Влияние магнитного поля на ферментативный катализ

Элина Каепкулова

Влияние магнитного поля на ферментативный катализ

В данной дипломной работе приведены механизм влияния магнитных полей на живые организмы в промежуточных и сильных полях и теория биологических магнитных эффектов для ферментативных реакций протекающих без разделения электронов и без образования радикальных пар, способная объяснить магнитно - полевые биологические эффекты в промежуточных и сильных полях. В работе проведено детальное исследование кинетики "двухканальной" ферментативной реакции, выполнены теоретические расчеты влияния контактного взаимодействия Ферми двух электронных спинов с ядерным спином молекулы, его влияние на синглет-триплетную конверсию таких молекул и на выход молекул АТФ.

Физика

Дипломы

Вуз: Оренбургский государственный университет

ID: 5f327535cd3d3e0001b70aef

UUID: c1d9ca30-bdec-0138-16cd-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: больше 4 лет назад

Просмотры: 13

14.26

Элина Каепкулова

Оренбургский государственный университет

Комментировать 12

Рецензировать 1

Скачать - 1,1 МБ

Поделиться работой

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Физический факультет Кафедра биофизики и физики конденсированного состояния ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Направление подготовки 03.03.02 Физика Влияние магнитного поля на ферментативный катализ ОГУ 03.03.02. 1020. 034 ОО Заведующий кафедрой д-р физ.-мат. наук, доцент В.Л. Бердинский Руководитель д-р физ.-мат. наук, доцент В.Л. Бердинский Студент Э.И. Каепкулова Оренбург 2020

Утверждаю заведующий кафедрой биофизики и физики конденсированного состояния _______________ Бердинский В.Л._ подпись инициалы фамилия «____»____________________20____г ЗАДАНИЕ на выполнение выпускной квалификационной работы студенту Каепкуловой Элине Ильгизовне по направлению подготовки (специальности) 03.03.02 Физика 1 Тема выпускной квалификационной работы «Влияние магнитного поля на ферментативный катализ» 2 Срок сдачи студентом ВКР «_____» _______________ 2020 г. 3 Цель ВКР: построить кинетическую теорию биологических магнитных эффектов для ферментативных реакций протекающих без разделения электронов и без образования радикальных пар, способную объяснить магнитные и спиновые полевые биологические эффекты в промежуточных и сильных полях. Задачи выпускной квалификационной работы: – найти механизм влияния магнитных полей на живые организмы в промежуточных и сильных полях; – проверить предположение о возможных биохимических и ферментативных реакциях идущих без образования радикальных пар, то есть без разделения электронных пар. 4 Исходные данные к ВКР Литературные данные о влиянии магнитного поля и ядерных спинов на ферментативные реакции. 5 Перечень вопросов, подлежащих разработке: освоение метода феноменологической кинетики и их применение для анализа биохимических ферментативных реакций и освоение основных методов квантово-механического описания спин зависимых процессов в конденсированных средах, анализ результатов о влиянии ядерных спинов и магнитных полей на ферментативные реакции. Дата выдачи и получения задания «_____» ___________ 20__ г. Руководитель ВКР «_____» ___________ 20__ г. _____________ Бердинский В.Л._ подпись инициалы фамилия Студент «_____» ___________ 20__ г. _____________ подпись 2 Каепкулова Э.И. инициалы фамилия

Аннотация Дипломная работа содержит 45 страниц, в том числе 15 рисунков, 20 источников литературы. Графическая часть работы выполнена в виде презентаций средствами Microsoft PowerPoint. В данной дипломной работе приведены механизм влияния магнитных полей на живые организмы в промежуточных и сильных полях и теория биологических магнитных эффектов для ферментативных реакций протекающих без разделения электронов и без образования радикальных пар, способная объяснить магнитно - полевые биологические эффекты в промежуточных и сильных полях. Были получены теоретические результаты о том, что сверхтонкое взаимодействие неподеленной электронной пары с ядерным спином способно вызывать S-T- переходы в магнитных полях, соответствующих области и пересечения энергетических уровней синглетного и триплетного состояния. 3

The summary Degree work contains 45 pages, including 15 figures, 20 sources of the literature. The graphic part of work is executed in the form of presentations by means Microsoft PowerPoint. This thesis presents the mechanism of influence of magnetic fields on living organisms in intermediate and strong fields and the theory of biological magnetic effects for enzymatic reactions occurring without electron separation and without the formation of radical pairs, which can explain the magnetic field biological effects in intermediate and strong fields. Theoretical results were obtained that the hyperfine interaction of an undivided electron pair with a nuclear spin is capable of causing S-T transitions in the area of the intersection of the singlet and triplet states in the area of the intersection of the corresponding levels. 4

Содержание Введение ....................................................................................................................... 6 1 Литературный обзор ................................................................................................ 8 1.1 Магнитное поле ..................................................................................................... 8 1.1.1 Влияние магнитного поля на живые организмы ........................................ 9 1.1.2 Влияние магнитного поля на бактериальные клетки.................................. 9 1.1.3 Влияние магнитно-изотопного эффекта на радикальные реакции ......... 10 1.1.4 Синглет-триплетная эволюция радикальных пар ..................................... 12 1.2 АТФ и её значение для живых организмов ...................................................... 15 1.2.1 АТФ – основной источник энергии в живых организмах ........................ 15 1.2.2 Значение АТФ для живых организмов ...................................................... 16 1.2.3 Электронные механизмы синтеза АТФ ...................................................... 17 1.2.4 Влияние магнитных изотопов на синтез АТФ........................................... 20 1.2.5 Магнитно-изотопные и магнитно-полевые эффекты на синтез АТФ in vivo ........................................................................................................................... 23 2 Кинетика и элементарные спин зависимые процессы ферментативного синтеза АТФ............................................................................................................... 30 2.1 Постановка задачи ........................................................................................... 30 2.2 Феноменологическая кинетика “двухканального” ферментативного синтеза АТФ ........................................................................................................... 30 2.3 Сверхтонкое взаимодействие как причина S-T эволюции неподеленной электронной пары в молекулах ............................................................................ 35 2.4 Основные результаты и выводы..................................................................... 42 Заключение ................................................................................................................ 43 Список использованных источников ...................................................................... 44 5

Введение Влияние магнитных полей на биохимические реакции и на биологические процессы – малоисследованная область молекулярной биологии, химии и физики конденсированного состоянии. Ясность начала появляться после открытия спиновой химической поляризации ядер, радиочастот полей, эффекта магнитного поля и магнитного изотопного эффекта фосфорилирования на выделенных ферментах in vitro. Все известные магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях объяснялись влиянием магнитного поля и ядерных спинов на синглет триплетную эволюцию в ион радикальных парах. Для таких пар предполагают существование разделенных неспаренных неэквивалентных электроновносителей не спаренного электронного спина. Для реализации синглет триплетной конверсии необходима магнитная неэквивалентная электронных спинов в партнерах электронной радикальной пары. Тот механизм успешно объяснял магнитно-спиновые эффекты в жидко-фазных радикальных реакциях. Применение свободно радикальных теорий магнитных эффектов для ферментативных реакций позволила объяснить магнитно- полевые эффекты в слабых магнитных полях и не объясняет биологические магнитные эффекты в промежуточных и сильных полях. Цель выпускной квалификационной работы - построить кинетическую теорию биологических магнитных эффектов для ферментативных реакций протекающих без разделения электронов и без образования радикальных пар, способную объяснить магнитные и спиновые полевые биологические эффекты в промежуточных и сильных полях. Будет показано, что сверхтонкое взаимодействие неподеленной электронной пары с ядерным спином способна вызывать S-T- переходы в области пересечения синглетного и триплетного |T-> состояния в области пересечения соответствующих уровней. В данной работе будет использована модель, подобная идеализированной модели реакции образования АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Задачи выпускной квалификационной работы: - найти механизм влияния магнитных полей на живые организмы в промежуточных и сильных полях; 6

- проверить предположение о возможных биохимических и ферментативных реакциях идущих без образования радикальных пар, то есть без разделения электронных пар. Предполагаем, что в начальный момент электронная плотность сосредоточенна на (кольцевых) двух неспаренных электронах, расположенных на двух концах фосфатных группах. Она описывается молекулярной волновой функцией ѱ1(r), а состояние неподеленной электронной пары описывается     волновой функцией r1 , r2 , s   21 / 2 φ1 r1 φ1 r2  1 2  1 2 . Если в процессе синтеза АТФ к кольцевым фосфатным группам АДФ приближается отрицательно заряженная группа неорганического фосфата PO3, то электрическая плотность АДФ частично “перетекает” на ион Mg+2 и, возможно, на адениновый фрагмент АДФ. При таком переносе электронная пара остается не поделенной, но начинает взаимодействовать с ядерным спином ионом магния в результате сверхтонкого взаимодействия. Далее будет показано, как сверхтонкое взаимодействие переводит не поделенную электронную пару из синглетного в триплетное состояние. Как правило, из-за действия принципа Паули переход неподеленной электронной пары из синглетного в триплетное состояние должен сопровождаться перераспределением пространственной плотности электронов и снижением активационного барьера реакции. 7

1 Литературный обзор 1.1 Магнитное поле Магнитное поле – силовое поле, действующее на движущиеся электрические заряды и на тела, обладающие магнитным моментом, независимо от состояния их движения. Магнитного поля присутствуют во всем окружающем нас мире [1]. Движущиеся электрические заряды и собственные магнитные моменты элементарных частиц, связанные со спином, создают магнитные поля. Поля магнитные и электрические взаимозависимые и представляют собой составляющие электромагнитной силы, одной из четырех фундаментальных сил природы. Изучение магнитных полей началось в 1269 году с эксперимента французского ученого Петруса Перегрина де Марикура. Он изобразил магнитное поле на поверхности шарообразного магнита, с помощью железных игл и обнаружил, что результирующие линии поля пересекаются в двух точках, он наименовал эти точки "полюсами" в сравнении с полюсами Земли. Магниты постоянно имеют Северный и Южный полюс, независимо от того, насколько тонко их разрезают согласно принципу Петруса Перегрина. Позднее Уильям Гилберт воспроизвел работу Петруса Перегрина и первым смело объявил, что Земля - это магнит. Магнетизм как науку в 1600 году установила работа Гилберта. В модели Симеона Дени Пуассона (1781-1840) магнитное Н - поле формируется “магнитными полюсами”, а магнетизм определен маленькими парами северных и южных магнитных полюсов. Ампер в 1825 году издал собственную успешную модель магнетизма. В ней он представил эквивалентность электрических токов магнитам и предположил, что магнетизм определен непрерывно протекающими петлями тока вместо диполей магнитного заряда в модели Пуассона. Это объясняет, отчего магнитный заряд не может быть изолирован. Электрон является источником спинового и орбитального магнетизма [2]. Орбитальный момент L электрона, движущейся со скоростью υ и радиус– вектором r равен      L  r  p  r  mv  , (1) где m − масса электрона. В молекулах и атомах орбитальный момент принимает только дискретные значения. L  l l  1, 8 (2)

где l − орбитальное квантовое число. Спин – это собственный угловой момент электрона. S=ћ[s(s+1)]1/2 , (3) где s − спиновое квантовое число. Спиновые угловые моменты создают собственный магнитный момент электрона. Этот магнитный момент может взаимодействовать с внешним магнитным полем и участвовать в магнитных взаимодействиях. 1.1.1 Влияние магнитного поля на живые организмы Магнитобиология - это раздел биофизики изучающий влияние магнитных полей на живые организмы [4]. Механизмом магниточувствительности живых организмов могут стать внутриклеточные ферментативные реакции с участием ион- радикальных состояний. Слабые магнитные поля могут повлиять на скорости внутриклеточных ферментативных реакций. Синглет - триплетная конверсия ион-радикальных пар в активных центрах ферментов, индуцированная сверхтонкими и зеемановскими взаимодействиями ядерных и электронных спинов - есть главная магниточувствительная стадия. К сильной зависимости скорости ферментативной реакции в слабых магнитных полях, сопоставимых с магнитным полем Земли приводит участие ядерного спина в ион- радикальном процессе. 1.1.2 Влияние магнитного поля на бактериальные клетки В 1975 году микробиолог Ричард Блекмор (Richard P.Blakemore) предложил термин «магнитотаксис» проверив свое предположение о влиянии магнитного поля на бактерии. Ричард Блекмор занялся сбором бактерий из болот, которые расположены вдоль Атлантического побережья. Как оказалось, внутри бактерии заключены крошечные частицы магнетита. Размер каждой такой частицы составляет всего 50 нм с каждой стороны. У разных бактерий это могут быть либо гранулы магнетита (Fe3O4) либо же гранулы грейгита (Fe3S4). Эти гранулы окружены липопротеиновой мембраной. Органы, где синтезируются кристаллы, носят название магнетосомы. Внутри бактерий они могут быть объединены в цепочки, а в клетках магнитотактических бактерий их число может насчитывать несколько десятков или даже сотен. 9

Рисунок 1– Бактерии, синтезирующие магнетит Магнитосомная цепочка имеет немалые размеры и магнитный момент, это разъясняет ориентацию бактерий в магнитном поле[6]. К примеру, живые бактерии плывут, перемещаясь вдоль силовых линий поля, потому что их заставляет ориентация, а мертвые бактерии ориентируются вдоль магнитных силовых линий. У бактерий наблюдались видоизменения во времени деления клеток и биомассе, когда на них было влияние магнитного поля. При влиянии магнитного поля на бактерии Escherichia coli происходит уменьшение времени размножения. Сложными оказались отношения прием-отклик данного эффекта так как, они происходят лишь в определенном диапазоне от 0 до 22 мТл [7]. Рост Bacillus subtilis увеличивают переменные поля (0,8 и 2,5 мТл, 0,8 и 1кГц). Магнитное поле переменного тока оказывая влияние тормозное или стимулирующее, трудным образом зависит от напряженности и частоты поля. Изменение в расположении белков ДНК в E. coli происходит при действии слабых магнитных полей. При влиянии сильных магнитных полей на штаммы кишечной палочки не обнаружилось повреждений ДНК. Снижение выживаемости дрожжей Saccharomyces cerevisia провоцировали переменные магнитные поля (120 мТл, 50 Гц). 1.1.3 реакции Влияние магнитно-изотопного эффекта на радикальные Зависит магнитно изотопный эффект от магнитных взаимодействий в радикальной паре и находится разностью скоростей синглет - триплетной конверсии в радикальных парах, включающих немагнитные и магнитные изотопы. В радикальных реакциях из-за действия на динамику синглет триплетных переходов в радикальных парах появляется магнитный изотопный 10

эффект за счет магнитного момента ядер[8]. Одним из механизмов синглет триплетных переходов в радикальных парах является сверхтонкое взаимодействие неспаренных электронов радикалов с магнитными ядрами. При условии, что сверхтонкое взаимодействие подает видимый вклад в спиновую динамику радикальных пар, то тогда на нее можно воздействовать изотопным замещением, потому что разные изотопы характеризуются разным сверхтонким взаимодействием. Если неспаренные электроны обнаруживаются в синглетном состоянии вследствие спиновой динамики, то геминальные пары могут рекомбинировать. В последствии появления из протонированных молекул в радикальных парах синглет-триплетные переходы выполняются из-за сверхтонкого взаимодействия, а в радикальных парах, которые возникают из дейтерированных молекул M(D), синглет-триплетные переходы порождаются сверхтонким взаимодействием с дейтонами. Поскольку магнитный момент дейтона в четыре раза меньше магнитного момента протона,то в итоге этого в протонированных парах S-T смешивание случается со значительной частотой, чем в подобных дейтерированных парах. Распавшиеся протонированные молекулы имеют возможность регенирировать с высокой вероятностью, в подобии от распавшихся дейтерированных молекул. Магнитно-изотопный эффект в рекомбинации геминальных радикальных пар имеет разную величину для синглетного и триплетного предшественника пары. Оптимальным видимо будет время жизни радикальной пары. Сверхтонкое взаимодействие не успевает подействовать на реакцию при коротеньких временах жизни радикальной пары. При значительных временах жизни во всех радикальных парах, вне зависимости от изотопного состава, может случиться смешивание синглет - триплетное. В каждой из двух ситуациях будет очень невелик магнитно-изотопный эффект. Оптимальное время жизни радикальной пары можно сопоставить со временем синглеттриплетного перехода в радикальной паре, порожденного сверхтонким взаимодействием. Изотопное замещение сильно влияет на сверхтонкое взаимодействие в тех радикалах для которых будет обнаруживаться видимый магнитноизотопный эффект. Если заменить 12C на 13C в CO группе радикала C6H5CH2CO, то случится увеличение энергии сверхтонкого взаимодействия в предоставленном радикале, примерно в шесть раз. Однако при замене 12C на 13C в CH2C6H5 не замечается существенных изменений энергии сверхтонкого взаимодействия в радикале. Для обнаружения магнитно-изотопного эффекта надо, чтобы сверхтонкое взаимодействие давало видимый вклад в спиновую динамику радикальной пары. Если спиновая динамика целиком проверяется взаимодействиями не зависящими от магнитных моментов ядер, то тогда магнитно-изотопный эффект не будет обнаруживаться. 11

В труде специалиста в области физической химии и химической физики, Бучаченко Анатолия Леонидовича, представлен пример рассмотрения магнитно - изотопного эффекта [9]. Он заметил, что молекула кислорода обогащается изотопом 17O впоследствии цепной реакции окисления продукта реакции. Схема реакции: 2RO2→{RO2 · ·RO2}→RO4R→O2, (4) В такой реакции создаются диффузионные радикальные пары. Сверхтонкое взаимодействие с 17O убыстряет конверсию триплетных пар в синглет для таких радикальных пар, что содержат 17O. Вследствие этого молекула кислорода, основанная в последствии рекомбинации радикальных пар, обогащается изотопом 17O. Магнитно- изотопный эффект используется для изучений, связанных с устройствами химических реакций. Во время наблюдения за магнитноизотопным эффектом обнаружилось, что радикальные стадии в реакциях играют немаловажную роль. Рассуждать о мультиплетности предшественника радикальной реакции можно по знаку магнитно-изотопного эффекта реакции. 1.1.4 Синглет-триплетная эволюция радикальных пар Состояние радикальной пары изобразим на диаграмме электронных термов. Электронные термы основного синглетного состояния и первого возбужденного триплетного состояния как функции координаты реакции представлены на рисунке 2. Различие энергии у радикальной пары в триплетном Ет и синглетном Es состояниях связана с обменным взаимодействием ET  ES  2J (r ) , где (5) J (r ) - обменный интеграл,  - постоянная Планка. Во внешнем магнитном поле Н триплетное состояние расщепляется на три подуровня. 12

Рисунок 2 – Схема уровней энергии радикальной пары [8] S-Т-переход в радикальной паре можно объяснить с помощью векторной модели спинов. Схема взаимной ориентации спинов Ŝ1 и Ŝ2 неспаренных электронов радикальной пары в трех триплетных состояниях Т +1, Т-1, Т0, отвечающая трем значениям проекции суммарного спина радикальной пары на направление внешнего магнитного поля Ĥ0, равным соответственно +1; -1; 0. представлена на рисунке 3 (а, б, в). Синглетное спиновое состояние радикальной пары схематически можно представить как два магнитных момента, прецессирующих вокруг магнитного поля так, что их сумма всегда равна нулю (рисунок 3 г). 13

Рисунок 3 – Векторная модель состояний электронных спинов радикальной пары [9] Переход из Т+1 или T-1 в S-конфигурацию - это изменение проекции одного спина на ось квантования. Из рисунка 3 видно, что S и T0 различаются фазами прецессии S1 и S2. Разфазировка прецессии спинов индуцирует переходы между T0- и S-состояниями. Следовательно, действенными механизмами интеркомбинационных переходов в радикальной паре являются спиновые взаимодействия неспаренных электронов. Три механизма играют главную роль в расфазировке синглет-триплетных переходов в радикальной паре - это релаксационный, Δgмеханизм и сверхтонкое взаимодействие (СТВ). 14

1.2 АТФ и её значение для живых организмов 1.2.1 АТФ – основной источник энергии в живых организмах Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ, англ. АТР - Adenosine-5'triphosphate) – молекула, что обладает большим значением для обмена энергии и веществ во всех живых организмах. Универсальный источник энергии для всех ферментативных процессов в живых системах есть АТФ. Новую молекулу - аденозинтрифосфорную кислоту АТФ в 1929 году раскрыли учёные Гарвардской медицинской школы – Сайрус Фиске,Карл Ломан и Йеллапрагад Суббарао выделением из кислых экстрактов мышц. Также было открыто, что АТФ участвует во многих процессах клеточного энергетического обмена. Будущий академик АН СССР В.А. Энгельгардт в 1931 году открыл взаимосвязь между синтезом АТФ и клеточным дыханием. Впоследствии он определил участие АТФ в сокращении мышц животных. В 1941 году Липман выяснил, что энергия внешнего источника первоначально запасается в форме химической энергии молекул АТФ и только потом применяется для совершения полезной работы и выразил он это как основной закон биоэнергетики [10]. Рисунок 4 – Химическая формула аденозинтрифосфорной кислоты Теперь общепринято, что аденозинтрифосфат (АТФ) обеспечивает энергией многие не только сокращение мышц, но и другие процессы, например, распространение нервных импульсов и химический синтез. Поэтому АТФ часто называют "молекулярной денежной единицей" внутриклеточных процессов. В метаболических процессах он превращается либо в аденозиндифосфат (АДФ), либо в аденозинмонофосфат (АМФ). При регенерации АТФ человеческое тело каждый день вырабатывает и затем расходует свой собственный эквивалент массы тела в АТФ [3]. 15

Основное значение процессов дыхания и фотосинтеза заключается в том, что они поставляют энергию для синтеза АТФ, которая используется в клетках для выполнения большей части работы. 1.2.2 Значение АТФ для живых организмов В живых организмах АТФ обеспечивает энергией биохимические реакции. Это реакции синтеза сложных веществ в организме, активные переносы молекул сквозь биологические мембраны, в том числе для создания трансмембранного электрического потенциала и осуществляют мышечных сокращений. Синтез и гидролиз АТФ осуществляется специальными ферментами аденозинтрифосфатазами (АТФ-азами). Эти ферменты находятся в клетках всех организмов. АТФ-синтаза - это фермент, который создает молекулу накопления энергии аденозинтрифосфат (АТФ). АТФ является наиболее часто используемой "энергетической валютой" клеток для всех организмов. Он образуется из аденозиндифосфата (АДФ) и неорганического фосфата PO3 . Общая реакция, катализируемая АТФ-синтазой, такова: АДФ  PO3  АТФ , (6) Рисунок 5 – Цикл энергозависимых превращений АТФ в клетке В клетках многих бактерий, насекомых и животных АТФ синтезируется клеточных органеллах – в митохондриях. Энергия, которая выделяется в клеточных окислительно-восстановительных реакциях, запасается в виде макроэргических связей молекулы АТФ. АТФ-синтаза состоит из основных белковых субъединиц F0 и F1. Они работают как мотор, который сближает молекулу АДФ и неорганический фосфат и производит АТФ. Поэтому АТФ-синтаза может считаться молекулярной машиной. Схема ATФ-синтазного комплекса и его расположение в мембранах и митохондрий показаны на рисунках 6 и 7. Комплекс похож на 16

гриб, круглая шляпка которого выступает наружу, а ножка погружена в мембрану (рисунок 6). Рисунок 6 – Схематическое изображение АТФ-синтазного комплекса в мембранах митохондрий Рисунок 7 - Расположение АТФ-синтазных комплексов в мембранах хлоропластов (а) и митохондрий (б). Области желтого цвета соответствуют энергонасыщенным областям хлоропластов и митохондрий 1.2.3 Электронные механизмы синтеза АТФ В настоящее время не существует общепризнанных описаний электронных механизмов синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата в активных центрах АТФ-синтезирующих ферментах. По аналогии с другими механизмами органической химии наиболее вероятным считается нуклеофильный механизм. Нуклеофильное присоединение фосфатной группы к АДФ требует затрат энергии. На больших расстояниях партнеры по реакции в виде отрицательно 17

заряженных ионов отталкивают друг друга, несмотря на то, что заряженные аминокислотные остатки, составляющие каталитический сайт, незначительно компенсируют кулоновское отталкивание реагентов. Однако на малых расстояниях и в переходном состоянии отталкивание замкнутых электронных оболочек достаточно сильно, и для преодоления этого отталкивания требуется высокая энергия, чтобы произошло нуклеофильное присоединение. Энергетический барьер для нуклеофильной реакции гидролиза АТФ еще выше, около 39 ккал / моль, и связан с нуклеофильной атакой HO - на фосфатную группу АТФ. Обычно при анализе такого нуклеофильного механизма реакции роль иона магния либо не учитывается, либо считается, что он лишь формирует пространственную структуру промежуточного комплекса. Однако квантовохимические расчеты структуры комплексов Mg2+-АТФ и Mg2+-АДФ показывают, что ион Mg2+ связан не только с фосфатными группами, но и с атомом азота аденинового фрагмента АТФ и АДФ. Активную роль магния в ферментативном синтезе АТФ явило открытие изотопных и магнитно полевых эффектов магния в реакциях синтеза АТФ in vitro и in vivo. Рисунок 8 – Структура одиночного хелатного комплекса Mg2+-АТФ. Атом Mg отмечен зеленым цветом в центре, атомы фосфора Р трифосфатной группы – желтым цветом, атомы кислорода О – красным цветом, атомы азота N аденинового фрагмента – синим цветом, атомы углерода С – серым цветом. Непрерывными линиями показаны ковалентные связи молекулы АТФ, пунктирными линиями показаны координационные связи иона Mg2+ Поэтому для объяснения магнитных и спиновых эффектов изотопов магния в ферментативных реакциях академиком А.Л. Бучаченко [12] был предложен ион-радикальный механизм. Начальная реакция ионно-радикального механизма – перенос электрона – является экзоэргическим процессом. Расчет энергетического профиля для ион18

радикального механизма реакции синтеза АТФ отсутствует. Однако сравнение с типичными экзоэргическими реакциями переноса электронов позволяет предположить, что и в данном случае энергетический барьер достаточно низок. Это утверждение согласуется с известными экспериментальными результатами: выход АТФ увеличивается и превышает вклад, поступающий от нуклеофильного механизма при концентрациях ионов Mg2+, Ca2+, Zn2+, где работает ионно-радикальный механизм. Ион-радикальный механизм не требует преодоления высокоэнергетического нуклеофильного барьера и сильного сжатия. Даже низкий уровень сжатия достаточен для удаления слабосвязанных молекул воды из оболочки гидрата ионов магния и, следовательно, для индуцирования переноса электронов в качестве стартовой, ключевой реакции синтеза АТФ. Низкая энергетическая стоимость является причиной высокой эффективности синтеза АТФ по ионно-радикальному пути. Повышенная эффективность, индуцируемая ионами 25Mg2+ ,означает увеличение продукции АТФ на каждый оборот γ-вала в фрагменте F1 АТФ-синтазы. Это делает фармакологический потенциал ионов 25Mg2+ еще более привлекательным, поскольку высокий уровень продукции АТФ достигается без дополнительного увеличения выхода опасного супероксидного радикала. Открытие ионно-радикального механизма не исключает нуклеофильного пути в ферментативном синтезе АТФ. Однако это создает новую загадку: почему эти два маршрута - дешевый и дорогой, высокоэффективный и низкоэффективный - сосуществуют? Несомненно, источником энергии, необходимой для преодоления высокоэнергетического барьера при нуклеофильной атаке, является сжатие каталитического участка. Для того чтобы присоединить фосфатную группу к АДФ, это сжатие должно быть достаточно значительным. Но на пути жесткого сжатия реагентов лежит ионнорадикальный механизм, так как предполагается, что он включается даже при относительно слабом сжатии. Иными словами, ионно-радикальный механизм всегда должен предшествовать нуклеофильному. Следует ответить на вопрос, когда и при каких условиях тот или другой механизм доминирует. Ответ, как ожидается, будет получен в результате изучения синтеза АТФ в зависимости от концентрации ионов магния. Внутри каталитического участка находятся два состояния ионов Mg2+: в одном из них ион плотно связан с остатком пирофосфата АДФ, в другом-ион металла слабо связан, координируясь аминокислотными остатками и молекулами воды. Именно этот ион, как предполагается, отвечает за ионнорадикальный механизм, поскольку он принимает электрон, пожертвованный ADP. Ясно, что ионы Mg2+ должны быть плотно связаны с остатками пирофосфата АДФ при низких концентрациях магния. В этом случае слабо связанные гидратированные ионы отсутствуют. В этих условиях действует нуклеофильный механизм, в то время как ионно-радикальный механизм 19

выключен. При высоких концентрациях магния, наоборот, избыток каталитических ионов включает ионно-радикальный механизм. Границей между этими двумя механизмами является точка, где в каталитическом участке появляются свободные, не связанные с фосфатными, карбоксильными или другими хелатирующими группами ионы металлов. Поскольку каталитические сайты различны для различных синтезирующих АТФ ферментов, то и точки, где появляются свободные ионы металлов, также различны. Это дает ответ, почему ионно-радикальный механизм включается при различных концентрациях ионов металлов в разных ферментах. Это предсказание полностью согласуется с экспериментальными наблюдениями. Показано, что при низких концентрациях магния изотопный эффект либо мал, либо вообще отсутствует. Это приводит к выводу, что при низких концентрациях ионов доминирует нуклеофильный механизм. Напротив, высокие концентрации магния, превышающие нормальные физиологические значения, стимулируют ионно-радикальный механизм. Это свойство также проявляется в экспериментах с ионами Ca2+ и Zn2+. 1.2.4 Влияние магнитных изотопов на синтез АТФ Аденозинтрифосфат, или АТФ, является основной макроэргической молекулой в живых организмах. Энергия, выделяемая при расщеплении, используется во многих биологических процессах, включая ферментативные реакции, синтез дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК) кислот. Возможность контроля внутриклеточной концентрации, или пула АТФ, и процесса синтеза АТФ является важной междисциплинарной научной проблемой. Одним из возможных способов воздействия на пул АТФ является влияние внешнего магнитного поля или магнитных изотопов. Так, например, внутриклеточная концентрация АТФ увеличивается в 3,5 раза после одного часа воздействия статического магнитного поля (17 мТл) на бактерии Escherichia coli. Синтез АТФ, осуществляемый мембранными ферментами, стимулируется переменными электромагнитными полями. Однако механизм магнитного воздействия на продукцию и расходование АТФ внутриклеточными системами авторами этих работ не предложен. Воздействие внешнего магнитного поля и магнитных моментов атомных ядер химических элементов, например магнитного изотопа 31Р, 25Mg, 67Zn, на живые организмы может осуществляться посредством элементарных актов последовательности ферментативных реакций с переносом одного или нескольких электронов. Образующаяся в таких процессах ионно-радикальная пара (ИРП) служит "первичным приемником" магнитного поля и основным источником магнитного поля и магнитных изотопных эффектов. Магнитное воздействие может вызвать преобразование ИРП из первичного синглетного состояния в триплетное. Это приводит к изменению вероятностей прямых и 20

обратных ферментативных реакций и выхода продукта. Для ферментативного синтеза АТФ предложенный механизм имеет множество экспериментальных подтверждений с участием ионов магнитного магния 25Mg2+, цинка 67Zn2+, кальция 43Ca2+ изотопов. В последние десятилетия были открыты магнитно-изотопные эффекты для важных ферментативных реакций: - синтез АТФ – главного носителя энергии в живых организмах; Синтез АТФ зависит от вида изотопа магния, который присутствует в каталитическом участке. Скорость синтеза АТФ ферментами, в тех, где катион магния обладает магнитным ядром 25Mg, в 2-3 раза выше, чем скорость генерации АТФ с теми же ферментами, при тех же условиях. Скорость синтеза АТФ не меняется, когда обладает изотопами магния 24Mg и 26Mg. Открытие магнитно изотопного эффекта приносит верные доказательства того, что синтез АТФ есть ион-радикальная реакция с участием парамагнитных промежуточных продуктов: радикальных ионных пар и радикальных ионов. Рисунок 9 – Химический механизм фосфорилирования АТФ - синтазой 21

В первом акте реакции происходит перенос электрона от фосфатного аниона к иону Mg2+ и создание первичной ион-радикальной пары, состоящей из иона магния Mg1+ и концевой фосфатной группы РО3 с отсутствующим электроном. Из-за своего происхождения из синглетной пары неразличимых электронов в диамагнитной молекуле эта пара находится в синглетном спиновом состоянии. У этой первичной радикальной есть три пути превращений: 1) обратный перенос электрона с регенерацией исходных диамагнитных частиц (стадия 1-); 2) образование молекулы АТФ с двумя неспаренными электронами (стадия 2); 3) переход первичной синглетной ионрадикальной пары в триплетное состояние с последующим образованием молекулы АТФ (стадия 2’). Но для триплетной ион-радикальной пары запрещен переход в исходное состояние диамагнитных частиц. Поэтому переход ионрадикальной пары в триплетное состояние ускоряет “прямую” реакцию синтеза АТФ. Переход синглетной ион-радикальной пары в триплетную может стимулироваться Скорость фосфорилирования по синглетному состоянию уменьшается спин-разрешенным обратным переносом электрона. В присутствии ионов 25 Mg2+ взаимодействие неспаренного электрона в катион-радикале 25Mg2+ с магнитным ядром 25Mg совершает спиновую конверсию пары из синглета в триплет. верхняя кривая–фермент с 25Mg2+, нижняя кривая – фермент с 24Mg2+ Рисунок 10 – Влияние магнитного поля на синтез АТФ креатинкреназой В первичной ион-радикальной паре оксирадикал присоединяется по двойной связи P=O фосфатной группы креатинфосфата; новый оксирадикал распадается по типу β-распада. В такой реакции рождается АТФ, а обратный перенос электрона от Mg+ к протонированному радикалу креатина регенерирует Mg2+ и вызывает креатин. Скорость фосфорилирования по такому каналу ограничена обратным переносом электрона; он позволен по спину, регенерирует исходные реагенты и интенсивно снижает выход АТФ. Если есть изотопный ион 25Mg2+, то в ион-радикальной паре взаимодействие неспаренного 22

электрона с магнитным ядром 25Mg меняет спин пары и сводит ее в триплетное состояние, из которого обратный перенос электрона запрещен по спину. Возникает добавочный, триплетный канал фосфорилирования, который превосходит синглетный канал по эффективности в 2-3 раза; магнитный изотопный эффект является дополнительным каналом фосфорилирования[4]. Кроме того, константа скорости синтеза АТФ креатинкиназой увеличивается с добавлением внешнего магнитного поля только для фермента, обогащенного магнитным изотопом магния 25Mg. Обогащение фермента по немагнитному изотопу магния 24Mg не изменяет кинетических характеристик ферментативных процессов реакции во внешнем магнитном поле. 1.2.5 Магнитно-изотопные и магнитно-полевые эффекты на синтез АТФ in vivo Эффективность использования магнитных изотопов во внутриклеточных процессах неоднократно подтверждалась в экспериментах in vivo. Магнитный изотоп магния, 25Mg, содержащийся в клетках кишечной палочки, влияет на их рост, развитие и жизнедеятельность. Интересно, что их биологические эффекты отличаются от эффектов немагнитного изотопы 24,26Mg. Колониеобразующая способность бактерий E. coli растёт (для полей 0-15 и 76-93 мТл), а внутриклеточный элементный состав изменяются в результате комбинированного воздействия внешнего ПМП (постоянное магнитное поле) и магнитного изотопа магния 25Mg и 67Zn. Наблюдаемые эффекты указывают на влияние магнитных моментов атомных ядер изотопов 25Mg, 67Zn на весь организм. Это влияние осуществляется через последовательность внутриклеточных ферментативных процессов, включая синтез АТФ. В работе (здесь как раз ссылка на непосредственно эту статью) провели поиск экспериментальных доказательств совместного действия слабых ПМП и магнитных моментов ядер изотопов магния 25Mg и цинка 67Zn на внутриклеточную концентрация АТФ в кишечной палочке. Зависимость внутриклеточной концентрации АТФ у бактерий E. coli от внешнего ПМП для контрольных образцов представлена на рисунке 11. Было проведено 6 экспериментальных серий, каждая из которых повторялась дважды или трижды. Среднее содержание АТФ в одной бактериальной клетке в выбранных условиях роста составило 10–19 моль, что согласуется с литературными данными. Были обнаружены эффекты в двух характерных диапазоных:0-10 и 15-95 мТл. В первом диапазоне пул АТФ достигает максимального значения, в два раза превышающего концентрацию АТФ для бактерий, культивируемых в геомагнитном поле (первая точка на кривой). Большое количество исследований ошибочно сосредоточено на обнаружении эффектов магнитного поля в сильных магнитных полях, значительно превышающих магнитное поле 23

Земли. Обычно обнаруживаемые в таких случаях эффекты не могут объяснить магнитную чувствительность живых организмов в слабом магнитном поле техногенной природы и их реакцию на изменения этого поля. Более того, эти результаты вряд ли могут быть использованы для понимания механизма магнитного контроля внутриклеточного ферментативного процесса. Комбинированное воздействие внешних ПМП и магнитных моментов атомных ядер можно наблюдать и регистрировать именно в слабых магнитных полях, сила которых меньше величины констант сверхтонких взаимодействий. Диапазон магнитных полей для наблюдения таких эффектов, согласно теоретическим расчетам, должен составлять 0-10 мТл. Согласно теории ферментативной магниточувствительности, первичный приемник внешнего магнитного поля является спин-зависимой стадией элементарных актов ферментативных процессов. Магниточувствительность этих стадий обусловлена участием частиц с ядерными магнитными моментами, таких как магнитные изотопы 1Н, 13С, 39К и их сверхтонким взаимодействием с электронным спином и внешним магнитным полем. Эти изотопы присутствуют во всех живых организмах независимо от условий произрастания. Обязательным условием таких магниточувствительных ферментативных реакций является перенос электронов и образование ИРП. Ядерно-магнитные моменты стабильных изотопов и внешнего ПМП должны индуцировать переход ион-радикальных пар из исходного синглетного состояния в триплетное . Вероятности прямого и обратного электронных процессов зависят от полного спинового состояния такой пары. Например, синглет-триплетная конверсия пары "Ион магния 25Mg+ - радикал АДФ" в активном центре АТФсинтазы приводит к увеличению вероятности прямой реакции (образования АТФ). Наиболее интересными эффектами в соответствии с теоретическими предсказаниями являются эффекты магнитного поля, полученные в диапазоне 0-10 мТл. 24

Рисунок 11– Магнитно-полевая зависимость пула АТФ у бактерий E. coli, культивируемых в среде LB. Диапазон магнитных полей от 0,8 до 98 мТл. * Различия между средними значениями для магнитных полей от 6 до 9 мТл и магнитных полей 0,8-5, 10-95 мТл статистически значимы при р<0,05. Размер выборки каждой группы составил n=14, степень свободы df=26 Изменения бактериального роста E. coli были обнаружены в том же диапазоне ПМП. Увеличение колониеобразующей способности и скорости роста наблюдалось при воздействии на бактерии ПМП 0-10 мТл независимо от наличия магнитных изотопов в питательной среде. Эти эффекты магнитного поля указывают на достоверность теоретических предсказаний и наличие магниточувствительных ферментативных реакций, протекающих в ионнорадикальном механизме. Для пула АТФ во втором диапазоне 15-95 мТл не было зарегистрировано никаких эффектов магнитного поля со статистической достоверностью. Зависимость внутриклеточной концентрации АТФ у бактерий E. coli от внешнего магнитного поля и содержания изотопов магния (24Mg, 25Mg, 26Mg, Mg) представлена на рисунке 12. В первом диапазоне 0,8-16 мТл были зарегистрированы эффекты магнитного поля и изотопа магния для всех бактерий. Статистически значимых эффектов внутриклеточных изменений АТФ в бактериальных клетках в диапазоне от 16 до 70 мТл обнаружено не было. Совместное воздействие внешнего ПМП и магнитного изотопа магния 25Mg на пул АТФ было обнаружено в диапазоне 70-98 мТл. 25

Пики пула АТФ в диапазоне от 0 до 16 мТ наблюдались для всех бактерий, обогащенных магнитными 25Mg и немагнитными изотопами 24,26Mg, а также природным магнием. Авторы утверждают, что этот эффект - результат различной эффективности магнитных и немагнитных изотопов магния как внутриклеточных элементов. Можно суммировать несколько эффектов, таких как магнитные, масс-зависимые изотопные эффекты и эффекты магнитного поля. Наблюдаемые эффекты представляют особый интерес из-за выбранного диапазона слабых магнитных полей. Они коррелирует с влиянием магнитного поля на содержание АТФ в контрольных экспериментальных группах (Рисунок 11). Аналогичные зависимости были получены авторами для скорости роста клеток E.coli. Рисунок 12– Магнитно-полевая зависимость пула АТФ у бактерий E. coli, культивируемых в среде М9 с содержанием изотопов магния 24Mg, 25Mg, 26Mg, Mg. Диапазон магнитных полей от 0,8 до 98 мТл. * Различия между средними значениями для магнитного изотопа магния 25Mg и немагнитного изотопа магния 24Mg и 26Mg при одном и том же магнитном поле статистически значимы при р<0,001 (n=12, df=22) Совместное действие магнитного изотопа иона магния 25Mg2+ и было обнаружено в АТФ-пуле бактерий E. coli в диапазоне от 70 до 98 мТл. Внутриклеточная концентрация АТФ увеличивается в 2-3 раза в этих полях для бактерий, обогащенных магнитным изотопом магния 25Mg. Интересно, что даже 10%-ное обогащение питательной среды магнитным изотопом 25Mg (это содержание магнитного изотопа в природном магнии) позволяет 26

регистрировать увеличение пула АТФ. Эти данные коррелируют с влиянием магнитных полей на колониеобразующую способность. Ключевая роль в этом сильнейшем эффекте магнитного поля принадлежит, скорее всего, увеличению скорости синтеза АТФ из-за участия ядерного спина 25Mg в ферментативной радикальной ионной реакции и индукции синглетно-триплетного превращения за счет механизма сверхтонкого взаимодействия. Это также подтверждается результатами экспериментов во внешнем магнитном поле с выделенными ферментами, обогащенными магнитными 25Mg и немагнитными 24Mg in vitro. В этом диапазоне ранее были обнаружены комбинированные эффекты ПМП и магнитных моментов атомного ядра 25Mg и 67Zn в содержании Na, Ca, Mg, P бактерий. Ионы магния являются эффективными участниками ионнорадикальных реакций ферментативного синтеза АТФ. Важно отметить, что все эти элементы Na, Ca, Mg, P связаны с работой бактериальных АТФ-асов. Изменения их внутриклеточного содержания подтверждают влияние внешних ПМП и магнитных моментов атомных ядер на ферментативные процессы синтеза АТФ в диапазоне 70-98 мТл. В результате проведения экспериментов по комбинированному воздействию ПМП и магнитного изотопа 67Zn на содержание АТФ в кишечной палочке авторами были получены экспериментальные магнитно-полевые зависимости содержания внутриклеточного АТФ в бактериях, культивируемых в средах с изотопами цинка. Результаты представлены на рисунке 13. На рисунке можно выделить три диапазона магнитных полей (2,2–8, 25-35 и 60-78 мТл) с характерными особенностями. В первом диапазоне содержание внутриклеточного АТФ повышалось независимо от типа изотопа цинка, а также в контрольных группах и в экспериментах (Рисунок 11) с изотопами магния (Рисунок 12). Аналогичные зависимости в этом диапазоне были получены для констант числа КОЕ и скорости роста клеток E. coli, культивируемых в среде M9 с изотопами цинка. В этом диапазоне внутриклеточное содержание АТФ повышается для всех бактерий. Однако у бактерий, выращенных на среде с магнитным изотопом 67Zn в диапазоне от 2,2 до 4,2 мТл, концентрация АТФ была в 2-3,5 раза выше. Это свидетельствовало о совместном влиянии внешнего ПМП и магнитных ядерных моментов 67Zn на ферментативный синтез АТФ. Во втором диапазоне КОЕ (25-35 мТл) концентрация АТФ несколько повышалась, но существенно не отличалась от концентрации других тест-групп бактерий. Это означает, что совместное воздействие ПМП и магнитного изотопа цинка на КОЕ и константы скорости роста, найденные в этом диапазоне, связано с другими ферментативными процессами, а не с синтезом АТФ. 27

Рисунок 13– Магнитно-полевая зависимость пула АТФ у бактерий E. coli, культивируемых в среде М9 с содержанием изотопов цинка 64Zn, 66Zn, 67Zn, *Zn. Диапазон магнитных полей от 2,2 до 78 мТл. ** Различия между средними значениями для магнитного изотопа цинка 67Zn и немагнитного изотопа цинка 64 Zn и 66Zn при одном и том же магнитном поле статистически значимы при р<0,05 (n=10, df=18) В третьем диапазоне ПМП (60-80 мТл) обнаружено незначительное увеличение внутриклеточной концентрации АТФ для бактерий, культивируемых в среде, содержащей магнитный изотоп цинка 67Zn. Аналогичный эффект наблюдался ранее при изучении комбинированного действия магнитного поля этого диапазона и магнитного изотопа магния 25Mg (Рисунок 12). Большинство ферментативных реакций синтеза АТФ протекают через образование ион-радикальной пары с участием Mg2+. Вероятно, при отсутствии ионов магния в среде двухвалентные ионы цинка Zn2+ могут замещать его в различных реакциях, включая синтез АТФ. Метаболизм ионов Mg2+ и Zn2+ зависит друг от друга, в том числе и по принципу "мимикрии", хорошо известному в микробиологии. В случае биологической недоступности необходимых двухвалентных ионов внутриклеточные молекулярные комплексы способны использовать имеющиеся ионы той же валентности в молекулярной среде. Поэтому многие ферментативные системы, использующие в своей работе ионы магния, способны взаимодействовать с ионами цинка и наоборот. Тем не менее, влияние ионов цинка было значительно меньше, а 28

обнаруженный комбинированный эффект внешнего ПМП и магнитного изотопа цинка был низким (не более 15%). Все наблюдаемые эффекты внешнего магнитного поля и магнитного изотопа цинка 67Zn согласуются с теорией магниточувствительности живых организмов. Воздействие магнитного поля в диапазоне от 0,8 до 16 мТл, регистрируемое для всех бактерий независимо от магний-изотопного обогащения среды, свидетельствует о чувствительности внутриклеточных процессов к слабым магнитным полям. Пул АТФ в бактериях Escherichia coli является магнитно-зависимым индикатором жизни микроорганизмов. Это зависит от величины внешнего ПМП и наличия ядерного магнитного момента изотопа магния, добавляемого в питательную среду. Совместное воздействие магнитного поля от 70 до 95 мТл и магнитного изотопа магния 25Mg на бактерии E. coli приводит к значительному увеличению внутриклеточной концентрации АТФ. Этот комбинированный эффект подтверждает возможность магнитного контроля внутриклеточного ферментативного синтеза АТФ. Совместные эффекты магнитного поля и магнитного изотопа магния в диапазоне от 70 до 95 мТл представляют особый практический интерес и нуждаются в дополнительном теоретическом обосновании. Именно это и явилось мотивацией данной выпускной квалификационной работе. 29

2 Кинетика и элементарные спин зависимые процессы ферментативного синтеза АТФ 2.1 Постановка задачи Экспериментальные исследования магнитно полевых зависимостей различных биохимических и функциональных параметров клеток E. coli, взращенных на питательных средах М9, обогащенных разными изотопами 24 Mg, 25Mg и 26Mg, продемонстрировали две интересные закономерности. Вопервых, в слабых магнитных полях (меньше 10 мТл) эти параметры возрастали с увеличением магнитного поля Н до некоторых постоянных величин. Такое поведение магнитно - полевых зависимостей согласуется с теорией ионрадикального механизма ферментативного каталитического синтеза АТФ. Это предсказывали оба механизма синглет - триплетной эволюции ионрадикальных пар (Δg- и СТВ - механизмы). Во-вторых, в промежуточных магнитных полях порядка 80 мТл существенно возрастает и внутриклеточное содержание АТФ и КОЭ. Например, КОЭ возрастает в 2,5 раза для изотопа 25 Mg, незначительно (в 1,5 раза) возрастает для естественной смеси изотопов * Mg и незначительно убывает для немагнитных изотопов 24Mg и 26Mg. Ни Δgмеханизм, ни СТВ - механизм не могут объяснить такое поведение магнитно полевых зависимостей. Магнитное поле Н, даже очень сильное, само по себе не в состоянии изменить динамику внутриклеточных процессов, тем более не в состоянии вызвать такие изменения в относительно узком диапазоне магнитных полей. С другой стороны, сильные изотопные различия магнитно полевых зависимостей указывают на участие ядерного спина 25Mg в динамике внутриклеточных процессов в этом диапазоне магнитных полей. Анализ магнитно-полевой зависимости, представленной на рисунке 12 позволяет предположить, что в магнитных полях от 70 до 100 мТл магнитное поле Н “включает” дополнительный канал ферментативного синтеза АТФ. Предварительная проверка этой гипотезы требует исследования простой модели кинетики такой “двухканальной” реакции и микроскопического объяснения механизма переключения каналов синтеза АТФ в ферментативных и внутриклеточных реакциях действием магнитного поля Н и ядерного спина. 2.2 Феноменологическая ферментативного синтеза АТФ кинетика “двухканального” Простейшую кинетическую схему реакции ферментативного синтеза АТФ ферментом АТФ-азой и другими фосфаттрансферазами можно представить следующим образом. В активном центре фермента появляются АДФ в виде комплекса с ионом Mg2+ и неорганический фосфат PO3 30

Конформационные изменения фермента сближают эти частицы, заставляя преодолеть кулоновское отталкивание фосфатных групп, и образуют АТФ с константой скорости kS. О О P О Mg2+ r О О О 2 О P О P О 1 О О  Рисунок 14 - Схема переноса электронной плотности с орбиталей   φ1 r1 φ1 r2  пирофосфатного фрагмента комплекса Mg-АТФ на молекулярную    орбиталь φu r   c1φ1 r   c2φ2 r  при сближении с заряженной фосфатной группой РО3 После этого АТФ покидает фермент, попадает в другой фермент, производит полезную работу, сопровождающуюся разделением АТФ на АДФ и фосфатную группу, которые затем вновь оказываются в активном центре АТФсинтазы с константой скорости k-1. Предполагается, что в течение всего сложного процесса все частицы и их комплексы находятся в синглетных спиновых состояниях. Это простая схема обратимой реакции k , k A, B  A  B , 1 где S (7) A, B – комплекс Ф, АДФ ; A  B – молекулы АТФ. Этой схеме обратимой реакции соответствует система кинетических уравнений d A, B/ dt  k S A, B  k 1 A  B  d A  B/ dt   k S A, B  k 1 A  B , (8) В нормальных стационарных условиях d A, B/ dt  d A  B/ dt  0 и система кинетических уравнений имеет простое решение, где соотношение продуктов определяется только отношением констант скоростей реакции A, B  k 1 k 1  k S , (9) 31

и A  B  kS 1  k 1  k S 1  (k 1 / k S ) , (10) Для того, чтобы объяснить эффекты “сильного” магнитного поля, приведенные на рисунке 12, предположим, что в активном центре фермента совместное действие магнитного поля Н и ядерного спина изотопа 25Mg индуцирует превращение одной из частиц комплекса (Фосфат-АДФ) из синглетного A, B S  состояния в триплетное состояние A, BT  с константой скорости k ST (H) . Предполагается, что из этого состояния комплекса тоже образуется АТФ, но с другой константой скорости kT , которая не зависит от магнитного поля. На основании этих предположений можно предложить следующую “двухканальную” схему реакции синтеза АТФ. Рисунок 15- Схема “двухканальной” реакции синтеза АТФ Этой схеме реакции соответствует система кинетических уравнений                 d A, B S / dt  k S A, B S  k ST A, B S  k 1 A  B ,  T T S d A, B / dt  kT A, B  k ST A, B  S T d A  B / dt   k S A, B  kT A, B  k 1 A  B  , (11) Для простоты вычислений удобно ввести другие обозначения для величин A, B S  , A, BT  и A  B A, B   A, A, B   B, S T  A  B   C. , 32 (12)

Теперь система уравнений может быть представлена в простом виде dA / dt  k S A  k ST A  k 1C ,  dB / dt  kT B  k ST A, dC / dt   k A  k B  k C. S T 1  , (13) При почленном сложении всех трех дифференциальных уравнений получается dA / dt  dB / dt  dC / dt  d ( A  B  C) / dt  0 , (14) Следовательно, система дифференциальных уравнений имеет интеграл движений, который можно положить равным 1 A  B  C  1, (15) Тогда C  1  ( A  B) , (16) Как правило, все биохимические и физиологические процессы в живых клетках развиваются достаточно медленно, что позволяет рассматривать их как квазистационарные или стационарные процессы и считать dA / dt  dB / dt  dC / dt  0 , (17) В этом случае система дифференциальных уравнений (13) превращается в систему простых алгебраических уравнений, для решения которой достаточно использовать только два уравнения  k ST A  kT B  0   k S A  kT B  k 1C , (18) После очевидной замены получается  k ST A  kT B  0   k S A  kT B  k 1 (1  A  B), И, окончательно, 33 (19)

 k ST A  kT B  0  (k S  k 1 ) A  (kT  k 1 ) B  k 1 , (20) Определитель системы   k ST (kT  k 1 )  kT (k S  k 1 ) , (21) Количество частиц А A  kT k 11  kT k 1 k ST (kT  k 1 )  kT (k S  k 1 ) , (22) Количество частиц В B  kT k 11  k ST k 1 k ST (kT  k 1 )  kT (k S  k 1 ) , (23) Количество частиц С в случае “двухканальной” реакции 1  k ( k  kT )  kT (k ST  k S )  , C  1  1 ST k ST (kT  k 1 )  kT (k S  k 1 )  kT (k ST  k S )  (24) зависит от всех четырех констант скорости kT , k ST , k S и k 1 . Равенства (10) и (24) позволяют определить условия, при выполнении которых “двухканальный” путь реакции будет эффективнее “одноканального”. Как и следовало ожидать, “двухканальный” путь реакции будет эффективнее “одноканального”, если kT  k S независимо от константы скорости k ST превращения комплексов A, B S  в комплексы A, BT . Однако эта константа существенно влияет на количество продукта реакции A  B . Интересная ситуация возникает, если константа становится достаточно большой kST  kT , k S . В этом случае   C 1 kT  1  (k1 / kS ) k1  kT , (25) и основным источником образования молекул A  B является предшественник A, BT .   34

2.3 Сверхтонкое взаимодействие как причина S-T эволюции неподеленной электронной пары в молекулах Очевидно, и общеизвестно, что ни магнитное поле Н, ни ядерный спин не способны повлиять на энергетику химических и биохимических реакций; они могут повлиять только на спиновое состояние реагирующих частиц и. тем самым, влиять на кинетику спин-зависимых процессов. Но подавляющее большинство органических молекул находятся в диамагнитном синглетном спиновом состоянии и участвуют в молекулярных реакциях без образования парамагнитных радикалов. Для двух эквивалентных и неразличимых электронов это состояние S  21 / 2 1 2  1 2 . Находясь в синглетном состоянии, электроны обладают нулевым суммарным спиновым моментом, который не взаимодействует с внешним магнитным полем Н. Поэтому магнитное поле не способно индуцировать синглет-триплетную эволюцию в диамагнитных молекулах. На первый взгляд, кажется, что и сверхтонкое взаимодействие (СТВ), если его представлять в обычном виде,     H СТВ  a S1  S 2 I ,   (26) неспособно переводить синглетные молекулы в триплетное состояние, так как        H СТВ S  ,   a S1  S 2 I S  ,   a S1  S 2 S I  ,    0 ,      (27) Считается, что в большинстве ферментативных реакций работают молекулярные механизмы, например, нуклеофильное присоединение, которое не оставляет возможностей для проявления магнитных и спиновых эффектов, известных для радикальных и ион-радикальных реакций. Но в фотовозбужденных органических молекулах синглет-триплетная конверсия эквивалентных электронов возможна и происходит из-за спин-орбитального взаимодействия, в котором участвуют эквивалентные спины двух электронов    S1 и S 2 и угловой момент L их орбитального движения. При этом важную роль играет симметрия пространственной волновой функции двух электронов. Подобным образом и сверхтонкое взаимодействие с учетом симметрии пространственной волновой функции неразличимых электронов с ядерным спином способно переводить молекулы из синглетного в триплетное состояние. Для понимания физического механизма синглет-триплетной конверсии, индуцированной сверхтонким взаимодействием, необходим учет  пространственных частей полной волновой функции электронов r, s  ,  включающей пространственную φ1 r  и спиновую S части   r , s   φ1 r  S , 35 (28)

Пусть в начальный момент времени два электрона находились в синглетном спиновом состоянии на одной и той же молекулярной орбитали  φ1 r  . Тогда их общее состояние будет описываться волновой функцией     r1 , r2 , s   21 / 2 φ1 r1 φ1 r2  1 2  1 2 , (29) Далее будем считать это состояние начальным состоянием одного из партнеров молекулярного комплекса в активном центре металлсодержащего фермента, например, пирофосфатного фрагмента АДФ в комплексе с ионом Mg2+. Пространственное сближение этого фрагмента с отрицательно заряженной фосфатной группой PO3 неизбежно вызовет “деформацию” электронной плотности пирофосфатного фрагмента АДФ и ее делокализацию на ион Mg2+ и, возможно, далее – на аденозиновую часть этой молекулы. Очевидно, что во время и после такой делокализации этом оба электрона остаются неразличимыми и эквивалентными, их спиновое состояние не изменяется и остается синглетным S . Новое пространственное распределение электронов можно описать новой одноэлектронной волновой функцией    φu r   c1φ1 r   c2φ2 r  , (30) Теперь волновая функция двух электронов будет     u r1 , r2 , s   2 1 / 2 φ u r1 φ u r2  1  2  1 2 , (31) Из-за требования антисимметрии полной волновой функции пространственные части всех триплетных состояний T  1 2 , должны быть антисимметричными, причем T0  21 / 2 12  1 2 и T  1 2 электроны должны находиться на разных ортогональных пространственных   орбиталях φu r  и φ g r  . В качестве второй ортогональной функции можно взять молекулярную орбиталь    φ g r   c2φ1 r   c1φ2 r  , (32) Полная волновая функция двухэлектронных триплетных состояний будет       g r1 , r2 , s   21/ 2 φu r1 φ g r2   φ g r1 φu r2 T,0 36 , (33)

присутствие в молекулах ядерного спина I = ½ учитывается умножением     электронных волновых функций u r1, r2 , s  и g r1 , r2 , s  на векторы состояний ядерного спина  n и  n . Для синглетного состояния имеем      u (r1 , r2 )  u r1 , r2 , s   n ,     u (r1, r2 )  u r1, r2 , s  n , (34) И (35) Для триплетных состояний      g (r1 , r2 )  g r1, r2 , s   n , (36) и      g (r1, r2 )  g r1 , r2 , s  n (37) , Гамильтониан сверхтонких взаимодействий электронных и ядерных спинов в молекулах имеет вид   8   8  H СТВ    gg n  n SI    gg n  n S z I z  ( S I   S I  ) / 2   S z I z  ( S I   S I  ) / 2 ,  3   3  (38)     где S – оператор двух электронных спинов S1 и S 2 в точке rA расположения ядра в молекуле        S  S1 r1  rA   S 2 r2  rA  , (39) Чтобы учесть роль пространственной части волновых функций двух  электронов гамильтониан H СТВ сверхтонкого контактного взаимодействия следует представить в виде             H СТВ  8 / 3gg n  n S  I  8 / 3gg n  n S1 r1  rA   S 2 r2  rA   I , (40) В этом выражении две присутствие двух δ- функций показывает, что взаимодействие “включается” только тогда, когда электронные спины  находятся в точке расположения ядра rA ; обе пространственные части волновых функций. 37 δ-функции действуют на

    Каждая из компонент S z , S  и S  операторов электронных спинов S1 и   S 2 , действуя совместно с операторами ядерного спина I , способны переводить синглетное спиновое состояние диамагнитной молекулы в триплетное. Для  операторов первого электронного спина S1   S1z I z 12  1 2  n 21/ 2  23 / 2 12  1 2  n  21 T0  n   S1 I  1 2  1 2  n 2 1/ 2  2 1/ 2 1 2  n  2 1/ 2 T  n ,  S1 I  1 2  1 2  n 2 1/ 2  2 1/ 2 1 2  n  2 1/ 2 T  n (41)  Для операторов второго электронного спина S 2   S2 z I z 12  1 2  n 21 / 2  23 / 2 12  1 2  n  21 T0  n   S2 I  12  1 2  n 21/ 2  21 / 2 1 2 n  21 / 2 T n ,  S2 I  12  1 2 n 21 / 2  21 / 2 12  n  21 / 2 T  n (42) Сравнение формул (41) и (42) показывает, что действие каждого из   спинов S1 и S 2 на спиновой вектор синглетного состояния S переводит его в триплетные состояния T , T0 и T , однако результаты их действий отличаются знаками. Совместные эффекты всех спиновых операторов, включенных в сверхтонкое взаимодействие в диамагнитных молекулах, можно определить, лишь вычислив матричные элементы оператора гамильтониана сверхтонких взаимодействий              g (r1, r2 , s) H СТВ u (r1, r2 , s)    g (r1, r2 , s)  (r1  rA ) S1I u (r1, r2 , s)            g (r1, r2 , s)  (r2  rA ) S2 I u (r1, r2 , s) Здесь    g (r1 , r2 , s) (43)   8 / 3gg n  n . Поскольку векторы состояния u (r1 , r2 , s) и являются произведениями пространственных волновых функций   φu r  и φ g r  , векторов состояния электронных спинов T , T0 , T и S , а также векторов состояния ядерного спина  n и  n , то матричные элементы  можно представить в виде произведения матричных элементов операторов S1 ,   S 2 и I и вычислять их по отдельности. Например, для первого электронного  спина S1                g (r1, r2 , s)  (r1  rA )S1I u (r1, r2 , s)   b (r1, r2 )  (r1  rA )  a (r1, r2 ) ψb S1I ψa 38 , (44)

    В этой формуле  a (r1, r2 ) и  b (r1, r2 ) - пространственные двухэлектронные волновые функции начального и конечного состояния, а ψb и ψ a – векторы    состояния ядерного спина I и двух электронных спинов S1 и S 2 . Для первого электронного спина пространственных волновых функций,          S1 множитель, зависящий от        b (r1, r2 )  (r1  rA )  a (r1, r2 )  21 φu r1 φ g r2   φ g r1 φu r2   (r1  rA ) φu r1 φu r2       φu rA   φ g rA . (45) Для второго электронного спина пространственных волновых функций,          S2  множитель, зависящий от       b (r1, r2 )  (r2  rA )  a (r1, r2 )  21 φu r1 φ g r2   φ g r1 φu r2   (r2  rA ) φu r1 φu r2       φu rA   φ g rA  , (46) Эти множители для первого и второго спинов отличаются знаками “плюс” и “минус”. Следовательно, сверхтонкое взаимодействие двухэлектронных состояний в молекулах из-за антисимметрии полной волновой функции необходимо описывать спиновым гамильтонианом     2  2    H СТВ  8 / 3gg n  n φu rA  φ g rA  (S1  S2 ) I  a(S1  S2 ) I , (47) где a – константа сверхтонкого взаимодействия для двухэлектронного антисимметричного состояния   a  8 / 3ggn nφu rA φ g rA  , (48) Это сверхтонкое взаимодействие смешивает синглетное и триплетные состояния молекул и, при определенных условиях, способно переводить молекулы из синглетного в триплетное состояние с перераспределением электронной плотности.       При вычислении матричных элементов  b (r1, r2 )  (r1  rA )  a (r1, r2 ) и        b (r1 , r2 )  (r2  rA )  a (r1 , r2 ) использованы ортогональность и нормировка   пространственных волновых функций φ1 r  и φ2 r         φi r  φ j r    φi r  φ j r dr   ij , - и свойства δ-функции 39 (49)

       φi r   φi r    (r  rA )dr  -         φ r   (r  r )dr  φ r  i 2 A i A 2 , (50) - Для вычисления множителей, зависящих от пространственных двухэлектронных волновых функций, следует воспользоваться их полезным       свойством. Если φu r   c1φ1 r   c2φ 2 r  и φ g r   c2φ1 r   c1φ2 r  , то их антисимметричная комбинация является антисимметричной комбинацией   базисных волновых функций φ1 r  и φ 2 r  .     2 1 / 2 φ u r1 φ g r2   φ g r1 φ u r2   c φ r   c2 φ 2 r1   c2 φ1 r2   c1φ 2 r2   1 / 2  1 1 1 2                   c φ r  c φ r  c φ r  c φ r 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 2 2        2 1 / 2 φ1 r1 φ 2 r2   φ 2 r1 φ1 r2  (51) Предположим, что в данном случае нет переноса электрона и нет образования ион-радикальных пар. Тогда остается единственная возможность – предположить, что из синглетного в триплетное состояние переходит только одна из частиц комплекса в активном центре фермента, вторая остается в исходном синглетном состоянии. Очевидно, что внутримолекулярная синглет-триплетная S-T конверсия оставляет электроны неразличимыми и химически эквивалентными, но обязательно изменяет их пространственное распределение из-за антисимметрии полной волновой функции, включающей спиновую и пространственную части. Такая S-T конверсия возможна только в области квазпересечения синглетного и триплетного терма молекулы. Этот механизм маловероятен в малых молекулах, с большим расщеплением основного синглетного и возбужденного триплетного терма. Однако этот механизм может быть эффективным в больших ферментсубстратных комплексах, где возможно перераспределение электронов на большие расстояния, что уменьшает синглет-триплетное расщепление. В результате S-T конверсии пространственная часть полной электронной   волновой функции g r1 , r2 , s  комплекса Mg-АДФ переходит из состояния с   двумя электронами на одной орбитали φ1 r1 φ1 r2  пирофосфатного фрагмента в     21 / 2 φ1 r1 φ2 r2   φ2 r1 φ1 r2 , где электроны находятся на разных состояние   молекулярных орбиталях φ1 r  и φ2 r  . Очевидно, что такое перераспределение уменьшает электронную плотности на молекулярной орбитали пирофосфатного фрагмента АДФ и уменьшает кулоновское отталкивание с электронами нерганического фосфата РО3. Изменение пространственного распределения электронов, участвующих в образовании химических связей, очевидно, способно изменить энергию отталкивания взаимодействующих частиц, то есть изменить высоту барьера 40

реакции и энергию активации и, следовательно, константу скорости термоактивируемых реакций. Если реакция является не термоактивируемой, а “принудительной” и индуцированной конформационной перестройкой фермента, то изменение высоты барьера активации способно уменьшить время прохождения реакционной зоны и тоже увеличить скорость элементарного акта реакции. Поэтому естественно предположить, что в магнитных полях порядка 80 мТл магнитное поле и спин ядра “включают” дополнительный триплетный канал ферментативной реакции с константой скорости kT , увеличивающий скорость образования АТФ. 41

2.4 Основные результаты и выводы Кинетический анализ показал, что ”включение” дополнительного канала ферментативного фосфорилирования с константой скорости kT способен увеличивать выход АТФ, если эта константа больше скорости “синглетного” канала kT  k S . Проведен квантово-механический анализ контактного взаимодействия Ферми для диамагнитных молекул с заполненными электронными оболочками. Показано, что в диамагнитных молекулах сверхтонкое взаимодействие двух эквивалентных и неразличимых электронах может индуцировать синглеттриплетную конверсию и переводить молекулы в триплетное состояние. Синглет-триплетная конверсия в диамагнитных молекулах, индуцированная контактным взаимодействием, наиболее эффективна в магнитных полях, соответствующих квазипересечению синглетного и триплетного энергетического уровня. Спиновая синглет-триплетная конверсия обязательно сопровождается перераспределением электронной плотности в молекулах, что вызывает уменьшение кулоновского отталкивания электронов других молекул и увеличение скорости ферментативных реакций. 42

Заключение Кинетический и квантовомеханический анализ реакции ферментативного фосфорилирования и ее элементарного акта – присоединение нерганического фосфата к комплексу Mg-АДФ – показали, что внешнее магнитное поле Н и ядерный спин иона 25Mg способны увеличивать скорость реакции и выход АТФ в области магнитных полей, соответствующих квазипересечению синглетного и триплетного терма участников реакции. В процессе выполнения квалификационной работы освоены методы феноменологической кинетики и их применение для анализа биохимических ферментативных реакций. Освоены основные методы квантовомеханического описания спин зависимых процессов в конденсированных средах. Получены оригинальные результаты о влиянии ядерных спинов и магнитных полей на ферментативные реакции. Задачи выпускной квалификационной работы выполнены. 43

Список использованных источников 1) Вонсовский, С.В. Магнетизм / С.В.Вонсовский, А.А. Гусев, К.Ф. Брудко–Москва.: Наука, 1984.–208с. 2) Кудреватых, Н. В. Магнетизм редкоземельных металлов и их интерметаллических соединений : [учеб. пособие] / Н. В.Кудреватых, А. С. Волегов ; М-во образования и науки Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т. – Екатеринбург.: Урал. ун-та, 2015. – 198с. 3) Бучаченко, А.Л. Новая изотопия в химии и биохимии / А.Л.Бучаченко–М.: Наука, 2007.–189с. 4) Buchachenko, A.L. Electron spin catalysis / Berdinsky V.L. // Chem. Rev. – 2002. – Vol. 102. – P. 603–612. 5) Летута, У.Г. Магнитно-полевые эффекты в бактериях E. coli в присутствии изотопов Mg. / У.Г.Летута, Е.И.Авдеева, В.Л.Бердинский – Известия Академии Наук, 2014. – 1089-1102с. 6) Бинги, В.Н. Физические проблемы действия слабых магнитных полей на биологические системы / В.Н. Бинги, А.В.Савин // Успехи физических наук, 2003. – Т.173(3). –265–300с. 7) Бучаченко, А.Л. Cпиновый катализ - новый тип катализа в химии/ А.Л. Бучаченко, В.Л. Бердинский // Успехи химии. – 2004. – Т. 73, № 11. – С. 1123-1130. 8) Салихов, К. М. 10 лекций по спиновой химии / К.М. Салихов. – Казань: УНИПРЕСС, 2000. – 152 с. 9) Сагдеев, Р.З. Влияние магнитного поля на процессы с участием радикалов и триплетных молекул в растворах / Сагдеев Р.З., Салихов К.М., Молин Ю.Н. // Успехи химии, 1977. – Т. 46, № 4. – C. 569-601. 10) Холодов, Ю.А. Магнитные поля биологических объектов /Ю.А. Холодов, А.Н. Козлов, А.М. Горбач – М: Наука, 1987. – 145с. 11) Frankel, R.B. Magnetotactic bacteria at the geomagnetic aquato / R.B.Frankel, R.B.Blakemore//Science, 1981.-Vol.212.-P.1269-1270 12) Бучаченко, А.Л. Магнитно-спиновые эффекты в химии и молекулярной физике/Я.Б. Зельдович, А.Л. Бучаченко, Е.Л. Франкевич. – М.: Успехи физических наук, 1988. – 483с. 13) Buchachenko, A.L. Magnetic field affects enzymatic ATP synthesis / A.L.Buchachenko, D.A.Kouznetsov // J. Am. Chem. Soc. -2008. – Vol. 130. – P. 12868-12869. 14) Бучаченко, А.Л. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях / А.Л Бучаченко, Р.З Сагдеев, К.М Салихов. – Новосибирск: Наука, 1978. – 355с. 15) Бучаченко, А.Л. Магнитно-спиновые эффекты в химии и молекулярной физике/Я.Б.Зельдович, А.Л.Бучаченко, Е.Л.Франкевич. – М.: Успехи физических наук, 1988. – 483с. 16) Бучаченко, А.Л. Спиновая химия «новая земля» в науке /А.Л.Бучаченко, Е.Л.Франкевич – М.: Успехи физических наук,1988. –453с.

17) Шевченко У.Г. Биологические эффекты магнитного изотопа магния 25Mg в клетках E. сoli / У.Г.Шевченко, Е.И.Авдеева, В.Л.Бердинский // Хим.физика, 2012 – Т31(30), № 7. – 1-18с. 18) Холодов, Ю. А. Магнетизм в биологии. - М.: Наука, 1970. –97с. 19) Letuta, U.G. Magnetosensitivity of bacteria E. coli: Magnetic isotope and magnetic field effects / U.G. Letuta, Berdinskiy V.L.// Bioelectromagnetics, 2017. –P. 581–591. 20) Летута, У. Г. Ферментативные механизмы биологической магниточувствительности: эффекты ядерного спина [Электронный ресурс] / У.Г. Летута, В.Л. Бердинский // Известия Академии наук. Сер. Химическая. – 2015. – №7. - С. 1547-1552. 45

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Элина Каепкулова

ВКР состоит из двух основных частей: литературного обзора по теме работы, и оригинальной части, где изложены теоретические результаты,полученные Каепкуловой Элиной Ильгизовной. Студент Каепкулова Э.И. самостоятельно изучила научную литературу по теме ВКР, выполняла все теоретические расчеты и провела анализ полученных результатов. Работа выполнена на высоком уровне, полученные результаты имеют ...

больше 4 лет назад