Метанолдегидрогеназа из бесклеточного экстракта метилобактерий M.extorquens pCM160 как биокатализатор амперометрического медиаторного биосенсора

Мария Улитина

Метанолдегидрогеназа из бесклеточного экстракта метилобактерий M.extorquens pCM160 как биокатализатор амперометрического медиаторного биосенсора

Выпускная квалификационная работа посвящена изучению биокаталитических свойств фермента метанолдегидрогеназы из бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160. В ходе выполнения эксперимента использовались классические физико-химические методы, спектрофотометрический и амперометрический, для изучения биокаталитических свойств фермента метанолдегидрогеназы. Для выращивания микроорганизмов использовали микробиологический метод, а для разрушения клеточной структуры рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160 применили ультразвуковое дезинтегрирование и центрифугирование.

Общественные науки в целом

Дипломы

Вуз: Тульский государственный университет (ТулГУ)

ID: 5f3fa841cd3d3e0001544049

UUID: d3244060-c5ca-0138-1e53-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 24

14.48

Мария Улитина

Комментировать 0

Рецензировать 1

Скачать - 2,6 МБ

Поделиться работой

МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тульский государственный университет» Институт________Естественнонаучный_________ (наименование института) Кафедра ___________Химии_________________ (наименование выпускающей кафедры) ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Направление подготовки________04.03.01__________ (код) Химия (наименование) Метанолдегидрогеназа из бесклеточного экстракта метилобактерий M.extorquens pCM160 как биокатализатор амперометрического медиаторного биосенсора ( тема ) Студент группы 420461 Руководитель работы _____________ Улитина М.А. (подпись, дата) (фамилия, инициалы) _____________ (подпись, дата) Заведующий кафедрой _____________ (подпись, дата) Тула, 2020 к.х.н., доц. Кузнецова Т.А. (фамилия, инициалы) к.х.н.,проф. Алферов В.А. (фамилия, инициалы)

Содержание Введение ........................................................................................................................... 4 1. Литературный обзор ................................................................................................. 6 1.1. Аэробные метилотрофные бактерии ................................................................. 6 1.1.1. Род Methylobacterium ............................................................................... 6 1.1.2. Характеристика PQQ – зависимой дегидрогеназы метилобактерий .... 8 1.1.3. Рекомбинантный штамм Methylobacterium extorquens pCM160 ......... 10 1.2. Ферментативная кинетика МДГ ..................................................................... 11 1.3. Медиаторы в амперометрических биосенсорах ............................................ 15 1.4. Биосенсоры на основе клеток метилотрофных бактерий .............................. 18 2. Экспериментальная часть ....................................................................................... 24 2.1. Использованные материалы ............................................................................ 24 2.2. Культивирование метилотрофных бактерий ................................................. 24 2.3. Получение бесклеточного экстракта .............................................................. 25 2.4. Спектрофотометрические измерения ............................................................ 25 2.4.1. Определение активности фермента ....................................................... 25 2.4.2. Количественное определение белка по методу Лоури ......................... 26 2.5. Электрохимические измерения ...................................................................... 27 2.5.1. Медиаторный биосенсор ........................................................................ 27 2.5.2. Формирование рабочего электрода ...................................................... 28 2.5.3. Электрохимические измерения окислительной активности бесклеточного экстракта метилобактерий ................................................................... 29 3. Результаты и обсуждение ...................................................................................... 31 3.1. Культивирование биомассы рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 ........................................................................................................................... 31 3.2. Количественное определение содержания белка в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 .................................................................................................... 31 2

3.3. Определение активности МДГ спектрофотометрическим методом ............ 33 3.4. Определение субстратной специфичности бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 спектрофотометрическим методом ......................................... 35 3.5. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам спектрофотометрическим методом .............................................................................. 36 3.6. Бесклеточный экстракт Methylobacterium extorquens pCM160 как основа функционирования амперометрического медиаторного биосенсора ........................ 40 3.6.1. Селективность медиаторных сенсоров на основе бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160. .......................... 42 3.6.2. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам амперометрическим методом ................................................................... 43 3.7. Сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим и электрохимическим методами ................................................................................... 50 Выводы ........................................................................................................................... 54 Список литературы ........................................................................................................ 56 Приложение .................................................................................................................... 60 3

Введение В настоящее время одно из ключевых мест в промышленности занимает углеродное сырье, наиболее распространенным из которых является метанол. Он является достаточно доступным и сравнительно недорогим непищевым сырьем, который используется в качестве источника углерода для своеобразных организмов – метилобактерий, применяемых при проведении различных биотехнологических процессов. Род Methylobacterium является одним из наиболее изученных [1] и играет большую роль в научных исследованиях, в частности, для мониторинга уровня токсичных соединений С1 и их последующей биоремедиации [2]. Одной из особенностей метилобактерий является высокая концентрация в периплазматической мембране пирролохинолинхинон (PQQ) зависимых - дегидрогеназ. Основной из них является метанолдегидрогеназа (МДГ) – фермент, катализирующий окисление метанола до формальдегида, а также способный окислять первичные спирты и альдегиды, используя искусственные акцепторы электронов. Клетки метилобактерий, их бесклеточный экстракт, фермент МДГ могут являться основой при создании биосенсорных систем мониторинга С1 соединений в природных и антропогенно загрязненных экосистемах. Работа с биосенсорами на основе микроорганизмов часто сопровождается внедрением биокатализаторов (ферментов, ускоряющих реакцию) в процесс анализа [3]. Ими могут быть, например, клетки метилотрофных бактерий, бесклеточный экстракт метилобактерий или фермент МДГ, входящий в их состав. Количество научной литературы, описывающей амперометрические биосенсоры на основе метилобактерий, фермента МДГ и медиаторов электронного транспорта невелико, поэтому применение бесклеточного экстракта метилобактерий в качестве биокатализаторов и разработка на его основе амперометрического медиаторного биосенсора является актуальной задачей. 4

Целью настоящей работы является изучение биокаталитических свойств фермента метанолдегидрогеназы из бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160 как основы функционирования амперометрического медиаторного биосенсора. Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1. Получить M.extorquens бесклеточный pCM160 с экстракт помощью рекомбинантных ультразвукового метилобактерий дезинтегрирования и центрифугирования и установить концентрацию белка в нем; 2. Определить удельную активность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 в системе медиаторов феназинметасульфат (ФМС) + 2,6дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ); 3. Изучить спектр окисляемых субстратов бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 спектрофотометрическим и амперометрическим методами; 4. Определить кинетические параметры фермента МДГ, содержащегося в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам двумя методами – спектрофотометрическим и амперометрическим; 5. Провести сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим и амперометрическим методами. 5

1. Литературный обзор 1.1. Аэробные метилотрофные бактерии Аэробные метилотрофные бактерии в качестве источников углерода и энергии используют метан (метанотрофы), его окисленные или замещенные производные (метилобактерии). По способу питания различают факультативные и облигатные метилотрофные бактерии. Первые из них помимо одноуглеродных (С 1) соединений используют различные полиуглеродные (Сn) соединения, облигатные метилотрофы – только С1-соединения, тогда как ограниченно-факультативные могут расти на одном или нескольких Сn субстратах [2]. Метилотрофы обитают в водоемах и почвах различного типа, где идут процессы с образованием одноуглеродных соединений. Их выделение происходит из сточных вод, с гниющих растительных остатков, из рубца жвачных животных. Потребность в изучении метилотрофов вызвана не только особенностями их метаболизма, но и перспективами их использования в практической деятельности: метилотрофы характеризуются активным ростом, высокими выходами биомассы, большим содержанием полноценного белка в клетке; являются эффективными продуцентами различных веществ [4]. Субстратами, на которых могут растут аэробные метилобактерии, являются восстановленные С1-соединения – метанол, метилсульфиды и метилсульфонаты, галометаны, метилированные амины, широко распространенные во флоре и фауне. Метилотрофы участвуют в различных биогеохимических процессах биосферы, тем самым окисляя природные и антропогенные соединения с одним атомом углерода. Загрязнение окружающей среды порождает количество мест с высоким содержанием токсичных С1-соединений. Таким образом, изучение метилобактерий играет большую роль, так как они являются естественным природным барьером поступления С1-соединений в окружающую среду [5, 6]. 1.1.1. Род Methylobacterium 6

Типовой вид – Methylobacterium organophilum. В 1983 году к роду были добавлены еще три вида: M. rhodium (прежнее название – Pseudomonasrhodos), M.radiotolerans (прежнее название – Pseudomonasradiora) и M.mesophilicum (прежнее название– Pseudomonasmesophilica), и внесены уточнения в его описание. В 1984 году был описан род Protomonas, включающий один вид P.extorquens (прежнее название – Pseudomonasextorquens). Однако в 1985 году представители Protomonas классифицированы и перенесены в род Methylobacterium. В 1988 году к роду Methylobacterium отнесены еще три вида: M.rhodesianum, M.zatmanii и M.fujisawaense [1]. Из промышленных сточных вод в Швейцарии был выделен штамм Methylobacterium dichloromethanicum DM 4, способный разлагать дихлорметан (метилен хлорид, CH2Cl2), который является антропогенным загрязнителем окружающей среды, так как примерно 80% эмиссии этого поллютанта в атмосферу обусловлено его использованием [7]. Сходством, объединяющим все виды Methylobacterium, является способность расти на одном или нескольких C1–соединениях, помимо метана, и прежде всего метанола, который является одним из основных летучих органических соединений выделяемых растениями. Таким образом, штаммы Methylobacterium часто встречаются в ассоциации с растениями, либо участвуют в симбиозах как эндофиты или как эпифиты на поверхности листьев [8]. Палочки 0,8–1,0 * 1,0–8,0 мкм, одиночные, иногда в розетках. В некоторых случаях клетки разветвленные или плеоморфные. Подвижные благодаря единственному полярному, субполярному или латеральному жгутику, хотя у некоторых штаммов подвижность слабо выражена. Клетки часто содержат крупные включения, окрашивающиеся Грамотрицательные, однако, Суданом, многие и иногда штаммы гранулы волютина. грамвариабельные. Для репрезентативных штаммов характерна многослойная клеточная стенка и тип цитратсинтазы, свойственный грамотрицательным бактериям. На глицерол- пептонномагаре колонии диаметром 1 – 3 мм, от бледно-розовых до ярких 7

оранжево-красных; на метанол-солевом агаре колонии более однородные, бледнорозового цвета. Пигмент нерастворимый, вероятно каротиноидный. При культивировании в жидкой среде без перемешивания растут в виде розового кольца или пленки на поверхности оксидазоположительные среды. (активность Облигатные последнего аэробы; фермента каталазо- часто и низкая). Хемоорганотрофы, факультативные метилотрофы и в ряде случаев факультативные метанотрофы. Способность некоторых штаммов использовать метан в качестве единственного источника углерода и энергии легко утрачивается, если их не поддерживать на неорганической среде в атмосфере метана. Репрезентативные штаммы ассимилируют одноуглеродные соединения по гомоизоцитратному пути; при росте на сложных органических средах действует полный ЦТК. Выделены из почв, пыли, пресной воды, озерных осадков, с поверхности листьев, из клубеньков, зерен риса, воздуха и больничной среды. Оптимальная температура для роста 25 – 30 ºС [1, 8]. 1.1.2. Характеристика PQQ – зависимой дегидрогеназы метилобактерий В процессе окисления метана у метилотрофов промежуточным веществом в большинстве случаев является метанол, образование которого катализируется ферментом метанмонооксигеназой. Окисление метанола сопровождается действием метанолдегидрогеназы (МДГ), который как и предыдущий фермент является неспецифическим, способный окислять широкий спектр субстратов [9]. Метанолдегидрогеназа – водорастворимый хинопротеин, участвующий в метаболизме небольших молекул, таких, как молекулы метанола и метана у метилотрофных бактерий. Этот процесс признан ключевым в обеспечении энергии для роста и развития метилотрофов [10]. Токсичность формальдегида, продукта окисления метанола, обуславливается нахождением фермента в периплазме. Главным отличием кофактора PQQ (пирролохинолинхинон) от других окислительно-восстановительных кофакторов (флавины и никотинамиды) является 8

его каталитическое действие на pH-зависимую двухэлектроную, двухпротонную обратимую реакцию переноса электрона при относительно низких потенциалах [11]. Процесс полного окисления метана у метилотрофов может быть представлен в виде следующей схемы: Ф1 Ф2 Метан НАД∙Н2 Ф3 Метанол НАД Ф4 Формиат Формальдегид + Компоненты клетки Рисунок 1. Схема окисления метана и связи энергетического и конструктивного метаболизма у метилотрофов где Ф1-метанмонооксигеназа; Ф2-метанолдегидрогеназа; Ф3- формальдегиддегидрогеназа; Ф4-формиатдегидрогеназа. Ассимиляционные циклы: 1 – рибулозомонофосфатный; 2 – сериновый; 3 – восстановительный пентозофосфатный. Рентгеноструктурный анализ показал, что МДГ существует в виде определенного тетрамера α2β2. В каждой α-субъединице молекулы нековалентно связаны редокс-коферментом пироллохинолинохиноном (рис.2) (PQQ, 4,5-дигидро4,5-диоксо-1Н-пирроло[2,3-f] хинолин-2,7,9-трикарбоновая кислота) и ионами Са2+. Ионы Са2+, находящиеся в активном центре, выполняют одну и главных функций в механизме действия МДГ- поддержание PQQ в нужной конфигурации в активном центре. 9

H N COOH 1 2 COOH 3 9 8 7 4 6 HOOC 5 N O O Рисунок 2. Структурная формула кофактора метанолдегидрогеназ – пирролохинолинхинона Известно, что PQQ катализирует неферментные реакции при средних значениях pH специфических и температуры. ферментных Наличие реакций окислительных PQQ-зависимых свойств PQQ дегидрогеназ и дает возможность использовать их в качестве биокатализатора в высокоселективных и высокочувствительных электрохимических биосенсорах. [11, 12]. 1.1.3. Рекомбинантный штамм Methylobacterium extorquens pCM160 В процессе разработки биосенсоров для анализа содержания спиртов и альдегидов используются клетки аэробных метилобактерий. Эта возможность обуславливается уникальным метаболизмом данных клеток, а также наличием периплазматической локализации PQQ-дегидрогеназ, основной из которых является метанолдегидрогеназа (МДГ) [13]. Для очистки рекомбинантной МДГ в одну стадию методом металл-хелатной хроматографии был создан рекомбинантный штамм метилобактерий Methylobacterium extorquens АМ1 [13]. Для создания векторной реплицирующуюся в системы использовалась метилобактериях, что плазмида обеспечивает pCM160, получение функционально-активного фермента МДГ. Для создания генетической системы фрагмент ДНК, содержащий ген mxaF, был амплифицирован и клонирован в векторе pCM160, содержащем конститутивный промотор МДГ из Methylobacterium extorquens AМ1 (Рис. 3). 10

Рисунок 3. Карта вектора, несущего ген mxaF из M. extorquens AМ1 Полученный вектор был внесен в клетки метилобактерий методом коньюгации. Так как плазмида содержит ген, кодирующий устойчивость к канамицину, рекомбинантный штамм культивировали на среде с этим антибиотиком. Поскольку модифицированный штамм содержит нативную (природную) МДГ, а также рекомбинантный фермент, он обладает повышенным содержанием МДГ в целом. 1.2. Ферментативная кинетика Кинетика ферментативных реакций – раздел биохимии, который изучает зависимость скорости химических реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ, а также от факторов окружающей среды. Для измерения каталитической активности ферментов используют такие показатели, как ферментативной скорость реакции реакции – мера или активность каталитической фермента. активности Скорость фермента, 11

определяющаяся изменением количества молекул субстрата или продукта за единицу времени, ее обозначают как активность фермента. Факторы, влияющие на активность фермента: 1. Концентрация солей. Большое количество ферментов не могут существовать при высокой концентрации. Ионы разрушают гидратную оболочку белков, тем самым вызывая их осаждение. Типичные энзимы активны при концентрации солей 1-500 мМ. 2. Температура. Все ферменты работают в определенном диапазоне температур, специфичном для каждого организма. Повышение температуры обычно приводит к увеличению скорости реакции, но существует его предел, когда повышение температуры приводит к денатурации белка в результате разрушения слабой ионной и водородной связи, стабилизирующей третичную структуру активного центра фермента. Оптимальная температура для человеческих ферментов обычно составляет от 35 до 40 °C. Для большинства ферментов, участвующих в односубстратной каталитической реакции, зависимость ее скорости от температуры описывается колоколообразной кривой [14] (Рис. 4). Рисунок 4. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры 3. Влияния pH. Большинство ферментов чувствительны к изменению pH, что обусловлено степенью ионизации функциональных группировок в активном центре 12

фермента, а также изменением степени связывания фермента с субстратом. Для большинства ферментов оптимум pH находится в пределах от 6,0 до 8,0, а pHзависимость скорости реакции также имеет колоколообразную форму (Рис. 5). Рисунок 5. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН 4. Концентрация субстрата. Увеличение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции, но полное насыщение фермента ее ограничивает. График зависимости представляет собой гиперболу, которую можно разделить на 2 участка: 1 - линейная зависимость скорости от концентрации субстрата, 2 – скорость реакции не зависит от концентрации субстрата (Рис. 6). Рисунок 6. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата Основным уравнением для моносубстратных ферментативных реакций является уравнение Михаэлиса-Ментен, которое связывает между собой начальную 13

скорость реакции, максимальную скорость реакции и исходную концентрацию субстрата. Ферментативная реакция представляет собой двухэтапный процесс: связывание фермента (Е) с субстратом (S) и образование фермент-субстратного комплекса (ES) с его последующим необратимым распадом для освобождения фермента и продукта (Р): k1 kcat E + S ↔ [ES] → P + E k −1 В равновесной модели Михаэлиса-Ментена образование фермент- субстратного комплекса является наиболее быстрым процессом относительно скорости его распада. Поэтому предполагается, что первая стадия реакции будет равновесной. Константа равновесия для комплекса ES является мерой сродства фермента к субстрату и соответствует концентрации субстрата при ½Vmax: Ks = [E] × [S] [ES] Таким образом, чем ниже значение Ks, тем выше сродство фермента к субстрату. Скорость ферментативной реакции ограничена скоростью разрушения комплекса ES и поэтому может быть выражена следующим образом: V = kcat × [ES] где kcat соответствует эффективной константе реакции первого порядка для распада комплекса ES на свободный фермент и продукт. Порядок реакции обычно определяется общей концентрацией фермента ([ET] = [E] + [ES]): V kcat × [ES] = [ET ] [E] + [ES] где [Е] и [ES] соответствуют концентрациям свободного фермента и фермент– субстратного комплекса. Замена [ES] на выражение [E]×[S] / Ks приводит к уравнению: V kcat × ([E] × [S]/K s ) = [ET ] [E] + ([E] × [S]/K s ) 14

Деление числителя и знаменателя на [E], умножение числителя и знаменателя на KS и перестановка дают известное выражение для скорости реакции, катализируемой ферментом: V= kcat × [ET ] × [S] K s + [S] Путем определения Vmax в качестве максимальной скорости реакции, равной Vmax = kcat×[ET], данное уравнение может быть преобразовано в конечное уравнение Михаэлиса-Ментен: V= Vmax × [S] K S + [S] Для стационарного состояния KS может быть заменена на КМ. В большинстве случаев, связывание субстрата происходит быстрее, чем распад комплекса ES, а значит KS ≈ KM, что делает модели эквивалентными [15]. Vmax и KM – главные кинетические характеристики эффективности фермента.Vmax характеризует каталитическую активность фермента и имеет размерность скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата. KM определяет сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше KM, тем больше сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции [16]. 1.3. Медиаторы в амперометрических биосенсорах Во втором поколении биосенсоров для передачи электронов используются искусственные акцепторы электронов - медиаторы. Под медиатором понимается низкомолекулярная окислительно- восстановительная пара, которая переносит электроны от активного центра фермента к поверхности индикаторного электрода. 15

В данной работе использовались три вида медиатора электронного транспорта – феназинметасульфат (ФМС), 2,6 – дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) и ферроцен. Феназинметасульфат (ФМС) и 2,6 – дихлорфенолиндофенол как искусственные акцепторы электронов Синтетический краситель феназинметасульфат является наиболее активным акцептором водорода для растворимого фермента, а также достаточно эффективным для флавопротеидных дегидрогеназ. Феназинметасульфат, перенося электроны от активного центра фермента к поверхности электрода, катализирует данный процесс, что приводит к наименьшей затрате времени на химический анализ в целом. Такая активность ФМС, возможно, обусловлена его фотохимическим превращением в пиоцианин в присутствии кислорода (Рис. 7) [17, 18]. O N CH 3SO 4 - N O2 + N N CH3 CH3 Рисунок 7. Превращение феназинметасульфата в пиоцианин 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) представляет собой химическое соединение, которое используется в качестве окислительно - восстановительного красителя (Рис. 8). O Cl Cl N OH Рисунок 8. Структурная формула 2,6 – дихлорфенолиндофенола 16

Отличительной особенностью данного медиатора является то, что ДХФИФ может быть использован в качестве индикатора для витамина С. Если витамин С, который является хорошим восстановителем, присутствует, то синий краситель, который превращается розовый в кислых условиях, снижается до бесцветного соединения аскорбиновой кислоты. Эта реакция является окислительно - восстановительной реакцией: витамин С (аскорбиновая кислота) окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты, а ДХФИФ восстанавливается до бесцветного соединения [19]. Ферроцен как медиатор электронного транспорта В настоящее время ферроцен и его производные являются одним из самых эффективных и актуальных классов нерастворимых медиаторов электронного транспорта, применяемых на практике. Это может быть обусловлено некоторыми достоинствами: 1) широкий спектр восстановительных потенциалов в зависимости от заместителей; 2) минимум побочных реакций, так как ферроцений-ионы генерируются при довольно низком потенциале (+0,22 В); 3) небольшое время отклика сенсора; 4) восстановленный ферроцен не реагирует с кислородом, поэтому сенсор не чувствителен к О2; 5) независимость потенциала от рН и приемлемые методы синтеза различных производных [20, 21]. Ферроцен представляет собой π-ареновый комплекс переходного металла, который состоит из атома железа, зажатого двумя циклопентадиениловыми кольцами (Рис. 9). 17

Рисунок 9. Структурная формула медиатора электронного транспорта ферроцена Стоит отметить, что использование электрохимических свойств ферроцена основано на легкости и обратимости протекания процессов одноэлектродного окисления или восстановления (редокс-процесс). (С5Н5)2Fe0 - 1е-↔ (С5Н5)2Fe+ Система ферроцен – катион ферроцения одной из наиболее высокоообратимых в гомогенных условиях является окислительно-восстановительных систем. Достаточно успешным оказалось использование этого свойства на практике. Вопервых, в качестве обратимых электродов в химических аналитических целях и, вовторых, в качестве эффективного переносчика электрона в различных системах, прежде всего в биохимических исследованиях [22]. Исследование электрохимических свойств ферроцена и его производных показало, что в зависимости от природы заместителей и их положений редокспотенциал изученных веществ составляет от 0,15 В до 0,60 В [23]. 1.4. Биосенсоры на основе клеток метилотрофных бактерий Клетки микроорганизмов, различных бактерий, а также их бесклеточный экстракт являются достаточно сложными объектами для исследований по сравнению с ферментами. Одна из главных особенностей целых клеток заключается в том, что восстановители, образующиеся в метаболических процессах внутри клеток, изолированы от внешнего мира мембраной. 18

Поэтому контакт микробных клеток с электродом обычно выражается в переносе электрона через клеточную мембрану. транспорта способны принимать электроны Медиаторы электронного от восстановленных сайтов бактериальной клетки [24]. Метилобактерии имеют ряд преимуществ перед другими биохимическими компонентами биосенсоров. В первую очередь, они касаются сравнения характеристик ферментных и микробных сенсоров, поскольку метилобактерии чаще всего как источник определенной ферментативной активности. К таким преимуществам относятся:  исключение дорогостоящих операций выделения и очистки ферментных препаратов;  повышение устойчивости ферментов в живых клетках, бесклеточном экстракте по сравнению с изолированными ферментами в силу сохранения привычного микроокружения и наличию систем репарации, включая биосинтез в процессе жизнедеятельности клеток и их деления;  одновременное присутствие в клетке кофакторов, необходимых для функционирования фермента, а также систем их регистрации;  возможность целенаправленной продукции требуемых ферментов с использованием генно-инженерных подходов;  наличие простых и универсальных способов измерения активности ферментов по общим показателям жизнедеятельности клетки [25]. Помимо преимуществ использования метилобактерий в биосенсорах, данный биологический материал обладает следующими недостатками, такими как: а) высокая приспособляемость и изменчивость метилобактерий могут снижать селективность и чувствительность микробных сенсоров, так как может окисляться не только подлежащий определению субстрат. Кроме того, клетки, лишенные какого-либо субстрата, могут «переключаться» на альтернативный путь метаболизма. 19

б) проблема в биологической устойчивости, что связано с необходимостью длительного хранения и поддержания активности метилобактерий и их бесклеточного экстракта в течение длительного времени [19]. При введении субстрата генерация электронов метилотрофными бактериями либо бесклеточным экстрактом приводит восстановленного медиатора. к увеличению концентрации Пределы чувствительности, точность и время отклика сенсора будут определяться величиной тока, получаемого при данных количествах метилобактерии и субстрата. Эффективность преобразования сигнала зависит от скорости восстановления медиатора бактериальными клетками, бесклеточным экстрактом, которая достаточно различается для разных типов микроорганизмов и медиаторов [26]. Известно лишь небольшое количество разработанных биосенсоров на основе метилотрофных бактерий. Например, в работе Плехановой Ю.В. [27] клетки бактерий-деструкторов дихлорметана иммобилизовали на измерительной поверхности pH-чувствительного полевого транзистора как основы биосенсора для детекции дихлорметана. Разработан биосенсор на основе иммобилизованных в альгинате клеток Hyphomicrobium DM2 для определения концентрации дихлорметана и других дигалометанов. Для количественного анализа спиртов были разработаны потенциометрические (на основе рН-чувствительных полевых транзисторов) и амперометрические (на основе чувствительного к О 2 или Н2О2 электрода) биосенсоры (например, на основе клеток H. Polymorpha, чувствительным к низким концентрациям формальдегида). Амперометрический Methylobacterium медиаторный dichloromethanicum биосенсор DM4 на разработан формальдегида в объектах окружающей среды и основе для клеток определения в биотехнологических производствах [28]. 20

Так, например, в разработанном амперометрическом медиаторном биосенсоре для определения метанола клетки метилобактерий M. mays ВКМ В-2221 иммобилизовались на поверхность амперометрического медиаторного электрода, в качестве медиатора используется 2,5-дибром-п-бензохинон для более эффективного биоэлектрокаталитического окисления метанола [29]. Разработан модифицированный амперометрический МДГ-биосенсор, который является экономичным и простым в изготовлении, а также по некоторым аналитическим и метрологическим характеристикам превосходит другие биосенсоры для определения содержания метанола. Но затруднения в биосенсорном анализе возникают из-за наличия трудоемкой стадии очистки фермента. Альтернативным МДГ-биосенсору для определения метанола служит биосенсор на основе клеток Methylobacterium nodulans [30]. Недавно стало известно, что мембрана яичной скорлупы может быть использована в иммобилизации фермента и бактериальных клеток для построения ферментов и микробных биосенсоров. Мембрана яичной скорлупы, в основном, состоит из биологических молекул и белковых волокон. Сетчатая структура и газопроницаемые превосходную свойства микросреду мембраны для яичной выживания скорлупы клеток и обеспечивают поддержания их ферментативной активности. Сочетание наночастиц и биомолекул получили значительный интерес в области биотехнологии и биоаналитической химии, так как наночастицы, особенно золотые наночастицы (AuNPs) могут сыграть важную роль в повышении эффективности биосенсора, так как они имеют большую удельную поверхность organophilium и отличную были биосовместимость. иммобилизованы вместе Клетки с метилобактерий наночастицами AuNPs М. на поверхности мембраны яичной скорлупы для изготовления микробного биосенсора (на основе чувствительного к О2 электрода) для определения содержания метанола. Разработанный биосенсор может быть подготовлен без каких-либо сложных процедур иммобилизации. Биосенсор на основе этих клеток показывает 21

хорошую воспроизводимость и высокую операционную стабильность [31]. Механизм иммобилизации показан на рис.9. Рисунок 9. Механизм иммобилизации Methylobacteriumorganophiliumс AuNPs на поверхности мембраны яичной скорлупы Таким образом, использование целых клеток микроорганизмов в сочетании с медиаторами переноса электронов открывает широкие возможности для создания биосенсоров для детекции различных веществ [32]. В заключении литературного обзора стоит отметить, что биосенсоры на основе метилобактерий, их бесклеточного экстракта или фермента МДГ являются перспективным направлением в различных исследованиях, т.к. эти биокатализаторы содержат большое количество мембраннолокализованныхдегидрогеназ легкодоступных для медиаторов электронного транспорта. Также нетрудно будет изучить биокаталитические свойства фермента МДГ из бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160, так как факторы, влияющие на активность и стабильность фермента, легко контролировать в процессе исследования. 22

Метилотрофные микроорганизмы представляют значительный интерес как потенциальные объекты биотехнологии: для производства белка, ферментов, липидов, стеринов, гормонов, антиоксидантов, пигментов, полисахаридов, факторов транспорта железа, первичных и вторичных метаболитов [32]. 23

2. Экспериментальная часть 2.1. Использованные материалы В работе использовали клетки рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM 160. 2.2. Культивирование метилотрофных бактерий Метилобактерии выращивали на среде Канеда («К») со следующим составом: Таблица 1. Среда «К», pH=7,35 Вещество Содержание, г/л KH2PO4 2,0 (NH4)2SO4 2,0 NaCl 0,5 MgSO4·7H2O 0,125 FeSO4·7H2O 0,002 Канамицин 0,05 Агар-агар (для агаризованной среды) 2% по объему Субстрат (для агаризованной среды) 2% по объему Субстрат (для жидкой среды) 0,5% по объему Посев M. extorquens pCM160 на агаризованную среду проводили в стерильных условиях с предоставленных выращенных образцов с добавлением 2% субстрата (100% раствор CH3OH) по объему среды и 0,05 г/л канамицина. Чашки помещали в термостат при температуре 28°С и, после получения устойчивых колоний (7 суток), производили посев на жидкую среду. Культуры микроорганизмов выращивали в колбах объемом 750 мл в стерильных условиях с добавлением 0,5% субстрата (100% раствор CH3OH) по объему среды и 0,05 г/л канамицина. Инокулят вносили в приблизительном 24

количестве в размере 2,5 г/л. Выращивание проводили при 27°С и аэрацию на шейкере при 160 об/мин. Биомассу отбирали на 7 сутки и выделяли бесклеточный экстракт. 2.3. Получение бесклеточного экстракта Отобранные клетки центрифугировали (5000 об/мин, 10 мин), дважды отмывали 0,05 М фосфатным буфером (рН=7,5) с последующим ресуспендированием в том же буфере. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE150 (Англия) при охлаждении льдом: 15 циклов по 10 секунд с интервалом 60 секунд. Клеточные мембраны отделяли центрифугированием при 30000 g в течение 30 мин при 4°С. 2.4. Спектрофотометрические измерения 2.4.1. Определение активности фермента Активность МДГ определяли спектрофотометрически на спектрофотометре ПЭ-5400УФ (ЭКРОС, Россия), толщине кюветы 1 см за время 2 минуты (ε = 1,9 х 104 М-1см-1) при 30°С по известной методике [33] с незначительной модификацией реакционной смеси. Анализируемая смесь содержала следующие компоненты: Таблица 2. Состав смеси для определения активности МДГ Реактивы Сисх Св кювете V, мл Трис-HCl 137 мМ 100 мМ 1,5 NH4Cl 0,6 М 15 мМ 0,05 NaN3 80 мМ 2 мМ 0,05 Вода - - 0,2 ФМС 44 мМ 1,1 мМ 0,05 ДХФИФ 3,48 мМ 0,087 мМ 0,05 СН3ОН 0,4 М 10 мМ 0,05 Экстракт - - 0,05 Буфер 25

Смесь, содержащую буфер, нагретый до 30°С, воду и метанол инкубировали в течение 5 мин., и затем добавляли охлажденные акцепторы электронов ДХФИФ и ФМС, и измеряли тангенс ферментативной реакции. Реакцию инициировали добавлением экстракта, активность МДГ определяли путем измерения уменьшения поглощения ДХФИФ при 600 нм за 1 мин., реакция проходит в пределах 15 - 45 сек. Расчет проводили по следующей формуле: Активность ( (∆ОП600⁄мин опыт − ∆ОП600 ⁄мин контроль ) × Vреакц смеси,мл × f Ед )= мл 19 × Vобразца,мл Уд. активность (Ед⁄мг белка) = (Ед⁄мл) × 1 С где: f – коэффициент разбавления исходного раствора препарата фермента; 19 – коэффициент миллимолярной экстинкции ДХФИФ при 600 нм, pH 9,0; Vобразца – объем образца в мл; C – концентрация белка в исходном растворе, мг/мл. За единицу активности принимали количество МДГ, которое катализирует за минуту превращение 1 мкмоль метанола в формальдегид при рН 9,0 и 30°С. Показатели активность, суммарной активности и удельной активности рассчитывали с помощью программы MS Exсel 2007 и SigmaPlot 11.0 [34]. Белок в экстрактах определяли по методу Лоури, в качестве стандартного белка использовали раствор БСА. 2.4.2. Количественное определение белка по методу Лоури Измерения проводили посредством построения градуировочного графика по стандартным растворам БСА (200мкг/мл) (Табл. 3). Перед определением смешивали 50 мл 2% раствора Na2CO3 в 0,1н растворе NaOH (реактив А) и 1 мл 0,5% раствора CuSO4 в 1% растворе Na3C6H5O7 (реактив В), получив раствор С. Одновременно готовили пробирку с неизвестной концентрацией, разбавленной в 100 и в 40 раз. В каждую пробирку добавили по 5 мл приготовленного раствора С и через 10 минут добавили 0,5 мл реактива Фолина, разбавленного в 2 раза. Термостатировали при 37°С 30 минут для развития окраски. 26

Таблица 3. Данные для построения градуировочного графика с растворами белка разной концентрации Содержание Станд. р-р БСА Дистиллированная Конц. белка, (200 мкг/мл), мл вода, мл мкг/мл 1 0,05 0,95 10 10 2 0,20 0,80 50 50 3 0,50 0,50 100 100 4 0,80 0,20 160 160 5 1,00 - 200 200 № белка в пробе, мкг Фотометрировали на спектрофотометре ПЭ-5400УФ (ЭКРОС, Россия) при длине волны 600 нм. По результатам измерения построили градуировочный график и определили содержание белка в каждой пробе [35]. 2.5. Электрохимические измерения 2.5.1. Медиаторный биосенсор Медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод, а рабочим – модифицированный графито-пастовый электрод (Рис.10). Биоматериал наносился на поверхность рабочего электрода и фиксировался диализной мембраной (размер пор 14 кДа) «Sigma» (США). 27

Рисунок 10. Схематическое изображение рабочего электрода и электрода сравнения где 1 – пластиковая трубка, 2 – графитовая паста, 3 – платиновая проволока, 4 – пластиковое кольцо, 5 – диализная мембрана, 6 – слой биоматериала, 7 – контакт, 8 – стеклянный корпус, 9 – отверстие для ввода раствора KCl, 10 – серебряная проволока, 11 – раствор KCl (насыщенный), 12 – асбестовое волокно, обеспечивающее контакт с анализируемым раствором. 2.5.2. Формирование рабочего электрода Рабочий графито-пастовый электрод готовили, наполняя графитовой пастой «графитовая пудра - минеральное масло» пластиковый шприц. Носик шприца содержал графитовую пасту с добавлением медиатора ферроцена «Aldrich» (Германия). Концентрация медиатора в пасте составляет 10% по массе. Графитовую пасту готовили смешиванием в агатовой ступке 100 мг графитовой пудры «Fluka» (Германия) с необходимым количеством медиатора и 20 мм3парафинового масла «Fluka» (Германия). Шприц содержал платиновую проволоку для электрического контакта с частицами графита. 28

В качестве биоматериала для медиаторного электрода использовали бесклеточный экстракт рекомбинантных метилобактерий M. extorquens pCM160. На поверхность электрода иммобилизовали 20 мкл бесклеточного экстракта подсушивали на сушилке без нагревания в течение 3 мин и досушивали при комнатной температуре 15 минут. Для более прочной иммобилизации клеток использовали диализную мембрану (размер пор 14 кДа) «Sigma» (США), которую закрепляли на поверхности электрода с помощью пластикового кольца. 2.5.3. Электрохимические измерения окислительной активности бесклеточного экстракта метилобактерий Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «IPC-micro», интегрированного с ПК (Рис.11). Для измерений электроды (аналитический, содержащий иммобилизованные биокатализаторы и хлорсеребряный электрод) погружали в электролитическую ячейку объемом 4 мл, содержащую раствор фосфатного буфера с добавлением хлорида аммония (15мМ), pH=8,0. Измерения выполняли при 20°С и постоянном перемешивании (200 об/мин). Рисунок 11. Схема амперометрического медиаторного биосенсора [36] Зависимость силы тока медиаторного электрода от времени регистрировали при постоянном потенциале (Е=250 мВ). В качестве исследуемых растворов использовали метанол и другие субстраты. После установления постоянного уровня тока в ячейку автоматической пипеткой («Ленпипет», Россия) вводили 29

необходимый объем субстрата (5-50 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл, 1000-5000 мкл). После каждого добавления субстрата производили промывку ячейки фосфатным буфером. Измеряемым параметром сигнала сенсора в процессе каталитического окисления субстрата являлась амплитуда изменения тока, определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot и MicrosoftOfficeExcel. 30

3. Результаты и обсуждение 3.1. Культивирование биомассы рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 В ходе эксперимента нами выращены колонии M.extorquens pCM160 на агаризированной среде (Рис.12) и затем пересажены на жидкую среду Канеда. Рисунок 12. Метилотрофные бактерии M.extorquens pCM160 на агаризованной среде Выделение бесклеточного экстракта проводили путем разрушения клеточной массы на ультразвуковом дезинтеграторе, а клеточную структуру отделяли с помощью центрифугирования. Таким образом, масса бесклеточного экстракта метилобактерий M.extorquens pCM160 составила 5,6 г. Определение активности фермента МДГ, содержащегося в бесклеточном эксракте, проводили на 7 сутки с начала посева метилобактерий M.extorquens pCM160. Данный период был выбран в результате мониторинга предыдущих экспериментов по изучению активности на разных стадиях роста для данного штамма, из которых видно, что этот промежуток времени наиболее оптимален. 3.2. Количественное определение содержания белка в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 31

Определение концентрации белка проводили по методу Лоури. Был построен градуировочный график (Рис. 13) в пределах концентраций от 10 до 200 мкг/мл. 0.7 0.6 Оптическая плотность 0.5 0.4 y = 0.0036x - 0.0675 R² = 0.9887 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1 50 100 150 200 250 Концентрация белка, мкг/мл Рисунок 13. Градуировочная зависимость оптической плотности от концентрации белка Далее опытным путем подбирали разбавление анализируемого бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 неизвестной концентрации, чтобы содержание белка находилось в пределах концентраций градуировочного графика. Таким образом, анализируемый образец был разбавлен в 100 раз. В табл. 4 указаны концентрация белка в кювете, исходная концентрация белка и посчитан суммарный белок с помощью формулы: Ссумм.белка = Сисх.белка × 𝑉 где V – общий объем образца, мл. Таблица 4. Определение концентрации белка в анализируемых образцах Концентрация белка в Исходная концентрация кювете, мкг/мл белка, мг/мл 110,420 11,042 Суммарный белок, мг 28,378 32

Стоит отметить, что значение исходной концентрации белка очень близко к значению концентрации белка, рассчитанной в экстракте M.nodulans после разрушения (11,1 мг/мл) [37] и немного различается с концентрацией в экстракте M.extorquens (8,96 мг/мл) [12]. Исходя из имеющихся данных, можно сделать вывод об эффективности разрушения метилобактерий, а именно концентрация белка в бесклеточном экстракте, тем выше – чем больше эффективность разрушения метилобактерий. Таким образом, полученное значение исходной концентрации белка (11,042 мг/мл) было использовано для расчета активности фермента. 3.3. Определение активности МДГ спектрофотометрическим методом В клетках метилобактерий МДГ катализирует окисление метанола, передавая электроны на природный акцептор – цитохром С. Также известно, что in vitro МДГ проявляет активность с искусственными акцепторами электронов, такими как ФМС. Таким образом, эффективный перенос электронов от фермента на электрод возможен при использовании природных или синтетических переносчиков электронов. В качестве переносчиков электронов использовали систему – ФМС+ДХФИФ: CH 3OH + PQQ PQQH 2 + ÔÌÑ îê. ÔÌÑ âîñ. + PQQH 2 ÔÌÑ âîñ. + PQQ ÔÌÑ îê. + ÄÕÔÈÔ âîñ. HCOH + ÄÕÔÈÔ îê. Данный комплекс медиаторов является универсальным для определения активности дегидрогеназ. Так, ДХФИФ восстанавливается флавопротеиновыми ферментами, а добавление ФМС, в качестве промежуточного переносчика электронов, позволяет соединиться с никотинамиднуклеотидсвязанными дегидрогеназами [38]. Активность МДГ определяли спектрофотометрически при 600 нм, 30ºС и толщине кюветы 1 см на приборе ПЭ-5400УФ (ЭКРОС, Россия). Для этого измеряли 33

оптическую плотность холостого опыта и по расчетным формулам определяли активность, удельную активность и суммарную активность МДГ в образце (Табл.5). Аппроксимацию экспериментальных данных проводили с помощью программы MS Exсel 2007 и SigmaPlot 11.0. График кинетической зависимости оптической плотности от времени выглядит следующим образом (Рис. 14): 148 Оптическая плотность×100 146 144 y = -0.5699x + 146.5 R² = 0.9985 142 140 138 136 134 132 0 5 10 15 20 25 Время, сек Рисунок 14. Зависимость оптической плотности от времени при проведении реакции для определения активности МДГ (600 нм) Как можно заметить, данная зависимость носит отрицательный характер (уменьшение оптической плотности) вследствие уменьшения степени поглощения света. Это связано с протеканием ферментативной реакции, в которой метанол, под действием фермента МДГ, превращается в формальдегид, в результате чего изменяется окраска раствора с темно-зеленой на желто-зеленую, поскольку восстановленная форма ДХФИФ бесцветна. Таблица 5 Активность МДГ, Ед/мл 1,603 Удельная активность Суммарная активность МДГ, Ед/мг белка МДГ, Ед 0,145 4,12 34

Значение удельной активности МДГ (0,145 Ед/мг белка) соответствует литературным данным (0,2±0,7 Ед/мг белка [33]; 3,82 Ед/мг белка [37]), следовательно, фермент МДГ активен, а бесклеточный экстракт, который его содержит, является рабочим и может использоваться в дальнейших экспериментах. 3.4. Определение субстратной специфичности бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 спектрофотометрическим методом Специфичность бесклеточного экстракта оценивали по величине удельной активности фермента к определенному субстрату. В качестве субстратов использовали формальдегид, карбоновые кислоты и спирты различного строения в концентрациях 0,1 моль/л (Табл.6). Для бесклеточного экстракта метилобактерий M.extorquens pCM160 построили диаграмму зависимости удельная активность в Ед/мг белка для различных Удельная активность, Ед/мг белка субстратов (Табл.7) (Рис. 15). 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 Субстраты Рисунок 15. Субстратная специфичность бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 Основным ферментом, который присутствует в бесклеточном экстракте метилотрофных бактерий M.extorquens pCM160, является МДГ, что видно из полученных результатов - максимальная каталитическая активность наблюдается к 35

метанолу, что согласуется с литературными данными [23]. Но данный бесклеточный экстракт содержит в своем составе и другие ферменты, например, формиатдегидрогеназа, поэтому окислительная активность бесклеточного экстракта проявляется к другим субстратам. Так как метанолдегидрогеназа является невысокоспецифичным ферментом, способная окислять, кроме метанола, и другие спирты первичные спирты (С1–С5), но слабо взаимодействует с их вторичными и третичными изомерами [23], поэтому окислительная активность фермента относительно изопропанола и трет-бутанола достаточно ниже, чем активность относительно метанола. Для дальнейшего определения кинетических параметров ферментативной реакции были использованы муравьиная кислота, щавелевая кислота, метанол, трет-бутанол и изопропанол, так как ответы на эти субстраты были достаточно высоки, карбоновые кислоты ранее не использовались в подобных экспериментах, а также количество данных субстратов было достаточно для проведения исследований. 3.5. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам спектрофотометрическим методом Для определения кинетических параметров фермента МДГ по отношению к разным субстратам изучали зависимость удельной активности МДГ от концентрации субстратов – муравьиной кислоты (Табл. 8, 9), щавелевой кислоты (Табл. 10, 11), метанола (Табл. 12, 13), трет-бутанола (Табл. 14, 15), изопропанола (Табл. 16, 17). По полученным данным (Табл. 8-17) построили графики зависимости удельной активности фермента МДГ от концентрации субстратов (Рис. 16-20). 36

Удельная активность, Ед/мг белка 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 Концентрация муравьиной кислоты, моль/л Рисунок 16. График зависимости удельной активности МДГ от концентрации муравьиной кислоты Удельная активность, Ед/мг белка 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 Концентрация щавелевой кислоты, моль/л Рисунок 17. График зависимости удельной активности МДГ от концентрации щавелевой кислоты 37

Удельная активность,Ед/мг белка 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 Концентрация метанола,моль/л Рисунок 18. График зависимости удельной активности МДГ от концентрации метанола Удельная активность,Ед/мг белка 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 Концентрация трет-бутанола,моль/л Рисунок 19. График зависимости удельной активности МДГ от концентрации трет-бутанола 38

Удельная акивность, Ед/мг белка 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 Концентрация изопропанола,моль/л Рисунок 20. График зависимости удельной активности МДГ от концентрации изопропанола Для описания кинетики ферментативных реакций в гомогенных условиях используют гиперболическое уравнение Михаэлиса-Ментен с двумя параметрами. Если же калибровочные зависимости имеют сигмоидальный характер, их аппроксимируют уравнением Хилла с тремя параметрами для описания кинетики аллостерических ферментов. Уравнение Михаэлиса-Ментен: V= Vmax × [S] K M + [S] где V – начальная скорость при концентрации субстрата [S]; Vmax – максимальная скорость ферментативной реакции, Ед/мг белка; KM – константа Михаэлиса, моль/л. Экспериментальные данные аппроксимировали с помощью уравнения Михаэлиса-Ментен и получили следующие результаты, представленные в табл.18. 39

Таблица 18. Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен для бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам Параметр Vmax, Ед/мг белка KM, ммоль/л R2 0,093±0,002 0,2±0,1 0,9813 0,065±0,003 1,0±0,4 0,9428 Метанол 0,100±0,003 0,4±0,2 0,9455 Трет-бутанол 0,090±0,004 0,7±0,3 0,9049 Изопропанол 0,100±0,006 0,5±0,4 0,8983 Муравьиная кислота Щавелевая кислота Константа Михаэлиса (КМ) численно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости, и характеризует сродство фермента к данному субстрату. Как известно, чем меньше КМ, тем больше сродство фермента к субстрату и тем выше начальная скорость реакции. Анализируя данные, представленные в табл.18, видно, что наименьшая КМ характерна для муравьиной кислоты (0,2±0,1 ммоль/л). Это объясняется тем, что в качестве биокатализатора используется не чистый фермент МДГ рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160, для которого характерна наименьшая КМ к метанолу [23], а их бесклеточный экстракт, в котором, кроме МДГ, находятся и другие ферменты (например, формиатдегидрогеназа). 3.6. Бесклеточный экстракт Methylobacterium extorquens pCM160 как основа функционирования амперометрического медиаторного биосенсора Количественную оценку окислительной активности бесклеточного экстракта изучали электрохимическим биоэлектрокаталитического методом окисления определения субстратов в интенсивности присутствии медиатора электронного транспорта ферроцена. Амперометрический медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод, а рабочим электродом - графито-пастовый 40

электрод, содержащий пасту с медиатором – ферроценом и иммобилизованным на поверхности биокатализатором. На медиаторный электрод подавали положительный потенциал относительно хлорсеребрянного электрода сравнения. За ответ сенсора принимали изменение силы тока ΔI (нА) – разность между базовой и стационарной величинами тока. На рис. 21 представлен классический вид отклика биосенсора на метанол в присутствии медиатора– ферроцена. Через 60 секунд после добавления субстрата ток достигал стационарного значения, а при удалении субстрата помывкой принимал исходное значение. Рисунок 21. Типичный вид отклика биосенсора, модифицированного ферроценом для бесклеточного экстракта M. extorquens pCM 160, на метанол (5 мМ) Процесс, который протекает при электрокаталитическом окислении метанола под действием фермента МДГ, содержащей кофактор PQQ в присутствии ферроцена, может быть представлен в следующем виде: Анод (подается потенциал 250 мВ относительно электрода сравнения): СН3ОН + PQQ-МДГ PQQH2-МДГ + 2[Fе(С5Н5)2]+ Fe(C5H5)2 - 1e- HСОН + PQQH2-МДГ PQQ-МДГ + 2 Fe(C5H5)2 + 2H+ [Fе(С5Н5)2]+ 41

Катод: AgCl + e- Ag + Cl- МДГ катализирует реакцию по механизму «пинг-понг» с последовательным восстановлением PQQ метанолом и выделением формальдегида. При этом ферроцений-ионы восстанавливаются до ферроцена, а затем окисляются опять до феррроцений-иона. Последний вновь вступает в новый цикл взаимодействий. 3.6.1. Селективность медиаторных сенсоров на основе бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 Селективность биосенсорного анализа определяется специфичностью биологического материала, а именно бесклеточного экстракта. Для ее изучения оценивали величину откликов (в нА) сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата (Рис. 22). В качестве субстратов использовали те же субстраты, что и при спектрофотометрическом определении (Табл. 6). 6000 5000 Ответ, нА 4000 3000 2000 1000 0 Субстраты Рисунок 22. Субстратная специфичность бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 в присутствие медиатора ферроцена. 42

Исследуемый бесклеточный экстракт проявляет наибольшую окислительную активность по отношению к метанолу, что согласуется с литературными данными [23]. Также на рис. 22 наблюдается снижение каталитической активности фермента с увеличением длины углеродной цепи субстрата, что соответствует литературному источнику [23]. Окислительная активность МДГ к формальдегиду достаточно высока, так как МДГ способна окислять данный субстрат [23]. К глицерину, муравьиной и щавелевой кислотам значение активности слишком мало, что может быть обусловлено неспособностью ферментных систем проявлять активность по отношению к данным субстратам в присутствии медиатора ферроцена. 3.6.2. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам амперометрическим методом Часто возникает потребность в калибровке биосенсора. Причиной этому служит получение воспроизводимых результатов в процессе проведения различных исследований. В качестве субстратов использовали муравьиную кислоту, щавелевую кислоту, метанол, трет-бутанол и изопропанол. Экспериментальные данные аппроксимировали с помощью уравнения Михаэлиса-Ментен (Рис. 23-27). 43

4000 3500 Ответ сенсора, нА 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Концентрация метанола, мМ Рисунок 23. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 от концентрации метанола 4000 3500 Ответ сенсора, нА 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Концентрация изопропанола, мМ Рисунок 24. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 от концентрации изопропанола 44

800 700 Ответ сенсора, нА 600 500 400 300 200 100 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Концентрация трет-бутанола, мМ Рисунок 25. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 от концентрации трет-бутанола 700 Ответ сенсора, нА 600 500 400 300 200 100 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Концентрация муравьиной кислоты, мМ Рисунок 26. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 от концентрации муравьиной кислоты 45

700 Ответ сенсора, нА 600 500 400 300 200 100 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Концентрация щавелевой кислоты, мМ Рисунок 27. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 от концентрации щавелевой кислоты В табл. 19 приведены значения кинетических параметров уравнений калибровочных зависимостей по отношению к различным субстратам. Таблица 19. Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен для бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам Параметр Vmax, нА KM, ммоль/л R2 920±70 0,12±0,02 0,9491 1000±80 0,16±0,03 0,9565 Метанол 5600±300 0,15±0,01 0,9829 Трет-бутанол 900±80 0,13±0,03 0,9068 Изопропанол 5700±300 0,16±0,02 0,9853 Муравьиная кислота Щавелевая кислота 46

По отношению к метанолу и изопропанолу максимальная скорость развития сигнала различается незначительно и составляет 5600±300 нА и 5700±300 нА соответственно. Также стоит отметить, что максимальная скорость для таких субстратов как муравьиная кислота и трет-бутанол ниже, но тоже практически совпадает и составляет 920±70 нА и 900±80 нА соответственно. Что касается константы Михаэлиса, то наименьший данный параметр наблюдается у муравьиной кислоты (0,12±0,02 ммоль/л), также как и в спектрофотометрическом методе. Для снижения ошибок анализа используют линейные участки калибровочных зависимостей (Рис. 28 - 32). Коэффициент чувствительности рассчитывался как тангенс угла наклона линейного участка калибровочной зависимости. 3000 Ответ сенсора, нА 2500 2000 1500 1000 500 0 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 Концентрация метанола, мМ Рисунок 28. Линейный участок градуировочной зависимости ответа сенсора от концентрации метанола 47

2500 Ответ сенсора, нА 2000 1500 1000 500 0 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Концентрация изопропанола, мМ Рисунок 29. Линейный участок градуировочной зависимости ответа сенсора от концентрации изопропанола 500 Ответ сенсора, нА 400 300 200 100 0 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Концентрация трет-бутанола, мМ Рисунок 30. Линейный участок градуировочной зависимости ответа сенсора от концентрации трет-бутанола 48

500 Ответ сенсора, нА 400 300 200 100 0 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Концентрация муравьиной кислоты, мМ Рисунок 31. Линейный участок градуировочной зависимости ответа сенсора от концентрации муравьиной кислоты 500 Ответ сенсора, нА 400 300 200 100 0 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Концентрация щавелевой кислоты, мМ Рисунок 32. Линейный участок градуировочной зависимости ответа сенсора от концентрации щавелевой кислоты 49

Полученные участки аппроксимировали с помощью уравнения прямой, коэффициенты представлены в табл. 20. Таблица 20. Параметры линейных зависимостей Параметры a±Δa b±Δb R2 Муравьиная кислота 4090±90 25±6 0,9934 Щавелевая кислота 4370±90 7±6 0,9941 Метанол 19200±700 270±50 0,9804 Трет-бутанол 4230±90 33±6 0,9936 Изопропанол 21200±500 170±30 0,9937 Коэффициенты чувствительности (а) для метанола и изопропанола достаточно высоки (19200±700 и 21200±500 соответственно) по сравнению с другими субстратами, что свидетельствует о том, что возможно обнаружить и определить малые количества данных субстратов (метанола и изопропанола), получив один и тот же аналитический сигнал, и точнее определить одно и то же количество вещества. 3.7. Сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим и электрохимическим методами В ходе работы были выполнены исследования биокаталитических свойств бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 двумя различными методами – спектрофотометрическим, основанным на изучении спектров поглощения в видимой (400-760 нм) области спектра, и амперометрическим, основанным на изучении зависимости тока, протекающего через электролитическую ячейку, от напряжения. Результаты показаны на рис.33 и в табл.21. 50

Ответ,% от метанола 120 100 80 60 Амерометрический метод 40 Спектрофотометрическ ий метод 20 0 Субстраты Рисунок 33. Субстратная специфичность бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 двумя различными методами Из диаграммы видно, что максимальная окислительная активность бесклеточного экстракта наблюдается к метанолу, что согласуется с литературными данными [23] и подтверждается высоким коэффициентом чувствительности на данный субстрат (Табл.20). Наименьшая активность в двух методах наблюдается к глицерину. Стоит отметить, что ответы на карбоновые кислоты в амперометрическом методе намного ниже, чем в спектрофотометрическом. Скорее всего, это связано с использованием разных медиаторов в методах. Вероятно, ферроцен не взаимодействует с формальдегиддегидрогеназой, содержащейся в бесклеточном экстракте, из-за чего мы наблюдаем низкий ответ. Таким образом, скорее всего использование различных медиаторов может влиять на специфичность бесклеточного экстракта и биокатализаторов в целом. Также стоит подчеркнуть, что амперометрический метод является более селективным. Однако чтобы убедиться в правильности предположения о возможном изменении специфичности в зависимости от медиатора требуются дополнительные исследования (использование ФМС и ДХФИФ в амперометрическом биосенсоре). 51

Таблица 21. Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен для бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам для двух методов анализа Метод анализа Спектрофото метрический Амперометри ческий Vmax,Ед/мг К М, белка/нА ммоль/л Муравьиная кислота 0,093±0,002 0,2±0,1 0,9813 Щавелевая кислота 0,065±0,003 1,0±0,4 0,9428 Метанол 0,100±0,003 0,4±0,2 0,9455 Трет-бутанол 0,090±0,004 0,7±0,3 0,9049 Изопропанол 0,100±0,006 0,5±0,4 0,8983 Муравьиная кислота 920±70 0,12±0,02 0,9491 Щавелевая кислота 1000±80 0,16±0,03 0,9565 Метанол 5600±300 0,15±0,01 0,9829 Трет-бутанол 900±80 0,13±0,03 0,9068 Изопропанол 5700±300 0,16±0,02 0,9853 Субстраты R2 Из приведенных данных видно, что в ходе спектрофотометрического анализа максимальная скорость процесса достигается при реакции бесклеточного экстракта с такими субстратами как метанол и изопропанол (0,100±0,003 Ед/мг белка и 0,100±0,006 Ед/мг белка соответственно). При амперометрическом анализе субстраты, максимальная скорость реакции с которыми равна 5600±300 нА и 5700±300 нА, совпадают с предыдущим методом (метанол и изопропанол соответственно). Наименьшая константа Михаэлиса наблюдается у муравьиной кислоты сразу в двух методах исследования (в спектрофотометрическом методе - 0,2±0,1 ммоль/л; в амперометрическом - 0,12±0,02 ммоль/л). Коэффициент корреляции для всех субстратов при разных методах примерно совпадает. 52

Также стоит отметить, что в спектрофотометрическом анализе удельная активность на муравьиную кислоту ниже, чем на метанол, при этом константа Михаэлиса выше (Табл. 9, 18). Таким образом, можно сделать вывод, что муравьиная кислота окисляется не метанолдегидрогеназой, а другим ферментом – формиатдегидрогеназой, содержащейся в бесклеточном экстракте метилобактерий M.extorquens pCM160. Таким образом, получив и проанализировав результаты исследования бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 двумя химическими методами, можно сделать вывод, что фермент метанолдегидрогеназа, содержащийся в бесклеточном экстракте метилотрофных бактерий действующий, активный и способный катализировать окисление различных субстратов. 53

Выводы 1. Получен M.extorquens бесклеточный pCM160 с экстракт помощью рекомбинантных ультразвукового метилобактерий дезинтегрирования и центрифугирования, масса которого составила 5,6 г. Установлена концентрация белка – 11,042 мг/мл. 2. Определена максимальная удельная активность фермента МДГ в системе медиаторов ФМС+ДХФИФ (0,145 Ед/мг белка). 3. Изучен спектр окисляемых субстратов бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 - муравьиная кислота, щавелевая кислота, метанол, третбутанол, изопропанол, этанол, бутанол-1, изоамиловый спирт, глицерин, бензиловый спирт и формальдегид, спектрофотометрическим и амперометрическим методами. Из субстратной специфичности, определенной спектрофотометрическим методом, видно, что максимальная каталитическая активность наблюдается к метанолу, что согласуется с литературными данными [23]. Такая же тенденция наблюдается и в амперометрическом методе. Также в амперометрическом методе можно заметить снижение каталитической активности фермента с увеличением длины углеводородной цепи субстрата. 4. Определены кинетические параметры фермента МДГ, содержащегося в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам двумя методами – спектрофотометрическим и амперометрическим. В первом Михаэлиса методе характерна (спектрофотометрическом) для муравьиной кислоты наименьшая (0,2±0,1 константа ммоль/л). В амперометрическом методе высокие коэффициенты чувствительности наблюдаются у метанола и изопропанола (19200±700 и 21200±500 соответственно). 5. Проведен сравнительный спектрофотометрическим специфичности в обоих и анализ амперометрическим методах максимальная результатов, методами. В окислительная полученных субстратной активность 54

бесклеточного экстракта наблюдается к метанолу, что подтверждается высоким коэффициентом чувствительности на данный субстрат. Что касается кинетических параметров, исследуемых двумя методами, видно, что в ходе обоих методах максимальная скорость процесса достигается при реакции бесклеточного экстракта с такими субстратами как метанол и изопропанол (в спектрофотометрическом анализе - 0,100±0,003Ед/мг белка и 0,100±0,006Ед/мг белка соответственно; в амперометрическом - 5600±300 нА и 5700±300 нА) Наименьшая константа Михаэлиса наблюдается у муравьиной кислоты сразу в двух методах исследования (в спектрофотометрическом методе - 0,2±0,1 ммоль/л; в амперометрическом - 0,12±0,02 ммоль/л). 6. Результаты, полученные спектрофотометрическим и амперометрическим методами, могут использоваться для дальнейших исследований в научнопрактической деятельности. Фермент МДГ, содержащийся в бесклеточном экстракте рекомбинантных метилотрофных бактерий M.extorquens pCM160 активный, действующий и способный катализировать окисление различных субстратов. 55

Список литературы 1. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии // Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 2010. 325 с. 2. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. / NewYork, NY: Academic Press – 1982. 3. Ю.А. Троценко. Аэробные метилотрофы – перспективные объекты современной биотехнологии // Журнал Сибирского федерального университета. Биология, 2012. Т. 5. № 3. С. 243-279. 4. Глазков В.В., Мизгунова У.М., Золотова Г.А., Долманова И.Φ. Ферментативное определение этанола и метанола // Журн. аналит. химии. 1997.–Т. 52, № 1.–С. 83. 5. Ю.А. Троценко. Биология аэробных метилобактерий – деструкторов галометанов / Ю.А. Троценко и Н.В. Доронина // Микробиология, 2003. Т. 72. № 2. С. 149-160. 6. M.E. Lidstrom. Aerobic methylotrophic prokaryotes. New York: SpringerVerlag, 2006. Chapter 1.20.P. 618-634. 7. Определитель бактерий Берджи. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кринга, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямся.–М.: Мир.–1997.–Т. 1–432 c. 8. Leisinger, T., Braus-Stromeyer S.A. Bacterial growth with chlorinated methanes // Environ. Health Perspect.1995.–V. 103.–P. 33 – 36. 9. S.Vuilleumier. Methylobacterium Genome Sequences: A Reference Blueprint to Investigate Microbial Metabolism of C1 Compounds from Natural and Industrial Sources // Plos one, 2009. V. 4, № 5. P. 16. 10. D.O. Mountfort. Oxidation of Aromatic Alcohols by Purified Methanol Dehydrogenase from Methylosinustrichosporium // J.Bacteriology, 1990.V. 172, № 7.P. 3690–3694. 11. X. Zhang, S. Y. Reddy, T. C. Bruice. Mechanism of methanol oxidation by quinoprotein methanol dehydrogenase // PNAS, 2007.V. 104, № 3.P. 745–749. 56

12. L.Qinfeng, J.R. Kirchhoff. A rapid method for the purification of methanol dehydrogenase from Methylobacteriumextorquens // Protein Expression and Purification, 2006.V. 46. P. 316–320. 13. Т.А.Кузнецова, Ю.А. Троценко. Конструирование рекомбинантной плазмиды для экспрессии гена метанолдегидрогеназы. Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 24-27 декабря 2014 г.: Материалы. М.: Макс Пресс, 2014. С. 137. 14. Комов В.П., Шведова В.Н., Биохимия: Учеб. для вузов/ - М.: Дрофа – 2004. 15. Alejandro G. Marangoni Enzyme kinetics: a modern approach / Department of Food Science University of Guelph – 2003. 16. Северин Е.С. , Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – 2-е изд., испр. – М.:ГЭОТАР-МЕД – 2004. 17. K. Habermüller. Electron-transfer mechanisms in amperometric biosensors / K. Habermüller, M. Mosbach, W. Schuhmann // J. Anal. Chem.,2000. V. 366. P. 560-568. 18. T. Ikeda. An Electrochemical Approach to the Studies of Biological Redox Reactions and Their Applications to Biosensors, Bioreactors, and Biofuel Cells / T. Ikeda and K. Kano // J. Biosci Bioeng, 2001. V. 92,№1. P. 9-18. 19. Э.Тернер, И. Карубе, Дж. Уилсон. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир, 1992. С. 578. 20. В.А. Алферов. Эффективность медиаторов электронного транспорта при электрокаталитическом окислении субстратов иммобилизованными бактериями / В.А. Алферов, Е.Е. Бабкина, О.Н. Понаморева, И.В. Россинская, Е.В. Чубарова, И.В. Блохин, А.Н. Решетилов // Известия ТулГУ. Сер. Химия, 2004. Т. 4. С. 104-112. 21. Е.Ю. Чигринова. Микробные сенсоры на основе производных ферроцена и бензохинона, применяемых в качестве медиаторов / Е.Ю. Чигринова, Е.Е. Бабкина, 57

О.Н. Понаморева, В.А. Алферов, А.Н. Решетилов // Сенсорные системы, 2007. Т. 21. С. 263-269. 22. Д.А. Леменовский. Сандвичевые металлокомплексные соединения. Ферроцен. // Соросовский образовательный журнал, 1997. №2. С. 66-69. 23. М. Грин. Металлоорганические соединения переходных металлов. М.: Мир, 1972. С. 456. 24. О.Н. Понаморева, В.А. Арляпов, А.Н. Решетилов, В.А. Алферов. Биосенсоры и биотопливные элементы. Тула: Изд-во ТулГУ, 2010. С. 255. 25. Г.А. Евтюгин, Г.К. Будников, Е.Е. Стойкова. Основы биосенсорики. Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина, 2007. С.80. 26. J.M. Dicks, W.J. Aston, G. Davis, A.P.F. Turner. Mediated amperometric biosensors for D-galactose, glycolate and L-amino acids based on a ferrocene-modified carbon paste electrode, 1986. V. 218. P. 103-112. 27. Плеханова Ю.В., Фирсова Ю.Е., Доронина Н.В., Троценко Ю.А., Решетилов А.Н. Аэробные метилобактерии как основа биосенсора для детекции дихлорметана // Прикл. Биохим. Микробиол. -2013. – Т. 49 (№2). – С.203 28. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Решетников А.С., Горячева А.А. Биоэлектрокаталитическое окисление формальдегида метилобактериями Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 в присутствии медиатора электронного транспорта - ферроцена. // ИзвестияТулГУ. Естественныенауки. Тула: ИздвоТулГУ.-Вып. 1. -2012. – С.236-245. 29. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола клетками метилотрофных бактерий в присутствии медиаторов электронного транспорта // Известия ТулГУ. Естественные науки. Тула: Изд-во ТулГУ.- Вып. 1. -2013. – С.222-232. 30. Кузнецова Т.А., Бесчастный А. П., Алфёров С.В., Троценко Ю.А. Свойства модифицированных амперометрических биосенсоров на основе 58

метанолдегидрогеназы и клеток Methylobacteriumnodulans //Прикл. Биохим. Микробиол. -2013. – Т. 49 (№6). - С.613-618. 31. G. Wen, X. Wen, S. Shuang, M.M.F. Choi, Whole-cell biosensor for determination of methanol //Sensors and Actuators B: Chemical 2014. –V. 201, № 1. –P. 586–591. 32. Глазков В.В., Мизгунова У.М., Золотова Г.А., Долманова И.Φ. Ферментативное определение этанола и метанола // Журн. аналит. химии. 1997.–Т. 52, № 1.–С. 83. 33. Day, D.J. Methanol dehydrogenase from Methylobacterium extorquens AM1 / D.J. Day and C. Anthony // Methods Enzymol. – 1990. – V. 188. – P. 210–216. 34. Mary Lidstrom, Methods in Enzymology, Hydrocarbons and Methylotrophy, Volume 188, 1st Edition – 1990. 35. Невмержицкая Ю.Ю., Тимофеева О.А. Практикум по физиологии и биохимии растений (белки и ферменты): Учебно-методическое пособие/Казань: Казанский университет – 2012. 36. Арляпов В.А. Амперометрический биосенсор для определения глюкозы на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в электропроводящий гель // Известия ТулГУ. Естественные науки. - Вып.1. - Тула, 2016. 37. Кузнецова Т.А., Бесчастный А.П., Понаморева О.Н., Троценко Ю.А. Очистка и характеристика метанолдегидрогеназы ризосферного фитосимбионта Methylobacterium nodulans // Прикл. Биохим. Микробиол. -2012. – Т. 48 (№6). - С.16. 38. Досон Р., Эллиот Д. Справочник биохимика: Пер. с англ./Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонсон К. – М.: Мир, 1991. 59

Приложение Таблица 6. Анализируемые субстраты Субстрат Структурная формула Муравьиная кислота HCOOH Щавелевая кислота HOOC—COOH Метанол CH3—OH CH3 Трет-бутанол HO C CH3 CH3 OH Изопропанол CH H3C Этанол Бутанол-1 CH3 CH3—CH2—OH CH3—CH2—CH2—CH2—OH CH3 Изоамиловый спирт ÑH2 ÑH ÑH2 HO ÑH2 Глицерин CH3 ÑH2 ÑH HO OH OH Бензиловый спирт ÑH2OH H Формальдегид C H O 60

Таблица 7. Экспериментальные данные спектрофотометрического анализа субстратной специфичности бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 Субстрат Удельная активность, Доверительный интервал, Ед/мг белка Ед/мг белка Муравьиная кислота 0,096 0,004 Щавелевая кислота 0,08 0,01 Метанол 0,13 0,02 Трет-бутанол 0,09 0,01 Изопропанол 0,114 0,008 Этанол 0,08 0,02 Бутанол-1 0,08 0,02 Изоамиловый спирт 0,02 0,02 Глицерин 0,03 0,02 Бензиловый спирт 0,04 0,02 Формальдегид 0,11 0,02 61

Таблица 8. Экспериментальные данные спектрофотометрического анализа бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата муравьиной кислоты Концентрация ОП600/мин Разведение Объем Объем HCOOH, холостой образца, образца, смеси, моль/л опыт раз мл мл 0,015 0,003 0,481 1 0,05 2 0,015 0,003 0,519 1 0,05 2 0,025 0,003 0,490 1 0,05 2 0,025 0,003 0,489 1 0,05 2 0,010 0,003 0,455 1 0,05 2 0,010 0,003 0,483 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,448 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,480 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,460 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,469 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,448 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,462 1 0,05 2 0 0,003 0,058 1 0,05 2 ОП600/мин анализ.образец 62

Таблица 9. Расчетные данные активности МДГ бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата муравьиной кислоты Исходная Удельная концентрация активность, Ед/мг белка мг/мл белка 1,006 11,042 0,091 0,015 1,086 11,042 0,098 0,025 1,025 11,042 0,093 0,025 1,023 11,042 0,093 0,010 0,952 11,042 0,086 0,010 1,011 11,042 0,092 0,0075 0,937 11,042 0,085 0,0075 1,004 11,042 0,091 0,0050 0,962 11,042 0,087 0,0050 0,981 11,042 0,089 0,0025 0,937 11,042 0,085 0,0025 0,966 11,042 0,088 0 0,116 11,042 0,010 Концентрация Активность, HCOOH, моль/л Ед/мл 0,015 63

Таблица 10. Экспериментальные данные спектрофотометрического анализа бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата щавелевой кислоты Концентрация HOOC— COOH, моль/л ОП600/мин холостой опыт ОП600/мин анализ.образец Разведение Объем Объем образца, образца, смеси, раз мл мл 0,015 0,003 0,351 1 0,05 2 0,015 0,003 0,330 1 0,05 2 0,025 0,003 0,344 1 0,05 2 0,025 0,003 0,328 1 0,05 2 0,010 0,003 0,316 1 0,05 2 0,010 0,003 0,278 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,277 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,273 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,268 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,272 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,255 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,263 1 0,05 2 0 0,003 0,048 1 0,05 2 64

Таблица 11. Расчетные данные активности МДГ бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата щавелевой кислоты Концентрация HOOC—COOH, моль/л Активность, Ед/мл Исходная Удельная концентрация активность, Ед/мг белка мг/мл белка 0,015 0,733 11,042 0,066 0,015 0,688 11,042 0,062 0,025 0,718 11,042 0,065 0,025 0,684 11,042 0,062 0,010 0,659 11,042 0,060 0,010 0,579 11,042 0,052 0,0075 0,577 11,042 0,052 0,0075 0,568 11,042 0,051 0,0050 0,558 11,042 0,051 0,0050 0,566 11,042 0,051 0,0025 0,531 11,042 0,048 0,0025 0,547 11,042 0,050 0 0,095 11,042 0,087 65

Таблица 12. Экспериментальные данные спектрофотометрического анализа бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата метанола Концентрация ОП600/мин Разведение Объем Объем CH3OH, холостой образца, образца, смеси, моль/л опыт раз мл мл 0,015 0,003 0,650 1 0,05 2 0,015 0,003 0,625 1 0,05 2 0,015 0,003 0,588 1 0,05 2 0,025 0,003 0,628 1 0,05 2 0,025 0,003 0,607 1 0,05 2 0,025 0,003 0,579 1 0,05 2 0,010 0,003 0,625 1 0,05 2 0,010 0,003 0,605 1 0,05 2 0,010 0,003 0,581 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,616 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,600 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,568 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,617 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,520 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,585 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,580 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,492 1 0,05 2 0 0,003 0,055 1 0,05 2 ОП600/мин анализ.образец 66

Таблица 13. Расчетные данные активности МДГ бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата метанола Исходная Удельная концентрация белка активность, Ед/мг мг/мл белка 1,362 11,042 0,123 0,015 1,309 11,042 0,119 0,015 1,232 11,042 0,112 0,025 1,316 11,042 0,119 0,025 1,272 11,042 0,115 0,025 1,213 11,042 0,110 0,010 1,309 11,042 0,119 0,010 1,267 11,042 0,115 0,010 1,217 11,042 0,110 0,0075 1,291 11,042 0,117 0,0075 1,257 11,042 0,114 0,0075 1,189 11,042 0,108 0,0050 1,293 11,042 0,117 0,0050 1,088 11,042 0,099 0,0050 1,225 11,042 0,111 0,0025 1,215 11,042 0,110 0,0025 1,029 11,042 0,093 0 0,109 11,042 0,010 Концентрация Активность, CH3OH, моль/л Ед/мл 0,015 67

Таблица 14. Экспериментальные данные спектрофотометрического анализа бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата трет-бутанола Концентрация третбутанола, моль/л ОП600/мин холостой опыт ОП600/мин анализ.образец Разведение Объем Объем образца, образца, смеси, раз мл мл 0,015 0,003 0,488 1 0,05 2 0,015 0,003 0,501 1 0,05 2 0,015 0,003 0,466 1 0,05 2 0,025 0,003 0,459 1 0,05 2 0,025 0,003 0,463 1 0,05 2 0,025 0,003 0,439 1 0,05 2 0,010 0,003 0,43 1 0,05 2 0,010 0,003 0,435 1 0,05 2 0,010 0,003 0,442 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,415 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,408 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,374 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,110 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,488 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,501 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,466 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,459 1 0,05 2 0 0,003 0,463 1 0,05 2 68

Таблица 15. Расчетные данные активности МДГ бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата трет-бутанола Концентрация трет-бутанола, моль/л Активность, Ед/мл Исходная Удельная концентрация белка активность, Ед/мг мг/мл белка 0,015 1,021 11,042 0,092 0,015 1,048 11,042 0,095 0,015 0,975 11,042 0,088 0,025 0,960 11,042 0,087 0,025 0,968 11,042 0,088 0,025 0,918 11,042 0,083 0,010 0,899 11,042 0,081 0,010 0,909 11,042 0,082 0,010 0,924 11,042 0,084 0,0075 0,867 11,042 0,079 0,0075 0,853 11,042 0,077 0,0075 0,781 11,042 0,071 0,0050 0,225 11,042 0,020 0,0050 1,021 11,042 0,092 0,0050 1,048 11,042 0,095 0,0025 0,975 11,042 0,088 0,0025 0,960 11,042 0,087 0 0,968 11,042 0,088 69

Таблица 16. Экспериментальные данные спектрофотометрического анализа бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата изопропанола Концентрация ОП600/мин Разведение Объем Объем изопропанола, холостой образца, образца, смеси, моль/л опыт раз мл мл 0,015 0,003 0,540 1 0,05 2 0,015 0,003 0,589 1 0,05 2 0,015 0,003 0,585 1 0,05 2 0,025 0,003 0,532 1 0,05 2 0,025 0,003 0,536 1 0,05 2 0,025 0,003 0,472 1 0,05 2 0,010 0,003 0,538 1 0,05 2 0,010 0,003 0,459 1 0,05 2 0,010 0,003 0,540 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,451 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,528 1 0,05 2 0,0075 0,003 0,429 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,113 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,540 1 0,05 2 0,0050 0,003 0,589 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,585 1 0,05 2 0,0025 0,003 0,532 1 0,05 2 0 0,003 0,536 1 0,05 2 ОП600/мин анализ.образец 70

Таблица 17. Расчетные данные активности МДГ бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 на основе субстрата изопропанола Концентрация изопропанола, моль/л Активность, Ед/мл Исходная Удельная концентрация белка активность, Ед/мг мг/мл белка 0,015 1,131 11,042 0,102 0,015 1,234 11,042 0,112 0,015 1,225 11,042 0,111 0,025 1,114 11,042 0,101 0,025 1,122 11,042 0,102 0,025 0,987 11,042 0,089 0,010 1,126 11,042 0,102 0,010 0,960 11,042 0,087 0,010 1,131 11,042 0,102 0,0075 0,943 11,042 0,085 0,0075 1,105 11,042 0,100 0,0075 0,897 11,042 0,081 0,0050 0,232 11,042 0,021 0,0050 1,131 11,042 0,102 0,0050 1,234 11,042 0,112 0,0025 1,225 11,042 0,111 0,0025 1,114 11,042 0,101 0 1,122 11,042 0,102 71

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Мария Улитина

Бакалаврская работа Улитиной Марии посвящена изучению биокаталитических свойств фермента метанолдегидрогеназы из бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160. В ходе выполнения экспериментальной части работы Мария Андреевна освоила классические и современные экспериментальные методики. Так, для выращивания микроорганизмов и получения бесклеточного эк...

больше 3 лет назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв