Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего образования
«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
ИНСТИТУТ ФИЗИКИ
Кафедра медицинской физики
Направление: 03.04.02 – Физика
Профиль: Физика конденсированного состояния
МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ
Исследование структурных характеристик циклоспорина D методом
ЯМР высокого разрешения
Студент 2 курса магистратуры группы 06-719
«__» ________2019 г.
___________ (Кобчикова П.П.)
Научный руководитель
д.х.н., профессор
«__» ________2019 г.
___________
(Клочков В.В.)
Заведующий кафедрой физики твердого тела
к. ф.-м. н..доцент
«__» ________2019 г.
___________
(Воронина Е.В.)
Казань – 2019
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Физические основы спектроскопии ЯМР ......................................................... 7
1.1 Явление ядерного магнитного резонанса .................................................... 7
1.2 Квантованные уровни энергии ядра ............................................................ 7
1.3 Распределение населенностей ...................................................................... 9
1.4 Техника проведения эксперимента ЯМР ..................................................... 9
1.5 Природа ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО/NOE) ............................. 12
2 Основные методы 1D и 2D-спектроскопии ЯМР ........................................... 17
2.1 1D-спектроскопия ЯМР ............................................................................... 17
2.3 2D-спектроскопия ЯМР ............................................................................... 18
2.3.1 2D COSY ................................................................................................. 18
2.3.2 2D HSQC ................................................................................................. 20
2.3.3 2D TOCSY............................................................................................... 21
2.3.4 2D NOESY .............................................................................................. 21
2.3.5 2D ROESY............................................................................................... 22
3 Циклические пептиды........................................................................................ 24
3.1 Циклоспорин................................................................................................. 24
3.2 Механизм действия циклоспорина (в лечении аутоиммунных
заболеваний) ....................................................................................................... 25
3.3 Роль циклических пептидов в изучении структуры биологических
объектов .............................................................................................................. 26
4 Практическая часть ............................................................................................ 28
4.1 Материалы и методы ................................................................................... 28
4.2 Объект исследования ................................................................................... 29
4.3 1D-спектры ЯМР .......................................................................................... 30
2
4.4 2D-спектры ЯМР .......................................................................................... 33
4.5 Определение расстояний ............................................................................. 41
5 Результаты........................................................................................................... 44
Выводы ................................................................................................................... 47
Библиографический список: ................................................................................ 49
3
ВВЕДЕНИЕ
Целевой синтез биологически активных веществ, действующих
селективно, то есть веществ, не имеющих побочных эффектов, уже
значительное время интересует ученых. Многие лаборатории стремятся
установить связь между структурой веществ и их биологическими
свойствами. Разработка лекарств требует новых знаний в области химии,
биологии и медицины [1]. Сначала ученые обращали внимание только на
химический состав веществ, но, в конце концов, поняли, что молекулярная
конфигурация вещества также важна. Хотя Бартон [2] четко показал роль
молекулярной
конформации
в
химии
и
биологии,
долгое
время
предпринимались лишь слабые попытки изучить связь между конформацией
и биологической активностью [3]. Несложно понять, почему какое-то время
это направление почти не развивалось. Дело в том, что конформеры в
реальных системах (растворах, кристаллах) не изолированы друг от друга, то
есть могут сосуществовать одновременно, что затрудняет изучение их
биологической активности.
Тем не менее, вскоре стало невозможным игнорировать очевидный
факт
влияния
на
физико-химические
свойства
органических
и
биоорганических веществ не только состава, но и их пространственной
структуры. От этого зависит характер внутри- и межмолекулярных
взаимодействий. Небольшие изменения в пространственной структуре могут
существенно влиять на активность вещества, что, конечно же, открывает
большие перспективы для такого современного направления, как “drug
design” [1].
Интерес к циклическим пептидам в качестве основы для разработки
лекарственных средств против сложных мишеней, например, для регуляции
межбелковых взаимодействий, исходит из предпосылки, что большие
макроциклы лучше подходят для ингибирования больших поверхностей
связывания. Определение конформаций циклических пептидов может дать
представление о взаимосвязи структура-активность и структура-свойство,
4
что
может
помочь
в
разработке
соединений
с
улучшенными
характеристиками биологической активности [5].
Существует несколько типов циклоспоринов. В данной работе
изучается
циклоспорин
D
(CsD).
Он
имеет
слабовыраженные
имунноподавляющие свойства, но, тем не менее, представляет интерес с
точки зрения попытки более глубоко понять влияние изменений структуры
на биологическую активность.
Исследования проводились с помощью метода спектроскопии ядерного
магнитного резонанса, в том числе методами, базирующимися на эффекте
Оверхаузера. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса, как правило,
используется для изучения структуры органических соединений в растворах,
в том числе пептидов. Различными методами ЯМР можно определить
структуру молекул, анализируя информацию о межатомных расстояниях
[6, 7] и об ориентации межатомных связей [8, 9, 10]. Таким образом, ЯМР
является
эффективным
методом
исследования
структуры
молекул.
Взаимодействие, называемое ядерным эффектом Оверхаузера (ЯЭО),
представляет особый интерес, так как позволяет определять межпротонные
расстояния между магнитными ядрами в диапазоне до 5 Å между ними [11].
В настоящее время современные методы спектроскопии ЯМР достигли столь
высокого уровня, что позволяют вплотную приблизиться к детальному
изучению биофизических процессов как в медицине, так и в биологии [12];
таким образом, ЯМР становится мощным инструментом в исследованиях
биофизических свойств медицинских объектов, в том числе циклоспоринов.
Целью работы является получение структурных параметров для
молекулы циклоспорина D.
Задачи магистерской диссертации следующие:
Освоение
техники
получения
спектров
ЯМР
высокого
разрешения (как двумерных спектров, так и одномерных)
Отнесение сигналов по одномерным и двумерным спектрам
5
Определение
расстояний
между
атомами
1
H
молекулы
циклоспорина D
Исследования проводились на оборудовании ФЦКП ФХИ Казанского
Федерального университета (спектрометр ЯМР Bruker Avance III 700).
6
1. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР
1.1 Явление ядерного магнитного резонанса
В 1946 году Блохом и Парселлом было открыто явление ядерного
магнитного резонанса (ЯМР). Многие вещества при помещении их в
магнитное поле способны поглощать энергию электромагнитных волн [13].
Данный
эффект
наблюдается
при
особых
условиях,
называемых
резонансными. В довольно большом количестве работ привлекается метод
ядерного магнитного резонанса [14, 15, 16–22], который и по сей день
является одним из самых мощных инструментов изучения веществ на
молекулярном уровне.
1.2 Квантованные уровни энергии ядра
В терминах квантовой механики ядерный магнитный момент ядра
будет направлен либо вдоль, либо против приложенного извне магнитного
поля индукцией B0 и может иметь 2I + 1значение проекций. Для ядра с I = 1/2
и положительным гиромагнитным отношением γ возможен только один
переход между двумя энергетическими уровнями. Энергетически выгодная
ситуация
осуществляется,
когда
магнитный
момент
сонаправлен
с
приложенным полем (спин с проекцией m = +1/2). Такое состояние часто
обозначается символом α. При антипараллельной ориентации состояние с
более высокой энергией (m = –1/2) имеет обозначение β. Ось вращения ядра
не может быть ориентирована точно параллельно (или антипараллельно)
направлению прикладываемого поля B0 (определяемого в нашей системе
координат
относительно
оси
z).
Но
ось
вращения
ядра
должна
прецессировать (движение, подобное гироскопу) относительно этого поля с
угловой скоростью (Рисунок 1), определяемой выражением:
(1)
где ω0 – скорость прецессии, которая также называется частотой Лармора.
7
Прецессия
вокруг
приложенного
поля
Вращающееся
ядро
Рисунок 1 – Прецессия оси вращения атома вокруг приложенного поля.
Ориентации, которые может принимать магнитный момент ядра во
внешнем магнитном поле, не равны по энергии. Спиновые состояния,
ориентированные параллельно внешнему полю, имеют меньшую энергию,
чем в отсутствие внешнего поля. Напротив, спиновые состояния, ориентации
которых противоположны внешнему полю, имеют более высокую энергию,
Относительная
энергия
чем при отсутствии внешнего поля (Рисунок 2).
Увеличение напряженности магнитного поля
поля
Рисунок 2 – Ориентация энергетических уровней в зависимости от
магнитного момента ядра.
Там, где существует разница в энергетических уровнях, существует
возможность вызвать переход между различными состояниями спина.
Облучая
ядро
электромагнитным
излучением
подобранной
энергии
(определяемой по его частоте, E = hν, где E – энергия, h – постоянная Планка
8
и ν – частота), ядро с низкой энергетической ориентацией можно заставить
«перейти» в ориентацию с более высокой энергией. Поглощение энергии при
этом переходе составляет основу метода ЯМР.
1.3 Распределение населенностей
В конкретном образце ядра будут распределены по различным
доступным спиновым состояниям. Поскольку энергетическое разделение
между этими состояниями сравнительно мало, энергии от тепловых
столкновений достаточно, чтобы некоторые ядра перешли в спиновые
состояния с более высокой энергией. Количество ядер в каждом спиновом
состоянии описывается распределением Больцмана:
(2)
где N – число ядер в соответствующих спиновых состояниях, γ –
гиромагнитное отношение, h – постоянная Планка, B0 –индукция внешнего
магнитного поля, k – постоянная Больцмана и T – температура.
1.4 Техника проведения эксперимента ЯМР
Существует два основных типа приборов ЯМР: с непрерывной
разверткой (CW) и импульсные с преобразованием Фурье. Ранние
эксперименты проводились с инструментами с непрерывной разверткой
(CW), и в 1970 году стали доступны первые инструменты с преобразованием
Фурье (FT). В настоящее время используются практически только
инструменты с преобразованием Фурье.
В FT-ЯМР все частоты исследуемой спектральной ширины облучаются
одновременно радиочастотным импульсом. Используется единственный
генератор (передатчик) для создания импульса электромагнитного излучения
с частотой ω0 и длительностью τ.
После импульса магнитные моменты оказываются в неравновесном
состоянии, и начинают возвращаться в свое начальное положение в согласии
9
с приложенным магнитным полем. Они начинают процесс, называемый
«релаксацией», с помощью которого спины возвращаются к тепловому
равновесию. Сигнал излучения во временной области (называемый спадом
свободной индукции (ССИ или FID)) регистрируется прибором, когда
магнитные моменты ядер восстанавливаются до равновесия с приложенным
магнитным полем. Спектр частотной области затем получается с помощью
преобразования Фурье сигнала ССИ.
Чтобы
понять
влияние
радиочастотного
импульса,
рассмотрим
прецессирующие магнитные моменты ядер 1Н в образце, находящемся в
приложенном магнитном поле (Рисунок 3):
Рисунок 3 – Прецессирующие магнитные моменты ядер. Часть из них
направлена по полю, часть – против.
Магнитных моментов, направленных по полю, больше, чем магнитных
моментов, направленных против него. Это означает, что, когда все
противоположные магнитные моменты взаимно компенсируют друг друга,
чистая разница в населенностях уровней создаст суммарный вектор
намагниченности (называемый М0), направленный вдоль B0 (Рисунок 4):
10
Суммарный вектор
намагниченности
Рисунок 4 – Суммарный вектор намагниченности.
В эксперименте ЯМР применяют радиочастотные импульсы на
ларморовской частоте наблюдаемых ядер, чтобы возмущать магнитные
моменты 1Н магнитной составляющей приложенного ВЧ электромагнитного
излучения. На диаграммах ниже короткий радиочастотный импульс подается
вдоль оси x' (вращающейся системы координат [23]) (Рисунок 5).
B1
B1
Импульс
Рисунок 5 – Короткий радиочастотный импульс подается вдоль оси x',
суммарный вектор намагниченности переходит в плоскость x’y’.
Магнитное поле этого излучения обозначено символом B1. Во
вращающейся системе отсчета B1 и M0 неподвижны и находятся под прямым
углом.
Импульс
заставляет
вектор
суммарной
намагниченности
M0
вращаться по часовой стрелке вокруг оси x'. Скорость вращения
определяется длительностью импульса.
11
Детектор направлен вдоль оси y'. Если мы вернемся к статической
системе отсчета, чистый магнитный момент будет вращаться вокруг оси y на
частоте
Лармора.
Это
движение
магнитных
моментов
составляет
радиочастотный сигнал, который можно обнаружить. Когда импульс
заканчивается, ядра релаксируют и возвращаются в равновесное состояние, и
сигнал затухает. Этот затухающий сигнал воспринимается в катушке как
осциллирующее
напряжение,
генерируемое
магнитными
моментами,
прецессирующими и одновременно релаксирующими к равновесному
состоянию. Сигнал не может быть записан напрямую, потому что частота
слишком высока. Он смешивается с низкочастотным сигналом для получения
интерферограммы низкой частоты. Эта интерферограмма оцифровывается и
называется спадом свободной индукции (ССИ). Преобразование Фурье ССИ
дает спектр частотной области.
1.5 Природа ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО/NOE)
Биологическая
активность
молекул
в
биологических
системах
проявляется обычно в водных растворах. Ядерный эффект Оверхаузера
(ЯЭО), основанный на прямом взаимодействии магнитных моментов ядер
элементов, составляющих молекулу, является единственным методом,
дающим возможность определить структурные параметры молекул в
растворах. ЯЭО исключает влияние на спектр молекул скалярного спинспинового взаимодействия и некоторых других факторов. Прямое магнитное
взаимодействие ядер зависит от расстояния между ядрами и дает
возможность определения этого расстояния [24, 25].
Ядерный эффект Оверхаузера состоит в изменении интенсивности
резонансной линии, вызванном диполь-дипольным взаимодействием с
соседними спинами с возмущенными населенностями энергетического
уровня. Чтобы понять природу NOE, стоит рассмотреть двухспиновую
систему I1 и I2. Используем для этого диаграмму энергетических уровней
(Рисунок 6):
12
Рисунок 6 – Диаграмма энергетических уровней для двухспиновой системы.
Возможные переходы для этой двухспиновой системы можно
разделить на три группы:
- W1-переходы, включающие переворот спина только одного из двух
спинов (I1 или I2), что соответствует только T1-релаксации спина.
- переход W0, включающий одновременный переворот спина α→β для
одного спина и β→α для другого (то есть, в сумме, переход с нулевым
квантованием).
- переход W2, включающий одновременный переворот спинов в обоих
направлениях в одном направлении, соответствующий чистому двойному
квантовому переходу.
Если мы возмущаем один спин, например, I1, то есть изменяем его
заселенности состояний a и b, то релаксация заставит I1 вернуться к
равновесному распределению Больцмана. С механизмом W1 спин I1 будет
просто релаксировать, не влияя на спин I2 (Рисунок 7). Тем не менее, два
других механизма будут влиять на I2.
13
Рисунок 7 – С возвращением поляризации спина I1 от состояния насыщения к
равновесию Больцмана механизм W0 вызовет отклонение соседнего (пока что
невозмущенного) спина от равновесия Больцмана в сторону уменьшения
разности популяций a, b. После 900-градусного импульса это приведет к
снижению интенсивности сигнала для I2 – «отрицательный эффект NOE».С
другой стороны, механизм W2 приводит к увеличению разности
населенностей невозмущенного спина I2, что соответствует увеличению
интенсивности сигнала: «положительный эффект NOE».
Эти эффекты могут непосредственно наблюдаться в очень простом
эксперименте, одномерной разностной последовательности NOE (Рисунок 8):
Рисунок 8 – Общая схема последовательности NOE.
Один спин избирательно насыщается длительным непрерывным
слабым (CW) излучением. Как только спин отклоняется от своего
распределения населенности Больцмана, начинается продольная релаксация.
Через механизмы W0 или W2 это ведет к изменению в распределении
населенности соседних спинов. После 90° импульса это проявляется как
увеличение или уменьшение интенсивности сигнала.
Обычно эксперимент повторяется без насыщения, вследствие чего
получается нормальный одномерный спектр. Затем этот спектр вычитается
из спектра с облучением, так что заметить небольшие изменения
14
интенсивности от эффектов NOE становится легче: спины с положительным
NOE (т.е. с более высокой интенсивностью в спектре NOE, чем в эталонном
1D) показывают небольшой положительный остаточный сигнал, спины с
отрицательным значением NOE дают отрицательный сигнал, а сигналы
спинов без эффекта NOE (т.е. те, которые далеки в пространстве от
насыщаемого спина) полностью исчезают.
Молекула в образце постоянно перемещается в растворе. Вращение
молекулы вызывает модуляцию поля, которое фактически испытывает спин,
благодаря воздействию соседних спинов. Таким образом, движение других
спинов генерирует электромагнитное поле. Самым простым приближением
для описания вращения молекулы в растворе является предположение о том,
что молекула является жесткой сферой. Если посчитать, сколько энергии на
«определенной» частоте генерируется при случайном вращении,
то
получается следующее выражение для «спектральной плотности» на частоте ω:
( )
(3)
Это означает, что у нас есть максимум при ω = 0, и спектральная
плотность затем падает на более высоких частотах. Скорость контролируется
параметром τc, это время молекулярной вращательной корреляции («время
корреляции»). Время корреляции определяется различными факторами: в
основном, молекулярной массой. Чем больше молекула, тем медленнее ее
переориентация, т.е. тем дольше ее τc. На τc также влияют другие параметры:
температура (чем выше температура, тем меньше τc), вязкость растворителя
(чем выше вязкость, тем больше τc), агрегация в растворе и т.д.
Наблюдаемый эффект NOE определяется скоростью кросс-релаксации:
(
)
(4)
15
и с учетом зависимости от спектральных плотностей на «резонансных
частотах» для W0 (ω = 0) и W2 (ω = 2ω0) получаем:
{ (
)
( )}
(5)
Для случая 6J(2ω0) > J(0) мы получаем положительные значения NOE.
Это требует относительно высокой спектральной плотности при ω = 2ω0, то
есть короткого τc. В противоположном случае (длинное τc) будет
доминировать W0: отрицательное NOE.
В этих уравнениях мы смотрим на σij, скорость кросс-релаксации
между двумя спинами i и j. Однако в описанном выше эксперименте с
одномерным разностным NOE реально невозможно измерить скорость
накопления NOE, поскольку нам требуется относительно длительное
(порядка секунд) селективное облучение с низкой мощностью для
насыщения одного спина. В течение этого времени NOE будет постепенно
нарастать, так как мы начинаем насыщать I1 все больше и больше без
определенной начальной точки. То, что мы получаем после достаточно
длительного облучения, это так называемое «устойчивое состояние NOE», то
есть стационарное распределение популяции соседних спинов, которое
происходит из-за двух противодействующих эффектов: (1) нарастание NOE
из-за кросс-релаксации с облученным спином I1, и (2) T1-релаксация спинов,
которые отклонились от своего равновесного положения из-за NOE и
пытаются вернуться в изначальное состояние равновесия.
Устойчивое состояние NOE, полученное в результате этого баланса,
теперь не зависит от расстояния между двумя спинами, но лишь до тех пор,
пока наблюдение какого-либо эффекта не подтвердит, что расстояние
меньше, чем приблизительно 5-6 Å. Интенсивность наблюдаемого NOE
может широко варьироваться в зависимости от соседства других протонов,
которые действуют как источник релаксации.
16
2 ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ 1D И 2D-СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР
2.1 1D-спектроскопия ЯМР
Любой одномерный ЯМР-эксперимент (1D-NMR) состоит из двух
основных частей: подготовки и детектирования (Рисунок 9) [26]. Во время
подготовки спиновая система приводится в определенное состояние с
помощью последовательности импульсов. В простейшем случае подготовка
представляет собой 90-градусный импульс (Рисунок 9), применяемый вдоль
оси x, который вращает намагниченность Mz к оси y (My). После этого
импульса каждый спин прецессирует со своей собственной ларморовой
частотой вокруг оси z и индуцирует сигнал в приемной катушке. Сигнал
затухает из-за релаксации T2 и поэтому называется спадом свободной
индукции (FID/ССИ). Во время детектирования регистрируется конечный
сигнал.
Рисунок 9 – Схема одномерного ЯМР-эксперимента.
Обычно
эксперимент
повторяется
несколько
раз,
и
данные
суммируются для увеличения отношения сигнал/шум. После суммирования
данные обрабатывают с помощью Фурье-преобразования для получения
окончательного одномерного спектра.
Есть несколько основных параметров в спектрах ЯМР [27]:
- химический сдвиг
- интегральная интенсивность
- константа спин-спинового взаимодействия (КССВ)
17
2.3 2D-спектроскопия ЯМР
Невозможно получить полезную информацию из спектра, пока пики
или мультиплеты не разрешены полностью. Так или иначе, разрешение
пиков зависит от ширины линии или, в конце концов, от формы линии [28].
Двумерная
ЯМР-спектроскопия
упрощает
процесс
определения
структуры и также увеличивает диапазон решаемых проблем. Такие
эксперименты легко интерпретировать, также они являются достаточно
надежными, что является причиной их популярности [28]. Двумерная
спектроскопия ЯМР позволила использовать ЯМР для определения структур
биомолекул, таких как белки, ДНК, РНК – до изобретения двумерной
спектроскопии молекулы такого размера считались неразрешимыми, так как
их спектры содержат большое количество линий. В 1971 году была
предложена схема эксперимента, которая послужила началом двумерной
ЯМР спектроскопии [29].
В двумерных спектрах интенсивность поглощения отвечает двум
разным частотам. Таким образом, видимый пик на двумерном спектре
говорит о наличии спин-спиновой связи для двух спинов через химическую
связь либо о диполь-дипольном механизме взаимодействия, то есть о
взаимодействии через пространство.
2.3.1 2D COSY
Эксперимент 2D COSY (COrrelation SpectroscopY) является наиболее
простым и широко используемым 2D экспериментом. Это эксперимент по
корреляции гомоядерного химического сдвига, основанный на переносе
поляризации импульсом смешивания между непосредственно J-связанными
спинами (Рисунок 10). Таким образом, гомоядерные взаимодействия через
связь могут быть прослежены простым анализом двумерной карты,
обеспечивающей более общую и полезную альтернативу классическим 1D
экспериментам.
18
Рисунок 10 – Корреляция между двумя J-связанными спинами
Последовательность для эксперимента 2D COSY состоит из двух
90°-ых импульсов. Первый импульс – импульс возбуждения, с помощью него
передается намагниченность от одного спина к другому. В течение
импульсной программы производится накопление n сканов за время t1. Затем
задержка времени t1 увеличивается на Δt1, после чего снова регистрируется n
сканов, но уже с более длинным временем t1. Второй импульс – это импульс
смешивания. Данный процесс повторяется несколько раз.
Осуществив двойное преобразование Фурье, мы получаем спектр
химического сдвига по двум осям. Таким образом, COSY показывает частоты
одного и того же изотопа, чаще всего – водорода (1H) по обеим осям.
Спектры COSY показывают два вида пиков:
Диагональные пики (имеют одинаковые частоты по обеим осям,
находятся на диагонали спектра);
Кросс-пики (на разных осях имеют разное значение частот и
находятся вне диагональной линии)
Диагональные пики соответствуют пикам, получаемым с помощью 1DЯМР экспериментов. Более интересны кросс-пики, так как они указывают на
связывание между атомными ядрами. Кросс-пики возникают в результате
переноса намагниченности (magnetization transfer), их присутствие означает
связь между двумя атомными ядрами, которые имеют разные резонансные
частоты, вследствие чего на двумерной карте ЯМР можно наблюдать сигнал
вне диагонали с двумя разными значениями по каждой оси. Каждое
взаимодействие дает на спектре два симметричных кросс-пика (над и под
диагональю). Таким образом, с помощью кросс-пиков можно определить
наличие химической связи (общих электронов) между ядрами [30].
19
2.3.2 2D HSQC
Эксперимент 2D HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation)
1
позволяет получить двумерную карту корреляции между ядрами
гетероядрами (обычно
эксперимент
13
C и
позволяет
15
H и
N), соединёнными химической связью. Этот
увеличить
чувствительность
ядер
13
«неблагоприятным» гиромагнитным отношением, например, для
возможно, так как сигнал регистрируются через влияние ядер
13
с
С. Это
С на более
чувствительные ядра 1Н. Первый 1Н корреляционный эксперимент был
предложен Мюллером [31]. Так как детектируемым ядром в данной методике
являются
протоны,
это
позволяет
значительно
сократить
время
эксперимента, если сравнивать с традиционным гетерокорреляционным
экспериментом (HETCOR). HSQC позволяет достичь высокого разрешения
по оси ядра X. Этот эксперимент не сразу стал рутинным, так как возникали
13
проблемы с сигналами от протонов, не связанных с ядрами
С. Была
необходимость в подавлении таких сигналов [32].
Базовая 2D импульсная последовательность HSQC состоит из четырех
независимых частей:
1.
Начальная
последовательность
импульсов
INEPT
передает
поляризацию от 1H до X через 1J(XH).
2. Противофазная намагниченность 13C развивается в течение периода
переменной
эволюции
t1
под
действием
химического
сдвига
X.
Гетероядерные соединения 1H-X рефокусируются путем применения 180º-ого
импульса в середине этого периода.
3. Серия импульсов обратного INEPT преобразует X-намагниченность
в синфазную 1H-намагниченность.
4.
Наконец,
производится
регистрация
сигнала
протонов
с
одновременной развязкой от ядер X.
Импульсная последовательность HSQC часто встроена в гораздо более
сложные последовательности.
20
2.3.3 2D TOCSY
Эксперимент TOCSY (Total correlation spectroscopy) аналогичен
эксперименту COSY, в котором наблюдаются кросс-пики связанных
протонов. Однако кросс-пики наблюдаются не только для ядер, которые
непосредственно связаны, но также и между ядрами, которые связаны цепью
связей. Это делает TOCSY полезным для идентификации более крупных
взаимосвязанных сетей спиновых связей. Эта способность достигается путем
введения повторяющихся серий импульсов, которые вызывают изотропное
смешивание в течение периода смешивания. Более длительное время
изотропного
смешивания
приводит
к
тому,
что
поляризация
распространяется через все большее число связей [28].
2.3.4 2D NOESY
Эксперимент 2D NOESY (Nuclear Overhauser SpectroscopY) предлагает
простой способ получения всей информации о NOE в молекуле с помощью
одного эксперимента. 2D NOESY – это техника, с помощью которой можно
наблюдать сигналы между ядрами, находящимися в непосредственной
близости в пространстве, вследствие диполь-дипольного взаимодействия за
счет ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО или NOE).
Этот метод основан на обмене намагниченности через дипольдипольное взаимодействие во время релаксации спинов к состоянию
теплового равновесия.
Последовательность для эксперимента 2D NOESY состоит из трех 90°
импульсов [33].
Любая количественная интерпретация стационарных NOE требует
знания расположения всех протонов относительно друг друга. В противном
случае, вместо стационарного NOE необходимо определять скорость
нарастания NOE, которая зависит от межпротонного расстояния как r–6. Это
также называют переходным NOE или кинетическим NOE.
21
Несмотря на то, что для измерения скоростей нарастания используются
некоторые вариации эксперимента одномерного NOE, самый простой способ
сделать это – эксперимент 2D NOESY (Рисунок 11):
Рисунок 11 – Последовательность импульсов NOESY. В течение t1
поперечная намагниченность приобретает метку фазы в соответствии со
смещением; эта поперечная намагниченность переворачивается вдоль оси z
вторым импульсом. Во время смешивания τm кросс-релаксация может
передавать эту меченую z-намагниченность другим спинам. Последний
импульс поворачивает z-намагниченность в поперечную плоскость, позволяя
обнаружить сигнал.
В
NOESY
для
установления
корреляций
используется
кросс-
релаксация ЯЭО между ядерными спинами в течение периода cмешивания.
Полученный спектр похож на COSY, он имеет диагональные пики и кросспики, однако кросс-пики отвечают резонансам ядер, расположенных близко в
пространстве, а не тем, которые связаны друг с другом химической связью.
Спектры NOESY также содержат дополнительные пики на частоте Ω = 0
(аксиальные), которые не дают дополнительной информации и могут быть
устранены с помощью разностного эксперимента путем изменения фазы
первого импульса [28], т.е. фазовым циклом. Одним из применений NOESY
является изучение больших биомолекул.
2.3.5 2D ROESY
Эксперимент ROESY (Rotating
frame
nuclear
Overhauser
effect
spectroscopy) похож на NOESY, за исключением того, что начальное
22
состояние отличается. Вместо наблюдения кросс-релаксации из начального
состояния
z-намагниченности,
равновесная
намагниченность
сначала
поворачивается на ось x, а затем блокируется при вращении специальной
импульсной последовательностью, так что она не может прецессировать.
Этот метод полезен для определенных молекул, у которых время
вращательной корреляции находится в диапазоне, где ЯЭО слишком слаб,
чтобы его можно было обнаружить, обычно это молекулы с молекулярной
массой около 1000 дальтон.
Как правило, ROESY имеет различную зависимость между временем
корреляции и константой скорости кросс-релаксации. В NOESY константа
скорости кросс-релаксации изменяется от положительной к отрицательной с
увеличением времени корреляции и включает в себя диапазон, где она близка
к нулю (точнее, ядерный эффект Оверхаузера в NOESY перестает
наблюдаться при ω0τc = √ ≈ 1, где эффекты от W0 и W2 компенсируют друг
друга – см. главу 1.5), тогда как в ROESY константа скорости кроссрелаксации всегда положительна [28,34]. ROESY иногда называют «кроссрелаксацией, подходящей для малых молекул, эмулируемых запертыми
спинами» («cross relaxation appropriate for minimolecules emulated by locked
spins», CAMELSPIN).
23
3 ЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ
3.1 Циклоспорин
Циклоспорин был открыт в 1970 году и первоначально был признан
эффективным иммунодепрессантом при трансплантации органов [35].
Семейство циклоспоринов включает более 30 циклических пептидов,
встречающихся в природе в качестве метаболитов почвенных грибов.
Впервые циклоспорин был выделен из Tolypocladium inflatum Gams [36],
также известного как Tolypocladium niveum (O. Rostr.) Bissett [37];
телеоморфная форма этого организма известна как Cordyceps subsessilis Petch
[38] или Elaphocordyceps subsessilis (Petch) [39] и является паразитом
жесткокрылых насекомых.
Исключительная стабильность каркаса циклопептидов предполагала
возможность
использования
циклоспорина
в
качестве
шаблона при
разработке лекарств. Например, в процессе создания циклического пептида
циклоспорина для собственной защиты грибы обеспечили человечество
лекарством,
которое
в
настоящее
время
произвело
революцию
в
трансплантационной терапии благодаря своей мощной иммуносупрессивной
активности [40].
Открытие
циклоспорина
А
(CsA)
исследователями
из
Сандоз
Фармасьютикалс стало ключевым ориентиром в области иммуноподавления.
CsA
показал
использования
плохие
по
результаты
назначению
в
в
испытаниях
качестве
на
животных
антибиотика,
для
однако
продемонстрировал, что препарат проявляет низкую токсичность и слабую
неспецифическую цитостатическую активность. Это побудило провести
тестирование в качестве иммунодепрессанта, где было обнаружено, что CsA
улучшает воспалительные реакции при адъювантном артрите Фрейнда,
отторжении кожного трансплантата и болезни «трансплантат против
хозяина» [25]. Последующие исследования показали, что CsA ингибирует
индуцированную конканавалином А пролиферацию лимфоцитов [25]. В
24
целом, ранние исследования CsA продемонстрировали ингибирование Тклеток без широко распространенной цитостатической активности, что
потенциально указывает на повышенную эффективность и улучшенный
профиль
безопасности
иммунодепрессантами.
по
сравнению
В
с
конечном
ранее
существовавшими
счете,
эффективность,
продемонстрированная в исследованиях на людях, оказалась решающей для
CsA, получившем клиническое одобрение в начале 1980-х годов и ставшим
основным
терапевтическим
средством
для
пациентов,
перенесших
трансплантацию.
3.2 Механизм действия циклоспорина (в лечении аутоиммунных
заболеваний)
При системных аутоиммунных заболеваниях воспалительные пути
активируются Т-клетками [41]. Циклоспорин избирательно ингибирует
активацию Т-клеток [42]. Внутри клетки циклоспорин связывается с
цитозольным белком циклофилином, образуя комплекс циклоспоринциклофилин,
который
ингибирует
фермент
кальциневрин.
При
ингибированном кальциневрине происходит блокирование пути передачи
сигнала, что приводит к высвобождению транскрипционного фактора,
ядерного фактора активированных Т-клеток, ответственных за активацию
генов для IL-2, IL-17 и других родственных цитокинов, как видно на рисунке
ниже
(Рисунок
12).
противовоспалительными
Эти
цитокины
медиаторами,
которые
являются
приводят
мощными
к
каскаду
чрезмерного воспаления [41]. Блокада циклоспорином приводит к снижению
уровня воспалительных цитокинов, что впоследствии ингибирует активацию
Т-клеток и уменьшает симптомы аутоиммунных болезней [43].
25
Рисунок 12 – Механизм действия циклоспорина. CsA связывается с
цитозольным белком циклофилином (CpN), образуя комплекс CsAYCpN.
Комплекс ингибирует фермент кальциневрин (CaN) от дефосфорилирования
цитоплазматического компонента ядерного фактора активированных Тклеток (NF-ATc). Только дефосфорилированный NF-ATc может
транспортироваться в ядро для образования комплекса с ядерным
компонентом ядерного фактора активированных T-клеток (NF-ATn) для
связывания промоторной области гена интерлейкина-2 (IL-2). В результате
CsA ингибирует активацию Т-клеток, блокируя выработку IL-2 [43].
3.3 Роль циклических пептидов в изучении структуры биологических
объектов
Обычно конформеры нельзя выделить отдельно друг от друга, и
поэтому невозможно изучить их биологическое действие. Как правило, поиск
стабильных конформеров в растворе является весьма трудной задачей; ещё
сложнее выглядит картина конформационного обмена в биологических
средах [44].
Существует несколько подходов в поиске наиболее стабильного
конформера. Если, допустим, надо изучить конформацию гормона на
рецепторе, то в одной из гипотез предполагается, что самая активная
26
молекула предпочитает в растворе такую конформацию, которая наиболее
схожа с конформацией на рецепторе (Рисунок 13) [45].
Рисунок 13 – Способ I определить конформацию малой молекулы (лиганда)
на рецепторе. Гипотеза: самая активная молекула предпочитает в растворе
такую конформацию, которая наиболее схожа с конформацией на рецепторе.
Другая возможность получить картину конформации на рецепторе
заключается в установлении конформационной жёсткости. На рисунке ниже
(Рисунок 14) это схематично показано «поясом». Если такое «сужение»
приведёт к геометрии, не соответствующей форме на рецепторе, активности
не будет; а при верном положении «пояса» активность не должна
измениться,
или
даже
может
возрасти.
На
практике
такого
рода
фиксирование конформации достигают проще всего замыканием в цикл, при
котором конформационная свобода сильно урезается до небольшого кольца.
Принцип
«придания
жёсткости»
заставляет
обратиться
к
изучению
циклических пептидов [46].
Рисунок 14 – Способ II определения конформации на рецепторе.
27
4 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
4.1 Материалы и методы
В настоящей работе исследования проводились с помощью метода
ЯМР высокого разрешения. Использовались такие техники получения
спектров, как COSY, HSQC, HMBC, TOCSY, ROESY.
Измерения проводились на спектрометре Bruker Avance III HD 700.
Отнесение
сигналов
производилось
с
использованием
комбинации
двухмерных спектров: DQF-COSY, TOCSY, HSQC и HMBC, записанных при
25°C. Сильные области перекрывания сигналов затрудняли идентификацию
некоторых атомов, включая Mle4 Hα и двух протонов при двойной связи в
Bmt1 (~5,35 м.д.); атомы Bmt1 Hη, Hγ и CH2δ имели близкие сигналы в одной
и той же области вместе с некоторыми неэквивалентными протонами CH2
других остатков (1.6–1.65 м.д.). Гетероядерные спектры были необходимы
для выяснения этих областей перекрытия, приписания групп NCH3 и
определения места каждого остатка в 11-членной цепи по сигналам
карбонильных атомов углерода. Гомоядерные 2D-спектры регистрировались
в спектральном окне 10х10 м.д. и размером временной области 2048х512
точек. Спектр HSQC имел спектральную ширину 10х140 м.д. (с центром при
65 м.д.) с 2048х512 точками; HMBC имел параметры 10х200 м.д. (в центре 95
м.д.) и 4096х512 точек данных. Спектр HMBC был оптимизирован для
наблюдения дальнего КССВ с константой 6 Гц. Для определения
структурных параметров (расстояние между ядрами) использовались
спектры ROESY, записанные при разных временах смешивания (τm).
Работа со спектрами проходила в программном обеспечении TopSpin.
Обрабатывались полученные спектры в программе Sparky (для двумерных
спектров) и SpinWorks (для одномерных спектров).
Измерения проводились на спектрометре кафедры медицинской
физики Bruker Avance III HD 700. Тройной датчик TXI позволяет проводить
ЯМР-измерения на ядрах
1
Н,
13
С,
15
N. Использованное оборудование
28
относится к Федеральному центру коллективного пользования физикохимических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ КФУ).
4.2 Объект исследования
Циклоспориновая цепь состоит из 11 аминокислотных остатков и
замкнута в кольцо. Остаток Bmt (4-methyl-4-[(E)-2-butenyl]-4,N-methyl
threonine),
или
его
производные,
является
уникальным
признаком
циклоспоринов, его обычно считают первым в цепи; остаток 2 является
наиболее вариабельным среди всего семейства этих пептидов. Другие
различия между возможными вариантами пептидов могут включать замену
аминокислот, наличие или отсутствие N-метилирования амидной группы и
изменения оптических изомеров отдельных остатков.
Циклоспорин D был приобретен у компании Cayman Chemical
Company. Важно понимать, в чем основное отличие циклоспорина D от
циклоспорина A. Ниже на рисунке (Рисунок 15) показано строение CsA, а
также отмечена область, которая отличается в CsD.
Рисунок 15 – Строение CsA. Отмечен второй остаток, так как в CsD он
заменен другой аминокислотой.
29
Как можно видеть, CsD содержит валин в положении 2 вместо
α-аминомасляной кислоты (Abu2).
Спектры и данные по CsA были получены ранее и использованы, как
готовый материал [45].
4.3 1D-спектры ЯМР
На первых этапах приписания сигналов легче всего начинать с
наиболее очевидных. Например, мы знаем, что у циклоспорина есть четыре
NH-сигнала, а также же знаем характерные для этой группы химические
сдвиги. Таким образом, мы начинаем расшифровку спектра именно с этих
сигналов, так как их легко идентифицировать.
На рисунке ниже (Рисунок 16) приведены резонансы протонов NH
исследованных пептидов в хлороформе. Сигналы остатков 2, Ala7 и Dal8
появляются почти в одних и тех же областях для обоих пептидов, в то время
как пик Val5 немного смещается, отличаясь на 0,1 м.д.
Сигналы
малой
интенсивности
относятся
к
дополнительным
конформерам, имеющим незначительную концентрацию в равновесии [47],
однако в спектре CsD эти второстепенные сигналы практически незаметны.
Рисунок 16 – Амидная область спектров ЯМР циклоспоринов CsA (500 МГц)
и D (700 МГц) в CDCl3. Стрелки показывают сателлиты 13C сигнала
хлороформа; в нижнем спектре они меньше, так как образец CsA имел более
высокую концентрацию. Dal обозначает D-Ala8. Метка Val* показывает пик
одного из минорных конформеров CsA.
30
На следующем рисунке (Рисунок 17) представлена средняя область
спектров, содержащая семь интенсивных линий групп NCH3. Здесь также не
наблюдается никаких дополнительных сигналов, которые означали бы
присутствие минорных конформеров для CsD. Следовательно, этот вариант
циклоспорина присутствует в виде одной молекулярной конформации.
Рисунок 17 – Часть ЯМР спектров циклоспоринов CsA (500 МГц) и D (700
МГц) в CDCl3, показывающая сигналы N-метильных групп и некоторые
сигналы треонина (Bmt) и саркозина (Sar).
Заметное различие в спектрах, обнаруженное для CsD, заключается в
наличии дополнительных сигналов около 3,8 м.д., которые нельзя
идентифицировать по экспериментам
1
H,13C-HSQC. Однако они имеют
корреляцию с бета-протонами Bmt1 в COSY и TOCSY, и поэтому были
отнесены к гидроксильной группе в γ-положении. Пиков такого типа в
спектре CsA не наблюдается; однако спектр ядерного эффекта Оверхаузера
этого пептида содержит широкий сигнал в высокопольной области (около 1,8
м.д.), который был отнесен к группе ОН, обменивающейся с остаточной
водой [47].
На следующем рисунке (Рисунок 18) представлена Hα-область
циклоспорина D. Можно видеть, что сигналы от Hα-групп для Sar3, Val2 и
Val5 трудноразделимы на одномерном спектре.
31
Hα - область
Val2
Рисунок 18 – Часть ЯМР спектра циклоспорина CsD (700 МГц) в CDCl3,
показывающая сигналы Hα-групп молекулы.
Что касается боковых цепей молекулы, то одномерный спектр является
действительно сложным (Рисунок 19), поэтому теперь логично будет перейти
к результатам двумерной спектроскопии.
Рисунок 19 – Часть ЯМР спектра циклоспорина CsD (700 МГц) в
CDCl3, показывающая сигналы боковых цепей молекулы. Высокие пики
принадлежат группам CH3; низкие – CH и CH2.
32
4.4 2D-спектры ЯМР
Приписание сигналов было выполнено на основе гомоядерной и
гетероядерной корреляционной спектроскопии (DQF-COSY, TOCSY, HSQC
и HMBC). Гомоядерные спектры позволили определить отдельные спиновые
системы лейцина, аланина, валина и других аминокислот; отдельные остатки
одного и того же типа различались с помощью спектров HSQC и HMBC,
которые позволяли отслеживать аминокислотную последовательность по
сигналам углерода
13
CO; они также были полезны для нахождения
перекрывающихся сигналов и концевых групп СН3 боковых цепей. Спектры
HSQC двух видов циклоспорина (область сигналов CHα-групп) показаны на
рисунке ниже (Рисунок 20). Как видно, положения большинства сигналов
отличаются незначительно.
33
Рисунок 20 – Спектр 1H,13C-HSQC циклоспоринов A (500 MHz) и D (700
MHz) в CDCl3 и 298 К. Показана область сигналов CHα, а также пик Bmt1
CHβ.
34
Полученные спектры HSQC для циклоспоринов A и D аналогичны и в
области сигналов боковых цепей (Рисунок 21).
Рисунок 21 – HSQC спектр CsA и CsD.
В самом начале расшифровки спектров было выполнено приписание
для Sar3 (Рисунок 22). Это небольшая аминокислота, которая к тому же
имеет в составе NCH3 группу, что делает ее простой для расшифровки.
35
Рисунок 22 – Химическая структура аминокислоты Sar.
Корреляционные пики (кросс-пики) в спектре COSY отвечают
протонам, испытывающим сильное КССВ. В данном случае это пара
геминальных протонов Hα2–Hα3 с большой константой J = 14 Гц (Рисунок
23). При этом КССВ с метильной группой при атоме азота не наблюдается,
потому что эти протоны отделены от альфа-протонов 4 связями.
Рисунок 23 – Часть спектра COSY, красным цветом выделены сигналы
Sar3Ha2-Ha3.
Согласно HSQC, эти сигналы водородов действительно являются
неэквивалентными, так как отвечают одному и тому же значению
химического сдвига углерода (Рисунок 24).
36
Рисунок 24 – Часть спектра HSQC – голубым цветом показаны сигналы Sar3.
Далее рассмотрим подробнее, как проходило отнесение сигналов на
примере лейцина (Рисунок 25), так как данная аминокислота имеет
достаточно длинную боковую цепь и вследствие этого интересна для
подробного разбора.
Рисунок 25 – Химическая структура аминокислоты лейцина.
В COSY-спектре мы наблюдаем область, где располагается множество
сигналов от боковых групп лейцинов (Рисунок 26), которые связаны друг с
другом в соответствии с их порядком в химической структуре, а в TOCSY
37
образуют «подспектр» на вертикальном или горизонтальном сечении
двумерного спектра.
Рисунок 26 – Область спектра COSY, где наблюдается сигналы от α-групп
лейцинов (Mle – метилированный лейцин).
Не вполне однозначными кажутся сигналы
13
С, так как они
перекрываются. Выходом из ситуации является использование COSY,
TOCSY и HSQC совместно (Рисунок 27).
38
13
β1
β1
β2
С
β2
Рисунок 27 – Схематичное представление соответствия сигналов между
TOCSY и COSY для установления точных химсдвигов 13С.
У Mle есть βCH2 группы, которые дают на спектре легко узнаваемый
узор сигналов (Рисунок 28), так как водороды в этой группе являются
неэквивалентными. С этих сигналов легче всего начинать расшифровку
спектра.
Рисунок 28 – βCH2 группы для четырех Mle. Эта область спектра является
весьма характерной, поэтому легко идентифицировать сигналы.
39
Этот же узор мы наблюдаем на реальном спектре HSQC (Рисунок 29).
Четыре неэквивалентные βCH2-группы соответствуют четырем сигналам,
каждый из которых расщеплен на два.
Рисунок 29 – Спектр 1H,13C-HSQC циклоспорина D (700 MHz) в CDCl3 при
298 К.
В лейцине γ-протон испытывает сильное взаимодействие с другими
ядрами, вследствие чего его сигнал на одномерном спектре получается
широким и неинтенсивным. Более того, даже на двумерном спектре HSQC
сигналы оказываются трудно читаемыми. В этом случае нам пришлось
обратиться к двумерному спектру HMBC (Рисунок 30), который позволил
отнести
каждый
гамма
сигнал
лейцина
к
правильной
порядковой
40
аминокислоте и заодно распознать сигналы концевых δCH3-групп. Так как
мы уже установили химические сдвиги для бета-протонов лейцинов, то
также мы знали химический сдвиг для углеродов. НМВС позволяет видеть
сигналы между различными ядрами, разделенными более чем одной связью.
Следовательно, зная химический сдвиг углерода бета-группы, не составило
труда найти сигналы атомов водорода, дающих с ним кросс-пики.
Рисунок 30 – Спектр 1H,13C- HMBC циклоспорина D (700 MHz) в CDCl3 при
298 К.
.
4.5 Определение расстояний
Обычно для определения структурных характеристик используются
спектры NOESY, но в нашем случае из-за молекулярной массы циклоспорина
D (MW ≈ 1000Da) эффект NOE был близок к нулю на рабочей частоте
700 МГц, поэтому параметры определялись по спектрам ROESY.
Ключевым моментом методики определения расстояний является
получение зависимости величин интегральных интенсивностей пиков
двумерного спектра от времени смешивания. Из этой зависимости получают
информацию о значениях констант скорости кросс-релаксации. Для этого
41
требуется накопить некоторое количество экспериментальных ROESYспектров, записанных при различных временах смешения (τm).
Константы скорости кросс-релаксации между ядрами i и j обратно
пропорциональны расстоянию между данными ядрами:
(6)
При известном расстоянии rcal между одной калибровочной парой ядер
с соответствующей константой скорости кросс-релаксации σcal можно из
относительных значений констант кросс-релаксации определить расстояния
между остальными взаимодействующими ядрами:
⁄
(
(7)
)
В работе [48] был предложен усовершенствованный метод анализа
данных спектроскопии NOESY в приближении начальной скорости,
основанный на вычислении отношений интегральных интенсивностей кросспиков к соответствующим им диагональным пикам. Он позволяет облегчить
анализ зависимости экспериментальных данных от времени смешивания и
улучшить точность определения констант скорости кросс-релаксации.
Приведенные
интегральные
интенсивности
представляют
собой
линейную зависимость от времени смешивания τm и не зависят от
релаксационного затухания сигналов. Следовательно, искомая скорость
кросс-релаксации σij может быть определена как тангенс угла наклона этой
линейной зависимости к оси ординат [49].
Уравнение, по которому были рассчитаны относительные расстояния
(Рисунок 31):
(
)
(8)
42
Рисунок 31 – Пики АА и ВВ – диагональные пики с интенсивностями IAA и
IBB; Пики АВ и ВА – кросс пики с интенсивностями IAB и IBA.
43
5 РЕЗУЛЬТАТЫ
Циклоспорин D был изучен методом ЯМР в CDCl3. Значения
химического сдвига были получены из спектров ЯМР высокого разрешения,
как описано выше. Значения для CsA были получены ранее [45]. Результаты
для CsD и CsA показаны в таблице ниже (Таблица 1).
Таблица 1.
Химические сдвиги основной цепи молекул CsD и CsA.
CsD
CsA
No.
остатка
Cα
Hα
C'
1
59.00
5.555
170.72
2
53.97
4.75
173.90
3
50.51
4.72
171.20
NH
7.99
No.
остатка
Cα
Hα
C'
1
58.97
5.461
170.6
2
48.94
5.021
174
3
50.5
4.725
171.4
3.183
NH
7.964
3.198
4
55.57
5.32
170.02
4
55.63
5.334
170.2
5
55.63
4.61
173.80
5
55.56
4.646
174
6
55.34
4.97
171.53
6
55.48
4.973
171.8
7
48.58
4.53
171.05
7.67
7
48.77
4.511
171.4
7.681
8
45.12
4.83
173.39
7.15
8
45.33
4.82
173.7
7.163
9
48.25
5.70
170.30
9
48.35
5.687
170.5
10
57.64
5.06
170.08
10
57.69
5.069
170.3
11
57.86
5.2
173.64
11
58.06
5.119
173.7
7.57
7.468
Затем была составлена Таблица 2, состоящая из разницы между
химическими сдвигами двух исследованных пептидов. Таким образом, были
выявлены участки, где происходят наиболее заметные изменения химических
сдвигов вследствие замены второго остатка.
44
Таблица 2.
Разница между химическими сдвигами молекул CsD и CsA.
ppm(CsD) – ppm(CsA)
Res. No.
Cα
Hα
C'
1
0.03
0.094
0.117
2
5.033
-0.273
-0.098
3
0.016
-0.003
-0.198
NH
0.031
-0.015
4
-0.057
-0.012
-0.176
5
0.074
-0.032
-0.192
6
-0.142
-0.001
-0.274
7
-0.187
0.021
-0.351
-0.011
8
-0.208
0.015
-0.3085
-0.01
9
-0.102
0.011
-0.195
10
-0.047
-0.009
-0.223
11
-0.199
0.002
-0.055
0.106
Замена второго остатка другой аминокислотой влияет главным образом
на химические сдвиги основной цепи в положениях 2, его соседях 1 и 3 и в
более отдаленных положениях (Mle6, Ala7, Mva11).
Также были рассчитаны расстояния между некоторыми ядрами
(Таблица 3). За калибровочное расстояние было взято расстояние между
ядрами Hd22-Hd23 в Bmt1 (r = 1,8 Å), так как это расстояние для CH2-группы
известно априори.
45
Таблица 3
Таблица расстояний между парами ядер в циклоспорине D
Сигналы
HaBmt1-NHVal2
Bmt1Hd22-Hd23
Bmt1Hd22-He
Mle4Ha-Bmt1Hd2
Val2Ha-Hb
Val5Hb-Mle4Ha
Mle4NCH3-Sar3Ha2
HaMle6-NHAla7
Sar3Ha-NCH3
Mle4Hb2-Hg
Mle4Hd2-Hg
Mle4Hg-Hd1
Val5Ha-Hb
Val5Hb-Hg1
Mle6Hg-Hd1
Mle6Hg-Hd2
Ala7Ha-Hb
Mle10Hb3-Mle9Hb2
Mle10Hb3-Mva11Hb
Mle10Hg-Hd1
MVal11Ha-Bmt1NCH3
Mva11Hb-Hg1
r, Å
1,957885
1,8
2,546592
2,933213
2,733212
2,757545
2,491494
1,959443
2,761
1,850049
1,69692
1,804152
2,159477
1,992066
1,799576
1,967804
1,907639
1,943997
1,915236
1,909946
2,18067
2,147293
46
ВЫВОДЫ
Циклоспорин D был исследован методом ЯМР спектроскопии.
Поскольку молекулярная структура должна быть ключевым фактором,
определяющим биологическое действие, мы стремились найти сходства или
различия между молекулами циклоспоринов CsD и CsA, которые могли бы
объяснить
их
свойства.
Структуры
двух
пептидов
различаются
незначительно, и более слабое биологическое действие CsD можно отнести к
потере аминокислоты Abu во 2 положении.
Другие различия, которые можно обнаружить по спектрам ЯМР,
заключаются в относительной конформационной чистоте CsD в хлороформе
при
комнатной
температуре
и
появлении
отчетливых
сигналов
гидроксильных групп (в Bmt1 в CsD). Дополнительная Н-связь делает протон
ОН-группы недоступным для растворителя, благодаря чему он наблюдается в
спектре ЯМР; она же может стабилизировать структуру. Дополнительная
жёсткость цепи, выражающаяся в отсутствии минорных конформеров, также
может быть причиной сниженной биологической активности этого пептида.
Необходимо учитывать, однако, что конформационная подвижность зависит
не только от свойств самого соединения, но и от используемого
растворителя.
Общими выводами работы является:
• Произведено сравнение спектров ЯМР циклоспоринов A и D, которое
показало практически полное отсутствие минорных конформеров CsD
в растворе. Структура молекулы CsD обладает большей жёсткостью.
• Замена одного участка цепи ведет к изменениям в других местах, что
определяется по химическим сдвигам атомов основной цепи. Замена
второго остатка влияет преимущественно на 6, 7 и 11 остатки, а также
на остаток 5, соединённый водородной связью со вторым.
• Общая конфигурация цепи CsD в неполярной среде отличается от CsA
в растворе незначительно, насколько можно судить по спектрам ЯМР
47
13
C. Поэтому выяснение причин малой активности CsD требует
детального исследования его пространственной структуры.
• Получены
геометрические
параметры
молекулярной
структуры
(межатомные расстояния).
48
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК:
1. Martin, Y.C. Quantitative Drug Design: A Critical Introduction [Текст] /
Y.C. Martin. – New York: Marcel Dekker. – 1978. – 272 p.
2. Barton, D.H.R. The Principles of Conformational Analysis (Nobel lecture)
[Текст] / Chemistry. – Amsterdam: Elsevier. – 1972. – pp. 298–311.
3. König, H. Pharmaceutical Chemistry Today — Changes, Problems, and
Opportunities [Текст] / H. König // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 1980. –
V. 19. –pp. 749–761.
4. Darryl, L. In Silico Technologies in Drug Target Identification and
Validation [Текст] / L. Darryl, S. Markel // CRC Press. – 2006. – 504 p.
5. Kobchikova, P.P. Studying of Cyclosporin D by High Resolution NMR:
Obtaining Information on the Spatial Structure [Текст] / P.P. Kobchikova,
S. V. Efimov, I. A. Khodov, V. V. Klochkov // 16-th International SchoolConference "Magnetic resonance and its applications" Spinus-2019 (St.
Petersburg, Russia, March 31 — April 5, 2019) – St. Petersburg, 2019. – 2.
6. Blokhin, D. S. Spatial structure of the decapeptide Val-Ile-Lys-Lys-Ser-ThrAla-Leu-Leu-Gly in water and in a complex with sodium dodecyl sulfate
micelles [Текст] / D.S. Blokhin, S.V. Efimov, A.V. Klochkov, A.R.
Yulmetov, A.V. Filippov, O.N. Antzutkin, A.V. Aganov, V.V. Klochkov //
Applied Magnetic Resonance. – 2011. – V. 41. – I. 2. – P. 267-282.
7. Usachev, K.S. NMR structure of the arctic mutation of the alzheimer’s
Aβ(1-40) peptide docked to SDS micelles [Текст] / K.S. Usachev, A.V.
Filippov, B.I. Khairutdinov, O.N. Antzutkin, V.V. Klochkov // Journal of
Molecular Structure. – 2014. – V.1076. – P. 518-523.
8. Usachev K.S., A combination of the RDC method and NOESY NMR
spectroscopy for structural determination of the Alzheimer's amyloid Aβ1035 peptide in solution and in SDS micelles [Текст] / K.S. Usachev, A.V.
Filippov, O.N. Antzutkin, V.V. Klochkov // European Biophysics Journal. –
2013. – V. 42. – I. 11-12. – P. 803-810.
49
9. Klochkov, A.V. Determination of the spatial structure of glutathione by
residual dipolar coupling analysis [Текст] / A.V. Klochkov, B.I.
Khairutdinov, M.S. Tagirov,
V.V. Klochkov // Magnetic Resonance in
Chemistry. – 2005. – V.43. – N.11. – P. 948-951.
10.Дероум, Э. Современные методы ЯМР для химических исследований
[Текст] / Э. Дероум. – М.: Мир. – 1992. – 403 с.
11.Blokhin, D. S. NOE Effect of Sodium Dodecyl Sulfate in Monomeric and
Micellar Systems by NMR Spectroscopy [Текст] / D. Blokhin, E.A.
Filippova, V.V. Klochkov // Applied Magnetic Resonance. – 2014. – V. 15.
– P. 715-721.
12.Галиуллина,
Л.Ф.
Исследование
структуры
компонентов
атеросклеротической бляшки методами магнитного резонанса: дис. …
канд. физ.-мат. наук: 01.04.07 физика конденсированного состояния –
дата защиты 26.12.13. – Казань, 2013. – 135 с.
13.Эрнст, Р., Боденхаузен, Дж. ЯМР в одном и двух измерениях [Текст] /
Р. Эрнст, Дж. Боденхаузен // М.: Мир. – 1990. – 711 с.
14.Чижик, В. И. Ядерная магнитная релаксация: учебное пособие [Текст] /
В.И. Чижик. – С-Пб.: Издательский дом Санкт-Петербургского
университета. – 2004. – 385 с.
15.Вашман, А.А. Ядерная магнитная релаксационная спектроскопия / А.А.
Вашман, И.С. Пронин. – М.: Энергоатомиздат. – 1986. – 231 с.
16.Александров, И.В. Теория магнитной релаксации [Текст] / И.В.
Александров. – М.: Наука. – 1975. – 400 с.
17.Фаррар, Т., Импульсная и Фурье спектроскопия ЯМР [Текст] / Т.
Фаррар, Э. Беккер. – М.: Мир. – 1973. – 164 c.
18.Маклаков, А.И. Самодиффузия в растворах и расплавах полимеров
[Текст] / А.И. Маклаков, В.Д. Скирда, Н.Ф. Фаткуллин. – Казань: Изд.
Казанского госуниверситета. – 1987. – 224 с.
19.Price, W.S. NMR Studies of Translational Motion [Текст] / W.S. Price. –
Cambridge: Cambridge University Press. – 2009. – 416 p.
50
20.Абрагам, А., Ядерный магнетизм [Текст] / А. Абрагам. – М.:ИЛ. – 1963.
– 550 с.
21.Чернышев, С.Ю. Ядерная магнитная релаксация в адсорбированных
жидкостях: обзор [Текст] / С.Ю. Чернышев. – Л.: Изд-во Ленингр. Гос
университета. – 1968. – Вып. 2. – С. 188 – 205.
22.Волков, В. Я. Исследование трансляционной подвижности молекул
жидкостей
в
пористых
средах
импульсным
методом
ЯМР:
Автореф…дис. канд.физ.-мат.наук. – Казань – 1976. – с. 32.
23.Сликтер, Ч., Основы теории магнитного резонанса [Текст] / Ч. Сликтер.
– М.: Мир. – 1981. – 448 с.
24.Насибуллин, Р. С. Структура
комплексов
фосфатидилхолин–
пиридин и фосфатидилхолин–пиразол: результаты конформационного
анализа [Текст] / Р. С. Насибуллин, M.A. Серебреник // Biopolymers and
cell. – V.18. – N.1. – P. 76-80.
25.Borel, J.F. Biological effects of cyclosporin A: a new antilymphocytic agent
[Текст] / J.F. Borel, C. Feurer, H.U. Gubler // Agents Actions 6(4). – 1976.
– P. 468-475.
26.Воловенко, Ю.М. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для
химиков [Текст] / Ю.М. Воловенко, В.Г. Карцев, И.В. Комаров, А.В.
Туров, В.П. Хиля. – М.: Издано Международным благотворительным
фондом «Научное партнерство», МБФНП. – 2011. – 704 с.
27.Попл, Дж. Спектры ядерного магнитного резонанса высокого
разрешения [Текст] / Дж. Попл, В. Шнайдер, Г. Бернстейн. – М.:
Издательство иностранной литературы, Москва. – 1962. – 296 с.
28.Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy [Текст] / J. Keeler. –
Cambridge.: Wiley. – 2005. – 459 с.
29.Jeener, J. Investigation of exchange processes by two-dimensional NMR
spectroscopy [Текст] / J. Jeener, B.H. Meier, P. Bachmann, R.R. Ernst //
The Journal of Chemical Physics. – 1979. – V. 71. – P.4546-4553.
51
30.Википедия
свободная
энциклопедия
[Электронный
ресурс]
/
https://ru.wikipedia.org/wiki/Двухмерная_ядерная_магнитнорезонансная
_спектроскопия (дата обращения 26.03.2019)
31.Parella, T. Pulsed field gradients: a new tool for routine NMR [Тext] / T.
Parella // Magn. Reson. Chem. – 1998. – p. 467-495.
32.Farrar, T. An Introduction To Pulse NMR Spectroscopy [Текст] / T. Farrar.
– Farragut Press, Chicago. – 1987. – 211 p.
33.Allen M.P. Computer simulation of liquids [Текст] / M.P. Allen, D.J.
Tidesley // Oxford: Clarendon Press. – 1987. – 230 p.
34.Nakanishi, K. One-dimensional and two-dimensional NMR Spectra by
Modern Pulse Techniques [Текст] / K. Nakanishi. – Mill Valley, California:
University Science Books. – 1990. –136 p.
35.Aue, W.P. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic
resonance [Текст] / W.P. Aue, E. Bartholdi, R.R. Ernst // Journal of
Chemical Physics. – 1976. – V. 64. – P. 2229–46.
36.Gams, W. Tolypocladium, eine Hyphomycetengattung mit geschwollenen /
W. Gams // Phialiden. Persoonia. – 1971. – V. 6. – P. 185-191.
37.Bissett, J. Notes on Tolypocladium and related genera [Текст] // Can. J. Bot.
– 1983. – V.61 – P. 1311-1329.
38.Hodge, K.T. Tolypocladium inflatum is the anamorph of Cordyceps
subsessilis [Текст] / K.T. Hodge, S.B. Krasnoff, R.A. Humber //
Mycological Research. – 1996. – V. 88. – P. 715-719.
39.Sung,
Gi-Ho,
Phylogenetic
classification
of
Cordyceps
and
the
clavicipitaceous fungi [Текст] / Gi-Ho Sung, N.L. Hywel-Jones, Jae-Mo
40.Craik, D. Seamless proteins tie up their loose ends [Текст] / D. Craik //
Science. – 2006. – V.311. – P. 1563-1564.
41.Krueger, J.G. Psoriasis pathophysiology: current concepts of pathogenesis
[Текст] / J.G. Krueger, A. Bowcock // Ann. Rheum. Dis. – 2005. - V. 64. –
P. 30-36.
52
42.Ryan, C. The use of cyclosporine in dermatology: part II [Текст] / C. Ryan,
K.T. Amor, A. Menter // J Am Acad Dermatol. – 2010. – P. 949-72.
43.Prens, E.P. Effects of cyclosporine on cytokines and cytokine receptors in
psoriasis [Текст] / E.P. Prens, T. van Joost, J.P. Hegmans, K. Hooft-Benne,
O.E. Ysselmuiden, R. Benner // J Am Acad Dermatol. – 1995. – P. 947-53.
44.Wüthrich, K. Conformational studies of lipid-bound polypeptides by
elucidation of proton-p-proton cross-relaxation networks [Текст] / K.
Wüthrich, C. Bosch, L.R.Brown // Biochem. Biophys. Res. Commun. –
1980. – V. 95. – P. 1504–1509.
45.Kessler, H. Assignment of the 1H-, 13C-, and 15N NMR Spectra of
Cyclosporin A in CDCl3 and C6D6 by a Combination of Homo- and
Heteronuclear Two-Dimensional Techniques [Текст] / H. Kessler, H.-R.
Loosli, H. Oschkinat // Helv. Chim. Acta. – 1985. – V. 68. –P. 661-681.
46.Deber, C. M. Why cyclic peptides? Complementary approaches to
conformations [Текст] / C. M. Deber, V. Madison, E. R. Blout // Acc.
Chem. Res. – 1976. – V. 9. – P. 106-113.
47.Hsu, V.L. Structural Elements Pertinent to the Interaction of Cyclosporin A
with Its Specific Receptor Protein, Cyclophilin [Текст] / V.L. Hsu, S.L.
Heald, M.W. Harding, R.E. Handschumacher, I.M. Armitage // Biochem.
Pharm. – 1990. – V. 40. – P. 131-140.
48.Macura, S. An improved method for the determination of cross-relaxation
rates from NOE data [Текст] / S. Macura, B.T. (II) Farmer, L. R. Brown
// J. Magn. Reson. – 1986. – V. 70. – N.3. – P. 493–499.
49.Гадиев, Т.А. Двумерная спектроскопия ЯМР NOESY в изучении
пространственной структуры мономерных и димерных производных
каликс[4]аренов [Текст]: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. физ.мат.наук (01.04.07) . – Казань.: 2007. – 23 с.
53
Отзывы:
Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыви хорошего настроения
удачи
успехов в конкурсе
Наверное было затрачено много времени и труда на работу
Продолжай свое исследование
Админам респект
И продвижения статьи в топы?
Как на счет взаимных комментариев под работами?)
Красиво написанная работа
Так держать
Молодец
Интересная работа!