Институт химии Санкт-Петербургского государственного университета
Кафедра химии природных соединений
Направление Химия
Выпускная квалификационная работа
Синтез α-кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино) валериановой
кислоты – регулятора активности NO-синтетазы
Работу выполнил:
студент 4 курса
Марченко Сергей Алексеевич
Научный руководитель:
к. х. н., старший преподаватель
Глуздиков Иван Александрович
Заведующий кафедрой ХПС:
д. х. н., профессор
Трифонов Ростислав Евгеньевич
Санкт-Петербург
2016
Оглавление
1. Перечень условных обозначений ……………………………….…………..…..3
2. Введение .………………………………………………………………………....4
3. Литературный обзор………………………………… ……………………….....5
4. Обсуждение результатов ………………………………………………………11
5. Экспериментальная часть …………………………………………………..….22
6. Выводы ……………………………………………………………………….…27
7. Благодарности …………………………………………………………………..28
8. Список цитированной литературы ……………………………………………29
9. Приложения ………………………………………………………………….…30
2
Перечень условных обозначений
DMVG - α-кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино) валериановая кислота
ADMA – асимметричный диметиларгинин – NG, NG-диметил –L-аргинин
AGXT2 - аланин-глиоксилат аминотрансфераза 2
Arg - аргинин - 2-амино-5-гуанидинпентановая кислота
Orn – орнитин –2, 5-диаминовалериановая кислота
Z-Cl – карбобензоксихлорид
трилон Б – динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
Boc2O – ди-трет-бутил-пирокарбонат
DMAP – 4-диметиламинопиридин
TFA – трифторуксусная кислота
TFAA - ангидрид трифторуксусной кислоты
Sc(OTf)3 - трифторметансульфонат скандия
EDCI - 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид
HOBt – 1-гидроксибензотриазол
3
Введение
В
последние
годы
отмечается
повышенный
интерес
в
отношении
асимметричного диметиларгинина (ADMA) и α-кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино)
валериановой кислоты (DMVG), как фактора риска развития сердечно-сосудистых
заболеваний. Являясь структурным аналогом L-аргинина, ADMA ингибирует
активность всех изоформ синтазы оксида азота, вызывая нарушение механизмов
образования оксида азота в плазме крови и в тканях. В 1992 году было впервые
показано, что увеличение концентрации ADMA приводит к значительному снижению
выработки оксида азота. Известно, что NO играет важную роль в регуляции
сосудистого тонуса. В недавних работах была установлена строгая корреляция между
уровнем ADMA в плазме и частотой развития сердечно-сосудистых заболеваний,
таких как артериальная гипертензия, сахарный диабет, атеросклероз и других. [1]
Также был найден путь трансаминирования ADMA в DMVG с помощью фермента
аланин-глиоксилатаминотрансферазы 2 (AGXT2). Сверхэкспрессия AGXT2 была
исследована на клеточных культурах и на мышах. В итоге была доказана зависимость
концентрации ADMA и концентрации NO. А значит, переход от ADMA к DMVG
также может быть связан с NO-гомеостазом в условиях регуляции AGXT2. [2]
В настоящее время, в доступной нам литературе препаративный синтез DMVG
не описан. В тоже время, при проведении биохимических исследований нарушения
синтеза оксида азота, требуется наличие синтетических образцов в качестве
стандартов сравнения. Целью данной работы является разработка препаративного
метода синтеза DMVG.
На данный момент DMVG получают только ферментативным способом в
небольших
количествах,
поэтому
разработка
эффективной
схемы
синтеза
препаративным способом DMVG является актуальной проблемой.
4
Литературный обзор
Для разработки схемы синтеза ADMA, как одного из производных аргининов,
были проанализированы различные известные способы получения замещенных
аргининов. Так как самым проблемным фрагментом ADMA является гуанидиновая
группа. Поэтому было рассмотрено несколько существующих схем синтеза
гуанилирования, синтеза замещенных аргининов в поисках оптимального варианта
синтеза ADMA.
1. Получение гуанидиновой группы из цианоамидов и аминов:
R1R2NH + H2NCN
1
NH
HClк, 180 0С
1 2
NH2
R R N
2
3
В классическом варианте эту реакцию проводят в жестких условиях, используя
концентрированную соляную кислоту при 180 С. В таких условиях амины
протонируются, и их нуклеофильность падает. Другой вариант использовать кислоты
Льюиса в апротонных растворителях, например AlCl3 в CH2Cl2. K. Tsubokura и
сотрудники оптимизировали этот метод. Они использовали в качестве катализатора
водный раствор Sc(OTf)3 [3]:
NH
R1R2NH + H2NCN
1
Sc(OTf)3 (10 mol%)
2
H2O, 100 0C
1 2
NH2
R R N
3
При использовании пептида (соединение 4), содержащего орнитин, в качестве
амина, можно получить пептид (соединение 6), содержащий аргинин, с выход 56% и
без рацемизации. [3]
5
NH2
HN
H2N
HN
O
O
NH
NH
NH
O
O
O
NH
HO
CH3
O
NHAc
+ H2NCN
O
H3C
Sc(OTf)3 (10 mol%) HO
NH
NH
NH
H2O, 100 0C, 56%
O
NHAc
NH
CH3
O
O
H3C
CH3
CH3
5
4
6
Получение монозамещенных производных аргинина данным способом не
изучено.
Получение
дизамещенных
производных
невозможно,
так
как
интермедиантом реакции является активированный карбодиимид, а в последнем у
атома азота не достаточно валентности для присоединения двух заместителей.
NH
Sc(OTf)3 (10 mol%)
R2NH + H2NCN
7
H2O, 100 0C
+
HN
C
Sc(OTf)3
NH
H2NR
-
8
NH2
R2 N
10
9
2. Получение производных гуанидина c помощью Ph3P и I2:
S
R
1
2
RNCS + R R NH
11
R
NH
12
13
2
Ph3P, I2
N
R
Et3N
1
I
R
1 2
Ph3P
NR R
S
R3R4NH
2
если R = H
R
NR
1
N
C
N
R
16
2
N
R
2
-Ph3P=S
R
4
N
N
15
14
R
1
R
3
17
если R2 H
-Ph3P=S
I
1 2
NR R
или
I
NR
R
N
C
19
R3R4NH
+
R
2
16
N
R
1
18
6
Замещенные гуанидины легко могут быть получены при взаимодействии
арильного изотиоцианата с аминами c помощью системы Ph3P - I2 / Et3N. С2симметричные N,N',N'' замещенные гуанидины (соединение 13) были легко доступны
с использованием арил изотиоцианат и амина в соотношении 1 : 2; в то время как при
последовательном
добавлении
двух
различных
аминов
в
эквимолярных
соотношениях образовывались асимметричные производные (соединение 17). Было
обнаружено, что первичные и вторичные амины реагируют преимущественно с
электронно-акцепторными
арильными
изотиоцианатами,
быстро
образуя
гуанидиновый фрагмент с хорошими выходами в мягких условиях [4].
Реакции c защищенными аминокислотами в качестве исходного амина не описаны.
3. Использование
производных
тиомочевины
и
амина
в
синтезе
монометиларгинина и диметиларгининов
Схема гуанилирования в общем виде:
CH3
S
R2N
R1NH2
S
CH3I
NHR
R2N
20
NHR
1
R
NR2
N
NR
21
22
Хорошо описан способ получения монометиларгинина [5]:
CH3
S
NH4OH 1,5 ч
70 80 C, 3,5 ч, NaOH
-
CS2 + MeNH2*HCl
23
0
MeSCN
66%
MeI 10 мин
H3C
NH
75%
25
24
S
NH2
90%
H3C
O
NH
27
26
OH
*HI
NH
-
Cu(Aс)2 NH4OH
O
NH2 *HCl
O
количественно
NH2
Cu
NH2
NH2
2
28
29
H3C
OH
NH
r. t. 24 ч
(27) + (29)
52%
O
NH
NH
+ Cu(SMe)2
NH2
30
31
7
В этом способе используются доступные реагенты, всего 5 стадий, и
получается хороший выход.
Принцип данных реакций, вероятно, можно использовать и для получения
дизамещенных аргининов, предварительно синтезировав дизамещенную тиомочевину
(соединения 34 и 43), затем метилировать ее и провести реакцию c защищенным
орнитином.
Д. Л. Рахманкуловым и сотрудниками разработана следующая реакция [6]:
S
S
2 O
+
O
+ 2 H2O
H2N
32
pH=4-6, 50 0С, 5 ч
95%
NH2
H3C
NH
33
NH
CH3
+
HO
OH
34
35
Логично предположить, что подобно способу получения монометиларгинина,
возможно получить и симметричный диметиларгинин:
S
H3C
NH
CH3
MeI
NH
CH3
S
37
H3C
36
NH
N
CH3
*HI
CH3
Orn2Cu
r. t. 24 ч
HN
OH
O
N
NH2
38
NH
CH3
39
+ Cu(SMe)2
40
Поскольку целью данной работы является получение асимметричного
диметиларгинина, были рассмотрены следующие реакции.
Вначале была получена 1,1-диметилтиомочевину разработанным ранее методом [7]:
S
NH
H3C
CH3
41
S
1. ТГФ, 50 0С, 2ч
+
N
N
N
N
42
H3C
2. MeOH, NH3 60 ч (52%)
N
NH2
H3C
43
Затем была предположена возможность следующих реакций для получения ADMA:
8
S
S
H3C
N
H3C
CH3
MeI
NH2
H3C
H3C
*HI
N
O
N
NH2
H3C
44
r. t. 24 ч
NH
CH3
N
OH
Orn2Cu
+ Cu(SMe)2
NH2
47
46
45
Но защищенный орнитин не может прореагировать c тиоизоурониевой солью
теоретически ввиду выраженности щелочной среды, в которой практически не
образуется интермедиат реакции – карбодиимид.
4. Использование тиоцитрулина и амина в синтезе замещенных аргининов:
NHBoc
NHBoc
H2N
ZNCS
O
ZHN
1 2
O R R NH, EDCI
NH
CH2Cl2, 0 0С to r. t., 2 ч
S
Ot-Bu
48
CH2Cl2
Ot-Bu
49
+
NH3
NHBoc
ZHN
N
O
тиоанизол, TFA
H2N
R
1
N
R
2
50a-e
Ot-Bu
NH
O
+
30 мин
R
1
CF3COO-
N
R
OH
2
CF3COO51
D. Shade и сотрудники успешно применили эту стратегию для получения
монозамещенных аргининов. [8] В качестве гуанилирующего реагента использовали
защищенный тиоцитрулин. Для получения защищенных аргининов (соединения 50ae) использовали 1,5 эквивалента амина и 1,5 эквивалента EDCI в безводном CH2Cl2
для обеспечения конверсии по тиоцитрулину (соединение 49). Деблокирование
аргинина (соединения 50a-e) проводили в мягких условиях с использованием смеси
TFA и тиоанизола. Далее представлена таблица с выходами замещенного аргинина
(соединения 50a-e):
9
R1
R2
OMe
a
87
OMe
H
89
CH2
H
87
H
89
H
85
H3C
c
H3C
d
H3C
e
(соединение 50), %
H
H3C
b
выход продукта
H3C
CH2
CH
Таблица 1
Вывод
Получение
дизамещенных производных аргинина из цианоамида и амина
оказалось невозможным.
Использование реакций c Ph3P и I2 для получения дизамещенных аргининов не
исключено, но недостаточно изучено.
Использование тиомочевины применимо для получения монометиларгинина и
симметричного диметиларгинина, но не приемлемо для синтеза ADMA.
Реакция c тиоцитрулином представляются наиболее приемлемыми для получения
нужного соединения. Исходя из этого, была разработана схема синтеза ADMA c
использованием тиоцитрулина.
10
Обсуждение результатов
Синтез ADMA состоит из нескольких стадий:
1) Получение медного комплекса орнитина
2) Введение Z-группы
3) Разложение медного комплекса орнитина
4) Введение Boc-группы
5) Введение трет-бутильной группы
6) Удаление Z-группы
7) Получение защищенного тиоцитрулина
8) Получение защищенного асимметричного диметиларгинина
9) Удаление Boc- и трет-бутильной групп
10) Удаление Z-группы
11) Получение α-кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино) валериановой кислоты
Схема синтеза:
O
O
O
OH
O
O
-
H2 N
H2N
H2N
Z-Cl
CuCO3
Trilon B
HN
O
83% (на две стадии)
количественно
O
2+
H2N
H2N
Cu
2
2+
Cu
2
1
2
3
O
O
O
OH
CH3
O
OH
H3 C
H2N
H3 C
Boc2O
O
CH3
H3 C
NH
H3 C
O
CH3
H3 C
NH
CH3
H3 C
Boc2O, DMAP, t-BuOH
HN
O
количественно
CH3
O
O
CH3
O
HN
O
O
H2 Pd/С (10 mol%)
HN
O
количественно
NH
94%
O
O
O
O
O
NH2
H3C
CH3
H3 C
4
5
6
7
11
O
H3C
O
H3 C
H3 C
O
O
H3 C
NH
CH3
H3C
O
CH3
O
CH3
O
CH3
H3C
NH
O
CH3
CH3
HN
Z-NCS, С2Сl4, DB-18-C-6
O
CH3
CH3
H3C
NH
H3C
H3C
CH3
O
O
CH3
O
S
EDCI
HN
32,5%
CH3NHCH3
N
HN
CH3
O
O
O
O
H2 N
N
7
9
8
O
H3C
H3C
O
CH3
CH3
H3C
NH
O
CH3
O
OH
H2N
O
O
OH
OH
O
CH3
CH3
N
N
N
TFA
CH3
52% (за 2 стадии)
HN
N
HN
CH3
O
O
O
H2N
TFAA
H2 Pd/С (10 mol%)
количественно
CH3
N
O
O
H2N
10
9
11
N
31%
CH3
N
N
CH3
H2N
12
1) На первой стадии получали медный комплекс орнитина.
O
O
OH
O
-
H2N
H2N
CuCO3
H2N
2+
H2N
Cu
2
1
2
Карбонат меди брали в 3-кратном избытке, так как, вводя избыток реагентов,
можно провести реакцию до полного завершения. Для увеличения скорости реакции
смесь нагревали до 90 0С. По окончании реакции раствор окрашивается в ярко-синий
цвет.
2) На следующей стадии вводили Z-группу.
12
CH3
O
O
O
O
-
H2N
H2N
Z-Cl
HN
O
O
2+
H2N
Cu
2
2+
Cu
3
2
Реакцию проводили при пониженной температуре, так как Z-Cl разлагается при
комнатной температуре. Также важен контроль pH. В слабощелочной среде
разложение Z-Cl протекает медленно. Полноту протекания реакции проверили c
помощью ТСХ.
3) Далее разлагают медный комплекс трилоном-Б
O
O
-
O
H2 N
OH
H2 N
Trilon B
HN
HN
O
O
O
O
2+
Cu
2
3
4
В качестве растворителя использовали воду, так как медный комплекс
орнитина, трилон-Б и комплекс меди с ЭДТА растворимы, а продукт реакции нет.
4) Постановка Boc-защиты.
13
O
O
OH
OH
H3C
H2N
H3C
O
NH
O
CH3
Boc2O
HN
HN
O
O
количественно
O
O
5
4
В качестве растворителя использовали изопропиловый спирт. Он хорошо
растворяет исходные соединения и смешивается с водой. Реакцию проводили при pH
=8-9, так как в сильнощелочной среде Boc2O разлагается, а в кислой идет
деблокирование защитной группы. После проведения реакции выпал осадок. Его
отфильтровали, а растворитель упарили. После этого добавили гексан, т.к. в нем
хорошо растворяется непрореагировавший Boc2O, а продукт не растворяется. Затем
продукт отфильтровали, промыли гексаном, растворитель упарили. Относительная
чистота 81% (приложение 1).
5) Далее вводили трет-бутильную группу
Использовали методику, указанную в работе K. Takeda и сотрудников [9].
O
H3 C
H3 C
O
CH3
O
OH
H3C
NH
H3C
O
O
5
CH3
Boc2O, DMAP, t-BuOH
HN
O
O
CH3
O
H3C
NH
CH3
O
HN
O
количественно
O
6
14
В качестве растворителя использовали трет-бутиловый спирт, т.к. в нем
хорошо растворимы исходные соединения, реакция протекает быстро и с высоким
выходом. Также он участвует реакции (соединение 17):
O
R
O
O
1
R
O
O
1
O
+
R
R
+
OH
14
13
R2COOH
O
O
2
DMAP
2
R
O
O
1
R
10
O
2
O
R
O
O
O
2
O
16
15
R1OH
17
O
R
2
O R
1
18
При использовании ТГФ время реакции увеличивается в 3-4 раза, а при
использовании метанола реакция идет долго и с маленьким выходом (около 6%) [9]. В
качестве катализатора использовали третичный амин – DMAP. По окончании реакции
раствор желтел, а затем становился коричневым вследствие окисления DMAP. Ход
реакции контролировали с помощью ВЭЖХ. Время удерживания исходного
соединения – 13,5 мин, продукта 16.5 мин, DMAP – 7,5 мин (приложение 2).
6) На следующей стадии удаляли Z- защиту.
O
H3C
H3 C
O
CH3
CH3
O
H3 C
NH
H3C
CH3
CH3
O
O
CH3
O
H2 Pd/С (10 mol%)
HN
O
HN
O
94%
O
NH2
O
H3C
CH3
H3C
6
7
15
Водород получали при смешивании 2н натриевой щелочи с алюминием. В
качестве катализатора использовали палладий на угле (10% Pd / C, 10 массовых %).
Он пирофорен, поэтому в начале его растворили в воде, а затем аккуратно добавили к
раствору защищенного орнитина в метаноле. Ход реакции контролировали с
помощью ВЭЖХ. (Приложение 3) Время удерживания продукта – 15 мин. По спектру
видно, что в полученном растворе много примесей. Поэтому было решено осадить
полученное соединение в виде оксалата. Вначале трет-бутиловый эфир Bocоринитина растворяли в диэтиловом эфире. Осадить не получилось: после
охлаждения большая часть вещества осталась в растворе. Результативным оказалось
перекристаллизация в гексане: после охлаждения выпал оксалат соединения 7.
Имеется хроматограмма после очистки (относительная чистота 76%, приложение 4).
7) Далее получали тиоцитрулин:
Z-Cl + KSCN
19
ZSCN
20
21
O
H3C
O
H3C
H3C
O
CH3
H3C
NH
O
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
NH
O
CH3
Z-NCS, С2Сl4, DB-18-C-6
32,5%
H2N
7
O
O
CH3
O
HN
S
HN
O
O
8
Как было показано в исследованиях A. Jirgensons[10], а также в работах D.
Schade [8] и соавторов предпочтительнее использовать следующие соотношения
реагентов, для того чтобы провести конверсию по ZNCS:
16
ZCl + KSCN
1
:
DB-18-C-6
С2Cl4
3
ZNCS
85%
O
O
O-t-Bu
O-t-Bu
BocHN
BocHN
+
ZNCS
HN
H2N
1,5
S
ZHN
:
1
В качестве катализатора использовали дибензо-18-краун-6. Также можно было
использовать менее гидрофобный 18-краун-6. Катализатор является специфическим
комплексообразователем для ионов калия. При проведении реакции Z-Cl с KSCN в
бензоле без катализатора выход ZNCS не превышает 10%. При использовании
катализатора выход повышается до 20%, а при использовании C2Cl4 в качестве
растворителя до 85%. [8]
На второй стадии получили тиоцитрулин. Протекание реакции контролировали
с помощью ВЭЖХ. Продукт содержал много примесей, поэтому было решено
очистить его на колонке. В качестве сорбента использовали силикагель 40-63 мкм, а в
качестве элюента - смесь петролейного эфира и этилацетата в соотношении 4:1.
Вначале смесь очистили от четыреххлористого этилена (приложение 5). C2Cl4
поглощает с временем удерживания 16,5 мин, а продукт - 17,2 мин, относительная
чистота 44%. Пики находятся рядом, поэтому для разделения необходимо было
использовать слабополярный растворитель, После очистки получили тиоцитрулин c
выходом 32% и относительной чистотой 78% (приложение 6).
8) Стадия получения защищенного асимметричного диметиларгинина:
17
O
H3C
H3C
O
CH3
H3C
NH
O
CH3
O
H3C
H3C
CH3
O
O
CH3
CH3
O
CH3
H3C
NH
O
CH3
HN
CH3NHCH3
S
EDCI*HCl
HN
N
N
HN
O
O
O
8
CH3
O
9
Предполагаемый механизм этой реакции представлен ниже:
Этот механизм предположен по аналогии с механизмом получения амидов
карбодиимидным способом.
18
Реакцию проводили на ледяной бане, так как при комнатной температуре
карбодиимид разлагается. В качестве карбодиимида взяли EDCI, так как он хорошо
растворим в воде. После проведения реакции смесь промывали водой, для удаления
тиомочевины и остатков карбодиимида, Ход реакции контролировали с помощью
ВЭЖХ. На хроматограмме (приложение 7 и 8) пик 6 мин соответствует тиомочевине,
7 мин – HOBt, 14 мин – продукту реакции, 17 мин - исходному веществу.
9 и 10) Далее проводили деблокирование защитных групп:
O
H3C
H3C
O
CH3
CH3
H3C
NH
O
CH3
O
OH
H2N
O
OH
O
CH3
CH3
N
N
CH3
TFA
52% (за 2 стадии)
HN
N
N
HN
O
O
O
CH3
H2N
H2 Pd/С (10 mol%)
количественно
CH3
N
O
N
CH3
H2N
9
10
11
Вначале удаляли Boc и t-Bu группы. Для этого использовали раствор TFA в
CH2Cl2 в соотношении 1: 2. По ВЭЖХ конверсия составила 88% - реакция прошла не
до конца, для достижения полной конверсии исходного соединения использовали
чистую TFA. (приложение 9) Затем продукт был очищен на препаративной ВЭЖХ и
лиофилизирован. Продукт был идентифицирован методом ЯМР 1H и С13 (приложение
11).
Следующая стадия – гидрогенолиз. Проводили реакцию так же, как и на стадии
получения соединения 7.
Для очистки продукт осаждали в виде соли гидрохлорида. Для этого получали
безводную соляную кислоту по следующей реакции:
19
диоксан (сухой)
SOCl2 + H2O
29
2HCl + SO 2
32
31
30
ADMA предварительно высушили, для этого его несколько раз смешивали c
бензолом, а затем упаривали. При смешивании диметиларгинина c HCl в диоксане
ADMA не растворился. После добавления 10 мл MeOH ADMA растворился. При
охлаждении выпал гидрохлорид асимметричного диметиларгинина.
11) Получение α-Кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино) валериановой кислоты (DMVG):
O
O
OH
OH
O
H2N
TFAA
CH3
N
N
31%
CH3
N
N
CH3
CH3
H2N
H2N
11
12
Предварительно ADMA сушили под вакуумом в течение часа при Т =70 C, для
того чтобы избавиться от H2O. Механизм этой реакции не доказан. Klein и соавторы
предположили такой механизм [11]:
R
O
-
O
H2N
(CF3CO2)O
N
F
O
R
F
33
O
R
H2O
O
O
OH- , H+
OH
F
34
35
Для того чтобы получить соединение 35 из 34, добавляли 1н NaOH,
выдерживали 20 мин и доводили pH до 8 трифторуксусной кислотой. Это
оптимальные условия, при которых побочные реакции практически не идут. К таким
выводам пришли Klein и соавторы. [11]
20
В сильнощелочной среде в течение суток проходит циклизация:
H3C
O
-
CH3
O
N
O
N
OH
H3C
-
N
O
NH2
CH3
NH
N
NH
O
O
COO
NH
H3C
N
CH3
36
38
37
Соединение 38 было идентифицировано методом ЯМР (Приложение 12 и 13)
Далее продукт был очищен на препаративной колонке (приложение 14) и
лиофилизирован.
DMVG
была
охарактеризована
методами
ЯМР
и
масс-
спектроскопией (приложение 15, 16 и 17).
21
-
Экспериментальная часть
Ход реакции и относительную чистоту соединений оценивали с помощью
аналитической ВЭЖХ.
Аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили
на
хроматографе
Shimadzu
LC-20AD,
оснащенным
спектрофотометрическим
детектором SPD-M20A. При проведении аналитической ВЭЖХ использовали колонку
YMC Triart-С18-S 3,0 мкм, 2х150мм при скорости потока элюента 0,3 мл/мин. Фаза А:
0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA/ацетонитрил.
Препаративную ВЭЖХ проводили на хроматографе Shimadzu LC-20AP со
спектрофотометрическим детектором SPD-20A при длинах волн 214 и 254 нм и
колонкой YMC Actus-Triart Prep С18-S 15 мкм, 12нм, 50х250мм при скорости потока
элюента 50 мл/мин.
Метод А: градиентный режим 0 мин -5% этанола, 95% вода; 5 мин-5% этанола,
95% вода; 60 мин -50% этанола, 50% вода. Метод B: изократически, 2% EtOH, 98%
H2 O
Спектры ЯМР 1H и 13C получены на спектрометре Bruker Avance 400 (400.1
МГц для 1H, 100.6 МГц для 13C) для растворов в D2O и DMSO-d6
Масс-спектры высокого разрешения с ионизацией методом электроспрея (ESI)
зарегистрированы на спектрометре microTOF 10223 фирмы Bruker.
22
Медный комплекс Nε-карбобензокси – L-орнитина (3)
Навеску монохлоргидрата орнитина (33,72 г, 0,20 моль) растворили в 285 мл воды,
добавили избыток карбоната меди (33 г, 0,27 моль). Смесь кипятили в течение 30
мин., отфильтровали и добавили 78 мл 2н раствора едкого натра. Раствор охладили до
0
0
С и при перемешивании добавляли десятью порциями в течение 30 мин
карбобензоксихлорид (32 мл, 0,22 моль), затем продолжили перемешивать смесь в
течение 2 часов, после чего отфильтровывали, промывали водой, спиртом и
высушили. Выход 49,59 г (83%)
Nε-карбобензокси-L-орнитин (4)
Медный комплекс Nε-карбобензокси – L-орнитина (22,04 г, 0,07 моль) растерли в
ступке с трилоном Б (56,26 г, 0,17 моль) до гомогенности и суспензировали в 300 мл
воды, затем кипятили, перемешивая, в течение 40 мин. Выпадал белый осадок Nεкарбобензокси – L-орнитина. Раствор остудили, осадок отфильтровывали и
промывали водой. Выход 41,12 г (количественно).
Nε-Карбобензокси-Nα-третбутилоксикарбонил-L-орнитин (5)
Nε-Карбобензокси-L-орнитин (41,12 г, 0,15 моль) растворили в изопропиловом спирте
при перемешивании, затем небольшими порциями добавляли ди-трет-бутилпирокарбонат (40,70 г, 0,18 моль) в течение 30 мин, после чего оставляли смесь при
перемешивании на 1 час. Поддерживая pH около 8-9, добавляя 2н растворы NaOH и
NaHCO3. Осадок отфильтровали, растворили в изопропиловом спирте. Отгоняли
изопропиловый спирт на роторном испарителе, затем избыток ди-трет-бутилпирокарбоната экстрагировали гексаном, а водную фазу подкисляли 2н H2SO4 до pH
8.
Продукт
экстрагировали
этилацетатом,
органическую
фазу
промывали
насыщенным раствором NaCl, сушили NaSO4, а этилацетат упаривали на роторном
испарителе. Выход количественный.
трет-Бутиловый эфир Nε-карбобензокси-Nα-третбутилоксикарбонил-L-орнитина
(6)
Nε-Карбобензокси-Nα-третбутилоксикарбонил-L-орнитин
(56,39
г,
0,154
моль)
растворили в 150 мл третбутанола, затем при перемешивании добавили ди-трет23
бутил-пирокарбонат (50,88 г, 0,231 моль). После полного растворения добавляли
небольшими порциями раствор 4-диметиламинопиридина (5,64 г, 0046 моль) в 100 мл
третбутанола. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов.
После удаления органического растворителя в вакууме остаток растворили в 250 мл
этилацетата, промыли водой, 2н H2SO4, водой, NaHCO3, водой и сушили Na2SO4.
Этилацетат удалили на роторном испарителе. Выход количественный.
трет-Бутиловый эфир Nα-третбутилоксикарбонил-L-орнитина (7)
Навеску
трет-бутилового
эфира
Nε-карбобензокси-Nα-третбутилоксикарбонил-L-
орнитина (10 г, 0,035 моль) растворили в 80 мл метанола, применив палладиевый
катализатор (10% / C, 1 г, 10 массовых процентов), и гидрировали в течение 3 часов
при комнатной температуре, контролируя ход реакции деблокирования по ТСХ
(бензол-ацетон, 2:1). После окончания реакции катализатор отфильтровали на целите545, промыли метанолом, растворитель упарили на роторном испарителе. Для
дополнительной очистки полученное соединение перекристаллизовали.
Трет-бутиловый эфир Nα-третбутилоксикарбонил-L-орнитина растворили в гексане и
добавили щавелевую кислоту (0,92 г). Полученный осадок отфильтровали, промыли
гексаном и оставили сушиться при комнатной температуре. Выход 7,06 г (94%)
Карбобензокси изотиоцианат (21)
Подготовка KCSN:
Роданид калия (12,2 г) растворили при нагревании в 95 мл этанола, к полученному
раствору добавили 460 мл диэтилового эфира. Осадок отфильтровали и высушили.
Очищенный роданид калия (10,38 г, 0,107 моль) суспензировали в 60 мл
четыреххлористого этилена. Затем добавили карбобензоксихлорид (5,1 мл, 0,036
моль)
и дибензо-18-краун-6 (0,64 г, 0,002 моль). Реакцию проводили при
перемешивании на масляной бане (Т=850С). Оставляли на ночь. После окончания
реакции смесь охладили, отфильтровали. Осадок промыли четыреххлористым
этиленом. Выход 10,38 г (85%)
трет-Бутиловый
эфир
Nε-карбобензокси-Nα-третбутилоксикарбонил-L-
тиоцитрулина (8)
24
Приготовили раствор диизопропилэтиламина (3,56 мл, 0,02 моль) в CH2Cl2, затем
добавили оксалат трет-бутилового эфира Nα-третбутилоксикарбонил-L-орнитина
(6,76 г, 0,01 моль). После этого колбу охлаждали льдом и через капельную воронку
добавляли в течение часа раствор карбобензокси роданида в C2Cl4. Окончание
реакции контролировали c помощью ТСХ (бензол-ацетон 4:1). Полученный раствор
промыли водой, высушили Na2SO4, растворитель упарили на роторном испарителе.
Продукт очистили на колоночной хроматографии (сорбент - силикагель 40-63, элюент
- петролейный эфир-этилацетат 4:1). Выход 3,16 г (32,5%).
трет-Бутиловый эфир Nε-карбобензокси-Nα-третбутилоксикарбонил-NG,NGдиметил L-аргинин (9)
В
100
мл
CH2Cl2
растворили
трет-бутиловый
эфир
Nε-карбобензокси-Nα-
третбутилоксикарбонил-L-тиоцитрулина (3,12 г, 0,0065 моль), затем добавили
диметиламмонийную соль гидроксибензотриазола (11,4 мл, 0,013 моль). При
охлаждении льдом и перемешивании добавили 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)
карбодиимид (2,48 г, 0,013 моль) и N-метилморфолин (2,1 мл, 0,0195 моль).
Контролировали ход реакции c помощью ВЭЖХ. После окончания реакции раствор
промыли водой, 0,5н H2SO4, водой, NaHCO3, водой. Сушили Na2SO4, в последующем
растворитель упарили. Выход 3,16 г (32%).
Nε-Карбобензокси -NG,NG-диметил L-аргинин (10)
Приготовили смесь TFA – CH2Cl2 2:1 (20мл: 10 мл), затем добавили трет-бутиловый
эфир
Nε-карбобензокси-Nα-третбутилоксикарбонил-NG,NG-диметил
L-аргинина.
Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, контролируя
окончание реакции на ВЭЖХ. После чего добавили 100 мл метил-трет-бутилового
эфира. Продукт выпадал в осадок, его отфильтровали, очистили c помощью
препаративной ВЭЖХ (метод А) и лиофилизировали. Выход 1,14 г (52% на 2 стадии)
1
H ЯМР (400 MHz, DMSO) δ=4,00 [m, 4H, β и γ -CH2], 2,93 [s, 6H, NMe2], 3,15 [t, 2H, δ-
CH2], 3,63 [t, 1H, α-CH], 5,04 [s, 2H, CH2Ph], 5,08 [m, 5H, Ph].
25
13
С ЯМР (100,6 MHz, DMSO) δ=25.36 (γ-CH2), 28,14 (β-CH2), 38,98 (2C, NMe2), 42,97
(δ-CH2), 52,91 (С гуанид.), 66,62 (α-CH), 128,06 128,09 128,77 (5C, Ph), 138,05 (Ph),
155,88 [CO( Z)], 158,80 [CO2 (Z)], 174,42 (CO2).
NG,NG-Диметил L-аргинин (11)
Nε-Карбобензокси-NG,NG-диметил L-аргинин растворили в 50 мл метанола, прибавляя
палладиевый катализатор (10% / C, 1 г, 10 массовых процентов), и пропускали ток
водорода
2
часа
при
комнатной
температуре,
контролируя
ход
реакции
деблокирования ТСХ (вода - бутанол –уксусная кислота - этилацетат, 1:1:1:1). После
окончания реакции катализатор отфильтровали на целите-545, промыли метанолом,
растворитель упарили на роторном испарителе. Выход количественный 0,68 г.
Гидрохлорид NG,NG-диметил L-аргинина
Приготовили безводную HCl, для этого смешали тионилхлорид (0,28 мл, 0,0034 моль)
с водой (0,061 мл, 0,0034 моль) в сухом диоксане (10 мл). Полученную смесь
добавили к раствору NG,NG-диметил L-аргинина (0,68 г, 0,0034 моль) в 10 мл сухого
диоксана и 10 мл метанола, затем растворитель упарили, а гидрохлорид NG,NGдиметил L-аргинина сушили. Выход 1,07 г (67%)
α-Кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино) валериановая кислота (12)
Предварительно NG,NG-диметил L-аргинин сушили при Т=70 0С в течение 1 часа.
Затем добавили ангидрид трифторуксусной кислоты (7 мл)
и кипятили 3 часа.
Полученную смесь охладили до -17 0С, добавили 50 мл 1н NaOH, через 20 мин
добавляли 0,5н раствор трифторуксусной кислоты по каплям до pH=8. После чего
лиофилизировали, очищали на препаративной колонке. (метод B) Затем еще раз
лиофилизировали. Выход 280 мг (31%)
1
H ЯМР (300 MHz, D2O) δ=1,74 [m, γ-CH2], 2,69 [t, 2H, δ-CH2], 2,86 [s,6H, NMe2,], 3,11
[t, 2H, β –CH2], 4,69 [s, 3H, NH3,].
13
С ЯМР (75 MHz, CDCl3) δ=22,35 (β-CH2), 36,55 (2C, NMe2), 38,26 (γ-CH2), 41,44 (δ -
CH2), 156,28 (С гуанид.), 170,72 (CO2), 206,47 (CO).
MS (ESI): m/z = 202 [M+H+], 224 [M+Na], 240 [M+K].
26
Выводы
1. Предложена схема синтеза α-кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино) валериановой
кислоты.
2. Осуществлен
синтез
α-кето-δ-(NG,NG-диметилгуанидино)
валериановой
кислоты по предложенной схеме.
27
Благодарности
Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, к. х. н.
Глуздикову Ивану Александровичу за постановку задачи и постоянное руководство
работой, а также Никольскую Софью Константиновну за неоценимый вклад в работу.
Выражаю также благодарность компании ООО «Пептидные технологии» за
предоставленную возможность выполнения ВКР, ресурсному центру СПбГУ
«Методы анализа состава вещества» за помощь в проведении исследований и
Селиванову Станиславу Ивановичу за съемку ЯМР спектров.
28
Список литературы
1)
Р. Родионов, И. Блхин, М. Галагудза, Е. Шляхто, C. Лентц; Артериальная
гипертензия, 2008, 14, 4, 306-314.
2)
J. Martens-Lobenhoffer, R. N Rodionov, A. Drust, S. M. Bode-Boger; Analytical
biochemistry, 2011, 419, 234-240.
3)
K. Tsubokura; I. Takayuki; T. Misako; K. Almira; F. Koichi; N. Yoichi; T.
Katsunori; Synlett 2014; 25(09), 1302-1306.
4)
S. Wangngae, M. Pattarawarapan, W. Phakhodee; Synlett 2016, 27, 1121-1127.
5)
M. Abou-Gharbia, W. K. Paik, D. Swern Journal of labelled compounds and
radiopharmaceuticals; 1980, vol. XVIII (6), 777-779.
6)
Д. Л. Рахманкулов, Н. Е. Максимова, Е. А. Кантор, А. М. Сыркин; патент СССР
591462, 1978 год.
7)
Патент RU 2 419 619 C2
8)
D. Schade, J. Kotthaus, B. Clement; synthesis 2008; 15; 2391-2397.
9)
K. Takeda, A. Akiyama, H. Nakamura, S. Takizawa, Y. Mizuno, H. Takayanagi, Y.
Harigaya; Synthesis 1994; 1994(10), 1063-1066.
10)
A. Jirgensonsa, I. Kumsa, V. Kaussa , I. Kalvinsa ; synthetic communications
1997;27 (2); 315-322.
11)
C. Klein, G. Schulz, W. Steglich; Leibigs Ann. Chem., 1983, 1623-1637.
29
Приложения
Приложение 1
O
H3 C
H3C
O
CH3
OH
NH
O
HN
O
O
5
30
Приложение 2
O
H3 C
H3 C
O
CH3
O
OH
H3C
NH
H3C
O
O
5
CH3
Boc2O, DMAP, t-BuOH
HN
O
O
CH3
O
H3C
NH
CH3
O
HN
O
количественно
O
6
31
Приложение 3
O
H3 C
H3 C
O
CH3
CH3
O
H3 C
NH
CH3
H3C
CH3
O
O
CH3
O
H2 Pd/С (10 mol%)
HN
O
NH
94%
O
O
O
NH2
H3C
CH3
H3 C
6
7
32
Приложение 4
H3C
CH3
O
CH3
O
NH
O
O
NH2
H3C
CH3
H3C
7
33
Приложение 5
O
H3C
O
H3C
H3C
O
CH3
H3C
NH
O
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
NH
O
CH3
Z-NCS, С2Сl4, DB-18-C-6
32,5%
H2N
7
O
O
CH3
O
HN
S
HN
O
O
8
34
Приложение 6
O
H3C
H3C
O
CH3
CH3
O
CH3
H3C
NH
O
HN
S
HN
O
O
8
35
Приложение 7
O
H3C
H3C
O
CH3
H3C
NH
O
CH3
O
H3C
H3C
CH3
O
O
CH3
CH3
O
CH3
H3C
NH
O
CH3
HN
EDCI*HCl
HN
N
N
HN
CH3
O
O
O
8
CH3NHCH3
S
O
9
36
Приложение 8
O
H3C
H3C
O
CH3
CH3
O
CH3
H3C
NH
O
CH3
N
N
HN
CH3
O
O
9
37
Приложение 9
O
OH
H2N
CH3
N
N
HN
CH3
O
O
10
38
Приложение 10
O
OH
H2N
CH3
N
N
HN
CH3
O
O
10
39
Приложение 11
O
OH
H2N
CH3
N
N
HN
CH3
O
O
10
O
OH
H2N
CH3
N
N
HN
CH3
O
O
10
40
Приложение 12
OH
N
COO
-
NH
H3C
N
CH3
38
41
Приложение 13
H3C
O
-
CH3
N
O
N
NH2
O
36
OH
N
COO
-
NH
H3C
N
CH3
38
42
Приложение 14
OH
NH2
CH3
O
N
N
CH3
O
12
43
Приложение 15
OH
NH2
CH3
O
N
N
CH3
O
12
44
Приложение 16
OH
NH2
CH3
O
N
N
CH3
O
12
45
Приложение 17
OH
NH2
CH3
O
N
N
CH3
O
12
46
Отзывы:
Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв