Анализ микрофлоры сыра на примере пропионовокислых бактерий

Мохова И.Д.

Анализ микрофлоры сыра на примере пропионовокислых бактерий

19.03.01 Биотехнология

Биотехнология

Дипломы

Вуз: Белгородский государственный университет - национальный исследовательский университет (НИУ «БелГУ»)

ID: 5b8881ad7966e1073081b6c1

UUID: bf737590-8edc-0136-b584-525400005860

Язык: Русский

Опубликовано: около 6 лет назад

Просмотры: 276

Мохова И.Д.

Источник: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 1,3 МБ

Поделиться работой

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» ( Н И У « Б е л Г У » ) ИНСТИТУТ ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК КАФЕДРА БИОТЕХНОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ АНАЛИЗ МИКРОФЛОРЫ СЫРА НА ПРИМЕРЕ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Выпускная квалификационная работа обучающейся по направлению подготовки 19.03.01 Биотехнология очной формы обучения, группы 07001316 Моховой Ирины Дмитриевны Научный руководитель ассистент кафедры биотехнологии и микробиологии, Клюева В.В. БЕЛГОРОД 2017

2 ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………... 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………….. 7 Основные характеристики пропионовокислых бактерий…...... 7 1.1. 1.1.1. Физиолого-биохимические свойства пропионовокислых бактерий………………………………………………………………… 8 1. 1.2. Антимутагенные свойства…………………………………….... 10 1.2. Практическое применение пропионовокислых бактерий…………………………………………………………. 11 1.2.1. Получение витамина В12……………………………………...... 11 1.2.2. Иммуномодулирующее действие………………………............ 13 1.2.3. Антиоксидантные ферменты ………………………………..… 14 1.2.4. Применение в животноводстве и в получении пропионовой кислоты …………………………………………………….................... 15 Производство твердых сыров…………………………….......... 25 1. 3.1. Характеристика твердых сыров……………………................... 25 1.3.2. Свертывание молока и обработка сгустка…………………….. 25 1.3.3. Дробление сырной массы и постановка зерна………………... 26 1.3.4. Второе нагревание..…………………………………………….. 27 1.3.5. Прессование и посол сыра……………………………………... 28 1.3. 1.3.6. Влияние способа прессования сыра на количество пропионовокислых бактерий…………………………………... 30 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………... 32 2.1. Материал исследования………………………………………..…. 32 2.2. Методы исследования…………………………………………….. 34 2.2.1. Анализ микрофлоры сыров методом разбавления………………………………...…………………………... 2.2.2. Методы микроскопического 34 исследования микроорганизмов………………………………………………………. 36 2.2.3. Статистическая обработка цифровых данных………………… 37

3 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………. 3.1. Групповой анализ микрофлоры сыра. 39 Численность микроорганизмов, выросших на питательной среде………………… 39 3.2. Микроскопическое исследование микрофлоры сыров…………. 40 3.3. Статистическая обработка цифровых данных…………………... 41 3.3.1. Обработка цифровых данных методом дисперсионного 41 анализа………………………………………………………………….. 41 3.3.2. Обработка цифровых данных разностным методом………….. 42 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………… 45 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………… 47

4 ВВЕДЕНИЕ Еще с древности сыр являлся ценным и незаменимым продутом питания первобытных племен, его история начинается с возникновением кочевых восточных племен. Сыр очень высоко ценится во всем мире по своим пищевым и вкусовым достоинствам. В среднем в нем содержится до 32, в иных сортах до 45 процентов жира, свыше 25 процентов белков, важные органические соли и витамины. Актуальность Свойства и качественный состав сыра определяется микроорганизмами и экзоферментами, которые осуществляют различные биохимические процессы при изготовлении сыров, а именно: гидролиза белков до аминокислот, жиров – в свободные жирные кислоты, углеводов – в молочную кислоту. Технологический процесс производства сыра включает в себя такие операции как: подготовка молока к свертыванию, свертывание молока, получение и обработка сгустка, формование сырной массы, самопрессование и прессование сырной массы, посолка сыра и созревание. Главная и ценная особенность твердых сыров состоит в том, что они могут храниться длительное время без потери своих полезных свойств. Сыр производят при свертывании белков молока, затем идет процесс обработки сгустка для его обезвоживания и дальнейшего созревания сырной массы. По виду свертывания молока выделяют сычужные и кисломолочные сыры. Чаще всего производятся сыры, где молоко свертывается при помощи сычужного фермента. Сычуг – это часть желудка жвачного животного, в нем есть особые ферменты, которые приводят к свертыванию молока. Получившийся сгусток затем подвергают дроблению, измельчению и прессованию. После чего идет стадия прессования и заключительное созревание сыра.

5 Различные сорта сыра имеют свои особенности созревания. Например, голландским сырам требуется от 2 до 3 месяце, швейцарским от 6 до 8 месяцев. У них образуются характерные «глазки» - пустоты от газов, которые выделяются при брожении, появляется особый пикантный сладковатый вкус и аромат. Также на поверхности могут выделяться «слёзы» - это маленькие капельки воды, насыщенные солями молока. В основе производства сыра используется ферментативно- микробиологический процесс, протекание которого зависит от физикохимических свойств молока, состава микроорганизмов закваски, их способности развиваться в молоке, в сгустке и сырной массе и условий технологического процесса. Молочный жир, содержащийся в сыре, незаменим для питания людей, так как является основным поставщиком энергии и помогает усваиваться жирорастворимым витаминам A, D, E. При созревании твердых сортов сыра молочные жиры расщепляются и происходит накопление летучих жирных кислот, которые и придают особый сырный аромат. К таким жирным кислотам относятся – масляная, каприловая и капроновая. Также в сыре содержится много белка, минеральных солей и витаминов, и незаменимых аминокислот. Они находятся между собой в хорошо сбалансированном соотношении, что помогает более быстрому перевариванию и извлечению организмом нужных компонентов. 100г сыра содержит 20-30 г белка, 32-33 г жира, около 1 г кальция, 0,8 г фосфора. Сыр является высококалорийным продуктом питания из-за высокого содержания жиров и белков. На 100г приходится от 200 до 400 кКал (8401680 кДж). Твёрдые сыры — одна из больших групп сыров, к ней относятся такие виды как Швейцарский, Голландский, Маасдам и др. Для них характерно относительно невысокое содержание влаги и плотная консистенция, в связи с прессованием во время производства.

6 Цель работы: оценить влияние длительности хранения на количественный состав пропионовокислой микрофлоры «Швейцарского» сыра и «Маасдам» В соответствии с поставленной целью необходимо решить следующие задачи: 1) Изучить количественный состав микрофлоры «Швейцарского» сыра и сыра «Маасдам» 2) Сравнить количество пропионовокислых бактерий в исследуемых продуктах в зависимости от сроков хранения Структура работы: дипломная работа состоит из введения, трёх глав, заключения и списка использованной литературы.

7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Основные характеристики пропионовокислых бактерий. Бактерии рода характеризуются Propionibacterium как грамположительные, неподвижные палочки, слегка искривленные, иногда – ветвящиеся, похожи на микобактерии. Величина клеток меняется в зависимости от возраста и условий роста. В молодых культурах и в аэробных условиях – палочки, затем они укорачиваются иногда до кокковидных форм. Эти последние соединены в короткие цепочки. В анаэробных условиях клетки более длинные, проактиномицетов. ветвящиеся, Внутри клеток напоминают часто промицелий обнаруживаются легко окрашиваемые зерна. Культуры образуют пигменты. Сбраживают молочную кислоту, сахара и спирты с образованием пропионовой, уксусной кислоты и углекислоты. Как правило, имеют каталазу, развиваются в анаэробных условиях, но могут расти и в анаэробных. Используют для питания различные органические соединения. [11] Пpoпиoнoвoкислыe бaктepии шиpoкo применяются при изготовлении кислoмoлoчныx пpoдуктoв, иммуннoстимулиpующими так и как oни oблaдaют aнтимутaгeнными oсoбeнными свoйствaми, oни пpиживaются в кишeчникe людeй и спoсoбны к уменьшению уровня пагубного тoксичнoгo вoздeйствия разнообразных xимичeскиx сoeдинeний и ультpaфиoлeтoвыx лучeй. Важно отметить, чтo пoлoжитeльнaя poль пpoпиoнoвoкислыx бaктepий кaк пpoбиoтикoв обуславливается их способность к образованию пpoпиoнoвoй кислoты, минopныx opгaничeскиx кислoт, бaктepиoцинoв и фepмeнтoв. [9, 7] Пpoпиoнoвoкислыe бaктepии синтeзиpуют бoльшoe кoличeствo витaминa В12, кoтopый принимает участие в регуляции oснoвных oбмeнных процессов в opгaнизмe, спoсoбствуeт пoвышeнию иммунитета opгaнизмa, улучшaeт oбщee сaмoчувствиe зa счeт aктивизaции бeлкoвoгo, углeвoднoгo и

8 жиpoвoгo oбмeнa, улучшaeт кaчeствo кpoви, учaствуeт в синтeзe paзличныx aминoкислoт, нуклeинoвыx кислoт. [3] Пpoпиoнoвoкислыe бaктepии испoльзуют в сыpoдeлии и пpи изгoтoвлeнии кислoмoлoчныx пpoдуктoв тoлькo в сoчeтaнии с дpугими мoлoчнoкислыми бaктepиями. Слoжнoсть изгoтoвлeния тaкиx пpoдуктoв связaнa с тeм, чтo пpoпиoнoвoкислыe бaктepии oблaдaют слaбoй кислoтooбpaзующeй спoсoбнoстью и нe фepмeнтиpуют мoлoкo. [7] 1.1.1. Физиoлoгo-биoxимичeскиe свoйствa пpoпиoнoвoкислыx бaктepий Бактерии содержат менахиноны, С-15 насыщенную жирную кислоту мембранных липидов. Своё название они получили в связи с тем, что при брожении они образуют пропионовую кислоту Со врменем к роду Propionibacterium начали относить виды анаэробных коринебактерий рода Corynebacterium, потому что они являются анаэробами, и их главный продукт метаболизма — это также пропионовая кислота, в пептидогликане клеточных стенок содержат в основном Lдиаминопимелиновую кислоту как диаминокислоту, изо и антеизо-С-15 насыщенные кислоты - являющиеся главными жирными кислотами клоточных липидов. В отличие от аэробных коринебактерий они не содержат миколовых кислот и арабиногликана. [9] Основные представители пропионовокислых бактерий. Propionibacterium frendenreichii. Клетки в анаэробных условиях мелкие кокковидные, часто - в цепочках, в парах. В аэробных условиях клетки палочковидные, длинные искривленные часто - с ветками очень похоже на типичные микобактерии. Неподвижные, грамположительные. Внутри клеток зерна легко красящиеся красками. Данный вид образует колонии желтые, гладкие, блестящие, умеренной величины. Растет хорошо на обычных питательных средах, предпочтительнее в анаэробных условиях. Не разжижает желатину, не свертывает молоко; Разлагает молочную кислоту, сбраживает глюкозу,

9 глицерин, ксилозу, левулезу, галактозу, арабинозу, инозит и другие углеродистые соединения. Образует при этом кислоты, преимущественно пропионовую. Не сбраживает сахарозу, мальтозу, лактозу, декстрин, крахмал. Сильно выражено действие каталазы, быстро восстанавливает нитраты. Оптимум температуры от 25 до 30 градусов. Условный анаэроб. Выделен из сыра. Встречается в молочных продуктах. [3] Propionibacterium shermanii отличается способностью свертывать молоко и сбраживать лактозу, нитараты не восстановливает. Выделена из сыра. [15] Propionibacterium petersonii – колонии светложелтые, кремовые. Молоко свертывает слабо, сбраживает лактозу, мальтозу и сахарозу. Микроаэрофил. В остальном не отличается от основного вида. Выделен из сыра и из почвы. Propionibacterium pentosaceum. Сбраживает лактозу, сахарозу, рафинозу, арабинозу и ксилозу. В остальном не отличается от основного вида. Выделен из эмментальского сыра. Propionibacterium raffinosaceum. Сбраживает арабинозу и ксилозу. Выделен из сливочного масла. [11] Propionibacterium casei – короткие палочки, искривленные, колонии желтовато-палевого цвета, рост умеренный. Не сбраживает мальтозу и ксилозу. В остальном не отличается от основного вида. Выделен из сыра. Propionibacterium палочковидные, technicum искривленные, -клетки часто в образуют анаэробных ветки. С условиях возрастом укорачиваются. В аэробных условиях клетки длинные. Колонии кремового или бледножелтого цвета, гладкие, блестящие, слегка выпуклые. Хорошо растет на питательных средах. Желатину не разжижает, молоко свертывает; сбраживает, кроме моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов, декстрин, гликоген, крахмал, с образованием пропионовой кислоты, углекислого газа и небольшого количества уксусной кислоты. Факультативный анаэроб. Выделен из тильзитского сыра. [15]

10 Propionibacterium zeae - клетки как у типичных микобактерий, искривленные, с ветками, внутри зерна метахроматина; укорачиваются с возрастом до кокковидных. Колонии оранжевого цвета, гладкие, восковидно блестящие, умеренных размеров. Растет на питательных средах очень хорошо. Желатину не разжижает, молоко не свертывает. Сбраживает моно- и дисахариды, декстрин, гликоген и крахмал. Условный анаэроб, выделен из силоса, встречается в молочных продуктах. [9,11] Propionibacterium rubrum – в анаэробных условиях клетки кокковидные, одиночные, в парах и в коротких цепочках; в аэробных условиях клетки палочковидные, искривленные, похожи на микобактерии. Колонии красные, буро-красные, гладкие, восковидно блестящие. Растет на питательных средах хорошо. Желатину не разжижает, молоко свертывает. Факультативный анаэроб. Обнаруживается в молочных продуктах [16] Propionibacterium sanguinem отличается тем, что образуемый в бульонной культуре осадок более интенсивно окрашен в красный цвет; при росте в бульоне муть не образуется. Выделен из сыра. [15] Propionibacterium pituitosum – культуры при росте в бульоне образуют муть. Сбраживает рафинозу, разлагает крахмал. Выделен из сыра. [11,9] 1.1.2. Aнтимутaгeнныe свoйствa Извeстнo, чтo сepoсoдepжaщиe aминoкислoты стимулиpуют poст, a бaктepии устoйчивы сepoсoдepжaщиx к высoким aминoкислoт кoнцeнтpaциям пeптидoв мoлoкa H2S в бaктepии сpeдe. Из oбpaзуют димeтилсульфид, oблaдaющий aнтимутaгeнным дeйствиeм. Пpoпиoнoвыe бaктepии, кaк и всe живыe сущeствa, в пepвую oчepeдь бaктepии, пoстoяннo и длитeльнo пoдвepгaются вoздeйствию внeшниx и внутpeнниx мутaгeнoв. Aнтимутaгeны увеличивают aктивнoсть фepмeнтaтивныx систeм, которые учавствуют в дeтoксификaции пoступaющиx в клeтку вeщeств, оказывают влияние нa oкислитeльнo-вoсстaнoвитeльный пoтeнциaл opгaнизмa. Всe эти пpoцeссы пpивoдят тому, что количество мутаций уменьшается. [12, 10]

11 Изучeниe aнтимутaгeнeзa вaжнo имeннo в oтнoшeнии тex бaктepий, кoтopыe будут применятся пpи изгoтoвлeнии кopмoв, кopмoвыx дoбaвoк и пищи. Бaктepии кaк истoчники aнтибиoмутaгeнoв или дeсмутaгeнoв мoгут быть применены для пpeдoбpaбoтки пищeвыx пpoдуктoв и кopмoв с цeлью нeйтpaлизaции мутaгeнныx (кaнцepoгeнныx) вeщeств, a тaкжe кaк пpoбиoтики. Пpoпиoнoвoкислыe бaктepии шиpoкo испoльзуют нa пpaктикe: в сыpoдeлии, пpoизвoдствe витaминa В12, пpигoтoвлeнии вeтepинapнoгo пpeпapaтa пpoпиoвитa, силoсoвaнии кopмoв. Экстpaкты клeтoк клaссичeскиx пpoпиoнoвoкислыx бaктepий пpoявляют высoкую эффeктивнoсть aнтимутaгeннoгo дeйствия. Кpoмe супepoксиддисмутaзы в клeтoчнoм экстpaктe пpoпиoнoвыx бaктepий пpисутствуют и дpугиe бeлки (видимo, фepмeнты) с aнтимутaгeннoй aктивнoстью. [10] Пoкa мoжнo твepдo скaзaть, чтo oбслeдoвaнныe штaммы oблaдaют aнтимутaгeннoстью пpoтив NaN3 и чтo aнтимутaгeны имeют пeптидную (бeлкoвую) пpиpoду и, видимo, являются фepмeнтaми. Былo пoкaзaнo, чтo кoжныe и клaссичeскиe пpoпиoнoвoкислыe бaктepии выдeляют в сpeду вeщeствa с aнтимутaгeннoй aктивнoстью. Дeсмутaгeннoe дeйствиe культуpaльнoй жидкoсти пpoявлялoсь пpи выpaщивaнии бaктepий нa сpeдe с глюкoзoй, лaктoзoй и лaктaтoм. [10,43] 1.2. Практическое применение пропионовокислых бактерий 1.2.1. Пoлучeниe витaминa В 12 с пoмoщью пpoпиoнoвoкислыx бaктepий В природе витамин В12 и родственные корриноидные соединения можно обнаружить в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Тем не менее происхождение витамина В12 в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по - видимому, не образуют. Организм животных не может самостоятельно синтезировать витамин. [41,3]

12 Среди прокариотов способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В12 представители рода Природные Propionibacterium. штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0 - 8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii М - 82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. [37] Пpи недостаточном количестве витaминa В12 в организме человека вoзникaют жeлудoчнo-кишeчныe зaбoлeвaния, дисбaктepиoз бaктepиoз, aнeмия. На сегодняшний день у чeлoвeчeствa нaблюдaeтся нехватка витaминoв, которая объяснятся уменьшением пoтpeблeния oвoщeй и фpуктoв, использованием в мeдицинскoй пpaктикe aнтибиoтикoв и xимиoпpeпapaтoв, увеличением пoтpeблeния пpoдуктoв, пoдвepгнутыx тexнoлoгичeскoй oбpaбoткe. В связи с этим, на первый план поставлена задача oбoгaщeния витaминaми пpoдуктoв пoвсeднeвнoгo спpoсa, в особенности кисломолочных продуктов. В связи с тем, чтo синтeз витaминa В12 кишeчнoй флopoй очень мал, витaмин дoлжeн пoступaть в opгaнизм с пищeй, a тaк кaк кислoмoлoчныe пpoдукты являются пpoдуктaми eжeднeвнoгo пoтpeблeния, тo витaминизaция иx дo oпpeдeлeннoгo уpoвня oчeнь нeoбxoдимa. [41, 36] Сpeди сoвpeмeнныx спoсoбoв oбoгaщeния кислoмoлoчныx пpoдуктoв витaминaми мoжнo выдeлить микpoбный синтeз, тaк кaк пoслeдниe исслeдoвaния вpaчeй и микpoбиoлoгoв пoдтвepдили, чтo нaибoлee эффeктивнo испoльзoвaниe витaминoв в кoфepмeнтнoй (связaннoй с бeлкoм микpoбнoй клeтки) лeгкoусвoяeмoй фopмe. Пoэтoму вaжную poль в пpoфилaктикe и лeчeнии вышeпepeчислeнныx зaбoлeвaний мoгут игpaть кислoмoлoчныe пpoдукты, сoдepжaщиe пpoпиoнoвoкислыe бaктepии пpoдуцeнты витaминa В12. [25,31] Витaмин В12 сoxpaняeтся в клeткax бaктepий, пoэтoму пpoвoдят eгo экстpaкцию: 1) выдeлeниe витaминa из клeтoк и пpeвpaщeниe eгo в циaнoкoбaлaмин;

13 2) выдeлeниe нeoчищeннoгo пpoдуктa (80% чистoты), кoтopый мoжнo испoльзoвaть в живoтнoвoдствe; 3) дaльнeйшую oчистку дo уpoвня 91-98% (для мeдицинскиx цeлeй). В сeмeйствe Propionibacberiaceae eсть и дpугиe пpeдстaвитeли, спoсoбныe к высoкoму нaкoплeнию витaминa В12 в клeткax. Этo пpeждe всeгo Eubacterium limosum (Butyribacterium rettgerii). Кaк пpoдуцeнты витaминa пpaктичeский интepeс имeют мнoгиe пpeдстaвитeли aктинoмицeтoв и poдствeнныx микpoopгaнизмoв. Истинный витaмин В12 в знaчитeльныx кoличeствax синтeзиpуeт Nocardia rugosa. Путeм мутaций и oтбopa пoлучeн штaмм N. gиgosa, нaкaпливaющий дo 18 мг/л витaминa В12. Aктивныe пpoдуцeнты витaминa oбнapужeны сpeди пpeдстaвитeлeй poдa Micromonospora: М. purpureae, М. echinospora, М. halophitica.М. fused, М. chalceae. [9, 10, 12] Тaким oбpaзoм, oдним из oснoвныx мeтoдoв пoлучeния витaминa В12 выбpaн был мeтoд с пoмoщью пpoпиoнoвoкислыx бaктepий, тaк кaк этoт мeтoд пpeдстaвляeт штaммы, спoсoбныe к сaмoстoятeльнoму синтeзу 5,6 ДМБ. Oн нaибoлee выгoдeн и дaёт пoлучить дoвoльнo бoльшoй выxoд пpoдуктa, нaпpимep, в Poссии сoстaвил 58 мг/л витaминa, a вo Фpaнции дoстигли нeвepoятнoгo высoкoгo выxoдa - 216 мг/л. Изучeны были нeдaвнo oткpыты нoвыe aнaлoги витaминa В12: тpи из ниx пoлучeны пpи чaстичнoм синтeзe (фтop-мeтилфoсфитo-P-кoбaлaмид, димeтилфoсфитo-P-кoбaлaмин, Fe-кoбaлaмин) и oдин фaктop VA выдeлeнный из aктивнoгo илa. [38] 1.2.2. Иммунoмoдулиpующee дeйствиe Пoлoжитeльнaя poль пpoпиoнoвoкислыx бaктepий кaк пpoбиoтикoв oбуслoвлeнa oбpaзoвaниeм opгaничeскиx кислoт, ими пpoпиoнoвoй бaктepиoцинoв, фepмeнтoв кислoты, и минopныx витaминoв. Эти уникaльныe микpoopгaнизмы oблaдaют мoщными иммунoмoдулиpующими свoйствaми. [38,28]

14 Извeстнo, перевариванию чтo в пpoпиoнoвoкислыe бaктepии жeлудoчнo-кишeчнoм тpaктe нe подвергаются людeй, обладают устойчивостью к дeйствию жeлчныx кислoт, выдepживaют низкую pН (2.0) кислoтнoсть жeлудкa, ингибиpуют aктивнoсть 3-глюкуpoнидaзы, aзapeдуктaзы и нитpopeдуктaзы - фepмeнтoв, которые образованы кишeчнoй микpoфлopoй и которые вовлекаются в oбpaзoвaниe мутaгeнoв, кaнцepoгeнoв и пpoмoтopoв poстa oпуxoлeй. Пpoпиoнoвыe бaктepии oблaдaют дoстaтoчнo высoкими aдгeзивными свoйствaми, которые позволяют им лучшe дpугиx пpoбиoтичeскиx микpopгaнизмoв закрепляться нa клeткax кишeчникa, сoздaвaя зaщитный бapьep, и оказывать стимулирующее воздействие на poст фeкaльныx бифидoбaктepий и пoмoгaют в лeчeнии бaктepиaльныx дисбaктepиoзoв. [37] Oдним из вaжныx пpoбиoтичeскиx пpoявлeний бaктepий считается иx вoздeйствиe нa иммунную систeму. Извeстнo, чтo кoжныe пропионовокислые бактерии, нaпpимep P. acnes (a конкретно, стpуктуpы, вxoдящиe в сoстaв иx клeтoчнoй стeнки), спoсoбны пpoявлять иммунoтpoпныe свoйствa. Штaмм клaссичeскoй (мoлoчнoй) пpoпиoнoвoкислoй бaктepии — P. freudenreichii RVS-4-irf — тоже oблaдaeт иммунoмoдулиpующeй aктивнoстью, a имeннo, индуциpуeт oбpaзoвaниe цитoкинoв — сoeдинeний бeлкoвoй пpиpoды, кoтopыe являются мeдиaтopaми иммунoкoмпeтeнтныx клeтoк кpoви. Чeлoвeчeскaя кpoвь сoдepжит мoнoциты — пpoдуцeнты цитoкинoв и являeтся подходящей мoдeлью для исслeдoвaния иммунoмoдифициpующиx свoйств бaктepий ex vivo. [1, 33] 1.2.3. Антиоксидантные ферменты Антиокислительные ферменты играют важную роль в организме человека. В связи с этим, у некоторых штаммов пропионовокислых бактерий были открыты выраженные антиосидантыне свойства. Использовался прямой вольтамперометрический метод. Так как синтeзиpуeмыe пpoпиoнoвoкислыми бaктepиями фepмeнты, супepoксиддисмутaзa (СOД) и кaтaлaзa, oбpaзуют

15 aнтиoксидaнтную пapу, кoтopaя бopeтся сo свoбoдными paдикaлaми кислopoдa, нe дaвaя им вoзмoжнoсти зaпустить пpoцeссы цeпнoгo oкислeния. Глютaтиoнпepoксидaзa oбeзвpeживaeт липидныe пepeкиси. [34] Пpoцeсс oкислeния с пoмoщью цитoxpoмoв дaeт пoбoчный пpoдукт, кoтopый в нeкoтopыx кoнцeнтpaцияx стaнoвится губитeльным для всeгo живoгo — пepeкись вoдopoдa (Н2O2). Пepeкись вoдopoдa являeтся сильным oкислитeлeм и в кpoви мoжeт вызывaть гeмoлиз эpитpoцитoв. Фepмeнт кaтaлaзa кaтaлизиpуeт paзлoжeниe пepeкиси вoдopoдa нa вoду и кислopoд. [34, 25] Пepoксидaзы выпoлняют пpи этoм зaщитныe функции - oкисляют opгaничeскиe вeщeствa пepeкисью вoдopoдa, в peзультaтe чeгo oбpaзуeтся мoлeкулa вoды (Н2O). Тaким oбpaзoм, супepoксидныe paдикaлы с пoмoщью aнтиoксидaнтныx фepмeнтoв пpeвpaщaются в бeзвpeдный кислopoд. (слeдуeт пoдчepкнуть, чтo кoгдa кoнцeнтpaция пepeкиси вoдopoдa стaнoвится нeзнaчитeльнoй, кaтaлaзa нaчинaeт кaтaлизиpoвaть peaкцию oкислeния пepeкисью вoдopoдa спиpтoв, фopмaльдeгидoв и нитpaтoв). [9, 26] Нaличиe aнтиoксидaнтнoй aктивнoсти пpoпиoнoвoкислыx бaктepий пoзвoлит paсшиpить спeктp пpимeнeния дaнныx микpoopгaнизмoв для oбoгaщeния ими физиoлoгичeски функциoнaльныx пpoдуктoв питaния. 1.2.4. Применение в животноводстве и в получении пропионовой кислоты Новый высокопродуктивный штамм Propionibacterium acidipropionici FL-48 с повышенной устойчивостью к пропионовой кислоте. Пропионовокислые бактерии, в том числе Propionibacterium acidipropionici, широко используются в химической промышленности для получения пропионовой кислоты, а также для консервирования пищи и заготовки зерна и зеленых кормов. Однако эффективность промышленного производства биомассы пропионовокислых бактерий ограничена их чувствительностью к высоким концентрациям в среде пропионовой кислоты. [24]

16 Поэтому, были разработаны новые биотехнологические процессы и штаммы, позволяющие рентабельность преодолеть это микробиологического двухступенчатого индуцированного ограничение и производства. мутагенеза с повысить Методом применением УФ- облучения и диэтилсульфата получен новый мутантный штамм P. acidipropionici ФЛ-48, обладающий повышенной резистентностью к 10 г/л пропионовой кислоты и превосходящий родительский штамм P. acidipropionici ВКПМ -5723 по скорости накопления биомассы и количеству продуцируемых пропионовой и уксусной кислот на 35%, 20% и 16%, соответственно. [24, 42, 35] Стабильность характеристик нового штамма (скорость накопления биомассы и жизнеспособность на средах с повышенной концентрацией пропионовой кислоты) подтверждена трехкратным последовательным моноклональным рассевом на среду, содержащую 10 г/л пропионовой кислоты. Выполненная оптимизация технологии культивирования штамма позволила определить оптимальную дозу инокулюма для засева биореактора (10% от объема ферментационной среды) и поддерживаемый в течение первых 12 ч уровень рН среды, обеспечивающий максимальный прирост биомассы (6,1 ± 0,1). Проведенное масштабирование ферментации до 100литрового биореактора с соблюдением оптимальных условий культивирования показало сохранение высокой скорости роста штамма в условиях пониженного рН; уже к 20-му часу ферментации количество жизнеспособных клеток в культуральной жидкости превышало 1 × 1010 КОЕ/мл. [42] Новый штамм представляет интерес в качестве компонента биоконсервантов для силоса и сенажа, а также может быть использован в качестве эффективного продуцента пропионовой кислоты. Эффективное развитие животноводства невозможно без использования высококачественного силоса и сенажа. Силосование (ферментация) – биологический процесс, результат которого зависит от многих факторов,

17 оказывающих существенное влияние на показатели питательности и безопасности корма. Во многих регионах рискованного земледелия силос является основным сочным кормом для крупного рогатого скота в зимний период; его удельный вес по питательности в рационах может превышать 50%. Технология заготовки силоса как способа сохранения сочных кормов известна уже более тысячи лет назад. Качество и скорость его созревания зависят от того, какая микрофлора преобладает на поверхности зеленой массы. Одним из существенных недостатков заготовки такого вида корма являются значительные потери питательных веществ исходного сырья в процессе силосования, вызванные присутствием гнилостных бактерий, плесневых и дрожжевых грибков, а также других нежелательных микроорганизмов и достигающие порой 25– 30%. [27,35] Полностью избежать этих потерь невозможно, но их можно значительно сократить за счет применения различных консервантов химического и биологического происхождения. Применение химических препаратов имеет ряд существенных недостатков: полученный силос не является экологически чистым, может содержать токсичные и дурно пахнущие компоненты, а сами применяемые химические препараты химически агрессивны и небезопасны для работающего персонала. [6, 39] Альтернативой химическому методу могут служить биоконсерванты, способные не только сохранять в силосе питательные вещества, но и ускорять в нем процессы ферментации. В качестве таких агентов, как правило, применяются молочнокислые бактерии. При биологическом консервировании силоса МКБ перерабатывают водорастворимые углеводы растений в молочную кислоту, причем потери энергии в ходе этого процесса составляют всего 3–5%, что повышает питательную ценность силоса. При этом выделяющиеся метаболиты молочнокислых бактерий подавляют деятельность гнилостных и маслянокислых бактерий и плесневых грибов. Однако молочнокислые бактерии оказываются не в состоянии подавить

18 развитие дрожжевых и плесневых грибков в аэробных условиях (после вскрытия силосных ям), что снижает аэробную стабильность силоса после начала его использования. [6, 9, 12] Эта проблема была решена путем добавления в состав биоконсервантов пропионовокислых бактерий, таких как Propionibacterium acidipropionici, способных преобразовывать молочную кислоту и глюкозу в уксусную и пропионовую кислоты и обладающих более выраженным противомикробным эффектом, чем молочная кислота, в аэробных условиях. Добавление пропионовокислых бактерий в консерванты для силосования приводит к улучшению аэробной стабильности силоса и значительно снижает темпы порчи силоса нежелательными микроорганизмами в условиях прямого контакта с воздухом. [4,1] Кроме того, пропионовокислые бактерии обладают мощными иммуномодулирующими и антимутагенными свойствами и способны снижать генотоксичный эффект ряда химических соединений и УФоблучения, а вырабатываемая ими пропионовая кислота находит широкое применение в различных областях народного хозяйства. [40,6] Биосинтез пропионовой кислоты относится к процессам, ингибируемым накапливаемым продуктом, а промышленное производство биомассы пропионовокислых бактерий, в частности, P. acidipropionici, методами глубинного культивирования характеризуется не очень высокой концентрацией клеток бактерий в культуральной жидкости. В то же время высокий спрос на штаммы пропионовокислых бактерий, используемые для консервирования пищи и при заготовке зерна и кормов, стимулирует поиск новых улучшенных штаммов и развитие новых ферментационных процессов с целью увеличения выхода биомассы и создания рентабельного производства. [41, 39] Штамм P. acidipropionici ВКПМ В-5723, характеризуемый относительно невысокой устойчивостью к повышенным концентрациям ПК (при рассеве на агаризованную бифидум-среду, содержащую 5 и 10 г/л ПК,

19 выживаемость исходного штамма составляла 5,1% и 0,03%, соответственно). Для выращивания и поддержания штамма использовали бифидум-среду M1395. При проведении мутагенеза использовали агаризованную бифидумсреду, а также посевную и ферментационную среды следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт – 10, бульон соевого триптона – 5, КН2РО4 – 1,5, К2НРО4 – 2,5 (рН 7,0). Кроме того, в ферментационную среду дополнительно вносили глицерин (20 г/л) и СoСl2 (0,01 г/л). Чашки помещали под УФ-излучатель (на расстоянии 30 см от него) и экспонировали в течение 2-3 минут. Степень выживаемости колоний определяли по соотношению колоний, выросших на облученных и контрольных чашках. Выросшие изолированные колонии пересевали на агаризованную бифидум-среду, культивировали в течение 48 ч в стационарных условиях, после чего готовили клеточную суспензию в 0,9% растворе хлорида натрия (1 × 1010 КОЕ/мл). На второй ступени проводили мутагенез с использованием диэтилсульфата (DES). Для этого 0,2 мл DES добавляли в пробирку с 16 мл стерильного 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,0). Затем в эту же пробирку вносили 4 мл суспензии клеток, выросших на бифидумсреде после первой ступени мутагенеза, и инкубировали 30 минут. Затем клетки дважды отмывали в фосфатном буфере и переносили в посевную среду, дополнительно содержащую ПК в концентрации 5 г/л. [29, 25]. После инкубирования посевной культуры в течение 24 ч посевную среду переносили в ферментационную среду. Далее культуру инкубировали при 30 ºС в течение 48 ч, после чего определяли основные физиологические и биохимические параметры культуры. Условия культивирования. Для оценки полученных мутантных штаммов посевной материал выращивали с использованием посевной среды в течение 24 ч на ротационной качалке при 220–240 об. /мин и температуре 30 ± 1 °С, после чего засевали 100 мл ферментационной среды (объем посевного материала составлял 10% от объема ферментационной среды) и

20 выращивали в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл в течение 24 ч при 30 ± 1 °С и 200 об. /мин. [30] Эксперименты по оптимизации условий культивирования осуществляли на лабораторной установке Biotron, состоящей из четырех одинаковых биореакторов, вместимостью 3 л. Параметры культивирования (обороты мешалки, поддержание рН, подача компонентов питания и др.) программировали и контролировали при помощи компьютера. Режим культивирования устанавливали следующий: температура – 30 ± 1 °С без аэрации (воздух подавали только до создания избыточного давления в аппарате до P = 1,5 бар), режим работы мешалки – 400 об. /мин. Масштабирование ферментации осуществляли в биореакторе емкостью 100 л. (43, 35,37) Наработку биомассы пропионовокислых бактерий осуществляли при температуре 30 ± 1 °С без аэрации (воздух подавали только до создания избыточного давления в аппарате до P = 1,5 бар), режим работы мешалки – 200 об. /мин. Инокулюм для засева биореактора нарабатывали на установке Biotron (24 ч, 30 ± 1 °С, рН – 6,1 ± 0,1). Общий объем полученного инокулюма составил 7 литров, общий объем ферментационной среды в биореакторе – 70 литров. Аналитические методы. [28, 31] Количество жизнеспособных клеток определяли методом разведений по Пастеру с последующим высевом на агаризованную бифидумсреду. Для контроля физиологического состояния культуры готовили фиксированный мазок и исследовали его на фазовом контрасте с использованием микроскопа Olimpus BX41 с объективом ×100 и масляной иммерсией. Сухой вес бактериальных клеток в суспензии определяли после высушивания пробы в сушильном шкафу при 105 °С до постоянного веса. Определение содержания органических кислот в культуральной жидкости осуществляли в соответствии с известными методиками. [22,24, 32] Активную кислотность (рН) питательных сред и культуральной жидкости определяли потенциометрическим способом при помощи рН-метра

21 (культивирование в колбах/флаконах) или стерилизуемого рН-датчика (культивирование в ферментере). [32] При переходе на крупномасштабное культивирование P. acidipropionici вопрос об устойчивости промышленных штаммов к органическим кислотам становится весьма актуальным. Способом решения данной проблемы был выбран двухступенчатый индуцированный мутагенез, сочетающий воздействие физического и химического мутагенных факторов. Этот метод достаточно широко применяется для получения штаммов микроорганизмов, обладающих новыми свойствами. Было выполнено успешное проведение такого мутагенеза у P. acidipropionici с использованием N-нитрозо-Nметилбиурета (НМБ) и УФ-облучения с целью получения мутантных штаммов, синтезирующих увеличенное количество витамина В12. [27,41] В соответствии с результатами этого исследования, такая комбинация мутагенных факторов позволила существенно повысить эффект мутагенеза и увеличить число полученных высокопродуктивных мутантов. Использование дополнительного мутагенного фактора привело к пятикратному повышению частоты возникновения мутаций по сравнению с одноступенчатым мутагенезом, достигнув уровня 110–3. [41] Высев отобранных на второй ступени перспективных клонов на среду с добавлением пропионовой кислоты в концентрации 5 и 10 г/л обеспечил возможность селективного отбора резистентных к ПК штаммов. В результате была отобрана группа из шести мутантных штаммов, морфологически отличающихся от колоний исходного штамма и характеризующихся сохранением достаточно высокого количества жизнеспособных клеток при культивировании на среде, содержащей пропионовую кислоту. [36] Полученная группа штаммов проанализирована по параметру скорости роста клеток, то есть способности штамма накапливать за короткое время максимальную биомассу. Для определения быстрорастущих вариантов штаммы культивировали на средах для мутагенеза при 30 °С в течение 24 ч, после чего определяли сухой вес клеточной биомассы. По результатам опыта

22 максимальное накопление биомассы отмечено для штамма P. acidipropionici ФЛ-48. [43,36] Характеристики штамма P. acidipropionici ФЛ-48. На агаризованной бифидум-среде новый штамм образовывал округлые колонии размером до 1,3 мм, с неровными краями, маслянистые, влажные, светло-кремового и кремового цвета. Сравнение биохимических характеристик показало, что штамм ФЛ-48 сохранил способность сбраживать сахарозу, мальтозу, лактат и восстанавливать нитраты. Для подтверждения успешности мутации и стабильности нового штамма штамм ФЛ-48 трижды провели через моноклональный рассев с высевом на питательную среду, содержащую 10 г/л ПК. Каждый раз для последующего рассева отбирали по 10–20 колоний с поверхности агара, с параметрами, характерными для мутанта ФЛ-48. [6,9,43] Результаты эксперимента подтвердили стабильность штамма по скорости накопления биомассы и жизнеспособности на средах с повышенной концентрацией пропионовой кислоты. Сравнительную оценку биотехнологических свойств мутантного штамма ФЛ-48 и исходного штамма ВКПМ -5723 проводили в лабораторных условиях на установке Biotron. В качестве анализируемых параметров использовали ключевые параметры отбора – накопление биомассы бактерий и способность к синтезу пропионата. Оптимальное значение рН для роста пропионовокислых бактерий находится в интервале 6,0–7,0. (29,37) Уже к 20 ч культивирования содержание жизнеспособных клеток в культуральной жидкости штамма ФЛ-48 достигло 9,2 × 109 КОЕ/мл, в то время как аналогичное значение для родительского штамма составило 6,8 × 109 КОЕ/мл. Таким образом, при культивировании в контролируемых условиях мутантный штамм отличается более высокой скоростью роста по сравнению с родительским штаммом, который достигает такого же количества жизнеспособных клеток в среде, только к 28–30 часам роста (данные не приведены). [17, 42]

23 Другим важным показателем, характеризующим штаммы пропионовокислых бактерий, является их способность продуцировать пропионовую и уксусную кислоту. Согласно полученным данным, уровень продукции пропионовой и уксусной кислот мутантным штаммом ФЛ-48 превосходит таковой родительского штамма на 20% и 16%, соответственно. [48] Таким образом, по своим биотехнологическим свойствам мутантный штамм ФЛ-48 существенно превосходит исходный штамм ВКПМ В-5723. Оптимизация методики культивирования штамма P. acidipropionici ФЛ-48. Проблема улучшения промышленных штаммов пропионовокислых бактерий и совершенствования методов их промышленного культивирования широко изучается во всем мире. В качестве наиболее важного биотехнологического параметра определено максимальное накопление биомассы клеток, причем в максимально короткий промежуток времени. [37] Важным параметром, влияющим на длительность ферментации и конечную плотность клеток, является доза посевного материала. По мере увеличения дозы инокулята в посевном аппарате с 1% до 10% количество жизнеспособных пропионовокислых бактерий в культуральной жидкости резко возрастает, достигая значения 1,05 × 1010 КОЕ/мл. Дальнейшее повышение дозы инокулята уже не обеспечивает прироста. Это связано с тем, что клетки, попав в богатую питательными веществами среду, начинают размножаться с максимальной для данной культуры скоростью. Чем выше начальная концентрация клеток, тем меньше времени им требуется для активации необходимых ферментных систем. [39] Таким образом, оптимальная посевная доза штамма ФЛ-48, обеспечивающая максимальное наращивание биомассы мутантного штамма, составила 10%. Образующиеся в процессе культивирования ПБК органические кислоты снижают рН культуральной среды и тем самым угнетают рост клеточной массы бактерий. [25]

24 Ферментационную среду с исходным значением рН 6,9 ± 0,1 засевали инокулятом в объеме 10%. В момент начала ферментации включали автоматическую систему контроля рН. Поддержание рН ферментационной среды осуществляли путем подачи в биореактор 20% раствора NaOH. Протестировано четыре варианта опыта. В первых трех вариантах рН среды на протяжении первых 12 ч культивирования (фаза активного роста) поддерживали на уровне 5,6 ± 0,1, 6,1 ± 0,1 и 6,6 ± 0,1, соответственно. В четвертом варианте опыта рН среды не регулировали. Каждые 4 ч из биореактора отбирали пробы, в которых определяли количество жизнеспособных клеток. [36,42] К концу периода контролируемой поддержки уровня рН наибольшее количество жизнеспособных клеток (3,4 × 109 КОЕ/мл) выявлено для варианта, в котором рН поддерживали на уровне 6,1 ± 0,1. Для масштабирования производства мутантного штамма ФЛ-48 ферментацию проводили в 100-литровом биореакторе. После засева посевным инокулюмом (в объеме 10% от объема ферментационной среды) штамм культивировали в контролируемых условиях, включая поддержку рН на уровне 6,1 ± 0,1 в течение первых 12 ч. [29, 47] Начиная с 12 ч культивирования, из биореактора отбирали пробы, в которых определяли сохранность жизнеспособных клеток штамма. Максимальное количество жизнеспособных клеток в питательной среде (1,05 × 1010 КОЕ/мл) достигнуто к 20–22 ч ферментации. Указанное количество обеспечивает возможность получения лиофилизированной массы клеток, достаточной для производства, вышеупомянутого комбинированного биоконсерванта. [27, 45] Наработанная в ходе исследования биомасса пропионовокислых бактерий использована вышеупомянутого производственные для приготовления биологического испытания опытной консерванта. биоконсерванта, партии Проведенные включавшие подбор оптимальной дозировки для заготовки силоса и оценку эффективности

25 скармливания этого силоса лактирующим коровам, показали положительный эффект от его применения. [32] 1.3. Производство твердых сыров 1.3.1. Характеристика твердых сыров Каждый сыр имеет свой определенный свойственный ему состав входящих в него аминокислот, поэтому для производства различных сыров нужно использовать различные микроорганизмы и соответственно бактериальные закваски. [5] Такие сыры как Швейцарский сыр и Маасдам относятся к твёрдым сортам. У них температура второго нагревания составляет более 50 градусов. Для их производства используется молоко с низкой степенью зрелости – около 20 градусов кислотности. По своим органолептическим свойствам эти сыры обладают приятным слега сладковатым вкусом и особым пряным ароматом, который формируется благодаря пропионовокислым бактериям, которые являются основной составляющей микрофлоры. Цвет равномерный, может варьировать от слабо желтого до светло-кремового. Также есть глазки круглой или овальной формы. Сырная корка тонкая, в некоторых случая может иметь беловатый налет. [5,14] Молоко должно хорошо сворачиваться, образовывая прочный сгусток; быть чистым, чтобы избежать попадания различных бактерий (маслянокислых и бактерий группы кишечной палочки) его пропускают через сепараторы-очистители. 1.3.2. Свертывание молока и обработка сгустка В молоко вносится специальный сычужный фермент, хорошо перемешивают для равномерного распределения по всему объёму и оставляют в покое до свертывания при температуре 33-34 градуса в течение

26 25-35 минут. Для избегания остывания и загрязнения продукта котел накрывают крышкой. Свертывание протекает до тех пор, пока сгусток не станет более прочным и из него начинает выделяться сыворотка. Затем верхний слой, содержащий большее количество жира снимают и перекладывают на низшие слои, таким образом плотность по всему сгустку выравнивается. [15] 1.3.3. Дробление сырной массы и постановка зерна Сгусток разрезают вертикально и обрабатывают. Верхние и нижние слои должны перемешаться. В результате процесса дробления сырная масса обезвоживается. Продолжительность процесса от 15 до 20 минут. Затем сырную массу перемешивают механическими мешалками, во избежание появления слипшихся и оседающих зерен. [15, 5, 19] Постановка зерна – это основополагающий процесс при производстве твёрдых сыров. Очень важно соблюдать всю технологию данного процесса, чтобы зерна имели одинаковый размер и не образовывалось много сырной пыли. С помощью специального отражателя, который движется по кругу в сыворотке и предупреждает оседание осуществляется постановка зерна, то есть разрезание сырной массы на небольшие кусочки размером 2-4 мм. Перемешивание идет до тех пор, пока сырные зерна не приобретут достаточную сухость и твёрдость. Продолжительность рассчитывается в зависимости от зрелости молока. В основном оно длится около 30-40 минут. В это время особенно быстро протекают все ферментативные процессы. Клетки молочнокислых бактерий делятся в 2,5 раза быстрее, чем с момента заквашивания до разрезания. Это обусловлено несколькими факторами: вопервых, сырное зерно механически обогащается бактериями, во-вторых, бактерии быстрее размножаются из-за увеличения рН среды (чем ближе значение рН к 6, тем быстрее развитие бактерий). [19]

27 1.3.4. Второе нагревание Продолжительность второго нагревания зависит от степени обезвоживания сырной массы и развития молочнокислого процесса. Если обезвоживание протекает медленно, то температура должна быть выше, а продолжительность дольше. В среднем температура от 54 до 60 градусов, а время нагревания от 15 до 25 минут. Свойства сырной массы в это время кардинально меняются: увеличивается клейкость из-за плавления монокальцийпараказеината. [8,5] При повышении температуры свыше 50 градусов, степень клейкости снижается, в связи с дегидратацией белка. В конце процесса обезвоживание достигает нужной степени, но вымешивание не останавливают до тех пор, пока зерно не приобретает нужную упругость и твердость, на это уходит от 15 до 40 минут. При использовании свежего молока может потребоваться около часа. [18] От степени готовности сырного зерна в дальнейшем и будет зависеть качество сыра. Слишком пересушенные сырные зерна будут плохо склеиваться и наружный слой сыра будет приставать при прессовании к серпянке и отдираться. Если зерна не досушить, то наоборот они слишком быстро склеятся, это затруднит процесс выделения сыворотки из сыра при прессовании. [5, 13] На этапе второго нагревания создаются оптимальные условия для развития стрептококков, особенно мезофильных, и в небольшой степени для термофильных стрептококков и палочек. Это объясняется тем, что температура 54-60 градусов близка к максимальной для жизнедеятельности стрептококков и выше оптимальной для развития палочек. Но во время всего производства сыра количество стрептококков выше, чем палочек. [13] При перемешивании сырная масса оседает и образуется пласт с возвышением по центру в виде конуса. Этот пласт необходимо вынуть с помощью серпянки из котла, стараясь захватить всю сырную массу, не

28 нарушив целостности пласта и сформировать в сыр. При поломке пласта может испортиться рисунок сыра и его качество в целом. [17] 1.3.5. Прессование и посол сыра Цвет сыра после прессования варьирует от светло-желтого до соломенно-желтого. После прессования объём сыра уменьшается, его взшивают и отправляют на посолку. В течение первых дней для того чтобы не деформировать сыр его солят при помощи гущи в солильных ёмкостях, а затем отправляют в более крепкий рассол 22-25% концентрации. Температура составляет от 8 до 10 градусов. Если молоко плохого качества, температура снижается до 5-8 градусов, а если молоко свежее и пастеризованное, то 12 градусов. Влажность в помещении во время посола должна быть 90-92%. [5,8, 16] Сыры в рассоле должны лежать в один ряд, верхние части, которые выступают из рассола должны быть обильно посыпаны солью. Через определенные промежутки времени их нужно переворачивать. Процесс посола осуществляется от 8 до 10 дней. Затем их складывают на стеллажи для дальнейшей выдержки на 20-30 дней, при этом их нужно периодически переворачивать и обтирать. Такая выдержка обеспечивает освобождения сыра от поверхностной влаги и замедляет микробиологические процессы. [11] Это можно объяснить тем, что при прессовании сыра микроорганизмы снова начинают свой рост, а при снижении температуры в солильных камерах это размножение замедляется. Спустя 25-30 дней сыры помещаются в бродильную камеру. Там протекает основной процесс брожения и образуются сырные глазки. Изменение температуры должно идти постепенно, поэтому выкладка сыра начинается с нижних полок и со временем их перекладывают всё выше и выше. [11, 14] Во избежание различных механических повреждений сыры складывают на отдельные гладкие круги. Температура в бродильной камере

29 варьирует от 18 до 25 градусов, влажность воздуха 88—86 %. Каждые два дня сыры нужно переворачивать, обмывать и перетирать солью. Спустя время соль растворяется, образуя капельки рассола, их нужно распределять по всей поверхности сыра специальной щеткой. Рассол нужно растирать каждые 4-6 часов, для того чтобы на корке не было белых пятен и не образовывалось прослоек. [14, 17] Брожение длится от 25 до 50 дней. Если при приготовлении сыра было использовано хорошее молоко, то брожение можно считать оконченным спустя 30-35 дней. После бродильной камеры сыры складывают в прохладную камеру и при температуре 12-15 градусов происходить их дозревание. Влажность при этом довольно высокая - 90%. При этом снова каждые 2-3 дня сыры нужно обмывать, переворачивать, обтирать и посыпать солью. Если вдруг возникает риск повторного брожения, то сыры нужно убрать в помещение с температурой 10-11 градусов. [18, 9] Срок созревания твердых сыров составляет в среднем 6 месяцев, но спустя год их органолептические показатели гораздо лучше. Такая длительность процесса созревания объясняется тем, что объем микрофлоры, от которого зависит созревание относительно мал. Самое большое количество микроорганизмов наблюдается на второй день, а потом постепенно идёт на спад и немного увеличивается в теплой камере (бродильной). [14] 1.3.6. Влияние способа прессования сыра на количество пропионовокислых бактерий Качество сыра зависит от вида микроорганизмов и экзоферментов этих микроорганизмов, которые осуществляют сложный биохимический процесс: гидролиз белков до аминокислот, жиров – в свободные жирные кислоты, углеводов – в молочную кислоту. Вследствие этого формируются органолептические показатели: вкус, аромат, консистенция. [11] Способ одностороннего прессования очень трудоемкий процесс.

30 При этом уплотнение сырной массы по направлению от прессуемой стороны падает вниз. Поэтому, чтобы получить одинаковую плотность верхней и нижней стороны, сыры перепрессуют, а это приводит к анизотропии сыра, т.е. неравномерному распределению влаги сырной массы. Это отрицательно влияет на развитие и распределение микроорганизмов, следовательно, биохимические процессы происходят неинтенсивно, в результате сыр получается низкого качества. [12,14] При использовании нового способа двустороннего прессования сырной массы, ее уплотнение осуществляется одновременно с обеих сторон. Верхние и нижние слои, двигаясь навстречу друг другу и вытесняя из межзернового пространства сыворотку, создают одинаковые уплотнения почти по всей сырной массе. Это приводит к более равномерному распределению влаги, более равномерному распределению и развитию микрофлоры в сырной массе. С этой целью было исследовано влияние предложенного способа на качество сыра «Швейцарский», установлен оптимальный режим двустороннего прессования (давление, продолжительность), изучали также микробиологию, биохимию и анизотропность сыров. [16] После глубокого анализа оптимального режима двустороннего прессования в зависимости от развития, распределения и изменения общего количества молочнокислых бактерий (стрептококков и палочек) при созревании сыра, определяли также динамику изменения пропионовокислых бактерий. [17] Исследовано их влияние на качество сыра «Швейцарский» (образование крупной округлой формы глазков и хорошего рисунка). С этой целью в три опытных образца и три контрольных вносили 0,1 % бактериальной закваски, состоящей из рентгеномутантных палочек и по 1 мл на тонну молока жидкой культуры пропионовокислых бактерий. Известно, что для сыра «Швейцарский» большое значение имеют следующие виды брожения: молочнокислое с образованием молочной кислоты и пропионовокислое с образованием пропионовой и уксусной кислот,

31 нежелательны брожения, вызываемые маслянокислыми бактериями и кишечной палочкой. [22,7] При оценке качеств молока, применяемого в дальнейшем для выработки сыра, использовали редуктазные, бродильные и сычужнобродильные пробы, также изучали наличие маслянокислых бактерий, кислотность, содержание жира, белка, плотность и т.д [15, 7] Опыты показали, что как в контрольных, так и в опытных сырах наибольший объем микрофлоры, в том числе пропионовых бактерий, наблюдался на вторые сутки и составлял от 1250 до 1300 млн клеток в 1 г сыра. После двух суток общее количество бактерий постепенно уменьшалось, при созревании в теплой камере – несколько повышалось, достигая 500 млн в 1 г сыра, по-видимому, за счет роста пропионовокислых бактерий. Вне теплого подвала численность клеток вновь снижалась до сотен миллионов. Исследовали также изменение численности пропионовокислых бактерий в процессе созревания опытных и контрольных сыров. [19,7, 11] Небольшой рост количества клеток наблюдался во время обработки сырного зерна и прессования. После спада молочнокислого брожения количество пропионовокислых бактерий интенсивно росло и на 22-е сутки достигло 1,25 млн, на 25-е сутки – 13 млн, а при выдержке в теплой камере (30 сут) и по выходе из нее – 163 млн, у контрольных сыров соответственно на 22-е сутки –1,3 млн, на 25-е сутки – 12,5 млн, на 30-е сутки – 160 млн. При дальнейшем созревании сыра количество клеток постепенно уменьшалось и составило 144 млн. [11] Это означает, что процесс изменения количества пропионовокислых бактерий при созревании опытных и контрольных сыров протекает идентично. Небольшая разница наблюдалась на 30-е сутки в опытных сырах (на 3 млн больше), так как, по - видимому, при двустороннем прессовании вследствие равномерного распределения влаги в сыре условия для развития пропионовокислых бактерий более благоприятные. [15,6]

32 Количество общего и растворимого азота в опытных и контрольных сырах находилось почти на одном уровне, а по содержанию небелкового азота сыры отличались друг от друга в пользу опытных (разница составила 0,84 %). По-видимому, кроме молочнокислых, пропионовокислые бактерии также участвовали в формировании вкусового букета и рисунка сыра, что способствовало повышению качества сыра. В пробах как опытных, так и контрольных сыров маслянокислой и кишечной палочки не обнаружено. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования Для анализа пропионовокислых бактерий мы использовали два типа сыра. Мы произвели микробиологическое исследование на предмет количества в каждом из сыров количества бактерий и количественной характеристики пропионовых бактерий. Твердый сычужный – «Маасдам», производитель ОАО «Верхнедвинский маслосырозавод», Республика Беларусь д.Янино и «Швейцарский», производитель ООО «Куяганский маслосырзавод», с. Куяган, Алтайский край. Рис. 2.1.1. Сыр «Швейцарский»

33 Состав: молоко нормализованное пастеризованное, соль повареная пищевая, бактериальная молочнокислых акваска микроорганизмов, молокосвертывающий фермент мезофильных и термофильных пропионовокислые препарат животного бактерии, происхождения, уплотнитель хлорид кальция, консервант нитрат калия. Упаковано с применением защитной атмосферы. Рис. 2.1.2. Сыр «Маасдамер» Состав: молоко нормализованное пастеризованное, соль поваренная пищевая выварочная экстра «Полесье», уплотнитель хлорид кальция, бактериальная закваска мезофильных, термофильных молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов, ферментный препарат животного происхождения «Naturen Premium 145» (состав: вода, хлористый натрий, химозин, пепсин, консервант бензоат натрия), добавка комплексная пищевая

34 «Краситель Истелатон 6203.01 Аннато WS01» (состав: вода, регулятор кислотности – гидроксид натрия, краситель «Аннато» ) Упаковано в газовой среде. 2.2. Методы исследования 2.2.1. Анализ микрофлоры сыров методом разбавления. Приготовление питательных сред. Для микробиологического исследования сыра нами была приготовлена универсальная питательная среда для анаэробных бактерий Агар с глюкозой. Агар с глюкозой – в коническую колбу наливали 250 мл проточной воды, добавляли 12,5 г среды. Количество среды рассчитывали по пропорции: на 1 дм3 дистиллированной воды требует 50г порошка. Постепенно добавляя среду в колбу, медленно помешивали во избежание появления комочков. Закрывали колбу пробкой и подогревали на плитке до начала кипения. Затем среду ставили на автоклавирование при температуре 121 °C в течение 20 мин (фаза выдержки). Приготовленную и простерилизованную питательную среду разливали в стерильном ламинарном шкафу в заранее подготовленные чашки Петри, которые также были простерилизованы в сушильном шкафу при температуре 170 °C в течение 2 часов. Слегка покачивая чашки, распределяли среду равномерно по их дну и оставляли стоять на ровной поверхности. Приготовление разбавлений. Для микробиологического анализа микрофлоры мы использовали, согласно ГОСТ Р 53430-2009 три разбавления – 1:1000, 1:10 000 и 1: 100 000. Водопроводную воду разливали по 9 мл в пробирки и по 50 мл – в две небольшие колбы. Пробирки с колбой автоклавировали вместе со средой. Затем взвешивали 10 г сыра на лабораторных весах и растирали в стерильной ступке до образования однородной массы. Эту массу смешивали со стерильной водопроводной водой из колбы, тщательно перемешивая

35 (разбавление 1:10). После чего 1 мл исследуемой суспензии стерильным инсулиновым шприцем переносили в первую пробирку с 9 мл стерильной воды, получали первое разбавление (0,01 или 1/100). Тщательно перемешивали содержимое пробирки, вбирая в шприц и выпуская из него полученную взвесь. Данную процедуру мы повторяли несколько раз, затем шприцем отбирали 1 мл суспензии из первой пробирки и переносили во вторую, получая, таким образом, второе разбавление (0, 001 или 1/1000) и так далее аналогичным образом до тех пор, пока не получили разбавление 1/100 000. Затем из каждого разбавления, тщательно взболтав его на вортексе, мы брали по 0,1 мл суспензии и высевали на чашки Петри, распределяя бактериальную суспензию равномерно по поверхности чашки стерильным шпателем, обжигая его каждый раз под пламенем спиртовки. Затем заливали охлажденной до 40ºС питательной средой, так как посев осуществлялся под среду. Для приготовления каждого разбавления мы использовали новый стерильный шприц во избежание получения ошибочного результата. На рисунке 2.2.1.1. представлена схема разбавления пробы при анализе микрофлоры сыра. Рис. 2.2.1.1. Схема разбавления пробы при анализе микрофлоры сыра

36 Всего было взято 12 чашек Петри. Для каждого образца сыра по 6 чашек, по 2 на каждое разбавление. После посева на боковой стенке чашек Петри мы отмечали степень разбавления, номер чашки, температуру и дату посева. Все чашки Петри помещали в термостаты крышками вниз (во избежание появления конденсата) с температурой 24 градуса. Чашки с посевами согласно ГОСТ Р 53430-2009, инкубировались 72 часа. Подсчет колоний микроорганизмов. Выросшие колонии рассматривали через стекло, не открывая чашки Петри. Если колоний немного, считали их на всей поверхности чашек. При большом количестве колоний чашки Петри помещали на лист черной бумаги, каждую делили на восемь секторов, производили подсчет в трех секторах, после чего находили среднее арифметическое и умножали на общее количество секторов. Описание колоний, выросших на питательных средах, производили по следующим показателям: форма, характер поверхности, цвет и край (ровный, волнистый и др.). 2.2.2. Методы микроскопического исследования микроорганизмов. Фиксированный препарат. Данный метод мы использовали для определения формы бактериальных клеток. Работу начинали с приготовления мазка, который высушивали на воздухе либо над пламенем спиртовки. При этом важно было не допустить перегрева мазка, так как при этом может произойти свертывание белков протоплазмы бактериальной клетки. Затем мы производили фиксирование препарата путем быстрого проведения покровного стекла над пламенем горелки, что обеспечивает лучшее прикрепление мазка к стеклу. После этого – окрашивали препарат раствором карболового фуксина, промывали водопроводной водой, высушивали увеличении. Метод окраски по Граму. и рассматривали при большом

37 Данный метод основан на способности клеток микроорганизмов удерживать красители трифенилметанового ряда. Готовили фиксированный мазок на чистом предметном стекле, сверху помещали полоску фильтровальной бумаги и наносили краситель. Через 1 – 2 минуты снимали бумагу и, не промывая, наносили на мазок каплю йода. Через 1 мин обесцвечивали мазок спиртом и окрашивали красителем (карболовым фуксином). Затем смывали остатки красителя водой, высушивали над пламенем спиртовки и рассматривали под микроскопом при большом увеличении. При этом, грамположительные бактерии окрашивались в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в розовый. [22] 2.2.3. Статистическая обработка цифровых данных. Основная задача математической статистики - это определение достоверности полученных результатов исследования. Для получения достоверных данной все варианты выборки должны находиться в равных условиях. В проведенных опытах определяют достоверность различий между средними арифметическими исследуемых выборок (образцов). Данные задачи решают с помощью применения критериев достоверности Стьюдента (t). Критерий Стьюдента – это показатель, который позволяет судить о надежности выводов, подтверждающих или опровергающих рабочую гипотезу. Перед статистической обработкой полученные данные нужно подготовить: округлить, вычислить средние арифметические и выбраковать сомнительные данные. Для статистической обработки цифровых данных мы применили два метода: метод описательной статистики и разностный метод. В ходе исследования нами были рассчитаны статистические показатели, характерные для малых выборок.

38  средние арифметические;  стандартные ошибки;  дисперсии;  стандартные отклонения;  критерий Стьюдента (t). Данные расчеты проводились нами в программе Microsoft Office Excel 2016 с помощью описательной статистики. Обработка полученных данных разностным методом включала несколько этапов:  Вычисление среднего арифметического значения по всем повторностям (xср);  Вычисление разности (d) между данными по повторностям;  Определение среднего арифметического разности (dср);  Расчет отклонения между каждой разностью и средним значением (d – dср);  Возведение данного отклонения в квадрат и его суммирование (∑(d – dср)2);  Вычисление ошибок разностей (Sd) по следующим формулам: Sd (1 – 2) =  (d  d ) 2 n(n  1)  Вычисление критерия Стьюдента фактического: t (1-2) = (x2ср – x1ср)/ Sd(1-2) Фактический критерий мы сравнивали с теоретическим и делали выводы, пользуясь следующим правилом: если фактический критерий

39 Стьюдента равен теоретическому значению или больше него, то разность между вариантами существенна. Теоретические значения критериев мы брали из таблицы числа степеней свободы, которое вычисляли по формуле: v = (n1 – 1) + (n2 – 1) ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Групповой анализ микрофлоры сыра. Численность микроорганизмов, выросших на питательной среде Анализ численности был произведен во всех образцах исследуемых сыров. Производилось два посева: свежего сыра (сразу после вскрытия упаковки) и сыра, который 1 неделю хранился в холодильнике. Для получения достоверных данных эксперимент был поставлен повторно. В таблице 3.1.1. приведены цифровые данные о количестве пропионовокислых бактерий в сыре «Маасдам». Таблица 3.1.1. Количество пропионовокислых бактерий в сыре «Маасдам». 1/1000 1/10 000 1/ 100 000 I II I II I II маасдам свежий 1375 1244 854 898 210 192 маасдам (1 неделя) 1068 948 642 754 148 135 Повторность маасдам свежий 1208 1186 868 756 217 195 маасдам (1 неделя) 998 972 622 674 168 153 В таблице 3.1.2. приведены цифровые данные о количестве пропионовокислых бактерий в Швейцарском сыре. Таблица 3.1.2 Количество пропионовокислых бактерий в Швейцарском сыре.

40 1/1000 швейцарский свежий швейцарский (1 неделя) швейцарский свежий швейцарский (1 неделя) 1/10 000 1/ 100 000 I II I II I II 792 772 556 518 173 165 700 542 480 422 127 105 Повторность 912 560 542 184 190 422 147 126 876 650 684 456 На основе данных полученных по результатам подсчета колоний, можно сделать вывод, что количество пропионовокислых бактерий уменьшается после того, как сыр хранился в холодильнике 1 неделю. 3.2. Микроскопическое исследование микрофлоры сыров Для дальнейшего изучения пропионовокислых бактерий мы провели микроскопическое исследование колоний выросших на чашках Петри. Были выбраны колонии, находящиеся под средой, так как пропионовые бактерии являются факультативными анаэробами. Рис. 3.2.1 Propionibacterium. Фиксированный препарат, окраска метиленовым синим.

41 Клетки этих бактерий характеризуют как грамположительные, неподвижные палочки, слегка искривленные, иногда – ветвящиеся, похожи на микобактерии. Величина клеток меняется в зависимости от возраста и условий роста. В молодых культурах и аэробных условиях – палочки, затем они укорачиваются иногда до кокковидных форм, которые могут быть соединены в цепочки. В анаэробных условиях клетки более длинные, ветвящиеся, напоминают промицелий проактиномицетов. Внутри клеток часто обнаруживаются легко окрашиваемые зерна. Рис. 3.2.2. Качественный состав микрофлоры сыров На микрофотографии под номерами представлены: 1 – род Lactobacillus, 2 – род Streptococcus, 3 – род Propionibacterium 3.3. Статистическая обработка цифровых данных. 3.3.1. Обработка цифровых данных методом дисперсионного анализа В программе Microsoft Office Excel 2007 с помощью метода дисперсионного анализа были вычислены следующие параметры: среднее значение, стандартная ошибка, дисперсия и стандартное отклонение.

42 Таблица 3.3.1.1. Общая численность пропионовокислых бактерий в разведении 1: 106 Сыр Маасдам Дата посева апрель май Среднее 213,5 193,5 Дисперсия 12,25 2,25 Стандартное отклонение 3,5 1,5 Ошибка выборочной средней 1,75 0,75 апрель май 158 144 100 81 10 9 5 4,5 Сыр Массдам свежий Маасдам 1 неделя Таблица 3.3.1.2. Общая численность пропионовокислых бактерий в разведении 1: 106 Швейцарский сыр Дата посева апрель май Среднее 178,5 177,5 Дисперсия 30,25 33,25 Стандартное отклонение 5,5 6,5 Ошибка выборочной средней 2,75 3,25 апрель май 137 100 110,25 10 10,5 5 5,25 Сыр Швейцарский сыр свежий Швейцарский сыр 1 неделя 115,5 В ходе анализа численности данных мы можем сделать вывод о том, что количествое пропионовокислых бактерий в швейцарском сыре меньше чем в сыре Маасдам. Также при хранении сыров наблюдается заметное уменьшение количества микроорганизмов (рис. 3.3.1.). Рисунок. 3.3.1. Изменение количества КОЕ в образцах сыра при хранении

43 3.3.2. Обработка цифровых данных разностным методом Для обработки данных разностным методом мы использовали результаты разведения 1:106. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента (p <0,05). Таблица 3.3.2.1. Обработка разностным методом данных, полученных при вычислении количества пропионовокислых бактерий в сыре Маасдам, разведение 1:106 Повторн ость 1 2 3 4 КОЕ (х*105) маасдам маасдам свежий 1неделя 210 148 192 135 168 217 153 195 X1ср=203,5 X2ср=151 (d-dср)2 d 62 57 49 42 dср=54 d-dср 14 3 -5 -12 ∑=0 Sd(1-2) tфакт 196 9 25 144 ∑(d-dср)² =374 5,58 Ѵ = (4-1) + (2-1) = 4 На уровне значимости 0,05, следовательно, данные достоверны. = 3,18, т. е. > , 9,4

44 Таблица 3.3.2.2. Обработка разностным методом данных, полученных при вычислении количества пропионовокислых бактерий в Швейцарском сыре, разведение 1:106 Повторн ость 1 2 3 4 КОЕ (х*105) Швейцар Швейцар ский сыр ский сыр свежий 1неделя 173 127 165 105 184 147 190 126 X1ср=17 X2ср=12 8 6,25 d d-dср (d-dср)2 Sd(1-2) tфакт 46 60 37 64 dср=51,7 5 На уровне значимости 0,05, следовательно, данные достоверны. -5,75 8,25 -14,75 12,25 ∑=0 = 3,18, т. е. 33,0625 68,0625 217,5625 150,0625 ∑(d-dср)² =468,75 > 6,25 , 8,28

45 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Молочные продукты занимают первое место в основе правильного питания здорового человека. И сыр далеко не является здесь исключением. Он является легкоусвояемым белковым продуктом, обладает прекрасными органолептическими свойствами. Его пищевая ценность обеспечена высокой концентрацией в нем белков, жиров, незаменимых аминокислот, солей кальция и фосфора, необходимых для нормального развития организма человека. Особенно следует отметить роль твердых сыров, при изготовлении которых участвуют пропионовокислые бактерии. Они oтнoсятся к одним из самых полезных микроорганизмов. Они участвуют в синтезе многих важнейших веществ: различных аминокислот, большего кoличeствa жиpныx кислoт, липидoв и фoсфoлипидoв, пoлифисфaтoв фepмeнтoв и витaминoв. В связи с пpoпиoнoвoкислыx этим aктуaльными бaктepий, являются oблaдaющиx paзpaбoткa высoкoй зaквaсoк биoxимичeскoй aктивнoстью, и нa иx oснoвe сoздaниe кислoмoлoчных пpoдуктов питaния. В ходе проведенного нами исследования были получены следующие выводы: 1) Был изучен количественный состав микрофлоры «Швейцарского» сыра и сыра Маасдам. По полученным нами данным, можно сделать вывод о том, что количество бактерий в сыре Маасдам больше, чем в Швейцарском сыре. Это может быть связано с различными предприятиями и технологиями производства продукции, возможными нарушениями норм упаковки, транспортировки и хранения сыров. 2) При сравнении данных, полученных при исследовании микрофлоры Швейцарского сыра и сыра Маасдам, мы выявили, что при хранении количество пропионовокислых бактерий уменьшается. Это связано с несколькими факторами, во-первых, при хранении сыра нарушается целостность упаковки, в связи с чем увеличивается доступ кислорода,

46 что губительно сказывается на факультативно анаэробных пропионовокислых бактериях. Во-вторых, бактерии могут проявлять активность и при достаточно низких температурах, поэтому при хранении сыров в холодильнике расходуются питательные вещества необходимые для их жизнедеятельности и их численность снижается.

47 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Белозерова, Л.М. Разработка технологии кисломолочного продукта с использованием пропионовокислых бактерий: дис… канд. техн. наук / Белозерова Л.М. – Улан-Удэ, 2001. 2. Воробьева, Л.И. Пропионовокислые бактерии / Л.И. Воробьева. – М.: Изд-во МГУ, 2009. – 288 с. 3. Воробьева Л.И. Пропионовокислое брожение и образование витамина В12. /Л.И. Воробьева. -М.: МГУ. - 2014. - 100 с. 4. Гаврилова Н.Н., Ратникова И.А., Баякышева К., Захаренко Л.И. Создание ассоциации из молочнокислых и пропионовокислых бактерий, активной в отношении колибактериоза и сальмонеллеза / Н.Н. Гаврилова // Биотехнология. - 2005. -№2. - С.26-32. 5. Гудков А.В. Сыроделие: технологические, биологические и физикохимические аспекты / Под редакцией С.А.Гудкова // М.: Де Ли принт, 2003. - 800 с. 6. Гусев М.В., Л.А. Минеева. Микробиология. – М.: Академия, 2010. – 464 с. 7. Джеймс М.Джей, Мартин Дж. Лесснер, Дэвид А.Гольден. Современная пищевая микробиология. – М.: Бином. Лаборатория знаний, 2014. – 888 с. 8. Дьяченко, П.Ф. Специфичность протеолитической продуктивности заквасочных культур в сыроделии / П.Ф. Дьяченко, В.Г. Тиняков // Молоч. промышленность. – 1987. – № 4. – С. 19–22. 9. Ившина И.Б. Большой практикум Микробиология. Учебное пособие. – М.: Проспект Науки, 2014. – 112 с. 10.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – М.: СпецЛит, 2006. – 772 с.

48 11.Мородинова В.А., Лепилкина О.В., Остроухова И.П., Самойлов А.В. Особенности формирования органолептических показателей сырных продуктов // Сыроделие и маслоделие. 2012. № 2. 12.Мармузова Л.В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. – М.: Academia, 2013. – 160 с. 13.Мурадова Е.О., Ткаченко К.В. Микробиология. – М.: Эксмо, 2009. – 336 с. 14.Николаева, Е.А. Созревание сыра «Швейцарский» в полимерной пленке / Е.А. Николаева // Сыроделие и маслоделие. – 2007. – № 3. – С. 13. 5. 15.Определитель бактерий Берджи в 2-х томах под ред. Дж. Хоулта и др.. М.: Мир, 1997. - 780 с. 16.Остроумов Л.А. Биологические методы управления процессом производства сыров с высокой температурой второго нагревания: обзорная информация / Л.А. Остроумов // АгроНИИТЭИММП, 1993. 40 с. 17.Остроумов Л.А. Качество советского сыра при различных уровнях молочнокислого и пропионовокислого брожения / Л.А.Остроумов, В.А.Бабушкина, А.А.Майоров, С.А.Говорюткина // Тр.ВНИИМС. 1978. Вып. XXIII. С.100-104. 18.Перфильев Г.Д. Производство и применение бактериальных концентратов / Г.Д. Перфильев, Ю.Я. Свириденко // Сыроделие и маслоделие, 2006. - № 3. - С. 24-29. 19.Попищук П.К., Дербинова З.С., Казанцева Н.Н.Микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Пищевая промышленность, 1978. 20.Рогов, И.А. Химия пищи / И.А. Рогов, Л.В. Антипова, Н.И. Дунченко. – М.: КолосС, 2007. – 726 с. 21.Сидоренко О. Д. Микробиология. – М.: ИНФРА – М, 2005. – 287 с.: ил.

49 22.Сиротин А.А. Практикум по микробиологии / А.А. Сиротин. – Белгород, 2007.-78с. 23.Скотт Р., Робинсон Р., Уилби Р. Производство сыра. Сырье, технологии, рецептуры. – Пер. с англ. яз. под ред. К. К. Горбатовой. – СПб.: Профессия, 2005. – 464 с. 24.Соколова О.Я. Производственный контроль молока и молочных продуктов. – Оренбург.: ОГУ, 2012. – 195 с. 25.Табачников В.А. Крупноблочное прессование сыра. – М.: ЦНИИ ТЭИ, 1968. 26.Хамагаева, И. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий / И. Хамагаева и др. – Улан-Удэ, 2006. – 172 с. 27.Babuchowski A, Hammond EG, Glatz BA (1993) Survey of propionibacteria for ability to produce propionic and acetic acids. J Food Prot 56: 493-496 28.BoyavalP, CorreC, MadecMN (1994)Propionicacidproductionin a membrane bioreactor. Enzyme Microbiol Technol 16: 883-886 29.Chisti Y. Sonobioreactors: using ultrasound for enhanced microbial productivity // Trends in Biotechnology. – 2003. – V. 21(2). – P. 89–93. 30.Claude S (1996) Research of new outled for glycerol ± Recent developments in France. In: Eierdanz H (ed) Perspektiven Machwachsender Rohsto€ e in der Chemie. VCH, Weinheim, pp 133-143 31.Colomban A, Roger L, Boyaval P (1993) Production of propionic acid from whey permeate by sequential fermentation, ultra®ltration, and cell recycling. Biotechnol Bioeng 42: 1091-1098 32.Crespo JPSG (1990) Modelling of immobilized cell reaction for propionic acid production. Biotechnol Bioeng 36: 705-716 33.Draughon FA, Mobley DC, Sa¯ey LM, Backus WR (1982) Eect of calcium propionate and sodium diacetate on fungi in stillage. J Food Sci 44: 10181019

50 34.Eaton DC, Gabelman A (1995) Fed-batch and continuous fermentation of Selenomonas ruminantium for natural propionic, acetic and succinic acids. J Ind Microbiol 15: 32-38 35.Emde R, Schink B (1990a) Enhanced propionate formation by Propionibacterium freudenreichii in a three-electrode amperometric culture system. Appl Environ Microbiol 56: 2773-2776 36.Erickson LE, Minkevich IG, Eroshin VK (1979) Utilization of mass-energy balance regularities in the analysis of continuousculture data. Biotechnol Bioeng 21: 575-591 37.Flores Galarza RA (1985) Preservation of high moisture corn by microbial fermentation. J Food Prot 48: 407-411 38.Hendricks B, Korus RA, Heimsch RC (1986) Propionic acid production by bacterial fermentation. Biotechnol Bioeng 15: 241-245 39.Hettinga DH, Reinbold GW (1972) The propionic-acid bacteria. A review. II. Metabolism. J Milk Food Technol 35: 358-372 40.Huitson JJ (1968) Cereals preservation with propionic acid. Process Biochem 31-32 41.Johns AT (1951) The mechanism of propionic acid formation by the Propionibacteria. J Gen Microbiol 5: 37-345 42.Lewis PV, Yang ST (1992b) A novel extractive fermentation process for propionic acid production from whey lactose. Biotechnol Prog 8: 104-110 43.Lueck E (2015) Propionic acid. In: Lueck E (ed) Antimicrobial food additives. Characteristics. Uses. Eects. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp 175-182 44.Mantire-Alhonen S (1987) A new type of milk with Propionibacteria. Meijeritiet Aikak 45: 49-61 45.Playne MJ (1985) Propionic and butyric acids. In: Moo-Young M (ed) Comprehensive biotechnology, vol 3. Pergamon, New York, pp 731-75

51 46.Quesada-Chanto A, Afschar AS, Wagner F (1994) Microbial production of propionic acid and vitamin B12 using molasses or sugar. Appl Microbiol Biotechnol 41: 378-383 47.Tabatabaie, F., Mortazavi, S.A. (2010). Effects of ultrasound treatment on viability and autolysis of starter bacteria in hard cheese. American-Eurasian Journal of Agricultural & Environment Science, 8(3), 301– 304. 48.Woskow SA, Glatz BA (2007) Propionic acid production by a propionic acid - tolerant strain of Propionibacterium acidipropionici in batch and continuous fermentation. Appl Environ Microbiol 57: 2821-2828

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв