Выявление туберкулёзных микобактерий морфологическими методами при фиброзно-кавернозном туберкулёзе

Тема НИР: «Выявление туберкулёзных микобактерий морфологическими методами при фиброзно-кавернозном туберкулёзе». Научный руководитель: проф. Д.м.н. Цинзерлинг Всеволод Александрович Исполнитель: аспирант очной формы обучения Агапов Михаил Михайлович АННОТАЦИЯ. Актуальность. По данным информационного бюллетеня ВОЗ за октябрь 2017 года, туберкулёзом в 2016 году в мире заболели 10,4 миллиона человек, умерли – 1,7 миллиона. Заболевание входит в число 10 наиболее распространённых причин смерти в мире. Туберкулёз наряду с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, ВИЧ-инфекцией и злокачественными новообразованиями выступает отдельным пунктом в утверждённой в 2014 году Государственной программе развития здравоохранения в Российской Федерации. Разумеется, задача улучшения ситуации с заболеваемостью и смертностью от туберкулёза в равной степени лежит как на лечебно-профилактическом, так и на диагностическом звеньях оказания медицинской помощи. В практике большинства стационаров, даже имеющих доступ к высокотехнологичным методам выявления микобактерий, морфологическая диагностика была, остаётся и будет одной из основных составляющих дифференциального диагноза очаговых и инфильтративных процессов в лёгких, внутригрудных лимфатических узлах и других локализаций. Цель исследования. Оптимизация выявления туберкулёзных микобактерий в тканях. Задачи исследования. 1) Подбор наиболее сложных для классического бактериоскопического выявления туберкулёзных микобактерий случаев, сопровождающихся многолетним течением заболевания с длительной безуспешной терапией. 2) Анализ отрицательных результатов окраски по Цилю-Нильсену при выраженности морфологических признаков туберкулёза (казеозный некроз, формирование гранулём с гигантскими клетками Лангганса) и наличии рентгенологических, микробиологических, иммунологических признаков туберкулёза. 3) Сравнение результатов гистохимического выявления микобактерий по Цилю-Нильсену, флюоресцентной окраски аурамином-родамином и иммуногистохимического метода. 4) Сбор данных о морфологических и тинкториальных свойствах туберкулёзных микобактерий необычной формы. Научная значимость. Расширить представления о микробиологических свойствах возбудителя, его жизненном цикле, структуре клеточной стенки, способности к образованию биоплёнки. Практическая значимость. Ранее не встречались попытки произвести подробный анализ случаев отрицательной или слабоположительной окраски по Цилю-Нильсену, т.к. причиной подобных явлений считались дефекты при окраске, взятии материала, его фиксации, обезвоживании, либо ошибки при приготовлении реактивов. Благодаря расширению знаний о тинкториальных свойствах туберкулёзных микобактерий появится возможность выработать алгоритм морфологической диагностики туберкулёза и избежать случаи гипо- и гипердиагностики заболевания. Материалы и методы. Было изучено 24 аутопсийных случая клинически, рентгенологически и микробиологически верифицированного фиброзно-кавернозного туберкулёза лёгких. Большинство пациентов – мужчины, средний возраст 49,67±5,77 лет. У большей части пациентов была зафиксирована широкая (14 случаев ШЛУ МБТ) либо множественная (5 случаев МЛУ МБТ) лекарственная устойчивость (т.е. невосприимчивость заболевания, соответственно, к четырём или двум противотуберкулёзным препаратам первой линии), при этом ни в одном из случаев не имелось сочетания туберкулёза с ВИЧ. Во всех наблюдениях имело место длительное течение заболевания и продолжительное лечение в профильных стационарах. Кусочки лёгких для гистологического исследования фиксировались в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой в спиртах и заливкой в парафин по общепринятым методикам. Срезы окрашивались гематоксилином-эозином, карболовым фуксином по Ц-Н, аурамином-родамином (с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа), так же производилось иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к антигену РАВ (Protein antigen B). Исследование включало в себя оценку выраженности морфологических изменений в области каверн и активности туберкулёзного процесса, подсчёт количества микобактерий при увеличении х400 и количества полей зрения, в которых они визуализируются, соотношения между различными морфологическими формами возбудителя (палочковидными, кокковидными и прочими), а так же их локализации (внутриклеточно, внеклеточно, либо в виде адгезированных на поверхности фагоцитов). После оценки процентного соотношения различных морфологических форм микобактерий подсчитывалось среднее значение для каждой формы, затем вычислялась абсолютная погрешность с доверительной вероятностью γ=0,95. Значимость различий между методами исследования оценивалась путём вычисления критерия Стьюдента и сравнения с критическими значениями. Результаты. Во всех наблюдениях выявлены характерные для прогрессирующего туберкулёза изменения. При окраске по Цилю-Нильсену обнаруживались единичные скопления кислотоустойчивых бактерий (менее чем в 10 полях зрения общим числом не более 1000). При окраске аурамином-родамином число обнаруженных микобактерий оказалось достоверно выше (в 10-50 полях зрения, общим числом от 1000 до 10000), а наибольшим оно было при ИГХ-исследовании (более чем в 50 полях зрения общим числом свыше 10000). При этом локализация микобактерий при всех видах исследования была исключительно внеклеточной. Доля типичных палочек при окраске по Цилю-Нильсену (85-95%, в среднем 88,13±2,14) значимо больше таковой, выявленной при окраске аурамином-родамином (50-85%, в среднем 64,38±4,24) и ещё более значимо больше, чем при проведении ИГХ (50-70%, в среднем 57,29±2,78). Столь же сильно разнятся показатели для атипичных морфологических форм микобактерий, выявляемых при окраске по Цилю-Нильсену в минимальном количестве, и обнаруживаемых в большом количестве при флюоресцентном исследовании и ИГХ-исследовании. Выводы. 1. Во всех исследованных случаях диагноз туберкулёз не вызывал никаких сомнений и, несмотря на значительные различия индивидуальных особенностей пациентов, морфологическая картина во всех без исключения случаях имела поразительное сходство. 2. Проведённое исследование подтвердило, что туберкулёзные микобактерии могут выявляться в тканях с помощью различных методов и иметь различную морфологию, при этом наличие даже небольшого числа кислотоустойчивых бактерий при окраске по Ц-Н является важным диагностическим признаком, но их отсутствие не свидетельствует об отсутствии туберкулёза. 3. При использовании всех бактериоскопических методов на светооптическом уровне на нашем материале внутриклеточных форм возбудителя не обнаружено. 4. Наибольшая доля атипичных морфологических форм микобактерий обнаруживается при флюоресцентном (35,62%) и иммуногистохимическом (42,71%) исследованиях, что демонстрирует их более высокую чувствительность, в то время как при окраске по Ц-Н атипичные микобактерии выявляются в сравнительно небольшом количестве (11,87%). 5. Микобактерии однозначно обладают различной вирулентностью, которая не связана с видовой принадлежностью, а имеет, наиболее вероятно, генетические основы. 6. Микробиологическая сущность и клиническое значение морфологического полиморфизма микобактерий требуют дальнейшего изучения. Более того, можно утверждать, что в уточнении нуждается и патогенез туберкулёза в целом.