Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования
«Российский национальный исследовательский медицинский
университет
имени Н.И. Пирогова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
(ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России)
Медико-биологический факультет
Кафедра биохимии МБФ
Выпускная квалификационная работа
По специальности 30.05.01 «Медицинская биохимия»
Тема выпускной квалификационной работы:
Характеристика метода многолокусной метилчувствительной ПЦР в
режиме реального времени
Николаева Александра Федоровна
Студентка 3.6.11 группы
Работа выполнена в ФГБНУ «Медикогенетический научный центр им. Н.П.
Бочкова», лаборатория эпигенетики
Научный руководитель от принимающей
организации: Танас А.С., к.б.н., доцент
кафедры общей и медицинской генетики МБФ,
в.н.с. лаборатории эпигенетики ФГБНУ «МГНЦ».
Научный руководитель от РНИМУ им. Н.И.Пирогова:
Скамров А.В., к.б.н., доцент кафедры молекулярной
биологии и медицинской биотехнологии
Допущен к защите _____________ 2021 года
Подпись_______________ Зав. кафедрой биохимии МБФ, д.б.н., профессор
РАН, Мошковский С. А.
Москва 2021
Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ............... 3
ВВЕДЕНИЕ................................................................................................. 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................ 7
1.1 Качественные методы анализа метилирования ДНК ................... 12
1.1.1 Качественные методы анализа метилирования ДНК,
основанные на бисульфитной конверсии ................................ 12
1.1.2 Качественные методы, основанные на рестрикционном
анализе....................................................................................... 15
1.2 Количественные методы анализа метилирования ДНК ............... 20
1.2.1 Количественные методы, основанные на бисульфитной
конверсии .................................................................................. 20
1.2.2 Количественные методы, основанные на рестрикционном
анализе....................................................................................... 31
1.2.3 Анализ на основе аффинного обогащения ............................... 33
1.3 Обоснование выбора МЧ-кПЦР .................................................... 40
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................... 42
2.1. Материал для исследования ........................................................... 42
2.2 Выделение геномной ДНК из лимфоцитов периферической
крови................................................................................................ 42
2.3 Обработка ДНК метилчувствительной эндонуклеазой
рестрикции ...................................................................................... 44
2.4 Алгоритм разработки тест-системы для проведения
многолокусной МЧ-кПЦР .............................................................. 45
2.4.1 Выбор целевых районов, удовлетворяющих условиям для
проведения многолокусной МЧ-кПЦР .................................... 46
2.4.2 Выбор эндогенных контролей ................................................. 47
2.4.3 Формирование набора параметров для подбора совместимых
пар праймеров ........................................................................... 49
2.4.4 Подбор совместимых пар праймеров и зондов ....................... 51
2.5 Метилчувствительная многолокусная ПЦР в режиме реального
времени ........................................................................................... 53
1
2.5.1 Определение уровня метилирования по данным МЧ-кПЦР .. 57
2.6 Флуоресцентные красители, используемые в методе .................. 59
2.7 Электрофорез в полиакриламидном геле ...................................... 65
2.8 Окрашивание геля нитратом серебра ............................................ 67
2.9 Моделирование уровня метилирования ДНК для оценки
аналитических свойств метода МЧ-кПЦР .................................... 68
2.10
Определение аналитической чувствительности метода МЧ-
кПЦР................................................................................................ 70
2.11
Определение относительной погрешности метода МЧ-кПЦР
71
2.12
Программное обеспечение ....................................................... 72
2.13
Методы статистического анализа ............................................ 72
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ........................................ 73
3.1 Оптимизация лабораторного протокола ....................................... 73
3.2 Эффективность ПЦР ...................................................................... 80
3.3 Уровень метилирования по данным МЧ-кПЦР ............................ 82
3.4 Аналитическая чувствительность метода МЧ-кПЦР ................... 90
3.5. Относительная погрешность метода МЧ-кПЦР ........................... 91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................ 92
ВЫВОДЫ .................................................................................................. 95
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ....................................... 96
2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
МЧ-кПЦР – метилчувствительная количественная ПЦР
Real-Time – ПЦР в режиме реального времени
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
MSRE - methylation sensitive restriction enzyme (метилчувствительная
эндонуклеаза рестрикции)
RRBS – Reduced Representation Bisulfite Sequencing (бисульфитное
секвенирование ограниченных выборок геномных локусов)
НАХТ – неоадъювантная химиотерапия
COBRA – Combined Bisulphite Restriction Analysis (комбинированный
бисульфитный рестрикционный анализ)
LNA – locked nucleic acid (рибонуклеотиды)
п.н. – пара нуклеотидов
phos – фосфат
DTT – дитиотреитол
TBE – трис-боратный буфер
ТЕМЕД – тетраметилэтилендиамин
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
APS – аммония персульфат
dNTP – дезоксинуклеозидтрифосфат
SDS – додецилсульфат натрия
D – образец, обработанный метилчувствительной рестриктазой BstHHI
3
ND – образец, необработанный метилчувствительной рестриктазой
BstHHI
Me+ – модельная метилированная матрица
Me- – модельная неметилированная матрица
E – эффективность ПЦР
CV – coefficient of variation (коэффициент вариации)
RE – относительная погрешность
REST API - representational state transfer application programming interface
(интерфейс прикладного программирования с репрезентативной передачей
состояния)
AA – acrylamide (незаряженный мономер – акриламид)
bisAA – N,N'-methylenebisacrylamide (метиленбисакриламид)
Ct – threshold cycle (пороговый цикл)
MSP – метилспецифическая ПЦР
WGBS
–
Whole-Genome
Bisulfite
Sequencing
(полногеномное
бисульфитное секвенирование)
MethyLight
ddPCR
–
количественная
цифровая
капельная
метилспецифическая ПЦР
MS-HRM
–
Methylation-sensitive
high-resolution
melting
(метод
высокочувствительного плавления)
MeDIP – Methylated DNA Immunoprecipitation (иммунопреципитация)
4
ВВЕДЕНИЕ
Метилирование
ДНК
является
значимой
эпигенетической
модификацией, поскольку оно тесно связано с инактивацией гена,
дифференцировкой и канцерогенезом. Следовательно, обнаружение и
количественная оценка метилирования цитозина являются обязательными для
улучшения понимания функций данной модификации в организмах и для
разработки ранней диагностики.
Идентификация, количественная оценка и картирование метилирования
ДНК в геноме могут быть выполнены с помощью широкого спектра
доступных методов и подходов [1]. Коллективом лаборатории предлагается
метод многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени
(МЧ-кПЦР).
Это
одновременный
ампликона.
количественный
анализ
Данный
нескольких
метод
является
метод,
который
подразумевает
CpG-динуклеотидов
перспективным
в
границах
в медицинском
применении, так как одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза
является инактивация генов-супрессоров опухолевого роста вследствие
аномального метилирования CpG-островков.
Актуальность данной работы заключается в том, что созданная тестсистема на основе многолокусной МЧ-кПЦР является перспективным
лабораторным инструментом для применения в медицинских исследованиях,
в т.ч. в персонализированной медицине. Мультиплексный подход метода и
минимальное приемлемое количество входной ДНК позволяют производить
скрининг десятков образцов, что делает метод более доступным. Данная тестсистема применялась в исследовании предсказания эффективности на
неоадъювантную химиотерапию (НАХТ) у пациенток с люминальным B и
трижды-негативным подтипами рака молочной железы в рамках проекта РНФ
(№ 18-15-00430).
5
Целью
работы
является
охарактеризовать
свойства
метода
разработанной многолокусной МЧ-кПЦР для количественного анализа уровня
метилирования ДНК.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие
задачи:
1. Выбрать необходимые участки генома, позволяющие определить
уровень метилирования методом МЧ-кПЦР.
2. Осуществить подбор праймеров и зондов для МЧ-кПЦР.
3. Осуществить проведение МЧ-кПЦР.
4. Применить метод МЧ-кПЦР к объектам с различным уровнем
метилирования.
5. Оценить эффективность и аналитическую чувствительность метода МЧкПЦР.
Новизна работы определяется тем, что впервые метод МЧ-кПЦР
применяется в формате многолокусной тест-системы с использованием
Taqman – зондов. Качественные методы, основанные на рестрикционном
анализе, в сравнении с технологиями, использующими бисульфитную
конверсию, не приводят к деградации ДНК, однако на практике появление
ампликона после проведения ПЦР не всегда следует правилу «все или
ничего»,
что
обусловливает
необходимость
применения
надежных
количественных методов для анализа уровня метилирования ДНК. Описанные
ранее подходы к МЧ-кПЦР недостаточны для внедрения методики в
исследованиях больших выборок пациентов, что обусловлено отсутствием
мультиплексного формата реакции и эндогенных контролей. Коллективом
лаборатории
предлагается
метод
МЧ-кПЦР
с
возможностью
мультиплексирования и наличием внутренних контролей ПЦР.
6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Методы анализа метилирования ДНК разделяют на качественные и
количественные (табл. 1). Выделяют 3 основные группы методов для
идентификации конкретных дифференциально метилированных областей,
базирующиеся на:
1. Бисульфитной модификации ДНК.
2. Рестрикционном анализе.
3. Анализе на основе аффинного обогащения.
Методы, в основе которых лежит бисульфитная модификация ДНК,
подразумевают предварительную денатурацию ДНК под действием щелочи,
после чего одноцепочечная ДНК обрабатывается бисульфитом натрия (рис. 1,
2). Обработка ДНК бисульфитом натрия является причиной дезаминирования
как метилированных, так и неметилированных остатков цитозина, но
реакционная
способность
5-метилцитозина
намного
ниже,
чем
у
неметилированных остатков цитозина [2]; поэтому неметилированные
цитозины превращаются в урацилы, в то время как метилированные цитозины
остаются неизменны в CpG-динуклеотидах. Такая модификация позволяет
различать метилированную и неметилированную ДНК. Условием успешного
проведения реакции является полная обработка ДНК бисульфитом натрия [3].
После конверсии ДНК бисульфит натрия должен быть удален из смеси, так как
его присутствие предотвращает репликацию ДНК.
7
Рисунок 1. Схема бисульфитной конверсии неметилированной ДНК.
1 – сульфонирование остатка цитозина при pH=5 с образованием 6сульфоцитозина; 2 – гидролитическое дезаминирование остатка цитозина с
образованием
промежуточного
соединения
5,6-дигидроцитозин-6-
сульфоната; 3 – превращение аддукта дезаминированного бисульфита в
остаток урацила за счет удаления бисульфита при pH>13 (щелочное
десульфонирование) (по Tanaka K., 2007 г.) [4].
Рисунок 2. Схема бисульфитной конверсии метилированной ДНК.
После бисульфитной трансформации 5-метилцитозин превращается в тимин,
8
но скорость реакции образования бисульфитного аддукта намного ниже (по
Tanaka K., 2007 г.) [4].
Ограничения бисульфитной модификации ДНК:
1. Деградация ДНК в ходе бисульфитной конверсии [4], что может
объясняться депуризацией ДНК, катализируемой pH=5, или
сильными окислительными свойствами бисульфита натрия [5].
Это приводит к уменьшению количества ДНК, пригодной для
последующего ПЦР–анализа [6].
2. Неполная бисульфитная конверсия ДНК может привести к
интерпретации непревращенных цитозинов как метилированных
[7]. В свою очередь, неполная бисульфитная конверсия возникает
вследствие неполной денатурации матрицы ДНК или ее частичной
ренатурации во время бисульфитной обработки [8]. Такие
артефакты могут быть менее значительными, если выделять ДНК
с
использованием
расширенного
протокола,
включающего
обработку протеиназой К для удаления остаточного белка [9],[10].
Добавление мочевины так же может повысить эффективность
бисульфитной конверсии, поддерживая ДНК в денатурированном
состоянии [11].
3. Невозможность различения модификаций 5-метилцитозин (5mC)
и 5-гидроксиметилцитозин (5hmC). Специфическое окисление
5hmC до 5-формилцитозина (5fC) и последующее преобразование
в урацил (в условиях бисульфита) позволяет отличить 5hmC от
5mC [12].
4. Большое количество ДНК (> 10 мкг/мл) может привести к
снижению конверсии из-за истощения доступного бисульфита в
реакционной смеси и увеличению pH за счет образования NH 4+ в
качестве побочного продукта реакции.
9
Для оценки локус-специфичного метилирования ДНК используют
методы на основе ПЦР с праймерами, не содержащими в последовательности
CpG-динуклеотиды: метилспецифическая ПЦР (MSP), COBRA, бисульфитное
секвенирование
по
Сэнгеру/пиросеквенирование,
метилспецифическая
цифровая капельная ПЦР, Epityper. Используемые контроли при выполнении
реакции амплификации – полностью метилированная ДНК и полностью
неметилированная ДНК, отрицательный контроль (без матрицы), ПЦР с
непреобразованной бисульфитом ДНК [13], [14].
Рестрикционный
избирательном
анализ
гидролизе
метилирования
ДНК
ДНК
эндонуклеазами
основан
на
рестрикции,
чувствительными к метилированию ДНК, такими как MspI, HpaII, NotI или
SmaI. Чаще всего используется HpaII – эндонуклеаза, которая может
распознавать
и
расщеплять
последовательность
CCGG,
когда
она
неметилирована, но не разрезает сайт узнавания при добавлении метильной
группы к CpG-динуклеотиду (CmCGG) (рис. 3).
10
Рисунок 3. Принцип анализа метилирования с использованием
метилчувствительной эндонуклеазы рестрикции (MSRE). А – гидролиз ДНК
MSRE вследствие неметилированного цитозина, входящего в сайт узнавания
рестриктазы. Б – MSRE не гидролизует сайт узнавания рестриктазы, в котором
находится метилированный цитозин (по Dahl C., 2003 г.) [8].
Также
можно
использовать
пару
эндонуклеаз
с
разной
чувствительностью к конкретному сайту рестрикции. HpaII и MspI являются
одной из этих пар, где HpaII, как упоминалось ранее, является чувствительной
к метилированию эндонуклеазой, в то время как MspI гидролизует ДНК в
сайте узнавания независимо от его статуса метилирования. У некоторых
рестриктаз существуют такие ограничения, как ингибирование гидролиза
ДНК, если C рядом с CpG метилирован [15]. Также, некоторые эндонуклеазы
рестрикции не способны различать цитозины, метилированные в разных
положениях пиримидинового кольца [16].
Для оценки статуса метилирования ДНК гидролиз с помощью
метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции можно комбинировать с
11
различными методами: MSRE-Саузерн-блот, метилчувствительная ПЦР,
комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ (COBRA), и др.
1.1 Качественные методы анализа метилирования ДНК
1.1.1 Качественные методы анализа метилирования ДНК,
основанные на бисульфитной конверсии
Метилспецифическая ПЦР
Метилспецифическая ПЦР (MSP - Methylation-Specific PCR) является
основным методом анализа метилирования ДНК [17]. Данная методика
включает использование двух наборов праймеров: одна пара праймеров
специфична для неметилированной ДНК (U), напротив, другая пара
специфична для метилированной ДНК (M) [18]. Таким образом, для каждого
образца проводят две реакции ПЦР, либо используют мультиплексный формат
реакции [19], после чего фрагменты анализируют гель-электрофорезом [20].
Успешная амплификация из пары праймеров М указывает на
метилированную ДНК, а продукт ПЦР при использовании пары праймеров U
отражает неметилированную ДНК (рис. 4).
12
Рисунок 4. Схема возможных результатов метилспецифической ПЦР на
электрофорезе. Используя два набора праймеров (M – специфична для
метилированной ДНК, U – специфична для неметилированной ДНК), можно
анализировать статус метилирования ДНК: А – присутствие продукта
амплификации из пары праймеров M указывает на метилированную ДНК,
Б – присутствие продуктов амплификации с обоих пар праймеров M и U
указывает на образец одновременно с метилированной и неметилированной
ДНК в области интереса, В – присутствие продукта амплификации из пары
праймеров U указывает на неметилированную ДНК.
Для обеспечения качественной оценки наличия метилирования ДНК
методом MSP необходимо соблюдение критериев подбора праймеров (рис.5).
1. Праймеры,
подобранные
для
метилированной
и
неметилированной последовательности, должны отжигаться с
одной и той же CpG-содержащей областью.
13
2. Праймеры
должны
включать
многочисленные
последовательности CpG-динуклеотидов, находящиеся как можно
ближе к 3-области праймера, чтобы обеспечить максимальное
различие
между
метилированными
и
неметилированными
аллелями.
3. Последовательность ДНК (целевой локус) для проведения MSP
должна содержать достаточное количество цитозинов вне CpG
контекста.
Рисунок 5. Схема примера конструирования праймеров для проведения
MSP для олигонуклеотида, специфичного для неметилированной ДНК (слева)
и метилированной ДНК (справа). Конвертированная бисульфитом ДНК
модифицируется в зависимости от ее статуса метилирования (в центре). Эта
последовательность используется для создания прямого (forward) праймера
путем замены U на T.
Ограничения метода MSP сводятся к дороговизне, одновременной
оценке ограниченного количества CpG-сайтов, необходимости наличия
стандартных полностью метилированной и полностью неметилированной
ДНК, наличию ложноположительных результатов, ограничению длины ПЦРпродукта (80-175 п.н.) [21], низкой специфичности, невысокой стандартизации
результатов.
Преимущества метода MSP:
14
1. Разработаны модификации
в режиме реального
MSP
времени
(Methylight, MethylQuant) [22], что делает метод количественным и
позволяет рассчитать относительное метилирование по разнице
значений порогового цикла (Ct). Количественная оценка возможна
благодаря наличию метилированной эталонной ДНК [23]; при этом
связывается
TaqMan-зонд
только
с
определенной
областью
(метилированной или неметилированной последовательностью).
2. Высокая чувствительность.
3. Низкий уровень ложноотрицательных результатов.
4. В сравнении с другими методами, основанными на бисульфитной
конверсии, быстрее, так как не требует реакции секвенирования.
1.1.2 Качественные методы, основанные на рестрикционном
анализе
Метилчувствительная ПЦР
В основе метода метилчувствительной
ПЦР (МЧ-ПЦР) лежит
использование метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции. Механизм
действия
метилчувствительных
рестриктаз
заключается
в
гидролизе
неметилированных участков, метилированные же участки остаются не
гидролизованными, так как 5-mC блокирует активность ферментов [24].
Обработанные метилчувствительными
амплифицируют
последовательность
с
рестриктазами
фрагменты ДНК
праймеров,
фланкирующих
использованием
сайта
рестрикции.
Таким
образом,
только
метилированная ДНК приводит к детекции продукта ПЦР. Ампликоны
разделяют электрофорезом. Присутствие полосы в геле означает наличие
метилирования в сайте рестрикции (рис. 6).
15
Рисунок 6. Принцип МЧ-ПЦР. ДНК гидролизуется с использованием
метилчувствительных рестриктаз (MSRE) с последующей ПЦР. Отсутствие
метилированного цитозина способствует гидролизу с помощью MSRE, тем
самым, не генерируя полосы ампликона. Сгенерированная полоса ПЦРпродукта может быть использована для валидации статуса метилирования
исследуемой области.
В сравнении с методами, основанными на бисульфитной конверсии,
метод
МЧ-ПЦР
позволяет
избежать
некоторых
проблем,
присущих
бисульфитной конверсии, в частности, плохо контролируемой эффективности
модификации, которая может быть снижена из-за неполной денатурации или
частичной ренатурации ДНК во время обработки бисульфитом натрия [25].
Новые
протоколы
используют
количественную
ПЦР
вместо
традиционной, что позволяет рассчитать процент метилирования на основе
пороговых
циклов
(Ct),
измеренных
для
гидролизованной
и
не
гидролизованной ДНК. На сегодняшний день существует несколько подходов
к анализу метилирования ДНК на основе МЧ-кПЦР. Например, Beikircher G.,
совместно с соавт. [24] и Hua D., совместно с соавт. [26], используют подход
МЧ-кПЦР с использованием интеркалирующих красителей (SYBR-/Eva16
Green),
что
делает
невозможным
мультиплексирование
реакции.
Предлагаемая коллективом лаборатории технология многолокусной МЧкПЦР имеет преимущество перед остальными подходами, обусловленное
использованием
комплементарных
TaqMan-зондов,
исследуемой
последовательности, что повышает специфичность реакции и делает
возможным
мультиплексный
формат,
делая
выборку
исследований
многограннее.
Недостатки, присущие данной методике, обусловлены требованием
наличия в исследуемой области сайтов узнавания метилчувствительных
рестриктаз,
из
чего
вытекает
необходимость
подбора
праймеров,
направленного на охват целевой области, содержащей не менее 3 сайтов
узнавания рестриктазы в последовательности ампликона (гарантия полного
гидролиза, следовательно, минимизации ложноположительных результатов).
Преимущества методов МЧ-ПЦР и МЧ-кПЦР заключаются в простоте
анализа (нацелен на «нативную» ДНК), а также, в параллельном сравнении
контрольных (не гидролизованных) и экспериментальных (гидролизованных)
образцов даже для очень малых количеств исходной ДНК [17], что
увеличивает надежность данных за счет уменьшения ложноотрицательных
результатов, которые иногда наблюдаются в данных метилспецифической
ПЦР [27].
Метод МЧ-ПЦР используется в прогнозировании эффективности
неоадъювантной химиотерапии РМЖ [28], анализе статуса метилирования
промоторов генов [29], анализе уровней метилирования в тканях или
культивируемых клетках [30], диагностике и анализе прогрессирования
гепатоцеллюлярной карциномы [31], и др.
17
Комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ
Комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ (COBRA –
Combined Bisulphite Restriction Analysis) – методика, совмещающая 2
основных принципа анализа метилирования: бисульфитную конверсию и
рестрикционный анализ; введена Sadri, совместно с Hornsby [32]. Далее,
методику модифицировали для анализа метилирования ДНК в определенных
локусах: 1-цепочечную ДНК подвергают бисульфитной конверсии, после чего
интересующую область амплифицируют с использованием праймеров, не
содержащих CpG-динуклеотиды и не различающих метилированные и
неметилированные аллели [8], [33]. ПЦР-продукты очищают для обеспечения
полного гидролиза и количественного анализа на следующих этапах.
Комбинация обработки ДНК бисульфитом натрия и ПЦР-амплификации
приводит к превращению неметилированных остатков цитозина в тимин и
непревращению метилированных остатков цитозина (рис. 7). Следовательно,
в полученном ПЦР-продукте доля молекул, содержащих неконвертированные
цитозины, пропорциональна доле метилированой ДНК в этом сайте в
исходной
геномной
ДНК.
Продукты
амплификации
гидролизуют
эндонуклеазой рестрикции. Рестриктазу подбирают со специфическим сайтом
узнавания, различающим статус метилирования ДНК до конверсии. Анализ
продуктов ПЦР может быть качественным и количественным:
1. Качественный анализ – продукты гидролиза можно анализировать с
помощью электрофореза.
2. Количественный
анализ
–
процент
метилирования
ДНК
рассчитывается путем количественного определения соотношения
гидролизованных и не гидролизованных продуктов ПЦР [34]. Для
этого
проводят
электрофорез
электроблоттинг,
гибридизацию
в
полиакриламидном
мембран
со
геле,
специфическими
зондами, меченными 5-концом радиоактивным изотопом фосфора и
18
количественный анализ с помощью сканера. Стратегия гибридизации
гарантирует гибкость, обеспечиваемую выбором положения зонда
относительно
сайтов рестрикции.
Результаты,
полученные с
помощью различных зондов, можно использовать для подтверждения
значений метилирования ДНК, полученных для конкретного CpGсайта.
Рисунок 7. Общая схема методики COBRA. Схема эксперимента состоит
из стандартной бисульфитной обработки 1-цепочечной ДНК, за которой
следуют ПЦР, рестрикционный анализ и количественное определение уровня
метилирования.
На
первом
этапе
бисульфит
натрия
дезаминирует
неметилированные остатки цитозина до урацилов в то время, как
метилированные остатки остаются не превращёнными. Во время ПЦР остатки
урацила заменяются тиминами, а остатки метилированного цитозина
заменяются цитозинами [35]. Гидролизованные продукты ПЦР разделяют на
8% денатурирующем полиакриламидном геле и переносят на положительно
заряженную мембрану с помощью электроблоттинга, что обеспечивает
быстрый и эффективный перенос ДНК. Затем мембраны гибридизуют с
19
олигонуклеотидами, меченными 5'-концом радиоактивным изотопом фосфора
(длина олигонуклеотидов 15-25 н.) [36]. Количественный анализ выполняется
с помощью сканера, чувствительного к радиоактивному фосфору. Процент
полностью метилированных участков в образце геномной ДНК можно
рассчитать из соотношения между гидролизованным продуктом ПЦР и общим
количеством продукта ПЦР.
Недостатком
метода является
неполная
конверсия
цитозина
и
ограничение анализа существующими сайтами рестрикции в интересующей
области, в результате чего методика не может использоваться для анализа
статуса метилирования всех возможных CpG-сайтов.
Главное преимущество метода в том, что его применяют к образцам
ДНК, выделенным из различного биологического материала [34]; также,
методика
COBRA
характеризуется
простотой
и
оперативностью
использования.
1.2 Количественные методы анализа метилирования ДНК
1.2.1 Количественные методы, основанные на бисульфитной
конверсии
Бисульфитное секвенирование
Методика
бисульфитного
секвенирования
считается
«золотым
стандартом» в исследованиях метилирования ДНК. Бисульфитная конверсия с
последующим ПЦР была первым описанным способом анализа статуса
метилирования ДНК посредством использования ПЦР [37]. Методика
определяет последовательность нуклеотидов после бисульфитной конверсии
и предоставляет информацию об уровне метилирования каждого остатка
20
цитозина в целевой последовательности. ПЦР-продукты визуализируют
электрофорезом; определение нуклеотидной последовательности возможно
двумя способами:
1. Прямое секвенирование продукта ПЦР методом Сэнгера не
дает информации о паттернах метилирования отдельных
аллелей и позволяет определить только среднее значение
метилирования соответствующих CpG-динуклеотидов. После
секвенирования
индикатором
неполной
бисульфитной
конверсии является появление цитозинов вне CpG-сайтов. К
ограничениям
метода
секвенирования
сочетания
и
относят
низкую
аллелей
и
зашумленные
результаты
чувствительность
вследствие
гетерогенных
паттернов
метилирования [38]. Преимущества метода бисульфитного
секвенирования по Сэнгеру в том, что он позволяет достоверно
определить
динуклеотида
позволяет
уровень
в
метилирования
достаточно
детектировать
большом
частично
каждого
CpG-
фрагменте
ДНК;
метилированные
последовательности ДНК.
2. Клонирование продуктов ПЦР в плазмиду. Продукты ПЦР
клонируют в плазмидный вектор, которым трансформируют
компетентные клетки E. Coli; после размножения и очистки
плазмид вставки секвенируют. Метод используется в качестве
«золотого стандарта» для идентификации аллель-специфичных
паттернов метилирования [39]. Бисульфитное секвенирование
на основе клонирования требует не менее шести реакций
секвенирования для получения чувствительности выше, чем у
прямого бисульфитного секвенирования по Сэнгеру [40], что
делает этот вариант дорогостоящим и трудоемким.
21
Оценка уровня метилирования ДНК по результатам бисульфитного
секвенирования может быть качественной и количественной (рис.8).
1. Качественный анализ результатов бисульфитного секвенирования
возможен в случае наличия четкого одиночного пика для каждого
цитозина, входящего в CpG-динуклеотид. В этом случае пик тимина
будет интерпретироваться как неметилированный CpG, а пик
цитозина будет представлять собой метилированный CpG.
2. Количественная оценка уровня метилирования определяется путем
сравнения относительных высот пиков цитозина и тимина в каждом
CpG-динуклеотиде на электрофореграмме.
Рисунок
8.
Упрощенная
схема
электрофореграммы
возможных
результатов бисульфитного секвенирования. Левая панель: бисульфитное
секвенирование на основе клонирования: возможные результаты сводятся к
метилированию (остается C в данных секвенирования) или его отсутствию (T
22
заменяет C по сравнению с необработанной последовательностью). Правая
панель: прямое бисульфитное секвенирование по Сэнгеру: C обозначает
метилированный статус (100%), T обозначает неметилированный статус (0%),
и Y (C + T) обозначает различные проценты метилирования (по Susan, J., 1994
г. ) [37].
Полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS – Whole-Genome
Bisulfite Sequencing) характеризуется высокой стоимостью и большим
объемом получаемых данных, требующих анализа. Также применяют метод
RRBS
(Reduced
Representation
Bisulfite
Sequencing
–
бисульфитное
секвенирование ограниченных выборок геномных локусов), при котором
секвенируется только часть генома [41], [42], [43].
Бисульфитное пиросеквенирование
Бисульфитное пиросеквенирование – метод, основу которого составляет
принцип «секвенирования путем синтеза» с дальнейшим высвобождением
пирофосфата во время репликации ДНК [44], [45]. Методика используется для
количественного
анализа
метилирования
ДНК,
конвертированной
бисульфитом натрия [46]. Бисульфитное пиросеквенирование включает
проведение этапов бисульфитной конверсии 1-цепочечной ДНК, ПЦРамплификации, пиросеквенирования продуктов ПЦР (около 100 п.н.). Оценка
уровня метилирования для каждого CpG-сайта в секвенированной области
строится исходя из насыщенности сигналов для встроенных dGTP и dATP.
Методика
позволяет
обнаруживать
даже
небольшие
различия
в
метилировании (до 5%) [47]. Метод подходит для анализа гетерогенных
образцов (например, злокачественных новообразований), где только часть
клеток
имеет
метилирование
интересующего
дифференциально
метилированного гена.
Процесс пиросеквенирования можно разделить на 3 этапа:
23
1. Амплификация ПЦР: при этом, один из праймеров должен быть
конъюгирован с биотиновой меткой. Данная метка позволяет
очистить на последующих этапах образовавшиеся в результате
ПЦР ампликоны от остальных компонентов смеси, используя
взвесь частиц стрептавидин-сефарозы.
2. Выделение продукта ПЦР с гранулами стрептавидина и
гибридизация с праймером для секвенирования.
3. Секвенирование:
определенном
нуклеотиды
добавляются
порядке/циклически
в
в
заранее
зависимости
от
анализируемой последовательности.
Механизм реакции пиросеквенирования приведен на рис.9.
Рисунок
9.
Схематическое
изображение
ферментной
системы
пиросеквенирования. В результате включения нуклеотидов в растущую цепь
ДНК происходит полимеризация ДНК и стехиометрическое высвобождение
пирофосфата (PPi) фрагментом Кленова ДНК-полимеразы. PPi связывается с
24
аденозинфосфосульфатом (APS) под действием АТФ-сульфурилазы [48] с
образованием АТФ. АТФ используется люциферазой для преобразования
люциферина в оксилюциферин и получения видимого света, который
улавливается камерой устройства и отображается в виде пика на выходных
необработанных
данных
(пирограмма)
Высота
[49].
каждого
пика
пропорциональна количеству включенных нуклеотидов. Апираза разрушает
некомплементарные dNTP и остаточный АТФ [50], подтверждая, что световой
сигнал, обнаруживаемый при добавлении определенного нуклеотида,
возникает только в результате включения этого конкретного нуклеотида.
Процент (%) метилирования = 100% х высота пика цитозина
(метилированный сигнал) / сумма пика цитозина и тимина (неметилированный
и метилированный сигнал) [51].
Подбор праймеров для бисульфитного пиросеквенирования:
1. Выбор участка для праймера с наличием не менее четырех цитозинов в
последовательности ДНК до конверсии, не являющихся CpG, что
гарантирует
амплификацию
только
полностью
преобразованной
бисульфитом ДНК.
2. Присутствие максимум одного CpG в последовательности праймера.
3. Один из праймеров должен быть биотинилирован на 5'-конце.
4. Последовательность праймера для секвенирования должна отличаться
от
праймера
для
амплификации
по
крайней
мере
в
одном
дополнительном нуклеотиде на 3'-конце [52].
К ограничениям метода относится возможность анализировать только
короткие участки (максимум 350 п.н.). Одна из причин заключается в том, что
более длинные ампликоны могут образовывать вторичные структуры и петли,
которые препятствуют реакции секвенирования. Вторая проблема возникает
во время процедуры секвенирования, когда нуклеотиды добавляются в
каждом цикле секвенирования. Объем реакционных лунок увеличивается, что
25
вызывает разбавление всех реагентов, и, следовательно, уменьшение сигнала.
В то же время фоновый сигнал нарастает во время секвенирования из-за
неполной деградации ранее добавленных нуклеотидов [49]. Из-за этого
сигнал, измеренный после 90–100 циклов, имеет низкое качество, и
результаты недостоверны. Однако эти недостатки можно преодолеть,
используя больше праймеров для секвенирования на одном ампликоне или
путем последовательного пиросеквенирования [53], [54].
Преимущества
метода
бисульфитного
пиросеквенирования
заключаются в возможности количественной оценки статуса метилирования
каждого CpG-динуклеотида, изучения гетерогенных образцов, где только в
части клеток метилирован интересующий ген. Также, благодаря своей
относительной
простоте,
скорости
и
сопоставимым
результатам,
пиросеквенирование может быть предпочтительнее клонирования [55].
Цифровая капельная ПЦР
Цифровая капельная ПЦР – быстрый анализ, в котором отдельные
молекулы ДНК могут быть амплифицированы и проанализированы за один
день [56] из небольшого объема образца (допустимый объем образца – 8 мкл).
Одноцепочечная ДНК подвергается бисульфитной конверсии, затем
образец фракционируют (20 000 капель на 20 мкл смеси), амплифицируют
ПЦР в каждой отдельной капле, после чего анализируется каждая капля для
определения доли ПЦР-положительных капель в исходном образце.
Количественная
цифровая
капельная
ПЦР
(MethyLight
ddPCR)
позволяет с высокой чувствительностью количественно определять уровень
метилирования
образцов
ДНК
с
низкой
концентрацией
и
может
использоваться для подтверждения скрининговых исследований всего
генома [57].
Данный
метод
позволяет
точно
определять
редко
метилированные аллели, которые не могут быть обнаружены с помощью
26
обычного MethyLight [58], [59]. MethyLight ddPCR не требует стандартных
кривых для абсолютного количественного определения (в отличие от
традиционной количественной ПЦР).
Ограничение метода цифровой капельной ПЦР состоит в кропотливом
подборе независимых от метилирования зондов [21].
Преимущества метода: точность количественного определения ± 10%
(разница в точности в 4-5 раз выше по сравнению со стандартной ПЦР в
режиме реального времени [60]); позволяет работать с образцами низкой
концентрации (жидкая биопсия) [61]; возможность мультиплексирования [62].
Epityper
Анализ сочетает в себе ферментативный гидролиз и времяпролетную
масс-спектрометрию с лазерной десорбцией / ионизацией (MALDI-TOF MS)
для количественной оценки метилирования отдельных CpG-сайтов [63], [64].
Этапы методики Epityper представлены на рис.10. Конвертированная
бисульфитом 1-цепочечная ДНК амплифицируется с использованием
праймеров, один из которых (обратный, reverse) включает последовательность
промотора РНК-полимеразы T7; при этом праймеры не должны содержать
CpG-сайты и должны давать ампликон размером 200-600 п.н. ДНК
транскрибируется in vitro в одноцепочечную молекулу РНК, которая после
расщепляется РНКазой А (при этом расщепляются как метилированные, так и
неметилированные
области
после
каждого
урацила
с
образованием
фрагментов разной длины и массы), после чего продукты расщепления
измеряются с помощью масс-спектрометрии. Во время MALDI-TOF MS
образец сокристаллизуется на пластине и облучается интенсивным лазерным
импульсом в течение нескольких наносекунд в глубоковакуумной камере
масс-спектрометра [65], [66]. Неметилированная матрица дает расщепление
оснований U в транслируемой РНК (различие в нуклеотидном составе и
27
массе). Фрагменты РНК, полученные в результате транскрибирования
метилированной ДНК, будут тяжелее по массе.
Рисунок 10. Схема Epityper. Обработанная бисульфитом ДНК
амплифицируется с использованием праймеров, расположенных вокруг
интересующего CpG-сайта; один из праймеров (обратный, reverse) включает
последовательность
промотора
РНК-полимеразы
Т7.
Продукт
ПЦР
транскрибируется в транскрипт РНК и расщепляется специфичным для
оснований образом после каждого U (урацила). Затем продукты расщепления
анализируют с помощью масс-спектрометрии (MS) с лазерной десорбцией /
ионизацией (MALDI TOF), в результате получается характерная картина масссигнала.
Сигнал
в
позициях,
отмеченных
зеленым,
представляет
неметилированную ДНК, в отмеченных синим – метилированную ДНК.
Ограничения анализа: наличие полиморфизмов в интересующей
последовательности (изменение массы) [67]; наличие пиков примесей из-за
28
различных факторов, таких как конъюгация аналитов с солями, депуринизация
G или прерванные циклы амплификации во время ПЦР; исследуются только
средние данные метилирования на расщепленный фрагмент.
Преимущества: быстрая целевая количественная оценка отдельных CpG
с высокой пропускной способностью; аналитическая чувствительность метода
5–7% при метилировании 10 - 90% [63].
Метод высокочувствительного плавления
Метод высокочувствительного плавления (MS-HRM – Methylationsensitive high-resolution melting) основан на различных температурах
плавления (Tm) метилированной и неметилированной ДНК [46]. После
обработки
бисульфитом
натрия
ДНК амплифицируется
с помощью
количественной ПЦР [68], ПЦР-продукты анализируются плавлением с
высоким разрешением – методом, который подвергает ДНК денатурации при
плавном возрастании температуры (с изменением на 0,1°C [69]) в присутствии
интеркалирующего красителя (SYBR Green, EvaGreen или SYTO9). Также
было показано, что включение CpG-пар ближе к 5’-концу последовательности
праймеров значительно повышает чувствительность метода [70], компенсируя
смещение ПЦР в сторону неметилированных аллелей [71]. При температуре
плавления ½ продуктов ПЦР диссоциирует на две одиночные нити, вызывая
высвобождение красителя и резкое падение флуоресценции. Продукты ПЦР,
происходящие от метилированного аллеля, будут иметь другой состав и,
следовательно, температуру плавления (более высокую) по сравнению с
неметилированным вариантом из того же локуса [70]. Оценка процента
конкретного метилированного аллеля выполняется путем сравнения с
профилями метилированных и неметилированных контролей [69]. Размер
ампликона должен составлять около 100 п.н., чтобы упростить его профиль
плавления [72].
29
Рисунок 11. Схематический график отрицательной первой производной
кривой
плавления
контрольных метилированной
(Meth
= 100%) и
неметилированной (Meth = 0%) ДНК. ДНК, которая метилирована на 0%,
имеет более низкую температуру плавления по сравнению со 100%
метилированной ДНК.
Ограничения:
1. На точность метода могут влиять различные факторы (расположение и
длина ампликона, качество ДНК или даже метод подготовки ДНК) [73].
2. Несмотря на то, что малый размер ампликона дает более высокую
чувствительность, вместе с тем дает ограниченное разрешение между
уровнями
метилирования
из-за
небольшого
различия
между
метилированной и неметилированной ДНК. Более длинные ампликоны
имеют более различимые профили метилирования [69].
3. Чтобы исследовать статус метилирования неизвестного локуса, профиль
плавления ПЦР-продукта, полученного из этого локуса, должен быть
сравнен с профилями метилированного и неметилированного контролей
[74].
30
4. Не позволяет получить подробную информацию о метилировании
отдельных цитозинов в пределах интересующей последовательности
[74].
Преимущества:
1. Метод высокочувствительный (более чувствителен, чем прямое
секвенирование [75]) и экономичный для исследования метилирования
одного локуса.
2. Позволяет обнаруживать небольшие различия (5-10%) в метилировании
ДНК или даже вклад метилированной ДНК из гетерогенной популяции
клеток в образце.
3. Поскольку метод анализирует свойства плавления конечных продуктов
ПЦР, MS-HRM не только оценивает полностью метилированные аллели
пропорционально полностью неметилированным, но также может
обнаруживать гетерогенно метилированные образцы [76].
1.2.2 Количественные методы, основанные на рестрикционном
анализе
MSRE-Саузерн-блот
MSRE-Саузерн-блот – метод, позволяющий анализировать статус
метилирования с условием наличия большого количества ДНК (~10 мкг). В
данном методе используется пара рестриктаз – изошизомеров и одна
редкощепящая ресриктаза для ограниченя исследуемого участка; при этом
один из рестрикционных ферментов пары изошизомеров способен разрезать
ДНК только тогда, когда его мишень неметилирована, тогда как другой
нечувствителен к метилированным цитозинам. Наиболее часто используемые
изошизомеры – пара HpaII/MspI [46]. Оба изошизомера расщепляют ДНК по
мишени CCGG, но HpaII расщепляет только неметилированные сайты [77].
31
Далее проводят электрофорез для фракционирования продуктов
гидролиза ДНК. Полученные фракции переносят на нейлоновую мембрану и
гибридизуют с радиоактивным зондом [78]. Если тестируемый сайт
метилирован,
то
фрагмент,
детектируемый
после
обработки
ДНК
чувствительным к метилированию изошизомером, будет отличаться по длине
от
фрагмента,
полученного
после
обработки
нечувствительным
изошизомером (рис.5).
Рисунок 12. Схематическое изображение результатов, ожидаемых от
саузерн-блоттинга. А – сайт CCGG неметилирован внутри целевого сайта,
поэтому изошизомеры HpaII и MspI гидролизуют этот сайт. Б – второй
цитозин сайта CmCGG метилирован, поэтому изошизомер HpaII не будет
разрезать этот сайт (продукт обведен красной линией), в отличие от MspI.
Таким образом, удается наблюдать длинную полосу гибридизации на дорожке
HpaII и короткую полосу на дорожке MspI. Стрелка указывает на расщепление
эндонуклеазой рестрикции (по Hou P., 2006 г.) [78].
32
На результатах авторадиографии интенсивность сигнала длинных
продуктов пропорциональна содержанию метилированных молекул в образце,
коротких продуктов – содержанию неметилированных. Определить уровень
метилирования позволяет денситометрический анализ изображения.
1.2.3 Анализ на основе аффинного обогащения
Иммунопреципитация
Иммунопреципитация (MeDIP – Methylated DNA Immunoprecipitation) –
метод, основанный на использовании моноклональных антител (анти-5-meC),
которые
специфически
распознают
и
иммунопреципитируют
ДНК,
содержащую метилированные цитозины [79]. Для анализа требуется наличие
одноцепочечной ДНК для связывания с антителом. Метилированная ДНК
восстанавливается с помощью покрытых никелем магнитных шариков,
которые связываются с комплексом белок-ДНК, затем магнитные шарики
собираются с помощью магнита. Для аффинной очистки используют 5-метилсвязывающие белки для избирательного захвата и отделения 5-метилцитозина
в контексте CpG-динуклеотидов от остальной геномной ДНК. После
выделения метилированной ДНК фрагменты элюируются с гранул и
анализируются.
На основе MeDIP для исследования метилирования в масштабе всего генома
используют иммунопреципитацию в сочетании с высокопроизводительным
секвенированием (MeDIP-Seq, специфичность >97% [80]) и гибридизацией с
дифференциальным метилированием (DMH) [79], анализ ДНК-микрочипов
[81].
33
Рисунок 13. Блок-схема анализа MeDIP.
Ограничения: области с малым количеством CpG могут быть
недостаточно представлены или интерпретированы как неметилированные;
требуемая специфичность антител [82]; нормализация содержимого CpG
должна выполняться с использованием вычислительного анализа и не так
стандартизирована, как другие методы.
Преимущества: MeDIP, в сочетании с другими технологиями, дает
возможность полногеномного скрининга CpG.
34
Таблица 1.
Иммунопреципитация
Epytiper
MS-HRM
5-7%
510%
++
+++
++
-
++
+++
++
+++
++
Воспроизводимость5
Количественная
оценка4
Точность3
Специфичность2
Чувствительность1
-
Все CpG,
Все CpG,
содержащие
содержащиеся в
ся в
ампликоне (по РНКампликоне
транскриптам),
(оценивает
оценивает %
содержание метилирования для
метилирован каждого CpG - сайта
ия в
ампликоне)
Методы, основанные на
бисульфитной конверсии
Анализ на основе
аффинного
обогащения
Методы
Оценивает
метилированный
цитозин (MeDIP) Оценка CpG и
статуса
метилирования
Основные характеристики методов анализа метилирования ДНК
-
+
+++
Ограничения
Преимущества
Определение статуса
метилированных цитозинов
только с высокой
плотностью (MeDIP)
Возможность
комбинирования с другими
анализами, обогащает 5метилцитозин дозозависимым
и -независимым от
последовательности образом
Быстрый, применимый в
большом количестве образцов
Потребность в специальном
оборудовании, наличие SNP
дает неправильную
интерпретацию данных
Не предоставляет
информацию о статусе
метилирования отдельных
CpG-сайтов
Быстрый, простой в
использовании, обнаруживает
гетерогенное метилирование;
немедленное обнаружение
36
Бисульфитное
пиросеквенирование
Бисульфитное
секвенирование
Все CpG, содержащиеся в
ампликоне
ddPCR
Все CpG,
Все CpG, содержащиеся
содержащиеся в
в ампликоне
ампликоне,
оценивает средний
статус
метилирования
для каждого CpG
ложно (+) амплификации/
смещения ПЦР
10%
5%
1520%
+++
+++
+++
+++
++
++6,
+7
+++
+++
+6,
++7
+++
++
++
Потребность в специальном
оборудовании, трудоемкий
подбор праймеров,
потребность не менее 25
реакций секвенирования
для достижения
приемлемой
чувствительности
Потребность в специальном
оборудовании, короткая
длина чтения
Быстрый анализ
метилирования ДНК без
использования стандартной
кривой, нет смещения ПЦР,
информация на уровне
отдельной молекулы
Зашумленность результатов
секвенирования6;
дороговизна,
кропотливость,
длительность, наличие
систематических ошибок,
потребность в не менее 5
реакций секвенирования
для образца7
Быстрота (1 реакция
секвенирования на образец)6,
анализ метилирования
одиночной молекулы ДНК7
Быстрота, простота
использования, высокая
надежность
37
Методы, основанные на рестрикционном
анализе
COBRA
МЧ-кПЦР
МЧ-ПЦР
MSRE-Саузерн-блот
CpG, содержащиеся в 1-6 CpG, оценивает
определенных сайтах
уровень
CpG, содержащиеся в определенных сайтах рестрикции ампликона, метилирования в
рестрикции (обнаруживает метилированный
оценивает уровень
целом
/неметилированный статус CpG)
метилирования для
конкретного CpG - сайта
MSP
+++
+++
++
+++
10%
+++
+++
-
+++
+++
+++
++
++
++++
+++
+++
++
+
++
10%
++
+
++
Дороговизна, не
обнаруживает гетерогенное
метилирование, требует для
анализа 2 пробирочные
реакции
Экономичность, не требует
реакции секвенирования
Ограничение количества
CpG-сайтов, ограничение
интересующей области
сайтами узнавания
рестриктаз, анализ 1 CpG
Простота использования,
оперативность, позволяет
избежать
ложноположительных
результатов
Возможность анализировать
только те CpGдинуклеотиды, которые
попадают в сайты
узнавания известных
рестриктаз.
Дешевизна, доступность
реактивов и расходных
материалов, высокая
чувствительность.
Дороговизна, склонность к
ложно(+)-результатам,
ограничение количества
CpG-сайтов, ограничение
интересующей области
сайтами узнавания
рестриктаз
Простота использования,
скорость, позволяет избежать
некоторых проблем,
присущих бисульфитной
конверсии, обнаруживает
гетерогенное метилирование
1
Аналитическая чувствительность: + – низкая чувствительность, ++ – чувствительность, +++ – высокая чувствительность.
2
Специфичность: + – низкая специфичность, ++ – специфичность, +++ – высокая специфичность.
38
3
Точность: + – низкая точность, ++ – точность, +++ – высокая точность, - – нет достоверных данных.
4
Количественная оценка: + – не надежен для количественной оценки, ++ – количественный метод, +++ – точная количественная оценка.
5
Воспроизводимость: + – низкая воспроизводимость, ++ – воспроизводимость, +++ – высокая воспроизводимость, - – нет достоверных данных.
6
Прямое бисульфитное секвенирование по Сэнгеру.
7
Бисульфитное секвенирование методом клонирования.
39
1.3 Обоснование выбора МЧ-кПЦР
Потенциальным
инструментом
диагностики
злокачественных
заболеваний является метилирование ДНК (анализ 5-метилцитозина в составе
CpG-динуклеотидов). Для разработки диагностических тестов ведется поиск
биомаркеров метилирования ДНК [90].
Обоснованием
использования
метилчувствительных
рестриктаз
является исключение неметилированных матриц, что позволяет одноэтапное
обнаружение
негидролизованных
матриц.
Это
обоснование
было
использовано Зингером-Сэмом и его коллегами [83], которые обработали
геномную ДНК рестриктазой HpaII с последующей ПЦР-амплификацией
образца для анализа метилирования ДНК в локусе H-7 мыши.
Анализ изменений метилирования ДНК в диагностике человека
проводится классически с использованием чувствительных к метилированию
рестрикционных ферментов. С помощью метилчувствительных рестриктаз
давно исследуют паттерны метилирования ДНК, т.к. ферменты содержат в
сайте узнавания CpG-мотивы. Продукты амплификации можно детектировать
в реальном времени с помощью количественной ПЦР и, таким образом,
сделать
вывод
об
уровне
метилирования
интересующих
мишеней.
Комбинация методов метилчувствительных рестриктаз и детекции на основе
количественной ПЦР дает возможность использовать платформы ПЦР с
высокой пропускной способностью и, таким образом, позволяет проводить
тестирование метилирования в больших когортах исследований [24].
Такие методы, как NGS, обычно приводят к определению большого
количества
потенциальных
биомаркеров-кандидатов.
В
современных
исследованиях опираются на 3 основных принципа [84]:
1. Уменьшение количества значимых целей.
2. Проверка маркеров в больших исследуемых когортах.
40
3. Подтверждение результатов.
Условием успешного тестирования МЧ-кПЦР является качественный
гидролиз, в результате чего удается избежать ложноположительных
результатов. Полный гидролиз обеспечивается наличием в тест-системе
внутреннего контроля полноты гидролиза (локус, который содержит 2 сайта
узнавания рестриктазы и не содержит метилированных участков по данным
проекта «ENCODE») и заведомо выбранными таргетными локусами,
содержащими как минимум 3 сайта узнавания рестриктазы.
Часто ограничивающим фактором является доступное количество ДНК.
Обнаружение 0,1% циркулирующей опухолевой ДНК в бесклеточной ДНК
возможно только при теоретическом вводе 1000 геном-эквивалентов
(соответствует 6,5 нг диплоидной ДНК человека) [24]. Например, для
бисульфитного анализа малое доступное количество ДНК часто приводит к
ограничению
по
количеству
исследуемых
кандидатов
из-за
низкой
способности к мультиплексированию. Мультиплексный подход на основе
МЧ-кПЦР является успешным решением проблемы малого количества
входного материала, позволяя увеличить количество технических повторов, а
следовательно, точность анализа.
Таким
образом,
МЧ-кПЦР
обеспечивает
эффективный
анализ
небольших количеств ДНК, высокую степень мультиплексирования, а также,
подходит для клинических образцов из различных биологических источников,
которые часто доступны только в ограниченных количествах.
Ограничением метода МЧ-кПЦР является возможность анализировать
только те CpG-динуклеотиды, которые попадают в сайты узнавания известных
рестриктаз.
Преимущества данного метода в дешевизне и доступности реактивов и
расходных материалов; высокая чувствительность.
41
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.
Материалом
для
Материал для исследования
характеристики
метода
многолокусной
метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени служила ДНК из
лимфоцитов периферической крови. По 5 мл образца венозной крови было
получено от здоровых доноров. Письменное информированное согласие было
получено от всех добровольцев.
2.2 Выделение геномной ДНК из лимфоцитов
периферической крови
Растворы и реактивы:
1. Вода дистиллированная.
2. Ацетат натрия (0,2М, pH 5,2 ).
3. Додецилсульфат натрия (SDS, 10% р-р).
4. Хлорид натрия (5М, pH 5,2).
5. Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (вещества смешивали в
пропорции 24:1 по объёму).
6. 96% охлажденный этанол.
Выделение геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови
проводили согласно протоколу, включающему следующие этапы:
1. К 0,5 мл крови после размораживания добавляли
2 объема
дистиллированной воды до конечного объема 1,5 мл. Тщательно
перемешивали и оставляли на 15 минут при комнатной температуре.
2. Пробу центрифугировали в течение 6 минут при 10 200 об/мин.
Супернатант (надосадочную жидкость) сливали.
42
3. Осадок ресуспендировали пипетированием в 0,5 мл дистиллированной
воды, добавляли дистиллированной воды до 1,5 мл, вортексировали.
Центрифугировали согласно п.2. Надосадочную жидкость сливали.
4. К осадку добавляли 240 мкл 0.2 М ацетата натрия и 25 мкл 10%-ного
раствора SDS. Осадок клеток тщательно перемешивали, переворачивая
пробирку 10 раз до достижения вязкой субстанции, и инкубировали при
37 °C в течение 0,5 - 1 часа, либо при 60 °C в течение 5-7 минут для
лизиса (разрушения) ядер клеток.
5. Центрифугировали смесь 5 минут при 14 500 об/мин для разделения
осадка белка и водного раствора ДНК в супернатанте.
6. К образцу добавляли 300 мкл насыщенного хлорида натрия (5М, pH 5,2)
для осаждения примесей из комплекса нуклеиновых кислот, осадок
тщательно вортексировали.
7. Добавляли один объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) для
денатурации белков и облегчения разделения водной и органической
фаз, центрифугировали 5 минут при 14 500 об/мин.
8. Собирали верхнюю (водную) фазу, где содержится искомая ДНК, в
новую пробирку.
9. Повторили пункты 5,6,7 для полного удаления загрязнений из водной
фазы.
10.Добавляли два с половиной объема холодного 96% этанола (для
осаждения ДНК и отмывки от остатка солей).
11.Пробу центрифугировали в течение 10 мин. при 14 500 об/мин.
Надосадочную жидкость сливали. Добавляли 500 мкл 70% этанола
(отмывание от примесей). Высушивали осадок на воздухе и растворяли
в 120 мкл деионизированной воды.
43
2.3 Обработка ДНК метилчувствительной
эндонуклеазой рестрикции
Для анализа уровня метилирования промоторных областей изучаемых
генов проводили гидролиз ДНК метилчувствительной
эндонуклеазой
рестрикции с последующей многолокусной МЧ-кПЦР.
Материалы для обработки ДНК метилчувствительной рестриктозой:
1. BstHHI (СибЭнзим, Россия): 50 000 e.a./мл.
2. SE-буфер Y 10x (СибЭнзим, Россия): 33 мМ Tris-ацетат (pH 7.9
при 25°C); 10 мМ магний-ацетат; 66 мМ калий-ацетат; 1 мМ DTT.
3. SE-буфер для хранения и разбавления ферментов 1х (СибЭнзим,
Россия): 10 мМ Tris-HCl; 50 mM KCl; 0,1 mM EDTA; 200 mkg/ml
BSA; 1 mM DTT, 50% глицерин.
Обработку геномной ДНК рестриктазой BstHHI (сайт узнавания GCG/C)
проводили в реакционной смеси согласно таблице 2, инкубировали в течение
12 часов при 50°C:
Таблица 2.
Протокол обработки BstHHI
Объем в одну реакцию, мкл.
BstHHI
3,5
SE-буфер Y 10x
3,5
Образец ДНК
28 (350 нг)
Итоговый объём
35
Метод многолокусной МЧ-кПЦР имеет перспективу в дальнейших
исследованиях пациентов, в том числе, больных раком молочной железы.
44
Материалом для определения уровня метилирования в таких исследованиях
служит ограниченное количество биопсийного материала. Чтобы определить
минимальное
количество
материала,
исследования,
выяснили
количество
необходимое
ДНК,
при
для
проведения
которой
надежно
детектировалась амплификация всех таргетных и контрольных локусов.
Методом серийных разведений определено оптимальное количество ДНК – 10
нг.
2.4 Алгоритм разработки тест-системы для проведения
многолокусной МЧ-кПЦР
Ранее в лаборатории в рамках проекта “XmaI-RRBS” (Reduced
Representation
Bisulfite
Sequencing
–
бисульфитное
секвенирование
ограниченных выборок геномных локусов, 2017 г.) был определен список
генов, показавших в исследовании дифференциальное метилирование в
группах чувствительных и нечувствительных к НАХТ опухолей трижды
негативного и LumB иммуногистохимических подтипов РМЖ [85]. Данные
гены были включены в проект РНФ (№ 18-15-00430); из них для
характеристики
метода
МЧ-кПЦР
были
выбраны
гены
PRKCB
(гипометилирован в опухолях трижды негативного подтипа с низкой
эффективностью НАХТ) и GMDS (гиперметилирован в опухолях трижды
негативного подтипа с низкой эффективностью НАХТ).
Алгоритм работы, согласно которому был составлен набор генов с
дальнейшим выбором локусов, удовлетворяющих условиям для проведения
многолокусной МЧ-кПЦР включает:
1. Выбор целевых районов, удовлетворяющих условиям для проведения
многолокусной МЧ-кПЦР.
2. Выбор эндогенных контролей.
45
3. Формирование набора параметров для подбора совместимых пар
праймеров.
4. Подбор совместимых пар праймеров и зондов для мультиплексной ПЦР.
2.4.1 Выбор целевых районов, удовлетворяющих условиям для
проведения многолокусной МЧ-кПЦР
Выбор целевых районов, удовлетворяющих условиям для МЧ-кПЦР,
проводили в геномном браузере USCS (genome.ucsc.edu). Поскольку подход,
основанный на МЧ-кПЦР, зависит от успешного гидролиза неметилированной
фракции ДНК, разработка тест-системы должна учитывать рестрикционную
карту целевой области. Пары праймеров должны быть подобраны так, чтобы
охватить
геномное
местоположение
выбранного
целевого
района,
содержащего несколько сайтов узнавания метилчувствительной рестриктазы.
Целевые районы должны отвечать следующим параметрам:
1. Содержать не менее 3 сайтов узнавания рестриктазы BstHHI.
2. Длина ПЦР-продукта 100-300 п.н. (что дает возможность определить
локус с не менее 3 сайтами узнавания BstHHI и в то же время
визуализировать продукты на электрофорезе).
3. Протяженность участков генома, фланкирующих целевой район, не
содержащих сайтов узнавания BstHHI – не менее 50 п.н. (что
увеличивает
вероятность
подбора
праймеров,
совместимых
в
мультиплексной ПЦР).
46
Рисунок 14. Изображение в геномном браузере UCSC, иллюстрирующее
дизайн МЧ-кПЦР для области гена GMDS, на примере расположения сайтов
узнавания метилчувствительной рестриктазы (BstHHI; черные квадраты)
внутри CpG-островка (темно-зеленая полоса). Голубым цветом обозначен
целевой район локуса GMDS_1 (69 п.н.). Сиреневым цветом обозначены
участки генома для подбора праймеров, фланкирующие целевой район (левый
участок – 222 п.н., правый участок – 183 п.н.; нет сайтов узнавания BstHHI).
Белым цветом обозначен захват области треков уровня метилирования
цитозина по конкретным динуклеотидам CpG в группах клеточных линий по
данным RRBS (DNA Methylation by Reduced Representation Bisulfite Seq from
ENCODE/HudsonAlpha):
красный
=
100%
секвенированных
молекул
метилированы; желтый = 50% секвенированных молекул метилированы,
зеленый
=
0%
секвенированных
молекул
метилированы.
(Регион
chr6:1,624,400-1,624,872).
2.4.2 Выбор эндогенных контролей
Разработанные коллективом требования к разработке многолокусной
тест-системы включают в себя:
1. Наличие положительного контроля (внутреннего) эффективности ПЦР
(для контроля наличия амплификации – участок генома, в котором нет
сайтов узнавания рестриктазы).
47
Рисунок 15. Изображение в геномном браузере UCSC, иллюстрирующее
дизайн МЧ-кПЦР для области локуса PC6 (контроль амплификации), не
содержащего участки узнавания рестриктазы, внутри CpG-островка (темнозеленая полоса). Голубым цветом обозначен целевой район локуса PC6 (2 п.н.).
Сиреневым цветом обозначены участки генома для подбора праймеров,
фланкирующие целевой район (левый участок – 180 п.н., правый участок – 180
п.н.; нет сайтов узнавания BstHHI). (Регион chr6_ssto_hap7:4,278,1174,278,679).
2. Распространённой ошибкой, которая влияет на количественную оценку
уровня
метилирования
ДНК,
является
неполный
гидролиз
неметилированной ДНК, что в дальнейшем приводит к недооценке доли
неметилированной ДНК [86]. Во избежание данной проблемы,
необходимо наличие в тест-системе контроля полноты гидролиза ДНК
рестриктазой (в целевом локусе есть 2 участка узнавания рестриктазы и
нет метилированных участков).
Рисунок 16. Изображение в геномном браузере UCSC, иллюстрирующее
дизайн МЧ-кПЦР для области локуса DC10_TMEM158 (контроль полноты
гидролиза) на примере расположения сайтов узнавания метилчувствительной
рестриктазы (BstHHI; черные квадраты) внутри CpG-островка (темно-зеленая
48
полоса). Голубым цветом обозначен целевой район локуса DC10_TMEM158
(15 п.н.). Сиреневым цветом обозначены участки генома для подбора
праймеров, фланкирующие целевой район (левый участок – 71 п.н., правый
участок – 51 п.н.). Регион chr3:45,267,117-45,267,253. Белым цветом обозначен
захват области треков уровня метилирования цитозина по конкретным
динуклеотидам CpG в группах клеточных линий по данным RRBS (DNA
Methylation
by
Reduced
Representation
Bisulfite
Seq
from
ENCODE/HudsonAlpha) – целевой район конститутивно не метилирован (что
обеспечивает эффективный гидролиз метилчувствительной рестриктазой).
По данным RRBS, в базе данных лаборатории имеется множество
районов контроля амплификации и контроля полноты гидролиза. Такое
многообразие обеспечивает возможность успешного подбора совместимых с
конкретным набором целевых районов.
2.4.3 Формирование набора параметров для подбора совместимых
пар праймеров
Для подбора пар праймеров и зондов, совместимых в мультиплексной
МЧ-кПЦР, формировали набор параметров, необходимых для работы
программы MPprimer:
1. Геномные координаты целевых районов.
2. Длина участков, фланкирующих целевой район.
3. Температура отжига праймеров и зондов.
4. Длина праймеров и зондов.
5. GС-состав праймеров и зондов.
49
Рисунок 17. Рабочая таблица с параметрами для подбора совместимых
пар праймеров.
В тест-системе подбор зондов разрабатывали таким образом, чтобы
олигонуклеотиды
были
короткие.
Такое
условие
необходимо
для
минимизации расстояния между репортером и квенчером, что должно
положительно сказаться уменьшением фоновой флуоресценции. Проблему
низкой температуры плавления коротких TaqMan-зондов решали за счет LNAмодификации 3-6 оснований в составе зондов. LNA (locked nucleic acid) –
рибонуклеотиды, которые позволяют сохранить короткую длину, и, в то же
время, повысить температуру плавления зонда. В LNA остатки рибозы
модифицированы дополнительной связью между кислородом в 2'-положении
и углеродом в 4'-положении сахара. Температуру отжига зонда при замене
нуклеотидов на LNA считали с помощью программы “LNA Oligo Tm
Prediction”. Сравнивали температуры до и после применения LNA (табл.7).
50
Рисунок 18. Структурная формула LNA (locked nucleic acid).
2.4.4 Подбор совместимых пар праймеров и зондов
Используя компьютерную программу MPprimer, подбирали возможные
совместимые
пары
праймеров
и
зондов
для
выбранных
локусов
получили
кластерные
деревья
(http://biocompute.bmi.ac.cn/MPprimer/).
В
результате
работы
MPprimer
совместимости различных вариантов пар праймеров с зондом для температур
в диапазоне от 50 до 74°С и длин праймеров от 16 до 24 п.н. Для каждого
варианта пары праймеров с зондом были получены нуклеотидные
последовательности.
51
Рисунок 19. Кластерное дерево (на примере условий t51-l21)
совместимости вариантов пар праймеров и контролей. В названии варианта
пары праймеров с зондом последний суффикс «<N>» означает номер варианта.
Область, выделенная красным цветом – наиболее эффективный вариант пар
праймеров с зондами и контролей PC6_0, DC10_TMEM158_0, GMDS_1_0,
PRKCB_2_0. Все локусы находятся на одном расстоянии друг от друга. Ось
«расстояние между вариантами совместимых пар праймеров и контролей»
отражает совместимость в одной реакции вариантов пар праймеров с зондами
и контрольных районов: 0 – низкая вероятность димеров праймеров или
нецелевых продуктов в ПЦР, 1 – ожидается образование димеров праймеров
или нецелевых продуктов в ПЦР.
52
2.5 Метилчувствительная многолокусная ПЦР в режиме
реального времени
Метод основан на способности метилчувствительных рестриктаз
гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований и
оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин.
С
целью
определения
уровня
метилирования
CpG-островков
промоторных областей генов, входящих в тест-систему, был осуществлен
подбор специфических праймеров и зондов для проведения многолокусной
МЧ-кПЦР (п.2.4), последовательности праймеров и зондов приведены в
таблице 6,7.
Материалы:
1. Набор реагентов GenPak® DNA PCR test (Изоген, Россия).
2. TaqMan-зонды («ДНК-синтез», Россия).
3. Праймеры («Синтол», Россия).
В качестве матрицы использовали ДНК из лимфоцитов периферической
крови, предварительно обработанную рестриктазой BstHHI. Для исключения
ложноположительных и ложноотрицательных результатов была разработана
многолокусная ПЦР для 4-х пар праймеров. В качестве контроля полноты
гидролиза геномной ДНК использовали конститутивно неметилированный
фрагмент
гена
TMEM158.
В
качестве
положительного
контроля
амплификации использовали участок генома (chr6_ssto_hap7:4,278,1174,278,679), не содержащий сайтов узнавания используемой рестриктазы. ПЦР
в режиме реального времени проводили в амплификаторе QuantStudio™ 5
Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, США). Условия ПЦР подбирали
53
опытным путём. ПЦР проводили в смеси согласно таблице 3. Программа ПЦР
представлена в таблице 4.
ROX использовали как референсный краситель – в результате
амплификации уровень его флуоресценции не изменяется. В конце каждого
цикла прибор измеряет сигнал и с репортерного красителя, и с референсного
красителя ROX, тем самым появляется возможность нормализовать сигнал
флуоресценции.
Согласно
определению
Rn
(нормализованный
флуоресцентный сигнал репортерного красителя) – отношение интенсивности
испускания флуоресценции репортерного красителя к интенсивности
испускания флуоресценции референсного красителя. В результате, если
изменяется сигнал флуоресценции ROX, то также изменятся и интенсивность
флуоресценции [87], что может влиять на значение Ct. Таким образом,
применение референсного красителя нормализует различные помехи в
процессе амплификации (неравномерное освещение, различия в объеме
реакции, прозрачности стенок пробирок и т.п.), что повышает точность
данных.
Таблица 3.
Состав смеси ПЦР
PCR-diluent (Изоген)
Праймеры (12 пмоль)
PC6_0 f+r
DC_TMEM158 f+r
PRKCB_2 f+r
GMDS_1 f+r
TaqMan-зонды (10 пмоль)
PC6_0
DC_TMEM158
PRKC_2
GMDS_1
Объем в одну реакцию, мкл
10
0,3
0,3
0,3
0,3
0,25
0,25
0,25
0,25
54
Деионизованная вода
ДНК
Итоговый объем
6,8
1
20
Таблица 4.
Программа ПЦР
Длительность, сек
Первичная денатурация 300
Денатурация
30
Отжиг, совмещенный с 120
элонгацией
50 циклов
Температура, °C
95
95
58
Таблица 5.
Последовательности праймеров тест-системы для МЧ-кПЦР
Название
локуса
PC6
DC_TMEM
158
PRKCB_2
GMDS_1
Нуклеотидная последовательность
(5’→3’)
F:TAGAGGAAGTCGTAGAGGTGT
R: TCATTGTGTCTTGACAACCG
F: CCCCAGGTGCTCGATG
R: CGACCTACTGCTCTTCTCC
F: TCAAGAACCACAAATTCACCG
R: ACTGTCCATCCGGGAGT
F: CAGCTCCCCTCACTTCTC
R: TCGCTTTCGATGTGAGTATCT
Длина
продукта
ПЦР,
п.н.
244
97
240
148
Расчётная
темп-ра
отжига,
tºC
58.86
58.08
58.13
58.45
58.83
58.39
58.12
58.12
Кол-во
сайтов
узнавания
BstHHI
0
2
6
3
55
Таблица 6.
Последовательность зондов тест-системы для МЧ-кПЦР с репортерами
и квенчерами флуоресценции, где phos – фосфат
Название
локуса
PC6
DC_TMEM158
PRKCB_2
GMDS_1
Последовательность зонда
(5’→3’)
CGGCAC(T-BHQ2)AGCAGAGACCA-phos
CGAAGAAAGCGCGGCCG(T-BHQ1)-phos
CTTCATC(T-BHQ2)GGTGAGCG-phos
CCCGACCCTGAGAG(C-BHQ3)
Флуоресцентный
краситель
Cy5.5
FAM
HEX
Cy5
Расчётная
темп-ра
отжига, tºC
64
69
58
62
Таблица 7.
Последовательность и температура отжига зондов до и после
применения LNA с помощью программы «LNA Oligo Tm Prediction», где
(+N) – LNA-модифицированный нуклеотид
Последовательность зонда
Локус
Температура
отжига, ºC
до
после
LNALNAмодифи модифи-кации
кации
До LNA-модификации
После LNA-модификации
PC6
CGGCACTAGCAGAGACCA
CGG+CACTAG+CAGAGACCA
64
70
DC_TM
EM158
СGAAGAAAGCGCGGCCGT
CGAAGA+AAGCGCGGCCGT
69
70
PRKCB_
CTTCATCTGGTGAGCG
2
CTT+CA+TCT+GGT+GAGCG
58
70
GMDS
CCCG+ACCC+TGAG+AGC
62
70
CCCGACCCTGAGAGC
56
2.5.1 Определение уровня метилирования по данным МЧ-кПЦР
Для определения уровня метилирования для каждого гена были
получены значения ΔΔCy0 value и на основе этого посчитан уровень
метилирования.
Значение Cy0 показывает точку пересечения между осью x (количество
циклов) и касательной, пересекающей точку перегиба кривой флуоресценции
ПЦР в реальном времени (рис.20).
Существует усовершенствованный подход метода ΔΔCy0, который
учитывает кинетические параметры кривой амплификации и не зависит от
изменения эффективности ПЦР (в отличие от методов Ct и Cp) [88]. В данном
подходе касательные, рассчитанные на основе различной эффективности
ПЦР, имеют тенденцию пересекаться в общей точке около оси x, что приводит
к небольшим изменениям в значениях Cy0.
Показано, что различная эффективность реакции, полученная за счет
уменьшения количества реакционной смеси (E = 88,8% при 100%
амплификационной смеси; E = 84,4% при 60% амплификационной смеси, где
E – эффективность ПЦР), может привести к ошибке 400% в количественной
оценке, основанной на сравнительном методе Ct. Метод Ct неадекватно
оценивает образцы с разной амплификационной смесью из-за сдвига вправо, в
сравнении с методом Cy0 (CV Ct = 39,7% при RE = -0,318%, CV Cy0 = 22,52%
при RE = -0,128%, где CV – коэффициент вариации, RE – относительная
ошибка). При количестве амплификационной смеси 90-100% методы Cp и Cy0
эквивалентны, но при уменьшении эффективности точность Cy0 была более
стабильной, чем точность Cp в диапазоне концентраций от 3,14×107 до
3,14×105 молекул (CV Cp = 21,8% при RE = -0,184%). Аналогичная ситуация
наблюдается при добавлении в амплификационную смесь ингибитора (IgG):
при высоких концентрациях IgG метод Cy0 показал лучшие результаты, по
57
сравнению с методами Ct и Cp (CV Cy0 = 4,33% при RE = 4,98%, CV Ct =
25,62% при RE = -25,37%, CV Cp = 10,66% при RE = -9,02%) [89].
Рисунок
20.
Пример
ПЦР
в
режиме
реального
времени,
иллюстрирующий точку пересечения (Х) между осью x и касательной,
пересекающей точку перегиба кривой флуоресценции ПЦР в реальном
времени (значение Cy0).
Для того, чтобы определить значение ΔΔCy0, находили значение ΔCy0
экспериментальное (ΔCyE) и контрольное (ΔCyС) для референсного гена,
затем находили разницу между этими двумя значениями. В качестве
референсного гена выступал контроль амплификации PC:
1. ΔCy0 value experimental (ΔCyE) = Cy0 для локуса PC в лунке Me+ х
– Cy0 для таргета в лунке Me+х, где Me+х - модельный уровень метилирования.
2. ΔCy0 value control (ΔCyС) = Cy0 для локуса PC в лунке 100% Me+
– Cy0 для таргета в лунке 100% Me+.
3. ΔΔCy0 value = ΔCyE – ΔCyC.
Уровень метилирования определяли, согласно формуле:
58
Уровень метилирования = EΔΔCy0 100%
, где E – эффективность ПЦР.
2.6 Флуоресцентные красители, используемые в методе
Флуоресцентные красители, детектируемые прибором QuantStudio™ 5
Real-Time PCR,
представлены в табл.8.
Для
уменьшения
фоновой
флуоресценции в многолокусной тест-системе использовали тушители
флуоресценции Black Hole Quenchers (Biosearch).
При сближении флуоресцентной метки с тушителем (квенчером),
эффективность гашения флуоресценции возрастает (уровень фоновой
флуоресценции
снижается),
поэтому использовали
подбор зондов с
тушителем на внутреннем тимине TaqMan-зонда. Для эффективного гашения
флуоресценции спектр поглощения гасителя должен перекрывать спектр
флуоресценции флуорофора.
Таблица 8.
Флуорофоры и тушители, используемые для TaqMan-зондов МЧ-кПЦР
Флуорофор
FAM
HEX
Cy5
Cy5.5
λмакс.
поглощения
флуорофора,
нм
470 ± 15
520 ± 10
640 ± 10
662 ± 10
λмакс.
Флуоресценции
флуорофора, нм
520 ± 15
558 ± 12
682 ± 14
711 ± 12
Совместимый
тушитель
флуоресценции
λмакс.
поглощения
тушителя, нм
Диапазон
гашения
тушителя,
нм
BHQ-1
BHQ-2
BHQ-3
BHQ-2
535
575
670
575
480-580
550-650
620-730
550-650
Программное обеспечение прибора QuantStudio™ 5 Real-Time PCR
использует калибровки флуоресцентных красителей, чтобы вычислять
индивидуальный вклад каждого красителя в общий сигнал флуоресценции,
59
собираемый прибором для каждой комбинации светофильтров возбуждения и
эмиссии.
Перед проведением спектральной калибровки красителей, провели
оценку фонового свечения – калибровки фона (Background Calibration) для
проверки прибора на контаминацию (рис.21).
Рисунок 21. Фоновая калибровка (Background) прибора QuantStudio™ 5
Real-Time PCR для успешного проведения МЧ-кПЦР.
Так как в разработанной тест-системе используется многолокусный
формат проведения реакции с зондами с различными флуорофорами,
необходим алгоритм учета взаимного влияния спектров флуорофоров и
фоновых
сигналов.
Вследствие
этого
была
проведена
спектральная
калибровка по результатам однолокусных реакций в условиях, аналогичных
многолокусной ПЦР (рис. 22, 23, 24, 25). В лунки 96-луночного планшета
загружали реакционные смеси с праймерами и зондами для однолокусных
реакций и проводили термоциклирование с регистрацией флуоресценции в
реальном времени.
60
Для анализа многолокусной тест-системы в режиме реального времени
был
применен
флуоресценции,
собственный
снимаемых
алгоритм
детектором
анализа
прибора,
сырых
что
сигналов
обусловлено
недостаточно адекватного вычленения сигналов отдельных флуорофоров
программным обеспечением производителя прибора, что приводит к росту
или падению сигналов флуорофоров, не используемых в реакциях.
Рисунок 22. Пример данных реакции однолокусной ПЦР в режиме
реального времени в формате мультикомпонетной визуализации (локус PC6)
с применением калибровочных спектров флуоресценции, представленных
программным обеспечением прибора QuantStudio™ 5 Real-Time PCR, что
привело к наблюдению изменений сигнала флуоресценции красителя FAM
(локус DC_TMEM158), не используемого в реакции.
61
Рисунок 23. Пример данных реакции однолокусной ПЦР в режиме
реального времени в формате мультикомпонетной визуализации (локус PC6)
с применением
калибровочных спектров флуоресценции,
снимаемых
детектором прибора.
Сырые данные спектров флуоресцентного красителя по всем доступным
комбинациям светофильтров (21 комбинация для используемого прибора
QuantStudio 5 Real-Time PCR System) применяли для извлечения мажорной
комбинации светофильтров, что необходимо для решения двух задач:
1. Коррекция фонового сигнала – для мажорной кинетической кривой
определяется участок фона, и конечный участка фона служит для
отсчета нулевого (фонового) значения флуоресценции конкретного
зонда.
2. Определение результирующего спектра – по кинетической кривой,
снятой в мажорной комбинации светофильтров, определяли место
(номер цикла) наискорейшего роста по максимуму первой производной
кривой, и в точке наискорейшего роста забирали спектр по всем
комбинациям светофильтров. Из него вычитали спектр в цикле,
соответствующем конечному участку фона. Результирующий спектр
62
считали
приближенным
к
свойствам
сигнала
флуорофора,
высвобождаемого в процессе полимеразной реакции.
Впоследствии к данным экспериментальных лунок применяли спектры
конкретных
зондов,
извлеченные
из
однолокусных
реакций,
для
деконволюции сигнала в каждом цикле на профили зондов решением
системы линейных уравнений.
В результате такая калибровка обеспечивает адекватное вычисление
индивидуального вклада каждого красителя в общий сигнал флуоресценции.
Рисунок 24. Спектральный профиль флуоресцентного красителя FAM в
однолокусной ПЦР.
63
Рисунок 25. Спектральный профиль флуоресцентного красителя HEX в
однолокусной ПЦР.
Рисунок 26. Спектральный профиль флуоресцентного красителя Cy5 в
однолокусной ПЦР.
64
Рисунок 27. Спектральный профиль флуоресцентного красителя Cy5.5 в
однолокусной ПЦР.
Описанная база данных включена в лабораторную информационную
систему для анализа результатов МЧ-кПЦР, к которой разработали REST API
(representational state transfer application programming interface), позволяющий
получить кривые по запросу из скрипта R для запрашиваемого образца, а
также кривые для референсного локуса, после чего проходом по всем
комбинациям образцов и зондов формируется таблица с результатами анализа
(уровни метилирования исследуемых маркеров) с заданной эффективностью
ПЦР.
2.7 Электрофорез в полиакриламидном геле
В программе SimGel визуализировали модель гель-электрофореза для 4
локусов, входящих в тест-систему для определения уровня метилирования
ДНК (рис. 28).
65
Рисунок
Дорожка
1
28.
–
Компьютерная
маркер
симуляция
молекулярного
гель-электрофореза.
веса
pUC19/MspI.
Дорожка 2 – 4 локуса в модельной тест-системе: PC6, PRKCB_2, GMDS_1,
DC10_TMEM158. https://tools.epigenetic.ru/SimGel/.
Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 8% полиакриламидном геле
(ПААГ) в течение 1-2 часов.
Растворы и реактивы:
1. 10х буфер TBE (89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота,
2 мМ ЭДТА).
2. 10% раствор персульфата аммония (APS).
66
3. 30% раствор АА:bisAA (29:1).
4. Буфер
для
нанесения
образца
в
гель
(ксиленцианол,
бромфеноловый синий, глицерин).
Таблица 9.
Состав 8% ПААГ
Реактив
Дистиллированная вода
30% раствор АА:bisAA
10x буфер TBE
ТЕМЕД (TEMED)
10% APS (персульфат аммония)
Итоговый объем
Объем в одну реакцию
25,5 мл
7,25 мл
1,7 мл
28 мкл
685 мкл
35,163 мл
Электрофорез проводили в буфере ТВЕ. Пробы для нанесения в ПААГ
готовили следующим образом: 6 мкл исследуемого ПЦР-продукта смешивали
с 1 мкл буфера для нанесения с красителем, по которому осуществляли
визуальный контроль пробега проб.
2.8 Окрашивание геля нитратом серебра
ДНК визуализировали окрашиванием геля в нитрате серебра: гель
инкубировали в 0,011 М растворе нитрата серебра 15-20 минут, дважды
промывали дистиллированной водой и проявляли в растворе 0,75 М NaOH,
0,5 M формалина 10-15 минут в зависимости от интенсивности окрашивания.
Маркером молекулярного веса служили фрагменты плазмиды pUC19,
полученные
в
результате
ее
обработки
рестриктазой
MspI.
Для
документирования полученных результатов, гель фотографировали.
67
2.9 Моделирование уровня метилирования ДНК для оценки
аналитических свойств метода МЧ-кПЦР
Для определения аналитических свойств метода МЧ-кПЦР, считали, что
ДНК, не обработанная метилчувствительной рестриктазой BstHHI, является
модельной метилированной матрицей (Me+, не гидролизованная) в то время,
как гидролизованная ДНК – модельной неметилированной матрицей (Me-).
Включая во внимание состав SE-буфера Y, гидролиз матрицы осуществляли
совместно с параллельной реакцией mock-гидролиза.
Таблица 10.
Состав реакционной смеси для проведения гидролиза
Состав смеси для
Состав смеси для mock- Объем
гидролиза
гидролиза
BstHHI
SE-буфер для хранения и 3,5 мкл
в
одну
реакцию, мкл
разбавления ферментов
SE-буфер Y 10х
SE-буфер Y 10х
3,5 мкл
Образец ДНК
28 мкл (350 нг)
28 мкл (350 нг)
Итоговый объем 35 мкл
Во
избежание
остаточной
ферментативной
активности
после
проведения гидролиза пробы инактивировали путем инкубации модельной
ДНК 60 мин при 95 ºC.
Гидролизованную и негидролизованную ДНК смешивали в заданных
соотношениях,
чтобы
смоделировать
соответствующий
уровень
метилирования.
68
Далее,
проводили
МЧ-кПЦР
в
режиме
реального
времени
с
разработанной ранее многолокусной тест-системой.
Таблица 11.
Соотношения разведений модельной метилированной (Me+) и
модельной неметилированной (Me-) матрицы для моделирования заданного
уровня метилирования ДНК в образце
Моделируемый уровень
метилирования, %
Me-, мкл
Me+, мкл
0
10
0
1
9,9
0,1
2,5
9,75
0,25
5
9,5
0,5
10
9
1
25
7,5
2,5
50
5
5
75
2,5
7,5
90
1
9
100
0
10
69
2.10 Определение аналитической чувствительности метода МЧкПЦР
Аналитическая
чувствительность
метода
МЧ-кПЦР
(предел
обнаружения анализа) – минимальный уровень метилирования, который
сможет обнаружить метод и отличить от фонового шума.
Для определения аналитической чувствительности метода определяли
значения LoB и LoD [90]:
1.
LoB (Limit of Blank) – наивысшая концентрация аналита (по
данным измерений исследуемым методом), которую можно ожидать при
тестировании образца, не содержащего аналита.
LoB = meanblank + 1,645 x SDblank
, где meanblank – среднее наблюдаемое значение, SDblank – стандартное
отклонение образца, не содержащего аналит.
2.
LoD (Limit of Detection) – самая низкая концентрация аналита,
которую можно надежно отличить от LoB и при которой возможно
тестирование образца, содержащего аналит.
LoD = LoB + 1,645 x SDlow concentration sample
, где SD low concentration sample – стандартное отклонение образца с самой
низкой концентрацией аналита, которую можно отличить от концентрации
образца, не содержащего аналит.
Определение LoD через величину LoB необходимо для понимания,
какая концентрация аналита необходима, чтобы отличить образец без аналита
и образец с минимальной концентрацией аналита (гарантия того, что LoD >
LoB). Допускается содержание не менее 95% измерений, имеющих
70
измеренную концентрацию LoD выше, чем значение LoB. За образец без
аналита принимали образец с модельным уровнем метилирования 0% (Me+ матрица), за образец, содержащий самую низкую концентрацию аналита
принимали образец с модельным уровнем метилирования 1%.
2.11 Определение относительной погрешности метода МЧ-кПЦР
Относительную погрешность метода МЧ-кПЦР измеряли в соответствие
с рекомендациями по определению погрешности измерений:
1. Вычисляли среднее арифметическое из 16 измерений по формуле:
〈x〉 =
1
∑ xi
n
, где n – количество измерений в эксперименте, xi – результат i-го
измерения.
2.
Определяли
среднеквадратичную
погрешность
среднего
арифметического по формуле:
S = √∑
(⟨x⟩ − xi)2
n(n − 1)
3. Находили полуширину доверительного интервала (абсолютную
погрешность результата измерений) по формуле:
2
∆x = √∆xсл
, где ∆xсл = 𝑡𝛼,𝑛S (𝑡𝛼,𝑛 - коэффициент Стьюдента)
4. Оценивали относительную погрешность результата измерений,
согласно формуле:
71
𝛿=
∆x
⟨𝑥⟩
100%.
2.12 Программное обеспечение
Анализ геномных последовательностей (выбор целевых районов,
наличие полиморфизмов и визуальное сопоставление позиций CpGдинуклеотидов) проводили в геномном браузере UCSC Genome Browser.
Подбор
праймеров
и
TaqMan-зондов
проводили
с
помощью
программного обеспечения MPprimer. Специфичность и образование димеров
оценивали с помощью MFEprimer, PrimerBlast, PriDimerCheck.
Температуру плавления TaqMan-зондов с применением LNA оценивали
с помощью программы LNA Oligo Tm Prediction (QIAGEN).
Компьютерную симуляцию гель-электрофореза проводили в программе
SimGel.
2.13 Методы статистического анализа
Коэффициент детерминации R2 использовали для оценки доли
дисперсии зависимой переменной, объясняемой рассматриваемой моделью
зависимости. Стандартные отклонения использовали в качестве метрики
оценки
погрешности
[91]
измеренного
уровня
метилирования.
Для
кинетических кривых исследуемых локусов во всех образцах получены
значения Cy0 с помощью пакета qPCR языка программирования R и на основе
этих данных рассчитаны значения ΔΔCy0, уровни метилирования, и
построены
диаграммы
размаха
(бокс-плоты).
Аналитическую
чувствительность метода определяли путем нахождения значений Limit of
Blank (LoB) и Limit of Detection (LoD) [90].
72
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Осуществление
МЧ-кПЦР
предполагает,
кроме
использования
комплектов праймеров, также, соответствующих целевым участкам генома
TaqMan-зондов.
В
многолокусных
ПЦР
значительно
повышается
вероятность
образования димеров олигонуклеотидов, что отрицательно сказывается на
эффективности и специфичности амплификации. Следовательно, важным
этапом является оптимизация условий ПЦР.
3.1 Оптимизация лабораторного протокола
Для
успешного
проведения
многолокусной
МЧ-кПЦР
была
осуществлена проверка совместимости всех локусов в одной реакции методом
ПЦР с последующей детекцией ампликонов методом электрофореза в 8%
полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием нитратом серебра,
обеспечивающим
более высокую чувствительность
по сравнению с
интеркалирующими красителями. Несмотря на то, что при разрабротке тестсистемы контролировали специфичность и образование димеров с помощью
различного программного обеспечения, необходимым этапом являлась
дополнительная
проверка
специфичности
реакции,
и
последующая
оптимизация температуры отжига и концентрации праймеров.
1. Подобрана универсальная температура отжига праймеров, при
которой наблюдалось наибольшее количество целевых продуктов и
отсутствие неспецифических продуктов реакции при постановке
ПЦР с последующей детекцией в 8% полиакриламидном геле
(рис.29); подобрана универсальная температура отжига праймеров,
при которой наблюдался благоприятный рост кривой амплификации
продуктов ПЦР и наиболее ранние значения порогового цикла
73
реакции Ct (threshold cycle), которые показывают точки пересечения
графика накопления ДНК и пороговой линии (threshold line).
2. Оптимальное количество каждого праймера, при котором удалось
добиться успешного проведения ПЦР в формате многолокусной тест
– системы – 12 пмоль.
Рисунок 29. Гель-электрофорез: 4 локуса в многолокусной тест-системе:
PC6,
PRKCB_2,
GMDS_1,
DC_TMEM158.
Дорожка
1
–
маркер
молекулярного
веса
pUC19/MspI,
дорожка 2 – результат многолокусной ПЦР при температуре 67 °C,
дорожка 3 – результат многолокусной ПЦР при температуре 65,3 °C,
дорожка 4 – результат многолокусной ПЦР при температуре 62,8 °C,
дорожка 5 – результат многолокусной ПЦР при температуре 59,5 °C,
дорожка 6 – результат многолокусной ПЦР при температуре 57,2 °C,
дорожка 7 – результат многолокусной ПЦР при температуре 55,3 °C.
74
Реакцию ПЦР проводили с использованием коммерческого набора реагентов
«Isogene», GenPak® DNA PCR test, Россия (рис. 30, 31, 32, 33, 34). Было
принято решение изменить программу ПЦР, увеличив время отжига
праймеров до 2 минут с целью повышения специфичности ПЦР [92].
Концентрация и температура отжига праймеров были подобраны опытным
путем.
Далее провели однолокусные ПЦР с праймерами всех локусов по
отдельности
с
образцов
ДНК:
обработанного
метилчувствительной
рестриктазой (D) и необработанного (ND):
Рисунок 30. Результат МЧ-кПЦР. Локус PC6 (Cy5.5). ND – образец до
гидролиза эндонуклеазой BstHHI, D - образец после гидролиза эндонуклеазой
BstHHI.
75
Рисунок 31. Результат МЧ-кПЦР. Локус DC10_TMEM158 (FAM). ND –
образец до гидролиза эндонуклеазой BstHHI, D - образец после гидролиза
эндонуклеазой BstHHI.
76
Рисунок 32. Результат МЧ-кПЦР. Локус PRKCB_2 (HEX). ND – образец
до гидролиза эндонуклеазой BstHHI, D - образец после гидролиза
эндонуклеазой BstHHI.
77
Рисунок 33. Результат МЧ-кПЦР. Локус GMDS_1 (Cy5). ND – образец
до гидролиза эндонуклеазой BstHHI, D - образец после гидролиза
эндонуклеазой BstHHI.
По результатам однолокусных МЧ-кПЦР была доказана эффективность
внутренних
контролей
тест-системы:
после
обработки
ДНК
метилчувствительной рестриктазой BstHHI детектируется ПЦР – продукт
внутреннего контроля амплификации (PC, positive control) и не детектируется
ПЦР-продукт контроля полноты гидролиза (DC, digestion control), что
свидетельствует о надежности амплификации и гидролиза ДНК в тестсистеме. Детектирование амплификации ПЦР-продукта целевого района
GMDS_1 после обработки ДНК метилчувствительной рестриктазой BstHHI
указывает на метилирование данного локуса.
78
Рисунок 34.
Результат многолокусной МЧ-кПЦР до гидролиза
эндонуклеазой BstHHI (сплошные линии). Пунктирные линии – после
гидролиза эндонуклеазой BstHHI. Представлены локусы PC6 (Cy5.5,
фиолетовый), DC10_TMEM158_ (FAM, синий), PRKCB_2 (HEX, горчичный),
GMDS_1 (Cy5, бирюзовый).
По результатам многолокусной МЧ-кПЦР доказана совместимость
локусов в одной реакции, эффективность внутренних контролей тест-системы,
произведен расчет уровня метилирования и эффективности ПЦР для каждого
локуса.
Методом последовательных кратных разведений образца (от 50 нг/мкл)
была определена эффективность ПЦР для каждого локуса (табл. 14) и
оптимальное количество ДНК (10 нг).
79
Таблица 12.
Зависимость значения порогового цикла (Cy0) от исходной
концентрации матриц (LogN0) каждого локуса тест-системы
1,4
1,1
0,79
0,49
26,39 27,46
28,48
29,64 30,75
DC10_TMEM158
27,74 28,74
29,91
30,4
PRKCB_2
28,33 29,39
30,56
31,19 32,47
GMDS_1
26,27 27,39
28,36
29,46
31,86
Cy0
PC6
LogN0
1,7
30,7
3.2 Эффективность ПЦР
Эффективность ПЦР для каждого локуса тест-системы определили
посредством уравнения прямой, описывающей зависимость порогового цикла
кинетической кривой от логарифма концентрации ДНК в образце (рис.35).
Общее уравнение прямой:
y = −ax + b.
80
33
32
31
Ct
30
29
28
27
26
25
0.4
0.6
0.8
PRKCB_2
1
LogN0
1.2
DC10_TMEM158
y = -3,3306x + 34,039
R² = 0,9911
y = -3,266x + 33,309
R² = 0,9834
1.4
GMDS_1
y = -3,6084x + 32,393
R² = 0,9984
1.6
1.8
PC6
y = -3,5946x + 32,487
R² = 0,9997
Рисунок 35. График зависимости порогового цикла (Cy0) от исходной
концентрации матриц (LogN0) для каждого локуса тест-системы. Пунктирной
линией обозначена линия тренда. В квадратах указано уравнение прямой и
достоверность аппроксимации (R2).
Выражение, описывающее эффективность ПЦР для каждого локуса:
E = 101/a.
Таблица 13.
Эффективность ПЦР для каждого локуса тест-системы
Локус
Эффективность ПЦР
PC6
1,883 (94,15%)
DC_TMEM158
1,947 (97,35%)
PRKCB_2
1,95 (97,5%)
GMDS_1
1,882 (94,1%)
81
3.3 Уровень метилирования по данным МЧ-кПЦР
Для оценки аналитических характеристик метода воспользовались
моделированием уровня метилирования. Результаты многолокусных ПЦР
приведены на рис. 36-39.
Рисунок 36. Результат проведения многолокусной ПЦР при модельном
уровне метилирования 0%. Представлены локусы PC6 (Cy5.5, фиолетовый),
DC10_TMEM158_ (FAM, синий), PRKCB_2 (HEX, горчичный), GMDS_1
(Cy5, бирюзовый).
82
Рисунок 37. Результат проведения многолокусной ПЦР при модельном
уровне метилирования 50%. Представлены локусы PC6 (Cy5.5, фиолетовый),
DC10_TMEM158_ (FAM, синий), PRKCB_2 (HEX, горчичный), GMDS_1
(Cy5, бирюзовый).
83
Рисунок 38. Результат проведения многолокусной ПЦР при модельном
уровне метилирования 100%. Представлены локусы PC6 (Cy5.5, фиолетовый),
DC10_TMEM158_ (FAM, синий), PRKCB_2 (HEX, горчичный), GMDS_1
(Cy5, бирюзовый).
Таблица 14.
Средние значения ΔCy0 для локуса GMDS_1, для которого
смоделированный уровень метилирования равен 90%
ΔCy0
(experimental)
ΔCy0
(control)
ΔΔCy0
Expression
Fold Change
ΔCyE
ΔCyС
ΔΔCy0
EΔΔCy0
0,326
0,438
-0,112
0,93
, где E – эффективность ПЦР для локуса GMDS_1 (94,1%).
По данным многолокусной МЧ-кПЦР получены средние значения
измеренного уровня метилирования для каждого локуса (табл.15). В качестве
референсного гена выступал контроль амплификации PC6.
84
Таблица 15.
Средние значения измеренного уровня метилирования для каждого
локуса по данным 16 повторностей
Модельный
уровень
Измеренный уровень метилирования, %
метилирования
,%
DC10_TMEM158
PRKCB_2
GMDS_1
0
7,27
0,78
71,1
1
8,39
1,68
54,08
2,5
10,95
3,03
60,86
5
13,44
3,29
71,2
10
21,26
8,79
68,16
25
36,5
24,4
73,85
50
70,86
53,81
87,52
75
87,44
74,02
93,85
90
92,23
87,4
97,18
100
100,46
101,07
100,39
По полученным значениям уровней метилирования построили диаграммы
размаха (бокс-плоты) для каждого локуса тест-системы (рис. 39, 40, 41).
85
Рисунок 39. Диаграмма размаха для локуса DC10_TMEM158. По оси
ординат – уровни метилирования, детектированные в реакциях, от 0 до 100.
По оси абсцисс - моделируемый уровень метилирования, от 0% (модель
полностью неметилированного образца) до 100% (модель полностью
метилированного образца).
86
Рисунок 40. Диаграмма размаха для локуса PRKCB_2. По оси ординат –
уровни метилирования, детектированные в реакциях, от 0 до 100. По оси
абсцисс - моделируемый уровень метилирования, от 0% (модель полностью
неметилированного образца) до 100% (модель полностью метилированного
образца).
87
Рисунок 41. Диаграмма размаха для локуса GMDS_1. По оси ординат –
уровни метилирования, детектированные в реакциях, от 0 до 100. По оси
абсцисс - моделируемый уровень метилирования, от 0% (модель полностью
неметилированного образца) до 100% (модель полностью метилированного
образца).
88
Таблица 16.
Статические характеристики локусов DC10_TMEM158 и PRKCB_2
после проведения МЧ-кПЦР
Локус
DC_TMEM158 PRKCB_2
Коэффициент
детерминации (R2)
0,95
0,98
6,01
4,69
Стандартное
отклонение
метилирования (SD),
%
Для локуса PRKCB_2 модельный уровень метилирования прямо
коррелирует с уровнем метилирования, определенным c использованием
метода ΔΔCy0. Локус DC10_TMEM158 имеет недостаточное количество
сайтов узнавания рестриктазы, в связи с чем, коллективом лаборатории было
принято решение об использовании в дальнейших исследованиях контролей
полноты гидролиза с как минимум 3 сайтами узнавания рестриктазы.
Для локуса GMDS_1 для образцов, в которых присутствует только
гидролизованная матрица (Me-), значение измеренного уровня метилирования
близко к 50%, для образцов в которых гидролизованная (Me-) и
негидролизованная (Me+) матрицы представлены в равных соотношениях,
значение измеренного уровня метилирования близко к 75%. Наблюдаемый
феномен наилучшим способом можно объяснить наличием моноаллельного
метилирования исследуемого локуса GMDS_1 в ДНК из клеток крови
здоровых
доноров.
Это
предположение
подтверждается
по
данным
полногеномного бисульфитного секвенирования в одном из двух образцов Bклеток крови в базе данных NgsMethDB [93] (рис. 42) в первом и третьем
89
сайтах узнавания рестриктазы BstHHI, по второму сайту данных нет, по
другому образцу также отсутствуют данные об уровне метилирования в
позициях CpG-динуклеотидов в составе всех трех сайтов узнавания
рестриктазы BstHHI.
Рисунок 42. Данные полногеномного бисульфитного секвенирования по
данным базы данных NgsMethDB в геномном браузере UCSC Genome Browser.
В треках показаны координаты по хромосоме 6, наличие CpG-островка в
исследуемом районе (зеленым), структура ампликона (черным – районы
праймеров), положение сайтов узнавания метилчувствительной рестриктазы
BstHHI,
уровень
метилирования
CpG-динуклеотидов
по
данным
полногеномного бисульфитного секвенирования в двух образцах, участок
экзон-интронной структуры гена GMDS.
3.4 Аналитическая чувствительность
метода МЧ-кПЦР
По расчетным данным, аналитическая чувствительность метода
многолокусной МЧ-кПЦР составила 10%. У 100% образцов с модельным
уровнем метилирования 10%, измеряемое значение уровня метилирования
выше значения LoB (1,041%).
90
3.5. Относительная погрешность метода МЧ-кПЦР
По данным МЧ-кПЦР, где n = 16 измерений, относительная погрешность
метода составила 11,38%.
91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Метилирование ДНК – обратимая ковалентная эпигенетическая
модификация, которая присоединяет метильную группу к цитозиновому
остатку в CpG-динуклеотиде в позиции N5 пиримидинового кольца.
Метилирование
ДНК,
наряду
с
модификацией
гистонов
и
РНК-
интерференцией, является краеугольным эпигенетическим механизмом
регуляции экспрессии генов. Заболевания,
связанные с аномальным
метилированием ДНК, включают в себя группу болезней импринтинга
(синдром Прадера-Вилли и синдром Ангельмана, синдром ВидеманнаБеквита, синдром Сильвера-Рассела, синдром Мартина-Белл и др.), в основе
которых лежит изменение регуляции экспрессии гомологичных генов в
процессе развития организма в зависимости от родительского происхождения
гена,
хромосомы
или
генома.
Также,
аномальное
метилирование
(гипометилирование) играет важную роль в канцерогенезе и является одним
из маркеров, имеющих как прогностическое, так и предиктивное значение.
В связи с этим, разработка новых методов анализа метилирования ДНК
приобретает всё большую популярность, что доказывает прирост публикаций,
связанных с изучением механизмов метилирования и сравнительной
характеристикой методов исследования метилирования ДНК. Качественные
методы (метилспецифическая и метилчувствительная ПЦР, комбинированный
бисульфитный рестрикционный анализ) дают информацию о статусе
метилирования ДНК, напротив, количественные методы (бисульфитное
секвенирование и пиросеквенирование, цифровая капельная ПЦР, Epityper и
др.) являются инструментом для определения уровня метилирования.
Большинство доступных инструментов объединяют несколько вариантов
методологических
подходов,
ярким
примером
чего
является
комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ (COBRA).
92
Для определения аналитических свойств МЧ-кПЦР был составлен набор
генов с дальнейшим выбором локусов, удовлетворяющих условиям для
проведения многолокусной МЧ-кПЦР и адаптирован лабораторный протокол.
Ограничения метода были сведены к минимуму путем использования
внутренних контролей полноты гидролиза и амплификации.
В ходе исследования была определена эффективность ПЦР для каждого
локуса тест-системы, которая варьирует в диапазоне 1,88 – 1,95.
С целью возможности оценки предсказательной способности метода
было произведено моделирование уровня метилирования, где полностью не
гидролизованная матрица выступала в качестве модельной метилированной
(Me+), а гидролизованная матрица – модельной неметилированной (Me-). Для
определения уровня метилирования по данным МЧ-кПЦР использовали метод
на основе ΔΔCy0. Применение референсного красителя ROX помогло
надежнее определять участок фона для расчета пороговых циклов. Было
выявлено, что для локуса PRKCB_2 модельный уровень метилирования прямо
коррелирует с измеренным уровнем метилирования; локусы GMDS_1 и
DC10_TMEM158 не анализировали для определения уровня метилирования,
так как локус GMDS_1 моноаллельно метилирован в крови, локус
DC10_TMEM158
рестриктазы.
имеет
недостаточное
Коллективом
лаборатории
количество
было
сайтов
принято
узнавания
решение
об
использовании в дальнейших исследованиях контролей полноты гидролиза с
как минимум 3 сайтами узнавания.
По расчетным данным были определены аналитические свойства
метода МЧ-кПЦР:
1. Аналитическая чувствительность метода составила 10%.
2. Относительная погрешность метода составила 11,38%.
Исходя из полученных результатов, аналитическая чувствительность метода
МЧ-кПЦР выше таковой метода прямого бисульфитного секвенирования по
93
Сэнгеру, но уступает таким методам, как Epytiper, MS-HRM, бисульфитное
пиросеквенирование. В отличие от методов, основанных на бисульфитной
конверсии, пробоподготовка МЧ-кПЦР не приводит к деградации ДНК.
Применение
TaqMan-зондов
позволяет
мультиплексировать
несколько
целевых локусов в одной реакции, что является успешным решением
проблемы малого количества биологического материала, позволяя увеличить
количество технических повторов, а, следовательно, точность анализа, и
может быть использован для определения уровня метилирования панелей
генов в образцах, в которых доступно для анализа малое количество ДНК
(биопсия опухоли).
94
ВЫВОДЫ
1. Подбор праймеров и зондов осуществлен в соответствии с критериями
для проведения МЧ-кПЦР.
2. Оценена предсказательная способность метода многолокусной МЧкПЦР методом ΔΔCy0 для определения уровня метилирования,
показывающая,
что
модельный
уровень
метилирования
прямо
коррелирует с уровнем метилирования, определенным методом ΔΔCy0.
3. Определена эффективность ПЦР для каждого локуса тест-системы,
которая варьирует в диапозоне 1,88 – 1,95.
4. Аналитическая чувствительность метода многолокусной МЧ-кПЦР
составляет 10%.
5. Относительная погрешность метода составляет 11,38%.
6. Адаптированный лабораторный протокол многолокусной МЧ-кПЦР с
возможностью мультиплексирования для количественного определения
уровня метилирования ДНК позволяет снизить требования к количеству
материала образца, что может быть использовано для определения
уровня метилирования панелей генов в образцах, в которых для анализа
доступно малое количество ДНК.
95
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Umer M., Herceg Z. Deciphering the epigenetic code: An overview of DNA
methylation analysis methods // Antioxidants and Redox Signaling. 2013.
2.
Wang R.Y.H., Gehrke C.W., Ehrlich M. Comparison of bisulfite modification
of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues // Nucleic Acids Res.
1980.
3.
Pajares M.J. et al. Methods for analysis of specific DNA methylation status //
Methods. Elsevier Inc., 2020.
4.
Tanaka K., Okamoto A. Degradation of DNA by bisulfite treatment //
Bioorganic Med. Chem. Lett. 2007.
5.
Raizis A.M., Schmitt F., Jost J.P. A Bisulfite Method of 5-Methylcytosine
Mapping That Minimizes Template Degradation // Anal. Biochem. 1995. Vol.
226, № 1. P. 161–166.
6.
Grunau C., Clark S.J., Rosenthal A. Bisulfite genomic sequencing: systematic
investigation of critical experimental parameters // Nucleic Acids Res. 2001.
7.
Rother K.I. et al. Influence of DNA Sequence and methylation status on
bisulfite conversion of cytosine residues // Anal. Biochem. 1995.
8.
Dahl C., Guldberg P. DNA methylation analysis techniques // Biogerontology.
2003.
9.
Warnecke P.M. et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite
sequencing // Methods. 2002.
10.
Millar D.S. et al. Methylation sequencing from limiting DNA: Embryonic,
fixed, and microdissected cells // Methods. 2002.
11.
Paulin R. Urea improves efficiency of bisulphite-mediated sequencing of 5’methylcytosine in genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1998. Vol. 26, № 21.
P. 5009–5010.
96
12.
Huang Y. et al. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite
sequencing // PLoS One. 2010.
13.
Kristensen L.S. et al. Sensitive melting analysis after real time-methylation
specific PCR (SMART-MSP): High-throughput and probe-free quantitative
DNA methylation detection // Nucleic Acids Res. 2008.
14.
Rand K. et al. Conversion-specific detection of DNA methylation using realtime polymerase chain reaction (ConLight-MSP) to avoid false positives //
Methods. 2002.
15.
Busslinger M. et al. The sequence GGCmCGG is resistant to MspI cleavage //
Nucleic Acids Res. 1983.
16.
Butkus V. et al. Cleavage of methylated CCCGGG sequences containing either
N4-methylcytosine or 5-methytcytosine with Mspl, Hpall, Smal, Xmal and
Cfr9I restriction endonudeases // Nucleic Acids Res. 1987.
17.
Melnikov A.A. et al. MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA
methylation // Nucleic Acids Res. 2005.
18.
Ramalho-Carvalho J., Henrique R., Jerónimo C. Methylation-Specific PCR //
Methods in Molecular Biology. 2018.
19.
Dippmann C. et al. Triage of hrHPV-positive women: comparison of two
commercial methylation-specific PCR assays // Clin. Epigenetics. 2020. Vol.
12, № 1. P. 171.
20.
Herman J.G. et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for
methylation status of CpG islands // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996.
21.
Hernández H.G. et al. Optimizing methodologies for PCR-based DNA
methylation analysis // BioTechniques. 2013.
22.
Thomassin H., Kress C., Grange T. MethylQuant: a sensitive method for
quantifying methylation of specific cytosines within the genome. // Nucleic
97
Acids Res. 2004.
23.
C.A. E. et al. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA
methylation // Nucleic acids research. 2000.
24.
Beikircher G. et al. Multiplexed and sensitive DNA methylation testing using
methylation-sensitive restriction enzymes “MSRE-qPCR” // Methods in
Molecular Biology. 2018.
25.
Rein T., Zorbas H., DePamphilis M.L. Active mammalian replication origins
are associated with a high-density cluster of mCpG dinucleotides. // Mol. Cell.
Biol. 1997.
26.
Hua D. et al. Quantitative methylation analysis of multiple genes using
methylation-sensitive restriction enzyme-based quantitative PCR for the
detection of hepatocellular carcinoma // Exp. Mol. Pathol. 2011. Vol. 91, № 1.
P. 455–460.
27.
Paz M.F. et al. A systematic profile of DNA methylation in human cancer cell
lines // Cancer Res. 2003.
28.
Sigin V.O. et al. DNA methylation markers panel can improve prediction of
response to neoadjuvant chemotherapy in luminal B breast cancer // Sci. Rep.
2020.
29.
Aleyasin S.A. The epigenetic study of Fgfr2 as a potential biomarker in the
differential diagnosis of intestinal metaplasia and gastric cancer. Vol. 2. P. 1–
10.
30.
Moore H.R., Meehan R.R., Young L.E. Methylation-sensitive polymerase
chain reaction. // Methods Mol. Biol. 2006.
31.
Qiu X. et al. Hypermethylation of ACP1, BMP4, and TSPYL5 in
Hepatocellular Carcinoma and Their Potential Clinical Significance // Dig.
Dis. Sci. 2016. Vol. 61, № 1. P. 149–157.
98
32.
Sadri R., Hornsby P.J. Rapid analysis of DNA methylation using new
restriction enzyme sites created by bisulfite modification // Nucleic Acids Res.
1996.
33.
Frommer M. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive
display of 5- methylcytosine residues in individual DNA strands // Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 1992.
34.
Xiong Z., Laird P.W. COBRA: A sensitive and quantitative DNA methylation
assay // Nucleic Acids Res. 1997.
35.
Eads C.A., Laird P.W. Combined bisulfite restriction analysis (COBRA). //
Methods Mol. Biol. 2002.
36.
Church G.M., Gilbert W. Genomic sequencing // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A. 1984.
37.
Susan J.Ci. et al. High sensitivity mapping of methylated cytosines // Nucleic
Acids Res. 1994.
38.
Jiang M. et al. Rapid quantification of DNA methylation by measuring relative
peak heights in direct bisulfite-PCR sequencing traces // Lab. Investig. 2010.
39.
Reed K. et al. Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing
for measuring differences in DNA methylation // Anal. Biochem. 2010. Vol.
397, № 1. P. 96–106.
40.
Lewin J. et al. Quantitative DNA methylation analysis based on four-dye trace
data from direct sequencing of PCR amplificates // Bioinformatics. 2004.
41.
Lee Y.K. et al. Improved reduced representation bisulfite sequencing for
epigenomic profiling of clinical samples // Biol. Proced. Online. 2014.
42.
Meissner A. et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative
high-resolution DNA methylation analysis // Nucleic Acids Res. 2005.
43.
Chatterjee A. et al. Technical considerations for reduced representation
99
bisulfite sequencing with multiplexed libraries // J. Biomed. Biotechnol. 2012.
44.
Ronaghi M. Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing // Genome Res.
2001. Vol. 11, № 1. P. 3–11.
45.
Hyman E.D. A new method of sequencing DNA // Anal. Biochem. 1988. Vol.
174, № 2. P. 423–436.
46.
Šestáková Š., Šálek C., Remešová H. DNA Methylation Validation Methods:
A Coherent Review with Practical Comparison // Biological Procedures
Online. 2019.
47.
Kurdyukov S., Bullock M. DNA methylation analysis: Choosing the right
method // Biology. 2016.
48.
Segel I.H., Renosto F., Seubert P.A. Sulfate-activating enzymes // Methods in
Enzymology. 1987. P. 334–349.
49.
Tost J., Gut I.G. DNA methylation analysis by pyrosequencing // Nat. Protoc.
2007. Vol. 2, № 9. P. 2265–2275.
50.
Komoszynski M., Wojtczak A. Apyrases (ATP diphosphohydrolases, EC
3.6.1.5) : function and relationship to ATPases // Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 1996. Vol. 1310, № 2. P. 233–241.
51.
Ronaghi M., Uhlén M., Nyrén P. A sequencing method based on real-time
pyrophosphate // Science. 1998.
52.
Busato F. et al. Quantitative DNA methylation analysis at single-nucleotide
resolution by pyrosequencing® // Methods in Molecular Biology. 2018.
53.
Tost J., El abdalaoui H., Glynne Gut I. Serial pyrosequencing for quantitative
DNA methylation analysis // Biotechniques. 2006. Vol. 40, № 6. P. 721–726.
54.
Delaney C., Garg S.K., Yung R. Analysis of DNA Methylation by
Pyrosequencing // Methods in Molecular Biology. 2015. P. 249–264.
55.
Frommer M. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive
100
display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands (genomic
sequencing/DNA methylation/bisulfite modiflication/PCR/kininogen gene) //
Genetics. 1992.
56.
Hindson B.J. et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute
Quantitation of DNA Copy Number // Anal. Chem. 2011. Vol. 83, № 22. P.
8604–8610.
57.
Yu M., Heinzerling T.J., Grady W.M. DNA Methylation Analysis Using
Droplet Digital PCR // Methods in Molecular Biology. 2018. P. 363–383.
58.
Hayashi M. et al. Paired Box 5 Methylation Detection by Droplet Digital PCR
for Ultra-Sensitive Deep Surgical Margins Analysis of Head and Neck
Squamous Cell Carcinoma // Cancer Prev. Res. 2015. Vol. 8, № 11. P. 1017–
1026.
59.
Yu M. et al. MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute
quantification of infrequently methylated alleles // Epigenetics. 2015. Vol. 10,
№ 9. P. 803–809.
60.
Van Wesenbeeck L. et al. Droplet digital PCR is an accurate method to assess
methylation status on FFPE samples // Epigenetics. 2018. Vol. 13, № 3. P.
207–213.
61.
Weisenberger D.J. et al. DNA methylation analysis by digital bisulfite
genomic sequencing and digital MethyLight // Nucleic Acids Res. 2008. Vol.
36, № 14. P. 4689–4698.
62.
Luo Y. et al. Regional methylome profiling reveals dynamic epigenetic
heterogeneity and convergent hypomethylation of stem cell quiescenceassociated genes in breast cancer following neoadjuvant chemotherapy // Cell
Biosci. 2019. Vol. 9, № 1. P. 16.
63.
Ehrich M. et al. Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation
patterns by base-specific cleavage and mass spectrometry // Proc. Natl. Acad.
101
Sci. U. S. A. 2005.
64.
Coolen M.W. et al. Genomic profiling of CpG methylation and allelic
specificity using quantitative high-throughput mass spectrometry: Critical
evaluation and improvements // Nucleic Acids Res. 2007.
65.
Karas M., Hillenkamp F. Laser Desorption Ionization of Proteins with
Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons // Analytical Chemistry. 1988.
66.
Kirpekar F. et al. DNA sequence analysis by MALDI mass spectrometry //
Nucleic Acids Res. 1998.
67.
Thompson R.F. et al. A pipeline for the quantitative analysis of CG
dinucleotide methylation using mass spectrometry // Bioinformatics. 2009.
68.
Tse M.Y. et al. A refined, rapid and reproducible high resolution melt (HRM)based method suitable for quantification of global LINE-1 repetitive element
methylation // BMC Res. Notes. 2011. Vol. 4, № 1. P. 565.
69.
Wojdacz T.K., Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting
(MS-HRM): A new approach for sensitive and high-throughput assessment of
methylation // Nucleic Acids Res. 2007.
70.
Wojdacz T.K., Hansen L.L., Dobrovic A. A new approach to primer design
for the control of PCR bias in methylation studies // BMC Res. Notes. 2008.
71.
Wojdacz T.K., Lotte Hansen L. Reversal of PCR bias for improved sensitivity
of the DNA methylation melting curve assay // Biotechniques. 2006. Vol. 41,
№ 3. P. 274–278.
72.
Wojdacz T.K., Borgbo T., Hansen L.L. Primer design versus PCR bias in
methylation independent PCR amplifications // Epigenetics. 2009. Vol. 4, №
4. P. 231–234.
73.
Słomka M. et al. High Resolution Melting (HRM) for High-Throughput
Genotyping—Limitations and Caveats in Practical Case Studies // Int. J. Mol.
102
Sci. 2017. Vol. 18, № 11. P. 2316.
74.
Wojdacz T.K., Dobrovic A., Hansen L.L. Methylation-sensitive highresolution melting // Nat. Protoc. 2008.
75.
Wittwer C.T. et al. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting
Analysis Using LCGreen // Clin. Chem. 2003. Vol. 49, № 6. P. 853–860.
76.
Candiloro I.L. et al. Rapid analysis of heterogeneously methylated DNA using
digital methylation-sensitive high resolution melting: application to the
CDKN2B (p15) gene // Epigenetics Chromatin. 2008.
77.
Guevara M.Á. et al. Analysis of DNA cytosine methylation patterns using
methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) // Methods in
Molecular Biology. 2017.
78.
Hou P. et al. A Profile of Current Methods for DNA Methylation Analysis //
Curr. Anal. Chem. 2006.
79.
Hsu H.-K. et al. Detection of DNA Methylation by MeDIP and MBDCap
Assays: An Overview of Techniques // Methods in Molecular Biology. 2020.
P. 225–234.
80.
Taiwo O. et al. Methylome analysis using MeDIP-seq with low DNA
concentrations // Nat. Protoc. 2012. Vol. 7, № 4. P. 617–636.
81.
Weber M. et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify
sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells
// Nat. Genet. 2005.
82.
Kulis M., Esteller M. DNA Methylation and Cancer // Advances in Genetics.
2010. P. 27–56.
83.
Singer-Sam J. et al. Use of a HpaII-polymerase chain reaction assay to study
DNA methylation in the Pgk-1 CpG island of mouse embryos at the time of
X-chromosome inactivation. // Mol. Cell. Biol. 1990.
103
84.
Noehammer C. et al. Strategies for validation and testing of DNA methylation
biomarkers // Epigenomics. 2014.
85.
Tanas A.S. et al. Genome-wide methylotyping resolves breast cancer
epigenetic heterogeneity and suggests novel therapeutic perspectives //
Epigenomics. 2019.
86.
Hashimoto K. et al. Improved quantification of DNA methylation using
methylation-sensitive restriction enzymes and real-time PCR // Epigenetics.
2007.
87.
Edwards K., Logan J. Performing real-time PCR // Real-time PCR Curr.
Technol. …. 2009.
88.
Guescini M. et al. Accurate and Precise DNA Quantification in the Presence
of Different Amplification Efficiencies Using an Improved Cy0 Method //
PLoS One / ed. Maga G. 2013. Vol. 8, № 7. P. e68481.
89.
Guescini M. et al. A new real-time PCR method to overcome significant
quantitative inaccuracy due to slight amplification inhibition // BMC
Bioinformatics. 2008.
90.
Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of
quantitation. // Clin. Biochem. Rev. 2008.
91.
Ucar I., Pebesma E., Azcorra A. Measurement Errors in R // R J. 2019. Vol.
10, № 2. P. 549.
92.
Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain
reaction // Science (80-. ). 1991.
93.
Lebrón R. et al. NGSmethDB 2017: enhanced methylomes and differential
methylation // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № D1. P. D97–D103.
104
Отзывы:
Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв