Варианты ответа нейтрофильных гранулоцитов на иммунотропные препараты у больных вторичным иммунодефицитом по НСТ-тесту

Анастасия Савилова

Варианты ответа нейтрофильных гранулоцитов на иммунотропные препараты у больных вторичным иммунодефицитом по НСТ-тесту

За последнее время в связи с возросшим числом неблагоприятных факторов внешней среды произошло значительное увеличении лиц с вторичными иммуннодефицитными состояниями (ВИС). Важное место в комплексном лечении ВИС отводится иммунокоррегирующей терапии. Разнообразие клинических форм вторичных иммунодефицитов делает необходимым проведение корректного анализа влияния иммунотропных препаратов на функциональную активности нейтрофилов, который может способствовать назначению корректной лекарственной терапии. В последние годы фотометрический тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ – тест) стал одним из важных методических подходов ввиду упрощения его постановки и большей надежности по сравнению с визуальным НСТ- тестом. Тест отражает суммарную продукцию активных форм кислорода нейтрофилами. Целью нашего исследования явилось изучение влияние иммунотропных препаратов на активность нейтрофильных гранулоцитов (нейтрофилов) периферической крови с помощью фотометрического НСТ-теста. В задачи исследования входило оценить влияние иммунотропных препаратов показатели НСТ-теста, сравнить влияние препаратов внутри групп колониестимулирующих факторов и интерферонов/индукторов интерферонов Для исследования были выбраны следующие препараты: альфа-глутамил-триптофан, тимуса экстракт, интерферон альфа-2b и меглюмина акридонацетат. Было проведено сравнительное исследование эффекта иммунотропных препаратов на кислородзависимую бактерицидность нейтрофилов у 1068 больных вторичными иммунодефицитами по НСТ-тесту в цельной крови in vitro. Оценивали спонтанный и индуцированный Staphylococcus aureus НСТ-тест, рассчитывали индекс стимуляции (ИС) нейтрофилов – отношение показателей индуцированного НСТ-теста к показателю «покоящихся» клеток – спонтанного НСТ-теста. Предварительно проводили инкубацию крови с исследуемыми препаратами в течение 30 минут при 37 oС. В связи с существенным разбросом показателей теста, для дальнейшего анализа полученных данных, при изучении обеих пар препаратов было целесообразно разделить пациентов на три группы. У пациентов исходными значениями спонтанного, индуцированного НСТ-теста и ИС ниже нормы, все исследуемые препараты, за исключением меглюмина акридонацетата достоверно нормализовали показатели активности нейтрофилов. В группе пациентов с исходно нормальными показателями НСТ- теста, только интерферон альфа-2b и меглюмина акридонацетат оказывали на него достоверное влияние, незначительно снижая спонтанную активность нейтрофилов. В группе пациентов с изначально повышенной активностью нейтрофилов, интерферон альфа-2b и меглюмина акридонацетат достоверно влияли только на ИС нейтрофилов, в то же время, колониестимулирующих факторы нормализовали все показатели теста. Таким образом, все выбранные нами иммунотропные препараты вызывают сравнимое друг с другом нормализующее влияние на изначально высокоактивные нейтрофилы, а также, умеренное повышение активности исходно низкоактивных нейтрофилов. При этом, интерферон альфа-2b и меглюмина акридонацетат в отличии от других исследованных препаратов вызывал небольшое снижение исходно нормальной активности нейтрофилов, что демонстрирует важность предварительной индивидуальной in vitro диагностики при терапии иммунокоррегирующими препаратами.

Общие и комплексные проблемы естественных и точных наук

Дипломы

Вуз: Московский физико-технический институт (государственный университет) (МФТИ)

ID: 57a8f93a5f1be72d7451605e

UUID: d14244d0-3fdc-0134-8323-525400003e20

Язык: Русский

Опубликовано: больше 8 лет назад

Просмотры: 863

27.26

Анастасия Савилова

Московский физико-технический институт (государственный университет) (МФТИ)

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 0 байт

Поделиться работой

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)» Факультет биологической и медицинской физики Кафедра молекулярной медицины На правах рукописи УДК 615.273.3 Варианты ответа нейтрофильных гранулоцитов на иммунотропные препараты у больных вторичным иммунодефицитом по НСТ-тесту Магистерская диссертация Направление подготовки 030401 Прикладные математика и физика Магистерская программа 010982 Физико-химическая биология и биотехнология Заведующий кафедрой Говорун Вадим Маркович, д.б.н., профессор, член-корр. РАН / Научный руководитель ____ _ / Дидковский Николай Антонович, д.м.н., профессор / ____ _ / Научный консультант Говорун Вадим Маркович, д.б.н., профессор, член-корр. РАН / Студент ____ _ / Савилова Анастасия Григорьевна / г. Москва 2015 ____ _ /

1. ОГЛАВЛЕНИЕ 1. ОГЛАВЛЕНИЕ………………………….......……………...……...……2 2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ…………………………………………………...……4 3. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………..…………………………………6 4. ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………...……7 4.1 Актуальность проблемы…………………………………………...7 4.2 Цель работы………………………………………………………...9 4.3 Задачи работы………………………………………………………9 5. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………..11 5.1 Вторичные иммунодефицитные состояния……………………..11 5.2 Хронические воспалительные заболевания……………………..15 5.3 Нейтрофилы……………………………………………………….17 5.4 Иммунотропные препараты……………………………………...19 5.4.1 Антиоксиданты……………………………………………...19 5.4.2 Тимомиметики………………………………………………21 5.4.3 Интерфероны/индукторы интерферонов………………….22 6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………...........24 6.1 Характеристика пациентов………………………………………24 6.2 Приборы и материалы ……………………………………………24 6.3 Растворы и реактивы……………………………………………..25 6.4 Определение восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами спектрофотометрически (НСТ-тест) ……….....26 2

6.5 Статистическая обработка результатов…………………………29 7. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………...30 7.1 Влияние антиоксидантов на функциональную активность нейтрофилов………………………………………………………30 7.2 Влияние тимомиметиков на функциональную активность нейтрофилов………………………………………………………34 7.3 Влияние интерферонов/индукторов интерферонов на функциональную активность нейтрофилов…………………….39 8. ВЫВОДЫ……………………………………………………………...45 9. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ…………………46 3

2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Вторичные иммунодефицитные состояния — нарушения иммунной системы, развивающиеся в позднем постнатальном периоде или у взрослых, не являющиеся результатом генетических дефектов. Нейтрофилы — сегментоядерные и палочкоядерные нейтрофильные гранулоциты. НСТ-тест — фотометрический тест восстановления нитросинего тетразолия. Спонтанный НСТ-тест — НСТ-тест проводящийся с в цельной крови Индуцированный НСТ-тест — НСТ-тест проводящийся в цельной крови с нейтрофилами, активированными убитой автоклавированием культурой S.aureus в концентрации 1 млн/мл Индекс активации нейтрофилов, индекс стимуляции — отношение показателя, индуцированного НСТ-теста к показателю спонтанному НСТтеста (для одного и того же пациента) Контроль, изначальное значение — значение показателей НСТ-теста, таких как спонтанный НСТ-тест, индуцированный НСТ-тест, индекс активации нейтрофилов, без воздействия лекарственного препарата. Полиоксидоний® — торговое название лекарственного препарата, содержащего азоксимера бромид Имунофан® — торговое название лекарственного препарата, содержащего аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин 4

Глутоксим® — торговое название лекарственного препарата, содержащего глутамил-цистеинил-глицин динатрия Тимоген® — торговое название лекарственного препарата, название лекарственного препарата, название лекарственного препарата, лекарственного препарата, содержащего альфа-глутамил-триптофан Тактивин® — торговое содержащего тимуса экстракт Интрон-А® — торговое содержащего интерферон альфа-2b Циклоферон® — торговое название содержащего меглюмина акридонацетат 5

3. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИДС — вторичное иммунодефицитное состояние ЖКТ — желудочно-кишечный тракт СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита ХВЗ — хроническое воспалительное заболевание АОЗ — антиоксидантная защита НАДФH — восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат АФК — активные формы кислорода ОРЗ — острое респираторное заболевание НФ — нейтрофил УФ-излучение — ультрафиолетовое излучение НСТ-тест – тест восстановления нитросинего тетразолия сНСТ — спонтанный НСТ-тест иНСТ— индуцированный убитой автоклавированием культурой S.aureus (в концентрации 1 млн./мл) НСТ-тест ИС – индекс активации нейтрофилов ДМСО — диметилсульфоксид PBS — фосфатно-солевой буфер 6

4. ВВЕДЕНИЕ 4.1. Актуальность проблемы Иммунная система сложнейшая защитная система животных и человека, обеспечивающая многоступенчатую защиту от окружающих его повреждающих агентов. За последнее время на фоне ухудшающейся экологической ситуации зарегистрировано увеличение числа пациентов с соматическими и онкологическими заболеваниями, сопровождающимися развитием иммунодефицита. Вторичные иммунодефицитные состояния (ВИДС) являются, вероятно, мультифакториальными по своему происхождению. Большая роль отводится неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды на организм человека, в зоне экологического неблагополучия, каждый 10 житель имеет ту или иную разновидность иммунодефицита [1]. Известно, что у людей старшего возраста происходит ослабление иммунитета вследствие инволюции тимуса [2]. Таким образом, увеличение продолжительности жизни и доли старшего поколения в популяции [3] также влечет за собой абсолютное увеличение количества случаев ВИДС. Широкая распространенность ВИДС, отсутствие четких лабораторных критериев диагностики и знания узловых звеньев патогенеза ВИДС затрудняют их своевременное выявление и лечение. [4]. Несостоятельность иммунной системы ведет к развитию хронического инфекционного синдрома, а также возникновению аллергии, псевдоаллергии, аутоиммунных заболеваний, онкопатологий, в том числе 7

лимфопролиферативных заболеваний, что в свою очередь значительно ухудшает качество жизни отдельно взятого человека. В связи с этим особую актуальность приобретает изучение препаратов, способных скорректировать действие иммунной системы таким образом, чтобы она восстановила свое нормальное функционирование. Несмотря на большое разнообразие иммунокорректоров до сих пор чаще всего их назначение основывается лишь на данных иммунограммы, отражающей какие звенья иммунной системы несостоятельны у данного пациента, и общей клинической картины заболевания, которое явилось причиной возникновения ВИДС, но каждый организм реагирует на любое лекарственное средство с присущей ему индивидуальностью. Вследствие этого нередки в практике применения иммунокорректоров случаи, когда они либо совсем не оказывают воздействия, либо же являются причиной тяжелых осложнений, обусловленных развитием дисфункции иммунной системы, избыточного воспалительного процесса, интоксикации и существенно ухудшают прогноз болезни. Всё это ведет к дискредитации иммунокоррегирующих препаратов и отказу от их включения в комплексную терапию болезней, протекающих на фоне клинических признаков ВИДС, несмотря на то, что на сегодняшний день можно считать установленным, что ни при одном из патологических состояний, сопровождающегося приобретенной вторичной иммунной недостаточностью, лечение не может проводится адекватно без применения иммунокоррегирующих препаратов 8

[5]. Отказ от иммунотерапии ведет к значительному ухудшению протекания основного заболевания и подчас является причиной его затяжного лечения [6]. Исходя из вышесказанного, становится очевидным, что в настоящее время необходим простой в исполнении, недорогой и достоверный метод, который позволит оценить индивидуальную чувствительность пациента к тому или иному препарату с целью дальнейшего назначения эффективной иммунокоррегирующей терапии. В последние годы фотометрический тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ – тест) получил распространение в клинической практике и научных исследованиях как в России [7, 8, 9, 10], так и за рубежом [11, 12], и стал одним из важных методических подходов ввиду экономичности, упрощения постановки и большей надежности по сравнению с визуальным НСТ – тестом [13, 14]. НСТ – тест в фотометрической постановке, за счет использования иммунологических планшетов, позволяет исследовать действие нескольких препаратов, а также различных доз для нескольких пациентов одновременно. Тест отражает суммарную продукцию активных форм кислорода нейтрофилами и позволяет оперативно оценить изменение активности нейтрофилов периферической крови пациентов с ВИДС в ответ на воздействие на них иммунотропных препаратов. Изучение влияния иммунотропных препаратов на функциональную активность нейтрофилов у больных ВИДС, представляется важным также для выявления новых 9

возможностей их применения, расширения показаний. Таким образом, изучение влияние иммунотропных препаратов на активность нейтрофилов in vitro представляет значительный научный и практический интерес. 4.2. Цель работы Изучить влияние иммунотропных препаратов различных групп на функциональную активность нейтрофилов периферической крови пациентов, страдающих ВИДС с помощью фотометрического НСТ-теста. 4.3. Задачи работы 1. По данным НСТ-теста изучить влияние иммунотропных препаратов-антиоксидантов на спонтанную и индуцированную кислородзависимую бактерицидность нейтрофилов у больных, страдающих ВИДС. 2. По данным НСТ-теста Изучить влияние фармакологических препаратов интерферонов/индукторов интерферонов, на показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста у больных, страдающих ВИДС. 3. Изучить с помощью НСТ-теста воздействие тимомиметиков, на спонтанную и индуцированную кислородзависимую бактерицидность нейтрофилов у больных, страдающих ВИДС. 4. Определить значение различных показателей НСТ-теста – сНСТ, иНСТ, ИС – для оценки эффективности иммунотропной терапии. 10

5. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5.1. Вторичные иммунодефицитные состояния Проблема диагностики и лечения иммунодефицитных состояний является в настоящее время чрезвычайно актуальной для клинической медицины. Это обусловлено тем, что в последние годы накопилось большое количество новых сведений о строении и функционировании иммунной системы человека, иммуномодулирующая терапия стала активно внедряться в практику не только врачей иммунологов, но и врачей других специальностей, появилось множество новых иммуномодулирующих препаратов, увеличилось число нозологических форм, в лечении которых применяются иммунотропные средства. Все иммунодефицитные состояния принято разделять на первичные и вторичные. Первичные иммунодефициты — это врожденные заболевания, обусловленные дефектами генов, контролирующих иммунный ответ; при этом дефект может затрагивать один или несколько компонентов системы иммунитета: клеточный и гуморальный иммунитет, фагоцитоз, систему комплемента. параметров. Для них Клинически рецидивирующими характерны первичные инфекционными стойкие нарушения иммунодефициты заболеваниями, иммунных проявляются склонностью к аутоиммунной патологии, опухолевым заболеваниям. Эти иммунодефициты дебютируют, как правило, в раннем детском возрасте. 11

Вторичными иммунодефицитными состояниями называют нарушения иммунной системы, развивающиеся в позднем постнатальном периоде или у взрослых, не являющиеся результатом генетических дефектов. Клиническими признаками ВИДС являются хронические, часто рецидивирующие, традиционными любой вялотекущие, средствами локализации, трудно поддающиеся инфекционновоспалительные вызванные оппортунистическими лечению заболевания или условно патогенными микроорганизмами, а также патогенной флорой с атипичными биологическими свойствами и/или множественной устойчивостью к антибиотикам. Выделяют три формы ВИДС: приобретенную, индуцированную и спонтанную. Наиболее типичной приобретенной формой вторичного иммунодефицита является СПИД, развивающийся в результате поражения лимфоидной ткани человека вирусом. При спонтанной форме вторичного иммунодефицита явную причину нарушения иммунной реактивности выявить не удается (в ряде случаев это связано с недостаточными диагностическими возможностями современной клинической медицины). Факторы, способные вызвать индуцированный вторичный иммунодефицит, весьма разнообразны. ВИДС может быть вызвано как факторами внешней среды, так и внутренними факторами организма, например, рецидивирующие бактериальные, грибковые, вирусные инфекции различной локализации, аллергопатология (атопический дерматит, 12

бронхиальная астма, поллиноз, экзема с инфекционным синдромом), аутоиммунная патология, новообразования разной локализации; болезни крови, патология ЖКТ, патология эндокринной системы, старение, хирургические вмешательства, травмы; нарушения питания, цитостатическая терапия. [15]. В целом, все неблагоприятные факторы окружающей среды, способные нарушить обмен веществ организма, могут стать причиной развития ВИДС. К наиболее распространенным факторам окружающей среды, вызывающим иммунодефицит, относятся загрязнения окружающей среды, ионизирующее и СВЧ-излучение, острые и хронические отравления [16], длительный прием некоторых лекарственных препаратов, хронический стресс и переутомление. [17] Общей чертой описанных выше факторов является комплексное негативное воздействие на все системы организма, в том числе и на иммунную систему. Кроме того, такие факторы, как ионизирующее излучение, оказывают избирательное ингибирующее действие на иммунитет, связанное с угнетением системы кроветворения. Люди, проживающие или работающие в условиях загрязненной окружающей среды, чаще болеют различными инфекционными онкологическими болезнями заболеваниями [18]. Очевидно, и что чаще такое страдают повышение заболеваемости у этой категории людей связано со снижением активности иммунной системы. 13

Состояние формирования иммунной системы инфекционной имеет большое резистентности. значение Главная для задача противоинфекционной системы защиты — элиминировать инфекционные агенты, сохранив память о них (лимфоциты памяти) для более быстрого и эффективного реагирования в случае повторного заражения. Развитие хронического заболевания свидетельствует о том, что в сложной системе защиты организма есть сбои в функционировании. При инфицировании факторы естественной резистентности включаются мгновенно и на ранних этапах являются практически единственными защитниками организма. Только через 2–3 недели начинают функционировать элементы специфической защиты. В динамике развития заболевания эти две составляющие защитной реакции организма (врожденный и приобретенный иммунитет) функционируют параллельно, дополняя и усиливая друг друга [2]. Диагностика ВИДС в клинической практике очень важна, поскольку наличие иммунодефицита диктует необходимость применения иммунотропных препаратов для получения максимального терапевтического эффекта. Количество клинических ситуаций, в которых оправданно включение иммуномодуляторов в состав комплексной терапии пациентов, довольно велико [19, 20]. 14

5.2. Хронические воспалительные заболевания Среди хронических воспалительных заболеваний (ХВЗ) наиболее распространенными являются респираторные заболевания; их осложнения и хронизации до настоящего времени наносят существенный ущерб здоровью населения и экономике стран во всем мире. Патогенез респираторных заболеваний слагается из комплекса процессов, развивающихся на всех этапах репродукции возбудителей и их распространения в организме, а также процессов, развивающихся при взаимоотношении возбудителей с защитными системами хозяина, то есть с компонентами врожденного и приобретенного иммунитета. На внедрение возбудителя организм отвечает сложной системой защитно- приспособительных реакций, направленных на ограничение его репродукции и последующую элиминацию, а в конечном итоге, на полное восстановление возникающих структурно-функциональных нарушений. На раннем этапе наблюдается увеличение числа лимфоцитов, особенно нейтрофилов в очаге воспаления, и усиление их фагоцитарной активности, сопровождающейся перестройкой метаболизма клеток: увеличение ионной проницаемости клеточной мембраны, усиление окисления глюкозы и резкое в десятки раз - возрастание потребления кислорода, сопровождающееся гиперпродукцией свободных радикалов, в том числе генерации супероксид анион-радикала О2-, галогенов, Н2О2. Выраженность клинических симптомов заболевания определяется степенью активности иммунных реакций. 15

Повышение кислородозависимого метаболизма, с одной стороны, представляет собой проявление защитных реакций, но с другой – длительная активация нейтрофилов с накоплением большого количества свободных радикалов, особенно генерации супероксиданион радикала О2, может привести к их повреждающему действию на ткани, в том числе и на сами фагоциты, приводить к осложнениям [21]. В реакциях, протекающих с участием свободных радикалов, усиливаются процессы перекисного окисления липидов, протеолипидов, белков клеточных структур и даже нуклеиновых кислот. Запускается процесс нарушения липидного слоя клеточных мембран эпителия верхних отделов респираторного тракта и легких, его сурфактантного слоя, нарушаются матричные и барьерные свойства внутриклеточных мембран, увеличивается их проницаемость и развивается дезорганизация жизнедеятельности клетки вплоть до ее гибели. Разрушительному действию свободных радикалов и образующихся при этих химических превращениях перекисных соединений препятствует сложная многокомпонентная буферная система антиоксидантной защиты (АОЗ), которая снижает скорость их образования, прерывает цепные реакции, уменьшает концентрацию продуктов их трансформации, тем самым предотвращая развитие болезни. Чрезмерная активация свободнорадикальных процессов может привести к истощению АОЗ, а уменьшение емкости антиоксидантной системы неизбежно отразится на 16

развитии инфекционного процесса [22], что говорит о важности правильно подобранной терапии, в том числе, иммунокоррегирующей. 5.3. Нейтрофилы. Нейтрофильные сегментоядерные лейкоциты (нейтрофильные гранулоциты, или нейтрофилы) — преобладающая популяция белых клеток крови. В крови человека содержится 2,0–7,5×109/л нейтрофилов, что составляет 50–70% от общего числа лейкоцитов крови; также в крови присутствует некоторое количество (0,04–0,3×109/л, т.е. 1–6%) палочкоядерных форм нейтрофилов, не завершивших созревание. Ядро таких клеток не сегментировано. Диаметр нейтрофилов составляет 9–12 мкм. Им свойственна уникальная морфология: ядро сегментированное (обычно состоит из 3 сегментов) (гетерохроматином); с цитоплазма плотно упакованным содержит нейтральные хроматином (по данным окрашивания) гранулы, что и определяет название этих клеток. Наибольшее своеобразие свойственно гранулам нейтрофилов. Различают 4 разновидности гранул этих клеток: азурофильные (первичные), специфические (вторичные), желатиназные (третичные) и секреторные везикулы. Специфические гранулы содержат ферменты, проявляющие значениях свою рН: специфических активность лактоферрин, гранулах при нейтральных щелочную содержится и фосфатазу, большое слабощелочных лизоцим, количество в фермента НАДФН-оксидазы, катализирующего «кислородный взрыв» и образование 17

активных форм кислорода — главных факторов бактерицидности фагоцитов. Азурофильные гранулы содержат широкий набор гидролаз и других ферментов, активных при кислых значениях рН. Желатиназные (третичные) гранулы в соответствии с названием содержат желатиназу. Наконец, четвертый тип гранул — секреторные везикулы — содержат щелочную фосфатазу. При стимуляции нейтрофилов в первую очередь происходит высвобождение содержимого секреторных пузырьков. Преодолевать базальные мембраны нейтрофилам позволяет секрет желатиназных гранул. Специфические, а затем азурофильные гранулы сливаются с фагосомами в процессе фагоцитоза (через 30 с и 1–3 мин после поглощения частицы соответственно). Комплекс бактерицидных факторов, присутствующих в гранулах, обеспечивает разрушение многих микроорганизмов. Наиболее эффективно содержимое гранул повреждает стрептококки, стафилококки и грибы (включая кандиды). Содержимое гранул, особенно азурофильных, может секретироваться в результате дегрануляции. После дегрануляции восстановления гранул не происходит. Наряду с моноцитами/макрофагами нейтрофилы рассматривают как основные фагоцитирующие клетки. При этом нейтрофилы мигрируют из крови в очаг воспаления значительно быстрее моноцитов. Скорость мобилизации нейтрофилов дополняется их способностью развивать метаболические процессы («кислородный взрыв») в течение секунд. Все это делает нейтрофилы оптимально приспособленными 18

для осуществления ранних этапов иммунной защиты в рамках острой воспалительной реакции [2]. 5.4. Иммунотропные препараты Существуют различные классификации иммунокорректоров, например, в зависимости от происхождения и природы, по преимущественному действию на те или иные клетки или звено иммунитета, по фармакологическому действию. В данном исследовании сравнивалось действие иммунокорректоров на функциональную активность нейтрофилов, т.е. так или иначе воздействующие на моноцитарно-макрофагальное звено. При этом сравниваемые друг с другом препараты имели схожее фармакологическое действие. 5.4.1. Антиоксиданты Повышенное образование АФК (обеспечивают бактерицидность нейтрофилов) в условиях воспалительного процесса и интоксикации приводит к истощению антиоксидантной защиты (АОЗ) и развитию оксидативного стресса. Может возникать каскадоподобное повреждение мембран клеток пораженного органа и клеток иммунной системы. Существует целый ряд препаратов разной химической природы, которые способны подавлять процессы образования свободных форм кислорода (радикалов). Одни препараты нейтрализуют образовавшиеся радикалы и выводят их из организма, другие — способствуют восстановлению АОЗ [23]. 19

Азоксимера бромид (Полиоксидоний®) Фармакологическое действие - детоксицирующее, антиоксидантное, иммуномодулирующее. Увеличивает резистентность организма в отношении локальных и генерализованных инфекций. Основой механизма иммуномодулирующего действия - прямое воздействие на фагоцитирующие клетки и естественные киллеры. Активирует фагоциты периферической крови и тканевые макрофаги, восстанавливает иммунные реакции при вторичных иммунодефицитных состояниях, ингибирует перекисное окисление липидов [24]. Аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (Имунофан®) Фармакологическое действие - дезинтоксикационное, гепатопротективное, антиоксидантное, иммуномодулирующее. Препарат вызывает инактивацию свободнорадикальных и перекисных соединений. Корригирует состояние иммунной системы, восстанавливает баланс окислительно- антиокислительных реакций организма. Нормализует перекисное окисление липидов, ингибирует распад фосфолипидов клеточной мембраны, активирует фагоцитоз [25]. Глутамил-Цистеинил-Глицин динатрия (Глутоксим®) Фармакологическое действие восстановительные процессы, — регулирующее гемопоэтическое, окислительно- гепатопротективное, иммуномодулирующее. Воздействует на окислительно-восстановительный метаболизм клетки, стимулирует эндогенную продукцию цитокинов, 20

активирует фагоцитоз, в том числе, при иммунодефицитах, восстанавливает в периферической крови уровень нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов, функциональную активность тканевых макрофагов. Восстанавливает естественный противоопухолевый и противоинфекционный иммунитет [26]. Усиливает дегрануляцию нейтрофилов [27]. 5.4.2. Тимомиметики Препараты этой группы оказывают стимулирующее влияние как на лимфоциты, так и на фагоциты [23]. Альфа-глутамил-триптофан (Тимоген®) Синтетический дипептид, состоящий из остатков аминокислот — глутамина и триптофана. Разработан в НИИ ФХМ ФМБА России. Фармакологическое действие - иммуномодулирующее. Стимулирует клеточные факторы иммуногенеза, пролиферацию и дифференцировку предшественников Тлимфоцитов в зрелые иммунокомпетентные клетки, нормализует соотношение Т-хелперы/Т-супрессоры, стимулирует интерфероногенез и функцию естественных киллеров (в низких дозах). Обладает антимедиаторными свойствами. Высокоэффективен при иммунодефицитах Т-супрессорного типа. Усиливает неспецифическую резистентность организма, способствует активации фагоцитарных функций нейтрофилов и моноцитов/макрофагов [28, 29]. 21

Тимуса экстракт (Тактивин®) Фармакологическое действие — иммуностимулирующее. При иммунодефицитных состояниях препарат нормализует количественные и функциональные показатели иммунитета. Активизирует макрофагальную систему [30, 31]. 5.4.3. Интерфероны/индукторы интерферонов Иммунокоррекция при недостаточности интерфероногенеза в зависимости от стадии болезни и выраженности дефицита интерферонов проводится с использованием как заместительной иммунотерапии рекомбинантным интерфероном, так и индукторов интерферонов [32]. Интерферон альфа-2b (Интрон-А®) Фармакологическое действие - противовирусное, иммуномодулирующее, противоопухолевое, инфицированию антипролиферативное. клеток. иммунокомпетентным Стимулирует клеткам, Препятствует вирусному процесс презентации модулирует активность антигена киллеров, участвующих в противовирусном иммунитете. По данным литературы под влиянием интерферона альфа-2b происходит ингибировании респираторного взрыва [33]. Установлено, что Интрон-А оказывает иммуностимулирующее воздействие на нейтрофилы крови человека и нивелирует иммунодепрессивное действие некоторых доз УФ-излучения [34]. 22

Меглюмина акридонацетат (Циклоферон®) Фармакологическое Низкомолекулярный биологической действие индуктор активности иммуномодулирующая, — интерферониндуцирующее. интерферона (в том с широким числе противовоспалительная, спектром противовирусная, антипролиферативная, противоопухолевая). эффективен в отношении вирусов герпеса, гриппа и других возбудителей ОРЗ. Повышает неспецифическую резистентность организма в отношении вирусных и бактериальных инфекций. [35, 36]. 23

6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 6.1 . Характеристика пациентов У больных, чья кровь послужила материалом для исследования, наблюдались клинические признаки вторичного иммунодефицита, которые выражались в появлении очагов хронической инфекции бактериального и вирусного происхождения различной локализации. Наиболее характерно поражение слизистых оболочек дыхательных путей (фарингит, ринит, синуситы, трахеит, отит, бронхит) и мочеполовой системы (вагинит, аднексит, простатит, уретрит, цистит и т.д.), желудочно-кишечного тракта (дисбактериоз кишечной флоры). Поражение кожных покровов преимущественно грибковой инфекцией, рецидивирующими гнойничковыми высыпаниями, фурункулезом. У больных отмечаются частые ОРВИ (более 56 раз в год), характеризующиеся упорным течением, плохо поддающиеся стандартной терапии. Характерно указание в анамнезе на проведение многократных курсов антибактериальной терапии, по поводу инфекций различного генеза и локализации. Кровь для определения продукции активных форм кислорода (АФК) брали один раз натощак из локтевой вены в стерильные вакуумные пробирки, содержащие гепарин. 6.2. Приборы и материалы 1. Планшетный фотометр - Stat Fax 210® «Stat Fax» (США) 2. Шекер термостатируемый СТЗ Вошер® «Stat Fax» (США) 24

3. Автоматические пипетки переменного объема 20-1000 мкл «Ленпипет» (Россия) 4. Плоскодонные планшеты для ИФА «Медполимер» (Россия) 5. Пробирки 2 мл «Eppendorf» (Германия) 6. Наконечники для пипеток до 20 мкл «Eppendorf» (Германия) 7. Наконечники для пипеток до 200 мкл «Eppendorf» (Германия) 8. Пробирки Vacutest® «KIMA» (Италия) 6.3. Растворы и реактивы 1. НСТ «Sigma-Aldrich» (США) 2. Суспензия S.aureus в концентрации 1 млн./мл, убитых автоклавированием (приготовлена в бактериологической лаборатории ГКБ № 7) 3. Таблетки фосфатно-солевой буфер pH 7,4 «ПанЭко» Россия 4. ДМСО 99% «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга» (Россия) 5. КОН «Sigma-Aldrich» (США) 6. Азоксимера бромид — Полиоксидоний® раствор для приготовления лекарственных форм и вакцин «Петровакс фарм НПО» (Россия) 7. Аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин — Имунофан® раствор для внутримышечного и подкожного введения «Бионокс» (Россия) 8. Глутамил-цистеинил-глицин динатрия — Глутоксим® раствор для инъекций ЗАО «ФАРМА ВАМ» (Россия) 25

9. Альфа-глутамил-триптофан — Тимоген® раствор для инъекций НПО «Биомед» (Россия) 10. Тактивин — Тактивин® раствор подкожного введения «Биомед им. И.И. Мечникова» (Россия) 11. Интерферон альфа-2b — Интрон-А® раствор для внутривенного и подкожного введения «Вектор-Медика» (Россия) 12. Меглюмина акридонацетат — Циклоферон® Раствор для внутривенного и внутримышечного введения «ПОЛИСАН» (Россия) 6.4. Определение восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами спектрофотометрически (НСТ-тест). Тест отражает суммарную продукцию АФК нейтрофилами. В основе метода лежит способность восстановления поглощенного фагоцитом красителя нитросинего тетразолия в диформазан под влиянием активных форм кислорода. Очевидно, что концентрация НФ у людей индивидуальна. Соответственно, полученные величины оптической плотности в НСТ-тесте зависят не только от функционального состояния клеток, но и от их концентрации, по этой причине, показатели НСТ-теста нормировали на 10000 клеток, при этом заметим, что индивидуальная концентрация НФ не важна для определения ИС — отношения показателей спонтанного (сНСТ) и индуцированного НСТ-теста (иНСТ) для одного и того же человека. Из литературы известно, что при инкубации в течении 30 минут при 370С процент адгезированных к иммунологическому планшету нейтрофилов в 26

спонтанном и индуцированном НСТ-тесте не различается [37], таким образом возможное изменение адгезии НФ под влиянием препаратов будет влиять на показания ИС лишь как на один из факторов вносящий вклад в функциональную активность НФ как обобщённый показатель. Измерения проводили в цельной крови. Предварительно 500 мкл крови разливали в пробирки, добавляли растворы исследуемых препаратов в концентрациях, соответствующих средним терапевтическим дозам [38]. Концентрации препаратов приведены в таблице 6.4.1. В плоскодонные планшеты вносили и 20 мкл раствора НСТ 0,5 мг/мл на PBS (pH 7,4) на лунку с 20 мкл S.aureus в концентрации 1 млн./мл, убитых автоклавированием [39] для определения индуцированной продукции кислородных радикалов или 20 мкл PBS, для определения спонтанной продукции, и выдерживали в шейкере 10 мин при 140 об/мин для равномерного распределения раствора НСТ. Затем в лунки добавляли 50 мкл цельной крови (с растворами препаратов и без) и инкубировали 30 минут при 37°С. После этого клетки троекратно отмывали, добавляли по 100 мкл ДМСО (99%) и выдерживали в шейкере при 140 об/мин, при 50 0С, в течение 30 минут для выделения диформазана. Затем добавляли 100 мкл КОН (11 г/100 мл) – диформазан восстанавливался и приобретал синюю окраску. Оптическую плотность измеряли при λ=450 нм. Результаты нормировались на 10000 клеток и для удобства обращения приводились в условные единицы (у.е.) 27

Показатели НСТ-теста (cНСТ, иНСТ) определялись как НСТ = D × где 10000 Количество НФ × 100, (1) D — значение оптической плотности, непосредственно определяемое с помощью спектрофотометра, Количество НФ — количество нейтрофилов в 50 мкл периферической крови. Индекс стимуляции рассчитывали, как отношение индуцированной активности к спонтанной. Нормы показателей НСТ-теста, принятые в лаборатории клинической иммунологии НИИ ФХМ ФМБА России приведены в таблице 6.4.2. Таблица 6.4.1 Концентрации растворов препаратов, используемые в НСТ-тесте Действующее вещество Азоксимера бромид Аргинил-альфа-аспартил-лизил-валилтирозил-аргинин Глутамил-цистеинил-глицин динатрия Альфа-глутамил-триптофан Тимуса экстракт Интерферон альфа-2b Меглюмина акридонацетат Средняя терапевтическая доза, мг/70кг (млн МЕ/70кг) 8 Концентрация раствора, мкг/мл (тыс. ЕД/мл) 20 40 50 10 10 10 млн МЕ 250 200 20 20 4 тыс. ЕД/мл 1000 32 28

Таблица 6.4.2 Нормальные значения НСТ-теста Спонтанный НСТ, у.е. Индуцированный НСТ, у.е. Индекс стимуляции 70-110 110-170 1,08-1,40 6.5. Статистическая обработка результатов Данные полученные в результате исследования были статистически обработаны общепринятыми методами на ПК с использованием стандартных программ: STATISTICA 8.0, Microsoft Excel. В качестве статистических тестов использовали: однофакторный дисперсионный анализ для зависимых групп (single factor repeated measures ANOVA). Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез считали р = 0,05. 29

7. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 7.1. Влияние антиоксидантных препаратов на функциональную активность нейтрофилов. Для исследования были выбраны три препарата из данной группы: имунофан, полиоксидоний и глутоксим. Было проведено сравнение воздействия иммунотропных препаратов с антиоксидантными свойствами на кислородзависимую бактерицидность нейтрофилов у больных ВИДС по НСТ-тесту в цельной крови in vitro. Статистически достоверные изменения наблюдались только для ИС. Это объясняется существенным разбросом исходных значений. В связи с этим, для дальнейшего анализа пациенты были разделены на три группы: с контрольными значениями ИС ниже нормы, нормальными и повышенными в контроле значениями. Результаты представлены в таблице 7.1.1. В данном разделе в таблицах, тексте обсуждения и на иллюстрациях используются торговые названия лекарственных средств В группе пациентов с пониженными ИС (0,81±0,03, n=105) все исследуемые препараты восстанавливали ИС до нормы: Имунофан повышал ИС по сравнению с контролем на 22±8% до 0,99±0,09, (р<0,01), Полиоксидоний - 24±7% до 1,00±0,08, (р<0,01), Глутоксим - 24±9% до 1,0±0,1, (р<0,01). (Рис.7.1.1) 30

Таблица 7.1.1 Влияние иммунокорректоров с антиоксидантной активностью на индекс активации нейтрофилов. Группа Препарат Ниже нормы Норма Выше нормы n Имунофан Полиоксидоний Глутоксим Имунофан Полиоксидоний Глутоксим Имунофан Полиоксидоний Глутоксим Контроль Препарат ИС 105 0,81±0,03 42 1,217±0,004 48 1,9±0,1 0,99±0,09* 1,00±0,08* 1,0±0,1* 1,01±0,07* 1,3±0,01 1,20±0,09 1,3±0,3* 1,3±0,2* 1,4±0,2* *р<0,01 1,40 1,20 1,00 1,05* 1,05* 1,1* 0,81 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Контроль Имунофан Полиоксидоний Глутоксим Рис. 7.1.1 Влияние иммунокорректоров с антиоксидантной активностью на индекс активации нейтрофилов для группы пациентов с исходным ИС ниже нормы. В группе пациентов с изначально нормальными значениями ИС (1,217±0,004; n=42) только Имунофан оказывал на него достоверное влияние, понижая на 17±8% до 1,01±0,07, р<0,01, по сравнению с изначальным 31

значением ИС (без влияния препарата). При этом, влияние двух других исследуемых препаратов на активность нейтрофилов отличалось от такового для имунофана. Для Полиоксидония на 29±8%, для Глутоксима на 19±9%. Так, после инкубации крови с Полиоксидонием ИС составил 1,3±0,1, р<0,01 – достоверность различия ИС для Имунофана и Полиоксидония, а с Глутоксимом 1,20±0,09, р<0,05 - достоверность различия ИС для Имунофана и Глутоксима. (Рис.7.1.2) 1,35 1,3* 1,3 1,25 1,22 1,19 1,2 1,2 1,15 1,1 1,05 1 Контроль Имунофан Полиоксидоний Глутоксим Рис. 7.1.2 Влияние иммунокорректоров с антиоксидантной активностью на индекс активации нейтрофилов для группы пациентов с исходными значениями ИС в пределах нормы. В группе пациентов с изначально повышенной активностью нейтрофилов (1,9±0,1, n=48) все исследуемые препараты оказывали неё сравнимое друг с другом нормализующее действие. Имунофан снижал ИС по сравнению с его изначальным значение — без влияния препарата, на 30±20% 32

до 1,3±0,3, р<0,01, Полиоксидоний – также на 30±20% до 1,3±0,2, (р<0,01), Глутоксим – также на 30±20% до 1,4±0,2, (р<0,01). (Рис.7.1.3.) 2,5 1,9 2 1,3* 1,5 1,4* 1,3* 1 0,5 0 Контроль Имунофан Полиоксидоний Глутоксим Рис. 7.1.3. Влияние иммунокорректоров с антиоксидантной активностью на индекс активации нейтрофилов для группы пациентов с изначальными значениями ИС в пределах нормы. Таким образом, все выбранные нами иммунотропные препараты вызывают сравнимое друг с другом нормализующее влияние на изначально высокоактивные нейтрофилы, а также, умеренное повышение активности изначально низкоактивных нейтрофилов. При этом, имунофан в отличии от других исследованных препаратов вызывал снижение изначально нормальной активности нейтрофилов. 33

7.2. Влияние тимомиметиков на функциональную активность нейтрофилов Для исследования были выбраны следующие препараты: тимоген, Тактивин. (Табл.7.2.1) Было проведено сравнительное исследование эффекта иммунотропных препаратов на кислородзависимую бактерицидность нейтрофилов. Также, как и для препаратов из группы антиоксидантов, в связи с существенным разбросом исходных показателей, анализ проводился в группах исходно нормальных, сниженных и повышенных значений. (Табл.7.2.1.) Таблица 7.2.1 Влияние тимомиметиков на показатели спонтанного НСТ-теста. Группа Ниже нормы Норма Выше нормы Препарат n Тимоген Тактивин 57±3* 56±4* 69 Тимоген Тактивин Контроль Препарат 128 46±2 Тимоген Тактивин сНСТ 40 87±2 160±10 90±7 88±7 120±10* 120±10* *p<0,05 34

180 160 160 120* 140 120* 120 100 80 57* 56* 46 60 90 88 87 40 20 0 Контроль Тимоген Спонтанный НСТ-тест (ниже нормы) Тактивин Спонтанный НСТ-тест (норма) Спонтанный НСТ-тест (выше нормы) Рис. 7.2.1 Влияние тимомиметиков на показатели спонтанного НСТ-теста. Как видно из рисунка 7.2.1 при изначально пониженной активностью нейтрофилов (46±2, n=128) оба препарата оказывали на неё сравнимое друг с другом действие, повышая показатели сНСТ. Тимоген повышал сНСТ на 24±6% до 57±3, (р<0,05), Тактивин - на 22±7% до 56±4, (р<0,05). При этом показатели сНСТ оставались ниже нормы. Для пациентов с исходными значениями сНСТ в пределах нормы (87±2, n=69) ни один из препаратов рассматриваемой группы не оказывал достоверного влияния. При этом в группе пациентов с изначально повышенной активностью нейтрофилов (160±10, n=40) оба препарата оказывали одинаковое, нормализующее действие понижая сНСТ на 30±10%. Тимоген понижал сНСТ 35

до 120±10, (р<0,05) также, как и Тактивин 120±10, (р<0,05) и показатели сНСТ приходили к верхней границе нормы. Таблица 7.2.2 Влияние тимомиметиков на показатели индуцированного НСТ-теста. Группа Препарат Ниже нормы Тимоген Тактивин Тимоген Норма Тактивин Тимоген Выше нормы Тактивин Контроль Препарат n иНСТ 168 56±3 35 133±5 12 230±30 64±3* 68±4* 117±9 120±10 150±40* 200±50 *p <0,05 300 230 250 200 200 150 100 150* 133 120 68* 56 117 64* 50 0 Контроль Тимоген Тактивин Индуцированный НСТ-тест (ниже нормы) Индуцированный НСТ-тест (норма) Индуцированный НСТ-тест (выше нормы) Рис. 7.2.2 Влияние тимомиметиков на показатели индуцированного НСТ-теста. 36

При изучении влияния тимомиметиков на показатели индуцированного НСТ-теста обращает внимание (Табл. 7.2.2), что при изначально пониженной активности нейтрофилов (56±3, n=168) также, как и для сНСТ, оба препарата оказывали сопоставимое повышающее действие: Тимоген повышал иНСТ на 14±6% до 64±3, (р<0,05), Тактивин - на 21±7% до 68±4, (р<0,05) и, как и при рассмотрении влияния препаратов данной группы на сНСТ, изначально пониженные показатели иНСТ оставались ниже нормы. Для пациентов с исходными значениями иНСТ в пределах нормы (133±5, n=35) оба препарата существенного влияния на иНСТ не оказывали. В группе пациентов с изначально повышенной активностью нейтрофилов (230±30, n=12) только Тимоген оказывал нормализующее влияние на иНСТ понижая его на 40±50% 150±40, (р<0,05). Таблица 7.2.3 Влияние тимомиметиков на ИС Группа Ниже нормы Норма Выше нормы Препарат Тимоген Тактивин Тимоген Тактивин Тимоген Тактивин Контроль n Препарат ИС 194 0,79±0,02 69 1,22±0,02 50 1,8±0,1 1,05±0,06* 1,05±0,07* 1,14±0,07 1,19±0,09 1,3±0,1* 1,3±0,1* *p <0,01 37

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1,8 1,3* 1,3* 1,22 1,19 1,05* 1,14 1,05* 0,79 Контроль Ниже нормы Тимоген Тактивин Норма Выше нормы Рис. 7.2.3 Влияние тимомиметиков на ИС. В группе пациентов с ИС изначально ниже нормы (0,79±0,02, n=194) оба препарата оказывали одинаковое нормализующее действие повышая ИС на 33±5%. Тимоген повышал ИС до 1,05±0,06, (р<0,01), Тактивин – на до 1,05±0,07, (р<0,01). Для пациентов с изначально нормальными значениями ИС (1,22±0,02, n=69) существенных изменений не отмечено. В группе нейтрофилов пациентов (1,8±0,1, с n=50) изначально оба повышенной препарата оказывали активностью одинаковое нормализующее действие, приводя ИС к нормальным значениям 1,3±0,1, (р<0,01), понижая на 30±10%. Таким образом, оба выбранные нами иммунотропных препарата данной группы оказывали сравнимое друг с другом нормализующее влияние на изначально высокоактивные нейтрофилы (за исключением действия Тактивина на иНСТ), а также, умеренное повышение активности изначально 38

низкоактивных нейтрофилов. При этом, оба препарата вызывали небольшое снижение изначально нормальных показателей иНСТ, что демонстрирует важность предварительной индивидуальной in vitro диагностики при назначении терапии иммунокорректорами. 7.3. Влияние интерферонов и индукторов интерферонов на функциональную активность нейтрофилов Сравнивалось действие Интрона-А и Циклоферона на показатели НСТтеста. Было проведено сравнительное исследование эффекта иммунотропных препаратов на кислородзависимую бактерицидность нейтрофилов. Также, как и для других групп препаратов, в связи с существенным разбросом показателей теста, при изучении действия выбранной пары препаратов анализировалась динамика показателей в трёх группах: с исходно сниженными, нормальными и повышенными значениями. Таблица 7.3.1 Влияние интерферонов и индукторов интерферонов на показатели спонтанного НСТ-теста. Группа Ниже нормы Норма Выше нормы Препарат Интрон-А Циклоферон Интрон-А Циклоферон Интрон-А Циклоферон Контроль n Препарат сНСТ 212 42±2 82 87±4 24 150±20 50±3* 48±3 76±6 76±5 120±20 130±30 *p <0,05 39

180 160 160 130 120 140 120 100 87 76 76 80 60 50* 48 42 40 20 0 Контроль Циклоферон Интрон-А Спонтанный НСТ-тест (ниже нормы) Спонтанный НСТ-тест (норма) Спонтанный НСТ-тест (выше нормы) Рис. 7.3.1 Влияние интерферонов и индукторов интерферонов на сНСТ. В группе пациентов с изначально пониженной активностью нейтрофилов (42±2, n=212) только Интрон-А достоверно повышал сНСТ на 19±6% до 50±3, (р<0,01). Для пациентов с контрольными значениями сНСТ в пределах нормы (87±4, n=82) оба препарата не достоверного оказывали влияния на сНСТ. В группе пациентов с изначально повышенной активностью нейтрофилов (160±10, n=40) оба препарата также не вызывали достоверного изменения сНСТ. (Табл. 7.3.2) 40

Таблица 7.3.2 Влияние интерферонов и индукторов интерферонов на показатели индуцированного НСТ-теста. Группа Контроль Препарат n Интрон-А Ниже нормы Норма иНСТ 54±2 324 Циклоферон Интрон-А Циклоферон 22 Препарат 140±20 60±2* 58±3 130±20 120±20 *p <0,05 180 160 140 140 130 120 120 100 80 58 54 60* 60 40 20 0 Контроль Циклоферон Интрон-А Индуцированный НСТ-тест (ниже нормы) Индуцированный НСТ-тест (норма) Рис. 7.3.2 Влияние интерферонов и индукторов интерферонов иНСТ. 41

В группе пациентов с изначально пониженной активностью нейтрофилов (54±2, n=324) также, только Интрон-А незначительно повышал иНСТ по сравнению с контролем до на 11±5% 60±2, (p<0,05). Таблица 7.3.3 Влияние интерферонов и индукторов интерферонов на ИС Группа Ниже нормы Норма Выше нормы Контроль Препарат n Интрон-А Циклоферон Интрон-А Циклоферон Интрон-А Циклоферон Препарат ИС 241 0,80±0,02 90 1,22±0,02 69 1,9±0,1 1,11±0,07* 1,06±0,07* 1,3±0,1 1,20±0,09 1,2±0,1* 1,3±0,1* *p <0,01 2,5 1,9 2 1,5 1,3* 1,22 1,2 1,2* 1,11* 1,06* 0,8 1,3 1 0,5 0 Контроль Ниже нормы Циклоферон Норма Интрон-А Выше нормы Рис. 7.3.3 Влияние интерферонов и индукторов интерферонов на ИС. 42

В группе пациентов с ИС изначально ниже нормы (0,80±0,02, n=241) оба препарата оказывали сравнимое друг с другом действие, повышая ИС и приводя его в норму. Интрон-А повышал ИС на 39±5% до 1,11±0,07, (р<0,01), Циклоферон — на 31±5% до 1,05±0,07, (р<0,01). Для пациентов с исходными значениями ИС в пределах нормы (1,22±0,02, n=90) ни один из препаратов существенно не влиял на активность нейтрофилов, ИС оставался в пределах нормы. В группе пациентов с ИС изначально выше нормы (1,9±0,1, n=69) оба препарата оказывали сравнимое действие, понижая ИС и приводя его в норму. Интрон-А понижал ИС на 40±10% до 1,2±0,1, (р<0,01), Циклоферон – на 30±10% до 1,3±0,1, (р<0,01). Таким образом, все выбранные нами иммунотропные препараты вызывают сравнимое друг с другом нормализующее влияние на изначально высокоактивные нейтрофилы, а также, умеренное повышение активности исходно низкоактивных нейтрофилов. При этом, имунофан, Интрон-А и Циклоферон в отличии от других исследованных препаратов вызывали небольшое снижение исходно нормальной активности нейтрофилов, что демонстрирует важность предварительной индивидуальной in vitro диагностики при терапии иммунокорректорами. Необходимость индивидуального подбора терапии in vitro была подтверждена и сопоставлением конкретных полученных результатов с 43

клиническими данными. Подобранные таким образом препараты существенно повышали эффективность лечения. Кроме того, при индивидуальном анализе получаемых результатов во многих случаях был отмечен разнонаправленный ответ спонтанного и индуцированного НСТ-теста. При этом в подавляющем большинстве случаев ИС больше соответствовал клиническим признакам, что позволило рекомендовать именно этот показатель как критерий выбора. 44

8. ВЫВОДЫ 1. НСТ-тест позволяет оценивать иммунотропную эффективность фармакологических препаратов, обладающих различными механизмами воздействия на патофизиологический процесс. 2. Выявленная в ходе проведенной работы индивидуальность иммунного ответа пациентов на различные иммунотропные препараты убедительно доказывает необходимость подбора препаратов in vitro. 3. Полученные в ходе рассмотренные препараты, фармакологическим нормализующее исследования свидетельствуют, относящиеся группам, воздействие данные к оказывают на что различным преимущественно показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста, индекс активации. 4. При проведении исследований эффективности иммунотропной терапии оценку результатов необходимо проводить дифференцированно в группах с исходно повышенными, сниженными и нормальными показателями. 5. Для подбора лечебных дозировок и определения индивидуальной чувствительности более предпочтительно ориентироваться на коэффициент активации нейтрофилов, чем на показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста. 45

9. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ. 1. Любошенко Т.М. Изучение распространённости вторичных иммунодефицитов среди населения РФ с помощью кластерного анализа // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – N 3; URL: www.science-education.ru/117-13821 (дата обращения: 18.04.2015). 2. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 c. 3. Российский статистический ежегодник. М.: Росстат, 2014. – 693 с. 4. Гевондян Н.М., Алехин А.И., Гевондян В.С.// Новая форма вторичной иммунологической недостаточности и ее роль в развитии патологии. Аллергология и иммунология. – 2014(15). – N 3. C. 199. 5. Винницкий Л. иммунокорректоров И.// Проблемы клинического в хирургической клинике. применения Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – N 12. С. 12-16. 6. Лусс Л.В.// Качество жизни. Медицина. – 2005. – N 4. – С. 73-76. 7. Гусакова Н.В., нейтрофилов при Новикова И.А. хронической Функциональная рецидивирующей активность герпетической инфекции // Медицинская иммунология. – 2013. – № 2. – С. 169-176. 8. Рагулина В.А., Локтионов А.Л., Конопля А.И., Покровский М.В., Алехин С.А., Покровская Т.Г., Гудырев О.С., Корокин М.В., Кочкаров В.И. Эффективность производных 3-гидроксипиридина в коррекции иммунных и оксидантных нарушений при экспериментальном остром панкреатите // Научные ведомости. – 2012. – № 4. – C. 203-207. 46

9. Кратнов А.Е. Активность глутатионредуктазы в нейтрофилах – важный маркер окислительного стресса при ишемической болезни сердца // Российский иммунологический журнал. – 2011. – № 1. – С. 45-49. 10.Курзанов А.Н., Славинский А.А., Титов М.И., Балачевский Б.В. Влияние активации опиатных рецепторов нейтрофильных лейкоцитов на их функционально-метаболическую активность // Медицинская Иммунология. – 2007. – № 3. С. 148 -149. 11.Afzal MM, Jeshtadi A, Mohmmed AK. Study of neutrophilic function by nitroblue tetrazolium test in septicemias and immune deficiency diseases. Int J Res Health Sci. 2014 Apr 30; 2(2):581-90. 12.Hyung Sim Choi , Jun Woo Kim , Young‐Nam Cha & Chaekyun Kim (2006) A Quantitative Nitroblue Tetrazolium Assay for Determining Intracellular Superoxide Anion Production in Phagocytic Cells, Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 27:1, 31-44, Published online: 06 Feb 2007. 13.Amarasekara D. S., Wijerathna S., Fernando C., Udagama P. V., Costeffective diagnosis of male oxidative stress using the nitroblue tetrazolium test: useful application for the developing world Andrologia, 2014, 46, 73– 79. 14.Dubaniewicz A., Dubaniewicz A., Hoppe A. The spontaneous and stimulated nitroblue tetrazolium (NBT) tests in mononuclear cells of patients 47

with tuberculosis, Annales Academiae Medicae Bialostocensis 2004(49), 252-255. 15.Горностаева Ю. А. Вторичные иммунодефицитные состояния у взрослых в общеклинической практике // Аллергология. – 2010. – № 2 (53). – С. 13-15. 16.Ерофеев Ю. В. Особенности формирования здоровья населения крупного промышленного центра Западной Сибири / Ю. В. Ерофеев, В. А. Ляпин, Т. А. Нескин // Сибирь-Восток. – 2005. – № 9. – С. 4-8. 17.Порядин Г.В. Молекулярные и клеточные механизмы иммунопатологии (состояние и перспективы развития исследований). Актовая речь. – М.: РГМУ, 2008. – 48 с. 18.Куликова О.М. Прогнозирование онкологических заболеваний на территории РФ / О.М. Куликова, Т.М. Любошенко, А.А. Фоменко // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 3. URL: http://www.science-education.ru/103-6173 (дата обращения: 10.04.2015) 19.Горностаева Ю. А. Вторичные иммунодефицитные состояния у взрослых в общеклинической практике // Аллергология. – 2010. – № 2 (53). – С. 13-15. 20.Малашенкова И.К., Дидковский Н.А., Левко А.А. К вопросу о роли индивидуального подбора иммунокорректоров. Фарматека. – 2004. – С. 118-122. 48

21.Кратнов А. Е. Роль нейтрофилов в патогенезе ишемической болезни сердца // Научно-практический журнал «Клинико-лабораторный консилиум». – 2013. – № 2-3(46) – C. 39-44. 22.Сергеева И.В., Камзалакова Н. И., Тихонова Е.П., Булыгин Г.В. Патогенез острых респираторных вирусных инфекций и гриппа // Практическая медицина. – 2012. - № 6. – С. 47-50. 23.Малашенкова И.К., иммунокорригирующей Дидковский терапии вторичных Н.А. Принципы иммунодефицитов, ассоциированных с хронической вирусно-бактериальной инфекцией// РМЖ.- 2002.- Т.10.- №21.- С. 973–977. 24.Петров Р.В., Хаитов Р. М., Некрасов А.В., Аттаулаханов Р.И., Пучкова Н.Г., Иванова А.С., Пинегин Б.В., Хаумидуллина К.Ф., Дамбаева С.В., Климова С.В. Полиоксидоний: механизм действия и клиническое применение // Медицинская иммунология. – 2000. – № 3. – С. 271-278. 25.Лебедев В.В. Имунофан (Разработка, клинико-экспериментальное изучение и внедрение в практику): дис. ... канд./д-ра мед. наук. ЦНИИ Эпидемиологии Минздрава РФ, Москва, 1997. 26.Анисимова Т. М., Высокогорский В. Е. Влияние препарата глутоксим на процессы свободно радикального окисления и состояние системы глутатиона при комплексной терапии одонтогенных флегмон // Медицинская наука и образование Урала. – 2010. – № 2. – С. 85-87. 49

27.Алешина Г.М., Янкелевич И.А., Кокряков В.Н. Особенности дегрануляции нейтрофильных гранулоцитов под действием различных стимуляторов // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 2. – 504 с. 28.Клиническая фармакология тимогена / под ред. В.С. Смирнова. - СПб.: ФАРМиндекс, 2004. - 172 с. 29.Теоретические и клинические аспекты биорегулирующей терапии в хирургии и травматологии / Б.И. Кузник, И.Д. Лиханов, В.Л. Цепелев, В.А. Сизоненко. - Новосибирск: Наука, 2008. - 311 с. 30.Арион В.Я., Зимина И.В., Москвина С.Н., Быстрова О.В. Тактивин природный иммунокорректор. клиническое применение // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2007. - № 4. С. 11-26. 31. Киселева Н.М., Новоселецкая А.В., Иноземцев А.Н. Иммуномодулятор тактивин: новый спектр действия // Электронный научно- образовательный вестник Здоровье и образование в XXI веке. - 2010. № 4. - С. 194-195. 32.Малашенкова И.К., Дидковский Н.А., Левко А.А. К вопросу о значении индивидуального подбора иммунокорректоров // Фарматека. - 2007. № 12. - С. 4. 33.Conde M, Andrade J, Bedoya FJ, Sobrino F. Inhibitory effect of interferonalpha on respiratory burst and glucose metabolism in phagocytic cells. J Interferon Res. 1994 Feb;14(1):11-6. 50

34.Колтаков И. А., Шилов С. В., Леликова Е. Н., Артюхов В. Г., Уровень экспессии CD14 антигенов нейтрофилами крови человека в условиях комбинированного воздействия УФ-излучения и α2b-интерферона // Вестник ВГУ, Серия: химия. биология. Фармация. – 2013. – № 2. С. 106 -109. 35.Дидковский Н. А., Наровлянский А. Н., Коваленко А. Л. и др. Коррекция циклофероном иммунодефицитного состояния // Циклоферон -от эксперимента в клинику. Применение лекарственных форм циклоферона. – СПб., 2002. – С. 20-39. 36. Бажанова применение Е.Д. в Циклоферон: клинике // механизм действия, Экспериментальная и функции и клиническая фармакология. – 2012. – № 7. – С. 40-44. 37.Мельникова Я.И., Зуенок Н.Н., Изучение влияния перекисных условий на функциональную активность нейтрофилов периферической крови человека // Материалы XVI Международной научной конференции (Сахаровские чтения): «Экологические проблемы XXI века» Минск 2011. 38. Регистр лекарственных средств России; URL: http://www.rlsnet.ru (дата обращения: 20.05.2015). 39.Экологическая иммунология / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин, Х. И. Истамов. – Москва: Изд-во ВНИРО, 1995. – 219 с. 51

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв