Использование метода капиллярного электрофореза в аналитическом контроле энергетических напитков

Шайдорова Г.М.

Использование метода капиллярного электрофореза в аналитическом контроле энергетических напитков

44.03.01 Педагогическое образование

Народное образование. Педагогика

Дипломы

Вуз: Белгородский государственный университет - национальный исследовательский университет (НИУ «БелГУ»)

ID: 5c1a737d7966e104f6f85a25

UUID: 1f9df120-e5da-0136-046d-525400005860

Язык: Русский

Опубликовано: почти 6 лет назад

Просмотры: 36

Шайдорова Г.М.

Источник: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 1,1 МБ

Поделиться работой

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» ( Н И У « Б е л Г У » ) ИНСТИТУТ ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК КАФЕДРА ОБЩЕЙ ХИМИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В АНАЛИТИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ НАПИТКОВ Выпускная квалификационная работа обучающегося по направлению подготовки 04.03.01 Химия очной формы обучения, группы 07001417 Шайдоровой Галины Михайловны Научный руководитель: к.п.н., доцент Олейникова И. И. БЕЛГОРОД 2018

2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 3 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .................................................................................. 5 1.1 Кофеин. Влияние на организм ......................................................................... 5 1.2 Методы определения кофеина в напитках ..................................................... 7 1.3 Капиллярный электрофорез. История развития ............................................ 9 1.4 Основы метода................................................................................................. 10 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .................................................................. 19 2.1 Материальное обеспечение ............................................................................ 19 2.2 Методика эксперимента ................................................................................. 20 3 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................ 27 ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 38 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ............................................. 40

3 ВВЕДЕНИЕ C древнейших времён люди использовали природные стимуляторы такие как, кофе, чай, мате, орехи кола, отвары лимонника и женьшеня. Сегодняшний гиперактивностью образ и жизни отличается эмоциональными высокой нагрузками, что скоростью, приводит к перенапряжению всех систем организма. Для поддержания высокого ритма жизни и снятия усталости используются тонизирующие напитки. Энергетики – безалкогольные напитки, содержащие биологически активные вещества и стимулирующие центральную нервную систему (ЦНС), приобрели высокую популярность среди современной молодёжи. В состав энергетиков входят: кофеин, теобромин, теофиллин, витамины, глюкоза, сахароза, экстракты женьшеня и гуараны, большое количество угольной кислоты. Кофеин – алкалоид пуринового ряда, который оказывает влияние на системы организма: усиливает сердечную деятельность, стимулирует возбуждение ЦНС, вызывает расширение кровеносных сосудов, снижает агрегацию тромбоцитов, повышает диурез. Известно, что в больших дозах вызывает истощение ЦНС, а при регулярном употреблении – привыкание. Кофеин применяют при производстве всех известных сегодня энергетических напитков. В последние годы энергетики набирают огромную популярность. При этом часто никто не задумывается о том, что это не просто тонизирующий и утоляющий жажду напиток, обладающий оригинальным вкусом и запахом. Сегодня энергетические напитки используют скорее как тонизирующие, к работе и работоспособности это уже не имеет никакого отношения. Их употребление потребления. уже должно регламентироваться нормами суточного

4 Современные медицинские исследования доказывают, что при большом количестве потребления эти напитки оказывают отрицательное влияние на организм человек – повышают артериальное давление и уровень сахара в крови. Впоследствии это может стать развитием серьёзных заболеваний – гипертонии и сахарного диабета. В настоящее время государство уделяет пристальное внимание к таким направлениям предпринимательской деятельности, при которых осуществляется оборот пищевых продуктов. Качество и безопасность потребления энергетиков в современном обществе вызывает множество вопросов. В связи с этим представляются актуальными исследования по оценке качества и безопасности энергетиков с использованием современных инструментальных аналитических методов анализа. Исходя из высокой значимости и актуальности данной проблемы, можно поставить цель исследования. Цель исследования: изучить содержание кофеина в энергетических напитках разных производителей, реализуемых в торговой сети г. Белгорода. Задачи: 1. Изучить литературу по теме исследования. 2. Произвести анализ образцов энергетических напитков методом капиллярного электрофореза. 3. Сопоставить полученные данные с медицинскими нормами и стандартом ГОСТ. 4. Оценить достоверность полученных результатов, используя метод разбавлений и стандартных добавок. Объект исследования: энергетические напитки, реализуемые в торговой сети г. Белгорода. Предмет исследования: энергетических напитков. содержание кофеина в образцах

5 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Кофеин. Влияние на организм Кофеин (1,3,7-триметилксaнтин (и в виде натриябензоaта), 2,6-диокси1,3,7-триметилпурин) C₈H₁₀N₄O₂ (рис. 1.1.) – алкaлоид пуринового ряда, содержится в листьях чaя (~2%), семенах кофе (1-2%), орехах колa, плодах гуараны, какао бобах, луковицaх морского лука. Кофеин синтезируются в частях растений для предотвращения поедания насекомыми, а также для поощрения опылителей. Рис. 1.1. Структурная формула кофеина Белые шелковистые игольчатые кристаллы или белый кристаллический порошок горьковатого вкуса, без запаха [1]. Молярная масса: 194,19 г/моль. Плотность: 1,23 г/см3. Температура плавления: 238оС (безводный). Температура кипения: 179оС. Растворимость, г/100 мл: вода – 1,35; этанол – 2,30; эфир – 0,04; хлороформ – 14,2 [2]. Действие кофеина на организм, в частности на центральную нервную систему (ЦНС), было изучено И.П. Павловым.

6 Кофеин усиливает и регулирует процессы возбуждения в коре большого мозга – стимулирует положительные условные рефлексы и увеличивает двигательную активность; повышает умственную и физическую работоспособность, уменьшает усталость и сонливость. Большие дозы могут привести к истощению клеток. Дозирование кофеинa должно производиться с учётом индивидуальных особенностей нервной деятельности. Кофеин ослабляет действие снотворных и наркотических средств, повышает рефлекторную возбудимость спинного мозга, возбуждает дыхательный и сосудодвигательный центры. Сердечная сокращения деятельность миокарда под становятся влиянием более кофеина интенсивными усиливается, и частыми. Происходит расширение кровеносных сосудов скелетных мышц, сердца, почек, но сосуды органов брюшной полости и мозга суживаются. Кофеин снижает агрегацию тромбоцитов. В качестве лекарственного средства кофеин применяют при инфекционных и других заболеваниях, которые сопровождаются угнетением ЦНС и сердечно-сосудистой системы, при отравлениях наркотиками и другими ядами, при спазмах сосудов головного мозга, для повышения психической и физической работоспособности, для устранения сонливости [1]. Кофеин противопоказан при повышенной возбудимости, бессоннице, гипертензии, атеросклерозе, органических заболеваниях сердечно- сосудистой системы, глаукоме [3,4,5]. При злоупотреблении кофеин (более 300 мг в сутки, т.е. четыре чашки натурального кофе по 150 мл) может вызывать состояние тревоги, беспокойство, тремор, головную боль, спутанность сознания, сердечные экстрасистолии [6,7]. Безопасная днeвная доза для организма 300 - 400 мг

7 Максимальная доза для взрослых внутрь: при рaзовом приёме 0,3 г.; суточная доза – 1г. [1]. 1.2 Методы определения кофеина в напитках На сегодняшний день известны различные методы определения кофеина в напитках: йодометрический, фотометрический, масс-спектроскопия, спектрофотомeтрический, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), кaпиллярный электрофорез (КЭ) [8]. Регламентированными являются: 1. Метод ВЭЖХ – ГОСТ 30059–93 Образцы напитков дегазируют по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25 °С и фильтруют через бумажный фильтр. Условия анализа: Колонка с фазой С-18, 5-6 мкм, 0,15 х 4,6 мм. Подвижная фаза: 15% ацeтонитрила, 85% 0,0125 М раствора KH2PO4, доведенного фосфорной кислотой до рН 3,2. Скорость потока: линейный градиент от 1,2 см3/мин до 1,7 см3/мин за 8 мин. Температура термостата - 35 °С. Давление на колонке при скорости потока - 1,2 см3/мин - 120 кг/см2 (давление будет возрастaть по мере эксплуатации колонки). Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 210 нм 0,02 ед. адсорбции на всю шкалу. Вводимый объем образца - 10,0 мм3 [9]. 2. Метод КЭ - ГОСТ Р 53193-2008. Основан на разделении и количественном определении массовой концентрации электрофореза анализируемых в варианте компонентов мицеллярной методом капиллярного электрокинетической

8 хроматографии. Детектирование проводят по собственному поглощению компонентов при длине волны 254 нм [10]. Следует отметить, что для классического метода ВЭЖХ требуется достаточно большой расход дорогостоящих элюeнтов и растворителей, что не только усложняет процесс, но и существенно удорожает анализ. Группа компаний «ЛЮМЭКС», которая производит приборы капиллярного электрофореза «Капель» с фотометрическим детектором, разработала под свои приборы метод определения кофеина, аскорбиновой кислоты, консервантов и подсластителей методом КЭ и оформила как национальный стандарт ГОСТ Р. Этот метод заявлен сразу для разных видов напитков с определением широкого ассортимента вводимых компонентов и претендует на универсальность. Для выполнения выпускной квалификационной работы был выбран метод капиллярного электрофореза на системе «Капель – 105М». Капиллярный электрофорез – интенсивно развивающийся метод разделения сложных смeсей, позволяющий анализировать ионные и нейтральные компоненты различной природы с высокой экспрессностью и уникальной эффективностью. Метод капиллярного электрофореза обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами разделения:  в кварцевом капилляре достигается высокая эффективность разделения компонентов смесей – сотни тысяч теоретических тарелок;  благодаря многообразию вариантов метода КЭ разделяются ионные, нейтральные, гидрофильные, гидрофобные, хирaльные компоненты, наночастиц до макромолекул;  быстрота проведения анализа;  крайне низкий расход реактивов и растворителей (микролитры);  дозируется минимальный объем анализируемого образца; от

9  для большинства объектов используется простая подготовка пробы – в основном лишь фильтровaние, дегазирование и разбавление;  отсутствие дорогостоящих колонок с сорбентами и проблем с их старением и заменой;  низкая стоимость единичного анализа [11]. 1.3 Капиллярный электрофорез. История развития Электрофорез — это электрокинетическое явление, при котором осуществляется перемещение частиц в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Принцип электрофореза стал известен с начала XIX века. В 1937 году в Швеции Арне В.К. Тезелиус предложил метод разделения смеси белков под действием напряжения, который связан с различной подвижностью и зарядом отдельных белков. Позднее за работы по электрофорезу и адсорбции Тезелиус был удостоен Нобелевской премии [12]. Капиллярный электрофорез как инструментальный метод анализа берёт начало с 80-х годов XXвека в работах Йоргенсона и Лукаса. Быстрое развитие метода стало возможно из-за уменьшения диаметра разделительного капилляра до 25-100 мкм и детектировании в потоке жидкости в ближней УФ-области. Стало возможным разделение белков и дансил-аминокислот при помощи кварцевого капилляра диаметром 50-100 мкм. Разделение биомолекул резко повысило интерес к данному методу анализа во второй половине 80-х годов ХХ века. В 1984 году произошло открытие метода мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), который предусматривал разделение нейтральных молекул, с помощью добавления додецилсульфата

10 натрия в концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования. В 1985 году Гасмaном осуществлено разделение хирaльных компонентов методом КЭ. В 1991 году электрокинетической Вартaи предложил хроматографии вариант (МЭЭКХ), в микроэмульсионной котором вещества разделялись по гидрофобности и электрофоретической подвижности В дальнейшем метод капиллярного электрофореза стал альтернативой и дополнением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. На сегодняшний день известно более десяти отечественных и зарубежных фирм, занимающихся разработкой и выпуском аппаратного обеспечения на основе метода капиллярного электрофореза [13,14]. 1.4 Основы метода Капиллярный электрофорез (КЭ) – физический метод анализа, который базируется на движении внутри кварцевого капилляра заряженных частиц в растворе электролита под действием электрического поля. Микрообъём анализируемого раствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером – электролитом. Затем компоненты пробы разделяются под действием приложенного высокого напряжения (до 30 кВ), двигаясь по капилляру с разной скоростью, которая зависит от заряда и величины ионного радиуса. Соответственно зона детектирования компонентов пробы достигается в разное время. Последовательность пиков называется электрофореграммой. Качественная характеристика вещества – время миграции, количественная характеристика – высота или площадь пика, которая пропорциональна концентрации вещества [15].

11 Принцип электрофореза строго подчиняется закону Ома. Разделение достигается только при действии постоянного напряжения и в присутствии буфера, который обеспечивает электролитическую проводимость. КЭ имеет весомое преимущество перед всеми вариантами колоночной хроматографии: при анализе нет необходимости ждать пока последний пик пройдёт расстояние до конца капилляра, так как после анализа капилляр промывается и вновь наполняется буфером [12]. Процессы, происходящие в капилляре, заполненном электролитом и помещённом в электрическое поле: 1. под Силоксaновые группы, находящиеся на поверхности капилляра, действием водных растворов гидролизуются, с образoванием силaнольных групп, а затем гидрaтируются (рис. 1.2.). Рис. 1.2. Гидрaтация силaнольных групп 2. Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и рН водных растворов. При рН больше 2,5 поверхность кварца имеет отрицательный заряд; при рН около 2 и меньше силaнольные группы практически не диссоциируют – поверхность кварца нейтральна. 3. На границе раздела кварц/водный раствор образуется двойной электрический слой (рис. 1.3.) [16]. электролита

12 Рис. 1.3. Строение двойного электрического слоя (ДЭС) [18] Первая обкладка – неподвижные силaнольные группы, заряженные отрицательно. Вторая обкладка – катионы из раствора, заряженные положительно. Диэлектрик – молекулы воды, гидрaтирующие силaнольные группы и катионы. Положительная часть ДЭС делится на: неподвижную (у поверхности кварца) и диффузную (удалена от поверхности). В неподвижной части положительных зарядов меньше, чем отрицательных зарядов на поверхности кварца из-за увеличения размеров катионов вследствие гидрaтации. Таким образом, в диффузной части создаётся избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит граница скольжения — при действии электрического поля неподвижная часть остается на месте, а диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой в силу межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре - электроосмотический поток (ЭОП). Скорость ЭОП зависит от рН: в сильнокислой среде ЭОП отсутствует, в слабокислой – скорость очень мала, в нейтральной и щелочной среде – скорость максимальна [17]. Существуют различные варианты метода КЭ:

13  капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ);  мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ);  микроэмульсиoнная электрокинетическая хроматография (МЭЭКХ);  капиллярный гель-электрофорез (КГЭ);  капиллярное элeктрофокусирование;  капиллярный изотахoфорез (ИТФ);  хиральный капиллярный электрофорез;  неводный капиллярный электрофорез;  капиллярный aффинный электрофорез (КАЭ);  капиллярная электрохрoматография (КЭХ) [14]. Основными являются: 1. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) – наиболее распространённый вариант КЭ, который применяется для разделения мелких, водорастворимых молекул. КЗЭ применяют в анализе аминокислот, пептидов, ионов, энантиомеров и т.д. Разделение компонентов пробы основано на различиях в подвижности заряженных молекул или ионов. Метод используют только для ионогенных компонентов. Достоинство КЗЭ – высокая эффективность, недостаток – низкая селективность, которая может быть повышена за счёт изменения рН буферного раствора, введения в буферный раствор различных добавок.  Катионы перемещаются быстрее всего, так как электрофорез и ЭОП совпадают по направлению.  Нейтральные частицы не разделяются, они движутся только под действием ЭОП.  Малые анионы мигрируют против ЭОП в направлении анода, так как их электрофoретическая подвижность выше, чем ЭОП.

14  Большие анионы медленно мигрируют к катоду, так как их электрофoретическая подвижность ниже, чем ЭОП [18]. 2. метод, Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭХК) – объединяющий электрофорез и хроматографию. Метод предусматривает разделение нейтральных молекул и заряженных частиц. Разделение нейтральных молекул становится возможным при добавлении к буферному раствору концентрацией выше поверхностно критической активных концентрации веществ (ПАВ) с мицеллoобразования (ККМ). Образующиеся мицеллы несут заряд и поэтому мигрируют. Анионные ПАВ движутся к аноду, т.е. против ЭОП. Во время миграции мицеллы могут реагировать с компонентами раствора за счёт гидрофобных и электростaтических взаимодействий. Если вещество не реагирует с мицеллой, то оно движется с ЭОП Для улучшения условий разделения используют органические модификаторы (метанол, ацетонитрил) [12]. Система капиллярного электрофореза должна включать следующие компоненты: 1. Кварцевый капилляр; 2. Источник высокого напряжения; 3. Устройство ввода пробы; 4. Детектор; 5. Система сбора, обработки и вывода информации. На рисунке приведено капиллярного электрофореза [18]. схематическое устройство системы

15 Рис. 1.4. Устройство системы КЭ [18] 1. Кварцевый капилляр: обычно используют капилляры из высокочистого плaвленного кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полимерным защитным покрытием. В зоне детектирования полиимидный слой удаляют. Внутренний диаметр капилляра может быть различным от 20 до 100 мкм. Длина капилляра 20-100 см. Общая длина капилляра Lобщ – полная длина; эффективная длина капилляра Lэфф – длина от входного конца капилляра до зоны детектирования. 2. Источник высокого напряжения: диапазон от -25 до +25 кВ. Допустимая сила тока в капилляре до 200 мкА. 3. Устройство ввода пробы может осуществляться тремя способами: гидродинaмический, электрокинeтический; гидростатический. 4. Детектор. Детектирование в КЭ может осуществляться разными способами:  в капиллярной части, в режиме реального времени (on-capillary);

16  на выходе из капилляра (end-capillary);  вне системы КЭ (off-capillary). Основные типы детекторов в КЭ:  фотометрический в УФ-видимой области спектра;  флуoриметрический:  масс-спектрометрический;  кондуктометрический;  амперометрический;  радиометрический;  рефрактометрический. 5. Система сбора и обработки данных. Для фиксирования электрофоретических данных используют:  самописец;  принтер;  компьютер [19]. Метод КЭ характеризуется высокой эффективностью, которая выражается числом теоретических тарелок и определяется по формуле 1.1. ( где ) (1.1) – эффективность; – время миграции аналита; – ширина пика на половине высоты. На эффективность разделения влияют следующие факторы:  величина зоны вводимой пробы, определяемая длительностью ввода;  температурный градиент (разница серединой и стенками капилляра);  адсорбция на стенках капилляра; в температуре между

17  различная электропроводность у пробы и раствора электролита;  наличие гидродинамического потока. Параметр разрешения в КЭ определяют так же, как и в ВЭЖХ согласно формуле 1.2. , где (1.2) – разрешение; – времена миграции первого и второго компонента, мин.; – ширина первого и второго пика, мин. Разрешение в КЭ управляет эффективностью, а не селективностью – важное отличие КЭ от ВЭЖХ. Через формулу 1.3 можно выразить разрешение через эффективность (см. формулу 1.1). ( ̅ ), √ где (1.3) – изменение электрофоретической подвижности первого компонента и второго; ̅ – среднее арифметическое электрофоретических подвижностей первого компонента и второго. В варианте капиллярного зонного электрофореза фактор селективности определяют по формуле 1.4. , где (1.4) – фактор селективности; – электрофоретические подвижности первого и второго компонентов. В варианте мицеллярной электрокинетической хроматографии селективность определяется по формуле 1.5. , где – фактор селективности; (1.5)

18 - факторы ёмкости первого и второго компонентов. В свою очередь фактор ёмкости ( где ) можно найти из формулы 1.6. , (1.6) – время удерживания анализируемого вещества; – время удерживания компонента, не удерживаемого мицеллой; – время удерживания компонента, полностью удерживаемого мицеллой. Для нахождения и в анализируемую пробу вводят марке ЭОП (ацетон) и метку мицелл (судан 3 или судан 4), соответственно[20].

19 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Материальное обеспечение Средства измерений 1. Система капиллярного электрофореза «Капель» с положительной полярностью источника высокого напряжения (внутренний диаметр капилляра 75 мкм, полная длина капилляра 60 см, эффективная длина 50 см), оснащенная специализированным программным обеспечением на основе персонального компьютера. ТУ 4215-023-20506233-2006; 2. Весы лабораторные специального или высокого класса точности с ценой делений (дискретностью отсчета) не более 0,1 мг, наибольшим пределом взвешивания не более 210 г. ГОСТ 24104-2001; 3. Колбы мерные 2-1000-2, 2-50-2, 2-25-2. ГОСТ 1770-74; 4. Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 5,10 см3 . ГОСТ 29227-91; 5. Дозаторы пипеточные переменного объема 10 - 100 мм3, 100 - 1000 мм3 и 1000 - 5000 мм3 с пределом допускаемой погрешности измерения не более ± 2 %. ТУ 9452-001-33189998-95; 6. Цилиндры мерные лабораторные стеклянные с пробкой вместимостью 50 см3 . ГОСТ 1770-74. Реактивы 1. Вода дистиллированная. ГОСТ 6709-72; 2. Натрий тетрaборнокислый, стандарт-титр, молярная концентрация 0,05 моль/дм3 (молярная концентрация эквивалента 0,1 моль/дм3) ТУ2642-001-07500602-97 или натрий тетраборнокислый десятиводный. ГОСТ 4199-76 х.ч.; 3. Додeцилсульфат натрия, ч.д.а. или х.ч. ТУ 6-09-64-75;

20 4. Гидроксид натрия, х.ч. ГОСТ 4328-77; 5. Соляная кислота, х.ч. ГОСТ 3118-78; 6. Кофеин фармакопейный или имп., производства фирмы «Fluka». Вспомогательные устройства 1. Стаканы химические вместимостью 200 см3. ГОСТ 25336-82; 2. Колбы плоскодонные вместимостью 100 см3. ГОСТ 25336-82; 3. Пробирки одноразовые (типа Эппeндорфа) вместимостью 1,5 см3. ТУ 62-2-300-80; 4. Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 83 Гц (5000 оборотов в минуту), например ОПН-8 с ротором угловым РУ 180Л. ТУ 5-375-4261-76; 5. Холодильник бытовой; 6. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76; 7. Воронки лабораторные ГОСТ 25336-82; 8. Шприц медицинский одноразовый типа «Луер» вместимостью 10, 20 см3. ГОСТ 24861-91; 9. Фильтры целлюлозно-ацетатные, размер пор 0,2 мкм, диаметр 25 мм. ТУ6-55-221-879-88; 10. Оправа для фильтра производства фирмы «SАRТО- RIUSSТЕDIМ», кат. номер 16517. 2.2 Методика эксперимента Приготовление растворов 1. Раствор гидроксида натрия для промывки капилляра. В стакан из термостойкого стекла помещают 2 г гидроксида натрия и растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Срок хранения в сосуде из

21 полиэтилена – 6 месяцев. Молярная концентрация приготовленного раствора приблизительно равна 0, 5 моль/дм3. 2. Раствор соляной кислоты для промывки капилляра. В стакан из термостойкого стекла помещают 100 см3 дистиллированной воды, затем приливают 8 см3 соляной кислоты и перемешивают. Срок хранения не ограничен. Молярная концентрация приготовленного раствора приблизительно равна 1 моль/дм3. 3. Запасный раствор натрия тетрaборнокислого, молярная концентрация 0,05 моль/дм3 (молярная концентрация эквивалента 0,1 моль/дм3). Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции. Срок хранения раствора в плотно закрытом полиэтиленовом сосуде в условиях, исключающих поглощение углекислого газа - 6 месяцев. При отсутствии стандарт-титра раствор можно приготовить из натрия тетрaборнокислого дeсятиводного кристаллогидрата, растворив в мерной колбе вместимостью 1 дм3 навеску массой 19,07 г в дистиллированной воде. 4. Раствор додецилсульфата натрия, молярная концентрация 0,2 моль/дм3. В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают 1,44 г додецилсульфата натрия, добавляют 10-15 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают, выдерживают на водяной бане при температуре 40°С до полного растворения и после охлаждения доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора при комнатной температуре - 3 месяца. 5. Рабочий буферный раствор (ведущий электролит). В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают 10 см3 раствора натрия тетраборнокислого по п.3, 5 см3 раствора додeцил-сульфата натрия по п.4 и затем доводят до метки дистиллированной водой. Тщательно перемешивают и фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр (первую

22 порцию 0,5-1,0 см3 отбрасывают) в сухой полимерный 20 ммоль/дм3 сосуд с завинчивающейся крышкой. Ведущий электролит содержит натрия тетрaборнокислого, 40 ммоль/дм3 додецилсульфата натрия. Срок хранения раствора при комнатной температуре - 1 месяц. Приготовление грaдуировочных и контрольных растворов Исходными компонентами для приготовления грaдуировочных растворов служат сухие чистые вещества с содержанием основного вещества не менее 98 %. Действительное значение массовой концентрации i-го компонента в запасном растворе (Сi, мг/дм3) вычисляют по формуле 2.1. , (2.1) где m – масса навески; V – объём приготовленного раствора, дм3. Запасный раствор кофеина, массовая концентрация 1000 мг/дм3 В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают навеску кофеина массой (25 ± 2) мг, растворяют в дистиллированной воде и затем доводят до метки дистиллированной водой. Действительное значение массовой концентрации раствора вычисляют по формуле 2.1. Срок хранения раствора в холодильнике при температуре (4±2)°С - не более 3 месяцев. Приготовление градуировочных смесей Приготовили грaдуировочные растворы кофеина с массовыми концентрациями приведёнными в таблице 2.1. Действительные значения вычисляют по формуле 2.2. , (2.2) где Сij- массовая концентрация первого компонента в приготовленной смеси, мг/дм3;

23 Сik - массовая концентрация i-го компонента в исходной смеси, использованной для приготовления данной смеси, мг/дм3; Vk- объем исходной смеси, использованный для приготовления данной смеси, см3; Vj - объём приготовленной смеси, см3 [10]. Таблица 2.1. Номинальные значения массовых концентраций компонентов Компонент Массовая концентрация компонента, мг/дм3 Кофеин Смесь Смесь Смесь №1 200 №2 20 №3 2 Градуировочный график кофеина показан на рисунке 2.1. Рис. 2.1. Градуировочный график для определения кофеина Данные градуировочного графика приведены в таблице 2.2.

24 Таблица 2.2. Данные градуировки кофеина № Время Высота Площадь, Концентрация, Отклонение, выхода пика, mAU*мин мг/дм3 % пика, мин mAU 1 5.253 12.500 684.7 200.00 0.0 2 5.303 1.596 87.91 25.262 0.1 3 5.260 0.657 14.03 4.0953 0.0 Метрологические характеристики градуировочного графика кофеина из протокола программного обеспечения группы компаний «ЛЮМЕКС» «Эльфоран»: функция отклика: площадь; корреляция: 0,9996. Пробоподготовка образцов 1. Дегазирование при помощи ультразвуковой бани Град 13-35, частота 30 кГц, продолжительность 6 минут; 2. Фильтрование образцов через целлюлозно-ацетатные фильтры (d=0,2 мкм) в пробирки типа Эппендорф; 3. Центрифугирование в течение 5 минут при 5000 об/мин. Условия анализа  Буфер: боратный с добавками додецилсульфата натрия рН=9,2;  Капилляр: Lэфф/ Lобщ= 50/60 см, ID= 75 мкм;  Ввод пробы: 150 мбар*с;  Напряжение: +25 кВ;  Температура: +20° С;  Детектирование: 254 нм.

25 Боратный буфер обладает всеми необходимыми характеристиками для проведения анализа: достаточная буферная емкость в выбранном диапазоне рН, малое поглощение на длине волны детектирования, низкая подвижность ведущего иона, может использоваться в широком диапазоне концентраций без существенного увеличения тока, что позволяет, в свою очередь, применять максимально высокие напряжения в ходе анализа. На катоде: 2H2O + 2e- → Η2 + 2ΟΗНа аноде: 2ΟΗ- – 2e- → Ο2 + 2Η+ Образующиеся и гидроксильные и водородные ионы нейтрализуются буферными компонентами ведущего электролита: в прикатодном слое борной кислотой, в прианодном — борат-ионом. Разделение кофеина возможно благодаря введению анионного ПАВ (АПАВ) – додецилсульфата натрия в концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), для ДДСН в водном растворе составляет 8 мМ. В растворе электролита находятся мицеллы (гидрофобный «хвост» и гидрофильная отрицательно заряженная «голова») и небольшая доля мономерной формы ПАВ. Каждая мицелла окружена собственным ДЭС, внешнюю диффузную часть которого формируют катионы натрия. Ни мицеллярная, ни мономерная форма АПАВ не взаимодействуют со стенкой кварцевого капилляра, но при подаче на капилляр высокого напряжения обе формы мигрируют к аноду, в то время как ЭОП направлен к катоду. Если в капилляр на анодной стороне ввести пробу, содержащую нейтральные и заряженные компоненты, то ЭОП будет переносить их к катоду, а навстречу будет двигаться поток отрицательно заряженных мицелл АПАВ. Нейтральные компоненты пробы могут распределяться между фазой раствора и мицеллярной фазой. В результате на выходе капилляра регистрируется электрофореграмма нейтральных компонентов (кофеина), а также медленно мигрирующих анионов пробы [19].

26 Для подтверждения полученных результатов концентраций кофеина в образцах энергетических напитков были использованы методы разбавления и добавок [21, 22]. Разбавления исходных образцов проводили последовательно: в 2, 4, 8 и 16 раз. В методе стандартных добавок к 1 мл исследуемого энергетика приливали 0,5 мл кофеина с концентрацией 100 мг/дм3. Затем к 1 мл энергетика приливали 0,5 мл кофеина с концентрацией 1000 мг/дм3. Анализ проводили согласно методике в трёх повторностях Исходную концентрацию кофеина в образце энергетика определяли по формуле 3.1. , где (2.3) – исходная концентрация кофеина в образце, определённая ранее, мг/дм3; – концентрация стандартного раствора кофеина, мг/дм3; – объём добавленного стандартного раствора кофеина, мл; – объём пробы энергетика, взятый для анализа, мл; – площадь под пиком на электрофореграмме образца энергетического напитка, mAU*мин.; – площадь под пиком на ЭФГ после введения добавки, mAU*мин. Далее определяли среднюю концентрацию кофеина из трёх полученных результатов: , где (2.4) – концентрации кофеина, полученные из формулы 3.1.

27 3 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Для исследования были выбраны следующие образцы энергетических напитков, приобретённые в торговой сети г. Белгорода: 1. «Adrenаline Rash». Изготовитель: ООО «Пeпси Ко Холдингс». 2. «EON гранат-имбирь». Изготовитель: ООО «ДАЛ». 3. «BURN». Изготовитель: ООО «Кока-кола Эйчбиси Евразия» 4. «Flash up energy с кофеином и таурином». Изготовитель: ООО «Балтика – Тула». 5. «Power Torr energy». Изготовитель: ООО «Фонте Аква». 6. «Drive ме Ориджинал». Изготовитель: ООО «ПепсиКо Холдингс». 7. «Red Bull The Red Edition» со вкусом клюквы. Изготовитель: «РаухФрухтзафте ГмбХ энд Ко». 8. «Dracula». Изготовитель: ООО «Дикомп-Классик». 9. «Blаck Monster Assault». Изготовитель: «ДИС Контракт филлинг БВ Монстер Енерджи Лимитед». 10. «BULLIT». Изготовитель: «БУЛЛИТ ГМБХ». Анализ каждого образца производили в трёх повторностях. Электрофореграмма образца №1 «Adrenaline Rash» представлена на рисунке 3.1.

28 24 22 mAU 20 18 кофеин 452.02 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 мин Рис. 3.1. Электрофореграмма образца «Adrenaline Rash» С (кофеина) = 465,06 ± 29,90 мг/дм3. Электрофореграмма образца №2 «EON» представлена на рисунке 3.2. 20 18 16 кофеин 570.25 14 mAU 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 мин Рис. 3.2. Электрофореграмма образца «EON» С (кофеина) = 575,91 ± 15,61 мг/дм3. Электрофореграмма образца №3 «BURN» представлена на рисунке 3.3.

29 30 25 кофеин 393.55 mAU 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 мин Рис. 3.3. Электрофореграмма образца «BURN» С (кофеина) = 407,18 ± 25,53мг/дм3. Электрофореграмма образца №4 «Flash up energy» представлена на mAU рисунке 3.4. 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 кофеин 390.13 0 1 2 3 мин 4 5 6 Рис. 3.4. Электрофорeграмма образца «Flash up energy» С (кофеина) = 385,90 ± 23,84мг/дм3. Элeктрофореграмма образца №5 «Power Torr energy» представлена на рисунке 3.5.

30 16 14 кофеин 321.15 12 10 mAU 8 6 4 2 0 0 1 2 3 мин 4 5 6 Рис. 3.5. Элeктрофореграмма образца «Power Torr energy» С (кофеина) = 326,25 ± 13,81мг/дм3. Электрофореграмма образца №6 «Drive me Ориджинал» представлена на рисунке 3.6. 20 18 кофеин 410.47 16 14 mAU 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 мин 4 5 6 Рис. 3.6. Электрофорегрaмма образца «Drive me Ориджинал» С (кофеина) = 420,94 ± 22,64 мг/дм3. Электрофореграммa образца №7 «Red Bull The Red Edition» представлена на рисунке 3.7.

31 Рис. 3.7. Электрофореграммаобразца «Red Bull The Red Edition» С (кофеина) = 320,22 ± 4,03 мг/дм3. Электрофoреграмма образца №8 «Dracula» представлена на рисунке 3.8. Рис. 3.8. Электрофореграмма образца «Dracula» С (кофеина) = 298,90 ± 10,51мг/дм3.

32 Электрофореграмма образца №9 «Black Monster Assault» представлена на рисунке 3.9. 20 18 16 кофеин 270.17 14 mAU 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 мин 4 5 6 Рис. 3.9. Электрофореграмма образца «Black Monster Assault» С (кофеина) = 276,58 ± 14,18мг/дм3. Электрофорeграмма образца №10 «BULLIT» представлена на рисунке mAU 3.10. 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 кофеин 514.09 0 1 2 3 мин 4 5 6 Рис. 3.10. Электрофорeграмма образца «BULLIT» С (кофеина) = 514,37 ± 4,32 мг/дм3. Результаты анализа образцов энергетических напитков приведены в таблице 3.1.

33 Таблица 3.1. Концентрация кофеина в образцах энергетических напитков Содержание Допустимая Образец, объём кофеина в одной Концентрация концентрация упаковки, см3 упаковке, мг кофеина (мг/дм3) кофеина по ГОСТ, мг/дм3 [23, 24, 25] Adrenaline Rash 232,53 (500) 465,06 ± 29,90 EON (500) 278,96 575,91 ± 15,61 BURN (250) 101,80 407,18 ± 25,53 Flash up energy 192,95 (500) Power Torr energy 163,13 (500) Drive me 210,47 Ориджинал (500) Red Bull The Red 80,06 Edition (250) Dracula (330) 99,63 Black Monster 138,29 Assault (500) BULLIT (500) 257,19 385,90 ± 23,84 326,25 ± 13,81 420,94 ± 22,64 не менее 151; не более 400 320,22 ± 4,03 298,90 ± 10,51 276,58 ± 14,18 514,37 ± 4,32 Из таблицы 3.1. можно сделать следующие выводы: 1. Содержание кофеина в одной торговой упаковке образцов варьирует в пределах 80 – 279 мг, что, в принципе, удовлетворяет суточным нормам потребления кофеина по медицинским показаниям. 2. Однако первый пункт не учитывает следующие обстоятельства: количество потребляемых банок энергетика и их номинальный объём, а

34 также поступление других пуриновых алкалоидов с чаем и кофе, что в конечном итоге приводит к превышению суточной дозы потребления кофеина в три и более раз. 3. Концентрация кофеина в образцах энергетических напитков колеблется в пределах 276 – 576 мг/дм3. 4. Пять образцов удовлетворяют нормам ГОСТ: Flash up energy, Power Torr energy, Red Bull The Red Edition, Dracula, Black Monster Assault. 5. Два энергетика содержат пороговую концентрацию кофеина, согласно стандарту: BURN, Drive me Ориджинал. 6. В трёх образцах концентрация кофеина превышает допустимую: Adrenaline Rash – на 16,30%, EON – на 43,98%, BULLIT – на 28,59%. 7. Государственный стандарт не учитывает номинальный объём торговой упаковки энергетических напитков, что позволяет производителям замаскировать нарушения норм ГОСТ. Для анализа методом разбавления выбраны следующие образцы: 1. «EON гранат-имбирь». 2. «Drive me Ориджинал». 3. «BULLIT». Анализ каждого разбавления энергетических напитков осуществляли в трёх повторностях. На рисунке 3.11. представлены электрофореграммы разбавлений энергетика «EON».

35 а) б) в) г) д) Рис. 3.11. Электрофореграммы энергетического напитка «EON»: а) без разбавления; разбавление в 2 раза (б), в 4 раза (в), в 8 раз (г) и в 16 раз (д) В таблице приведены данные разбавлений трёх образцов энергетиков Таблица 3.2. Концентрации кофеина в образцах энергетиков после разбавлений Образец EON Drive me Ориджинал BULLIT без разбавления 575,91 ± 15,61 420,94 ± 22,64 514,37 ± 4,32 Концентрация, мг/дм3 Разбавление в 2 раза 4 раза 8 раз 285,96 ± 143,43 ± 71,76 ± 1,51 2,67 3,05 212,57 ± 106,43 ± 52,95 ± 1,58 3,01 3,23 257,46 ± 128,25 ± 65,69 ± 3,01 2,94 3,78 16 раз 37,63 ± 4,90 26, 98 ± 3,69 33,07 ± 4,58

36 Из таблицы следует, что определённые ранее концентрации кофеина в образцах энергетических напитков являются достоверными. При последовательном разбавлении в 2, 4, 8 и 16 раз наблюдается линейность полученных результатов. Методика определения кофеина является воспроизводимой. Также для подтверждения полученных ранее результатов концентрации кофеина в образцах энергетических напитков был использован метод стандартных добавок. Использовали образцы энергетиков: 1. «Power Torr energy». 2. «Red Bull The Red Edition». 3. «Black Monster Assault». Расчёт концентрации кофеина в образце «Power Torr energy» 1. Стандартная добавка 0,5 мл раствора кофеина с концентрацией 100 мг/дм3. Объём пробы энергетика 1 мл (см. формулу 3.1): ; ; . По формуле 3.2: . Аналогично производили расчёт при стандартной добавке раствора кофеина 0,5 мл с концентрацией 1000 мг/дм3 (см. формулу 3.1): ; ;

37 . По формуле 3.2: . Аналогично рассчитывали концентрацию образцов «Red Bull The Red Edition» и «Black Monster Assault», данные приведены в таблице 3.3. Таблица 3.3. Концентрации кофеина в образцах энергетиков, вычисленные по методу стандартных добавок Концентрация кофеина, мг/дм3 Образец из прямого анализа из расчёта по методу стандартных добавок 0,5 мл 100 мг/дм3 0,5 мл 1000 мг/дм3 Power Torr energy 326,25 ± 13,81 Red Bull The Red 320,22 ± 4,03 323,03 327,54 276,58 ± 14,18 274,86 277,58 Edition Black Monster Assault Из таблицы можно сделать вывод, что методика определения концентрации кофеина является воспроизводимой в образцах энергетических напитков, определённые согласно методике, являются достоверными и воспроизводимыми.

38 ВЫВОДЫ В рамках исследования данной выпускной квалификационной работы полностью раскрыта тема и достигнута цель - изучено содержание кофеина в энергетических напитках разных производителей, реализуемых в торговой сети г. Белгорода. Реализованы следующие задачи: 1. Изучена литература по теме исследования. 2. Произведён анализ образцов энергетических напитков методом капиллярного электрофореза. 3. Полученные данные сопоставлены с медицинскими нормами и стандартом ГОСТ. Исследования показали, что:  Содержание кофеина одной торговой упаковке не превышает норму суточного потребления кофеина по медицинским показаниям и варьирует в пределах 80 – 279 мг.  Концентрация кофеина в образцах энергетических напитков колеблется в пределах 276 – 576 мг/дм3.  Пять образцов удовлетворяют нормам ГОСТ: «Flash up energy», «Power Torr energy», «Red Bull The Red Edition», «Dracula», «Black Monster Assault».  Два энергетика содержат пороговую концентрацию кофеина, согласно стандарту: «BURN», «Drive me Ориджинал».  В трёх образцах концентрация кофеина превышает допустимую: «Adrenaline Rash» – на 16,3%, «EON» – на 43,98%, «BULLIT» – на 28,59%.  Государственный стандарт не учитывает номинальный объём торговой упаковки энергетических напитков, что позволяет производителям замаскировать нарушения норм ГОСТ.

39 4. Достоверность полученных результатов подтверждается методами разбавлений и стандартных добавок, что показывает высокую эффективность и воспроизводимость методики определения кофеина группы компаний «ЛЮМЭКС».

40 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Машковский М.Д. Лекарственные средства / 16-е изд, перераб., испр. и доп. М.: «Новая волн»,2012. 1216 с. 2. Де Векки Д.А., Москвин А.В., Петров М.Л. Новый справочник химика и технологa. Основные свойства неорганических, органических и элементоорганических соединений. СПб.: АНО НПО «Мир и Семья», 2002. 1280 с. 3. Беликов В.Г. Учебное пособие по фармацевтической химии. М.: «Медицина», 1979. 398 с. 4. Зайцева О.Е. Должны потребители кофеин-содержащих напитков знать фармакокинетику кофеина? // Фундаментальные исследования. 2015. № 1-5. С. 946-952. 5. Ahluwalia N., Herrick K. Caffeine intake from food and beverage sources and trends among children and adolescents in the United States: review of national quantitative studies from 1999 to 2011 // Adv Nutr. 2015. V. 6(1). P. 102– 111. 6. Wierzejska R. Caffeine-common ingredient in a diet and its influence on human health // Rocz Panstw Zakl Hig. 2012. V. 63(2). P. 141–147. 7. Bailey R.L., Saldanha L.G., Gahche J.J., Dwyer J.T. Estimating caffeine intake from energy drinks and dietary supplements in the United States // Nutr Rev. 2014. V. 72. P. 9–13. 8. Хасанов В.В., Слижов Ю.Г. АНАЛИЗ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ НАПИТКОВ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА // Журнал аналитической химии. 2013. Т.68. № 4. С. 385–388. 9. ГОСТ 30059–93. Напитки безалкогольные. Методы определения аспартама, сахарина, кофеина и бензоата натрия. Введ. 1996 –01–01. М.: «Стандартинформ», 2010. 7 с.

41 10. ГОСТ Р 53193-2008. Напитки алкогольные и безалкогольные. Определение кофеина, аскорбиновой кислоты и ее солей, консервантов и подсластителей методом капиллярного электрофореза [Текст]. Введ. 2010– 01–01. М.: «Стандартинформ», 2010. 12 с. 11. Каменцев Я. С., Комарова Н.В., Корашенников А.А. Возможности метода капиллярного электрофореза для контроля качества питьевых, поверхностных, сточных и технологических вод // ЭКВАТЭК-2002: Тез. докл. 5-го Международного конгресса - Москва, 2002. – С. 608–610. 12. Бёккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза / Перевод с немецкого В.С. Курова / Под редакцией А.А. Курановой. М.: «Техносфера», 2009. 472 с. 13. Энгельгардт Х. Руководство по капиллярному электрофорезу / Под редакцией д.х.н. А.М. Волощука. Научный совет по хроматографии. М.: «Наука», 1996. 111 с. 14. Проблемы аналитической химии Т.18: Капиллярный электрофорез / Под редакцией д.х.н. Л.А. Карцовой. М.: «Наука», 2014. 444 с. 15. Хомов Ю.А., Фомин А.Н. Капиллярный электрофорез как высокоэффективный аналитический метод (обзор литературы) [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования. 2012. № 5. URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=6775 (дата обращения: 06.05.2018). 16. Ламоткин С.А. Хроматография и электрофорез. Минск: «БГТУ», 2014. 289 с. 17. Каменцев Я. С., Комарова Н.В. Основы метода капиллярного электрофореза. Аппаратурное оформление в области применения // Аналитика и контроль. 2002. Т.6. №1. С. 13–18. 18. Комарова Н.В., Каменцев Я.С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ». СПб.: ООО «Веда», 2006. 212 с.

42 19. Беленький Б.Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез. СПб.: «Наука», 2009. 314 с. 20. Каменцев Я.Г., Ягов Г.В. Капиллярный электрофорез как аналитический метод. СПб.: ООО «Веда», 2000. 164 с. 21. химия: Вершинин В.И., Власова И.В., Никифорова И.А. Аналитическая учеб. для студ. учреждений высш. проф. образования. М.: «Академия», 2011. 448 с. 22. РМГ 76-2014 ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа. Введ. 2016-01-01. М.: «Стандартинформ», 2015. 110 с. 23. ТР ТС 021/2011. О безопасности пищевой продукции; Утв. Решением № 880 от 09.12.2011 Комиссии Таможенного союза, действ. с 01.07.2013. 24. ГОСТ Р 52844-2007. Напитки безалкогольные тонизирующие. Общие технические условия. Введ. 2009–01–01. М.: «Стандартинформ», 2008. 7 с. 25. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Приложение 1». Введ. 01-09-2002. М.: «Моркнига». 2018. 448 с.

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв