исключили OTU, встречаемость которых была меньше 16% (т.е. менее чем в 5 образцах на зону), а суммарное по образцам в зоне обилие OTU менее 50 прочтений. Топология сетей, построенных с использованием разных методов, значительно различалась. Сети, основанные на коэффициентах линейной корреляции Пирсона и Спирмена, отличались существенно большим количеством как связей, так и связанных узлов (Рисунок 3.10). Эти результаты иллюстрируют, что использование коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена на композиционных данных ведет к выявлению множества ложноположительных связей, а значит не применимы к анализу данных высокопроизводительного секвенирования (метабаркодинг и RNASeq). Неудивительно, что из-за существенного количества артефактных связей, сети, построенные с использованием коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена, были наименее похожи на результаты, полученные специализированными методами (Приложение 3 и 4). При значениях порога силы связи более 0.3 cети, полученные с помощью CCREPE, SPIEC-EASI и SparCC были сходны по составу объектов (т.е. OTU) более, чем на 70% (Таблица 3.6). При этом, наиболее сходные результаты получены с помощью методов SPIEC-EASI и SparCC (почти 100% сходство состава OTU). Сходство по составу связей между вершинами сильно зависело от порогового значения силы связи. С его увеличением, то есть с усилением консервативности по силе связи, сходство связей, выявляемых SPIEC-EASI – CCREPE снижалось, тогда как сходство результатов SparCC и остальных методов увеличивалось, достигая 90% при сравнении с результатами SPIEC-EASI. С учетом высокого сходства сетей, построенных SparCC и SPIEC-EASI по составу как вершин, так и связей, эти методы дают на выходе сети почти с идентичной топологией. 54

Рисунок 3.10 – Количество узлов (а) и ребер (б), выявляемых в результате анализа экологических сетей с помощью разных методов, для разных уровней достоверности связи: 0.7 (красный), 0.5 (синий) и 0.3 (зелёный) 55

Таблица 3.6 – Сходство экологических сетей, построенных разными методами при разных порогах силы связи. Показаны средние значения и стандартные отклонения коэффициента Жаккара, в скобках максимальные и минимальные значения учетная единица – зона загрязнения, n = 6. Полужирным отмечены значения, превышающие 0.80 Нижний порог корреляции Методы SPIEC-EASI – CCREPE CCREPE – SparCC 0.3 SparCC – SPIEC-EASI SPIEC-EASI – CCREPE CCREPE – SparCC 0.5 SparCC – SPIEC-EASI SPIEC-EASI – CCREPE CCREPE – SparCC 0.7 SparCC – SPIEC-EASI Узлы сети Связи сети 0.77±0.033 (0.82-0.72) 0.77±0.032 (0.81-0.72) 1.00±0.001 (1-0.997) 0.84±0.118 (0.98-0.71) 0.87±0.112 (0.98-0.72) 0.95±0.098 (1-0.75) 0.70±0.225 (1-0.38) 0.71±0.23 (1-0.38 ) 0.99±0.027 (1-0.93) 0.78±0.136 (0.9-0.54) 0.29±0.099 (0.45-0.16) 0.30±0.084 (0.42-0.22) 0.73±0.176 (0.93-0.48) 0.75±0.206 (0.97-0.42) 0.67±0.094 (0.86-0.61) 0.65±0.218 (0.88-0.32) 0.68±0.227 (0.92-0.32) 0.90±0.127 (1-0.7) 3.3 Кластеризованность сетей Для сетей, построенных специализированными методами, рассчитывали модулярность, ассортативность и транзитивность. Модулярность рассчитывали тремя методами. В обоих градиентах загрязнения число кластеров убывает, то есть внутри сети становится меньше обособленных сообществ (таблица 3.7). На территории КМЗ с падением числа кластеров также наблюдается уменьшение модулярности. Это указывает на сниженную пространственную кластеризацию сообществ. Для сообществ территории СМЗ характерна почти обратная закономерность. С помощью всех трёх методов в буферной зоне СМЗ выявлено максимальное значение модулярности. Модулярность сообществ импактной территории вблизи СМЗ 56

намного выше фоновой по результатам CCREPE, однако, несущественно выше по результатам SparCC и SPIEC-EASI. Причиной высоких значений модулярности (особенно в сообществах буферной зоны СМЗ) при сниженном количестве кластеров могло стать увеличение доли несвязанных подгрупп вследствие высокой пространственной изменчивости химических параметров почвы (рис. 3.11 и 3.12). Таким образом, наша гипотеза о снижении количества модулей, основанная на функционирования ранее зарегистрированном почвенных сапротрофов многократном на сильно снижении загрязненных территориях, подтвердилась. Снижение количества модулей подтверждает предположение о выпадении целых функциональных блоков в сообществах почвенных грибов. Гипотеза о том, что пространственная гетерогенность загрязнения почвы ведет к увеличению модулярности сетей подтверждена только для территорий вблизи СМЗ. Возможно, это связано с особенностями состава древостоя исследуемых участков. Древостой елово-пихтовых лесов вблизи СМЗ более гетерогенный (в нем значительна доля лиственных видов), чем в березово-сосновых лесах вблизи КМЗ. На импактной территории КМЗ древостой представлен почти исключительно березой (в нем почти отсутствует сосна), что могло обусловить снижение гетерогенности растительного опада (что наиболее актуально для сапротрофов) и видового состава корней (что актуально для микоризообразователей). Все сети можно назвать слабоассортативными и малотранзитивными. Значение ассортативности не превышает 0.5, а транзитивность находится на уровне не более 0.46 для сетей с пороговым уровнем корреляции 0.5 (Приложение 4). 57

Таблица 3.7 – Количество кластеров и модулярность экологических сетей почвенных грибов, рассчитанных разными методами. На примере сетей с пороговым значением силы связи |r| >0.5 Алгоритм выделения модулей сети Метод Завод КМЗ CCREPE СМЗ КМЗ SPIEC-EASI СМЗ КМЗ SparCC СМЗ Зона Greedy[Clauset, 2004] Louvain [Blondel, 2008] Модулярность Число кластеров Модулярность Число кластеров Walktrap [Pons, 2006] Модулярность Число кластеров Фон Буфер Импакт Фон Буфер Импакт 0.61 0.55 0.53 0.68 0.81 0.77 45 30 22 49 48 37 0.63 0.57 0.54 0.68 0.82 0.77 40 29 21 47 46 37 0.54 0.50 0.48 0.60 0.75 0.71 69 50 37 73 50 43 Фон Буфер Импакт Фон Буфер Импакт 0.97 0.72 0.70 0.70 0.89 0.74 92 35 23 39 44 27 0.97 0.71 0.71 0.70 0.89 0.73 92 37 25 36 43 28 0.97 0.64 0.66 0.62 0.87 0.65 92 62 36 97 50 58 Фон Буфер Импакт Фон Буфер Импакт 0.70 0.59 0.56 0.60 0.88 0.64 43 39 25 43 42 27 0.70 0.62 0.56 0.62 0.88 0.66 41 37 24 34 42 25 0.64 0.54 0.52 0.57 0.84 0.56 62 67 37 83 47 58 58

Рисунок 3.11 – Экологические сети сообществ почвенных грибов территории КМЗ. Размер узла пропорционален относительному обилию OTU. Цвета иллюстрирует степень узла, в ряду синий-жёлтый-красный степень повышается. Цветом линий обозначены положительные (красный) и отрицательные (синий) связи. Пороговое значение силы связи |r| >0.5. Сети получены методом CCREPE. Модулярность рассчитана методом Louvain 59

Рисунок 3.12 – Экологические сети сообществ почвенных грибов территории СМЗ. Размер узла пропорционален относительному обилию OTU. Цвета иллюстрирует степень узла, в ряду синий-жёлтый-красный степень повышается. Цветом линий обозначены положительные (красный) и отрицательные (синий) связи. Пороговое значение силы связи |r| >0.5. Сети получены методом CCREPE. Модулярность рассчитана методом Louvain 60

3.4 Экологические сети в сообществах эктомикоризных грибов Согласно функциональной классификации всего было найдено 351 OTU эктомикоризных грибов: в березово-сосновых лесах вблизи КМЗ – 299 OTU, в елово-пихтовых лесах в окрестностях СМЗ – 325 OTU. Подавляющее большинство грибов, формирующих эктомикоризу, принадлежит классу Agaricomycetes, которые представляют гигантов грибного царства. Именно поэтому несмотря на то, что количество их видов не превышает и пятой части всего грибного разнообразия почвы, относительное обилие этой группы составляет значительную часть (более половины) обилия грибных сообществ в изучаемых экосистемах, где доминируют древесные растения – основные участники эктомикоризных ассоциаций (Рисунок 3.13). Видовое богатство, доля видов в сообществе и относительное обилие эктомикоризных грибов возрастало в градиенте загрязнения на обеих территориях (вблизи КМЗ 95 OTU, 109 OTU и 95 OTU в фоновой, буферной и импактной зонах, соответственно; вблизи СМЗ 110 OTU, 100 OTU и 115 OTU в фоновой, буферной и импактной зонах, соответственно). Рисунок 3.13 – Доли абсолютных обилий (а) и OTU (б) эктомикоризных грибов в березово-сосновых и елово-пихтовых лесах с разным уровнем промышленного загрязнения. 61

Для выявления конкурентных взаимоотношений между представителями эктомикоризных грибов мы построили сети, основанные на отрицательной корреляции между встречаемостью OTU этой группы (таблица 3.8). Достоверным уровнем корреляции для методов CCREPE, SparCC и SPIECEASI считали -0.5, для метода Спирмена – -0.65, для метода Пирсона – -0.3. Сети, построенные методами SparCC1 и SPIEC-EASI2 были наименее консервативны в отношении количества вершин – в них вошли все OTU, обнаруженные на исследуемых участках. В сети, построенные методом CCREPE вошло 64–81% от общего числа OTU. Сети взаимоотношений между эктомикоризными грибами, построенные при пороговом значении корреляции 0.3 (то есть наименее консервативные), представлены на рисунках 3.14 – 3.16. С их помощью выявлено 5 – 25 отрицательных связей между встречаемостью OTU эктомикоризных грибов. При увеличении консервативности количество значимых связей снижается, при этом на импактных территориях сохраняется наибольшее количество отрицательных связей (62.5% всех уникальных отрицательных связей, Приложение 2). Наиболее устойчивые отрицательные связи, сохраняющиеся при использовании разных методов анализа, наблюдаются между 12 OTU (таблица 3.9). Однако необходимо с осторожностью интерпретировать результаты анализа. К примеру, устойчивая связь между Tylospora asterophora, вступающей в ассоциации с Picea abies и представителями рода Inocybe, из которых для одного вида известны ассоциации с Salix spp., а для другого широкий спектр хвойных и лиственных видов-хозяев, может иллюстрировать не только конкурентные взаимоотношения, но и приуроченность к разным условиям или хозяевам. Отрицательная связь встречаемости Laccaria alba (Agaricales, Hydnangiaceae) со встречаемостью другого OTU из этого же рода может иллюстрировать конкуренцию не только между родственными видами, но также и внутривидовую – между линиями одного вида (к сожалению, в 62

референтной базе данных не обнаружено близкого совпадения для этой OTU). Таблица 3.8 – Число и доля выявленных узлов, принадлежащих эктомикоризным грибам в экологических сетях CCREPE Зона Число узлов КМЗФон КМЗБуф КМЗИмп СМЗФон СМЗБуф СМЗИмп Доля, % SparCC1 и SPIEC-EASI2 Число узлов Доля1, % Доля2, % Пирсон3 и Спирмен4 Число узлов Доля3, % Доля4, % 63 19.4 95 16.4 19.4 34 6.1 6.5 70 22.4 109 19.5 23.0 109 18.9 19.0 77 28.4 95 27.5 32.8 95 26.4 26.5 83 15.1 110 12.8 14.3 110 12.5 12.6 78 21.7 100 17.5 20.5 100 16.8 16.9 93 23.2 115 19.4 23.4 115 19.0 19.2 63

Таблица 3.9 – Конкурирующие виды грибов-эктомикоризы определённые в ходе анализа консервативных сетей Минимальный уровень корреляции Конкурирующие виды -0.63 Спирмен, Пирсон, CCREPE, SparCC и SPIEC-EASI -0.66 Спирмен, Пирсон и CCREPE Inocybe phaeocystidiosa Basidiomycota Agaricales Inocybaceae Tylospora asterophora Inocybe nitidiuscula Методы Atheliaceae Amphinema byssoides -0.54 SparCC и SPIEC-EASI Cortinariaceae Cortinarius minusculus -0.50 SparCC и SPIEC-EASI Russulales Russulaceae Russula subfoetens -0.56 CCREPE Ascomycota Helotiales Myxotrichaceae Oidiodendron maius -0.51 SparCC Basidiomycota Agaricales Hydnangiaceae Laccaria sp. Laccaria alba -0.54 Спирмен, SparCC и SPIEC-EASI Ascomycota Pezizales Tuberaceae Tuber anniae Boletus ferrugineus -0.54 SparCC и SPIEC-EASI Atheliales Basidiomycota Paxillus involutus 64

Рисунок 3.14 – Сети совместной встречаемости грибов эктомикоризы на фоновых участках. Показаны статистически значимые положительные (красные) и отрицательные (синие) связи (|r| >0.3; p <0.05). Большие круги – OTU с отрицательными связями. Сети получены методом SPIEC-EASI 65

Рисунок 3.15 – Сети совместной встречаемости грибов эктомикоризы на буферных участках. Показаны статистически значимые положительные (красные) и отрицательные (синие) связи (|r| >0.3; p <0.05). Большие круги – OTU с отрицательными связями. Сети получены методом SPIEC-EASI 66

Рисунок 3.16 – Сети совместной встречаемости грибов эктомикоризы на импактных участках. Показаны статистически значимые положительные (красные) и отрицательные (синие) связи (|r| >0.3; p <0.05). Большие круги – OTU с отрицательными связями. Сети получены методом SPIEC-EASI 67

3.5 Подсети с участием грибов-микопаразитов По данным таксономической классификации OTU были обнаружены следующие виды микопаразитов: Aphanocladium sp., Calcarisporium arbucsula, Cladobotryum rubrobrunnescens, Cosmospora sp., Hypomyces sp., Lecanicillium flavidum, Lecanicillium fungicola, Polycephalomyces cuboideus, Syzygospora sp., Tremella sp.. Для установления связей паразит-хозяин мы сформировали подсети, включающие узлы, принадлежащие перечисленным выше видам и их соседям с порогом связи 0.5 и выше для методов CCREPE, SparCC и SPIECEASI, 0.65 – для метода Спирмена, 0.97 – для метода Пирсона. Связь считали значимой, если она встречалась хотя бы в двух сетях, полученных методами CCREPE, SparCC или SPIEC-EASI в соответствующих зонах. Методы Спирмена и Пирсона использовали как вспомогательные. В ходе анализа для пяти видов целевой группы выявлены статистически значимые устойчивые связи с некоторыми OTU (Таблица 3.10). Между тем, при интерпретации результатов необходимо соблюдать осторожность. Так, положительные связи Aphanocladium sp. с Agrocybe praecox, Hypomyces sp. с Inocybe silvae-herbaceae, а также Calcarisporium arbuscula с Mycena rebaudengoi могут иллюстрировать взаимоотношения паразит-хозяин. Однако связь Aphanocladium sp. с Hyaloscypha aureliella, вероятно, обусловлена другими причинами. Интересно, отметить и отрицательные корреляции. Так вид Cladobotryum rubrobrunnescens не встречается вместе с Paxillus involutus (Boletales), а вид Lecanicillium flavidum с Chalara piceae-abietis (Helotiales), Mortierella elongata и Mortierella macrocystopsis (Mortierellales). Возможно, что эти связи опосредованы. Сети, иллюстрирующие взаимоотношения между грибами- микопаразитами и остальными OTU исследуемых сообществ, представлены на рисунках 3.17 – 3.19. 68

Таблица 3.10 – Виды, с которыми выявлена значимая положительная связь встречаемости грибов-микопаразитов Хозяин Паразит Класс Порядок Семейство Leotiomycetes Helotiales Hyaloscyphaceae Agaricomycetes Agaricales Bolbitiaceae Agrocybe praecox Leotiomycetes Helotiales – – Agaricomycetes Agaricales Tricholomataceae Agaricomycetes Agaricales Inocybaceae Pezizomycetes Pezizales Pezizaceae Hyaloscyphaceae Leotiomycetes Helotiales Myxotrichaceae Sordariomycetes Hypocreales Agaricomycetes Agaricales Вид Hyaloscypha aureliella Mycena Вид Aphanocladium sp. Calcarisporium arbuscula rebaudengoi Inocybe silvaeherbaceae Peziza badia Hypomyces sp. Polycephalomyces cuboideus Hyaloscypha bicolor Oidiodendron flavum – – Inocybaceae Inocybe sindonia Syzygospora sp. *Серым цветом обозначен отдел Ascomycota, белым – Basidiomycota 69

Рисунок 3.17 – Сети совместной встречаемости грибов-микопаразитов в фоновой зоне. Показаны значимые положительные (красные) и отрицательные (синие) связи (|r| >0.3; p <0.05). Сети получены методом SPIEC-EASI 70

Рисунок 3.18 – Сети совместной встречаемости грибов-микопаразитов в буферной зоне. Показаны значимые положительные (красные) и отрицательные (синие) связи (|r| >0.3; p <0.05). Сети получены методом SPIEC-EASI 71

Рисунок 3.19 – Сети совместной встречаемости грибов-микопаразитов в импактной зоне. Показаны значимые положительные (красные) и отрицательные (синие) связи (|r| >0.3; p <0.05). Сети получены методом SPIEC-EASI 72

Выводы Результаты анализа, основанного на данных высокопроизводительного секвенирования ДНК верхних горизонтов почвы елово-пихтовых и березовососновых лесов Среднего и Южного Урала, демонстрируют уменьшение гамма-разнообразия грибных сообществ верхних горизонтов почвы сильно загрязненных территорий на 31-40%, альфа-разнообразия – на 33% по отношению к фоновому уровню. С увеличением загрязнения количество видов грибов, способных формировать эктомикоризные ассоциации, не изменяется, тогда как их относительное обилие увеличивается, что может указывать на их низкую чувствительность к избытку тяжелых металлов и повышенной кислотности почвы. В ходе сравнения разных методов построения сетей на основе композиционных данных показано, что при использовании коэффициентов корреляции Спирмена и Пирсона большое число связей между объектами артефактные, что не позволяет использовать эти методы для анализа профилей сообществ микроорганизмов, полученных с помощью метабаркодинга. Для использования рекомендованы специализированные алгоритмы CCREPE, SparCC и SPIEC-EASI, поскольку сети, построенные с их помощью, были более консервативны и сходны по топологии при разных нижних порогах силы связи между объектами. На примере эктомикоризных и микопаразитических грибов показано, что с помощью анализа сетей в многокомпонентных сообществах могут быть выявлены конкурентные взаимоотношения или разделение экологических ниш между отдельными функционально сходными видами или таксонами более высокого ранга, а также взаимоотношения паразит-хозяин. 73

Список использованных источников и литературы 1. Morowitz H. J. Physical background of cycles in biological systems // Journal of Theoretical Biology – 1966. – V. 13, № C. – P. 60–62. 2. Lange L., Huang Y., Busk P. K. Microbial decomposition of keratin in nature-a new hypothesis of industrial relevance // Appl Microbiol Biotechnol. – 2016 – V. 100, № 5. – P. 2083-2096. 3. Nilsson R. H., Anslan S., Bahram M., et al. Mycobiome diversity: highthroughput sequencing and identification of fungi // Nat Rev Microbiol. – 2019. – V. 17, № 2. – P. 95-109. 4. Федоров А. А. Жизнь растений. Том 2. Грибы. – М.: Просвещение, 1976. 3385 с. 5. Гарибова Л. В., Лекомцева С. Н. Oсновы микологии. морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов. – М.: т-во научных изданий КМК, 2005. 220 c. 6. Choi J. J., Kim S. H. A genome Tree of Life for the Fungi kingdom // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2017. – V. 114. № 35. – P. 9391–9396. 7. Eckburg P. B., Bik E. M., Bernstein C. N., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora // Science. – 2005. – V. 308, № 5728. – P. 1635-1638. 8. Tokuda G., Watanabe H. Hidden cellulases in termites: revision of an old hypothesis // Biol Lett. – 2007. – V. 3, № 3. – P. 336-339. 9. Sleator R. D., Shortall C., Hill C. Metagenomics // Lett Appl Microbiol. – 2008. – V. 47, № 5. – P. 361-366. 10.Kurokawa K., Itoh T., Kuwahara T., et al. Comparative metagenomics revealed commonly enriched gene sets in human gut microbiomes // DNA Res. – 2007 – V. 14, № 4. –P. 169-181. 11.Burke C., Kjelleberg S., Thomas T. Selective Extraction of Bacterial DNA from the Surfaces of Macroalgae // – 2009. – V. 75. № 1. – P. 252–256. 12.Metzker M. L. Sequencing technologies - the next generation // Nat Rev Genet. – 2010. – V. 11, № 1. – P. 31-46. 74

13.Morowitz H.J. The Derivation of Ecological Relationships from Physical and Chemical Principles // Proc. Nat. Acad. Sci. USA – 1974. – V. 71, № 6. – P. 2335–2336. 14.Frostegård A., Bååth E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil // Biol Fert Soils. – 1996. – V. 22, № 4. – P. 59–65. 15.Högberg M.N., Chen Y., Högberg P. Gross nitrogen mineralisation and fungi-to-bacteria ratios are negatively correlated in boreal forests // Biol Fertil Soils. – 2007. – V. 44, № 6. – P. 363–366. 16.Mourier J., Vercelloni J., Planes S. Evidence of social communities in a spatially structured network of a free-ranging shark species // Anim Behav – 2012. – V. 83, № 2. – P. 389–401. 17.Berbee M. L., James T. Y., Strullu-Derrien C. Early Diverging Fungi: Diversity and Impact at the Dawn of Terrestrial Life // Annu Rev Microbiol. – 2017. –V. 71, № 9. – P. 41-60. 18.Sah E., Nussear P. K., Esque T. C., et al. Inferring social structure and its drivers from refuge use in the desert tortoise, a relatively solitary species // Behav Ecol Sociobiol – 2016. – V. 70, № 8. – P. 1277–1289. 19.Sah P., Leu S. T., Cross P. C., et al. Unraveling the disease consequences and mechanisms of modular structure in animal social networks // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 2017. – V. 114, № 16. – P. 4165–4170. 20.Salathe M., Jones J. H. Dynamics and control of diseases in networks with community structure // PLoS Comput Biology – 2010. – V. 6, № 4. – P. 1–11. 21.Bouttier J., Di Francesco P., Guitter E. Geodesic distance in planar graphs // Nuclear Physics – 2003. – V. B, № 663. – P. 535–567. 22.Hage P., Harary F. Eccentricity and centrality in networks // Social Networks – 1995. – № 17. – P. 57–63. 75

23.Newman M. Assortative mixing in networks // Phys Rev Lett – 2002. – V. 89, – P. 5. 24.Newman M. E., Girvan M. Finding and evaluating community structure in networks // Physical review E-Statistical, Nonlinear and Soft Matter Physics – 2004. – V. 2, № 69. – P. 26–113. 25.Piraveenan M., Prokopenko M., Zomaya A. Assortative mixing in directed biological networks // IEEE/ACM Transactions on Computational Biology and Bioinformatics – 2012. – V. 9, № 1. – P. 66–78. 26.Aitchison J. The statistical analysis of compositional data. – London: Chapman and Hall, 1986. – 416 p. 27.Gloor G. B., Macklaim J. M., Pawlowsky-Glahn V., et al. Microbiome datasets are compositional: and this is not optional // Frontiers in microbiology – 2017. – № 8. – P. 22–24. 28.Quinn T. P., Erb I., Gloor G., et al. A field guide for the compositional analysis of any-omics data // Giga Science – 2019. – V. 8, № 9. – P. 1-19. 29.McMurdie P. J., Holmes S. Waste not, want not: why rarefying microbiome data is inadmissible // PLoS computational biology – 2014. – V. 10, № 4. – P. 1-12. 30. van den Boogaart K. G., Tolosana-Delgado R. «Compositions»: a unified R package to analyze compositional data // Comput Geosci – 2008. – V. 34, № 4. – P. 32–38. 31.Pearson K. Mathematical contributions to the theory of evolution. III. Regression, heredity, and panmixia // Philos Trans R Soc Lond – 1896. – № 187. – P. 253–318. 32.Aitchison J, Barcelo-Vidal C, Martin-Fernandez J. A, et al. Logratio analysis and compositional distance // Math Geol – 2000. – V. 32, № 3. – P. 271–275. 33.Pace N. R., Stahl D. A., Lane, D. J., et al. The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequences // Advances in Microbial Ecology – 1986. – V. 9, – P. 1–55. 76

34.Schmidt T. M., DeLong E. F., Pace N. R. Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing // Journal of bacteriology – 1991. – V. 173, № 14. – P. 4371–4378. 35.Healy F. G., Ray R. M., Aldrich H. C., et al. Direct isolation of functional genes encoding cellulases from the microbial consortia in a thermophilic, anaerobic digester maintained on lignocellulose // Applied Microbiology and Biotechnology – 1995. – V. 43, № 4. – P. 667–674. 36.Amann R. I., Ludwig W., Schleifer K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiological reviews – 1995. – V. 59, № 1. – P. 143–169. 37.Hugenholtz P., Goebel B. M., Pace N. R. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity // Journal of bacteriology – 1998. – V. 180, № 18. – P. 4765–4774. 38.Breitbart M., Salamon P., Andresen B., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 2002. – V. 99, № 22. – P. 14250–14255. 39.Venter J. C. Environmental genome shotgun sequencing of the sargasso sea // Science – 2004. – V. 304, № 5667. – P. 66–74. 40.Poinar H. N., Schwarz C., Qi J., et al. Metagenomics to paleogenomics: large-scale sequencing of mammoth DNA // Science – 2006. – V. 311, № 5759. – P. 392–394. 41.Woese C. R., Fox G. E. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 1977. – V. 74, № 11. – P. 5088–5090. 42.Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chainterminating inhibitors // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 1997. – V. 74, № 12. – P. 5463–5467. 77

43.Handelsman J., Rondon M. R., Brady S. F., et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products // Chemistry and biology – 1998. – V. 5, № 10. – P. 245–249. 44.Margulies M., Egholm M., Altman W. E., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors // Nature – 2005. – V. 437, № 7057. – P. 376–380. 45.Escobar-Zepeda A., Vera-Ponce de Leon A., Sanchez-Flores A. The road to metagenomics: from microbiology to DNA sequencing technologies and bioinformatics // Frontiers in genetics – 2015. – № 6. – P. 1-15. 46. Karow J. Following Roche's Decision to Shut Down 454, Customers Make Plans to Move to Other Platforms // GenomeWeb. 2013. URL: https://www.genomeweb.com/sequencing/following-roches-decision-shut-down454-customers-make-plans-move-other-platform (дата обращения 05.05.2020) 47.Rothberg J. M, Hinz W., Rearick T. M, et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing // Nature – 2011. – V. 475, № 7356. – P. 348–352. 48.Whiteley A. S., Jenkins S., Waite I., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform // Journal of microbiological methods – 2012. – V. 91, № 1. – P. 80–88. 49.Land M., Hauser L., Jun S. R., et al. Insights from 20 years of bacterial genome sequencing // Functional and integrative genomics – 2015. – V. 15, № 2. – P. 141–161. 50.Fichot E. B., Norman R. S. Microbial phylogenetic profiling with the Pacific Biosciences sequencing platform // Microbiome – 2013. – V. 1, № 1. – P. 1-5. 51.Kasianowicz J. J., Brandin E., Branton D., et al. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 1996. – V. 93, № 24. – P. 13770–13773. 78

52.Liu L., Li Y., Li S., et al. Comparison of next-generation sequencing systems // Journal of Biomedicine and Biotechnology – 2012. – V. 2012, № 5. – P. -12 53.Bennett S., Solexa Ltd // Pharmacogenomics – 2004. – V. 5, № 4. – P. 433– 438. 54.Whon T. W., Chung W. H., Lim M. Y., et al. The effects of sequencing platforms on phylogenetic resolution in 16 S rRNA gene profiling of human feces // Scientific data – 2018. – № 5. – P. 1-15. 55.Sevim V., Lee J., Egan R., et al. Shotgun metagenome data of a defined mock community using Oxford Nanopore, PacBio and Illumina technologies // Scientific data – 2019. – V. 6, № 1. – P. 1-9. 56.Hardwick S. A., Chen W. Y., Wong T., et al. Synthetic microbe communities provide internal reference standards for metagenome sequencing and analysis // Nature communications – 2018. – V. 9, № 1. – P. 30–96. 57.Sessou P., Keisam S., Tuikhar N., et al. High-throughput Illumina MiSeq amplicon sequencing of yeast communities associated with indigenous dairy products from republics of Benin and Niger // Frontiers in microbiology – 2019. – № 10. – P. 1-12. 58.Mbareche H., Veillette M., Bilodeau G., et al. Comparison of the performance of ITS1 and ITS2 as barcodes in amplicon-based sequencing of bioaerosols // Peer J – 2020. – № 8. – P. 1-36. 59.Hassa J., Maus I., Off S., et al. Metagenome, metatranscriptome, and metaproteome approaches unraveled compositions and functional relationships of microbial communities residing in biogas plants // Applied microbiology and biotechnology – 2018 – V. 102, № 12. – P. 5045–5063. 60.Frank J. A., Pan Y., Tooming-Klunderud A., et al. Improved metagenome assemblies and taxonomic binning using long-read circular consensus sequence data // Scientific reports – 2016. – № 6. – P. 1-10. 61.Scardoni G, Petterlini M., Laudanna C. Analyzing biological network parameters with CentiScaPe // Bioinformatics – 2009. – V. 25, № 21. – P. 2857–59. 79

62.Tedersoo L., Tooming-Klunderud A., Anslan S. PacBio metabarcoding of Fungi and other eukaryotes: errors, biases and perspectives // The New phytologist – 2017. – V. 217, № 3. – P. 1370–1385. 63.Kreimer A., Borenstein E., Gophna U., et al. The evolution of modularity in bacterial metabolic networks // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 2008. – V. 105, № 19. – P. 6976–6981. 64.Ban Y., An L., Jiang H. Investigating microbial co-occurrence patterns based on metagenomic compositional data // Bioinformatics – 2015. – V. 31, № 20. – P. 3322–3329. 65.Lo C., Marculescu R. MPLasso: Inferring microbial association networks using prior microbial knowledge // PLoS computational biology – 2017. – V. 13, № 12. – P. 1-20. 66.Yoon G., Gaynanova I., Müller C. L. Microbial networks in SPRING - semiparametric rank-based correlation and partial correlation estimation for quantitative microbiome data // Frontiers in genetics – 2019. – № 10. – P. 1-18. 67.Pearson K. Determination of the coefficient of correlation // Science – 1909. – V. 30, № 757. – P. 23–25. 68.Spearman C. The proof and measurement of association between two things // The American Journal of Psychology – 1904. –V. 15, № 1. – P. 72–101. 69.Surono, Narisawa K. The dark septate endophytic fungus Phialocephala fortinii is a potential decomposer of soil organic compounds and a promoter of Asparagus officinalis growth // Fungal Ecology – 2017. – № 28. – P. 1–10. 70.Rice A. V., Currah R. S. Oidiodendron maius: Saprobe in Sphagnum Peat, Mutualist in Ericaceous Roots? / Ed by Schulz B.J.E., Boyle C.J.C., Sieber T.N. Heidelberg: Springer Berlin 2006. – V. 9. – 227–246. 71.Змитрович И. В. Порядок Афиллофоровые. Вып. 3. Семейства Ателиевые и Амилокортициевые. / Определитель грибов России. – М. – СПб.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. – 278 с. 80

72.Cairney J. W. G., Chambers S. M. Ectomycorrhizal Fungi Key Genera in Profile. Heidelberg: Springer-Verlag Berlin, 1999. – 369 p. 73.Riesenfeld C. S., Schloss P. D., Handelsman J. Metagenomics: genomic analysis of microbial communities // Annual Review Genetics – 2004. – № 38. – P. 525-552. 74.Taberlet P., Coissac E., Pompanon F., et al. Towards next-generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding // Molecular Ecology – 2012. – № 21. – P. 2045-2050. 75.Abdelfattah A., Malacrino A., Wisniewski M. Metabarcoding: A powerful tool to investigate microbial communities and shape future plant protection strategies // Biological Control – 2017. – V. 120, № 10. – P. 10–16. 76.Ursell L. K., Metcalf J. L., Parfrey L. W., et al. Defining the human microbiome // Nutrition reviews – 2012. – № 70. – P. 38–44. 77.Blaalid R., Kumar S., Nilsson R. H., et al. ITS1 versus ITS2 as DNA metabarcodes for fungi // Molecular ecology resources – 2013. – V. 13, № 2. – P. 218–224. 78.Schoch C. L., Seifert K. A., Huhndorf S., et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 2012. – V. 109, № 16. – P. 6241–6246. 79.Schena L., Cooke D. E. Assessing the potential of regions of the nuclear and mitochondrial genome to develop a "molecular tool box" for the detection and characterization of Phytophthora species // Journal of microbiological methods – 2006. – V. 67, № 1. – P. 70–85. 80.Bellemain E., Carlsen T., Brochmann C., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases // BMC microbiology – 2010. – № 10. – P. 1-9. 81

81.Hebert P. D., Cywinska A., Ball S. L., et al. Biological identifications through DNA barcodes // Biological sciences – 2003. – V. 270, № 1512. – P. 313– 321. 82.Hollingsworth P. M. A DNA barcode for land plants // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 2009. – V. 106, № 31. – P. 12794–12797. 83.Kress W. J., Erickson D. L., Jones F. A., et al. Plant DNA barcodes and a community phylogeny of a tropical forest dynamics plot in Panama // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America – 2009. – V. 106, № 44. – P. 18621–18626. 84.Gilmore S. R., Grafenhan T., Louis-Seize G., et al. Multiple copies of cytochrome oxidase 1 in species of the fungal genus Fusarium // Molecular ecology resources – 2009. – V. 9, № 1. – P. 90–98. 85.Lee E. H., Eo J. K., Lee C. S., et al. Effect of soil ameliorators on ectomycorrhizal fungal communities that colonize seedlings of Pinus densiflora in abandoned coal mine spoils // Mycobiology – 2012. – V. 40, № 3. – P. 168–172. 86.Tu Q., Yuan M., He Z., et al. Fungal communities respond to long-term CO2 elevation by community reassembly // Applied and environmental microbiology – 2015. – V. 81, № 7. – P. 2445–2454. 87.Purahong W., Wubet T., Kruger D., et al. Molecular evidence strongly supports deadwood-inhabiting fungi exhibiting unexpected tree species preferences in temperate forests // The ISME journal – 2017. – V. 12, № 1. – P. 289–295. 88.Lori M., Symnaczik S., Mader P., et al. Organic farming enhances soil microbial abundance and activity-A meta-analysis and meta-regression // PloS one – 2017. – V. 12, № 7. – P. 1-25 89.Banerjee S., Walder F., Buchi L., et al. Agricultural intensification reduces microbial network complexity and the abundance of keystone taxa in roots // The ISME journal – 2019. – V. 13, № 7. – P. 1722–1736. 82

90.Danielsen L., Thurmer A., Meinicke P., et al. Fungal soil communities in a young transgenic poplar plantation form a rich reservoir for fungal root communities // Ecology and evolution – 2012. – V. 2, № 8. – P. 1935–1948. 91.Leonhardt S., Hoppe B., Stengel E., et al. Molecular fungal community and its decomposition activity in sapwood and heartwood of 13 temperate European tree species // PloS one – 2019. – V. 14, № 2. – P. 1-21. 92.Chen W., Hambleton S., Seifert K. A., et al. Assessing performance of spore samplers in monitoring aeromycobiota and fungal plant pathogen diversity in Canada // Applied and environmental microbiology – 2018. – V. 84, № 9. – P. 1-18 93.Cobo-Díaz J. F., Baroncelli R., Le Floch G., et al. Combined metabarcoding and co-occurrence network analysis to profile the bacterial, fungal and fusarium communities and their interactions in maize stalks // Frontiers in microbiology – 2019. – № 10. – P. 1-17. 94.Zhang T., Wang N. F., Zhang Y. Q., et al. Diversity and distribution of fungal communities in the marine sediments of Kongsfjorden, Svalbard (High Arctic) // Scientific reports – 2015. – № 5. – P. 1-4. 95.Ilany A., Akcay E. Social inheritance can explain the structure of animal social networks // Nature communications – 2016. – № 7. – P. 12–84. 96.Ilany A., Barocas A., Koren L., et al. Structural balance in the social networks of a wild mammal // Animal Behaviour – 2013. – V. 85, № 6. – P. 1397– 1405. 97.Buttigieg P. L., Hankeln W., Kostadinov I., et al. Ecogenomic perspectives on domains of unknown function: correlation-based exploration of marine metagenomes // PloS one – 2013. – V. 8, № 3. – P. 1-14 98.Bramon M. B., Gravel D., Gilarranz L. J., et al. Identifying a common backbone of interactions underlying food webs from different ecosystems // Nature communications – 2018. – V. 9, № 1. – P. 1-8. 83

99.Wang R., Tanjasiri S. P., Palmer P., et al. Network structure, multiplexity, and evolution as influences on community-based participatory interventions // Journal of community psychology – 2016. – V. 44, № 6. – P. 781–798. 100. Mikryukov V. S., Dulya O. V. Contamination-induced transformation of bacterial and fungal communities in spruce-fir and birch forest litter // Applied Soil Ecology – 2017. – № 114. – P. 111–122. 101. Nannipieri P., Ascher J., Ceccherini M.T., et al. Microbial diversity and soil functions // European Journal of Soil Science – 2003. – № 54. – P. 655– 670. 102. Bolyen E., Dillon M. R., Rideout J. R., et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2 // Nat Biotechnol – 2019. – V. 37. – P. 852–857. 103. Schloss P. D., Westcott S. L., Ryabin T., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities // Applied and environmental microbiology – 2009. – V. 75, № 23. – P. 7537–7541. 104. Palmer J. M., Jusino M. A., Banik, M. T., et al. Non-biological synthetic spike-in controls and the AMPtk software pipeline improve mycobiome data // PeerJ6 – 2018. – V. 6, – P. 1-27. 105. Clauset A., Newman M. E. J., Moore C. Finding community structure in very large networks // Phys. Rev. – 2004. – V. 70, – P. 1-6 106. Pons P., Latapy M. Computing communities in large networks using random walks // Journal of Graph Algorithms and Applications. – 2006. – V. 10, № 2. – P. 191-218. 107. Blondel V. D., Guillaume J-L., Lambiotte R., Lefebvre E. Fast unfolding of community hierarchies in large networks // Journal of Statistical Mechanics Theory and Experiment, – 2008. – V. 10, – P. 1-12. 108. Paine R. T. Food web complexity and species diversity robert // The American Naturalis – 1966. – V. 100, № 910. – P. 65-75. 84

109. Gotelli N. J. Ellison A. M. Food-web models predict species abundances in response to habitat change // PLoS Biology. – 2006. – V. 4, № 10. – P. 1869-73. 110. Kauffman S. Gene regulation networks: A theory for their global structure and behaviors // Curr. Top. in Dev. Biol. – 1971. – V. 6. № C. – P. 145182. 111. Zupan B. Bratko I., Demšar J., et al. GenePath: A system for inference of genetic networks and proposal of genetic experiments // Artif. Intell. Med. 2003. – V. 29. № 1–2. – P. 107–130. 112. Ward R. H. The genetic structure of a tribal population, the Yanomama Indians V. Comparisons of a series of genetic networks // Ann. Hum. Genet. 1972. – V. 36, № 1. – P. 21–43. 113. Buss L. W., Jackson J. B. C. Competitive Networks: Nontransitive Competitive Relationships in Cryptic Coral Reef Environments // Am. Nat. 2002. – V. 113, № 2. – P. 223–234. 114. Glass L. A topological theorem for nonlinear dynamics in chemical and ecological networks // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. – V. 72, № 8. – P. 2856–2857. 115. McCann K., Hastings A. Re-evaluating the omnivory-stability relationship in food webs // Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 1997. – V. 264, № 1385. – P. 1249-1254. 116. Akutsu T., Miyano S., Kuhara S. Identification of genetic networks from a small number of gene expression patterns under the Boolean network model // Proc. Pacific Symp. on Biocomputing. – 1999. – V. 4, № 2. – P. 17–28. 117. McMurdie P. J., Holmes S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data // PLoS ONE. – 2013. – V. 8, № 4. – P. 1-11. 118. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. – М: МГУ, 2005. – 445 с. 85

119. Schäfer W. The role of cutinase in fungal pathogenicity // Trends Microbiol. – 1993. – V. 1, № 2. – P. 69-71 120. Beimforde C., Feldberg K., Nylinder S., et al. Estimating the Phanerozoic history of the Ascomycota lineages: combining fossil and molecular data // Molecular phylogenetics and evolution. – 2014. – V. 78, № 9. – P. 386–398. 121. Дьяков Ю.Т. Ботаника, Курс альгологии и микологии. – М.: Издательство: МГУ, 2007. – 558 с. 122. Webster J., Weber R. Introduction to Fungi. – Cambridge: Cambridge University Press, 2007. – 841 p. 123. Tedersoo L., Mett M., Ishida et al. (2013). Phylogenetic relationships among host plants explain differences in fungal species richness and community composition in ectomycorrhizal symbiosis // The New phytologist. – 2013 – V. 199, № 3. – P. 822–831. 124. Tedersoo L., Sánchez-Ramírez S., Kõljalg U. et al. High-level classification of the Fungi and a tool for evolutionary ecological analyses // Fungal Diversity. – 2018. – V. 90, № 5. – P. 135–159. 125. Karpov S. A., Torruella G., Moreira D., at al. (2017). Molecular Phylogeny of Paraphelidium letcheri sp. nov. (Aphelida, Opisthosporidia) // The Journal of eukaryotic microbiology. – 2017. – V. 64, № 5. – P. 573–578. 126. phylogeny Karpov S. A., Mamkaeva M. A., Benzerara, et al. Molecular and ultrastructure of Aphelidium aff. melosirae (Aphelida, Opisthosporidia) // Protist. – 2014. – V. 165, № 4. – P. 512–526. 127. Han B., Weiss L. M. Microsporidia: Obligate Intracellular Pathogens Within the Fungal Kingdom // Microbiology spectrum. – 2017 – V. 5, № 2. – P. 126 128. Watkinson S. C., Boddy L., Money N. The Fungi. – Cambridge: Academic Press, 2008. 466 p. 86

129. Kluge M. A Fungus Eats a Cyanobacterium: The Story of the Geosiphon pyriformis Endocyanosis // Biology and Environment: Proceedings of the Royal Irish Academy – 2002. – V. 102B, № 1. – P. 11-14. 130. Nagy L. G., Riley R., Tritt A. et al. Comparative Genomics of Early- Diverging Mushroom-Forming Fungi Provides Insights into the Origins of Lignocellulose Decay Capabilities // Molecular Biology and Evolution/ – 2015 – V. 33, № 4. – P. 959–970. 131. Sanders W. B. A feeling for the superorganism: Expression of plant form in the lichen thallus // Botanical Journal of the Linnean Society. – 2006. – V. 150, № 1. – P. 89-99. 132. Bauer R., Garnica S., Oberwinkler F., et al. Entorrhizomycota: A New Fungal Phylum Reveals New Perspectives on the Evolution of Fungi // PloS one. – 2015. – V. 10, № 7. – P 1-19 133. Kurtz Z., Mueller C., Miraldi E., et al. (2019). SpiecEasi: Sparse Inverse Covariance for Ecological Statistical Inference. R package version 1.0.7. 134. Kurtz Z. D., Müller C. L., Miraldi E. et al. Sparse and compositionally robust inference of microbial ecological networks // PLoS computational biology – 2015 – V. 11, № 5. – P. 25. 135. Kurtzman C., Fell J.W., Boekhout T. The Yeasts. – Cambridge: Academic Press, 2010. 2354 p. 136. Nannipieri P., Smalla K. Nucleic Acids and Proteins in Soil. – Berlin: Springer Science & Business Media, 2006. 458 p. 137. Griffiths A. J. F, Miller J. H., Suzuki D. T., et al. An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition. New York: W. H. Freeman, 2000. 860 p. 138. Hedrick D. B., Peacock A., Stephen, et al. Measuring soil microbial community diversity using polar lipid fatty acid and denaturing gradient gel electrophoresis data // Journal of microbiological methods. – 2000. – V. 41, № 3. – P. 235–248. 87

139. Martin-Laurent F., Philippot L., Hallet S., et al. DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods // Applied and environmental microbiology. – 2001. – V. 67, № 5. – P. 2354–2359. 140. Huson D. H., Auch A. F., Qi J., et al. MEGAN analysis of metagenomic data // Genome Res. – 2007 – V. 17, № 3. – P. 377-386. 141. Bastida F., Moreno J.L., Nicolás C., et al. Soil metaproteomics: a review of an emerging environmental science. Significance, methodology and perspectives // European Journal of Soil Science. – 2009 – V. 60, № 9. – P. 845859. 142. Wainright P. O., Hinkle G., Sogin M. L., et al. Monophyletic origins of the metazoa: an evolutionary link with fungi // Science. – 1993. – V. 260, № 5106. – P. 340-342. 143. Newman. M. E. J. Networks—An Introduction. Oxford:Oxford University Press, 2010. 1042 p. 144. DeSantis T. Z., Hugenholtz P., Larsen N., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB // Appl Environ Microbiol. – 2006 – V. 72, № 7. – P 5069-5072. 145. Pruesse E., Quast C., Knittel K., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB // Nucleic Acids Res. – 2007 – V. 35, № 21. – P 7188-7196. 146. Guillou L., Bachar D., Audic S., et al. The Protist Ribosomal Reference database (PR2): a catalog of unicellular eukaryote small sub-unit rRNA sequences with curated taxonomy // Nucleic Acids Res. – 2013. – V. 41, № 1. – P. 597-604. 147. Mikryukov V.S., Dulya O.V. Fungal communities in organic and mineral soil horizons in an industrially polluted boreal forest // Biodiversity. – 2018. – V. 19, № 3. – P. 161-171. 88

148. Kõljalg U., Larsson K. H., Abarenkov K., et al. UNITE: a database providing web-based methods for the molecular identification of ectomycorrhizal fungi // New Phytol. – 2005. – V. 166, № 3. – P. 1063-1068. 149. Kõljalg U., Nilsson R. H., Abarenkov K., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi // Mol Ecol. – 2013. – V. 22, № 21. – P. 5271-5277. 150. Fosso B., Santamaria M., Consiglio A.et al. ITSoneDB: a specialized ITS1 database for amplicon-based metagenomic characterization of environmental fungal communities // EMBnet Journal – 2012. – V. 18, 90 151. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.:Издательство: МГУ, 1987. 256 с. 152. Crombach A., Hogeweg P. Evolution of evolvability in gene regulatory networks // PLoS Comput Biol. – 2008. – V. 11, № 4. – P. 1-13. 153. Greenblum S., Turnbaugh P. J., Borenstein E. Metagenomic systems biology of the human gut microbiome reveals topological shifts associated with obesity and inflammatory bowel disease // Proc Natl Acad Sci U S A. // – 2012. – V. 109, № 2. – P. 594-599. 154. Brohée S., Faust K., Lima-Mendez G., et al. NeAT: a toolbox for the analysis of biological networks, clusters, classes and pathways // Nucleic Acids Res. – 2008. – V. 36, № 1. – P. 444-451. 155. Mikryukov V. S., Dulya O. V., Modorov M. V. Phylogenetic signature of fungal response to long-term chemical pollution // Soil Biology and Biochemistry. – 2020. – V. 140, № 2. – P. 156. Barberán A., Bates S. T., Casamayor E. O., et al. Using network analysis to explore co-occurrence patterns in soil microbial communities // ISME J. – 2012. – V. 6, № 2. – P. 343-351. 89

157. Zheng X., Wei X., Zhang S. Tree species diversity and identity effects on soil properties in the Huoditang area of the Qinling Mountains, China // Ecosphere. – 2017. – V. 8, № 3. – P. 1-8. 158. Воробейчик Е. Л., Козлов М.В. Воздействие точечных источников эмиссии поллютантов на наземные экосистемы: методология исследований, экспериментальные схемы, распространенные ошибки // Экология. – 2012. № 2. – С. 83–91. 159. Воробейчик Е. Л. К методике измерения мощности лесной подстилки для целей диагностики техногенных нарушений экосистем // Экология. – 1997. № 4. – С.265–269 160. Трубина М.Р., Воробейчик Е.Л. Сильное промышленное загрязнение увеличивает β-разнообразие растительных сообществ // Доклады АН. – 2012. – Т. 442, № 1. – С. 139–141. 161. Воробейчик Е.Л. Сезонная динамика пространственного распределения целлюлозолитической активности почвенной микрофлоры в условиях атмосферного загрязнения // Экология. – 2007. № 6. – С. 427–437. 162. Хантемирова Е.В., Воробейчик Е.В. Реакция лесных фитоценозов на техногенное загрязнение: зависимость доза-эффект//Экология. – 1994. № 3. – С. 31-43. 163. Воробейчик Е.Л. Население дождевых червей (Lumbricidae) лесов Среднего Урала в условиях загрязнения выбросами медеплавильных комбинатов // Экология. – 1998. № 2. – С.102–108. 164. Бельская Е. А. Особенности размножения Pterostichus oblongopunctatus (Coleoptera, Carabidae) в условиях техногенного загрязнения // Проблемы почвенной зоологии. Почвенные сообщества от структуры к функциям: XV Всероссийское совещание по почвенной зоологии, Москва, 17-21 ноября 2008 г. М. Товарищество научных изданий КМК, – 2008. – С. 259-261. 90

165. Веселкин Д.В. Влияние загрязнения тяжелыми металлами и сернистым газом на эктомикоризы Picea obovata и Abies sibirica // Микология и фитопатология. – 2004. – Т. 38. №. 1. – С. 20–26. 166. Веселкин Д.В. Влияние загрязнения различных типов на разнообразие эктомикориз Pinus sylvestris // Микология и фитопатология. – 2006. – Т. 40, №. 2. – С. 122–132. 167. Воробейчик Е.Л. Изменение интенсивности деструкции целлюлозы под воздействием техногенной нагрузки // Экология. – 1991. N 6. – С.73–76. 168. Воробейчик Е.Л. Реакция лесной подстилки и ее связь с почвенной биотой при токсическом загрязнении // Лесоведение. – 2003. № 2. – С. 32–42. 169. Воробейчик Е.Л., Пищулин П.Г. Влияние деревьев на скорость деструкции целлюлозы в почвах в условиях промышленного загрязнения // Почвоведение. – 2011. – № 5. – С. 597–610. 170. Сморкалов И.А. Методические проблемы разделения потоков углекислого газа из почвы в полевых условиях: определение вклада дыхания корней // Экология: традиции и инновации: материалы конф. молодых ученых. Екатеринбург: изд-во «Гощицкий». – 2012. – С. 129–133. 171. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2020 URL: https://www.R-project.org/. (дата обращения 25.02.2020) 172. Moreno J. L. Nervous and mental disease monograph series, no 58.Who shall survive?: A new approach to the problem of human interrelations. Nervous and Mental Disease Publishing Co. 1934. 231 p. 173. Friedman J., Alm E. J. Inferring correlation networks from genomic survey data. // PLoS Comput Biol. – 2012. – V. 8, № 9 1-11 91

174. Friedman J., Hastie T., Tibshirani R. Sparse inverse covariance estimation with the graphical lasso // Biostatistics. – 2008. – V. 9, № 3. – P. 432441. 175. Meinshausen N., Bühlmann P. High-dimensional graphs and variable selection with the Lasso // Ann. Statist. – 2006. – V. 34, № 3. – P. 1436-1462. 176. Schwager E., Mallick H., Ventz S., et al. A Bayesian method for detecting pairwise associations in compositional data // PLoS Comput Biol. – 2017. – V. 13, № 11. – P. 1-21. 177. Corrected Schwager E., Weingart G., Bielski C.,CCREPE: Compositionality by PEr-mutation and Renormalization 2020. URL: https://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/ccrepe/inst/doc/ccrepe .pdf (дата обращения 25.02.2020) 178. Fang H., Huang C., Zhao H., et al. CCLasso: correlation inference for compositional data through Lasso // Bioinformatics. – 2015. – V. 31, № 19. – P. 3172-3180. 179. Watts S. C., Ritchie S. C., Inouye M., et al. FastSpar: rapid and scalable correlation estimation for compositional data // Bioinformatics. – 2019. – V. 35, № 6. – P. 1064-1066. 180. Berry D., Widder S.. Deciphering microbial interactions and detecting keystone species with co-occurrence networks. // Front Microbiol. – 2014. – V. 5, № 219. doi: 10.3389/fmicb.2014.00219. PMID: 24904535; PMCID: PMC4033041. 1-14. 181. Hirano H., Takemoto K. Difficulty in inferring microbial community structure based on co-occurrence network approaches // BMC Bioinformatics. – 2019. – V. 20, № 329. – P. 1-14. 182. Brandes U. A faster algorithm for betweenness centrality // The Journal of Mathematical Sociology. – 2001. – V. 25, № 2. – P. 163-177. 183. Brandes U. Network Analysis. Methodological Foundations. – New York: Springer, 2005. 484 p. 92

184. Deng Y., Jiang Y., Yang Y. et al. Molecular ecological network analyses // BMC Bioinformatics – 2012. – V. 13, № 113. – P. 1-20. 185. Vázquez-Baeza Y., Hyde E. R., Suchodolski J. S., et al. Dog and human inflammatory bowel disease rely on overlapping yet distinct dysbiosis networks // Nat Microbiol. – 2016. – V. 1, № 16177. – P. 1-16. 186. Gevers D., Kugathasan S., Denson L. A., et al. The treatment-naive microbiome in new-onset Crohn's disease. Cell Host Microbe. – 2014 – V. 15, № 3. – P. 382-392. 187. Stone L., Roberts A. The checkerboard score and species distributions // Oecologia. – 1990. – V. 85, № 5. – P. 74–79. 188. Fuhrman J. A., Cram J. A., Needham D. M. Marine microbial community dynamics and their ecological interpretation // Nat Rev Microbiol. – 2015 – V. 13, № 3. – P. 133-146. 189. Yang Z., Algesheimer R., Tessone C. J. A Comparative Analysis of Community Detection Algorithms on Artificial Networks // Sci Rep. – 2016. – V. 6, № 30750. – P. 1-18 190. Chaffron S., Rehrauer H., Pernthaler J., et al. A global network of coexisting microbes from environmental and whole-genome sequence data // Genome Res. – 2010 – V. 20, № 7. – P. 947-959. 191. Bonito G., Benucci G. M. N., Hameed K., et al. Fungal-Bacterial Networks in the Populus Rhizobiome Are Impacted by Soil Properties and Host Genotype // Front Microbiol. – 2019 – V. 29, № 10. – P. 1-21. 192. Sabidussi G. The centrality index of a graph // Psychometrika. – 1966. – V. 31, № 6. – P 581–603. 193. Strojan C. L. Forest leaf litter decomposition in the vicinity of a zinc smelter // Oecologia. – 1978. – V. 32, № 2. – P. 203-212. 194. Mikryukov V.S., Dulya O.V., Vorobeichik E.L. Diversity and spatial structure of soil fungi and arbuscular mycorrhizal fungi in forest litter 93

contaminated with copper smelter emissions // Water, Air, and Soil Pollution. – 2015. – V. 226, № 114. – P. 1-14. 195. Head S. R., Komori H. K., LaMere S. A., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges // Biotechniques. – 2014. – V. 56, № 2. – P. 1-31. 196. Jansson J. K., Hofmockel K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics // Curr Opin Microbiol. – 2018. – V. 43, № 7. – P. 162-168. 197. Nowinski B., Smith C. B., Thomas C. M., et al. Microbial metagenomes and metatranscriptomes during a coastal phytoplankton bloom // Sci Data. – 2019. – V. 6, № 1. – P. 1-7. 198. Urbain J. Idiotypes, expression of antibody diversity and network concepts // Ann. Imunol. – 1976. – V. 127, № 8. – P. 357-374. 199. Simonds P. E., Ph D. Sex Differences in Bonnet Macaque Networks and Social Structure 1 // Archives of Sexual Behavior. 1974. – V. 3, № 2. – P. 151– 166. 200. Wolpert L., Lewis J. H. Towards a theory of development // Fed Proc. – 1975. – V. 34, № 1. – P. 14-20. 201. Liang S., Fuhrman S., Somogyi R. REVEAL, a general reverse engi- neering algorithm for inference of genetic network architectures // Paci c Symposiumon Biocomputing. – V. 3, № 18. – P. 18-29. 202. Aitchison J. A new approach to null correlations of proportions // Mathematical Geology. – 1981. – V. 13, № 9. – P. 175–189. 203. Weiss S., van Treuren W., Lozupone C., et al. Correlation detection strategies in microbial data sets vary widely in sensitivity and precision // ISME J. – 2016. – V. 10, № 7. – P. 1669-1681. 204. Омельченко А. В. Теория графов. – М.: МЦНМО, 2018. – 416 с. 205. Burk W. J., Steglich C. E. G., Snijders T. A. B. (2007). Beyond dyadic interdependence: Actor-oriented models for co-evolving social networks and 94

individual behaviors // International Journal of Behavioral Development. – 2017. – V. 31, № 4. – P. 397–404 206. Takemoto K., Borjigin S. Metabolic network modularity in archaea depends on growth conditions // PLoS One. – 2011. – V. 6, № 10. – P. 207. Kellner H., Zak D. R., Vandenbol M. Fungi unearthed: transcripts encoding lignocellulolytic and chitinolytic enzymes in forest soil // PLoS One. – 2010. – V. 5, № 6. – P 1-7. 208. Banfield J. F., Verberkmoes N. C., Hettich R. L. Et al. Proteogenomic approaches for the molecular characterization of natural microbial communities // OMICS. – 2005. – V. 9, № 4. – P. 301-333. 209. Baldrian P., Kolařík M., Stursová M., et al. Active and total microbial communities in forest soil are largely different and highly stratified during decomposition // ISME J. – 2012. – V. 6, № 2. – P 248-258. 210. Sun H., Santalahti M., Pumpanen J. Fungal Community Shifts in Structure and Function across a Boreal Forest Fire Chronosequence // Applied and Environmental Microbiology. – 2015. – V 81. № 22. – P. 7869-7880. 211. Santalahti M., Sun H., Jumpponen A., et al. Vertical and seasonal dynamics of fungal communities in boreal Scots pine forest soil. – 2016. – V. 92, № 11. – P. 1-12. 212. Ihrmark K., Bödeker I. T., Cruz-Martinez K., et al. New primers to amplify the fungal ITS2 region–evaluation by 454-sequencing of artificial and natural communities // FEMS Microbiol Ecol. – 2012. – V. 82, № 3. – P. 666-677. 213. White T. J., Bruns T., Lee S., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. – New York: Academic Press Inc, 1990. – P 315–322. 214. Edgar RC. UCHIME2: improved chimera prediction for amplicon sequencing // bioRxiv preprint. – 2016a. – P. 1-21. 95

215. Edgar R. C. UTAX accurately predictstaxonomy of marker gene sequences 2016б. URL: http://drive5.com/stamps2016/utax_preprint.pdf (дата обращения 19.03.2020) 216. Edgar R.C. SINTAX: a simple non-Bayesian taxonomy classifier for 16S and ITS sequences // bioRxiv preprint. – 2016в. – P. 1-20. 217. Edgar R. C., Flyvbjerg H. Error filtering, pair assembly and error correction for next-generation sequencing reads // Bioinformatics. – 2015. – V. 31., № 21. – P 3476-82. 218. Wickham H. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. 2nd Edition. – New York: Springer, 2009. 219. Oksanen J. Blanchet F. G., Friendly M., et al. vegan: Community Ecology Package. // R package version 2.5-2. 2018. URL: https://CRAN.Rproject.org/package=vegan (дата обращения 25.02.2020). 220. Csardi G., Nepusz T. The igraph software package for complex network research // Complex Syst. – 2006. № 1695. – P. 1–9. 221. Shannon P., Markiel A., Ozier O., Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks // Genome Res. – 2003. – V. 13, № 11. – P. 2498-2504. 222. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads // EMBnet.journal. – 2011. – V. 17, № 1. – P. 10–12. 223. Zhang J., Kobert K., Flouri T., Stamatakis A. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR // Bioinformatics. – 2014. – V. 30, № 5. – P. 614-620. 224. Chen H., Yu F., Shi W.. Detection of N2O-producing fungi in environment using nitrite reductase gene (nirK)-targeting primers // Fungal Biol. – 2016. – V. 120, № 12. – P. 1479-1492. 225. Kadowaki K., Sato H., Yamamoto S., Tanabe A. S., Hidaka A., Toju H. Detection of the horizontal spatial structure of soil fungal communities in a natural forest // Popul. Ecol. – 2014. – V. 56, № 10. –P. 301–310. 96

226. Oliver A. K., Callaham M. A., Jumpponen A. Soil fungal communities respond compositionally to recurring frequent prescribed burning in a managed southeastern US forest ecosystem // For. Ecol. Manag. 2015. – V. 345, № 4. – P. 1– 9. 227. Toju H., Tanabe A. S., Ishii H. S. Ericaceous plant-fungus network in a harsh alpine-subalpine environment // Mol Ecol. – 2016. – V. 25, № 13. – P. 3242-3257. 228. Mahé F., Rognes T., Quince C., et al. Swarm v2: highly-scalable and high-resolution amplicon clustering // PeerJ. – 2015. – V. 3, № 7. 1-12. 229. Dulya O.V, Bergman I.E, Kukarskih V.V., et al. Pollution-induced slowdown of coarse woody debris decomposition differs between two coniferous tree species// Forest Ecology and Management. 2019. – V. 448. – P. 312-320. 230. Woodward G., Brown L. E., Edwards F. K., et al. Climate change impacts in multispecies systems: drought alters food web size structure in a field experiment // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. – 2012. – V. 367, № 1605. – P. 2990-2997. 231. Thomas T., Gilbert J., Meyer F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis // Microb Inform Exp. – 2012. – V. 2, № 3. – P. 1-12. 232. Reazin C., Morris S., Smith J. E., et al. Fires of differing intensities rapidly select distinct soil fungal communities in a Northwest US ponderosa pine forest ecosystem. // Forest Ecology and Management. – 2016. – V. 377, № 9 – P. 118–27 233. Кайгородова С. Ю., Воробейчик Е. Л. Трансформация некоторых свойств серых лесных почв под действием выбросов медеплавильного комбината // Экология. – 1996. – № 3. – С. 187-193. 234. Villegas-Olivera J. A., Perez J., Mata G., et al.. Type of light and formation of basidiomata of two species of edible ectomycorrhizal mushrooms associated with neo-tropical pines and the description of basidiomata development // Revista Fitotecnia Mexicana. – 2017. – V. 40. – P 405-413. 97

235. Trocha L. K., Kałucka I., Stasińska. M., et al. Ectomycorrhizal fungal communities of native and non-native Pinus and Quercus species in a common garden of 35-year-old trees // Mycorrhiza. – 2012 – V. 22. № 2. – P. 121-134. 236. Hawksworth D. L., Lücking R. Fungal Diversity Revisited: 2.2 to 3.8 Million Species // Microbiol Spectr. – 2017. – V. 5, № 4. – P. 79-95. 98

Приложения Приложение 1 – Распределение долей видового разнообразия (а) и обилий на исследуемых территориях (б) Приложение 2 – Число отрицательных и уникальных связей между компонентами сообществ эктомикоризных грибов разных территорий в зависимости от метода построения сетей Методы CCREPE SPIECEASI Пирсон Спирмен SparCC 0.5 Фон 0 КМЗ Буфер 2 0.5 0.65 0.3 0.5 1 0 0 1 0 4 1 0 2 5 |r| Импакт 3 Фон 0 2 1 2 0 4 1 2 1 Уникальные связи 6 2 99 СМЗ Буфер 0 Импакт 0 0 0 1 0 4 0 4 5 1 8

Приложение 3 – Средние значения степени узла, центральностей по промежуточности и эксцентриситету в сетях почвенных грибных сообществ разных территорий в зависимости от метода построения сети и уровня консервативности 100

Приложение 4 – Ассортативность и транзитивность сетей почвенных грибных сообществ разных территорий в зависимости от метода построения сети и уровня консервативности 101

Приложение 5 – Виды, присутствующие на всех участках исследуемых территорий Вид Хозяин Метод Amphinema byssoides Abies, Larix, Picea, Pinus, Alnus, Betula, Populus [Змитрович, 2008] Спирмен, Пирсон, CCREPE, SparCC, SPIEC-EASI Oidiodendron maius* Rhododendron [Rice, 2006] Спирмен, Пирсон, CCREPE, SparCC, SPIEC-EASI Phialocephala fortinii Pinus sylvestris, Pinus contorta, Picea abies, Abies alba [Surono, 2017] Спирмен, Пирсон, CCREPE, SparCC, SPIEC-EASI Cenococcum geophilum Salicaceae, Betulaceae, Fagaceae, Pinaceae [Cairney, 1999] CCREPE, SparCC, SPIEC-EASI Hebeloma leucosarx Eucalyptus, Larix, Picea, Pinus, Pseudotsuga [VillegasOlivera, 2017] CCREPE, SparCC, SPIEC-EASI Cortinarius Pinus sp., Quercus robur SparCC, SPIEC-EASI casimiri [Trocha, 2011] * – Oidiodendron maius включен в анализ взаимоотношений между эктомикоризными грибами, поскольку это широко распространенный корневой эндофит, часто ассоциированный с эктомикоризой. Его способность формировать микоризные ассоциаций с корнями растений недостаточно подтверждена. 102

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Георгий Лиходеевский

Рецензия на выпускную квалификационную работу магистранта Лиходеевского Г. А. от старшего научного сотрудника лаборатории молекулярной экологии растений Института экологии растений и животных Полежаевой М. А..

около 3 лет назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв