Влияние фазового состояния на физико-химические, технологические и биофармацевтические параметры дигидрокверцетина

Роман Терехов

Влияние фазового состояния на физико-химические, технологические и биофармацевтические параметры дигидрокверцетина

Дигидрокверцетин (ДКВ) является природным полифенолом, характеризующимся широким спектром фармакологической активности. Данное соединение имеет надежную ресурсно-сырьевую базу на территории России и производится в промышленных масштабах для нужд внутреннего рынка и экспорта. Разработка новых лекарственных препаратов на основе этого полифенола ограничена его низкой биологической доступностью. Ранее на примере других представителей семейства флавоноидов было продемонстрировано, что изменение строения твердой фазы может существенно улучшить функциональные свойства малорастворимых субстанций. Таким образом, цель работы - разработать способы получения фазовых модификаций ДКВ с улучшенными биофармацевтическими характеристиками, изучить природу твердой фазы и провести сопоставительный анализ их свойств. Исследование выполнено в трансляционном формате и включало этапы молекулярного моделирования, синтеза и системного анализа фазовых модификаций ДКВ комплексом физико-химических, биофармацевтических, фармацевтико-технологических и фармакологических методов. В ходе компьютерных расчетов построены виртуальные модели твердых фаз ДКВ и изучено влияние условий синтеза на свойства вещества. Результаты исследований in silico послужили основой для направленного синтеза фазовых модификаций природного полифенола с заданными физико-химическими свойствами. Таким образом были получены три новые формы ДКВ: микротрубчатая, микросфероидная и микроволокнистая. Сохранение исходной структуры подтвердили путем спектрального (УФ-, ИК-, ЯМР 1Н, масс-) и хроматографического (ВЭЖХ-МС/МС) анализа. При этом на основании рентгенографических и термических данных микротрубки были признаны новой псевдополиморфной моидфикацией ДКВ, а микросферы и микроволокна - отдельными аморфными формами. Кристаллическая ячейка псевдоплиморфной фомры ДКВ депонирована в международную базу данных Cambridge Crystallographic Data Centre (Deposition Number: 1892198). Микротрубки обладали повышенной сорбционной способностью. Все образцы характеризовались улучшенной проницаемостью через монослой клеток и улучшенной растворимостью в воде при комнатной температуре по сравнению с исходной субстанцией, что позволяет говорить об оптимизации биофармацевтических параметров ДКВ. Микросферы послужили основой для разработки таблеток для рассасывания с пролонгированным режимом высвобождения. А для микротрубок установлено значимое увеличение ранозаживляющей способности на модели ожога IIIA степени у крыс в сравнении с исходной фармацевтической субстанцией, традиционным противоожоговым фитопрепаратом (облепиховое масло) и плацебо. Отдельным результатом работы стало обнаружение фрактальной структуры микроволокнистой формы ДКВ. Используя фрактальную геометрию было установленно наличие корреляции между фрактальной размерностью образцов ДКВ и физико-химическими свойствами, используемыми как показатели качества субстанции. Данное наблюдение послужило теоретической основой для разработки автоматизированного неразрушающего метода контроля качества фармацевтических субстанций на базе тандема оптической микроскопии и интеллектуальных технологий. Таким образом, были получены и комплексно охарактеризованы новые фазовые модификации ДКВ, обладающие улучшенными биофармацевтическими, фармацевтико-технологическими и ранозаживляющими свойствами, что делает данные объекты перспективными для дальнейшей трансляции в реальную клиническую практику в основы для новых фитопрепаратов. Результаты исследования внедрены в научную деятельность НИИ трансляционной медицины РНИМУ им. Н.И. Пирогова и в производство АО "Аметис". По теме диссертационной работы опубликована 31 печатная работа, в том числе 5 статей в журналах, входящих в Перечень рецензируемых научных изданий, 7 статей в журналах, индексируемых в международных базах данных Scopus Web of Science, и 1 патент РФ.

Медицина и здравоохранение

Диссертации

Вуз: Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова)

ID: 6059becdccefde000190a4ec

UUID: 0ceaa690-6dee-0139-2f27-0242ac180002

Язык: Русский

Опубликовано: около 3 лет назад

Просмотры: 295

23.9

Роман Терехов

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова)

Комментировать 0

Рецензировать 2

Скачать - 6,8 МБ

Поделиться работой

1 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (СЕЧЕНОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ) На правах рукописи Терехов Роман Петрович Влияние фазового состояния на физико-химические, технологические и биофармацевтические параметры дигидрокверцетина 14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Селиванова Ирина Анатольевна Москва – 2021

2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 6 ГЛАВА 1. Фазовые модификации флавоноидов (обзор литературы) 13 1.1. Стратегия литературного поиска и общая характеристика статей 15 1.2. Изменение фазовых состояний флавоноидов 19 1.2.1. Дизайн и способы получения 19 1.2.2. Методы анализа 24 1.2.3. Фармакологические исследования 34 1.3. Оптимизация фазового состояния дигидрокверцетина 36 Выводы по главе 38 ГЛАВА 2. Дизайн и синтез фазовых модификаций дигидрокверцетина 2.1. Компьютерное моделирование фазовых состояний дигидрокверцетина 39 39 2.1.1. Роль молекул растворителя 40 2.1.2. Влияние значения рН среды 44 2.2. Разработка способов получения фазовых модификаций 45 2.2.1. Кристаллогидрат дигидрокверцетина 45 2.2.2. Аморфные формы дигидрокверцетина 48 Выводы по главе 51 ГЛАВА 3. Разработка системного подхода к исследованию фазовых модификаций 52 3.1. Химическое строение фазовых модификаций дигидрокверцетина 52 3.1.1. Хромофорная система 52 3.1.2. Функциональные группы и фрагменты 53 3.1.3. Молекулярная структура дигидрокверцетина 55 3.1.4. Родственные примеси и остаточные растворители 56 3.2. Структура твердой фазы модификаций дигидрокверцетина 3.2.1. Описание 62 62

3 3.2.2. Морфология 63 3.2.3. Кристаллическое и аморфное состояния 67 3.3. Физико-химические свойства фазовых модификаций дигидрокверцетина 76 3.3.1. Растворимость 77 3.3.2. Сорбционные свойства 78 Выводы по главе 83 ГЛАВА 4. Фрактальный анализ лиофилизатов дигидрокверцетина 4.1. Взаимосвязь морфологии и свойств лиофилизатов 84 84 4.1.1. Фракталы 84 4.1.2. Физико-химическая характеристика 88 4.2. Разработка и валидация методики фрактального анализа 89 Выводы по главе 91 ГЛАВА 5. Биофармацевтические свойства фазовых модификаций в условиях ex vivo 92 5.1. Дизайн эксперимента 94 5.1.1. Разработка методики количественного определения 94 5.1.2. Цитотоксические свойства 95 5.1.3. Оценка конфлюентности культуры клеток 99 5.2. Определение проницаемости фазовых модификаций дигидрокверцетина 100 Выводы по главе 102 ГЛАВА 6. Функциональные свойства фазовых модификаций дигидрокверцетина 6.1. Фармацевтико-технологические свойства 104 104 6.1.1. Таблетируемые массы на базе фазовых модификаций 105 6.1.2. Характеристики таблеток для рассасывания 108 6.2. Ранозаживляющие свойства в эксперименте in vivo 112 Выводы по главе 119

4 ГЛАВА 7. Материалы и методы исследования 7.1. Материалы 121 121 7.1.1. Объекты исследования 121 7.1.2. Реактивы, стандартные образцы, растворители 122 7.2. Оборудование 123 7.3. Методы эксперимента in silico 126 7.3.1. Построение виртуальных наночастиц 126 7.3.2. Расчет деформации наночастиц 126 7.3.3. Моделирование ионизации молекул дигидрокверцетина 127 7.3.4. Поля молекулярных взаимодействий 127 7.4. Методы морфологического анализа 127 7.4.1. Внешний вид 127 7.4.2. Микроскопия 127 7.4.3. Лазерная дифракция света 128 7.5. Методы физико-химического анализа 128 7.5.1. Спектрофотомерия в ультрафиолетовой области 128 7.5.2. Спектроскопия в инфракрасной области 128 7.5.3. Масс-спектрометрия 129 7.5.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 129 7.5.5. Хромато-масс-спектрометрия 129 7.5.6. Рентгеноструктурный анализ 131 7.5.7. Рентгеновская порошковая дифрактометрия 131 7.5.8. Термические методы анализа 132 7.5.9. Растворимость 133 7.5.10. Определение сорбционных свойств 134 7.6. Методы фрактального анализа 135 7.6.1. Синтез объектов исследования 135 7.6.2. Оптическая микроскопия 135 7.6.3. Расчет фрактальной размерности 136

5 7.7. Методы биофармацевтического анализа 136 7.7.1. Методика количественного определения дигидрокверцетина 136 7.7.2. Условия культивирования клеток 137 7.7.3. Оценка цитотоксичности 137 7.7.4. Оценка проницаемости 138 7.8. Методы фармацевтико-технологического анализа 140 7.8.1. Сыпучесть и прессуемость 140 7.8.2. Прочность на раздавливание 141 7.8.3. Прочность на истирание 141 7.8.4. Распадаемость 141 7.8.5. Тест «Растворение» 142 7.9. Методы фармакологического анализа 143 7.9.1. Условия содержания животных 143 7.9.2. Моделирование ожога IIIA степени 144 7.9.3. Методы лечения 144 7.9.4. Определение размеров ожога 144 7.9.5. Прочие физиологические тесты 145 7.10. Статистическая обработка данных 145 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 148 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 150 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 152 ПРИЛОЖЕНИЯ 169 Приложение А. Патент 169 Приложение Б. Акт внедрения (Сеченовский университет) 170 Приложение В. Акт внедрения (РНИМУ имени Н.И. Пирогова) 171 Приложение Г. Акт внедрения (АО «Аметис») 172 Приложение Д. Выписка из протокола заседания ЛЭК 173

6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. В XIV издание Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ XIV) впервые включена ОФС.1.1.0017.15 «Полиморфизм», в которой прописана обязательная оценка полиморфизма фармацевтических субстанций в тех случаях, когда он влияет на их терапевтическую эффективность и безопасность. В статье предусматривается контроль фазового лекарственного состояния препарата и действующего вещества регламентируются при методы разработке исследования полиморфных модификаций. Дигидрокверцетин (ДКВ) – флаванонол, производимый в промышленных масштабах в качестве фармацевтической субстанции из древесины Лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и Лиственницы даурской (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr., синоним Larix dahurica Turcz.). Несмотря на ограниченную биодоступность, это соединение обладает потенциалом в качестве основы для новых фитопрепаратов благодаря выраженным антиоксидантным свойствам и аффинности к различным биологическим мишеням. Таким образом, актуальность обусловлена возможностью улучшения характеристик ДКВ путем оптимизации его фазового состояния. Степень разработанности темы исследования. Комплексное изучение ДКВ было проведено в ИрИХ СО РАН под руководством Н.А. Тюкавкиной. В результате совместных исследований сотрудников Сеченовского университета (Н.А. Тюкавкина, Ю.А. Колесник, И.А. Селиванова), ВИЛАР (В.А. Быков, В.К. Колхир, Т.А. Сокольская), РНИМУ имени Н.И. Пирогова (Ю.О. Теселкин, И.В. Бабенкова) на базе ДКВ был создан препарат «Диквертин» антиоксидантного действия. В настоящее время изучается возможность использования ДКВ в качестве субстанции для разработки комбинированных лекарственных препаратов (М.Б. Плотников, В.Л. Белобородов, И.Р. Ильясов). Несмотря на общемировую тенденцию по оптимизации свойств флавоноидов путем изменения строения

7 твердой фазы, отраженную в работах M.J. Zaworotko, M. Sowa и D. Setyawan, вопрос влияния фазового состояния на свойства ДКВ ранее не рассматривался. Цель исследования – разработать способы получения фазовых модификаций ДКВ с улучшенными биофармацевтическими характеристиками, изучить природу твердой фазы и провести сопоставительный анализ их свойств. Задачи исследования: 1. Проанализировать современные тенденции в области модификации свойств флавоноидов посредством изменения их фазового состояния. 2. Сформулировать принципы, позволяющие направленно синтезировать фазовые модификации ДКВ. 3. Получить модификации ДКВ путем изменения его фазового исследованию фазовых состояния. 4. Разработать системный подход к модификаций ДКВ, охарактеризовать их с позиции полиморфизма, разработать и валидировать методики анализа. 5. Изучить биофармацевтические характеристики фазовых модификаций на модели ex vivo. 6. Сравнить прочностные профили характеристики высвобождения таблеток на действующего основе вещества различных и фазовых модификаций дигидрокверцетина. 7. Оценить взаимосвязь между фазовым состоянием ДКВ и его ранозаживляющими свойствами на модели ожога IIIA степени в эксперименте in vivo. Научная новизна. В результате проведенных исследований автором впервые: – использованы методы молекулярного моделирования in silico для поиска и предсказания свойств фазовых модификаций дигидрокверцетина; – синтезированы фазовые модификации ДКВ с повышенной растворимостью в воде при комнатной температуре: микротрубчатая (ДКВ т), микросфероидная (ДКВс) и микроволокнистая (ДКВв);

8 – расшифрована структура кристаллической ячейки ДКВт, которая депонирована в международной базе кристаллографических данных Cambridge Structural Database (Deposition Number: 1892198); – описана микроскопическая морфология фазовых модификаций ДКВ; – установлена псевдополиморфная природа двух фазовых модификаций ДКВ; – применены принципы фрактальной геометрии для разработки неразрушающей аналитической методики контроля качества лиофилизатов; – продемонстрирована корреляция между биофармацевтическими и фармакологическими свойствами фазовых модификаций ДКВ. Научная новизна исследования подтверждена патентом Российской Федерации № 2640413 от 09 января 2018 г. Теоретическая и практическая значимость работы. Доказана важность изменения фазового состояния действующего вещества как современного подхода к оптимизации свойств фармацевтических субстанций. Выявлена пролонгированном способность режиме, ДКВс что высвобождаться позволяет из рассматривать таблеток эту в фазовую модификацию в качестве перспективного объекта для разработки таблеток для рассасывания. Установлено повышение ранозаживляющего фармакологического эффекта ДКВт на 14,3% в сравнении с ДКВфс, что определяет целесообразность их дальнейшего изучения и последующего внедрения в качестве действующего вещества противоожоговых и ранозаживляющих лекарственных препаратов местного действия. Разработана методика автоматизированного неразрушающего контроля качества лиофилизатов посредством фрактального анализа, которая может послужить основой для реализации концепции Индустрии 4.0 в отечественном фармацевтическом производстве.

Рисунок 1 – Дизайн исследования фазовых модификаций ДКВ в трансляционном формате 9

10 Методология и методы исследования. Методологической основой данной работы является трансляционная модель исследования (Рисунок 1), включающая этапы молекулярного дизайна in silico, синтеза, отбора объектов-лидеров по ключевым характеристикам и дальнейшего сопоставительного анализа их свойств в условиях in vitro, ex vivo и in vivo. Основные положения, выносимые на защиту: – Способ получения микротрубчатой кристаллической модификации ДКВ с заданным размером частиц методом осаждения антирастворителем в присутствии мочевины. – Системный подход к проблеме идентификации фазового состояния ДКВ с позиции полиморфизма с помощью микроскопических, спектральных, рентгенографических и термических методов анализа. – Результаты комплексного трансляционного исследования фазовых модификаций ДКВ, включающие расчеты их свойств методом молекулярного моделирования in silico, анализ биофармацевтических параметров in vitro, и изучение фармако-токсикологических характеристик ex vivo и in vivo. – Методика фрактального анализа лиофилизатов на базе интеллектуальных технологий в тандеме с оптической микроскопией. – Валидационные характеристики неразрушающей методики определения предела содержания посторонних примесей в лиофилизированных субстанциях: специфичность, предел обнаружения, правильность, сходимость и устойчивость. Достоверность научных экспериментальных комплексным данных характером инструментальных выполненными и методов на положений и выводов. сформулированных выводов Достоверность определяется работы, использованием современных анализа, многократными измерениями, сертифицированном поверенном оборудовании, статистической обработкой данных и валидацией разработанных методик. Апробация результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на 11 th World Congress on Polyphenols Applications (Вена, 2017), XI International Conference on Chemistry for

11 Young Scientists «Mendeleev-2019» (Санкт-Петербург, 2019), XXI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 2019), Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва; 2015, 2018), Международном молодежном научном медицинском форуме «Белые цветы» (Казань; 2016, 2019), XIX Международной конференции студентов и молодых ученых «Студенческая медицинская наука XXI века (Витебск; 2019), Ежегодном Саммите молодых ученых и инженеров «Большие вызовы для общества, государства и науки» (Сочи; 2019), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Инновации в здоровье нации" (Санкт-Петербург; 2016), Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциал будущего» (Санкт-Петербург; 2018, 2019, 2020), Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва; 2018, 2019, 2020). Апробация диссертационной работы состоялась «29» января 2021 г. на совместном заседании кафедр химии, фармацевтической и токсикологической химии имени А.П. Арзамасцева, фармацевтического естествознания и фармакологии Института фармации имени А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет). Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выполнении информационно-поисковых и экспериментальных исследований, в анализе, интерпретации и обобщении полученных данных. При активном участии соискателя сформулированы положения и выводы диссертационной работы, подготовлены публикации по теме исследования. Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры химии ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России, в производственный процесс АО «Аметис», и используются в научно-исследовательской деятельности Отдела медицинской биофизики НИИ трансляционной медицины ФГБОУ ВО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России.

12 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения, изложенные в диссертационной работе, соответствуют формуле паспорта специальности 14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия», а именно пунктам 1, 2, 3 области исследования. Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в рамках плана и в соответствии с тематикой научно-исследовательской работы на кафедре химии ФГАОУ ВО Первого МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет) по теме «Разработка подходов к анализу, стандартизации, оценке качества, и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, медицинских изделий (технологические и экологические аспекты)». Публикации. По теме диссертационной работы опубликована 31 печатная работа, в том числе 5 статей в журналах Перечня рецензируемых изданий Университета, 7 статей в журналах, индексируемых в международных базах данных, и 1 патент РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и иллюстрирована 63 рисунками. Текст диссертации состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, посвященных обсуждению результатов исследования, экспериментальной части, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложения. Библиография включает 186 источников, в том числе 148 на иностранном языке.

13 ГЛАВА 1. Фазовые модификации флавоноидов (обзор литературы) В 1948 году J.C. Pew впервые описал получение из древесины Дугласовой пихты (Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco, более известной как Pseudotsuga taxifolia Britton) природного флаванонола ДКВ – 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2(3,4-дигидроксифенил)-4Н-1-бензопиранона-4 (Рисунок 1.1). По названию растительного сырья H. Erdtman предложил именовать новое соединение таксифолин, и именно под таким названием оно, преимущественно, известно в англоязычной научной литературе [134]. Рисунок 1.1 – Молекулярная структура ДКВ Результаты многолетних научно-исследовательских и опытно- конструкторских изысканий, выполненных советскими и российскими учеными, были успешно коммерциализированы и послужили основой для формирования рентабельного наукоемкого промышленного производства [1; 2; 10; 25; 31; 98; 166]. Благодаря надежной ресурсно-сырьевой базе в виде древесины Лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и Лиственницы даурской (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr., синоним Larix dahurica Turcz.), Россия является крупнейшим в мире экспортёром данного природного соединения [158]. ДКВ характеризуется широким спектром биологической активности в сочетании с высоким профилем безопасности и поэтому давно привлекает внимание научного сообщества как объект разработки лекарственных средств [18;

14 45; 124; 144; 157]. Вместе с тем многие исследователи отмечают, что низкая биологическая доступность ДКВ является одним из основных затруднений, ограничивающих разработку новых фитопрепаратов на его основе, что в целом характерно для флавоноидов [43; 163; 182; 184]. В связи с этим, представляло интерес проанализировать тенденции в области модификации биофармацевтических свойств флавоноидов. Как известно, в основе структуры этих природных полифенолов лежит дифенилпропан [12; 102; 103]. С химической точки зрения, они представляют собой конденсированную систему бензольного и гетероциклического колец, и связанный с ней боковой фенильный радикал [33]. Базовые структуры групп флавоноидов представлены на Рисунке 1.2. Рисунок 1.2 – Базовые структуры флавоноидов [33] Несмотря на неослабевающий интерес научного и медицинского сообщества к флавоноидам, обусловленный их выраженными антиоксидантными свойствами, широким спектром фармакологической активности, а также экологичностью и благоприятным соотношением «затраты-эффективность» при

15 промышленном производстве [140], создание новых фитопрепаратов на основе этих соединений затрудняется необходимостью оптимизации их биодоступности. Данная задача решается путем разработки более совершенных лекарственных форм [54; 181], получения твердых дисперсий [89; 174] и полусинтетических субстанций [44; 106]. Модификация физико-химических и биофармацевтических параметров флавоноидов посредством изменения фазового состояния и образования аморфных и коаморфных форм, полиморфов и кокристаллов является сравнительно молодым направлением исследований, которым занимается прикладной раздел супрамолекулярной химии, получивший название «инженерия кристаллов» [63]. Цель данного обзора – анализ тенденций в области модификации свойств флавоноидов через изменение их фазового состояния. 1.1. Стратегия литературного поиска и общая характеристика статей Аналитический обзор литературы выполнен в соответствии с руководством Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses (PRISMA) [121]. Исследование проведено на базе агрегаторов научных публикаций eLibrary, Google Scholar, PubMed. Анализировали литературные источники на русском и английском языках, опубликованные за период с 2000 по 2019 год. Стратегия поиска заключалась в сочетании ключевого слова «флавоноид» с одним из следующих терминов: «инженерия кристаллов», «полиморфизм», «кокристалл». На формализованном языке математической логики данный запрос был сформулирован следующим образом: “flavonoid” AND (“сrystal engineering” OR “polymorphism” OR “cocrystal”). Обнаруженные статьи подвергали скринингу, основанному на резюме публикаций, в ходе которого из дальнейшего исследования исключали работы обзорного характера, результаты исследований, опубликованные не на русском или английском языках, а также публикации, непосредственно не связанные с фазовой модификацией флавоноидов. Во избежание пропуска значимых

16 источников, учитывали список литературы из обзоров. Содержание отобранных статей тщательно изучали. Из 1239 статей, найденных в ходе первичного сбора данных с последующим удалением повторов, 1193 публикации были исключены из дальнейшего анализа при ознакомлении с их резюме. После изучения полных текстов оставшихся 43 статей были отброшены еще 2 публикации по причине воспроизведения ранее описанных методик супрамолекулярных синтезов. Алгоритм отбора статей из информационных ресурсов представлен на Рисунке 1.3 Рисунок 1.3 – Блок-схема процесса отбора статей согласно рекомендациям PRISMA Начиная с 2009 года наблюдается экспоненциальный рост числа статей по модификации физико-химических свойств флавоноидов путем их фазовой

17 модификации (Рисунок 1.4), что подчеркивает актуальность данного направления для фармацевтической науки. Крупнейшие научные центры, работающие в этой области, расположены в Индонезии (Университет Аирлангга, Сурабая) [50; 142; 143], США (Университет Южной Флориды, Тампа) [94; 95; 147-149] и Польше (Вроцлавский Технологический Университет) [150-154]. Это обусловлено исторически сложившимся интересом перечисленных организаций к разработке лекарственных препаратов на базе флавоноидов. Рисунок 1.4 – Кумулятивный рост числа публикаций, посвященных фазовым модификациям флавоноидов Структуры и названия по заместительной номенклатуре флавоноидов, используемых в качестве основы для синтеза новых фазовых модификаций, представлены на Рисунке 1.5.

18 Рисунок 1.5 – Структуры флавоноидов, подвергнутых фазовой модификации

19 1.2. Изменение фазовых состояний флавоноидов 1.2.1. Дизайн и способы получения Дизайн. В ходе рационального дизайна фазовых модификаций флавоноидов фундаментальное значение имеет поиск потенциальных сайтов связывания между компонентами твердой фазы – межмолекулярных синтонов. Таким образом, одной из классических концепций поиска новых фазовых модификаций является контент-анализ международной базы кристаллографических данных Cambridge Structural Database, реализованный в программном обеспечении, типа Mercury [76; 118]. В структуре флавоноидов присутствуют фенольные и вторичные спиртовые гидроксильные группы, выступающие в качестве кислотных центров, а также карбонильные функциональные группы, являющиеся основными центрами, что обуславливает склонность данных молекул к образованию водородных связей и, как следствие, межмолекулярных синтонов (Рисунок 1.6). Рисунок 1.6 – Частотность межмолекулярных синтонов в кристаллах флавоноидов

20 На основании наличия функциональных групп в молекулах, можно рассчитать вероятность образования супрамолекулярных комплексов. Эта идея осуществляется посредством различных дискрипторов, аналогичных моделям quantitative structure–activity relationship (QSAR) и quantitative structure–property relationship (QSPR) [11; 38; 73]. Таким образом был успешно оптимизирован дизайн синтеза ряда кокристаллов кверцетина, гесперетина, галлата эпигаллокатехина [94; 147] и байкалеина [154]. Альтернативный подход к рациональному дизайну фазовых модификаций предполагает расчет энергии образования новой твердой фазы. Он реализуется в программе COSMO-RS [113; 126], в основе алгоритмов которой лежит уравнение: ΔG° = ΔGmix + ΔGfus, (1.1) где ΔG° – изменение стандартной энергии Гиббса формирования твердой фазы, ΔGmix – изменение энергии Гиббса образования супрамолекулярного комплекса, ΔGfus – изменение энергии Гиббса при растворении компонентов твердой фазы. Поскольку в процессе получения фазовых модификаций система переходит из одного упорядоченного состояния в другое, то ΔGfus стремится к нулю. В то же время, энтропией в кристаллах также можно пренебречь, поэтому расчет ΔG° сводится к формуле: ΔG° = ΔНmix, (1.2) где ΔНmix – изменение энтальпии образования супрамолекулярного комплекса. Данное уравнение является методологической основой для скрининга потенциальных компонентов новых фазовых модификаций, как посредством расчета ab initio, так и методами молекулярной динамики, реализованными, в частности в пакете программ Shrödinger. Подобным образом были предсказаны структуры и успешно синтезированы кокристаллы кверцетина и нарингенина [100]. Применение молекулярного моделирования позволяет оптимизировать экономические и временные затраты для поиска новых фазовых модификаций. Тем не менее, согласно литературным данным, методы in silico в оптимизации свойств флавоноидов пока применяются редко.

21 Способы получения. Подходы к получению новых фазовых модификаций в лабораторных условиях [90; 101], в зависимости от использования растворителя, можно классифицировать на твердофазный и жидкофазный супрамолекулярный синтез. Методы твердофазного синтеза включают гриндинг и его модификацию дроп-гриндинг, а также экструзию горячего плава.  Гриндинг. От английского «grinding» – «измельчение», «дробление», «перемалывание». Данный метод твердофазного супрамолекулярного синтеза является базовым подходом механохимии [79], суть которого заключается в повышении удельной энергии поверхности вещества, достигаемой за счет перетирания субстанции. Это приводит к увеличению реакционной способности молекул, находящихся на внешнем слое твердой фазы и, как следствие, к спонтанному фазовому переходу.  Дроп-гриндинг. От английского «drop» – «капля». Данная модификация предыдущего метода супрамолекулярного синтеза отличается постепенным добавлением по каплям небольшого количества растворителя. При этом жидкая фаза, выступая в качестве вспомогательного компонента, проникает за счет капиллярных сил в микротрещены на поверхности твердых частиц перетираемого вещества и воздействует изнутри расклинивающими силами.  Экструзия горячего плава. Метод широко применяется в химии полимеров и предполагает расплавление основного компонента будущей новой твердой фазы и смешивание его с остальными компонентами. Этот процесс осуществляется в шнековом экструдере [91]. Данные технологические подходы объединяет простота исполнения и потенциальная масштабируемость процесса. В то же время твердофазные методы характеризуются достаточно высокими энергетическими затратами и проблемами с очисткой продукта супрамолекулярного синтеза. Тем не менее, таким образом, были успешно получены кокристаллы кверцетина [50; 171; 173] , гесперетина [58] и физетина [153], мирицетина [125; 152] и генистеина [150], а также коаморфная форма нарингина [123].

22 Методы жидкофазного супрамолекулярного синтеза, в зависимости от действий, приводящих к формированию осадка, можно классифицировать на подходы, связанные с уменьшением количества растворителя, и технологические приемы, основанные на изменении растворимости будущих компонентов твердой фазы. К первой подгруппе относятся медленное выпаривание и выпаривание на роторном испарителе.  Медленное выпаривание. супрамолекулярного Сущность синтеза этого заключается в метода жидкофазного постепенном переходе легколетучего растворителя из жидкой фазы в окружающую газообразную среду при комнатной температуре. Это приводит к образованию пересыщенного раствора и, как следствие, к выпадению осадка. Данный метод очень прост в исполнении, не требует дополнительных затрат и поэтому находит широкое применение в синтезе фазовых модификаций флавоноидов. Таким образом были получены кокристаллы кверцетина [80; 100; 111; 143; 149] кемпферола, лютеолина [114; 153], хризина, байкалеина [83; 154], генистеина [150; 180], физетина [151], гесперетина, мирицетина [82; 152], аромадендрина [175] и псевдополиморфы мирицетина [72]. К недостаткам описанного способа можно отнести длительность процесса – вплоть до недели и более.  Выпаривание на роторном испарителе. Данная методика призвана решить недостаток предыдущего способа жидкофазного синтеза и ускорить процесс концентрирования. К сожалению, часто это приводит к образованию плавов и, как следствие, вновь к длительным ожиданиям. Тем не менее, так были синтезированы кокристаллы кемпферола [156], кверцетина [142] и лютеолина [114], а также аморфная модификация кверцетина [170] и коаморфная форма мирицетина [177].  Электрораспыление. Одной из тенденций последних лет становится постепенный отказ от классических методов супрамолекулярной химии в сторону более электрораспыление. высокотехнологичных В 2018 году этим подходов, способом были например, получены

23 кокристаллы кверцетина с кофеином, растворимость которых в 14,44 раза превышала характеристики исходной субстанции [130]. Во второй подгруппе жидкофазных методов супрамолекулярного синтеза можно выделить вымораживание, осаждение, и сонокристаллизацию.  Вымораживание. Данный метод базируется на способности веществ снижать растворимость параллельно с уменьшением температуры окружающей среды. Несмотря на ощутимые энергетические затраты, вымораживание было успешно применено при синтезе кокристаллов кверцетина, гесперетина и галлата эпигаллокатехина [94; 147].  Осаждение. Этот подход основан на свойстве веществ растворяться в различных соотношениях в зависимости от растворителя [91]. Таким образом, в процессе изменения состава жидкой фазы происходит постепенное образование пересыщенного раствора, что, в итоге, приводит к выпадению осадка. Данный метод имеет множество модификаций в зависимости от природы используемого антирастворителя. Для этой цели применяют как широко используемые растворители, например, диметилсульфоксид (ДМСО) [27], так и суперкритические, такие как жидкий диоксид углерода [186].  Сонокристаллизация. Как и электрораспыление, эта методика применяется сравнительно недавно и основана на воздействии ультразвуковыми волнами на насыщенный раствор вещества [139]. Искривления пространства, обусловленные прохождением звука сквозь жидкую фазу, приводят к образованию твердой фазы. Таким способом были получены кокристаллы мирицетина [109; 137] и байкалеина [107]. Интересно отметить, что более чем в половине исследований в качестве исходных объектов использовали флавонолы и флавоны, в то время как на долю флаванонолов приходилось только 15,0% (Рисунок 1.7).

24 Рисунок 1.7 – Распределение по группам флавоноидов, подвергнутых фазовой модификации В итоге, можно утверждать, что, несмотря на широкий набор методов супрамолекулярного синтеза фазовых модификаций, флаванонолы и, в частности, ДКВ редко применяли в поисковых исследованиях, и поэтому данное соединение является перспективным объектом для изучения. 1.2.2. Методы анализа Установление субстанции является природы одним новой из синтезированной критически важных фармацевтической этапов разработки лекарственных препаратов, поскольку исходя из свойств вещества формируется комплекс качественных и количественных методов анализа для подтверждения его подлинности и соответствия нормативной документации. Полиморфизм как частный случай фазовой модификации подлежит контролю со стороны регуляторных органов в фармацевтической области, поскольку фазовые переходы могут приводить к изменению фармакологических параметров действующего вещества. Указания на возможность наличия полиморфов у фармацевтических субстанций и соответствующие статьи имеются в государственных фармакопеях Японии [161], Европы [68], США [162]. Рекомендации Food and Drug Administration (FDA) включают более широкий спектр объектов, указывая на методы контроля качества аморфных, сольватных и гидратных форм [78]. На данный момент наиболее полный список фазовых модификаций представлен в

25 проекте фармакопейной статьи международной фармакопеи, в котором, помимо прочего, указаны кокристаллы и псевдополиморфные модификации [65]. Интересно отметить, что в ГФ РФ XIV для гидратов, являющихся частным случаем псевдополиморфов, имеются отдельные фармакопейные статьи. Кроме того, в данном своде регуляторных норм впервые вводится ОФС.1.1.0017.15 «Полиморфизм». В качественный количественный и ней приведены методы, анализ позволяющие фармацевтических проводить субстанций, обладающих одинаковым молекулярным строением вещества, но различающихся формой твердой фазы [8]. Согласно данному документу, для этих целей можно использовать рентгенодифракционные, спектральные, термоаналитические, микроскопические, биологические методы анализа и оценку растворимости. Рентгенодифракционный анализ для фазовых модификаций флавоноидов использовали в формате рентгеноструктурного анализа (РСА) и рентгеновской порошковой дифрактометрии (РПД).  РСА. Метод позволяет получить наиболее полную и достоверную информацию о строении твердой фазы, включая компоненты кристаллической ячейки, их взаимное пространственное расположение и конфигурацию центров хиральности. Данный метод использовали в анализе 53,7% фазовых модификаций флавоноидов [56; 58; 59; 80; 94; 95; 111; 137; 148-153; 156; 171; 180]. Тем не менее, ОФС на РСА в РФ пока не разработана. Важно отметить, что качество результатов РСА сильно зависит от параметров исследуемого монокристалла, так как не всегда удается обеспечить требуемый размер и степень кристалличности вещества. Часто подобные кристаллы выращивают в среде перенасыщенного раствора, в связи с чем полученная структура кристаллической ячейки принадлежит не индивидуальным флавоноидам, а их сольватам. Так, в ходе РСА Kavuru продемонстрировала, что при выращивании кристаллов кверцетина в различных растворителях получаются псевдополиморфные формы флавонола, характеризующиеся специфичным строением твердой фазы [94]. Дигидрат кверцетина состоял из множества плоских слоев димеров

26 (Рисунок 1.8А), сольват с пиридином образовывал последовательные цепочки димеров (Рисунок 1.8В), а кокристалл с ацетоном формировался за счет сложной трехмерной структуры с молекулами растворителя, включенного в полости флавоноида (Рисунок 1.8С). А B C Рисунок 1.8 – Структуры кристаллических ячеек псеводполиморфных модификаций кверцетина: А – дигидрат, B – пиридиновый сольват, C – ацетоновый сольват [94]  РПД. Данным методом исследуют порошок вещества. Эту информацию можно использовать в качестве «отпечатков пальцев» для идентификации твердой фазы (допустимое отклонение пиков составляет ±0,2°). Кроме того, согласно ОФС.1.2.1.1.0011.15 «Рентгеновская порошковая дифрактометрия», метод пригоден для количественного анализа и оценки степени кристалличности вещества [8]. Часто РПД позволяет судить об успешности супрамолекулярного синтеза в процессе инженерии кристаллов флавоноидов, что показано, например, работе Muresan-Pop и соавт. Появление новых пиков в профиле дифрактограммы доказывало успешное образование новой фазовой модификации мирицетина (Рисунок 1.9) [125]. Благодаря экспрессной методике и простоте исполнения, РПД использовали в анализе более 80% фазовых модификаций флавоноидов.

27 Рисунок 1.9 – Дифрактограммы ацетамида (черный), мирицетина (красный) и их кокристалла (синий) [125] Несмотря на то, что методы дифракции рентгеновских лучей являются «золотым стандартом» в физике твердого тела, известны случаи, когда результаты анализа не позволяли корректно интерпретировать имеющиеся данные в отсутствии более комплексного подхода к исследованию вещества [92]. Термоаналитические методы занимают второе место по частотности применения в исследованиях фазовых модификаций флавоноидов. Эта группа методов включает дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) и термогравиметрический анализ (ТГА).  ДСК. Метод предполагает нагрев и охлаждение анализируемой субстанции. В ходе этих операций происходит измерение энергетических явлений в сравнении с пустой кюветой. Наличие экзо- и эндотермических эффектов позволяет судить о существовании фазовых переходов между различными формами вещества и тем самым установить природу вещества [138]. Для этих целей, согласно ОФС.1.2.1.0027.18 «Термический анализ», рекомендуется использовать ДСК [8]. Как и РПД, данный метод широко применяется в анализе фазовых модификаций флавоноидов – в 68,2% случаев. Этим методом Borghetti и соавт. доказали, что на рынке

28 фармацевтических субстанций в 2012 году находились в обращении по крайней мере три фазовые модификации кверцетина [56]. По положению и числу экзотермических пиков на термограммах анализируемых образцов флавонола можно сделать вывод, что они относятся к кристаллогидратам с различным строением кристаллической ячейки (Рисунок 1.10). Рисунок 1.10 – Термограммы трех псеводополиморфных модификаций кверцетина: форма a (черный), форма b (красный), форма с (синий) [56]  ТГА. В случае ТГА анализу подвергаются не тепловые явления, а масса. Метод дополняет ДСК и позволяет выстраивать более обоснованные суждения о природе обнаруженных фазовых переходов. Например, в публикации Zhang и соавт. [180] на основании результатов ТГА кокристаллов генистеина с бипиридином выраженный эндотермический эффект было установлено, что при 273,9 °С на термограмме продукта супрамолекулярного синтеза связан с разложением фазовой модификации, что подтверждается последующим уменьшением массы анализируемого образца (Рисунок 1.11). Кроме того, ОФС.1.2.1.0027.18 «Термический анализ» рекомендует использовать ТГА для контроля чистоты вещества [8]. Однако, в силу ограниченности, для количественного

29 анализа он не подходит [135]. Этот метод использовали в ходе исследований 31,7% фазовых модификаций флавоноидов [56; 72; 80; 83; 109; 125; 150-152; 173; 175; 180]. Рисунок 1.11 – Результаты ТГА (синий) и ДСК (красный) кокристаллов генистеина с бипиридином [180] Интересно отметить, что термоаналитические приборы в последнее время все чаще используют в тандеме с другими методами исследования, такими как РПД и масс-спектрометрия, с целью получения информации о структуре и свойствах не только твердой фазы, но и продуктов фазового перехода, однако для анализа фазовых модификаций флавоноидов подобные комбинации не были описаны. Спектральные методы включают спектроскопию в инфракрасной области (ИК-спектроскопия), рамановскую спектроскопию и спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в твердой фазе.  ИК-спектроскопия. Как и РПД, данный метод позволяет идентифицировать фазовое состояние вещества по «отпечаткам пальцев» и рекомендован ОФС.1.2.1.1.0002.15 «Спектрометрия в инфракрасной области» [8]. Таким образом, были описаны 48,7% фазовых модификаций флавоноидов [50; 80; 82; 114; 115; 123; 130; 142; 156; 164; 171; 173; 175; 180]. Очень часто этот метод используют в качестве экспресс теста для подтверждения успешности

30 образования новой фазовой модификации, сравнивая спектры продукта с исходными реагентами и их физической смесью (Рисунок 1.12). Например, в работе Athiyah был доказан успешный синтез кокристалла кверцетина с янтарной кислотой [50]. Кроме того, с помощью ИК-спектроскопии можно установить наличие водородных связей, участвующих в формировании твердой фазы [138]. Рисунок 1.12 – ИК-спектры кверцетина (A), янтарной кислоты (B), их механической смеси (C) и кокристаллов (D) [50]  Рамановская спектроскопия. Данный аналитический подход является неразрушающим методом и, в отличии от ИК-спектроскопии, основан на отражении рамановского излучения молекулами вещества. Полученный спектр также позволяет идентифицировать фазовое состояние вещества по «отпечаткам пальцев». Например, в работе Sowa и соавт. [150] рамановский спектр кокристалла генистеина и кофеина имел качественные отличия от исходных реагентов (Рисунок 1.13). Тем не менее, несмотря на ряд преимуществ спектрометрия», и рекомендации ввиду меньшей ОФС.1.2.1.1.0009.15 распространенности «Рамановская приборного оборудования в химических лабораториях, этот метод используется не часто [8].

31 А B Рисунок 1.13 – Рамановские спектры: C – кокристалл генистеина с кофеином [150]  C А – генистеин, B – кофеин, ЯМР в твердой фазе. Этот метод является одним из самых современных, чувствительных и информативных и обеспечивает проведение качественного и количественного анализа фазовых модификаций [8]. Согласно нашим данным, в центрах коллективного пользования России отсутствует возможность проведения подобных исследований. Несмотря на дороговизну оборудования, данный метод был использован в анализе каждой пятой новой твердой формы флавоноидов, синтезированных за рубежом, как например, для кокристаллов гесперетина с никотинамидом (Рисунок 1.14) в работе Vasisht и соавт [171]. B А C 13 Рисунок 1.14 – Спектры ЯМР С в твердой фазе: А – гесперетин, B – никотинамид, C – кокристалл гесперетина с никотинамидом [171] Морфологический анализ, выполненный посредством различных микроскопических методов, предоставляет информацию о геометрическом

32 строении твердой фазы, что может быть использовано для идентификации фазовых модификаций. Оптическая микроскопия, условия выполнения которой регулируются ОФС.1.2.1.0009.15 «Оптическая микроскопия», является наименее ресурсозатратным аналитическим методом [8]. Помимо этого, известны случаи успешного использования поляризационной оптической микроскопии, флуоресцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для идентификации и описания фазовых модификаций флавоноидов [69; 80; 132]. Так, в работе Liu и соавт. при помощи СЭМ было установлено, что в ходе сонокристаллизации образуются нанокристаллы мирицетина (Рисунок 1.15) [109]. А B Рисунок 1.15 – Микрофотографии фазовых модификаций мирицетина: А – исходная субстанция, B – нанокристаллы [109] Растворимость используется в фармацевтическом анализе как критерий подлинности и чистоты фармацевтических субстанций. Однако, фазовые модификации характеризуются различной растворимостью. Наблюдаемое противоречие объясняет теория «эффекта потока и парашюта» (“spring and parachute” effect) [53]. Согласно данной концепции, в процессе растворения образуется пересыщенный раствор за счет формирования метастабильных супрамолекулярных ассоциатов между молекулами компонентов твердой фазы и растворителя (эффект «потока»). В свою очередь, в соответствии с законом Оствальда, кинетика перехода из пересыщенного раствора в насыщенный с выпадением осадка может быть замедлена – эффект «парашюта». Поэтому фазовые модификации идентифицируют по скорости и полноте растворения твердой фазы, что наглядно подтверждает частотность подобных методик в

33 анализе новых форм флавоноидов – 63,6% случаев [50; 58; 59; 72; 82; 107; 109; 111; 115; 125; 130; 142; 143; 151; 171; 175]. Так, например, в публикации Franklin и соавт. указано, что растворимость двух кристаллогидратов мирицетина различалась более чем в 5 раз [72]. При этом на профиле растворения для более высоко растворимой модификации отчетливо виден резкий пик, обусловленный эффектом «потока» с последующим постепенным уменьшением концентрации вещества в растворе – эффект «парашюта» (Рисунок 1.16). Рисунок 1.16 – Профили растворения двух кристаллогидратов мирицетина [72] Другие физико-химические свойства также могут служить для идентификации фазовых модификаций. Так, Государственная фармакопея Японии допускает идентификацию полиморфов посредством анализа адсорбционнодесорбционного гистерезиса [161]. Известны случаи, когда кокристаллы обладали различными люминесцентными свойствами и способностью к таблетированию [62; 160]. Таким образом, научная литература и нормативная документация предоставляет широкий спектр аналитических подходов для исследования строения твердой фазы фармацевтических субстанций. Важно понимать, что использование одного метода повышает риск неверной интерпретации результатов анализа [55; 92]. Поэтому при исследовании фазовых модификаций необходимо использовать комплексный подход.

34 1.2.3. Фармакологические исследования В ходе фазовой модификации химическая структура действующего вещества не изменяется, поэтому с точки зрения фармакодинамики фазовые модификации, как правило, идентичны. Однако данные объекты представляют интерес для другого раздела фармакологии – фармакокинетики, поскольку можно ожидать различий в биологической доступности фазовых модификаций. В последнее время исследователи фокусируют внимание на оценке биологической доступности фазовых модификаций флавоноидов в условиях in vivo на экспериментальных животных. Результаты контент-анализа публикаций, посвященных данной теме, представлены в Таблице 1.1. В статье 2011 года Smith и соавт. описали повышение биологической доступности флавоноида более чем в 10 раз, используя кокристаллизацию кверцетина с теобромином [149]. Важно отметить, что иногда повышение биодоступности может быть достигнуто посредством снижения растворимости флавоноида в воде. Этот факт был продемонстрирован Smith и соавт. в работе 2013 года на примере кокристаллов эпикатехина с изоникотиновой кислотой [147]. Таблица 1.1 – Повышение биодоступности флавоноидов путем их фазовой модификации Площадь под кривой, мкг•ч/мл Увеличение биологической Объект исходный фазовая Ссылка доступности исследования флавоноид модификация флавоноида, × раз флавоноида 23,94 147,59 6,16 [107] Байкалеин 74,96 209,67 2,80 [83] Гесперетин 2,11 3,39 1,60 [58] 7,79 13,63 1,75 [171] Кверцетин 0,12 1,24 10,33 [149] Кемпферол 39,55 178,68 4,52 [80] Лютеолин 3,06 4,42 1,44 [114] Мирицетин 3,88 11,51 2,97 [109] Эпикатехин 0,66 0,91 1,37 [147] Вместе с тем, не стоит забывать, что целью проведения подобных научноисследовательских работ является не столько повышение биологической доступности флавоноидов, сколько достижение ими терапевтических эффектов за

35 счет потенциальных фармакологических свойств. Подобных исследований, на данный момент, проведено значительно меньше. Так Zhang и соавт. получили кокристаллы генистеина с бипиридином [180]. В ходе эксперимента in vitro на основании расширения зоны задержки роста условно патогенной микрофлоры выявлено увеличение антибактериальной активности кокристалла до 39% в сравнении с исходным флавоноидом. Другой пример подобных исследований описан в публикации Chadha и соавт. [58]. В результате оценки противовоспалительных свойств кокристаллов гесперетина с кофеином на модели экспериментальных животных установлено, что выраженность фармакологического эффекта повысилась на 43,4% по сравнению с исходной субстанцией. Также интересно упомянуть работу Liu и соавт. В результате кокристаллизации кверцетина с пиразинамидом, применяемым в качестве противотуберкулезного средства, на модели экспериментальных животных наблюдали значительное снижение гепатотоксического эффекта не флавоноидного компонента твердой фазы [111]. Важно подчеркнуть, что все вышеописанные исследования относятся к доклинической фазе разработки лекарственных препаратов. В базах данных клинических исследований ВОЗ и FDA на данный момент отсутствует информация о проведении испытаний фазовых модификаций флавоноидов с привлечением пациентов [60; 84]. Однако следует отметить, что научное сообщество вплотную приблизилось к этому критическому шагу, успешное прохождение которого позволит внедрить результаты фундаментальных исследований в реальную клиническую практику. Так, 18 февраля 2020 года группа ученых из Рейнского Боннского университета имени Фридриха Вильгельма объявила о старте пилотного рандомизированного плацебоконтролируемого исследования E-Pip-Pilot, целью которого является оценка возможности повышения биодоступности эпикатехина и галлата эпигаллокатехина при совместном приеме с пиперином [66]. Успех немецких ученых может послужить прецедентом, способствующим более активному изучению кокристаллов флавоноидов и их фазовых модификаций в целом.

36 Можно констатировать, сравнительно недавно что в отработаны результате научных исследований химические методы, позволяющие синтезировать фазовые модификации флавоноидов. На данный момент начаты работы по проведению оценки их потенциальных фармакологических преимуществ в сравнении с исходными субстанциями. 1.3. Оптимизация фазового состояния дигидрокверцетина Первые работы, посвященные изучению фазового строения ДКВ, были осуществлены на государственном стандартном образце (ГСО) ДКВ под руководством проф. Тюкавкиной Н.А. [4; 24]. При помощи комплекса методов, включающих РСА и термические методы анализа, было установлено, что данный объект является кристаллогидратом. Полученные результаты послужили теоретической базой для направленных исследований по модификации свойств ДКВ путем изменения его фазового состояния. Исторически наиболее ранним способом повышения биологической доступности ДКВ через увеличение его растворимости в воде был синтез хелатных комплексов. В научных публикациях описаны соли флавоноида с катионами железа(II), меди(II), кальция и цинка [14; 29; 30]. Однако дальнейшие исследования данных объектов не проводились, что связано, по-видимому, с неустойчивостью хелатных комплексов в биологических жидкостях организма и с токсическим действием тяжелых металлов. Для преодоления обозначенной проблемы и сохранения исходной молекулярной структуры природного вещества в течение последнего десятилетия велись разработки твердых дисперсий на базе ДКВ. Суть данной технологии заключается в растворении кристаллического вещества в полимере, что должно приводить к увеличению растворимости и биодоступности флавоноида. В качестве вспомогательного вещества по отношению к ДКВ были опробованы полисахариды, такие как арабиногалактан [26], хитозан [51], циклодекстрины [179; 185] и некоторые полимеры другой химической природы, например, поливинилпирролидон [146]. Во всех приведенных публикациях

37 исследователи отмечали улучшение профиля растворимости. Однако эксперимент in vivo по оценке изменения биологической доступности был проведен только для твердой дисперсии супрамолекулярного ДКВ с γ-циклодекстрином комплекса отмечено в ходе увеличение которого площади у под фармакокинетической кривой в 7 раз по сравнению с исходной субстанцией [179]. Наряду с изучением твердых дисперсий изменение физико-химических свойств флавоноидов осуществляли путем модификации их фазового состояния без использования полимеров. Часто новые субстанции характеризовались специфической морфологией. Так, в 2008 году Тараховским и соавт. был опубликован способ получения микроволокон ДКВ путем осаждения антирастворителем [27]. Исходную фармацевтическую субстанцию растворяли в ДМСО, а затем в полученный маточный раствор добавляли избыток воды при интенсивном перемешивании. Новая фазовая модификаций ДКВ получена в форме суспензии. В ходе оптической и электронной микроскопии было установлено, что в составе гетерогенной системы присутствовали: прямоугольные кристаллы шириной 10 – 15 мкм и длиной до 100 мкм, волокна, размеры которых составляли 1 мкм и 40 мкм и нанотрубки с диаметром 50 – 80 нм. В 2012 году Zu и соавт. сообщили о получении микронизированного ДКВ [184]. Спиртовой раствор флаванонола впрыскивали в сжиженный углекислый газ, который вытеснял ДКВ из раствора-носителя, что позволило отфильтровать биофлавоноид в виде осадка. Примечательно, что снижение температуры антирастворителя и повышение давления его подачи, уменьшение концентрации ДКВ в спиртовом растворе и снижении скорости смешивания двух жидкостей приводили к уменьшению размера частиц флаванонола. В ходе анализа микронизированного ДКВ методом ИК-спектроскопии было установлено наличие небольших различий в диапазоне от 3600 до 2400 см-1, а также увеличение интенсивности полос поглощения в этой области для новой фазовой модификации. Согласно данным РПД и ДСК новая форма ДКВ являлась безводной аморфной субстанцией. Микронизированный ДКВ обладал в 4 раза большей растворимостью в сравнении с исходной формой. Однако результаты

38 дальнейших исследований этих объектов в научной литературе обнаружены не были. Таким образом, ДКВ мало изучен с позиций инженерии кристаллов и представляет интерес в качестве объекта для получения фазовых модификаций. Выводы по главе  Описана успешная мировая практика улучшения физико-химических параметров флавоноидов посредством оптимизации их фазового состояния.  Продемонстрирована эффективность современных компьютерных методов in silico при проведении поисковых исследований по разработке новых фазовых модификаций флавоноидов.  Установлены методы синтеза фазовых модификаций, различающиеся технологическим уровнем и успешно апробированные на флавоноидах.  Отмечена необходимость комплексного изучения фазовых модификаций фармакопейными и не фармакопейными методами анализа для всестороннего описания продуктов супрамолекулярного синтеза с позиций строения кристаллической ячейки, фазовых переходов между модификациями, морфологии твердой фазы и физико-химических свойств.  Доказана оптимизация биофармацевтических параметров и установлено повышение фармакологической эффективности и безопасности фазовых модификаций флавоноидов в сравнении с исходными фармацевтическими субстанциями в экспериментах in vivo.  Выявлена малая частотность фазовых модификаций по отношению к флаванонолам в сравнении с другими группами флавоноидов, что делает ДКВ перспективным объектом для оптимизации его физико-химических, технологических и фазового состояния. биофармацевтических свойств путем изменения

39 ГЛАВА 2. Дизайн и синтез фазовых модификаций дигидрокверцетина 2.1. Компьютерное моделирование фазовых состояний дигидрокверцетина По результатам анализа международной библиографической базы данных PubMed, выполненного на момент начала данной научной работы, было установлено, что в период с 2005 по 2015 год наблюдалась тенденция к ежегодному экспоненциальному росту числа статей, посвященных изучению флавоноидов методом математического моделирования (Рисунок 2.1). Так, в 2005 году было опубликовано 20 статей по данной тематике, в то время как в 2015 году этот показатель вырос до 147. Этот тренд сохраняется и в настоящее время: в 2019 году результаты изучения флавоноидов методами in silico описаны в 290 работах. Как правило, целью исследователей был поиск соединений, характеризующихся высоким аффинитетом по отношению к биологическим мишеням [38]. Также компьютерно-вычислительные инструменты применяли для объяснения наблюдаемых фармакологических эффектов на молекулярном уровне [73]. Рисунок 2.1 – Экспоненциальный рост числа публикаций по компьютерному моделированию флавоноидов за десятилетний период

40 Согласно этим литературным данным, различные представители семейства флавоноидов, такие как кверцетин, лютеолин, гесперетин, могут проявлять противовирусное [112], антибактериальное [67], противодиабетическое [129], иммуномодулирующее противоопухолевое [105], [172] действие. Среди флавоноидов выделяется ДКВ. Было показано, что он может связываться с биологическими мишенями вируса SARS-CoV-2 [74]. В ходе исследования активности 4500 флавоноидов против четырех жизненно важных белков вируса Эболы ДКВ оказался одним из соединений-лидеров [136]. Кроме того, ДКВ способен ингибировать эпителиальные факторы роста [128], что может найти применение при лечении онкологических заболеваний. Биологическая активность этого биофлавоноида, во многом, объясняется его молекулярной структурой. В составе ДКВ содержатся четыре фенольных гидроксильных группы и одна вторичная спиртовая гидроксильная группа, а также карбонильная группа. Такой набор функциональных групп обуславливает возможность кислотно-основных взаимодействий, что в сочетании с неплоским углеродным скелетом и сравнительно малыми размерами молекулы обеспечивает склонность к плейотропному фармакологическому действию. Результаты компьютерных расчетов использовали в рациональном дизайне биологически активных молекул. Важно отметить, что изучение виртуальных объектов in silico часто является первым этапом разработки лекарственных средств, и способствует оптимизации исследовательского процесса. Тем не менее, несмотря на повышенный интерес научного сообщества к природным флавоноидам и все большее внедрение методов компьютерной химии в исследовательскую практику, до настоящего момента молекулярное моделирование не применялось для изучения фазового состояния ДКВ и поиска его новых фазовых модификаций. 2.1.1. Роль молекул растворителя Трансляционный формат данного исследования предполагал использование методов in silico для проведения поисковых исследований и осуществления направленного синтеза новых фазовых модификаций ДКВ. В ходе

41 вычислительных работ в виртуальном пространстве оценивали влияние молекул растворителей на супрамолекулярное строение твердой фазы исследуемого биофлавоноида. Было получено 15 вариантов моделей наночастиц ДКВ с различной степенью насыщения водой кристаллических ячеек и положением молекул растворителя в них (см. условия 7.3.1). Внешне частицы характеризуются похожим строением: они представляют собой кубы с вогнутыми гранями (Рисунок 2.2). Согласно данным литературных источников [34], подобная форма довольно распространена в мире нанообъектов и ее образование обусловлено давлением внешней среды на стенки наночастиц. Длина сторон кубов составляла, приблизительно, 17 нм. Рисунок 2.2 – Внешний вид модели наночастицы ДКВ С химической точки зрения, между гранями различных кубических наночастиц ДКВ наблюдались определенные различия. Некоторые грани моделей, за счет увеличения числа фенольных гидроксильных групп на поверхности, имели большую склонность к взаимодействиям с соединениями, обладающими основным характером. Другие стороны виртуальных объектов характеризовались повышенным содержанием карбонильных функциональных групп и π- насыщенных ароматических колец, что приводило к увеличению основных свойств. Также отмечена различная степень ионизации химических центров на поверхности моделей ДКВ. Введение в структуру твердой фазы молекул растворителей приводило к потенцированию реакционной способности.

42 Гораздо более выраженные различия между строением твердой фазы ДКВ наблюдали на поперечном срезе моделей наночастиц. Для сопоставительного анализа виртуальных объектов наиболее показательными были безводная форма и частица, в которой на две молекулы ДКВ приходится пять молекул воды. В отсутствии кристаллизационной воды формируется однородная твердая фаза (Рисунок 2.3А). Кристаллогидрат ДКВ характеризуется образованием полости внутри частицы в форме креста (Рисунок 2.3В). Расстояние между стенками полости варьирует от 4 до 11 нм для различных сечений. Таким образом, до 78,6% внутреннего объема твердой фазы кристаллогидрата ДКВ занимает пустое пространство. По материаловедческой классификации данные модели наночастиц можно охарактеризовать как мезопористый объект [119], поскольку диаметр внутренней полости (или канала) укладывается в диапазон от 2 до 50 нм. А В Рисунок 2.3 – Поперечный срез моделей фазовых модификаций ДКВ: А – в отсутствии молекул воды, В – при наличии кристаллизационной воды Виртуальные модели частиц, которые были построены из кристаллических ячеек, обладающих другой степенью насыщения водой и положением ее молекул в пространстве, также характеризовались наличием полости внутри твердой фазы. Однако они не обладали такой выраженной симметрией, как в случае молярного соотношения ДКВ к воде 2:5. Различия между твердой фазой ДКВ было отмечено не только в морфологических параметрах, но и физических характеристиках, в частности – в

43 упругих свойствах, изученных в процессе моделирования деформации (см. условия 7.3.2). Существенных различий в результатах 161 вычислительного алгоритма для отдельных моделей не выявлено, что позволяет характеризовать виртуальные наночастицы как изотропные объекты. То есть, вне зависимости от направления вектора приложения деформирующей силы наблюдали одинаковые процессы нарушения структуры частиц ДКВ, что говорит о постоянстве физических параметров твердой фазы. А В Рисунок 2.4 – Симуляция деформации фазовых модификаций ДКВ: А – безводная форма, В – кристаллогидратная форма В процессе деформации модель безводной фазы ДКВ сплющило, и она утратила исходную форму (Рисунок 2.4А). Такое поведение, наравне с изотропностью, характерно для аморфных субстанций. Твердая фаза кристаллогидрата характеризуется более выраженной жесткостью. В ходе моделирования происходит разрыв наиболее тонких стенок фазы, толщина которых в некоторых местах не превышает 2 нм. На Рисунке 2.4В хорошо видны осколки различных размеров и форм. Следовательно, данная модель характеризуется более выраженными кристаллическими свойствами. Следует отметить, что для кристаллических материалов более характерны анизотропные свойства, чем изотропные. Однако при моделировании деформации наночастиц ДКВ наблюдалась изотропность. Этот эффект можно объяснить

44 созданием идеальных условий in silico, поскольку сформированные виртуальные объекты обладали высокой степенью симметрии и не имели дефектов структуры. Таким образом, в структуре твердой фазы ДКВ молекулы воды выполняют не только структурную функцию, способствуя образованию внутренней полости, но и конструкционную, придавая системе кристаллическую структуру и жесткость. 2.1.2. Влияние значения рН среды Компьютерное моделирование позволяет оценивать влияние окружающей среды на степень ионизации молекул ДКВ (см. условия 7.3.3). Для формирования межмолекулярных синтонов между ДКВ и водой требовалось увеличить число частично ионизированных молекул флаванонола. Из Таблицы 2.1 следует, что оптимальное значение рН находится около 7, поскольку именно в этом случае примерное соотношение неионизированных и частично ионизированных молекул ДКВ приближается к равенству, что и способствует формированию стабильной твердой фазы. Таблица 2.1 – Соотношение молекул ДКВ с различной степенью ионизации в зависимости от значения рН среды Соотношение молекул ДКВ различной степени ионизации, % Форма ДКВ с Значение рН Неионизированная Другие ионизированные ионизированной форма ДКВ формы ДКВ 7 ОН-группой 1 100,00 0,00 0,00 2 100,00 0,00 0,00 3 99,99 0,01 0,00 4 99,93 0,07 0,00 5 99,32 0,67 0,01 6 93,59 6,34 0,07 7 59,22 40,09 0,69 8 12,09 77,82 10,09 9 0,89 60,22 38,89 10 0,02 12,85 87,13 11 0,00 0,88 99,12 12 0,00 0,01 99,99 13 0,00 0,00 100,00 14 0,00 0,00 100,00

45 Результаты молекулярного моделирования послужили теоретической базой для рационального дизайна фазовых модификаций ДКВ. 2.2. Разработка способа получения фазовых модификаций 2.2.1. Кристаллогидрат дигидрокверцетина По результатам исследований in silico, кристаллогидрат ДКВ представляет интерес для получения и дальнейшего изучения ввиду необычной пористой морфологии. Согласно данным литературного анализа, одним из наиболее простых и распространенных методов включения молекул растворителей в структуру кристалла является осаждение из гомогенной жидкой фазы. Супрамолекулярный синтез осуществляли в спиртовом растворе ДКВ. Дистиллированная вода выступала в качестве антирастворителя. Для регулирования кислотности среды, созданной этанолом и флаванонолом, использовали мочевину, проявляющую слабые основные свойства. Согласно данным оптической микроскопии, полученный осадок представлял собой микротрубки различных размеров. Таблица 2.2 – Влияние значения рН на выход ДКВт Соотношение Значение рН Выход ДКВ: мочевина маточного продукта, (масс.%) раствора (масс.%) 100:0 6 0,0 85:15 6 2,3 70:30 7 67,1 65:35 8 0,1 55:45 8 0,0 Размеры частиц, мкм Стабильность 215,29 х 12,89 234,40 х 22,84 218,61 х 13,09 - + + + - Технологию получения ДКВт оптимизировали по следующим параметрам: температурный режим, значение рН исходного маточного раствора и продолжительность процесса. В Таблице 2.2 продемонстрировано влияние соотношения ДКВ и мочевины на выход продукта супрамолекулярного синтеза. Представленные данные хорошо согласуются с результатами молекулярного

46 моделирования: нейтральная среда (значение рН=7) является оптимальной для получения ДКВт и достигается при соотношении компонентов 7:3. В ходе изучения влияния температуры (Таблица 2.3), при которой происходит осаждение ДКВт, установлено наличие прямой зависимости между параметрами окружающей среды и размерами образующихся частиц (Рисунок 2.5). Данное наблюдение можно объяснить тем, что в условиях пониженной температуры происходит снижение растворимости флавоноида. Это приводит к перенасыщению маточного раствора и увеличению количества точек кристаллизации. Поскольку осаждение происходит на большее количество частиц, фазовое равновесие достигается раньше, чем микротрубки успевают достаточно вырасти. Однако при низкой температуре (– 5 °C) происходит слишком быстрое образование осадка, что не позволяет сформироваться правильным колоновидным частицам. Таким образом, была установлена нижняя граница оптимума температурного режима для проведения супрамолекулярного синтеза ДКВт, равная + 5 °C. В то же время, на фоне повышения температуры среды происходит увеличение растворимости ДКВ, что приводит к снижению выхода целевого продукта, поэтому верхняя температурная граница осаждения ДКВт находится на уровне 35 °C. А B Рисунок 2.5 – Различные уровни организации ДКВт: А – микротрубки; B – (условия см. 7.4.2) нанотрубки

47 Таблица 2.3 – Влияние температуры на размер частиц ДКВт Температурный режим, °C Выход продукта, (масс.%) - 5 0,0 + 5 66,5 + 15 66,8 + 25 67,1 + 35 66,2 + 45 42,3 Оптимизацию осуществляли по продолжительности данным, Средние размеры трубок, мкм . 20,70 х 2,24 40,99 х 3,77 234,40 х 22,84 1998,70 х 64,20 679,49 х 66,21 супрамолекулярного отражающим зависимость между синтеза массой образовавшегося осадка ДКВт и временем, в течение которого происходило выдерживание маточного раствора. При температуре 25 ºС и соотношении масс ДКВ и мочевины 7:3, кривая выходит на плато через 36 ч (Рисунок 2.6). Рисунок 2.6 – Зависимость массы ДКВт от времени выдерживания маточного раствора Основываясь на результатах исследований in silico и in vitro можно описать процесс самосборки микротрубок следующим образом. 1. Медленное добавление воды в исходный спиртовой раствор ДКВ при интенсивном перемешивании приводит к изменению растворимости биофлавоноида и происходит формирование точек кристаллизации.

48 2. Взаимное расположение молекул ДКВ в кристаллической ячейке способствует образованию тетрагональных наночастиц на основе точек кристаллизации. 3. Частичная ионизация наночастиц ДКВ в совокупности с медленным переходом молекул флавоноида из раствора в твердую фазу позволяет добиться неравномерного роста с разных сторон нанообъектов, благодаря чему наблюдается самосборка микротрубок флаванонола. 4. После достижения фазового равновесия между твердой фазой осажденных микротрубок и водно-спиртовым раствором рост частиц постепенно замедляется и, в конечном итоге, выходит на плато. Разработанный способ получения ДКВт защищен патентом Российской Федерации RU 2 640 413 C1 (Приложение А). 2.2.2. Аморфные формы дигидрокверцетина Стратегия синтеза аморфных модификаций ДКВ строилась на процессе удаления молекул любых растворителей из твердой фазы флавоноида. Согласно данным молекулярного моделирования, этот процесс приводит к снижению жесткости структуры и повышению изотропных свойств. В качестве основного метода получения аморфных форм ДКВ использовали лиофилизацию – тип мягкой сушки субстанции в условиях пониженной температуры и давления. В качестве маточного раствора использовали гомогенную систему, включающую этанол и воду очищенную. Выбор данных растворителей обусловлен их низкой токсичностью (этанол – III класс токсичности, согласно ОФС.1.1.0008.15 «Остаточные органические растворители» [8]). Подбор концентрации ДКВ и соотношения этанола и воды базировался на двух принципах: достижения максимального выхода продукта за один синтез и соблюдения технологического регламента процесса лиофилизации. Ввиду высокой летучести этанола, даже при малых количествах органического растворителя сушка протекала с образованием жидкой фазы, что не допустимо при проведении лиофилизации. Таким образом, было установлено, что

49 соотношение этанола и воды 5:95 является оптимальным решением. Концентрация ДКВ выбрана не выше 5,0%, поскольку при более высоком содержании происходило осаждение флавоноида в процессе предварительной глубокой заморозки. Продукт лиофильной сушки – ДКВв – представляет собой микроволокнистую субстанцию со свойством статистического самоподобия структуры, то есть морфология твердой фазы обладает элементами, повторяющимися на различных уровнях организации, что хорошо видно при различных увеличениях (Рисунок 2.7). А B Рисунок 2.7 – Морфология ДКВв при увеличении: А – х400 раз, B – х1200 раз (условия см. 7.4.2) Одним из недостатков ДКВв следует признать нестабильность при длительном хранении (более 1 часа) на открытом воздухе, которая, очевидно, связана с высокой гигроскопичностью лиофилизата. В результате деградации образуется исходная форма ДКВ. В качестве альтернативного метода удаления кристаллизационной воды из структуры твердой фазы ДКВ использовали метод распылительной сушки, реализованный в промышленных условиях (см. условия 7.1.1). Вещество, полученное таким способом, имеет сфероидные частицы (Рисунок 2.8) и

50 обозначено нами как ДКВс. В отличии от ДКВв, данная форма может храниться на открытом воздухе. Рисунок 2.8 – Морфология частиц ДКВс (условия см. 7.4.2) Таким образом, путем изменения условий супрамолекулярного синтеза можно добиться образования целевой фазовой модификации ДКВ. Высокие температуры в сочетании с высоким давлением, равно как и экстремально низкие температуры в условиях разряженной атмосферы способствуют выведению молекул растворителя из твердой фазы исследуемого биофлавоноида и приводят к его аморфизации. В то же время, формирование кристаллогидрата в водноспиртовой среде происходит при нормальных условиях, однако при этом необходимо контролировать значение рН смеси. Полученные теоретические результаты внедрены в образовательный процесс на кафедре химии Института фармации имени А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первого МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Приложение Б). Результаты поисковых исследований по синтезу фазовых модификаций ДКВ с улучшенной растворимостью используются в научно-исследовательской

51 деятельности Отдела медицинской биофизики НИИ трансляционной медицины ФГБОУ ВО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России (Приложение В) и внедрены в производственный процесс АО «Аметис» (Приложение Г). Выводы по главе  Использованы методы молекулярного моделирования in silico для поиска новых фазовых модификаций ДКВ и предсказания их свойств.  Впервые получена виртуальная модель фазового состояния природного биофлавоноида на примере наночастицы ДКВ.  Сформулированы следующие принципы направленного синтеза фазовых модификаций ДКВ: - наличие кислотных и основных центров в структуре ДКВ способствует формированию межмолекулярных синтонов; - введение молекул растворителей в твердую фазу ДКВ приводит к увеличению степени его кристалличности; - изменение условий формирования твердой фазы ДКВ (температура, давление, степень ионизации молекул) приводит к смещению равновесия в сторону образования определенных фазовых модификаций.  Синтезированы новые фазовые модификации ДКВ: микротрубчатая, микросфероидная и микроволокнистая.  Описаны стадии самосборки микротрубчатых частиц одной из форм ДКВ.  Запатентован способ получения стабильной микротрубчатой кристаллической модификации ДКВ с заданным размером частиц методом осаждения антирастворителем из спиртового раствора в присутствии мочевины.

52 ГЛАВА 3. Разработка системного подхода к исследованию фазовых модификаций Объекты, дизайн и синтез которых был реализован и описан в предыдущей главе, представляли интерес для более углубленного изучения. Требовалось подтвердить сохранение исходной структуры биофлавоноида. Оставалась неопределенность в отношении природы полученных фазовых модификаций ДКВ: они могли представлять собой полиморфы, псевдополиморфы, кокристаллы, аморфные и коаморфные формы по отношению к исходной фармацевтической субстанции. Кроме того, следовало выявить различия в физико-химических свойствах ДКВфс, ДКВт, ДКВс и ДКВв, что послужило бы фундаментальной научной базой для их внедрения в практическую деятельность. Для ответа на обозначенный круг вопросов было необходимо разработать системный подход, заключающийся в последовательном использовании комплекса адекватных современных методов, в том числе спектральных, хроматографических, хемоинформатических, микроскопических, рентгенографических, термических и физико-химических. 3.1. Химическое строение фазовых модификаций дигидрокверцетина Для подтверждения состава и структуры продуктов химического синтеза использовали комплекс спектральных методов анализа, таких как спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях (УФ/ВИД-спектроскопия), ИК- спектроскопия, спектроскопия ЯМР 1Н и масс-спектрометрия. 3.1.1. Хромофорная система Молекула ДКВ характеризуется наличием двух сопряженных систем (кольца А и В), являющихся хромофорами и способных к избирательному поглощению света. Оба этих структурных фрагмента находятся в p,π-сопряжении с фенольными гидроксильными группами, а кольцо А, кроме того, с

53 карбонильной группой и атомом кислорода пиранового гетероцикла. Таким образом, особенности возможность строения использования данного метода биофлавоноида обуславливают электронной спектроскопии для качественного и количественного анализа ДКВ. УФ-спектры этанольных растворов полученных фазовых модификаций характеризуются максимумом поглощения при длине волны λ = 288,31 ± 0,27 нм (Рисунок 3.1). Рисунок 3.1 – УФ-спектры фазовых модификаций ДКВ в этаноле (условия см. 7.5.1): ДКВфс (черный, концентрация – 0,030 ммоль/л), ДКВт (синий, концентрация – 0,028 ммоль/л), ДКВс (красный, концентрация – 0,034 ммоль/л), ДКВв (зеленый, концентрация – 0,036 ммоль/л) Исходя из результатов УФ-спектрального анализа можно сделать вывод, что в ходе супрамолекулярного синтеза структура хромофоров не претерпела изменений. 3.1.2. Функциональные группы и фрагменты Отсутствие формирования новых ковалентных связей при образовании ДКВт, ДКВс и ДКВв было подтверждено методом ИК-спектроскопии в таблетках калия бромида (Рисунок 3.2).

54 Рисунок 3.2 – ИК-спектры фазовых модификаций ДКВ в таблетках калия бромида (условия см. 7.5.2): ДКВфс (черный), ДКВт (синий), ДКВс (красный), ДКВв (зеленый) Спектры всех полученных образцов, так же как и исходной субстанции ДКВфс, характеризуются широкой интенсивной полосой поглощения, соответствующей валентным колебаниям О-Н фенольных гидроксильных групп (Таблица 3.1). Кроме того, в спектрах наблюдается полоса поглощения валентных колебаний С=О карбонильной группы. Наличие ароматического структурного фрагмента подтверждается полосами поглощения валентных Сар-Сар и деформационных Сар-Н колебаний. Таблица 3.1 – Соотнесение полос поглощения в ИК-спектре со структурой ДКВ Тип колебания Волновое число, см-1 Интенсивность, % Валентные О-Н 3437,47 79 Валентные симметричные С-Н 2877,62 38 Валентные С=О 1635,67 97 1613,41 53 Валентные Сар-Сар 1524,36 51 1473,65 77 Деформационные симметричные С-Н 1359,91 46 Деформационные О-Н 1362,20 70 Валентные асимметричные С-О-С 1264,13 80 Валентные С-О 1166.24 89 Валентные симметричные С-О-С 1086.19 74 Деформационные Сар-Н 997.70 65

55 Вместе с тем, следует отметить, что, несмотря на совпадение максимумов полос поглощения, интенсивностью полос ИК-спектры поглощения исследуемых фенольных образцов различаются гидроксильных групп и карбонильных групп. В области отпечатков пальцев спектры также не идентичны, что указывает на различия в структуре твердой фазы. 3.1.3. Молекулярная структура дигидрокверцетина Более подробную информацию о структуре исследуемых образцов можно получить исходя из результатов масс-спектрального анализа (Рисунок 3.3), проведенного при отрицательной ионизации электроспреем. Заметных различий в масс-спектрах не наблюдали. А В С D Рисунок 3.3 – Масс-спектры фазовых модификаций ДКВ (условия см. 7.5.3): A – ДКВфс, B – ДКВт, C – ДКВс,D – ДКВв

56 Все спектры характеризуются тремя пиками со значением m/z 607, 417 и 303. Последний, очевидно, соответствует квазимолекулярному иону ДКВ. Поскольку электроспрей ионизация относится к «мягким методам», то появление пиков со значениями m/z большими, чем у молекулярного иона, объясняется за счет образования вторичных ионов путем присоединения ионизированных частиц к молекулам биофлавоноида. Сигнал со значением m/z 607 можно интерпетировать как продукт димеризации флаванонола, что распространено при масс-спектральном анализе флавоноидов [39]. В то же время формирование иона с массой 417 может быть объяснено образованием ассоциата [М-1] с компонентом подвижной фазы, муравьиной кислотой, и ее натриевой солью. Таким образом, структура ДКВ позволяет полностью объяснить пики, наблюдаемые на массспектрах. 3.1.4. Родственные примеси и остаточные растворители ЯМР 1Н. Спектроскопия ЯМР 1Н была использована как для доказательства молекулярной структуры ДКВ в фазовых модификациях, так и для идентификации родственных примесей и остаточных растворителей. Спектры ЯМР 1 Н для всех анализируемых образцов приведены на Рисунке 3.4, а их расшифровка – в Таблице 3.2. Таблица 3.2 – Соотнесение сигналов в спектре ЯМР 1Н со структурой компонентов Источник сигнала δ, м.д. Мультиплетность Молекула Протон ДКВ -Н 3. 4,465 триплет -Н 2. 4,944 дублет -ОН 3. 5,730 дублет -Н 8. 5,827 дублет -Н 6. 5,874 дублет -Н 5’ 6,709 мультиплет -Н 6’ -Н 2’ 6,842 синглет -ОН 3’ 8,961 синглет -ОН 4’ 9,012 синглет -ОН 7. 10,798 синглет -ОН 5. 11,872 синглет Вода -Н . 3,330 синглет Этанол -Н 2. 1,226 триплет -Н 1. 3,687 квадруплет Мочевина -Н . 5,410 синглет

57 A B C D Рисунок 3.4 – Спектры ЯМР 1Н фазовых модификаций ДКВ (условия см. 7.5.4): A – ДКВфс, B – ДКВт, C – ДКВс, D – ДКВв

58 Полученные спектральные данные позволяют охарактеризовать все образцы как 2R,3R-стереоизомер ДКВ в соответствии с литературными данными [116; 165]. Заметное отличие в спектре ЯМР 1Н наблюдается для ДКВт. Сигнал атома водорода фенольной гидроксильной группы в положении 7, имеющий химический сдвиг 10,798 м.д., на спектре ДКВт сильно размыт, что можно объяснить частичной ионизацией молекулы биофлавоноида. Во всех спектрах четко виден синглет 2,540 м.д., соответствующий ДМСО, в котором снимали спектры, и сигнал воды. Ее присутствие может быть объяснено высокой гигроскопичностью используемого органического растворителя. Используя метод ЯМР 1 Н, была получена информация не только о структуре анализируемых образцов, но и о примесях, имеющихся в составе твердой фазы модификаций ДКВ. Так в спектре ДКВт наблюдаются сигналы, указывающие на присутствие следовых количеств этанола (триплет и квадруплет с химическими сдвигами 1,226 м.д. и 3,687 м.д., соответственно) и мочевины (синглет при 5,410 м.д.), применяемых в супрамолекулярном синтезе. Также этанол обнаружен на спектре ДКВв. В спектре ЯМР 1Н ДКВс выявлены триплет, дублет, дублет и мультиплет с величинами химического сдвига 3,991 м.д., 5,313 м.д., 6,172 м.д. и 6,909 м.д., соответственно. Структуру соединения, которому принадлежат эти сигналы, устанавливали методом хромато-масс-спектрометрии. Хроматография. Согласно литературным данным [28; 39; 40; 61; 168], разделение флавоноидных композиций осуществляется в обращенно-фазовом режиме с октадецильными привитыми фазами. В качестве элюентов используют воду, ацетонитрил, метанол с добавлением муравьиной, уксусной и трифторуксусной кислот как модификаторов для подавления диссоциации фенольных гидроксильных групп. Учитывая, что ДКВ с был получен методом распылительной сушки при температуре 250 °С, этот процесс мог сопровождаться окислением флаванонола или его изомеризацией. Поэтому целесообразным аналитическим методом для идентификации примесного компонента является

59 ультра высокоэффективная жидкостная хроматография (УВЭЖХ) в сочетании со спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим способами детектирования. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент с привитыми фенильными группами. В ходе оптимизации условий хроматографирования рассматривали различные соотношения растворителей. Разделение компонентов проводили в режиме ступенчатого градиента (условия см. 7.5.5): A B C Рисунок 3.5 – УВЭЖХ фазовых модификаций ДКВ: A – ГCO ДКВ, B – ДКВфс, C – ДКВс Таблица 3.3 – Данные по разделению компонентов Хроматографические данные Стереоизомеры ДКВ ВУ, мин W0,5, мин W0,05, мин f, мин 2R,3R 10,83 ± 0,06 0,09 ± 0,01 0,15 ± 0,01 0,05 ± 0,01 2R,3S 11,12 ± 0,05 0,07 ± 0,01 0,14 ± 0,01 0,05 ± 0,01 Полученные хроматограммы приведены на As 1,5 1,4 N 81111 139805 Рисунке 3.5, Rs 1,70 а идентифицированные компоненты – в Таблице 3.3. В качестве внешнего стандарта использовали ГСО ДКВ, являющийся 2R,3R-стереоизомером [166] с

60 временем удерживания (ВУ) 10,83 ± 0,06 мин. Примесный компонент оказался более гидрофобным с большим ВУ (11,12 ± 0,05 мин). Несмотря на то, что у обоих пиков растянут задний фронт (As > 1), разрешение между пиками составило 1,70, что можно рассматривать как приемлемое разделении двух веществ. Поскольку УФ- и масс-спектры компонентов с временами удерживания 10,83 мин и 11,12 мин идентичны (Рисунок 3.6), эти компоненты являются стереоизомерами ДКВ. А В Рисунок 3.6 – УФ- и масс-спектры компонентов с временем удерживания: А – 10,83 мин, В – 11,12 мин

61 In silico. Процесс распылительной сушки был смоделирован в виртуальном пространстве программы MarvinView. Методом молекулярной динамики подтверждена потенциальная возможность преодоления энергетических барьеров при изомеризации ДКВ. Для установления структуры стереоизомера методом молекулярного моделирования оценивали внутреннюю энергию молекул ДКВ, отличающихся строением центров хиральности в положениях 2 и 3. Для 2R,3R-, 2R,3S-, 2S,3R- и 2S,3S-стереоизомеров данный параметр составил 14,21, 18,43, 21,32 и 32,06 кДж/моль, соответственно. Модели молекул 2R,3R- и 2R,3S-ДКВ обладали наименьшей внутренней энергией и, следовательно, эти стереоизомеры могут рассматриваться как наиболее стабильные структуры, что обусловлено оптимальным экваториальным положением более объемного заместителя – кольца В – в положении 2. А В Рисунок 3.7 – Поля молекулярных взаимодействий (оранжевый – по липофильному типу, голубой – по гидрофильному типу) диастереоизомеров ДКВ: А - 2R,3R-ДКВ, В - 2R,3S-ДКВ При изучении свойств полученных структур диастереомеров на поверхности молекул были сгенерированы поля молекулярных взаимодействий по гидрофильному и липофильному типу (условия см. 7.3.4). Их соотношение

62 составляло 6:1 и 5:1 для 2R,3R-ДКВ и 2R,3S-ДКВ, соответственно (Рисунок 3.7). На основании результатов компьютерных расчетов было сделано предположение, что 2R,3S-ДКВ должен быть более гидрофобным, чем 2R,3R-стереоизомер. Полученные данные хорошо согласуются с результатами хроматографического анализа, в котором минорный компонент характеризуется большим ВУ в сравнении мажорным. По данным УВЭЖХ фракция 2R,3R-диастереомера в ДКВфс, составляла 98,8% (в молекулярном соотношении), в то время как в ДКВс его содержание уменьшилось до 87,2%. То есть, в ходе распылительной сушки доля 2R,3S-ДКВ увеличилась в 10,67 раза. Таким образом, комплексом спектральных методов анализа подтверждено сохранение исходной молекулярной структуры ДКВ во всех исследуемых образцах и уточнен их примесный состав. Для установления природы полученных фазовых модификаций и выявления различий между ними были использованы более специфичные физико-химические методы анализа. 3.2. Структура твердой фазы модификаций дигидрокверцетина 3.2.1. Описание Все полученные фазовые модификации ДКВ представляют собой порошки различных оттенков желтого цвета (Рисунок 3.8). ДКВфс можно охарактеризовать как мелкодисперсную субстанцию бледно-желтого цвета. Порошок ДКВт состоял из множества блестящих на свету продолговатых частиц, хорошо различимых глазом. ДКВс был наиболее темным и обладал выраженной склонностью к комкованию, обусловленной, очевидно, электростатическим взаимодействием между частицами. ДКВв представлял собой пушистую массу бледно-желтого цвета. Все объекты имели слабый смолистый запах и горьковатый вкус.

63 А В С D Рисунок 3.8 – Внешний вид фазовых модификаций: А – ДКВфс, В – ДКВт, С – ДКВс, D – ДКВв 3.2.2. Морфология Морфологическое описание фазовых модификаций ДКВ заключалось в качественном и количественном анализе. Этап качественного исследования осуществляли методом СЭМ (условия см. 7.4.2). Количественная характеристика распределения частиц по размеру выполнена методом лазерной дифракции света. Исходная субстанция (Рисунок 3.9А) представляет собой мелкодисперсный порошок с частицами иррегулярной формы. При большем увеличении хорошо видно, что эти микрообъекты не являются монолитными. Можно выделить отдельные пластинчатые частицы, которые формируют единый агрегат.

64 Рисунок 3.9 – Микрофотографии фазовых модификаций ДКВ (левый столбец – увеличение х250, правый столбец – х2000): А – ДКВфс, В – ДКВт, С – ДКВс, D – ДКВв

65 В отличие от ДКВфс, частицы ДКВт образуют сложные звездчатые структуры, лучи которых имеют колоновидную форму (Рисунок 3.9В). При увеличении в ×2000 раз видно, что игольчатые кристаллы, формирующие сферолиты, обладают тетрагональном или, реже, гексагональным сечением и внутренней полостью, занимающей до 78,6% объема частицы. Соответственно, эти микрообъекты являются трубчатыми структурами. Поверхность игольчатых кристаллов гладкая и имеет продольные борозды. Таким образом, морфология частиц ДКВт во многом повторяет строение виртуальных частиц, полученных в ходе молекулярного моделирования. Частицы ДКВс представляют собой сферы (Рисунок 3.9С). Данные микрообъекты полые, поскольку при небольшом увеличении видны тонкие стенки разрушенных частиц. Также это подтверждается вогнутым характером деформации некоторых частиц ДКВс (Рисунок 3.10). На микрофотографии при высоком увеличении на поверхности сфер можно различить отдельные частицы, внешне аналогичные тем, что были видны в образце ДКВфс (см. Рисунок 3.8С). Очевидно, при прохождении субстанции через распылительную сушилку происходит сплавление твердой фазы с образованием сфер как наиболее энергетически выгодной геометрической фигуры с точки зрения поверхностного натяжения. В результате быстрого охлаждения частицы ДКВ с сохраняют полученную форму. Рисунок 3.10 – Деформации частиц ДКВс

66 Образец ДКВв характеризуется волокнистой структурой с гладкой поверхностью (Рисунок 3.9D). При этом более мелкие нити переплетаются и образуют более крупные волокна, тем самым реализовывая принцип самоподобия – ключевой элемент фрактальной геометрии. Для предоставления объективных данных о размерах частиц полученных образцов использовали фармакопейный метод анализа – лазерную дифракцию света (Рисунок 3.11). Измерение проводили в водной среде, поскольку порошок ДКВс имел склонность к комкованию из-за электростатических взаимодействий между частицами. Кроме того, для частиц, не обладающих сферической формой, «получают соответствующее распределение эквивалентных сфер по размеру», о чем имеется указание в ОФС.1.2.1.0008.15 «Определение распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света» [8] (условия см. 7.4.3). Рисунок 3.11 – Интегральное объемное распределение частиц по размеру Таблица 3.4 – Распределение частиц фазовых модификаций ДКВ по размеру Размер частиц, мкм Исследуемый образец Х10* Х50* ДКВфс 2,16 11,73 ДКВт 4,18 23,80 ДКВс 2,22 49,00 ДКВв 14,64 110,40 * объемные доли 10%, 50% и 90%, соответственно Х90* 46,90 214,00 190,60 122,40 Во всех исследуемых образцах можно выделить несколько фракций частиц. Так, наиболее гомогенно выглядят порошки ДКВфс и ДКВв: первый имеет размер

67 частиц до 66,8 мкм, а второй – до 142,0 мкм. В образцах ДКВс наблюдается две фракции частиц: более мелкая - в диапазоне до 87,3 мкм, и более крупная – от 174,4 до 242,0 мкм. В образцах порошка ДКВт обнаружено три фракции: до 51,3 мкм, от 179,6 до 248,0 мкм и от 306,0 до 658,0 мкм. Таким образом, трубчатая форма ДКВ характеризуется наибольшим размером частиц. Статистическая обработка полученных данных, выполненная в соответствии с требованиями ГФ РФ XIV, представлена в Таблице 3.4. На основании данных молекулярного моделирования, а также спектрального и морфологического анализа высказан ряд предположений в отношении природы полученных фазовых модификаций ДКВ. Синтезированные объекты могут представлять собой полиморфные, псевдополиморфные модификации, кокристаллы, амофрные и коаморфные формы. Для установления структуры твердой фазы использовали рентгенографические методы анализа: РПД и РСА; термические методы анализа: ДСК, ТГА и синхронный термический анализ и масс-спектрометрию (СТА МС). 3.2.3. Кристаллическое и аморфное состояния Метод РСА позволяет однозначно установить строение твердой фазы кристаллических соединений. Благодаря возможности варьировать условия супрамолекулярного синтеза в зависимости от размера желаемых частиц был выращен бесцветный монокристалл ДКВт, имеющий призматическую форму (условия см. 7.5.6). Его размеры составляли 0,40 мм × 0,37 мм × 0,32 мм. Кристаллическая ячейка ДКВт характеризуется моноклинной сингонией и кристаллизуется в хиральной пространственной группе С2. Ее грани обладали следующими размерами: a = 23,2416 Å, b = 5,2305 Å, c = 25,4061 Å. Величины углов α, β и γ соответствовали 90,000°, 102,634° и 90,000°, а плотность кристаллической ячейки ДКВт составляла 1,517 г/см3. Установлено, что данная фазовая модификация биофлавоноида представляет собой сестергидрат: на две молекулы флаванонола приходится пять молекул воды (Рисунок 3.12). Информация по длинам связей и валентным углам в молекулах представлена в Таблице 3.5 и Таблице 3.6, соответственно. Эти данные приближены к

68 результатам РСА, полученным в ходе разработки нормативной документации на ГСО ДКВ [24] и ГОСТа на ДКВ [16]. Однако, в ранее опубликованных статьях данные образцы не изучались с позиции фазовых модификаций. Рисунок 3.12 – Структура кристаллической ячейки ДКВт Таблица 3.5 – Длины связей в молекулах ДКВ Молекула 1 Молекула 2 Связь Длина, Å Связь O1—C9 O1—C2 O3—C3 O4—C4 O5—C5 O7—C7 O3'—C3' O4'—C4' C2—C1' C2—C3 C3—C4 C4—C10 C5—C6 C5—C10 C6—C7 C7—C8 C8—C9 C9—C10 C1'—C6' C1'—C2' C2'—C3' C3'—C4' C4'—C5' C5'—C6' 1,372 (8) 1,452 (7) 1,412 (7) 1,247 (8) 1,353 (8) 1,357 (7) 1,366 (7) 1,408 (8) 1,505 (9) 1,534 (8) 1,504 (9) 1,434 (9) 1,390 (9) 1,403 (9) 1,396 (9) 1,371 (9) 1,401 (9) 1,427 (9) 1,388 (9) 1,397 (9) 1,376 (9) 1,389 (10) 1,360 (9) 1,400 (9) O1A—C9A O1A—C2A O3A—C3A O4A—C4A O5A—C5A O7A—C7A O3'A—C3'A O4'A—C4'A C2A—C1'A C2A—C3A C3A—C4A C4A—C1OA C5A—C6A C5A—C1OA C6A—C7A C7A—C8A C8A—C9A C9A—C1OA C1'A—C6'A C1'A—C2'A C2'A—C3'A C3'A—C4'A C4'A—C5'A C5'A—C6'A Длина, Å 1,359 (8) 1,471 (7) 1,410 (7) 1,233 (8) 1,351 (8) 1,359 (7) 1,382 (8) 1,374 (8) 1,498 (10) 1,514 (9) 1,528 (10) 1,437 (9) 1,367 (9) 1,427 (9) 1,372 (9) 1,398 (10) 1,379 (9) 1,403 (9) 1,380 (9) 1,390 (10) 1,389 (10) 1,397 (9) 1,377 (10) 1,397 (10)

69 Таблица 3.6 – Значения валентных углов в молекулах ДКВ Молекула 1 Молекула 2 Атомы, образующие угол Размер угла, ° Атомы, образующие угол C9—O1—C2 115,4 (5) C9A—O1A—C2A O1—C2—C1' 108,5 (5) O1A—C2A—C1'A O1—C2—C3 108,2 (5) O1A—C2A—C3A C1'—C2—C3 112,4 (5) C1'A—C2A—C3A O3—C3—C4 113,9 (6) O3A—C3A—C2A O3—C3—C2 109,3 (5) O3A—C3A—C4A C4—C3—C2 110,1 (5) C2A—C3A—C4A O4—C4—C10 124,3 (7) O4A—C4A—C1OA O4—C4—C3 120,3 (6) O4A—C4A—C3A C10—C4—C3 115,3 (6) C1OA—C4A—C3A O5—C5—C6 117,4 (6) O5A—C5A—C6A O5—C5—C10 120,7 (6) O5A—C5A—C1OA C6—C5—C10 121,8 (6) C6A—C5A—C1OA C5—C6—C7 118,1 (6) C5A—C6A—C7A O7—C7—C8 118,4 (6) O7A—C7A—C6A O7—C7—C6 119,0 (6) O7A—C7A—C8A C8—C7—C6 122,6 (6) C6A—C7A—C8A C7—C8—C9 119,2 (6) C9A—C8A—C7A O1—C9—C8 117,2 (6) O1A—C9A—C8A O1—C9—C10 122,6 (6) O1A—C9A—C1OA C8—C9—C10 120,2 (6) C8A—C9A—C1OA C5—C10—C9 118,0 (6) C9A—C1OA—C5A C5—C10—C4 122,4 (6) C9A—C1OA—C4A C9—C10—C4 119,4 (7) C5A—C1OA—C4A C6'—C1'—C2' 119,9 (6) C6'A—C1'A—C2'A C6'—C1'—C2 119,5 (6) C6'A—C1'A—C2A C2'—C1'—C2 120,5 (6) C2'A—C1'A—C2A C3'—C2'—C1' 120,8 (7) C3'A—C2'A—C1'A O3'—C3'—C2' 124,4 (6) O3'A—C3'A—C4'A O3'—C3'—C4' 117,4 (6) O3'A—C3'A—C2'A C2'—C3'—C4' 118,1 (6) C4'A—C3'A—C2'A C5'—C4'—C3' 122,3 (7) O4'A—C4'A—C5'A C5'—C4'—O4' 121,1 (6) O4'A—C4'A—C3'A C3'—C4'—O4' 116,6 (6) C5'A—C4'A—C3'A C4'—C5'—C6' 119,5 (7) C4'A—C5'A—C6'A C1'—C6'—C5' 119,2 (7) C1'A—C6'A—C5'A Размер угла, ° 116,6 (5) 106,1 (5) 109,3 (5) 116,3 (6) 109,1 (5) 112,1 (6) 111,0 (5) 124,2 (7) 118,7 (6) 117,1 (6) 119,7 (6) 120,3 (6) 120,0 (6) 120,6 (7) 119,3 (6) 119,5 (6) 121,2 (6) 118,8 (6) 117,2 (6) 121,6 (6) 121,2 (6) 118,2 (6) 120,2 (6) 121,6 (6) 119,2 (7) 118,5 (6) 122,2 (6) 121,0 (7) 121,9 (6) 118,8 (6) 119,3 (6) 124,0 (6) 115,9 (6) 120,0 (7) 120,1 (7) 120,4 (6) Расшифрованная структура кристаллической ячейки ДКВт депонирована в международной базе кристаллографических данных Cambridge Structural Database (Deposition Number: 1892198).

70 A . B . C D Рисунок 3.13 – Дифрактограммы фазовых модификаций ДКВ (условия см. 7.5.7): А – ДКВфс, В – ДКВт, С – ДКВс, D – ДКВв

71 Учитывая возможную аморфную природу исследуемых объектов, провести сопоставительный анализ при помощи РСА не представлялось возможным. Поэтому был использован метод РПД, который является одним из наиболее распространенных для исследования фазового состояния фармацевтических субстанций и рекомендован ГФ РФ XIV [8]. Для всех анализируемых модификаций ДКВ были получены дифрактограммы (Рисунок 3.13). Результаты РПД подтверждают данные молекулярного моделирования, согласно которым ДКВс и ДКВв обладают аморфной природой, на что указывает характерное гало на спектрах. Однако первый максимум отражения сфероидной формы приходится на 2θ 24,92°, в то время как для волокнистой модификации максимум выявлен при 2θ 8,94°. На основании этих спектральных данных можно сделать вывод, что ДКВс и ДКВв являются различными аморфными модификациями исследуемого природного флавоноида [34]. В ходе анализа профиля дифрактограмм ДКВфс и ДКВт подтверждено, что данные образцы представляют собой кристаллические твердые фазы. Их спектры РПД характеризуются наличием одинакового набора пиков с 2θ 7,2°, 7,7°, 14,3°, 15,0°, 15,5°, 21,0°, 25,6°, 26,3°, 27,4°, 31,7°, 34,6°, 37,9°, 39,3° и 46,3°. Более детальное изучение спектров РПД исследуемых кристаллических форм ДКВ позволяет выявить различия в интенсивности дифрационных пиков (Рисунок 3.14). Прежде всего, на дифрактограмме ДКВфс наблюдается большее число пиков, превышающих уровень шума, а на спектре ДКВт присутствует несколько новых пиков с 2θ 9,2°, 10,8°, 11,6°, 33,9°, 42,5° и 44,7°. Данные различия можно объяснить изменением строения твердой фазы ДКВ в процессе супрамолекулярного синтеза. В результате сопоставительного анализа установлено, что в дифрактограмме ДКВт наблюдается перераспределение интенсивностей сигналов и имеется ряд отражений, не характерных для пространственной группы С2 (27,6º, 31,0º, 39,6º и 41,2º). Отсутствие отражений при 28,2º, 33,8º и 44,5º доказывает, что в структуре кристаллов ДКВт нет свободной мочевины [183]. С помощью программы MOLSV выявлено, что Ван-дер-Ваальсов объем молекул

72 мочевины и воды составили 40,4 Å и 13,1 Å, соответственно. Согласно данным РСА, в твердой фазе микротрубок ДКВ имеются каналы диаметром 45,0 Å. Таким образом, можно предположить, что ДКВт представляет собой клатрат, в котором мочевина выступает в качестве молекулы-гостя в кристаллической решетке сестергидрата ДКВ. Однако положение и интенсивность пиков на дифрактограммах не позволили сделать однозначный вывод о наличии полиморфизма у данного биофлавоноида, поэтому для дальнейших исследований использовали термические методы анализа (ДСК и ТГА), рекомендуемые фармакопеей [8]. А Рисунок 3.14 – Штрихрентгенограммы: А – ДКВфс, В – ДКВт В Для образцов ДКВфс, ДКВт и ДКВс были получены термограммы (Рисунок 3.15). Все анализируемые порошки начинают плавиться при 228±1 °C с последующим разложением, на что указывает характерный волнистый профиль кривой ДСК и постепенное снижение массы на ТГА. Также во всех образцах обнаружена сорбционная вода (от 2,00 до 5,00% по массе), поскольку на их термограммах присутствует пологий экзотермический эффект в области от 30 до 100 °C. Эти данные количественно не согласуются с результатами РСА, что вполне объяснимо, в силу ограничений метода ТГА [135].

73 А В С Рисунок 3.15 – Термограммы фазовых модификаций ДКВ (условия см. 7.5.8): A – ДКВфс, B – ДКВт, C – ДКВс

74 Результаты термического анализа ДКВт и ДКВс содержат принципиальные различия, позволяющие отнести их к фазовым модификациям. Так, термограмма ДКВс характеризуется наличием эндотермического эффекта в диапазоне от 147,0 до 157,9 °С. Это можно интерпретировать как монотропный фазовый переход из одного твердого состояния в другое, в процессе которого аморфная модификация преобразуется в стабильную кристаллическую форму. На ДСК ДКВт присутствует экзотермический эффект с максимумом при 181,5 °С, который может быть связан с разложением мочевины, находящейся в порах трубчатой формы. Для подтверждения этого предположения, было проведено дополнительное исследование методом СТА МС (Рисунок 3.16). Наличие комплекса характеристических пиков [87], выявленных на спектре: m/z 14 (N+), 15 (NH+, CH3+), 16 (NH2+), 17 (NH3+, OH+), 28 (CO+, N2+), 29 (HCO+), 42 (NCO+), 43 (HNCO+), 44 (CO2+) – указывает на присутствие мочевины. Рисунок 3.16 – Спектры СТА МС ДКВт (условия см. 7.5.8) Для формирования полной картины природы ДКВфс и ДКВт был привлечен высокотехнологичный метод – РПД выполненная in situ при различных температурах (Рисунок 3.17).

75 А В С Рисунок 3.17 – Дифрактограммы фазовых модификаций ДКВ при нагревании до 170 °С (условия см. 7.5.7): A – ДКВфс, B – ДКВт, C – ДКВс

76 В ходе нагревания для образца ДКВфс, не выявлено существенных изменений на дифрактограмме, за исключением исчезновения пика при 2θ 15,3° (что может быть связано с удалением сорбционной воды). Следовательно, данная форма биофлавоноида является наиболее термодинамически стабильной и именно ее плавление наблюдается на термограммах при температуре 228±1 °C. Однако спектр РПД ДКВт существенно изменился в процессе термической обработки: появился ряд новых пиков при 2θ 10,9°, 12,1°, 18,2°, 23,4°, 24,8°, 28,4°, 29,8°, 30,9° и 32,6°, в то время как сигналы при 2θ 11,6°, 15,3°, 23,0°, 24,0° и 25,9° погасли. Произошел фазовый переход из одного кристаллического состояния в другое. В результате анализа ДКВс на дифрактограмме отмечено преобразование аморфного гало в спектр, имеющий профиль, характерный для кристаллической твердой фазы. Важно отметить, что спектры РПД фазовых модификаций, полученные после нагревания до 170 °С, имеют одинаковые положения и интенсивности пиков для всех исследованных образцов. Следовательно, образовалась одна и та же фаза ДКВ, которая, согласно полученным данным, идентична исходной фармацевтической субстанции. Результаты исследования позволяют однозначно утверждать, что все изучаемые объекты принадлежат к различным фазовым модификациям ДКВ. Таким образом, в ходе комплексного анализа физико-химическими методами выявлено, что ДКВфс, ДКВт, ДКВс и ДКВв представляют собой отдельные фазовые модификации: ДКВс и ДКВв – аморфные формы, а ДКВфс и ДКВт – кристаллические порошки. Причем ДКВт является кристаллогидратом, поэтому его можно считать псевдополиморфной модификацией по отношению к ДКВфс, которая, в свою очередь, оказалось наиболее термодинамически стабильной формой биофлавоноида. 3.3. Физико-химические свойства фазовых модификаций дигидрокверцетина Смена фазового состояния не приводит к появлению новых химических свойств вещества или к изменению аффинности по отношению к биологическим

77 мишеням. Однако различное строение фаз отражается на их физико-химических свойствах. 3.3.1. Растворимость Растворимость в терминах ГФ РФ XIV. Одной из основных целей, преследуемых в ходе модификации фазового состояния ДКВ, было улучшение его биологической доступности. Косвенным параметром, позволяющим судить об изменении биофармацевтических растворимость в воде при характеристик комнатной температуре. вещества, В является соответствии с терминологией ГФ РФ XIV ДКВфс, ДКВт, ДКВс и ДКВв можно отнести к категориям очень мало растворим, мало растворим, мало растворим и растворим, соответственно. Следовательно, можно ожидать, что все новые фазовые модификации ДКВ будут обладать улучшенными биофармацевтическими свойствами по сравнению с исходной субстанцией. Седиментационный метод. Для количественного выражения растворимости ДКВ в воде при комнатной температуре использовали седиментационный метод с последующим спектрофотометрическим определением ДКВ (условия см. 7.5.9). Для этого строили калибровочный график зависимости оптической плотности водного раствора от концентрации ДКВ (Рисунок 3.18). Рисунок 3.18 – Калибровочный график для определения концентрации ДКВ в воде при комнатной температуре

78 Установлена линейная зависимость между этими величинами в диапазоне концентраций от 0,5 до 2,5 мг/мл (r2 = 0,9960). Данный интервал был выбран на основании литературных данных о растворимости ДКВ [185; 186] и результатов оценки растворимости фазовых модификаций в воде по методике ГФ РФ XIV. По прошествии 6 ч кривая концентраций выходила на плато, и устанавливалось равновесие между твердой фазой и растворенными молекулами флавоноида (Таблица 3.7). Значения растворимости, полученные для ДКВ фс хорошо согласуются с литературными источниками, согласно которым данный параметр варьирует от 0,87 мг/мл до 0,96 мг/мл [185; 186]. В результате проведенного анализа было рассчитано, что равновесная концентрация ДКВ с в воде при комнатной температуре в 2,225 раза выше аналогичного показателя для ДКВфс. Таблица 3.7 – Зависимость концентрации ДКВ от времени растворения Концентрация ДКВ, мг/мл Образец 0ч 1ч 2ч 4ч ДКВфс 0,7004±0,0159 0,7640±0,0174 0,7846±0,0179 0,8837±0,0201 ДКВс 1,6421±0,1767 1,7637±0,1898 1,8217±0,1961 2,0994±0,2260 6ч 0,9557±0,0230 2,1265±0,2289 3.3.2. Сорбционные свойства Поглощение иода. Трубчатая структура ДКВт позволяет ожидать у этой фазовой модификации наличие сорбционных свойств. Данное предположение было подтверждено на модели сублимированного иода (условия см. 7.5.10), который заполнял внутренние полости ДКВт (Рисунок 3.19). А В Рисунок 3.19 – Микроскопия частиц ДКВт: A – микротрубка, B – микротрубка после поглощения сублимированного иода

79 В ходе микроскопического исследования было обнаружено изменение цвета и прозрачности микротрубок, в то время как для ДКВфс в этих условиях видимых изменений не наблюдали. В процессе десорбции галогена пробирка типа Эппендорф наполнилась парами розового цвета. В пробирке с ДКВфс данный процесс не происходил (Рисунок 3.20). Установленные различия позволяют утверждать, что молекулы иода не адсорбируются на поверхности субстанции а заполняют внутренние полости трубок за счет капиллярных эффектов. Рисунок 3.20 – Десорбция иода: слева – ДКВфс, справа – ДКВт Метод Киплинга. Для количественной характеристики сорбционных свойств ДКВт и их сопоставительного анализа в сравнении с ДКВфс была построена изотерма Ленгмюра (условия см. 7.5.10) на базе метода Киплинга [97]. Для разработки модельной системы, подобрали растворитель, сорбируемое вещество и способ определения его концентрации в растворе. В качестве растворителя выбрали циклогексан, который характеризуется приемлемым профилем безопасности и является неполярным растворителем, что позволяет избежать растворения частиц ДКВ в ходе эксперимента. Для количественной оценки наиболее оптимальным вариантом является спектрофотометрический метод анализа ввиду простоты пробоподготовки. В связи с этим, сорбируемый агент должен удовлетворять следующим критериям:  обладать лиофильными свойствами для того, чтобы сорбция осуществлялась не за счет меньшего сродства вещества к растворителю, а за счет капиллярных свойств сорбента;

80  иметь длинную цепь сопряжения – чтобы была возможность осуществить спектрофотометрический анализ;  характеризоваться пересекающимся хотя со бы одним спектром ДКВ, максимумом чтобы поглощения, исключить не возможные погрешности. Рисунок 3.21 – Структурная формула Судана III Этим критериям соответствует Судан III (Рисунок 3.21), широко используемый в гистохимическом анализе эфирных масел при проведении фармакогностических исследований. Спектр данного красителя содержит несколько максимумов поглощения, но один из них приходится на длину волны 505 нм, что позволяет использовать данный краситель без внесения поправок на ДКВ (Рисунок 3.22). Рисунок 3.22 – УФ/ВИД-спектр Судана III в циклогексане при концентрациях от 0,0016 ммоль/л до 0,0500 ммоль/л Калибровочный график для осуществления количественного анализа строили в координатах оптическая плотность : концентрация Судана III (Рисунок 3.23). Выбор диапазона концентраций обусловлен оптимальными

81 значениями оптической плотности при высоких концентрациях (0,0500 ммоль/л) и возможностью отличить сигнал от шума при низких концентрациях (0,0016 ммоль/л). При этом сохраняется линейная зависимость между концентрацией и оптической плотностью циклогексанового раствора Судана III (r2 = 0,9996). Рисунок 3.23 – Калибровочный график для определения концентрации Судана III в циклогексане Результаты количественного анализа сорбционных свойств ДКВфс и ДКВт представлены в Таблице 3.8. Поскольку значение константы Ленгмюра для обоих объектов исследования меньше 1, можно сделать вывод, что процесс десорбции Судана III с поверхности ДКВ превалировал над сорбцией. В то же время сорбционная способность для ДКВфс и ДКВт составила 84,80 мг/мг и 218,75 мг/мг, соответственно. Таким образом, сорбционные свойства трубчатой формы в 2,6 раза выше по сравнению с исходной фармацевтической субстанцией. Таблица 3.8 – Сорбционные свойства фазовых модификаций ДКВ Доля поглощенного красителя (%) Параметры изотермы Ленгмюра при различных массах сорбента Образец 10,0 25,0 50,0 75,0 100,0 Сорбционная Константа R2 мг мг мг мг мг способность, мг/мг Ленгмюра ДКВфс 0,9 1,2 3,4 4,6 5,3 84,80 0,027 0,9674 ДВКт 1,6 2,8 5,6 11,5 15,6 218,75 0,101 0,9818 Таким образом, был разработан и реализован системный подход к исследованию фазовых модификаций (Рисунок 3.24).

Рисунок 3.24 – Концепция системного подхода к исследованию фазовых модификаций ДКВ 82

83 По результатам проведенного анализа физико-химических свойств изучаемых объектов установлены существенные различия между формами ДКВ. Полученные данные могут послужить фундаментальной базой для внедрения синтезированных модификаций биофлавоноида в реальную клиническую практику. Выводы по главе  Разработан системный подход к анализу фазовых модификаций ДКВ, сочетающий рентгенографические, термические, спектральные и микроскопические методы анализа: o подтверждено отсутствие образования новых ковалентных связей в молекуле ДКВ в составе фазовых модификаций; o установлено, что ДКВт является псевдополиморфной модификацией ДКВфс, а ДКВс и ДКВв – различными аморфными формами ДКВфс.  Описана микроскопическая морфология фазовых модификаций ДКВ: трубчатая, сферическая, волокнистая.  Расшифрована структура кристаллической ячейки ДКВт, в которой на 2 молекулы биофлавоноида приходится 5 молекул воды – полученные данные депонированы в международной базе кристаллографических данных Cambridge Structural Database (Deposition Number: 1892198).  Обнаружено повышение растворимости в воде при комнатной температуре для ДКВт, ДКВс и ДКВв по сравнению с ДКВфс: согласно терминологии ГФ РФ XIV они отнесены к категориям мало растворим, мало растворим, растворим и очень мало растворим, соответственно.  Разработана методика количественной оценки сорбционных свойств ДКВ на базе спектрофотометрического метода анализа в неполярном растворителе с использованием Судана III в качестве сорбируемого вещества.  Выявлено улучшение сорбционных свойств ДКВт в 2,6 раза по сравнению с ДКВфс.

84 ГЛАВА 4. Фрактальный анализ лиофилизатов дигидрокверцетина Наличие фрактальной морфологии образцов ДКВв, выявленной в ходе микроскопического анализа, позволило предположить возможную взаимосвязь между геометрическими характеристиками лиофилизатов, такими как фрактальная размерность, и их физико-химическими свойствами. Фрактальная геометрия является сравнительно молодой математической концепцией, которая, тем не менее, уже нашла свое прикладное применение в различных областях науки [52; 131] и отраслях хозяйства, в частности, в пищевой промышленности [57; 75]. Известно, что фрактальные структуры часто образуются в результате хаотических процессов. Такие процессы очень чувствительны к изначальным условиям. Поэтому результат действия хаотических сил может изменяться непредсказуемым образом, однако он не является случайным (не стохастическим). Также важно оговорить, что в природе объекты не полностью удовлетворяют критерию фрактальности. Данную геометрическую особенность называют статистическим самоподобием [71]. 4.1. Взаимосвязь морфологии и свойств лиофилизатов 4.1.1. Фракталы Чтобы проверить гипотезу о наличии взаимосвязи между фрактальной размерностью лиофилизатов и их физико-химическими свойствами, были синтезированы новые объекты ДКВ с различными коформерами в молярном соотношении 1:1 (условия см. 7.6.1). Полученные объекты были подвергнуты морфологическому анализу методом оптической микроскопии (Рисунок 4.1). Все они обладали гомогенной структурой, а большинство из них можно отнести к хоппер-формам – твердая фаза образовывала микрообъектов, не заполняя внутренний объем. только внешние грани

85 А B C D E F Рисунок 4.1 – Микрофотографии лиофилизатов ДКВ с различными коформерами (условия см. 7.6.2): А – без коформера, В – с бензальдегидом, С – с ванилином, D – с коричным альдегидом, E – с мочевиной, F – с никотиновой кислотой Несмотря на кажущуюся морфологическую однородность полученных лиофилизатов, при использовании программного обеспечения, были установлены различия фрактальной размерности их структурных элементов (условия см. 7.6.3). Для этих целей применяли программы FDim и Gwyddion от двух разработчиков, чтобы исключить искажение результатов исследования, вызванные возможными ошибками компьютерного кода. В обоих инструментах реализован алгоритм boxcounting, в ходе которого расчет фрактальной размерности (Dc) осуществляется по формуле:

86 (4.1) , где λ – диаметр области, подвергнутой исследованию, N – число темных пикселей, обнаруженных внутри исследуемой области. Путем математического преобразования из этой формулы можно получить уравнение прямой зависимости количества темных пикселей от логарифма диаметра исследуемой области: (4.2) . В процессе реализации алгоритма box-counting в виртуальном пространстве программного обеспечения происходит поэтапное уменьшение площади исследуемой области. На основании проведенных расчетов осуществляется построение графика, на котором по оси абсцисс указан диаметр анализируемой области, а по оси ординат – количество темных пикселей. Полученные точки аппроксимируются в прямую линию, для которой известны значения λ и N(λ). Это, в свою очередь, дает возможность рассчитать искомое значение фрактальной размерности. Результаты проведенного математического анализа Таблице 4.1. Относительное среднеквадратическое представлены в отклонение всех анализируемых объектов не превышало 5%, что является приемлемым значением для фармацевтического анализа. U-критерий Манна-Уитни использовали для оценки степени однородности значений фрактальной размерности, полученных независимо в программах FDim и Gwyddion. Этот параметр был применён, поскольку изучаемые величины не являются ни бинарными, ни дискретными, а размер выборки не позволяет оценить принадлежность данного ряда значений к нормальному распределению. Статистически значимые различия достигались при U-критерии меньше 7. Таким образом, был сделан вывод, что рассчитанные значения фрактальной размерности не зависят от используемого программного обеспечения.

Никотиновая кислота Мочевина Коричный альдегид Ванилин Бензальдегид FDim Без коформера Gwyddion FDim Gwyddion FDim Gwyddion FDim Gwyddion FDim Gwyddion FDim Gwyddion Программное обеспечение Коформер Серия 1 2,441 2,455 2,316 2,422 2,307 2,322 2,383 2,331 2,456 2,463 2,482 2,456 2,406 2,400 2,367 2,406 2,580 2,621 2,588 2,580 2,364 2,333 2,388 2,364 Серия 2 2,427 2,435 2,392 2,451 2,999 2,309 2,331 2,338 2,469 2,506 2,507 2,469 2,412 2,421 2,411 2,412 2,601 2,590 2,580 2,601 2,415 2,368 2,294 2,415 Серия 3 2,423 2,424 2,457 2,499 2,307 2,322 2,383 2,331 2,486 2,494 2,500 2,486 2,410 2,498 2,309 2,410 2,594 2,568 2,591 2,594 2,396 2,351 2,366 2,396 Фрактальная размерность 2,369 2,365 2,597 2,589 2,399 2,410 2,474 2,494 2,338 2,309 2,423 2,434 Среднее значение 0,020 0,042 0,017 0,011 0,023 0,060 0,021 0,014 0,026 0,011 0,064 0,012 Стандартное отклонение Метрологические характеристики Таблица 4.1 – Фрактальная размерность твердых монофазных бинарных систем ДКВ 17,0 13,0 10,0 8,0 10,5 17,0 U-критерий Манна-Уитни 87

88 4.1.2. Физико-химическая характеристика Растворимость всех полученных объектов была оценена в соответствии с методологией ГФ РФ XIV (Таблица 4.2). Таблица 4.2 – Растворимость твердых монофазных бинарных систем с ДКВ* Растворимость в воде Коформер в терминологии ГФ РФ XIV в числовом эквиваленте, г/мл бензальдегид умеренно растворим 0,01 – 0,03 ванилин хорошо растворим 0,10 – 1,00 коричный альдегид растворим 0,03 – 0,10 мочевина очень хорошо растворим > 1,00 никотиновая кислота умеренно растворим 0,01 – 0,03 *лиофилизат ДКВ без коформеров по ГФ РФ XIV – растворим (0,03 – 0,10 г/мл) В ходе сопоставительного анализа значений фрактальных размерностей морфологических элементов твердых монофазных бинарных систем ДКВ и их растворимости в воде при комнатной температуре установлено наличие логарифмической зависимости (Рисунок 4.2). Рисунок 4.2 – Логарифмическая зависимость растворимости от фрактальной размерности их морфологических элементов лиофилизатов ДКВ Обнаруженная взаимосвязь (r2 = 0,9417) может быть объяснена физическим смыслом фрактальной геометрии. Скорость и полнота растворения субстанции

89 зависит от площади поверхности соприкосновения твердой фазы и растворителя. Рост значения фрактальной размерности взаимосвязан с увеличением площади взаимодействия с молекулами воды – поверхность лиофилизатов занимает промежуточное состояние между 2D и 3D объектами. Поскольку аналитический метод должен не только описывать состояние хорошо известных объектов, но и предсказывать свойства еще не изученных объектов, к полученным значениям фрактальной размерности была применена перекрестная кросс-валидация (Таблица 4.3). Рассчитанные величины не имели статистически значимого отличия от экспериментальных данных. Таким образом, была подтверждена возможность использования фрактального анализа в контроле качества лиофилизатов. Таблица 4.3 – Перекрестная кросс-валидация (условия см. 7.10) Экспериментальная Рассчитанная Относительная Коформер фрактальная фрактальная ошибка, % размерность* размерность Без 2,434 2,400 1,40 коформера Бензальдегид 2,309 2,359 2,18 Ванилин 2,494 2,530 1,45 Коричный альдегид 2,410 2,405 0,22 Мочевина 2,589 2,603 0,22 2,328 1,55 Средняя относительная ошибка, % 1,17 Никотиновая 2,365 кислота * получена в программе FDim 4.2. Разработка и валидация методики фрактального анализа В фармацевтическом анализе различают методы, предназначенные для качественной и количественной оценки чистоты фармацевтической субстанции, что закреплено в ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитической методики» [8]. Фрактальную размерность можно отнести к показателям чистоты субстанции. По требованию ГФ РФ XIV пригодность аналитических методик, предлагаемых к

90 применению в контроле качества фармацевтических субстанций, должна быть подтверждена экспериментально. В связи с этим были рассчитаны валидационные характеристики методики фрактального анализа для лиофилизатов ДКВ (Таблица 4.4). Результаты позволяют признать потенциал данного подхода в качестве количественной методики контроля чистоты субстанций. Поскольку фракталы тесно сопряжены с хаотическими процессами, в которых небольшое изменение условий приводит к существенным переменам в результате, была проведена оценка устойчивости методики. В целом валидационные характеристики фрактального анализа соответствуют требованиям ГФ РФ XIV. Однако, ввиду высокой чувствительности результата к таким параметрам, как степень увеличения объекта, положение и размер анализируемой области, реализовываться данный метод может исключительно с применением интеллектуальных технологий. Таблица 4.4 – Валидационные характеристики метода фрактального анализа (условия см. 7.10) Валидационная характеристика Фрактальный анализ Нормы по ГФ РФ XIV Специфичность + +/- Предел обнаружения 0,3927 Должна быть оценена Правильность 0,0384 <0.0500 Сходимость 0,0400 <0.0500 на увеличение в х10 раз ± 0,0200 на изменение размера Устойчивость области анализа на 100 пикс2 на смещение положения ± 0,0002 Должна быть оценена ± 0,0007 области анализа на 1 пикс Помимо объектов на базе малых молекул (ДКВ), данная методика была апробирована на лиофилизатах пробиотика бифидобактерий бифидум монокомпонентного (ФС.3.3.1.0061.18 «Пробиотик бифидобактерий бифидум монокомпонентный, лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь и местного применения» [8]). Дальнейшая автоматизация этой методики позволит

91 разработать инновационный неразрушающий метод контроля качества фармацевтических субстанций. Полученные результаты будут способствовать реализации концепции Индустрии 4.0 в отечественном фармацевтическом производстве. Выводы по главе  Установлена взаимосвязь между морфологией лиофилизатов ДКВ и их физико-химическими свойствами.  Применены принципы фрактальной геометрии для разработки аналитической методики неразрушающего контроля качества лиофилизатов ДКВ на базе интеллектуальных технологий.  Валидирована методика фрактального анализа для лиофилизатов ДКВ.

92 ГЛАВА 5. Биофармацевтические свойства фазовых модификаций в условиях ex vivo Научное сообщество и регуляторные органы отмечают необходимость и важность проведения сопоставительного анализа биофармацевтических свойств полиморфных модификаций фармацевтических субстанций [3; 8; 78; 99]. В соответствии с Биофармацевтической классификацией соединений (БКС), в зависимости от растворимости и проницаемости, изучаемые объекты относят к одной из четырех групп [19]. По первому параметру фармацевтические субстанции подразделяют на соединения с «высокой» и с «низкой» растворимостью в зависимости от способности раствориться в 250 мл воды при температуре 37 °С в количестве, равном высшей разовой дозе [17, 77]. По литературным данным, на территории Российской Федерации был зарегистрирован один препарат на базе ДКВфс – «Диквертин», высшая разовая доза (ВРД) которого в остром периоде заболевания может составлять от 40 до 60 мг [9]. Учитывая, что по классификации ГФ РФ XIV ДКВфс, ДКВт и ДКВс относятся к категориям очень мало растворим (от 0,1 до 1,0 мг/мл), мало растворим и мало растворим (от 1,0 до 10 мг/мл), соответственно, все исследуемые фазовые модификации ДКВ характеризуются высокой растворимостью по БКС. Под «проницаемостью» подразумевают способность действующего вещества всасываться в желудочно-кишечном тракте [19]. Современный технологический уровень позволяет осуществлять исследование данной характеристики фармацевтической субстанции на моделях in vivo и ex vivo. Последний метод биофармацевтических находит все более исследованиях широкое благодаря распространение сочетанию в хорошей воспроизводимости и достоверности результатов со сравнительно низкими затратами на проведение анализа [35]. При изучении проницаемости ex vivo можно использовать эпителиальные клетки аденокарциномы толстого кишечника человека (Сасо-2) и клетки Мадин-Дарби почек собаки (MDCK). Культура клеток

93 Сасо-2 характеризуется более адекватной экспрессией генов, ответственных за синтез АТФ-зависимых эффлюксных насосов. В то же время клетки MDCK быстрее формируют монослой (достигают конфлюентности), что позволяет интенсифицировать проведение биофармацевтических исследований [85; 99]. В литературе имеются сведения об изучении проницаемости ДКВ на модели Сасо-2 [70; 124], однако отсутствуют данные об использовании клеток MDCK для этих целей, в связи с чем, для проведения наших исследований была выбрана именно эта культура. Проведение анализа проницаемости соединения на модели ex vivo предполагает использование планшетов с лунками, позволяющими установить полупроницаемую мембрану, на которой осуществляется выращивание клеточной культуры (Рисунок 5.1). Рисунок 5.1 – Схема лунки планшета для оценки проницаемости соединения Исследуемый образец помещается с апикальной стороны монослоя клеток в донорный раствор, после чего система культивируется некоторое время. Через определенные промежутки принимающего подвергают раствора осуществляется с количественному забор базолатеральной анализу. В аликвотных стороны связи с долей монослоя, этим, для из которые изучения проницаемости фазовых модификаций ДКВ требовалось разработать метод для определения концентрации ДКВ в принимающем растворе и цитотоксические свойства флаванонола по отношению к клеткам MDCK. оценить

94 5.1. Дизайн эксперимента ex vivo 5.1.1. Разработка методики количественного определения Количественный анализ в ходе исследования проницаемости биологически активных веществ предполагает использование максимально чувствительного подхода, поскольку на начальных этапах эксперимента концентрация соединения в принимающем растворе очень мала и выражается в нмолях. Наиболее подходящим методом для этой цели является высокопрецизионный метод ВЭЖХ со спектрофотометрическим способом детектирования, учитывая наличие хромофорной системы в ДКВ. Рисунок 5.2 – Хроматограмма раствора ГСО ДКВ, концентрация – 0,01 мг/мл (условия см. 7.7.1) С целью повышения чувствительности метода был использован изократический режим, позволяющий повысить соотношение сигнал-шум. В ходе анализа различных соотношений растворителей и модификаторов в качестве подвижной фазы был выбран состав, включающий 2% раствор муравьиной кислоты в воде (70%) и ацетонитрил (30%). Хроматографирование осуществляли в обращенно-фазовом режиме на привитой октадецильной неподвижной фазе. Скорость потока подвижной фазы – 1,0 мл/мин. Детектирование проводили

95 спектрофотометрически в максимуме поглощения ДКВ при длине волны 290 нм. В этих условиях ВУ ДКВ составило 5,453 мин (Рисунок 5.2). Используя описанные условия хроматографирования, был построен калибровочный график зависимости площади пика от концентрации ДКВ, в интервале измеряемых значений (Рисунок 5.3). Установлена линейная зависимость между этими величинами в диапазоне концентраций от 0,00001 до 0,50000 мг/мл (r2 = 0,9999). На основании полученных данных было рассчитано, что минимальная определяемая концентрация ДКВ данным методом составляет 0,00018 мг/мл. Рисунок 5.3 – Калибровочный график для определения концентрации ДКВ в принимающем растворе Таким образом, на базе метода ВЭЖХ была разработана методика количественного определения ДКВ, приемлемая для оценки содержания биофлавоноида в эксперименте по изучению проницаемости его фазовых модификаций. 5.1.2. Цитотоксические свойства Согласно международной нормативной документации, если лекарственное средство имеет длительную историю использования (более 30 лет для традиционных средств и более 10 лет для остальных), то его безопасность считается доказанной [22]. Однако для проведения эксперимента по

96 исследованию проницаемости на культуре клеток сначала необходимо оценить специфические цитотоксические цитотоксичности свойства лежит ДКВ. реакция В основе окисления определения молекул никотинамидадениндинуклеотида восстановленного (NADH до NAD+). Для визуализации этого процесса традиционно тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид используют 3-(4,5-диметил-2- (МТТ-тест). Посредством медиаторов восстановления бесцветная форма тетразола трансформируется в формазан, характеризующийся длинной цепью сопряжения, раствор которого окрашен в оранжевый цвет. По интенсивности окраски растворов, оцененной спектрофотометрическим методом в максимуме поглощения при длине волны 450 нм, можно судить о выживаемости культуры клеток [122; 169]. Однако данный метод очень чувствителен к условиям проведения МТТтеста, при не соблюдении которых происходит кристаллизация красителя, что негативно сказывается на релевантности полученных результатов. В связи с этим в качестве аналогичного индикатора выживаемости клеток применяют 2-(2метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразола мононатриевую соль (ССК-8), отличающуюся лучшей растворимостью [167; 176]. Методика определения цитотоксичности субстанций при помощи ССК-8 аналогична вышеописанному методу. Химическая основа модифицированного МТТ-теста с помощью ССК-8, использованного в нашей работе, представлена на Рисунке 5.4. Рисунок 5.4 – Химическая основа модифицированного МТТ-теста цитотоксичности субстанции определения

97 В ходе разработки дизайна эксперимента по оценке проницаемости исследуемых модификаций ДКВ принимали во внимание необходимость сохранения их твёрдого состояния. В связи с этим более предпочтительными объектами для проведения испытаний были не истинные растворы ДКВ, а суспензии его различных форм. Эксперимент с использованием суспензий принято называть исследованием «бесконечной проницаемости» (infinity permeability test). Поэтому в ходе цитотоксических испытаний оценивали свойства образцов с достаточно высокой концентрацией биофлавоноида (Таблица 5.1). Оптические плотности для «контроля +» и «контроля –» составляли 0,64899 ± 0,04651 и 0,13942 ± 0,01207, соответственно. Таблица 5.1 – Оптическая плотность клеточных суспензий с ССК-8 (условия см. 7.7.3) Оптическая плотность при λ = 450 нм Исследуемый образец ДКВфс ДКВт ДКВс 2,0000 0,512 ± 0,020 0,490 ± 0,016 0,494 ± 0,020 1,0000 0,534 ± 0,015 0,513 ± 0,023 0,508 ± 0,036 0,5000 0,536 ± 0,008 0,543 ± 0,026 0,531 ± 0,040 0,577 ± 0,046 0,547 ± 0,022 0,547 ± 0,029 Концентрация ДКВ, 0,2500 мг/мл 0,1250 0,594 ± 0,032 0,552 ± 0,019 0,547 ± 0,039 0,0625 0,592 ± 0,028 0,584 ± 0,031 0,568 ± 0,040 0,0313 0,609 ± 0,013 0,592 ± 0,023 0,572 ± 0,041 0,0156 0,626 ± 0,010 0,600 ± 0,032 0,582 ± 0,031 После математической обработки полученных спектрофотометрических данных была установлена обратная логарифмическая зависимость между концентрацией ДКВ и выживаемостью клеток MDCK (Рисунок 5.5). В результате проведенного исследования был подтвержден высокий профиль безопасности ДКВфс, что хорошо согласуется с литературными данными [70; 144], и выявлена низкая цитотоксичность его синтезированных фазовых модификаций. Выживаемость клеток MDCK на фоне использования различных форм и концентраций флаванонола превышала или статистически не отличалась от 70%. Обнаруженный логарифмический характер зависимости можно объяснить тем, что, с повышением концентрации биофлавоноида, вклад токсического действия

98 молекул на выживаемость культуры клеток ослабевает, и наблюдаемые изменения обусловлены скорее физическим воздействием частиц твердой фазы. Рисунок 5.5 – Логарифмическая зависимость выживаемости клеток от концентрации ДКВ Можно отметить, что статистически значимая разница в цитотоксических свойствах ДКВфс, ДКВт и ДКВс по отношению к клеткам MDCK отсутствовала. Однако, исходя из наклонов прямых на графике выживаемости, можно сделать вывод, что у аморфной формы наблюдается тенденция к более приемлемому профилю безопасности (3,29 ± 0,10) в сравнении с кристаллическими модификациями (4,36 ± 0,18 и 4,59 ± 0,21 для ДКВт и ДКВфс, соответственно). На основании полученных результатов модифицированного МТТ-теста суспензии с концентрацией 1 мг/мл были выбраны для осуществления сопоставительной оценки в формате бесконечной проницаемости.

99 5.1.3. Оценка конфлюентности культуры клеток Одним из важных этапов исследования проницаемости фармацевтических субстанций ex vivo является окончательное формирование монослоя модельной культуры клеток, что позволяет достигать более воспроизводимых и релевантных результатов эксперимента. В ходе описываемого исследования конфлюентность клеток MDCK контролировали путем микроскопического анализа и измерения трансэпителиального электрического сопротивления. При изучении поверхности полупроницаемой мембраны под микроскопом (Рисунок 5.6) было установлено, что на первый день культуральная среда представляет собой суспензию отдельных клеток MDCK и их агломератов. По прошествии девяти суток наблюдали формирование гомогенного монослоя. А В Рисунок 5.6 – Микроскопический контроль конфлюентности клеток MDCK (условия см. 7.7.4): A – день 1, B – день 9 Согласно рекомендациям [35; 104], мониторинг достижения конфлюентности клеточной культуры должен осуществляться путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления (Таблица 5.2). В ходе проведенного анализа выявлено, что, начиная с седьмого дня, вольтметр регистрировал величины, не имеющие статистически значимых отличий от последующих измерений. Это позволяет говорить о выходе на плато. В то же время, полученные значения трансэпителиального электрического сопротивления превышали 260 Ом/см2, что соответствует минимальной величине монослоя.

100 Таблица 5.2 – Мониторинг достижения конфлюентности Трансэпителиальное электрическое сопротивление, Ом/см 2 День ДКВфс ДКВт ДКВс 1 169,50 ± 42,11 180,50 ± 23,56 181,25 ± 22,38 3 174,25 ± 19,81 200,25 ± 22,10 205,25 ± 20,61 5 220,50 ± 06,66 245,25 ± 13,82 233,50 ± 15,80 7 261,00 ± 14,76 270,00 ± 19,13 261,50 ± 06,56 9 266,00 ± 05,60 277,25 ± 14,24 273,75 ± 09,60 Таким образом, используя два независимых метода анализа, было подтверждено формирование монослоя клеток MDCK, и готовность системы для сопоставительного анализа проницаемости фазовых модификаций ДКВ. 5.2. Определение проницаемости фазовых модификаций дигидрокверцетина Оценку биофармацевтических свойств полученных фазовых модификаций ДКВ методом бесконечной проницаемости на модели ex vivo осуществляли в течение двух часов (Рисунок 5.7). В первой измерительной точке (15 мин) различия между кристаллическими формами ДКВ имели статистически значимые различия: концентрация флавоноида в лунках с ДКВфс была в два раза выше, чем с ДКВт – 0,12465 ± 0,01870 мг/мл и 0,06384 ± 0,02711 мг/мл, соответственно. В дальнейшем разница между исследуемыми образцами нивелировалась. После математической обработки полученных профилей изменения концентрации ДКВ в принимающем растворе не выявлено существенных различий между кристаллическими формами биофлавоноида. В то же время профиль изменения концентрации ДКВс характеризовался более выраженными статистически значимыми различиями в сравнении с ДКВфс и ДКВт. В первой измерительной точке средняя концентрация биофлавоноида в лунках с аморфной формой была выше остальных (0,13503 ± 0,01961 мг/мл). Однако дальнейшее увеличение количества ДКВ в принимающем растворе происходило не настолько интенсивно, как с кристаллическими образцами. В конечной измерительной точке (120 мин) концентрация флаванонола в лунках со сфероидной модификацией была

101 статистически значимо ниже, чем с ДКВфс и ДКВт – 0,29974 ± 0,01230 мг/мл, 0,35887 ± 0,04191 мг/мл и 0,36019 ± 0,03562 мг/мл, соответственно. Наблюдаемые различия можно объяснить общей термодинамической неустойчивостью аморфной твердой фазы. Изначальная улучшенная растворимость позволила достигнуть высоких концентраций. Вероятно, в процессе пребывания в испытуемой системе происходит фазовый переход, который сопровождается снижением растворимости, достижением насыщенного раствора и, как следствие, уменьшением проницаемости. Рисунок 5.7 – Изменение концентрации ДКВ в принимающем растворе (условия см. 7.7.4) Для количественной интерпретации результатов исследований проницаемости фармацевтических субстанций ex vivo используют значение кажущейся проницаемости (Рарр), которое рассчитывают на основании изменения концентрации соединения в принимающей ячейке с течением времени (Таблица 5.3). Выявлены статистически значимые различия в значениях кажущейся проницаемости для всех изученных фазовых модификаций ДКВ. Трубчатая форма характеризовалась самым высоким значением Рарр, в то время как у аморфной модификации наблюдали более пролонгированный режим.

102 Таблица 5.3 – Результаты оценки кажущейся проницаемости и выживаемости клеток Измеренные параметры Исследуемый образец dC/dT Рарр, см/с · 106 Выживаемость, % ДКВфс 0,00225 ± 0,00002 14,8 ± 0,3 70,75 ± 9,86 ДКВт 0,00295 ± 0,00001 19,4 ± 0,2 71,33 ± 4,31 ДКВс 0,00162 ± 0,00002 10,7 ± 0,3 86,82 ± 5,55 Интересно отметить, что в ходе последующего измерения трансэпителиального электрического сопротивления были получены данные по выживаемости клеток MDCK, сопоставимые с результатами модифицированного МТТ-теста (см. 5.1.2). У ДКВс выявлен наиболее высокий профиль безопасности, и на этот раз данный параметр достиг статистически значимых различий. Однако, в целом, выживаемость всех клеток MDCK была более 70% во всех случаях. Для классификации фазовых модификаций ДКВ по БКС полученные значения Рарр нужно сравнить с кажущейся проницаемостью соединения, известного высокой биологической доступностью. Одним из «золотых стандартов» в подобных исследованиях является метопролол [35]. Значение Рарр зависит от величины рН среды и, согласно литературным данным, в слабокислой среде для метопролола данное значение установлено на уровне 7,8 см/с • 10⁶ [110; 178]. Следовательно, все исследованные фазовые модификации ДКВ обладают высокой проницаемостью. Сочетание высокой растворимости и высокой проницаемости позволяет отнести ДКВфс, ДКВт и ДКВс к I классу БКС. Вместе с тем, принимая во внимание активную разработку новых лекарственных препаратов на базе ДКВ, следует учитывать, что в перспективе возможно установление более высокой ВРД для данного биофлавоноида, что может привести к переходу ДКВфс во II класс БКС. Выводы по главе  Разработана методика количественного определения ДКВ на основе метода ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрическим детектированием для проведения исследований ex vivo.

103  Продемонстрирован высокий профиль безопасности у ДКВфс и его фазовых модификаций в эксперименте ex vivo на модели клеток MDCK.  Обнаружена повышенная проницаемость у ДКВт в сравнении с исходной фармацевтической субстанцией.  Выявлен пролонгированный режим всасывания для ДКВс.  Установлено, что синтезированные фазовые модификации ДКВ относятся к I классу БКС.

104 ГЛАВА 6. Функциональные свойства фазовых модификаций дигидрокверцетина Неоднородность в физико-химических свойствах фазовых модификаций ДКВ, описанная в главе 3, обуславливает возможность их различного применения. Новые функциональными формы свойствами, ДКВ могут обладать подтверждающими специфичными целесообразность их использования. 6.1. Фармацевтико-технологические свойства Многие лекарственные препараты, зарегистрированные к применению на территории РФ, находятся в форме таблеток. В последнее время все больше внимания уделяют таблеткам, диспергируемым и растворяемым в ротовой полости, что обусловлено высокой биологической доступностью данной лекарственной формы. Особенно часто таблетки для рассасывания применяют при оториноларингологических заболеваниях. Целесообразность использования именно такой формы при лечении воспалительных заболеваний объясняется их эффективностью [20]. Кроме того, данная лекарственная форма может быть особенно привлекательна для тех пациентов, которые испытывают трудности при глотании таблеток: старики, дети, а также пациенты, страдающие от тошноты и психических заболеваний [15]. ДКВ характеризуется наличием противовоспалительного, противовирусного и антибактериального фармакологических эффектов [18]. Поэтому разработка таблеток для рассасывания с целью проведения комплексной терапии воспалительных заболеваний полости рта и горла представляется одним из перспективных направлений исследования ДКВ. Подобные лекарственные препараты должны обладать пролонгированным режимом высвобождения. Следовательно, исходя из результатов анализа биофармацевтических параметров,

105 ДКВс является наиболее подходящим объектом для создания таблеток для рассасывания на основе данного биофлавоноида. В результате совместных работ с кафедрой фармацевтической технологии Института фармации имени А.П. Нелюбина Сеченовского университета был разработан оптимальный действующего вещества состав таблеток для была установлена в рассасывания. соответствии Дозировка с ранее зарегистрированным лекарственным препаратом «Диквертин» - 20 мг [9]. Спектр вспомогательных веществ, вошедших в исследуемые составы, базировался на данных литературных источников с особым вниманием к наиболее используемым компонентам таблеток для рассасывания [15]. В качестве наполнителей и, отчасти, коррегентов вкуса рассматривали дисахарид сахарозу, а также альдиты моносахаридов маннозы (маннитол) и глюкозы (сорбитол). Полимеры натрия крахмала гликолят, кросповидон и натрия кроскармилоза выполняли роль разрыхляющих агентов. В соответствии с требованиями ГФ РФ XIV доля антифрикционного компонента, в качестве которого использовали кальция стеарат, не превышала 1% от общей массы таблеток [8]. Учитывая горький вкус, которым обладает ДКВ, в состав некоторых рецептур таблеток для рассасывания были добавлены коррегенты вкуса аспартам и ментол. В итоге, был разработан следующий оптимальный состав: ДКВ : сахароза : кросповидон : кальция стеарат : ментол – 20 : 265 : 8 : 2 : 5. Общая масса таблетки – 300 мг. Представляло интерес исследовать фармацетико-технологические параметры таблетируемых масс и таблеток, изготовленных на основе ДКВс, в сравнении с исходной фармацевтической субстанцией. 6.1.1. Таблетируемые массы на базе фазовых модификаций Нами был осуществлен сопоставительный анализ сыпучести ДКВ фс и ДКВс, а так же таблетируемых масс на их основе тремя различными методами: по скорости протекания порошка через стандартизованное отверстие, по углу естественного откоса и по насыпному объему (условия см. 7.8.1). Также была изучена прессуемость субстанций.

106 При определении степени сыпучести по скорости протекания порошка установлено, что подвижных свойств ДКВфс и таблетируемой массы на ее основе недостаточно для прохождения ни через одно из трех стандартных отверстий. Для образцов на базе ДКВс показатель сыпучести определен при диаметре отверстия 25 мм (№ 3) – данные измерения представлены в Таблице 6.1. Поскольку отдельные значения отклоняются от среднего более чем на 10%, поэтому целесообразно отметить, что показатели сыпучести аморфной формы и смеси на ее основе укладывались в диапазон от 19,4 г/с до 23,2 г/с и от 11,2 г/с до 18,8 г/с, соответственно. Таблица 6.1 – Сравнение порошков по показателю «Скорость протекания порошка» Скорость протекания порошка, г/с Объект исследования Отдельные измерения I ДКВс II Среднее III субстанция 20,5 23,2 19,4 21,0 таблетируемая масса 11,2 18,8 14,7 14,9 Исходя из результатов определения степени сыпучести по скорости протекания порошка через стандартизованное отверстие, определение степени сыпучести по углу естественного откоса осуществлялось с насадкой № 3. Материал базы, на которую проводилось формирование конуса, представлял собой бумагу. Результаты измерений углов естественных откосов позволяют утверждать, что введение вспомогательных веществ способствовало повышению степени сыпучести исследуемых образцов (Таблица 6.2). При этом углы откосов конусов, сформированных порошками на базе сфероидной формы, характеризовались меньшими значениями, то есть степень их сыпучести, согласно ОФС.1.4.2.0016.15 «Степень сыпучести порошков» – «очень хорошая». В то же время фармацевтическая субстанция демонстрировала «неудовлетворительную» сыпучесть, а в составе таблетируемой массы этот показатель был меньше 45°, что свидетельствовало об «удовлетворительной» сыпучести.

107 Таблица 6.2 – Сравнение порошков по показателю «Угол естественного откоса» Угол естественного откоса, º Объект исследования Проба Отдельные измерения I субстанция ДКВфс таблетируемая масса субстанция ДКВс таблетируемая масса II Среднее III 1 59 45 41 2 47 42 60 3 45 43 39 1 49 42 39 2 51 44 43 3 50 46 38 1 30 33 25 2 45 30 27 3 24 17 35 1 27 25 20 2 17 25 30 3 30 27 19 46,8 44,7 29,6 24,4 В ходе анализа степени прессуемости фазовых модификаций ДКВ по насыпному объему было выявлено преимущество аморфной формы для технологического процесса в сравнении с исходной субстанцией (Таблица 6.3). Таблица 6.3 – Сравнение порошков по показателям прессуемости Коэффициент Индекс Hausner Объект исследования прессуемости субстанция 28,85 1,421 ДКВфс таблетируемая масса 28,57 1,642 ДКВс Индекс Carr, % 29,63 39,08 субстанция 13,73 1,235 19,00 таблетируемая масса 14,58 1,219 17,99 Анализируя результаты измерений, можно сделать вывод, что ДКВ с характеризуется «очень хорошей» сыпучестью и «приемлемой» прессуемостью.

108 ДКВфс обладает прессуемостью. «неудовлетворительной» При этом коэффициент сыпучестью уплотнения и «высокой» фармацевтической субстанции вдвое выше по сравнению с аморфной формой. Полученные данные свидетельствуют о том, что при разработке таблеток на базе аморфной формы потребуется меньшее количество вспомогательных веществ, что является более предпочтительным вариантом как с экономической, так и фармакологической точек зрения. 6.1.2. Характеристики таблеток для рассасывания Проанализированные таблетируемые массы на базе фазовых модификаций ДКВ послужили основой таблеток для рассасывания, полученных прямым прессованием (условия см. 7.1.1). В результате сопоставительного анализа (условия см. 7.8.2-7.8.4) установлено статистически значимое различие по показателю «Распадаемость» (Таблица 6.4). Распадаемость для таблеток на базе ДКВс более чем в 5 раз превышала аналогичный показатель таблеток с ДКВфс. При этом лекарственная форма на основе ДКВфс не укладывались в обозначенное нами референтное время. Однако по характеристикам прочности оба состава соответствовали требованиям ГФ РФ XIV: прочность на сжатие превышала 40 Н, а прочность на истирание была меньше 3%. Таблица 6.4 – Фармацевтико-технологические параметры таблеток на базе ДКВ Прочность Прочность Действующее вещество Распадаемость, на раздавливание, Н на истирание, % таблеток для рассасывания мин ДКВфс 7,1 ± 1,8 74,9 ± 33,6 1,3 ДКВс 36,4± 2,3 81,0 ± 23,4 0,3 Для осуществления исследования таблеток для рассасывания по показателю «Растворение» требовалось определить условия проведения испытания, поскольку в нормативной документации России отсутствуют соответствующие указания. Дизайн анализа основывался на данных базы FDA [64] и был

109 максимально приближен к физиологическим условиям полости рта [108]. Поэтому растворение (условия см. 7.8.5) осуществляли при температуре 37,0 °С в среде, характеризующейся значением рН = 6,8. Для проведения оценки профилей высвобождения действующего вещества из таблеток на базе различных фазовых модификаций ДКВ было необходимо разработать методику количественного анализа биофлавоноида в обозначенных условиях методом спектрофотометрии. В водном растворе со значением рН=6,8 максимум поглощения ДКВ наблюдали при длине волны 324 нм (Рисунок 6.1). Рисунок 6.1 – УФ-спектр ДКВ в фосфатном буфере (рН=6,8), концентрация – 0,03 ммоль/л (условия см. 7.8.5) Для осуществления количественного анализа был построен калибровочный график зависимости оптической плотности ДКВ от его концентрации в растворе (Рисунок 6.2). Выявлена линейная зависимость между этими величинами в интервале от 10 до 50 мг/л (r2 = 0,9966), что соответствовало диапазону измеряемых концентраций ДКВ.

110 Рисунок 6.2 – Калибровочный график для определения концентрации ДКВ при рН=6,8 На основе полученного калибровочного графика была оценена скорость высвобождения ДКВ из таблеток для рассасывания с различными полиморфными формами (Рисунок 6.3). Установлено, что оба исследуемых объекта соответствуют требованиям ГФ РФ XIV: в течение 45 мин происходит высвобождение 75% действующего вещества. Рисунок 6.3 – Профили высвобождения ДКВ из таблеток для рассасывания

111 Следует отметить, что таблетки для рассасывания на базе ДКВ с характеризуются более интенсивным высвобождением биофлавоноида на протяжении первых 5 мин испытания по сравнению с таблетками с ДКВфс (33,37% и 16,25%, соответственно). Однако, в целом, таблетки на основе аморфной формы имеют более пролонгированный режим высвобождения, чем на базе ДКВфс. Это наблюдение было подтверждено путем расчета константы скорости высвобождения действующего вещества и периода полурастворения таблетки (Таблица 6.5). При этом нельзя считать данные образцы эквивалентными, поскольку их коэффициент различия превышал 15%, а коэффициент подобия был менее 50%. Выявленные различия в профилях высвобождения могут быть объяснены природой фазовых модификаций ДКВ, вошедших в состав таблеток для рассасывания. Поскольку аморфные тела характеризуется изотропностью свойств, то ДКВ с выполняла не только функцию действующего вещества, но и служила связывающим агентом. Тем самым обеспечивались дополнительные прочностные характеристики и становился возможным более пролонгированный режим высвобождения. Таблица 6.5 – Сравнение профилей высвобождения ДКВ из таблеток для рассасывания Показатель Константа Период Действующее скорости высвобождения полураспада Коэффициент Коэффициент вещество действующего вещества, таблетки, различия, % подобия, % -1 мин мин ДКВфс 0,034 ± 0,002 20,63 ± 1,13 23,0 ± 1,7 42,8 ± 6,0 ДКВс 0,048 ± 0,002 14,56 ± 0,48 Таким образом, таблетки для рассасывания на основе ДКВс обладают более пролонгированным режимом высвобождения. Это делает их перспективным объектом для дальнейших фармакологических исследований с целью внедрения в клиническую практику в качестве местного антисептика для действия в полости рта при профиля. заболеваниях стоматологического и оториноларингологического

112 6.2. Ранозаживляющие свойства в эксперименте in vivo По литературным данным, ДКВ характеризуется противовоспалительным, антибактериальным и выраженным антиоксидантным фармакологическими эффектами [18]. Поэтому не удивительно, что одной из приоритетных областей медицинской науки, в которой ведется активное исследование терапевтического потенциала данного биофлавоноида, является комбустиология – направление травматологии, изучающее методы врачевания ожогов и связанных с ними патологических состояний. В настоящее время имеется несколько публикаций, в которых, используя различные лекарственные формы ДКВ, удавалось добиться выраженного фармакологического эффекта при лечении ожогов II и III степени [36; 127]. В сравнении с традиционными методами терапии использование ДКВ характеризовалось более физиологичными процессами восстановления поврежденной ткани. Однако к настоящему моменту не было проведено исследований, позволяющих изучить влияние фазового состояния на регенеративное действие ДКВ. Благодаря капиллярным свойствам и более высоким биофармацевтическим характеристикам ДКВт представляется перспективным объектом для проведения подобных исследований. Для получения достоверной информации о фармакологической эффективности биологически активного соединения одним из ключевых этапов исследования является разработка протокола эксперимента, соответствующего современному технологическому уровню и критериям биоэтики. Для этого необходимо подобрать экспериментальных животных, условия моделирования патологического состояния, методы лечения в исследуемых и контрольных группах, а также способы оценки терапевтического эффекта Согласно литературным источникам [37], с точки зрения морфологии покровных тканей собаки и кошки наиболее родственные человеку экспериментальные животные, но их содержание сопряжено с высокими материальными затратами и высоким травматологическим риском при

113 моделировании патологического состояния. Кролики и крысы так же достаточно близки к Homo sapiens, хотя ожоговая болезнь у данных животных сопровождается менее выраженными проявлениями воспалительного процесса, нагноения и грануляции. Имеются сведения, что мыши не подходят для оценки терапевтического эффекта соединений при лечении ожоговых ран. Учитывая пласт работ, посвященных исследованию регенеративных свойств на фоне ожоговой травмы на модели крыс [41; 96; 120; 141], были отобраны именно эти подопытные животные, с целью сравнения результатов эксперимента с аналогичными исследованиями. Наиболее высокотехнологичным методом моделирования ожоговой болезни является использование доступности к лазерных установок подобному оборудованию, [96]. для Ввиду ограниченной формирования ожогов у экспериментальных животных часто используют более традиционный способ, предполагающий выдерживание металлической пластинки, разогретой до определенной температуры, в течение конкретного временного промежутка на выбритой спине [41; 141]. В нашем эксперименте для стандартизации ожоговой раны использовали металлический брусок массой 200 г, разогретый до 105 °С и закрепляемый на коже крыс в течение 20 с. В описанных условиях у модельных животных формируется ожог IIIA степени. Для снижения дистресса, оказываемого на подопытных животных, все манипуляции проводили под общим наркозом. Для получения релевантной информации относительно регенеративных свойств исследуемых фазовых модификаций ДКВ генеральная совокупность подопытных особей была разделена на 4 равные группы в зависимости от метода лечения. Группа I выступала в качестве отрицательного контроля без лечения. Группы II и III лечили водными суспензиями ДКВфс и ДКВт, соответственно, с концентрацией 50 мг/мл. Данная дозировка сопоставима с ранее проведенным исследованием [36] и позволяет оценить влияние фазового состояния флаванонола на его фармакологическую эффективность. Группу IV использовали как положительный контроль, в котором терапию осуществляли традиционным

114 методом лечения. В качестве препарата сравнения использовали облепиховое масло, известное своими регенеративными свойствами [13; 23]. Современные методы оценки ранозаживляющих эффектов можно подразделить на контактные, требующие непосредственного взаимодействия экспериментатора с подопытным животным, и бесконтактные, позволяющие оценивать изменение размера раны с помощью аналоговых и цифровых технологий. Для повышения достоверности полученных результатов, в нашем эксперименте реализованы обе концепции: в качестве контактного метода анализа использовали способ Л.Н. Поповой, а среди бесконтактных был выбран метод цифрового фотографирования с эталоном площади [21]. Кроме того, для оценки дистресс-синдрома и развития воспалительных процессов измеряли массу и температуру подопытных животных. Общая схема дизайна эксперимента in vivo, составленная в соответствии с международными биоэтическими нормами [6; 7], представлена на Рисунке 6.4. Данный дизайн эксперимента был одобрен Локальным этическим комитетом Сеченовского университета (Приложение Д). Рисунок 6.4 – Дизайн эксперимента in vivo на модели ожога IIIA степени у крыс

115 К моменту начала эксперимента средняя масса тела в группах I, II, III и IV составляла 279,4 ± 11,2 г, 276,1 ± 7,1 г, 268,2 ± 10,4 г и 277,1 ± 7,8 г, соответственно (Таблица 6.6). Температура тела также не имела статистически значимых отличий и колебалась на уровне 38,0 ± 0,9 °С (Таблица 6.7). Таким образом, изначально группы были гомогенны и однородны. После моделирования ожога IIIA степени во всех группах наблюдали уменьшение веса от 0,3 до 3,4%, что, очевидно, связано с дистрессом от нанесения раны. Тем не менее, в дальнейшем масса тела достигла исходных значений во всех группах. В ходе измерения температуры тела не выявлено значимых различий в исследуемых группах. Однако расхождения в скорости заживления ожогов были существенными. Таблица 6.6 – Изменения массы крыс на фоне различных методов терапии Средняя масса крыс в группе, г Группа День 0 День 1 День 8 День 14 День 24 I 279,4±11,5 273,9±11,9 279,7±14,6 337,6±18,5 369,9±22,2 II 276,1±07,1 266,8±07,6 272,2±09,5 314,1±12,9 357,1±15,2 III 268,2±10,4 263,1±10,3 278,1±09,6 306,2±12,9 349,1±17,4 IV 277,1±07,8 276,4±10,3 314,4±17,2 325,6±14,3 369,2±17,6 Таблица 6.7 – Изменения температуры тела крыс на фоне различных методов терапии Средняя температура тела у крыс в группе, °С Группа День 0 День 1 День 8 День 14 День 24 I 38,3±0,6 37,3±0,8 38,1±0,9 38,3±0,8 38,9±1,0 II 38,1±0,4 38,5±0,8 38,2±0,8 37,7±0,4 38,1±0,5 III 37,3±0,4 38,8±0,7 38,2±0,3 38,2±0,7 37,9±0,5 IV 38,3±0,9 37,9±0,3 38,0±0,8 38,2±0,2 37,7±0,9 На первые сутки после моделирования ожога IIIA степени на поврежденной коже у крыс отмечено формирование волдырей (Рисунок 6.5). Поскольку рану

116 наносили при стандартизированных условиях, то средняя площадь ожога не имела статистически значимых (p < 0,05) различий между исследуемыми группам и составляла 7,8 ± 1,0 см2, 8,7 ± 0,5 см2, 9,0 ± 0,5 см2 и 8,9 ± 0,7 см2 для группы I, группы II, группы III и группы IV, соответственно, при измерении по способу Л.Н. Поповой (Таблица 6.8). В ходе измерения бесконтактным методом были получены сопоставимые результаты, хотя доверительный интервал оказался шире. К восьмым суткам во всех группах наблюдали формирование струпа на раневой поверхности (Рисунок 6.4). При этом было отмечено уменьшение площади ожога, однако скорость заживления раны отличалась. Наименьший уровень ранозаживления выявлен в группе I (19,2 ± 7,7%), а самый высокий – в группе III (43,3 ± 5,6%). В группе II и в группе IV данный параметр составил 34,5 ± 3,4% и 36,0 ± 2,4%, соответственно. Таким образом, в течение первой недели эксперимента наблюдалось статистически значимое (p < 0,05) различие в скорости заживления ожога между крысами, получавшими лечение, и группой отрицательного контроля. На четырнадцатые сутки во всех группах отмечено наращивание скорости заживления раны (Рисунок 6.4). В то же время, статистически значимых различий в уровнях ранозаживления не выявлено: для группы I, группы II, группы III и группы IV этот параметр составил 59,0 ± 6,4%, 66,7 ± 5,7%, 72,2 ± 5,6% и 66,3% ± 7,1%, соответственно. К двадцать четвертым суткам после моделирования ожога во всех группах наблюдали практически полное заживление раны (Рисунок 6.5). У всех крыс, кроме группы IV, отмечено интенсивное зарастание шерстью здоровой кожи. В группе III установлено увеличение уровня ранозаживления до 97,8 ± 2,2%. В остальных группах данный параметр изменился не настолько выраженно: в группах I, II, IV он составил 92,3 ± 10,3%, 93,1 ± 8,0% и 93,3 ± 7,1%, соответственно.

117 А В С D Рисунок 6.5 – Процесс заживления ожога у крыс по дням в зависимости от группы лечения: А – группа I, В – группа II, С – группа III, D – группа IV

118 Таблица 6.8 – Ранозаживление на фоне различных методов терапии (условия см. 7.9.4) Площадь раны, см2 (уровень ранозаживления, %) Группа Контактный метод День 1 I II III IV 7,8±1,0 8,7±0,5 9,0±0,5 8,4±0,7 День 8 Бесконтактный метод День 14 День 24 6,3±0,6 3,2±0,5 0,6±0,8 (19,2%) (59,0%) (92,3%) 5,7±0,3 2,9±0,5 0,6±0,7 (34,5%) (66,7%) (93,1%) 5,1±0,5 2,5±0,5 0,2±0,2 (43,3%) (72,2%) (97,8%) 5,7±0,2 3,0±0,6 0,6±0,6 (36,0%) (66,3%) (93,3%) День 1 8,7±1,3 8,4±1,2 8,9±1,4 8,9±1,3 День 8 День 14 День 24 5,8±1,3 3,1±0,9 0,7±0,8 (33,4%) (64,1%) (92,3%) 5,5±1,6 2,5±0,8 0,7±0,6 (34,4%) (70,0%) (92,0%) 7,0±1,2 2,7±1,0 0,6±0,3 (21,0%) (70,2%) (93,4%) 7,5±1,7 3,2±1,1 0,6±0,7 (15,3%) (64,1%) (92,7%) В итоге, общая скорость заживления (Рисунок 6.6) ожога IIIA степени на фоне лечения суспензией ДКВт была наиболее высокой (4,8 ± 0,1%) и статистически значимо отличалась от терапевтического эффекта в других группах (p < 0,05). В то же время, на фоне отсутствия лечения наблюдали наименьшую скорость заживления ран (4,1 ± 0,1%), также значимо отличающуюся от других групп (p < 0,05). Согласно литературным данным [36], скорость заживления ожогов на фоне лечения мазью с ДКВ фс сопоставима с терапией облепиховым маслом. Наши результаты согласуются с этими данными: скорость заживления ран в группах II и IV составила 4,2 ± 0,1% и 4,3 ± 0,1%, соответственно. Наблюдаемые различия в терапевтическом эффекте между группами, получавшими лечение различными фазовыми модификациями ДКВ, могут быть обусловлены более высокой проницаемостью трубчатой формы биофлавоноида. Иными словами, в группе крыс, проходивших лечение с суспензией ДКВ т, выздоровление, в среднем, наступало на 21 день. В обеих группах, в которых осуществляли лечение суспензией ДКВфс или облепиховым маслом, ожоговая

119 рана затягивалась к 24 дню. В отсутствии лечения, к моменту окончания эксперимента, раны большинства крыс из группы I так и не зажили. Рисунок 6.6 – График средней скорости ранозаживления На основании полученных результатов эксперимента in vivo можно утверждать, что ДКВт представляет интерес для клинических исследований в качестве противоожогового препарата с целью дальнейшей трансляции в реальную травматологическую практику. Выводы по главе  Таблетируемая масса с ДКВс нуждается в меньшем количестве вспомогательных компонентов для оптимизации показателей прессуемости и сыпучести.  Установлено, что таблетки для рассасывания на базе ДКВс характеризуются улучшенными прочностными свойствами и пролонгированным профилем высвобождения действующего вещества в сравнении с ДКВфс.

120  Продемонстрирована корреляция между биофармацевтическими характеристиками фазовых модификаций ДКВ и их фармакологической эффективностью.  Установлена значимая разница в скорости затягивания раны на фоне лечения ДКВт в сравнении с облепиховым маслом и исходной фармацевтической субстанцией – на 11,6% и 14,3%, соответственно.

121 ГЛАВА 7. Материалы и методы исследования 7.1. Материалы 7.1.1. Объекты исследования Объектами исследования служили фазовые модификации ДКВ, полученные путем супрамолекулярного синтеза из ДКВфс – ФС 000388-270812, «Лавитол», АО «Аметис», Благовещенск, Россия. ДКВТ. Для приготовления маточного раствора 1 г ДКВфс смешивали с мочевиной в мольном соотношении 1:1. Полученную смесь растворяли в 50 мл этанола денатурированного, после чего к спиртовому раствору добавляли по каплям воду очищенную при постоянном интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Маточный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 48 ч, после чего твердую фазу отфильтровывали. Полученный продукт высушивали на открытом воздухе на протяжении 24 ч. ДКВс. Для приготовления маточного раствора 1 кг ДКВфс растворяли в 40 л воды деионизированной, нагретой до 60 °С, при постоянном интенсивном перемешивании. Полученный раствор подавали через резервуар на высокоскоростное центрифужное сушильное оборудование распылительного типа, оснащенное механическими форсунками высокого давления. Температурный режим на входе был установлен на уровне 250 °С, на выходе – на уровне 80 °С. ДКВв. Для приготовления маточного раствора 1 г ДКВфс растворяли в 50 мл этанола денатурированного и добавляли 950 мл воды очищенной. Полученную смесь немедленно подвергали глубокой заморозке путем выдерживания маточного раствора в сухом льду при температуре –78 °С в течение 24 ч. Колбу с замороженным образцом подсоединяли к лиофильной сушилке и высушивали при температуре –55 °С и атмосферном давлении 0,35 атм на протяжении 36 ч.

122 В качестве образца сравнения использовали фармацевтическую субстанцию ДКВфс. Таблетки на базе ДКВфс и ДКВс получали прямым прессованим на лабораторном механическом прессе для таблетирования при давлении около 7 атм. 7.1.2. Реактивы, стандартные образцы, растворители Ацетонитрил – для хроматографии, Merck KGaA, Дармштадт, Германия. Бензальдегид – 98,0%, Геел, Бельгия. Ванилин – 99,0%, Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия. ГСО ДКВ – 99,99%, АО «Аметис», Благовещенск, Россия; ГСО 10766-2016, свидетельство об утверждении типа стандартного образца № 4777. ДМСО – 99,5%, XiLonh Scienitific, Гуанчжоу, Китай. Иод – 99,8%, Merck KGaA, Дармштадт, Германия. Калия бромид – чда, АО «ЛенРеактив», Санкт-Петербург, Россия. Калия гидрофосфат – хч, ООО «Компонент-Реактив», Москва, Россия. Калия дигидрофосфат – хч, ООО «Компонент-Реактив», Москва, Россия. Кальция стеарат – хч, ЛДХим, Старая Купавна, Россия. Коричный альдегид – 99,0%, Acros Organics, Геел, Бельгия. Кросповидон – ISP Inc., Вейн, США. Ментол – Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия. Метанол – для хроматографии, Merck KGaA, Дармштадт, Германия. Мочевина – 99,6%, Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия. Муравьиная кислота – для хроматографии, DikmaPure, Пекин, Китай. Никотиновая кислота – 99,5%, Honeywell, Моррис Плейнс, США. Облепиховое масло – Wulumuqi Huajinshan Shipin Co. Ltd., Урумчи, Китай. Раствор пенициллин/стрептомицин – P/S, 1X, Gibco, Уолтем, США. Раствор трипсина с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) – Trypsin-EDTA (0.25%), 1X, Gibco, Уолтем, США. Раствор соли Хэнкса – HBSS, 1X, Gibco, Уолтем, США. Сахароза – Südzucker AG, Мангейм, Германия.

123 Среда Дульбекко модифицированная по Иглу – DMEM/F-12 50/50 with L-glutamine & 15mM HEPES, 1X, Corning, Корнинг, США. ССК-8 – Beijing Bio Dee Biotechnologies, Пекин, Китай. Судан III – чда, АО «Вектон», Санкт-Петербург, Россия. Циклогексан – 99,5%, Merck KGaA, Дармштадт, Германия. Эмбриональная телячья сыворотка – FBS, 1X, Gibco, Уолтем, США. Этанол денатурированный – 99,8%, Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия. 7.2. Оборудование Лиофильная сушилка Alpha 1–2 (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Остероде-на-Гарце, Германия) – для супрамолекулярного синтеза ДКВв. Инвертированный оптический микроскоп Axiovert S 100 (Zeiss AG, Оберкохен, Германия), оборудованный камерой AxioCam MRc (Zeiss AG, Оберкохен, Германия) – для морфологического анализа, в том числе, фрактального. Установка магнетронного распыления IB-3 (Eiko Engineering Co., Токио, Япония) – для пробоподготовки к СЭМ. Сканирующий электронный микроскоп JSM-6380LA (JEOL Technics LTD, Акишима, Япония) – для морфологического анализа. Лазерный анализатор Analysette 22 (Fritsch GmbH, Идар-Оберштайн, Германия) – для определения размера частиц. Спектрофотометр Cary 100 (Varian, Пало Альто, США) – для качественного и количественного УФ-спектрофотометрического анализа, в том числе, при установлении растворимости седиментационным методом и при проведении теста «Растворимость». ИК-Фурье спектрометр ФСМ-1201 (ООО «Инфраспек», Санкт-Петербург, Россия) – для качественного ИК-спектроскопического анализа. Спектрометр ЯМР Varian VNMRS-400 (Agilent, Санта Клара, США) – для качественного ЯМР 1Н спектроскопического анализа.

124 Масс-спектрометр LC-MS (Advion, Итака, США) – для качественного массспектрометрического анализа. Хроматограф AСQUITY UPLC (Waters, Милфорд, США) – для качественного и количественного хромато-масс-спектрометрического анализа. Масс-спектрометр Xevo TQD (Waters, Милфорд, США) – для детектирования в ходе хромато-масс-спектрометрического анализа. Дифрактометр Xcalibur Eos (Agilent, Санта Клара, США) – для РСА. Дифрактометр ARL X’TRA (Thermo Electron Corporation, Волтем, США) – для РПД в изотермических условиях и при нагревании. Высокотемпературная камера HTK2000 (Anton Paar GmbH, Грац, Австрия) – для проведения нагревания при РПД. Дискретный контроллер Eurotherm 2604 (Eurotherm Ltd., Уэртинг, Великобритания) с термопарой BP5\20 – для контроля температуры в ходе РПД при нагревании. Аналитические весы GH-202 (A&D COMPANY, Токио, Япония) – для взвешивания точной навески при проведении термического анализа. Дифференциальный сканирующий калориметр DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH Group, Зельб, Германия) – для ДСК. Термовесы TG 209 F1 Iris (NETZSCH Group, Зельб, Германия) – для ТГА. Синхронный термический анализатор STA 409 PC Luxx (NETZSCH Group, Зельб, Германия) – для СТА-МС. Масс-спектрометр QMS 403C Aëolos (NETZSCH Group, Зельб, Германия) – для масс-спектрометрического анализа в ходе СТА-МС. Центрифуга Centrifuge 5413 (Eppedorf, Гамбург, Германия) – для пробоподготовки в ходе седиментационного анализа растворимости. Шейкер Mixer 5432 (Eppedorf, Гамбург, Германия) – для пробоподготовки в ходе седиментационного анализа растворимости. Хроматограф Waters 600 HPLC (Waters Corporation, Милфорд, США) – для количественного анализа в ходе определения проницаемости.

125 УФ-детектор Waters 2489 (Waters Corporation, Милфорд, США) – для регистрации хроматограммы в ходе количественного анализа при определении проницаемости. Центрифуга Remi PRP Centrifuge (Remi Laboratory Instruments, Мумбаи, Индия) – для пробоподготовки в ходе эксперимента ex vivo. Камера Горяева XB.K.25 (Qiujing, Чжуншань, Китай) – для расчета концентрации клеточных суспензий в ходе эксперимента ex vivo. УФ-спектрофотометр SPARK (Tecan Group Ltd., Цюрих, Швейцария) – для проведения УФ-спектрофотометрического анализа в ходе оценки цитотоксичности. Инвертированный оптический микроскоп CKX31 (Olympus, Токио, Япония) – для контроля конфлюентности монослоя клеток и проведения расчета концентрации клеточных суспензий в ходе эксперимента ex vivo. Вольтметр MILLICELL-ERS (Millipore Corporation, Берлингтон, США) – для контроля конфлюентности монослоя клеток в ходе эксперимента ex vivo. Тестер типа «бункер» GTL (Erweka GmbH, Ланген, Германия) – для оценки сыпучести. Тестер SVM 121 (Erweka GmbH, Ланген, Германия) – для оценки насыпного объема. Тестер типа качающаяся корзинка ZT 121 light (Erweka GmbH, Ланген, Германия) – для оценки распадаемости. Тестер ТВН 100 (Erweka GmbH, Ланген, Германия) – для оценки прочности на раздавливание. Тестер ТAR 220 (Erweka GmbH, Ланген, Германия) – для оценки прочности на истирание. Тестер типа лопастная мешалка DT 600 (Erweka GmbH, Ланген, Германия) – для проведения теста «Растворение».

126 7.3. Методы эксперимента in silico 7.3.1. Построение виртуальных наночастиц Исходная 3D-модель ДКВ для проведения эксперимента in silico была выгружена из базы данных Cambridge Structural Database [76]. Графический редактор BIOVIA Discovery Studio Visualizer (версия 4.5, Dassault Systèmes BIOVIA, Сан-Диего, США) [81] использовали для регулирования количества молекул воды, участвующих в формировании кристаллической ячейки. Построение моделей фазовых модификаций ДКВ осуществляли в виртуальном пространстве модуля Disordered System Builder, являющегося частью пакета программ Materials Science Suite (версия 2018-2, Schrödinger LLC, НьюЙорк, США) [42]. Компьютерные симуляции осуществляли для объектов, включающих 32, 64, 128, 512 и 1024 кристаллические ячейки. Метод силового поля OPLS 2005 использовали для минимизации энергии полученных виртуальных структур [88; 155]. Все компьютерные расчеты проводили в трехкратной повторности. Результаты молекулярного моделирования визуализировали при помощи программы BIOVIA Discovery Studio Visualizer. 7.3.2. Расчет деформации наночастиц Компьютерную симуляцию деформации наночастиц фазовых модификаций ДКВ осуществляли методом молекулярной динамики в виртуальном пространстве модуля Elastic Constants, также интегрированного в пакет программ Materials Science Suite. Компьютерный расчет включал стандартное восьмикратное моделирование процессов общего сжатия, общего растяжения, двухстороннего растяжения и деформации чистого сдвига. Учитывая направления векторов приложения силы при осуществлении деформации, всего были получены данные для 161 расчета на каждую исследованную модель наночастицы фазовой модификации ДКВ. Для минимизации энергии полученных виртуальных структур также использовали метод силового поля OPLS 2005. Снятие напряжения с деформированной структуры моделировали в течение 100 пс компьютерного

127 времени при температуре 300 К. Результаты молекулярного моделирования визуализировали при помощи программы BIOVIA Discovery Studio Visualizer. 7.3.3. Моделирование ионизации молекул дигидрокверцетина Исходная 3D-модель ДКВ для проведения эксперимента in silico была выгружена из базы данных ZINC [86]. Взаимосвязь между значением рН раствора и степенью ионизации молекул ДКВ рассчитывали в виртуальном пространстве программы Marvin View (версия 5.2.4, ChemAxon, Будапешт, Венгрия) [93]. Компьютерную симуляцию проводили в диапазоне значений рН от 0 до 14 с шагом 0,2 при температуре 298 К. 7.3.4. Поля молекулярных взаимодействий Исходные структуры ДКВ для проведения эксперимента in silico были выгружены из базы данных ZINC и Cambridge Structural Database. Построение полей молекулярных взаимодействий по липофильному и гидрофильному типу осуществляли в виртуальном пространстве программы Maestro (версия 10.3, Schrodinger, Нью-Йорк, США) [38]. 7.4. Методы морфологического анализа 7.4.1. Внешний вид Анализируемый объект помещали на белую матовую поверхность и описывали в соответствии с ОФС.1.1.0006.15 «Фармацевтические субстанции» при дневном освещении [8]. 7.4.2. Микроскопия Оптическая микроскопия. Использовали инвертированный микроскоп при увеличении в ×400 раз без применения покровного стекла и иммерсионной жидкости. Описание микроскопических объектов проводили в соответствии с ОФС.1.2.1.0009.15 «Оптическая микроскопия» [8]. Сканирующая электронная микроскопия. Анализируемые объекты закрепляли на фиксаторе образца при помощи двухсторонней клейкой ленты на углеродной основе и покрывали золотом в атмосфере аргона при давлении

128 0,1 торр. Толщина металлического слоя составляла, приблизительно, 20 нм, что позволяло пренебречь влиянием золотого напыления на морфологию анализируемых объектов. СЭМ осуществляли при увеличении в ×250, ×2000 и ×10000 раз на сканирующем микроскопе, который работал при ускоряющем напряжении 20 кВ в режиме визуализации вторичных электронов (SEI-mode). 7.4.3. Лазерная дифракции света Небольшую аликвоту анализируемого объекта добавляли в воду до образования суспензии. Размер частиц определяли в диапазоне от 0,1 мкм до 1250 мкм. Математическую обработку полученных данных осуществляли при помощи программы Fritsch Analysette software (Fritsch GmbH, Идар-Оберштайн, Германия). Результаты были обработаны и представлены в соответствии с ОФС.1.2.1.0008.15 «Определение распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света» [8]. 7.5. Методы физико-химического анализа 7.5.1. Спектрофотомерия в ультрафиолетовой области Анализируемые объекты растворяли в этаноле денатурированном до концентрации 0,03 ммоль/л. В кювету сравнения помещали этанол. УФ/ВИДспектроскопию осуществляли со скоростью 100 нм/мин в диапазоне длин волн от 600 до 200 нм в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в УФ и видимой областях» [8]. 7.5.2. Спектроскопия в инфракрасной области Точную навеску анализируемых образцов (0,001 г) запрессовывали в таблетки с заранее высушенным калия бромидом. ИК-спектроскопию осуществляли в диапазоне частот от 350 см-1 до 4000 см-1 с шагом 1 см -1 в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0002.15 «Спектрометрия в инфракрасной области» [8]. В качестве образца сравнения использовали таблетки калия бромида без анализируемого вещества.

129 7.5.3. Масс-спектрометрия Анализируемые объекты растворяли в смеси метанола и воды (в соотношении 80:20 по объему), содержащем 0,1% муравьиной кислоты. Массспектрометрию осуществляли на масс-спектрометре, работающем в режиме регистрации анионов. Ионизацию проводили путем распыления в электрическом поле (ESI). Напряжение на капилляре и на конусе устанавливали на уровне 3 кВ и 30 В, соответственно. Температура газа-осушителя составляла 350 °С, а скорость потока – 700 л/ч. Температура источника – 150 °С. Данные регистрировали в диапазоне значений m/z от 10 до 700. Образцы анализировали в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0008.15 «Масс-спектрометрия» [8]. 7.5.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Анализируемые объекты растворяли в ДМСО-d6. Спектроскопию ЯМР 1Н осуществляли на спектрометре, работающем при частоте 399.82 МГц и при температуре 25 °C. Величину химического сдвига определяли по внешнему стандарту, в качестве которого использовали тетраметилсилан. Образцы анализировали в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0007.15 «Спектроскопия ядерного магнитного резонанса» [8]. 7.5.5. Хромато-масс-спектрометрия Исследуемые объекты растворяли в водно-спиртовом растворе. Анализ осуществляли методом тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) на хроматографе с диодно-матричным детектором и тандемным квадрупольным масс-спектрометром. Разделение проводили на колонке AСQUITY UPLC BEH Phenyl 1,7мкм (2,1x100 мм) (Waters, Милфорд, США). Режим элюирования:  0-2 мин – изократический. Состав элюента: 90% - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, 10% - 0,1% раствор муравьиной кислоты в смеси метанол:ацетонитрил (1:1, об.);  2-15 мин – градиентный, при котором доля водного раствора муравьиной кислоты снижается до 25%;

130  15-16 мин – изократический. Состав элюента: 25% - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, 75% - 0,1% раствор муравьиной кислоты в смеси метанол:ацетонитрил (1:1, об.). Скорость потока составляла 0,2 мл/мин. Масс-спектрометр работал в режиме отрицательной электроспрей ионизации. Напряжение на капилляре и на конусе устанавливали на уровне 3 кВ и 30 В, соответственно. Температура газа-осушителя составляла 350 °С, а скорость потока – 700 л/ч. Температура источника – 150 °С. Ввод пробы в массспектрометр проводили как после хроматографического разделения, так и непосредственно в ионизационную камеру. Математическую обработку результатов хроматографии осуществляли в соответствии с ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография» [8]. Эффективность хроматографической системы оценивали по числу теоретических тарелок (N): (7.1) , где tR – время удерживания пика, W – ширина пика у основания. Также учитывали фактор асимметрии пика (As), который рассчитывали по формуле: (7.2) , где f – расстояние между перпендикуляром, опущенным из вершины пика, и восходящей W0,05 – стороной ширина пика пика на на 5% уровне от 5% его от его высоты, высоты. Кром того, было оценено разрешение (Rs) между пиками диастереомеров ДКВ по формуле: (7.3) .

131 7.5.6. Рентгеноструктурный анализ Монокристалл ДКВ выращивали путем осаждения водой из спиртового раствора в присутствии мочевины, после чего маточный раствор выдерживали при температуре 4 °С в течение 1 месяца. Рентгеноструктурный анализ осуществляли на дифрактометре в режиме ωсканирования (θmax = 28,73º). В качестве источника излучения использовали молибденовый катод (λ = 0,71 Å). Структуру расшифровывали прямым методом при помощи комплекса программ SHELXTL (версия 6.14, Brucker AXS, Мэдисон, США) [145]. Позиции и температурные параметры неводородных атомов уточняли в анизотропном приближении полноматричным методом наименьших квадратов. Атомы водорода гидроксильных функциональных групп локализовывали геометрически. Позиции остальных атомов водорода двух независимых молекул ДКВ выявляли из разностных синтезов и в дальнейшем уточняли с наложением ограничений по модели «всадника». 7.5.7. Рентгеновская порошковая дифрактометрия РПД. Осуществляли на дифрактометре, оборудованном вертикальным широкоугольным гониометром и полупроводниковым детектором Пельтье. В качестве источника излучения использовали медный катод (λ = 1,54 Å), работающий при силе тока 25 мА и под напряжением 45 кВ. Сбор данных осуществляли при 295 К в диапазоне 2θ от 5° до 50° с шагом 0,04° и временем накопления заряда 1 с. Образцы анализировали в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0011.15 «Рентгеновская порошковая дифрактометрия» [8]. РПД при нагревании. Анализируемые объекты закрепляли на вольфрамовом бруске, используемом в качестве фиксатора образца и вакуумировали. Толщина слоя составляла, приблизительно, 50 мкм. РПД при различных температурах осуществляли на дифрактометре, оборудованном высокотемпературной камерой. В качестве источника излучения использовали медный катод (λ = 1,54 Å), работающий при силе тока 40 мА и под напряжением 45 кВ. Дифрактограммы записывали при 295 К в диапазоне 2θ от 10° до 35° с шагом 0,05° и временем накопления заряда 4 с. Систему нагревали со

132 скоростью 300 К/мин. Температуру мониторировали при помощи дискретного контроллера с термопарой. Данные РПД регистрировали при температуре 25 °С, 130 °С и 170 °С. 7.5.8. Термические методы анализа Анализируемые объекты взвешивали на аналитических весах с точностью до 0,01 мг и помещали в стандартные алюминиевые кюветы (для ДСК) или кюветы из оксида алюминия (для ТГА и СТА-МС), закупоренные крышкой с отверстием. Объём кюветы составлял 56 мм3, диаметр – 6 мм, площадь дна и отверстия соотносились на уровне 40:1. ДСК. ДСК осуществляли на приборе, оборудованном термопарой Е-типа. Предварительную калибровку системы проводили по точно установленным фазовым переходам веществ (циклогексан, ртуть, галий, бензойная кислота, нитрат калия, индий, олово, висмут, свинец, цинк, хлорид цезия) с чистотой более 99,999% в соответствии с международными стандартами ASTM E967 и ASTM E2253 [46; 49]. Средняя ошибка калибровки составила 5% по теплоте и 0,2 K по температуре. В качестве объекта сравнения использовали пустую алюминиевую кювету. Систему нагревали в токе осушенного азота, подаваемого со скоростью 40 мл/мин, в диапазоне от 25 °С до 300 °С со скоростью 10 К/мин. Полученные экспериментальные данные подвергали математической обработке в программе NETZSCH Proteus Thermal Analysis (NETZSCH Group, Зельб, Германия). Результаты представляли в соответствии с ОФС.1.2.1.0027.18 «Термический анализ» [8]. ТГА. ТГА осуществляли на термовесах. Предварительную калибровку системы проводили по точно установленным фазовым переходам веществ (индий, олово, висмут, цинк, алюминий, серебро, золото) с чистотой более 99,999% в соответствии с международными стандартами ASTM E968 и ASTM E1582 [47; 48]. Средняя ошибка калибровки составляла 0,2% по теплоте и 0,3 K по температуре. В качестве объекта сравнения использовали пустую кювету из оксида алюминия. Систему нагревали в диапазоне от 25 °С до 300 °С со скоростью 10 К/мин в токе осушенного азота, подаваемого со скоростью

133 70 мл/мин. Полученные экспериментальные данные подвергали математической обработке в программе NETZSCH Proteus Thermal Analysis (NETZSCH Group, Зельб, Германия). Результаты представляли в соответствии с ОФС.1.2.1.0027.18 «Термический анализ» [8]. СТА МС. СТА МС осуществляли на приборе, оборудованном квадрупольным масс-спектрометром. Предварительную калибровку и нагрев системы проводили в условиях, описанных для ТГА. Сигналы в масс-спектре регистрировали по следующим величинам m/z: 14, 15, 16, 17, 28, 29, 42, 43, 44. Полученные экспериментальные данные подвергали математической обработке в программе NETZSCH Proteus Thermal Analysis (NETZSCH Group, Зельб, Германия). 7.5.9. Растворимость Растворимость по ГФ. Растворимость определяли в соответствии с ОФС.1.2.1.0005.15 «Растворимость» [8]. Седиментационный метод. Для осуществления количественной оценки растворимости ДКВ седиментационным методом строили градуировочный график. Для этого точную навеску ГСО ДКВ (20 мг) растворяли в 10 мл этанола денатурированного, после чего из полученного раствора отбирали аликвотную долю объемом 0,025, 0,050, 0,075, 0,100 и 0,125 мкл и доводили водой очищенной до 10,0 мл. Полученные растворы подвергали спектрофотометрическому анализу на приборе, работающем в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм со скоростью 100 нм/мин. На основании полученных данных был построен график зависимости оптической плотности раствора при длине волны 290 нм от концентрации ДКВ. Точную навеску анализируемого объекта (40 мг) помещали в 10 мл воды очищенной и интенсивно встряхивали руками в течение 5 мин, после чего суспензию равномерно распределяли по 5 пробиркам Эппендорфа объемом 2,0 мл. Одну из пробирок использовали в качестве нулевой точки. Оставшиеся 4 пробирки подвергали интенсивному перемешиванию на шейкере, работающем в режиме встряхивания со скоростью 1450 об/мин в течение 1, 2, 4 и 6 ч. Все пробирки центрифугировали со скоростью 15000 об/мин в течение 5 мин. Из

134 надосадочной жидкости отбирали аликвоту 0,05 мл и растворяли в 9,95 мл воды очищенной. Полученный раствор подвергали спектрофотометрическому количественному анализу по градировочному графику. Эксперимент проводили в трехкратной повторности. Полученные данные подвергали статистической обработке. Было рассчитано среднее значение для каждой величины и стандартное отклонение. 7.5.10. Определение сорбционных свойств Поглощение иода. Кристаллический иод массой 5 г помещали на дно стакана химического термостойкого объемом 1 л. Перфорированную фарфоровую вставку использовали в качестве штатива для микропробирок объемом 1,5 мл, содержащих по 10 мг анализируемого объекта. Систему изолировали и нагревали при температуре 50 °С в течение 1 ч. Перед извлечением микропробирки закрывали и подвергали макроскопическому анализу. Часть образца микроскопировали на инвертированном микроскопе, при увеличении в ×400 раз. Поглощение Судана III. Для построения калибровочного графика точную навеску красителя (1,7 мг) растворяли в 100 мл циклогексана (раствор 1). Готовили серию растворов с концентрациями 0,0500, 0,0333, 0,0250, 0,0125, 0,0063 и 0,0016 ммоль/л. Растворы подвергли спектрофотометрическому анализу на приборе, работающем в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм со скоростью 100 нм/мин. На основании полученных данных был построен график зависимости оптической плотности раствора в максимуме поглощения при длине волны 505 нм от концентрации Судана III. Сорбционную способность фазовых модификаций оценивали методом Киплинга [97]. В микропробирки вместимостью 1,5 мл помещали различное количество анализируемых объектов (точные навески): 10 мг, 20 мг, 50 мг, 100 мг. Добавляли 1,5 мл раствора Судана III в циклогексане (раствор 1) и интенсивно перемешивали в течение 24 ч на шейкере, работающем в режиме встряхивания со скоростью 1450 об/мин. Затем жидкая и твердая фазы полученной суспензии были разделены центрифугированием со скоростью 15000 об/мин в течение 15

135 мин. Надосадочную жидкость подвергли количественному спектрофотометрическому анализу по градуировочному графику. Эксперимент осуществляли в трехкратной повторности. Полученные данные использовали для построения изотермы Ленгмюра в координатах зависимости 1/А от 1/с, где А – величина сорбции красителя на ДКВ (мг/мг), а с – равновесная концентрация Судана III (мг/л). На основании угла наклона графика (α) рассчитывали сорбционную способность (А∞) анализируемого объекта по формуле: А∞ = 1/tg(α). (7.4) Константу Ленгмюра (КL) находили по формуле: КL = 1/(h А∞), (7.5) где h – значение 1/А в точке пересечения линии зависимости с осью ординат. 7.6. Методы фрактального анализа 7.6.1. Синтез объектов исследования Для приготовления маточного раствора 1 г ДКВфс смешивали с эквимолярным количеством коформера, в качестве которого выступали бензальдегид, ванилин, коричный альдегид, мочевина и никотиновая кислота. Полученную смесь растворяли в 50 мл этанола денатурированного, добавляли 950 мл воды очищенной. Раствор подвергали немедленной глубокой заморозке путем выдерживания маточного раствора в сухом льду при температуре –78 °С в течение 24 ч. Колбу с замороженным образцом подсоединяли к лиофильной сушилке, работающей в режиме разряженной атмосферы (0,35 атм) и пониженной температуры (–55 °С) на протяжении 36 ч. 7.6.2. Оптическая микроскопия Оптическую микроскопию осуществляли на инвертированном микроскопе при увеличении в ×100 раз, ×400 раз и ×1000 раз без применения покровного

136 стекла и иммерсионной жидкости. Всего для каждого анализируемого объекта получали по 5 микрофотографий. 7.6.3. Расчет фрактальной размерности Полученные микрофотографии монохроматизировали. Участки для фрактального анализа выбирали вручную по показателям осветлённости изображения и его разрешения. Фрактальную размерность рассчитывали независимо в виртуальном пространстве двух программ: FDim (Harvard Medical School, Гарвард, США) и Gwyddion (Czech Metrology Institute, Брно, Чехия). Компьютерной обработке на каждой микрофотографии подвергали по две области, максимальный размер которых ограничивался рабочим полем программы (950 пикселей на 1900 пикселей). При выборе минимального размера соблюдали условие, чтобы число пикселей в анализируемой области в два раза превышало число черных пикселей. 7.7. Методы биофармацевтического анализа 7.7.1. Методика количественного определения дигидрокверцетина Для построения калибровочного графика точную навеску ГСО ДКВ (1,0 мг) растворяли в 10,0 мл воды очищенной. Готовили серию из 6 растворов с концентрациями от 0,00001 до 0,50000 мг/мл. Анализируемые растворы в количестве 0,02 мл вводили в хроматограф через автосамплер. Разделение проводили на колонке Phenomenex Luna C-18 5 мкм (2,1×250 мм) (Danaher Corporation, Вашингтон, США). В качестве подвижной фазы использовали смесь, содержащую 30% ацетонитрила и 70% 2%-го водного раствора муравьиной кислоты. Элюирование осуществляли в изократическом режиме, скорость потока составляла 1,0 мл/мин. Детектировали спектрофотометрическим методом при длине волны 290 нм. На основании полученных данных был построен график зависимости площади пика под хроматографической кривой от концентрации ДКВ.

137 7.7.2. Условия культивирования клеток В эксперименте использовали клетки линии MDCK (р=25-28), предоставленные Cell Culture Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Пекин, Китай). Клетки культивировали в среде Дульбекко, модифицированной по Иглу, с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки и раствора пенициллин/стрептомицин в соотношении 89:10:1. Культуру клеток накапливали во флаконах объемом 50 мл в инкубаторе при температуре 37 оС в атмосфере с содержанием 5% углекислого газа и относительной влажности 95%. используемый для Культуральную среду обновляли каждые 48 ч. 7.7.3. Оценка цитотоксичности Для расчёта концентрации клеток во флакон, культивирования, добавляли 3,0 мл раствора трипсина с ЭДТА, который заранее подогревали до 37 °С, и выдерживали в течение 10 мин. Ферментативную реакцию останавливали, добавляя 6,0 мл среды Дульбекко, модифицированной по Иглу, с последующей промывкой внутренней поверхности флакона этой же клеточной суспензией. Полученную клеточную суспензию центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок разводили путем добавления 1,0 мл среды Дульбекко, модифицированной по Иглу. Контроль концентрации суспензии проводили путем подсчета клеток в камере Горяева, используя инвертированный оптический микроскоп при увеличении в ×300 раз. Расчет концентрации клеток (С) осуществляли по формуле: С = (N / 4) • V • 104, (7.6) где N – число клеток, обнаруженных в счетном поле камеры Горяева, V – разведение раствора. Концентрацию клеток доводили до 4•104 клеток/мл, путем добавления культуральной среды, и суспензию равномерно распределяли между 54 лунками в центре планшета, имеющего 96 лунок. После 36 часов инкубирования, культуральную среду удаляли. В первый ряд лунок с клетками добавляли свежий раствор культуральной среды (контроль

138 +), в последний ряд – раствор ДМСО (контроль -). В оставшиеся семь рядов по 6 лунок приливали растворы или суспензии различных форм ДКВ в культуральной среде с концентрациями 2,00 мг/мл, 1,00 мг/мл, 0,50 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,13 мг/мл, 0,06 мг/мл, 0,03 мг/мл и 0,02 мг/мл. Смеси инкубировали при температуре 37 °С в атмосфере с содержанием 5% углекислого газа и относительной влажности 95% в течение 2 ч. По истечении указанного срока среды удаляли и добавляли ССК-8, клетки инкубировали при аналогичных условиях еще 2 ч. Полученные растворы анализировали на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Значения оптической плотности использовали для расчета выживаемости клеток (V) по формуле: V = (An – A0) / (A100-A0) • 100, (7.7) где Аn – средняя оптическая плотность раствора ССК-8 после инкубирования клеток с раствором фазовой модификации ДКВ при определенной концентрации, А0 – средняя оптическая плотность раствора ССК-8 после инкубирования клеток с раствором ДМСО, / А100 – средняя оптическая плотность раствора ССК-8 после инкубирования клеток с чистой средой Дульбекко, модифицированной по Иглу. Рассчитывали среднее значение для каждой величины выживаемости и стандартное отклонение. 7.7.4. Оценка проницаемости Для установления различий в проницаемости между полиморфными формами ДКВ использовали метод бесконеченой проницаемости (infinity permeability), характеристикой которого является кажущаяся проницаемость. Во флакон, используемый для культивирования, добавляли 3,0 мл заранее подогретого до 37 °С раствора трипсина с ЭДТА и выдерживали в течение 10 мин. Ферментативную реакцию останавливали путем добавления 6,0 мл среды Дульбекко, модифицированной по Иглу, с последующей промывкой внутренней поверхности флакона этой же клеточной суспензией. Полученную клеточную суспензию центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок разводили путем добавления 1,0 мл

139 среды Дульбекко, модифицированной по Иглу. Контроль концентрации суспензии проводили путем подсчета клеток в камере Горяева, используя инвертированный оптический микроскоп при увеличении в х300 раз. Расчет концентрации клеток (С) осуществляли по формуле (7.6). Концентрацию клеток доводили до 2•106 клеток/мл, путем добавления культуральной среды, и суспензию равномерно распределяли между 12 лунками планшета по 0,5 мл в каждую. Клетки помещали на полупрозрачные мембраны площадью 4,7 см 2. Во внутреннюю часть лунок заливали по 1,5 мл культуральной среды. Культуральную среду обновляли каждые 2 дня до достижения клетками конфлюентности. Формирование монослоя контролировали путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления на вольтметре и микроскопически на инвертированном оптическом микроскопе. После выхода значения трансэпителиального электрического сопротивления на плато культуральную среду удаляли, а лунки планшета трижды промывали раствором соли Хэнкса, температуру которого поддерживали на уровне 37 °С. Затем в каждую из 4 лунок ряда планшета добавляли суспензию одной из фазовых модификаций ДКВ в культуральной среде по 0,5 мл (донорный раствор). Во внутреннюю часть лунки помещали 1,5 мл раствора соли Хэнкса, который выполнял роль принимающего раствора. По истечении 15 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин из принимающего раствора каждой лунки отбирали аликвоту объемом 0,2 мл с последующим замещением эквивалентным объемом чистого раствора соли Хэнкса. По окончании сбора аликвотных долей значения трансэпителиального электрического сопротивления измеряли повторно. В аликвоты добавляли 0,2 мл ацетонитрила, смесь интенсивно перемешивали в течение 3 мин, полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 12500 об/мин. От надосадочной жидкости отбирали аликвоту объемом 0,250 мл и анализировали методом ВЭЖХ, в условиях, описанных выше. На основании полученных результатов анализа строили графики зависимости концентрации фазовых модификаций ДКВ в принимающем растворе

140 от времени культивирования с клетками MDCK. Эти графические данные использовали для расчета кажущейся проницаемости (Рарр) по формуле: (7.8) , где dC/dT – изменение концентрации ДКВ в принимающей ячейке во времени, V – объем принимающего раствора, A – площадь полупроницаемой мембраны, C – исходная концентрация ДКВ в культуральной среде. Для каждой исследуемой фазовой модификации рассчитывали среднее значение кажущейся проницаемости и стандартное отклонение. 7.8. Методы фармацевтико-технологического анализа 7.8.1. Сыпучесть и прессуемость Скорость осуществляли протекания в соответствии порошков с через отверстие. ОФС.1.4.2.0016.15 «Степень Определение сыпучести порошков» [8]. Анализ проводили при помощи тестера типа «бункер» с насадками 1, 2 и 3, характеризующимися диаметром выходного отверстия 10 мм, 15мм и 25 мм, соответственно. Точную навеску (100 г) анализируемого образца помещали в закрытый бункер, после чего открывали отверстие и замеряли время, за которое высыпается порошок. При необходимости размер отверстия регулировали при помощи насадок. Испытание проводили в трехкратной повторности. Угол естественного откоса. Угол естественного откоса определяли в соответствии с ОФС.1.4.2.0016.15 «Степень сыпучести порошков» [8]. Анализ проводили при помощи тестера типа «бункер» с насадками 1, 2 и 3, характеризующимися диаметром выходного отверстия 10 мм, 15мм и 25 мм, соответственно. В качестве основания использовали бумажную подложку. Углы у основания конуса в трех плоскостях переносили на бумажный носитель при помощи тени от направленного света и затем измеряли транспортиром. Испытание проводили в трехкратной повторности.

141 Насыпной объем. Определение насыпного объема определяли в соответствии с ОФС.1.4.2.0016.15 «Степень сыпучести порошков» [8]. Анализ проводили при помощи тестера, снабженного мерным цилиндром объемом 250 мл, в который помещали заранее взвешенный (m) анализируемый образец в количестве 100 мл (V0). После 10, 500 и 1250 соскоков фиксировали изменение объема образца - V10, V500, V1250, соответственно. Испытание проводили в трехкратной повторности. На основании полученных данных рассчитывали коэффициент прессуемости (Кп) по формуле: Кп = 100 • (V0 - V1250)/V0. (7.9) Кроме того, данные по насыпной плотности использовали при расчете индекса Hausner (Н) и индекса Carr (С): Н = (V1250 / m) / (V0 / m), (7.10) C = 100 • (1 – (V0 / m) / (V1250 / m) ). (7.11) 7.8.2. Прочность на раздавливание Прочность таблеток на раздавливание определяли в соответствии с ОФС.1.4.2.0011.15 «Прочность таблеток на раздавливание» [8]. Испытание проводили на 10 таблетках, изготовленных на основе определенной фазовой модификации ДКВ. 7.8.3. Прочность на истирание Прочность таблеток на истирание определяли в соответствии с ОФС.1.4.2.0004.15 «Истираемость таблеток» [8]. Испытание проводили на 10 заранее взвешенных таблетках, изготовленных на основе определенной фазовой модификации ДКВ, в течение 5 мин, массу таблеток измеряли повторно (с точностью до 0,0001 г). 7.8.4. Распадаемость Распадаемость таблеток определяли в соответствии с ОФС.1.4.2.0013.15 «Распадаемость таблеток и капсул» [8]. Анализ проводили при помощи тестера типа качающаяся корзинка в среде воды очищенной. Объем жидкости – 1 л, температуру поддерживали на уровне (37 ± 2) °С. Испытанию подвергали по 6 таблеток, изготовленных на основе определенной фазовой модификации ДКВ.

142 Каждую таблетку помещали в трубку качающейся корзинки и анализировали в течение 45 мин. 7.8.5. Тест «Растворение» Точную навеску ГСО ДКВ (20 мг) растворяли в 10 мл этанола денатурированного, из полученного раствора отбирали аликвотные доли объемом 0,025, 0,050, 0,075, 0,100 и 0,125 мкл и доводили фосфатным буфером (рН = 6,8) до 10,0 мл. Полученные растворы подвергали спектрофотометрическому анализу на приборе, работающем в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм со скоростью сканирования 100 нм/мин. Строили график зависимости оптической плотности раствора при длине волны 324 нм от концентрации ДКВ. Тест «Растворение» осуществляли в соответствии с ОФС.1.4.2.0014.15 «Растворение для твердых дозированных лекарственных форм» [8]. Анализ проводили при помощи тестера типа лопастная мешалка в среде фосфатного буфера. Объем жидкости – 0,5 л, температуру поддерживали на уровне 37 ± 0,5 °С. Скорость вращения лопастей – 50 об/мин. Испытание проводили на 6 таблетках, изготовленных на основе определенной фазовой модификации ДКВ, в течение 45 мин. Аликвотные доли объемом 5 мл для количественного анализа высвободившегося ДКВ отбирали через 5, 10, 20, 30 и 45 мин с последующим замещением эквивалентным объемом фосфатного буфера. Определяли оптическую плотность полученных растворов в максимуме поглощения при длине волны 324 нм. Сопоставительный анализ профилей высвобождения действующего вещества из таблеток осуществляли по коэффициентам различия (f1) и подобия (f2), рекомендованным нормативной документацией [32], которые рассчитывали по формулам: , (7.12) где n – число точек отбора пробы, Rj и Tj – доля высвободившегося действующего вещества из референтного и испытуемого препарата, соответственно, в момент времени j.

143 , (7.12) где n – число точек отбора пробы, Rj и Tj – доля высвободившегося действующего вещества из референтного и испытуемого препарата в момент времени j, соответственно. Кроме того, для описания кинетики высвобождения ДКВ из таблеток использовали константу скорости высвобождения действующего вещества (Квысв) и период полураспада таблетки (t50%) [5], которые рассчитывали по формулам: , (7.13) где С0 – исходное содержание действующего вещества в таблетке, Сt –содержание действующего вещества в таблетке в момент t; . (7.14) 7.9. Методы фармакологического анализа 7.9.1. Условия содержания животных Исследование проводили на 48 крысах-самцах линии Sprague Dawley возрастом 3 мес и со средним весом 270 г, предоставленных виварием Institute of Medical Plant Development (г. Пекин, Китай). Крыс содержали при температуре 23 ± 2 °С и при относительной влажности 50 – 60% отдельно от других животных в клетках по 5 особей со свободным доступом к еде и воде. В лаборатории поддерживали 12-часовой режим сменяемости дневного и ночного освещения. Вновь прибывших животных выдерживали на карантине в течение 7 дней. Данные условия соответствуют требованиям ГОСТ №33215-2014 от 09 ноября 2015 г. «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» [6] и ГОСТ №332162014 от 09 ноября 2015 г. «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» [7].

144 7.9.2. Моделирование ожога IIIA степени Модель ожога IIIA степени формировали при стандартизованных условиях. На выбритую спину крысы, введенной в глубокий наркоз хлоралгидратом внутрибрюшинно в дозировке 430 мг/кг и разведении 100 мг/мл, помещали предварительно разогретую до 105 ± 5 °С металлическую пластинку массой 200 г с диаметром площади соприкосновения 8 см 2 и выдерживали в течение 20 с. 7.9.3. Методы лечения Всех экспериментальных животных разделили на четыре равные группы по 12 особей в каждой в зависимости от метода лечения:  Группа I. Отрицательный контроль – лечение отсутствовало.  Группа II. Лечение осуществляли нанесением на рану 1 мл суспензии ДКВфс с концентрацией 50 мг/мл.  Группа III. Лечение осуществляли нанесением на рану 1 мл суспензии ДКВт с концентрацией 50 мг/мл.  Группа IV. Положительный контроль – лечение осуществляли нанесением на рану 1 мл облепихового масла. Лечение проводили ежедневно через 24 ч после нанесения ожогов. Размеры групп рассчитывали по формуле: N = (σ2 • (Zα – Zβ)2) / δ2, (7.15) где Zα и Zβ – критические значения нормального распределения, соответствующие заданным уровням ошибок I и II рода (для мощности теста в 80% и уровня достоверности 0,05 эти значения равны 1,96 и 0,84, соответственно), σ и δ – разница измеряемых величин и стандартное соответственно, основанные на результатах оценки отклонение, фармакологической эффективности ранозаживляющей мази на базе дигидрокверцетина [36]. 7.9.4. Определение размеров ожога Контактный метод Поповой. На 1, 3, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 24 дни после формирования ожога на поверхность раны зафиксированной крысы накладывали прозрачную пленку, и ее края отмечали маркером. Площадь ожога высчитывали путем наложения пленки на масштабно-координатную чертёжную бумагу [21].

145 Бесконтактный метод. На 1, 3, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 24 дни после формирования ожога осуществляли фотографирование раны таким образом, чтобы в кадр попадала линейка, выступающая в качестве внутреннего стандарта длины. Фотоаппарат устанавливали на расстоянии 33,0-35,0 см от поврежденной поверхности. Полученное изображение анализировали при помощи программы GNU Image Manipulation Program (версия 2.10.18, GNOME Foundation, Пало Альто, США), в которой размер раневой поверхности (в пикселях) сравнивали со стандартом длины (в пикселях) и на основе полученных данных находили текущую площадь ожога [21]. В обоих случаях уровень ранозаживления (W) рассчитывали по формуле: W = ((S0 – St) / S0 ) • 100%, (7.16) где S0 – площадь раны в день 1, St – площадь раны в день t. 7.9.5. Прочие физиологические тесты На 1, 3, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 24 дни после формирования ожога у крыс измеряли вес и температуру. 7.10. Статистическая обработка данных Статистическую калибровочных обработку графиков, экспериментальных выведение уравнений данных, построение зависимости и расчет коэффициентов корреляции осуществляли в программе LibreOffice Calc (версия 6.2, The Document Foundation, Берлин, Германия) в соответствии с ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента» [8]. Размер выборок варьировал в зависимости от используемого метода исследования. Физико-химический анализ и фармацевтико-технологические испытания проводили в трехкратной повторности. Исследование цитотоксичности осуществляли на выборке из 6 лунок, а проницаемости – из 4. При разработке метода фрактального анализа каждый объект подвергали

146 компьютерной обработке в шестикратной повторности. В эксперименте in vivo каждая группа лечения включала по 12 особей крыс. Среднее выборки ( ) рассчитывали по формуле: (7.17) , где хi – результат однократного измерения, n – размер выборки. Стандартное отклонение определяли по формуле: (7.18) . Граничные значения доверительного интервала в эксперименте in vivo определяли по критерию Стьюдента (t(P,f)) при уровне значимости р = 0,05: (7.19) . Отсутствие статистически значимой разницы между фрактальными размерностями, рассчитанными при помощи программ FDim и Gwyddion, подтвердили посредством U-критерия Манн-Уитни [117; 132]. Данный непараметрический статистический тест основан на суммировании рангов значений двух анализируемых выборок и базируется на использовании формулы: (7.20) , где n1 и n2 – размеры выборок 1 и 2, соответственно, nx – размер более высокоранговой выборки, Tx – сумма рангов более высокоранговой выборки. Оценку проводили для уровня значимости р = 0,05. Предсказательные поэлементной возможности кросс-валидации [133]. метода Суть оценивали метода при помощи заключается в последовательном удалении данных, полученных от одного из анализируемых объектов, из общей выборки, что приводило к изменению математической зависимости между растворимостью и фрактальной размерностью. В дальнейшем проводили расчет фрактальной размерности по новым уравнениям зависимости

147 логарифма растворимости от фрактальной размерности, что позволяло найти величину относительной ошибки при сравнении рассчитанной величины с результатами обработки микрофотографий при помощи программы FDim. Валидацию разработанного метода фрактального анализа осуществляли в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» [8] по следующим характеристикам: специфичность, предел обнаружения, правильность, сходимость и устойчивость. Специфичность подтверждали путем анализа модельных смесей известного состава, выступавших в качестве анализируемых объектов. Предел обнаружения (ПО) рассчитывали по формуле: ПО = 3,3 · S/b, (7.21) где S – свободный член уравнения линейного калибровочного графика, b – тангенс угла наклона калибровочной кривой. Правильность оценивали путем рассмотрения результатов линейности валидируемой методики. Сходимость и внутрилабораторную прецизионность результатов измерения фрактальной размерности оценивали в рамках работы одной лаборатории в течение 3 месяцев с применением различных оптических микроскопов и программного обеспечения. Устойчивость валидируемой методики оценивали при изменении следующих условий проведения анализа:  степень увеличения в ходе микроскопического анализа;  изменение размера области, подверженной компьютерной обработке;  смещение области, подверженной компьютерной обработке.

148 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Общие выводы. 1. Описана успешная мировая практика улучшения физико-химических и биофармацевтических параметров флавоноидов посредством оптимизации их фазового состояния. 2. Сформулированы следующие принципы направленного синтеза фазовых модификаций ДКВ: – наличие кислотных и основных центров в структуре ДКВ способствует образованию межмолекулярных синтонов; – участие молекул воды при формировании твердой фазы ДКВ приводит к увеличению степени его кристалличности и пористости; – изменение условий синтеза твердой фазы ДКВ (температура, давление, степень ионизации молекул) способствует получению новых фазовых модификаций. 3. Синтезированы новые фазовые модификации ДКВ: микротрубчатая, микросфероидная и микроволокнистая. 4. Разработан системный подход к анализу фазовых модификаций ДКВ, сочетающий рентгенографические, термические, спектральные и микроскопические методы анализа: – подтверждено отсутствие образования новых ковалентных связей в молекуле ДКВ в составе фазовых модификаций; – выявлено, что ДКВс и ДКВв представляют различные аморфные формы, а ДКВфс и ДКВт – кристаллические; – установлено, что ДКВт является псевдополиморфной модификацией ДКВфс. – обнаружена взаимосвязь между морфологией лиофилизатов ДКВ и их физико-химическими свойствами, которая послужила основой для разработки и валидации аналитической интеллектуальных технологий. методики фрактального анализа на базе

149 5. Установлено, что новые формы ДКВ характеризуются улучшенной растворимостью и модифицированной проницаемостью и относятся к I классу БКС. 6. Установлено влияние фазового состояния на показатели качества таблеток для рассасывания и таблетируемых масс на базе ДКВ. Таблетки на основе ДКВс характеризуется улучшенными пролонгированным профилем прочностными высвобождения характеристиками действующего вещества и в сравнении с ДКВфс. 7. Выявлено наличие корреляционных связей между улучшением биофармацевтических показателей фазовой модификации ДКВ и повышением ранозаживляющего эффекта ДКВт в сравнении с ДКВфс. По показателю средней скорости заживления раны новая модификация ДКВ значимо превосходила препарат сравнения на 11,6%. Практические рекомендации. использованы в разработке Полученные результаты могут быть фитопрепаратов с улучшенными биофармацевтическими и фармакологическими параметрами и для создания нормативной документации в сфере контроля качества фармацевтических субстанций. Перспективы дальнейшей разработки темы. В качестве актуального направления развития данной работы можно рассматривать проведение доклинических и клинических испытаний с целью трансляции результатов фундаментальных исследований в реальную клиническую практику.

150 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ БКС биофармацевтическая классификация соединений ВРД высшая разовая доза ВУ время удерживания ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография ГСО государственный стандартный образец ГФ РФ XIV Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания ДКВ дигидрокверцетин ДКВв микроволокнистая форма дигидрокверцетина ДКВс микросфероидная форма дигидрокверцетина ДКВт микротрубчатая форма дигидрокверцетина ДКВфс фармацевтическая субстанция дигидрокверцетина ДМСО диметилсульфоксид ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия ИК-спектроскопия спектроскопия в инфракрасной области РПД рентгеновская порошковая дифрактометрия РСА рентгеноструктурный анализ СТА-МС синхронный термический анализ с масс-спектрометрией СЭМ сканирующая электронная микроскопия ТГА термогравиметрический анализ УВЭЖХ ультра высокоэффективная жидкостная хроматография УФ/ВИД- спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях спектроскопия УФ-спектроскопия спектроскопия в ультрафиолетовой области Сaco-2 эпителиальные клетки аденокарциномы толстого кишечника человека

151 CCK-8 2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразола мононатриевая соль FDA Food and Drug Administration MDCK клетки Мадин-Дарби почек собаки MTT 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид As фактор асимметрии f расстояние между перпендикуляром, опущенным из вершины пика, и восходящей стороной пика на 5 % его высоты N число теоретических тарелок Papp кажущаяся проницаемость Rs разрешение между пиками W0,05 ширина пика на 5% его высоты W0,5 ширина пика на 50% его высоты

152 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Антиоксидантное, капилляропротекторное, противовоспалительное и антигистаминное средство : пат. 2014841 Рос. Федерации : МПК А 61 К 35/78 / С. Я. Соколов, Н. А. Тюкавкина, В. К. Колхир [и др.]; заявитель и патентообладатель Международная ассоциация фитотерапии и традиционной медицины «Фитосан-Интер». – № 5048842/14; заявл. 23.06.1992; опубл. 30.06.1994. 2. Антонова, Г. Ф. Водорастворимые вещества лиственницы и возможности их использования / Г. Ф. Антонова, Н. А. Тюкавкина // Химия древесины. – 1983. – N 2. – С. 89–96. 3. Василькин, Д. А. Получение и изучение полиморфных модификаций некоторых лекарственных веществ и из биофармацевтических свойств : дис. … канд. фарм. наук : 14.04.01 / Дмитрий Александрович Василькин. – СПб., 2012. – 117 с. 4. Вязникова, М. Ю. Исследование состояния воды в стандартном образце дигидрокверцетина и в новом фитопрепарате диквертине / М. Ю. Вязникова, С. С. Николаева, В. А. Быков [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. – 1997. – Т. 31 – N 2. – С. 42–45. 5. Гладышев, В. В. Биофармация : учебник для студентов высших учебных заведений / В. В. Гладышев, Л. Л. Давтян, А. Л. Дроздов [и др.] ; под ред. В. В. Гладышева. – 2-е изд. – Днипро. : ЧМП «Экономика», 2018. – 250 с. 6. ГОСТ 33215-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур (Переиздание). – М.: Стандартинформ, 2019 – 23 с. 7. ГОСТ 33216-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами (Переиздание). – М.: Стандартинформ, 2019 – 24 с. 8. Государственная фармакопея Российской Федерации : в 4 т. – 14-е изд. – М., 2018. – URL: http://femb.ru/femb/pharmacopea.php (дата обращения: 14.05.2018). 9. Диквертина таблетки 0.02 (Diquertin tablets 0.02). – М. : Справочник Видаль «Лекарственные препараты в России», 2020 – URL: https://www.vidal.ru/drugs/diquertin_tablets_0_02__28013 (дата обращения: 05.02.2020). 10. Колхир, В. К. Диквертин – новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство / В. К. Колхир, Н. А. Тюкавкина, В. А. Быков // Химико-фармацевтический журнал – 1995. – N 9. – С. 61–64.

153 11. Куркин, В. А. Флавоноиды лекартсвенных растений: прогноз антиоксидантной активности / В. А. Куркин, В. В. Поройков, А. В. Куркина [и др.] // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – N 2-2. – С. 517–524. 12. Куркин, В. А. Флавоноиды как биологически активные соединения лекарственных растений / В. А. Куркин, А. В. Куркина, Е. В. Авдеева // Фундаментальные исследования. – 2013. – N 11. – С. 1897–1901. 13. Куркин, В. А. Основы фитотерапии : учебное пособие для студентов, обучающихся по специальности 060108 (040500) - Фармация / В. А. Куркин –Самара : Офорт, 2009. - 963 с. 14. Мельникова, Н. Б. Взаимодействие дигидрокверцетина с ионами металлов в водных растворах их солей и в изотонических медицинских средах / Н. Б. Мельникова, И. Д. Иоффе // Химия растительного сырья. – 2001. – N 4. – С. 25–33. 15. Мизина П. Г. Таблетки для рассасывания: достижения и перспективы / П. Г. Мизина, А. С. Гуленков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2018. – Т. 21 – N 2. – С. 3–11. 16. Нифантьев, Э. Е. К вопросу об идентификации флавоноида дигидрокверцетина / Э. Е. Нифантьев, М. П. Коротеев, Г. З. Казиев [и др.] // Журнал общей химии. – 2006. – Т. 76 – N 1. – С. 164–166. 17. Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза : утв. Решением Совета Еразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 N 85 : в ред. Решения Совета Еразийской экономической комиссии от 4 сентября 2020 N 67 // Официальный сайт Евразийского экономического союза. – URL: http://docs.cntd.ru/document/565704480 (дата обращения: 25.12.2020). 18. Плотников, М. Б. Лекарственные препараты на основе диквертина / М. Б. Плотников, Н. А. Тюкавкина, Т. М. Плотникова. – Томск : Издательство Томского университета, 2005. – 228 с. 19. Раменская, Г. В. Классификация лекарственных веществ по их биофармацевтическим свойствам - БКС и BDDCS / Г. В. Раменская, И. Е. Шохин, Ю. И. Кулинич // Вестник ВГУ, серия: химия, биология, фармация. – 2012. – N 1. – С. 212–215. 20. Рязанова, Т. К. Исследование номенклатуры лекарственных средств для местного лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта и горла, представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации / Т. К. Рязанова, Н. Р. Варина, В. А. Куркин [и др.] // Медицинский альманах. – 2016. – Т. 45 – N 5. – С. 207–210.

154 21. Савченко, Ю. П., Методы определения размеров раневой поверхности / Ю. П. Савченко, С. Р. Федосов // Вестник хирургии имени И. И. Грекова. – 2007. – T. 166, N 1. – С. 102-105. 22. Саканян, Е. И. Современные подходы к оценке эффективности и безопасности лекарственных средств растительного происхождения в России и за рубежом / Е. И. Саканян, Т. Б. Шемерякина, Ю. К. Малкина [и др.] // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. – 2015. – N 1. – С. 35–39. 23. Самылина, И. А. Фармакогнозия / И. А. Самылина, Г. П. Яковлев – М. : ГЭОТАР- Медиа, 2014. - 976 с. 24. Селиванова, И. А. Исследование кристаллической структуры дигидрокверцетина / И. А. Селиванова, Н. А. Тюкавкина, Ю. А. Колесник [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. – 1999. – Т. 33 – N 3. – С. 51–53. 25. Способ выделения дигидрокверцетина : пат 2114631 Рос. Федерации : МПК А 61 К 35/78, С 07 D 311/32 / Н. А. Тюкавкина, В. А. Хуторянский, Б. Н. Баженов [и др.]; заявители Н. А. Тюкавкина, В. А. Хуторянский, Б. Н. Баженов [и др.]; патентообладатели Н. А. Тюкавкина, В. А. Хуторянский, Б. Н. Баженов, М.Ю. Сайботалов. – № 97111748/14; заявл. 22.07.1997; опубл. 10.07.1998. 26. Сунцова, Л. П. Механохимическое получение и исследование водорастворимых композиций на основе флавоноидов – генистеина, дигидрокверцетина, рутина / Л. П. Сунцова, Е. С. Метелева, А. В. Душкин // Фундаментальные исследования. – 2014. – N 11. – С. 2174–2179. 27. Тараховский, Ю. С. Фибриллы из таксифолина как основа наноизделий для биомедицины / Ю. С. Тараховский, Ю. А. Ким, Г. Р. Иваницкий // Доклады академии наук. – 2008. – Т. 422 – N 2. – С. 262–264. 28. Тринеева, О. В. Исследование состава флавоноидов плодов облепихи крушиновидной / О. В. Тринеева, И. Б. Перова, А. И. Сливкин, К. И. Эллер // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2017. – Т. 17 – N 1. – С. 87-93. 29. Трофимова, Н. Н. Строение и электрохимические свойства комплексных соединений металлов с дигидрокверцетином / Н. Н. Трофимова, Е. В. Столповская, В. А. Бабкин [и др.] // Химия растительного сырья. – 2014. – N 3. – С. 121–131. 30. Теселкин, Ю. О. Взаимодействие дигидрокверцетина с ионами двухвалентного железа / Ю. О. Теселкин, И. В. Бабенкова, И. А. Руленко // Научный вестник Тюменской медицинской академии. – 1997. – С. 22–24. 31. Теселкин, Ю. О. Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина / Ю. О. Теселкин, Б. А. Жамбалова, И. В. Бабенкова [и др.] // Биофизика. – 1996. – Т. 41 – N 3. – С. 620–624.

155 32. Тест «Растворение» в разработке и регистрации лекарственных средств. Научно- практическое руководство для фармацевтической отрасли / под ред. И. Е. Шохина. – М. : Изд-во Перо, 2015. – 320 с. 33. Тюкавкина, Н. А. Органическая химия : учебник для вузов : в 2 кн. Кн. 2 : Специальный курс / Н. А. Тюкавкина, С. Э. Зурабян, В. Л. Белобородов [и др.]; под ред. Н. А. Тюкавкиной. – 2-е изд., стереотип. – М. : Дрофа, 2009. – 592 с. 34. Цао, Г. Наноструктуры и наноматериалы: синтез, свойства и применение / Г. Цао, И. Ван : пер. с англ. – 2-е изд. – М. : Научный мир, 2012. – 520 с. 35. Шохин, И. Е. Применение биологической модели для оценки кишечной проницаемости in vitro – монослоя эпителиальных клеток Сасо-2 / И. Е. Шохин, Ю. И. Кулинич, Г. В. Раменская, В. Г. Кукес // Биомедицина. – 2012. – N 3. – С. 91–97. 36. Щукина, О. Г. Экспериментальное исследование ранозаживляющих свойств дигидрокверцетина при термической травме кожи : дис. … канд. биол. наук : 14.03.06 / Ольга Геннадьевна Щукина. – СПб., 2014. – 147 с. 37. Щукин, О. Г. Ожоговая болезнь, её моделирование на лабораторных животных для испытания новых лекарственных средств / О. Г. Щукина, Г. Г. Юшков, В. В. Игуменьщева, Н. А. Малышкина // Вестник Ангарской государственной технической академии. – 2009. – Т. 3 – N 1. – С. 143–146. 38. Хёльтье, Х.-Д. Молеккулярное моделирование: теория и практика / Х.-Д. Хёльтье, В. Зиппль, Д. Роньян, Г. Фолькерс ; пер. с англ. – 2-е изд. – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. – 319 с. 39. Abad-Garcia, B. A fragmentation study of dihydroquercetin using triple quadrupole mass spectrometry and its application for identification of dihydroflavonols in Citrus juices / B. Abad-Garcia, S. Garmon-Lobato, L. A. Beruetta [et al.] // Rapid communications in mass spectrometry. – 2009. – Vol. 23 – P. 2785–2792. 40. Abdel-Hameed, E.-S. S. Characterization of the Phytochemical Constituents of Taif Rose and Its Antioxidant and Anticancer Activities / E.-S. S. Abdel-Hameed, S. A. Bazaid, M. S. Salman // BioMed Research International. – 2013. – Vol. 2013, N 345465 – URL: https://www.hindawi.com/journals/bmri/2013/345465/ (дата обращения: 12.04.2015). 41. Alemzadeh, E. Hyaluronic acid hydrogel loaded by adipose stem cells enhances wound healing by modulating IL‐1β, TGF‐β1, and bFGF in burn wound model in rat / E. Alemzadeh, A. Oryan, A. A. Mohammadi // Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. – 2020. – Vol. 108, N 2. – P. 555–567. 42. Aithal, G. C. Localized In Situ Nanoemulgel Drug Delivery System of Quercetin for Periodontitis: Development and Computational Simulations / G. C. Aithal, U. Y. Nayak, C. Mehta

156 [et al.] // Molecules. – 2018. – Vol. 23, N 1363 – URL: https://www.mdpi.com/1420-3049/23/6/1363 (дата обращения: 18.09.2018) 43. Akhlaghi, M. Bioavailability and Metabolism of Flavonoids: A Review / M. Akhlaghi, S. Foshati // International Journal of Nutrition Sciences. – 2017. – Vol. 2, N 4. – P. 180–184. 44. An, H. Physical and Chemical Stability of Formulations Loaded with Taxifolin Tetra- octanoate / H. An, Y. Lee, L. Liu [et al.] // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. – 2019. – Vol. 67 – P. 985–991. 45. Asmi, K. S. Theraputic aspects of taxifolin – An update / K. S. Asmi, T. Lakshmi, S. R. Balusamy, R. Parameswari // Journal of Advanced Pharmacy Education and Research. – 2017. – Vol. 7, N 3. – P. 187–189. 46. ASTM E967 Standard Test Method for Temperature Calibration of Differential Scanning Calorimeters and Differential Thermal Analyzers. – West Conshohocken : American Society for Testing and Materials, 2018 – 4 p. 47. ASTM E968 Standard Practice for Heat Flow Calibration of Differential Scanning Calorimeters. – West Conshohocken : American Society for Testing and Materials, 2017 – 5 p. 48. ASTM E1582 Standard Test Method for Temperature Calibration of Thermogravimetric Analyzers. – West Conshohocken : American Society for Testing and Materials, 2017 – 6 p. 49. ASTM E2253 Standard Test Method for Temperature and Enthalpy Measurement Validation of Differential Scanning Calorimeters. – West Conshohocken : American Society for Testing and Materials, 2016 – 8 p. 50. Athiyah, U. Crystal engineering of quercetin by liquid assisted grinding method / U. Athiyah, P. A. Kusuma, T. Tutik [et al.] // Jurnal Teknologi. – 2019. – Vol. 81, N 1. – P. 39–45. 51. Baranov, I. A. Long-Acting Bioactive Composition Based on Chitosan and Taxifolin / I. A. Baranov, D. Yu. Dzhons, A. V. Budruev [et al.] // Inorganic Materials: Applied Research. – 2015. – Vol. 6, N 5. – P. 479–484. 52. Basak, U. K. Fractal dimension and complexity in the longterm dynamics of a monomolecular layer / U. K. Basak, A. Datta // Chaos, Solitons & Fractals. – 2015. – Vol. 81 – P. 534–541. 53. Bavishi, D. D. Spring and parachute: How cocrystals enhance solubility / D. D. Bavishi, C. H. Borkhataria // Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials. – 2016. – Vol. 63, N 3. – P. 1–8. 54. Bilia, A. R. Flavonoids Loaded in Nanocarriers: An Opportunity to Increase Oral Bioavailability and Bioefficacy / A. N. Bilia, B. Isacchi, C. Rihgeschi [et al.] // Food and Nutrition Sciences. – 2014. – Vol. 5 – P. 1212–1227.

157 55. Boldyreva, E. V. Isoenergetic Polymorphism: The Puzzle of Tolazamide as a Case Study / E. V. Boldyreva, S. G. Arkhipov, T. N. Drebushchak [et al.] // Chemistry – A European Journal. – 2015. – Vol. 21 – P. 15395–15404. 56. Borghetti, G. S. Physicochemical properties and thermal stability of quercetin hydrates in thesolid state / G. S. Borghetti, J. P. Carini, S. B. Honorato [et al.] // Thermochimica Acta. – 2012. – Vol. 539 – P. 109–114. 57. Campos-Dominguez, A. Indirect Monitoring Cane Sugar Crystallization via Image Fractal Analysis / A. Campos-Dominguez, Y. I. Ceballos-Ceballos, S. A. Zamora-Castro [et al.] // Computación y Sistemas. – 2018. – Vol. 22, N 4. – P. 1147–1155. 58. Chadha, K. Co-crystals of Hesperetin: Structural, Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Evaluation / K. Chadha, M. Karan, Y. Bhalla [et al.] // Crystal Growth & Design. – 2017. – Vol. 17, N 5. – P. 2386–2405. 59. Chadha, R. Chrysin cocrystals: Characterization and evaluation / R. Chadha, Y. Bhalla, A. Nandan [et al.] // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – 2017. – Vol. 134 – P. 361–371. 60. ClinicalTrails : database. – Bethesda : U.S. National Library of Medicine, 2020 – URL: https://clinicaltrials.gov/ct2/home (дата обращения: 25.12.2020). 61. Cretu, E. In Vitro Study on the Antioxidant Activity of a Polyphenol-Rich Extract from Pinus brutia Bark and Its Fractions / E. Cretu, M. Karonen, J.-P. Salminen [et al.] // Journal of Medicinal food. – 2013. – Vol. 16, N 11. – P. 984–991. 62. Dai, X.-L. Pharmaceutical cocrystallization: an effective approach to modulate the physicochemical properties of solid-state drugs / X.-L. Dai, J.-M. Chen, T.-B. Lu // CrystEngComm. – 2018. – Vol. 20 – P. 5292–5316. 63. Desiraju, G. R. Crystal Engineering: From Molecule to Crystal / G. R. Desiraju // Journal of the American Chemical Society. – 2013. – Vol. 135, N 27. – P. 9952–9967. 64. – Dissolution Methods : database. – Silver Spring : Food and Drug Administration, 2019 URL: https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/dissolution/index.cfm (дата обращения: 25.12.2019). 65. Draft chapter for The International Pharmacopoeia. Polymorphism. – December 2018. – Geneva : World Health Organization, 2018 – 12 p. 66. Einfluss von Piperin auf die Bioverfügbarkeit von Epicatechin und Epigallocatechingallat (E-Pip-Pilot) : Probandeninformation. – Bohn : Institut für Ernährungs- und Lebensmittelwissenschaften, 2020 – URL: https://www.lwf.uni-bonn.de/institute/iel/institut/lmw/epip/probandeninformation_einwilligung_e-pip-pilot (дата обращения: 25.12.2020).

158 67. Emran, T. B. Molecular docking and inhibition studies on the interactions of Bacopa monnieri’s potent phytochemicals against pathogenic Staphylococcus aureus / T. B. Emran, M. A. Rahman, M. M. N. Uddin [et al.] // DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. – Vol. 23, N 26 – URL: https://link.springer.com/article/10.1186/s40199-015-0106-9 (дата обращения: 13.01.2016). 68. European Pharmacopoeia. – 8th ed. – Strasbourg : Council of Europe, 2013. – 3655 p. 69. Fan, G. Molecular cocrystals of diphenyloxazole with tunable fluorescence, up- conversion emission and dielectric properties / G. Fan, X. Yang, R. Liang [et al.] // CrystEngComm. – 2016. – Vol. 18 – P. 240–249. 70. Fang, Y. Study of Structure and Permeability Relationship of Flavonoids in Caco-2 Cells / Y. Fang, W. Cao, M. Xia [et al.] // Nutrients. – 2017. – Vol. 9, N 1301. – URL: https://www.mdpi.com/2072-6643/9/12/1301/htm (дата обращения: 03.08.2019). 71. Feldman, D. P. Chaos and fractals: an elementary introduction / D. P. Feldman. – Oxford : University Press, 2012 – 408 p. 72. Franklin, S. J. Solid-State and Solution Characterization of Myricetin / S. J. Franklin, P. B. Myrdal // AAPS PharmSciTech. – 2015. – Vol. 16, N 6. – P. 1400–1408. 73. Filimonov, D. A. Prediction of the Biological Activity Spectra of Organic Compounds Using the Pass Online Web Resource / D. A. Filimonov, A. A. Lagunin, T. A. Gloriozova [et al.] // Chemistry of Heterocyclic Compounds. – 2014. – Vol. 50, N 3. – P. 444–457. 74. Fischer, A. Potential Inhibitors for Novel Coronavirus Protease Identified by Virtual Screening of 606 Million Compounds / A. Fischer, M. Sellner, S. Neranjan [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. – 2020. – Vol. 21, N 3626. – URL: https://www.mdpi.com/14220067/21/10/3626 (дата обращения: 10.10.2020). 75. Gabriel-Guzmán, M. Chaos and Fractality in coffee bean surface for roasting process. Chaos Solitons Fractals: an elementary introduction / M. Gabriel-Guzmán, V. M. Rivera, Y. Cocotle-Ronzón [et al.] // Chaos, Solitons & Fractals. – 2017. – Vol. 99 – P. 79–84. 76. Groom, C. R. The Cambridge Structural Database / C. R. Groom, I. J. Bruno, M. P. Lightfoot, S. C. Ward // Acta Crystallographica Section B: Structural Science, Crystal Engineering and Materials. – 2016. – Vol. 72 – P. 171–179. 77. Guidance for Industry. Waiver of in vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification. – December 2017. – Silver Spring : Food and Drug Administration, 2017. – 19 p. 78. Guidance for Industry. ANDAs: Pharmaceutical Solid Polymorphism. – July 2007. – Rockville : Food and Drug Administration, 2007. – 10 p.

159 79. Hasa, D. Screening for new pharmaceutical solid forms using mechanochemistry: a practical guide / D. Hasa, W. Jones // Advanced Drug Delivery Reviews. – 2017. – Vol. 117 – P. 147–161. 80. He, H. Zwitterionic Cocrystals of Flavonoids and Proline: Solid-State Characterization, Pharmaceutical Properties, and Pharmacokinetic Performance / H. He, Y. Huang, Q. Zhang [et al.] // Crystal Growth & Design. – 2016. – Vol. 16, N 4. – P. 2348–2356. 81. Hodis, E. An encyclopedic effort to make 3D structures easier tounderstand / E. Hodis, J. L. Sussman // Trends in Biochemical Sciences. – 2009. – Vol. 34, N 3. – P. 100–101. 82. Hong, C. A Novel Strategy for Pharmaceutical Cocrystal Generation Without Knowledge of Stoichiometric Ratio: Myricetin Cocrystals and a Ternary Phase Diagram / C. Hong, Y. Xie, Y. Yao [ et al.] // Pharmaceutical Research. – 2015. – Vol. 32 – P. 47–60. 83. Huang, Y. Baicalein–Nicotinamide Cocrystal with Enhanced Solubility, Dissolution, and Oral Bioavailability / Y. Huang, B. Zhang, Y. Gao [et al.] // Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2014. – Vol. 103, N 8. – P. 2330–2337. 84. International Clinical Trials Registry Platform : Search Portal. – Geneva : World Health Organization, 2017 – URL: https://apps.who.int/trialsearch/ (дата обращения: 25.12.2020). 85. Irvine, J. D. MDCK (Madin−Darby Canine Kidney) Cells: A Tool for Membrane Permeability Screening / J. D. Irvine, L. Takahashi, K. Lockhart [ et al.] // Journal of Pharmaceutical Sciences. – 1999. – Vol. 88, N 1. – P. 28–33. 86. Irwin, J. J. ZINC: A Free Tool to Discover Chemistry for Biology / J. J. Irwin, T. Sterling, M. M. Mysinger [et al.] // Journal of Chemical Information and Modeling. – 2012. – Vol. 52, N 7. – P. 1757–1768. 87. Jones, J. M. Thermogravimetric evolved gas analysis of urea and urea solutions with nickel alumina catalyst / J. M. Jones, A. N. Pollinson // Thermochimica Acta. – 2013. – Vol. 565 – P. 39–45. 88. Jorgenson, W. L. Development and Testing of the OPLS All-Atom Force Field on Conformational Energetics and Properties of Organic Liquids / W. L. Jorgenson, D. S. Maxwell, J. Tirado-Rivers // Journal of the American Chemical Society. – 1996. – Vol. 118, N 45. – P. 11225–11236. 89. Kanaze, F. I. Dissolution Enhancement of Flavonoids by Solid Dispersion in PVP and PEG Matrixes: A Comparative Study / F. I. Kanaze, E. Kokkalou, I. Niopas [et al.] // Journal of Applied Polymer Science. – 2006. – Vol. 102, N 1. – P. 460–471. 90. Karagianni, A. Pharmaceutical Cocrystals: New Solid PhaseModification Approaches for the Formulation of APIs / A. Karagianni, M. Malamatari, K. Kachrimanis // Pharmaceutics. – 2018. – Vol. 10, N 18. - URL: https://www.mdpi.com/1999-4923/10/1/18 (дата обращения: 02.02.2019).

160 91. Karimi-Jafari, M. Creating Cocrystals: A Review of Pharmaceutical Cocrystal Preparation Routes and Applications / M. Karimi-Jafari, L. Padrela, G. M. Walker, D. M. Croker // Crystal Growth & Design. – 2018. – Vol. 18, N 10. – P. 6370–6387. 92. Karpinski, P. H. Polymorphism of Active Pharmaceutical Ingridients / P. H. Karpinski // Chemical Engineering & Technology. – 2006. – Vol. 29, N 2. – P. 233–237. 93. Karthikeyan, M. Chemoinformatics Approach for the Design and Screening of Focused Virtual Libraries / M. Karthikeyan, R. Vyas. – New Delhi : Springer India, 2014 – 533 p. 94. Kavuru, P. Crystal engineering of flavonoids : dis. … Master of Science / Padmini Kavuru. – Tampa, 2008. – 101 p. 95. Kesani, S. Crystallization studies of epigallocatechin gallate : dis. … Master of Science / Sheshanka Kesani. – Tampa, 2007. – 94 p. 96. Khedir, S. B. The healing effect of Pistacia lentiscusfruit oil on laser burn / S. B. Khedir, S. Bardaa, N. Chabchoub [et al.] // Pharmaceutical biology. – 2017. – Vol. 55, N 1. – P. 1407–1414. 97. Kipling, J. J. Adsorption from Solutions of Non-Electrolytes / J. J. Kipling. – London : Academic press, 1965 – 328 p. 98. Kolhir, V. K. Antioxidant activity of a dihydroguercetin isolated from Larix gmelinii (Rupr). Rupr. wood / V. K. Kolhir, N. A. Tjukavkina, Yl. A. Kolesnik, I. A. Rulenko // Phytotherapy Research. – 1996. – Vol. 10, N 6. – P. 478–482. 99. Ku, M. S. Use of the Biopharmaceutical Classification System in Early Drug Development / M. S. Ku // The AAPS Journal. – 2005. – Vol. 10, N 1. – P. 208–212. 100. Kuleshova, L. N. Lattice energy calculation – A quick tool for screening of cocrystalsand estimation of relative solubility. Case of flavonoids / L. N. Kuleshova, D. W. M. Hofmann, R. Boese // Chemical Physics Letters. – 2013. – Vol. 564 – P. 26–32. 101. Kumar, A. A Review about Regulatory Status and Recent Patent of Pharmaceutical Co- Crystals / A. Kumar, S. Kumar, A. Nanda // Advanced Pharmaceutical Bulletin. – 2018. – Vol. 8, N 3. – P. 355–363. 102. Kurkin, V. A. Phenylpropanoids as the biologically active compounds of the medicinal plants and phytopharmaceuticals / V. A. Kurkin // Advances in Biological Chemistry. – 2013. – N 3. – P. 26–28. 103. Kurkin, V. A. Рhenylpropanoids from medicinal plants: distribution, classification, structuralanalysis, and biological activity / V. A. Kurkin // Chemistry of Natural Compounds. – 2003. – Vol. 39, N 3. – P. 123–153.

161 104. Le Ferrec, E. In Vitro Models of the Intestinal Barrier: The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 46 / E. Le Ferrec, C. Chesne, P. Artusson [ et al.] // Alternatives to Laboratory Animals. – 2001. – Vol. 29 – P. 649–668. 105. Lee, W.-Y. Treatment of Rheumatoid Arthritis with Traditional Chinese Medicine / W.- Y. Lee, H.-Y. Chen, K.-C. Chen, C. Y.-C. Chen // BioMed Research International. – 2014. – Vol. 2014, N – 528018 URL: https://www.hindawi.com/journals/bmri/2014/528018/ (дата обращения: 13.01.2016). 106. Li, J. Synthesis, characterization, solubilization, cytotoxicity and antioxidant activity of aminomethylated dihydroquercetin / J. Li, J. Dong, J. Ouyang [et al.] // MedChemComm. – 2017. – Vol. 8, N 2. – P. 353–363. 107. Li, W. A strategy to improve the oral availability of baicalein: The baicalein- theophylline cocrystal / W. Li, J. Pi, Y. Zhang [et al.] // Fitoterapia. – 2018. – Vol. 129 – P. 85–93. 108. Lilienthal, B. Buffering systems in the mouth / B. Lilienthal // Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology. – 1955. – Vol. 8, N 8. – P. 828–841. 109. Liu, M. The generation of myricetin–nicotinamide nanococrystals by top down and bottom up technologies / M. Liu, C. Hong, G. Li [et al.] // Nanotechnology. – 2016. – Vol. 27, N 395601 – URL: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/0957-4484/27/39/395601/meta (дата обращения: 01.08.2019). 110. Liu, W. Sotalol permeability in cultured-cell, rat intestine and PAMPA system / W. Liu, H. Okochi, L. Z. Benet, S.-D. Zhai // Pharmaceutical research. – 2012. – Vol. 29, N 7. – P. 1768–1774. 111. Liu, F. Protective Effects of Quercetin against Pyrazinamide Induced Hepatotoxicity via a Cocrystallization Strategy of Complementary Advantages / F. Liu, L.-Y. Wang, Y.-T. Li [et al.] // Crystal Growth & Design. – 2018. – Vol. 18, N 7. – P. 3729–3733. 112. Liu, Z. Molecular Docking of Potential Inhibitors for Influenza H7N9 / Z. Liu, J. Zhao, W. Li [et al.] // BioMed Research International. – 2015. – Vol. 2015, N 480764 – URL: https://www.hindawi.com/journals/cmmm/2015/480764/ (дата обращения: 13.01.2016). 113. Loschen, C. Solubility prediction, solvate and cocrystal screening astools for rational crystal engineering / C. Loschen, A. Klamt // Journal of Pharmacy and Pharmacology. – 2015. – Vol. 67, N 6. – P. 803–811. 114. Luo, Y. Luteolin cocrystals: Characterization, evaluation of solubility, oral bioavailability and theoretical calculation / Y. Luo, S. Chen, J. Zhou [et al.] // Journal of Drug Delivery Science and Technology. – 2019. – Vol. 50 – P. 248–254. 115. Luo, C. Pharmaceutical cocrystals of naringenin with improved dissolution performance // C. Luo, W. Liang, X. Chen [et al.] // CrystEngComm. – 2018. – Vol. 20 – P. 3025–3033.

162 116. Mabry, T. J. The Systematic Identification of Flavonoids / T. J. Mabry, K. R. Markham, M. B. Thomas. – New York : Springer-Verlag, 1970. – 350 p. 117. MacFarland, T. W. Introduction to Nonparametric Statistics for the Biological Sciences Using R / T. W. MacFarland, J. M. Yates. – Cham : Springer, 2016. – 329 p. 118. Macrea, C. F. Mercury 4.0: from visualization to analysis, design and prediction / C. F. Macrea, I. Sovago, S. J. Cottrell [et al.] // Journal of Applied Crystallography. – 2020. – Vol. 53 – P. 226–235. 119. McCusker, L. B. Nomenclature of structural and compositional characteristics of ordered microporous and mesoporous materials with inorganic hosts (IUPAC Recommendations 2001) / L. B. McCusker, F. Liebau, G. Engelhardt // Pure and Applied Chemistry. – 2001. – Vol. 73, N 2. – P. 381–394. 120. Mehrabani, D. The Healing Effect of Curcumin on Burn Wounds in Rat / D. Mehrabani, M. Farjam, B. Geramizadeh [et al.] // World journal of plastic surgery. – 2015. – Vol. 4, N 1. – P. 29–35. 121. Moher, D. Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses: The PRISMA Statement / D. Moher, A. Liberati, D. G. Altman [ et al.] // PLos Medicine. – 2009. – Vol. 6, N 7 – e1000097. 122. Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays / T. Mosmann // Journal of Immunological Methods. – 1983. – Vol. 65 – P. 55–63. 123. Muddukrishna, B. S. Preparation, Solid state Characterisation of Paclitaxel and Naringen Cocrystals with Improved Solubility / B. S. Muddukrishna, S. J. Dengale, G. G. Shenoy, K. Bhat // International Journal of Applied Pharmaceutics. – 2016. – Vol. 8, N 4. – P. 32–37. 124. Muramatsu, D. Cell cytotoxity and anti-glycation activity of taxifolin-rich extract from Japanese larch, Larix kaempferi / D. Muramatsu, H. Uchiyama, H. Kida, A. Iwai // Helyion. – 2019. – Vol. 5, N e02047. - URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S240584401935707X (дата обращения: 01.08.2019). 125. Mureşan-Pop, M. Novel nutraceutical Myricetin composite of enhanced dissolution obtained by co-crystallization with acetamide / M. Mureşan-Pop, L. B. Chiras, F. Martin, S. Simon // Composites Part B: Engineering. – 2016. – Vol. 89 – P. 60–66. 126. Musumeci, D. Virtual cocrystal screening / D. Musumeci, C. A. Hunter, R. Prohens [et al.] // Chemical Science. – 2011. – Vol. 2 – P. 883–890. 127. Naumov, A. A. Liposomal form of dihydroquercetin contributes to skin regeneration after thermal burns / A. A. Numov, M. M. Potselueva // Cell and Tissue Biology. – 2010. – Vol. 4 – P. 240–244.

163 128. Oi, N. Taxifolin Suppresses UV-Induced Skin Carcinogenesis by Targeting EGFR and PI3K / N. Oi., M. O. Kim, R. A. Lubet [et al.] // Cancer Prevention Research. – 2012. – Vol. 5, N 9. – P. 1103–1114. 129. Paramaguru, R. Antidiabetic Activity of Pterospermum acerifolium Flowers and Glucose Uptake Potential of Bioactive Fraction in L6 Muscle Cell Lines with Its HPLC Fingerprint / R. Paramaguru, P. M. Mazumder, D. Sasmal, V. Jayaprakash // BioMed Research International. – 2014. – Vol. 2014, N 459376 – URL: https://www.hindawi.com/journals/bmri/2014/459376/ (дата обращения: 13.01.2016). 130. Patil, S. Electrospray technique for cocrystallization of phytomolecules / S. Patil, K. Chaudhari, R. Kamble // Journal of King Saud University – Science. – 2018. – Vol. 30 – P. 138–141. 131. Peng, X. Describing some characters of serine proteinase using fractal analysis / X. Peng, W. Qi, R. Su, Z. He // Chaos, Solitons & Fractals. – 2012. – Vol. 45, N 7. – P. 1017–1023. 132. Pessoa, A. S. Precipitation of resveratrol-isoniazid and resveratrol-nicotinamide cocrystals by gas antisolvent / A. S. Pessoa, G. P. S. Aduiar, J. V. Oliveira [et al.] // The Journal of Supercritical Fluids – 2019. – Vol. 145 – P. 93–102. 133. Petrie, A. Medical statistics at a glance / A. Petrie, C. Sabin. – 4th ed. – London : Wiley Blackwell, 2019. – 187 p. 134. Pew, J. C. A Flavonone from Douglas-Fir Hearwood / J. C. Pew // Journal of the American Chemical Society. – 1948. – Vol. 70, N 9. – P. 3031–3034. 135. Pindelska, E. Pharmaceutical cocrystals, salts and polymorphs: Advanced characterization techniques / E. Pindelska, A. Sokal, W. Kolodziejski // Advanced Drug Delivery Reviews. – 2017. – Vol. 117 – P. 111–146. 136. Raj, U. Flavonoids as Multi-target Inhibitors for Proteins Associated with Ebola Virus: In Silico Discovery Using Virtual Screening and Molecular Docking Studies / U. Raj, P. K. Varadwaj // Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences. – 2016. – Vol. 8 – P. 132–141. 137. Ren, S. The effects of pH, surfactant, ion concentration, coformer, and molecular arrangement on the solubility behavior of myricetin cocrystals / S. Ren, M. Liu, C. Hong // Acta Pharmaceutica Sinica B. – 2019. – Vol. 9, N 1. – P. 59–73. 138. Reutzel-Edens, S. M. Analytical Techniques and Strategies for Salt/Co-crystal Characterization / S. M. Reutzel-Edens // Pharmaceutical Salts and Co-crystals / ed. by J. Wouters, L. Quéré. – Cambridge : RCS Publishing, 2012. – P. 212–246. 139. Sander, J. R. G. Sonocrystallization and sonofragmentation / J. R. G. Sander, B. W. Zeiger, K. S. Suslick // Ultrasonics Sonochemistry. – 2014. – Vol. 21, N 6. – P. 1908–1915.

164 140. Sathishkumar, P. Flavonoids mediated ‘Green’ nanomaterials: A novel nanomedicine system to treat various diseases – Current trends and future perspective / P. Sathishkumar, F. L. Gu, Q. Zhan [et al.] // Materials Letters. – 2018. – Vol. 210 – P. 26–30. 141. Sayer, H. Comparison of efficacy of topical phenytoin with hypericin in second-degree burn wound healing: An experimental study in rats / H. Sayer, N. Gergerlioglu, N. Seringec [et al.] // Medical science monitor basic research. – 2014. – Vol. 20 – P. 36–46. 142. Setyawan, D. Improvement in vitro Dissolution Rate of Quercetin Using Cocrystallization of Quercetin-Malonic Acid / D. Setyawan, S. A. Permata, A. Zainul, M. L. A. D. Lestari // Indonesian Journal of Chemistry. – 2018. – Vol. 18, N 3. – P. 531–536. 143. Setyawan, D. Physicochemical Characterization and In Vitro Dissolution Test of Quercetin-Succinic Acid Co-crystals Prepared Using Solvent Evaporation / D. Setyawan, I. P. Oktavia, R. Farizka, R. Sari // Turkish journal of pharmaceutical sciences. – 2017. – Vol. 14, N 3. – P. 280–284. 144. Schauss, A. G. Toxicological and Genotoxicity Assessment of a Dihydroquercetin-Rich Dahurian Larch Tree (Larix gmelinii Rupr) Extract (Lavitol) / A. G. Schauss, S. S. Tselyico, V. A. Kuznetsova, I. Yegorova // International Journal of Toxicology. – 2015. – Vol. 34, N 2. – P. 162–181. 145. Sheldrick, G. M. A short history of SHELX / G. M. Sheldrick // Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. – 2008. – Vol. 64 – P. 112–122. 146. Shykov, A. N. Nanodispersions of taxifolin: Impact of solid-state properties on dissolution behavior / A. N. Shykov, O. N. Pozharitskaya, I. Miroshnyk [et al.] // International Journal of Pharmaceutics. – 2009. – Vol. 377 – P. 148–152. 147. Smith, A. J. Crystal Engineering of Green Tea Epigallocatechin-3-gallate (EGCg)Cocrystals and Pharmacokinetic Modulation in Rats / A. J. Smith, P. Kavuru, K. K. Arora [et al.] // Molecular Pharmaceutics. – 2013. – Vol. 10, N 8. – P. 2948–2961. 148. Smith, A. J. Modulating the Pharmacokinetics of Bioflavonoids : dis. … Doctor of Philosophy / Adam John Smith. – Tampa, 2012. – 120 p. 149. Smith, A. J. Cocrystals of Quercetin with Improved Solubility and Oral Bioavailability / A. J. Smith, P. Kavuru, L. Wojtas [et al.] // Molecular Pharmaceutics. – 2011. – Vol. 8, N 5. – P. 1867–1876. 150. Sowa, M. Solid-state characterization and solubility of a genistein–caffeinecocrystal / M. Sowa, K. Ślepokurab, E. Matczak-Jona // Journal of Molecular Structure. – 2014. – Vol. 1176 – P. 80–88. 151. Sowa, M. Improving solubility of fisetin by cocrystallization / M. Sowa, K. Ślepokurab, E. Matczak-Jona // CrystEngComm. – 2014. – Vol. 16 – P. 10592–10601.

165 152. Sowa, M. A 1:1 pharmaceutical cocrystal of myricetin in combination with uncommon piracetam conformer: X-ray single crystal analysis and mechanochemical synthesis / M. Sowa, K. Ślepokurab, E. Matczak-Jona // Journal of Molecular Structure. – 2014. – Vol. 1058 – P. 114–121. 153. Sowa, M. Cocrystals of fisetin, luteolin and genistein with pyridinecarboxamide coformers: crystal structures, analysis of intermolecular interactions, spectral and thermal characterization / M. Sowa, K. Ślepokurab, E. Matczak-Jona // CrystEngComm. – 2013. – Vol. 15 – P. 7696–7708. 154. Sowa, M. A 1:1 cocrystal of baicalein with nicotinamide / M. Sowa, K. Ślepokurab, E. Matczak-Jona // Acta Crystallographica Section C: Structural Chemistry. – 2012. – Vol. 68 – P. 262–265. 155. Stortz, C. A. Comparison of different force fields for the study of disaccharides / C. A. Stortz, G. P. Johnson, A. D. French, G. I. Csonka // Carbohydrate Research. – 2009. – Vol. 344, N 16. – P. 2217–2228. 156. Su, X. Preparation of a 1:1.5 cocrystal of kaempferol with 4,4'-bipyridine based on analyzing intermolecular interaction of building units / X. Su, H. Yin, L. Liu [et al.] // Journal of Molecular Structure. – 2019. – Vol. 1177 – P. 107–116. 157. C. Sunil, Sunil, C. An insight into the health-promoting effects of taxifolin (dihydroquercetin) / B. Xu // Phytochemistry. – 2019. – Vol. 166, N 112066. – URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031942219304005?via%3Dihub (дата обращения: 01.08.2019). 158. Taxifolin Market - Global Industry Analysis, Size, Share, Growth, Trends and Forecast 2018 – 2028 // TMR Research : [сайт]. – 2018. – URL: https://www.tmrresearch.com/taxifolin-market (дата обращения: 07.01.2021). 159. Teja, A. Simultaneous improvement of solubility and permeability by fabricating binary glassy materials of Talinolol with Naringin: Solid state characterization, In-vivo In-situ evaluation / A. Teja, P. B. Musmade, A. B. Khade, S. J. Dengale // European Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2015. – Vol. 78 – P. 234–244. 160. Thakuria, R. Cocrystal Dissociation under Controlled Humidity: A Case Study of Caffeine−Glutaric Acid Cocrystal Polymorphs / R. Thakuria, M. Arhangelskis, M. D. Eddelston // Organic Process Research & Development. – 2019. – Vol. 23 – P. 845–851. 161. The Japanese Pharmacopeia. English Version. – 17th ed. – Tokyo : Ministry of Health, Labour, and Welfare, 2016. – 2643 p. 162. The United States Pharmacopeia. The National Formulary. – 41st ed. – Rockvill : The United States Pharmacopeial Convention, 2018. – 2143 p.

166 163. Thilakarathna, S. H. Flavonoid Bioavailability and Attempts for Bioavailability Enhancement / S. H. Thilakarathna, H. P. V. Rupasinghe // Nutrients. – 2013. – Vol. 5 – P. 3367–3387. 164. Timmons, D. J. Assembling Extended Structures with Flavonoids / D. J. Timmons, M. R. Pacheco, K. A. Fricke, C. Slebodnick // Crystal Growth & Design. – 2008. – Vol. 8, N 8. – P. 2765–2769. 165. Tjukavkina, N. A. Diquertin – a new bioflavonoid product obtained from plant raw materials / N. A. Tyukavkina, V. V. Naumov, Yu. A. Kolesnik, I. A. Rulenko // Polyphenols Communications 96 / ed. by J. Vercauteren, C. Chéze, M. C. Dumon, J. F. Weber. – Bordeaux : Groupe Polyphénols, 1996. – P. 101–102. 166. Tjukavkina, N. A. Dihydroquercetin - a new antioxidant and biologically active food supplement / N. A. Tjukavkina, I. A. Rulenko, Y. A. Kolesnik // Problems of Nutrition. – 1997. – Vol. 66, N 6. – P. 12–15. 167. Tominaga, H. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cellviability assay / H. Tominaga, M. Ishiyama, F. Ohseto [et al.] // Analytical Communications. – 1999. – Vol. 36, N 2. – P. 47–50. 168. Tsimogiannis, D. Characterization of Flavonoid Subgroups and Hydroxy Substitution by HPLC-MS/MS / D. Tsimogiannis, M. Samiotaki, G. Panayotou, V. Oreopoulou // Molecules. – 2007. – Vol. 12, N 3. – P. 593–606. 169. Twarużek, M. The use of in vitro assays for the assessment of cytotoxicity on the example of MTT test / M. Twarużek, E. Zastempowska, E. Soszczyńska, I. Ałtyn // Folia Biologica et Oecologica. – 2018. – Vol. 14 – P. 23–32. 170. Uchiyama, H. Improved Solubility of Quercetin by Preparing Amorphous Solid with Transglycosylated Rutin and Isoquercitrin / H. Uchiyama, Y. Wada, M. Takamatsu [et al.] // Environmental Control in Biology. – 2018. – Vol. 56, N 4. – P. 161–165. 171. Vasisht, K. Enhancing biopharmaceutical parameters of bioflavonoid quercetin by cocrystallization / K. Vasisht, K. Chadha, M. Karan [et al.] // CrystEngComm. – 2016. – Vol. 18 – P. 1403–1415. 172. Verma, S. Molecular construction of NADH-cytochrome b5 reductase inhibition by flavonoids and chemical basis of difference in inhibition potential: Molecular dynamics simulation study / S. Verma, A. Singh, A. Mishra // Journal of Applied Pharmaceutical Science. – 2012. – Vol. 2, N 8. – P. 33–39. 173. Veverka, M. Cocrystals of quercetin: synthesis, characterization, and screening of biological activity / M. Veverka, T. Dubaj, J. Gallovič [ et al.] // Monatshefte für Chemie. – 2015. – Vol. 146, N 1. – P. 99–109.

167 174. Wang, W. Enhanced dissolution rate and oral bioavailability of Ginkgo biloba extract by preparing solid dispersion via hot-melt extrusion / W. Wang, Q. Kang, N. Liu [et al.] // Fitoterapia. – 2015. – Vol. 102 – P. 189–197. 175. Wang, C. Enhancing Bioavailability of Dihydromyricetin through Inhibiting Precipitation of Soluble Cocrystals by a Crystallization Inhibitor / C. Wang, Q. Tong, X. Hou [et al.] // Crystal Growth & Design. – 2016. – Vol. 16, N 9. – P. 5030–5039. 176. Wang, Y.-J. Interference of Phenylethanoid Glycosides from Cistanche tubulosa with the MTT Assay / Y.-J. Wang, S.-M. Zhou, G. Xu, Y.-Q. Gao // Molecules. – 2015. – Vol. 20, N 5. – P. 8060–8071. 177. Wei, Y. Further enhanced dissolution and oral bioavailability of docetaxel by coamorphization with a natural P-gp inhibitor myricetin / Y. Wei, S. Zhou, T. Hao [et al.] // European Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2019. – Vol. 129 – P. 21–30. 178. Wong, M. Lead Identification/Optimization / M. Wong, M. McAllister // Oral Formulation Roadmap from Early Drug Discovery to Development / ed. by E. Kwong. – Hoboken : John Wiley & Sons Inc., 2017. – P. 9–38. 179. Zhang. Q.-F. Structure selective complexation of cyclodextrins with five polyphenols investigated by capillary electrokinetic chromatography / Q.-F. Zhang, H.-Y. Cheung, X. Shangguan, G. Zheng // Journal of Separation Science. – 2012. – Vol. 35 – P. 3347–3353. 180. Zhang, Y.-N. Preparation of a 1:1 cocrystal of genistein with 4,4′-bipyridine / Y.-N. Zhang, H.-M. Yin, Y. Zhang [et al.] // Journal of Crystal Growth. – 2017. – Vol. 458 – P. 103–109. 181. Zhao, J. Improvement strategies for the oral bioavailability of poorly water-soluble flavonoids: An overview / J. Zhao, J. Yang, Y. Xie // International Journal of Pharmaceutics. – 2019. – Vol. 570, N 118642. – URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378517319306878 (дата обращения: 02.04.2020). 182. Zaragozá, C. Potential Therapeutic Anti-Inflammatory and Immunomodulatory Effects of Dihydroflavones, Flavones, and Flavonols / C. Zaragozá, L. Villaescusa, J. Monserrat [et al.] // Molecules. – 2020. – Vol. 25, N 1017. – URL: https://www.mdpi.com/1420-3049/25/4/1017 (дата обращения: 31.12.2020). 183. Zavodnik, V. Electron density study of urea using TDS-corrected X-ray diffraction data: quantitative comparison of experimental and theoretical results / V. Zavodnik, A. Stash, V. Tsirelson [et al.] // Acta Crystallographica Section B: Structural Science, Crystal Engineering and Materials. – 1999. – Vol. 55 – P. 45–54.

168 184. Zu, Y. Enhancement of solubility, antioxidant ability and bioavailability of taxifolin nanoparticles by liquid antisolvent precipitation technique / Y. Zu, W. Wu, X. Zhao [et al.] // International Journal of Pharmaceutics. – 2014. – Vol. 471 – P. 366–376. 185. Zu, Y. The high water solubility of inclusion complex of taxifolin-γ-CD prepared and characterized by the emulsion solvent evaporation and the freeze drying combination method / Y. Zu, W. Wu, X. Zhao [et al.] // International Journal of Pharmaceutics. – 2014. – Vol. 477 – P. 148–158. 186. Zu, S. Micronization of Taxifolin by Supercritical Antisolvent Processand Evaluation of Radical Scavenging Activity / S. Zu, L. Yang, J. Huang // International Journal of Molecular Sciences. – 2012. – Vol. 13, N 7. – P. 8869–8881.

169 ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение А (рекомендуемое) Рисунок А.1 – Патент

170 Приложение Б (рекомендуемое) Рисунок Б.1 – Акт внедрения (Сеченовский университет)

171 Приложение В (рекомендуемое) Рисунок В.1 – Акт внедрения (РНИМУ имени Н.И. Пирогова)

172 Приложение Г (рекомендуемое) Рисунок Г.1 – Акт внедрения (АО «Аметис»)

173 Приложение Д (рекомендуемое) Рисунок Д.1 – Выписка из протокола заседания ЛЭК

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Роман Терехов

Отзыв научного руководителя, д-ра фарм. наук, проф. кафедры химии Института фармации им. А.П. Нелюбина Селивановой Ирины Анатольевны

около 3 лет назад

Рецензия от Роман Терехов

Автореферат

около 3 лет назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв