Анализ потенциальных рецептор-распознающих белков бактериофага ϕ24B

Александр Кузнецов

Анализ потенциальных рецептор-распознающих белков бактериофага ϕ24B

Способность к продукции шигаподобного токсина некоторыми патогенными штаммами Escherichia coli является следствием лизогенной конверсии, то есть была приобретена клеткой в результате фаговой инфекции, развивающейся по лизогенному пути. Ген шигаподобного токсина (stx) присутствует в геномах нескольких видов лямбдоидных фагов. Ключевой стадией инфекции для бактериофагов служит адсорбция на поверхности клетки-хозяина. Известно, что stx-конвертирующий бактериофаг φ24B в качестве конечного рецептора распознает белок BamA, однако рецептор-распознающие белки фага не идентифицированы. Также остается открытым вопрос о преодолевании фагом слоя О-антигена, экранирующего белок BamA. В ходе работы был проведен биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей потенциальных рецептор-распознающих белков бактериофага φ24B, получены как очищенные препараты бактериофага, так и соответствующие им лизогенные культуры клеток, изучены свойства последних. Полученные данные позволяют сделать предположения о деталях взаимодействия вирусной частицы с поверхностью бактериальной клетки.

Биология

Дипломы

Вуз: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова (МГУ имени М.В. Ломоносова)

ID: 5e9df25eca23590001d0ece2

UUID: c3618f10-6567-0138-3152-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: около 4 лет назад

Просмотры: 16

10.42

Александр Кузнецов

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова (МГУ имени М.В. Ломоносова)

Комментировать 15

Рецензировать 0

Скачать - 3,7 МБ

Поделиться работой

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. Ломоносова БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра Вирусологии Анализ потенциальных рецептор-распознающих белков бактериофага ϕ24B Potential receptor-binding proteins of bacteriophage ϕ24B Выпускная квалификационная работа бакалавра Студента IV курса Кузнецова Александра Сергеевича Научный руководитель: заведующий лабораторией вирусов микроорганизмов, доктор биологических наук Летаров Андрей Викторович Институт Микробиологии им. С. Н. Виноградского ФИЦ Биотехнологии РАН Москва, 2019

ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Введение 3 2. Обзор литературы 5 2.1. Лизогенная конверсия 5 2.1.1. Stx-конверсия 6 2.1.2. Stx-конвертирующий бактериофаг ϕ24B 7 2.2. Семейство Podoviridae 7 2.3. Адсорбция хвостатых бактериофагов 9 2.4. Фаговые рецепторы грамотрицательных бактерий 10 2.4.1. Пили и жгутики 12 2.4.2. Белки внешней мембраны 12 2.4.3. Липополисахариды 13 2.5. Адсорбция фагов семейства Podoviridae 2.5.1. Специфика адсорбции бактериофага ϕ24B 14 15 3. Материалы и методы 18 4. Результаты и их обсуждение 26 5. Заключение 42 6. Выводы 43 7. Благодарности 44 8. Список литературы 45 2

Введение Бактериофаги - одна из наиболее многочисленных и разнообразных групп вирусов. Они играют важную роль в формировании микробных сообществ, в эволюции бактерий, осуществлении биогеохимического круговорота веществ. Способность бактериофагов к лизогении — варианту жизненного цикла, при котором происходит сохранение и репликация генетического материала в виде профага без лизиса клеток и размножения вируса — позволяет инфицированным лизогенным клеткам приобретать новые признаки благодаря латеральному переносу генов. Иногда вследствие лизогенизации бактериофагами бактерии способны приобретать новые, в том числе и патогенные свойства. Таким образом возникает поток генов патогенности бактериями-патогенами и родственными им бактериями-симбионтами нормальной микробиоты. Лизогенный цикл начинается с акта адсорбции вирусной частицы на поверхности бактериальной клетки — эта стадия является необходимой и определяющей дальнейшее развитие инфекции. Поэтому изучение механизмов адсорбции может помочь в решении проблем, связанных с патогенной конверсией бактерий. Умеренный бактериофаг ϕ24B является представителем семейства Podoviridae (фаги с коротким несократимым хвостом), но специфика его генома дает основание относить его к лямбдоидным бактериофагам. Этот вирус может эффективно лизогенизировать различные штаммы Escherichia coli. Геном фага ϕ24B содержит ген шигаподобного токсина stx, способный экспрессироваться в инфицированных клетках. Несмотря на потенциальную значимость этого объекта для экологии симбиотической флоры человека и животных, механизмы его адсорбции пока слабо 3

изучены, в том числе из-за методических сложностей исследования, связанных с его биологическими особенностями. Целью данной работы является исследование строения и свойств потенциальных белков адсорбционного аппарата бактериофага ϕ24B. Для этого мы поставили несколько задач, включающих получение и анализ исследуемых белков в рекомбинантном виде, получение бактерийлизогенов по этому бактериофагу, изучение их свойств, получение и электронная микроскопия очищенных препаратов данного вируса. 4

Обзор литературы 2.1. Лизогенная конверсия Для многих умеренных фагов показана способность к лизогенной конверсии — приобретению лизогенами новых биологических свойств. В таком случае продукты конвертирующих генов в составе профага не влияют непосредственно на жизненный цикл вируса, но могут нести адаптивные преимущества клетке-хозяину (Barksdale, 1959; Harrison, Brockhurst, 2017). При лизогенизации определенным фагом клетки обычно приобретают устойчивость к этому фагу (Holloway, Cooper, 1962). Лизогенная конверсия может выражаться в изменении химического состава поверхности клетки (Wollin et al., 1987), приобретении устойчивости к антибиотикам (Młynarczyk, 1997), приобретении новых систем регуляции экспрессии клеточных генов (Feiner et al., 2015). Многие конвертирующие гены профагов патогенных бактерий кодируют возможные факторы вирулентности (Brüssow et al., 2004). Так, фаг фитопатогенных бактерий ϕRSY1 в результате лизогенизации усиливает агрегацию клеток, увеличивает размеры колоний и изменяет тип подвижности клеток (Askora et al., 2017). Зачастую конвертирующие бактериофаги могут иметь в составе своего генома гены токсинов. К примеру, фаг fCTX, конвертирующий Pseudomonas aeruginosa, содержит в геноме ген цитотоксина (ctx) (Nakayama et al., 1999). Другими примерами таких токсинов являются некоторые типы ботулотоксина, синтезируемые токсигенными штаммами Clostridium botulinum (Eklund et al., 1971). Ген холерного токсина кодируется нитчатым бактериофагом, конвертирующим Vibrio cholerae (Waldor, Mekalanos, 1996). Первым открытым токсин5

конвертирующим вирусом прокариот является фаг β, инфицирующий грамположительную палочковидную бактерию Corynebacterium diphtheriae (Freeman, 1951). Дифтерийный токсин кодируется профагом, однако его экспрессия контролируется клеточной системой репрессии и зависит от концентрации железа в среде (Hatano, 1956). Показано, что умеренные бактериофаги играют значительную роль в эволюции и вирулентности патогенных бактерий (Fortier, Sekulovic, 2013). 2.1.1. Stx-конверсия Шигаподобный токсин некоторых штаммов кишечной палочки (E. coli Stx+, Shiga toxin-producing E. coli, STEC), в частности патогенных серотипов O104:H4 и O157:H7, имеет гомологию аминокислотной последовательности с шигатоксином (токсин бактерий рода Shigellа, являющихся возбудителями дизентерии) и высвобождается при индукции профага. Stx1 и Stx2 – самые распространенные формы шигаподобного токсина (Donnenberg, Whittam, 2001), каждый из которых представляет собой четвертичную структуру, состоящую из мономера белка А и пентамера белка В. В-субъединицы глоботриацилцерамидом и схожими специфически связываются гликолипидами на с мембране эукариотической клетки. А-субъединица проникает внутрь клетки путем эндоцитоза и транспортируется в ЭПР, где связывает функционально важный остаток аденозина в составе 28S рРНК, что приводит к прекращению синтеза белка и, как следствие, гибели клеток путем апоптоза (Yoshida et al., 1999). Фагов, способных к такой конверсии, по генетической классификации относят к лямбдоидным (Ibarra et al., 2013). Шигатоксигенные E. coli населяют тонкий кишечник животных, однако при индукции профага возможно возникновение лизогенов в толстой кишке 6

(Baines et al., 2008). Важное значение имеют штаммы группы STEC, особенно энтерогеморрагические штаммы E. coli (EHEC), такие, как серотип O157:H7. Индукцией штаммов этого серотипа были получены Stxконвертирующие фаги, которые имеют морфологию типичных подовирусов (Sváb et al., 2015). 2.1.2. Stx-конвертирующий бактериофаг ϕ24B Среди шигатоксин-конвертирующих фагов особого внимания заслуживает бактериофаг ϕ24B, способный инфицировать in vivo большое количество разнообразных штаммов E. coli. Многие STEC являются лизогенами по экспрессировать этому ген фагу (Dydecka шигаподобного et al., токсина 2017) stx. и Этот способны токсин экспрессируется только при индукции профага, происходящей лишь в небольшой части клеток лизогенной популяции. Тем не менее, наличие Stxконвертирующего профага превращает некоторые штаммы E. coli в крайне опасные возбудители пищевых инфекций у людей и животных. Наличие шигатоксигенных E. coli у скота не допускается санитарными правилами, что приводит к вынужденному забою и существенным экономическим потерям в сельском хозяйстве (Geue et al., 2017). Помимо конверсии к токсигенности профаг ϕ24B также заметно изменяет метаболическую активность клетки (Holt et al., 2017), усиливая патогенный потенциал лизогена. 2.2. Семейство Podoviridae Семейство Podoviridae включает в себя бактериофагов с коротким несократимым хвостом. Вирусные частицы имеют комплексную структуру и состоят из капсида, который представлен правильным или вытянутым 7

икосадельтаэдром, содержащим линейную дцДНК, и коротким несократимым хвостом. Некоторые подовирусы внутри капсида содержат дополнительные структурные белки. Соединение капсида с хвостом осуществляется через портальный белок (рис. 1; McNulti et al., 2018) Хвосты подовирусов образованы цилиндрическим комплексом из одного или нескольких типов белков, организованных в гексамерные или додекамерные структуры (Cuervo et al., 2013), и адсорбционным аппаратом, который представлен большим разнообразием фибрилл и хвостовых шипов. К уникальной вершине капсида через портальный белок присоеденён белок-привратник (connector), через который происходит эжекция ДНК (рис. 2). Хвостовая структура заканчивается белковой конструкцией типа “сопло” (nozzle). У подовируса P22 сборка хвоста начинается с взаимодействия шести субъединиц привратника gp4 с додекамерной портальной структурой gp1 (Olia et al., 2006), после чего происходит присоединение других частей хвоста — gp10 и gp26, и формирование полноценного хвоста (рис. 1). Рис. 1. Сравнение зрелой (слева) и пустой (справа) вирусной частицы бактериофага P22. gp1 – портальный белок; gp4 – хвостовой дополнительный фактор (привратник); gp10 – боковая фибрилла; gp26 – хвостовая игла (осевая структура хвоста); черная стрелка показывает изменение конформации осевой структуры хвоста после эжекции ДНК (McNulti et al., 2018) 8

Рис. 2. А — локализация различных белков в хвостовой структуре бактериофага T7; Б — пространственное изображение хвостовой структуры бактериофага Т7, вид сбоку (слева) и с дистального конца (справа) (Cuervo et al., 2013) 2.3. Адсорбция хвостатых бактериофагов Первым и зачастую определяющим дальнейшую судьбу вируса этапом фаговой инфекции оказывается адсорбция вирусной частицы на поверхности клетки, выражающаяся в специфическом, как правило нековалентном связывании вирусных рецептор-распознающих белков с различными структурами на поверхности клетки, первичными или вторичными рецепторами фага. Адсорбцию можно рассматривать в виде двух последовательных стадий: узнавание вирионом поверхности клеткихозяина и изменение структуры вирусной частицы для осуществления эжекции ДНК в цитоплазму. Первая стадия заключается во взаимодействии фагового адгезина и соответствующего ему клеточного рецептора с образованием промежуточного комплекса, который может затем разрушиться. Это приводит к диссоциации бактериофага от клетки с сохранением им способности адсорбироваться на поверхности клетки снова. В роли фаговых адгезинов у хвостатых фагов выступают фибриллы 9

либо хвостовые шипы (tailspikes), находящиеся на хвосте вирусной частицы. У хвостатых бактериофагов обычно встречается кратное трем число хвостовых фибрилл или хвостовых шипов (Pickard et al., 2010), обычно распознающих первичный рецептор. Такое взаимодействие называют обратимой адсорбцией. Рецептор-распознающий центр фагового адгезина имеет узкий спектр сродства к рецепторам на поверхности клетки и обычно связывается лишь с определенной частью узнаваемой молекулы. Благодаря иммуноглобулиновым доменам белки адсорбционного аппарата бактериофагов могут узнавать, например, короткие аминокислотные участки в составе петель клеточных поверхностных белков (Flayhan et al., 2012), либо 2-3 моносахаридных остатка в узнаваемом полисахариде за счет наличия в составе некоторых фаговых адгезинов лектиновых доменов (Pyra et al., 2017). При этом в связи с высокой изменчивостью первичных рецепторов на поверхности клетки и элементов адсорбционного аппарата бактериофагов спектр большинства вирусов бактерий описывается часто набором родственных штаммов одного вида (Letarov et al., 2010; Letarov & Kulikov, 2017). Явление необратимой адсорбции заключается во взаимодействии фага с конечным рецептором и конформационной перестройке белков капсида, создающей условия для эжекции ДНК. 2.4. Фаговые рецепторы грамотрицательных бактерий Оболочка грамотрицательных бактерий имеет две мембраны — внешнюю (ОМ) и внутреннюю (IM), между которыми находится слой пептидогликана, образующий клеточную стенку, и периплазматическое пространство (рис. 3), при этом внешний слой ОМ состоит из липополисахаридов. Адсорбция вирусных частиц происходит на наружной 10

мембране, при этом ее разные элементы могут служить как первичными, так и вторичными рецепторами фага. Рис. 3. Строение клеточной оболочки грамотрицательных бактерий на примере E. coli. MDO – мембран-ассоциированные олигосахариды (membrane-derived oligosaccharides), Omp – белок внешней мембраны (outer membrane protein), Chap – периплазматические шапероны, Pull. - пуллуланаза, Dsb – белки правильного формирования дисульфидных связей, GSP – главный путь секреции (general secretory pathway), PC – предшественник мембран-связанного белка оболочки фага M13 (Duong et al., 1997) 11

2.4.1. Пили и жгутики Различные выросты на поверхности ОМ могут быть использованы бактериофагами в качестве первичных рецепторов (McCutcheon et al., 2018). Некоторые бактериофаги могут связывать жгутики бактерии с помощью “головного филамента”, сближаясь таким образом с клеточной поверхностью (Guerrero-Ferreira et al., 2011). 2.4.2. Белки внешней мембраны Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий содержит большое количество поринов (например, OmpA) и транспортеров (например, BtuB, FhuA) — мембранных интегральных белков, представляющих собой цилиндрическую структуру, образованную бета-структурными элементами, центральная часть которой проницаема для определенных соединений (рис. 4). Подобные белки могут служить для бактериофага в качестве как первичного (Trojet et al., 2011), так и вторичного рецептора (Langenscheid et al., 2004). Рис. 4. Трехмерная структура белка внешней мембраны на примере LptD. А — вид сбоку, Б — вид со стороны периплазмы. Зеленым цветом обозначены α-спирали, синим — β-слои, фиолетовым — нерегулярные структуры (петли) (Zha et al., 2016) 12

2.4.3. Липополисахариды Липополисахариды (ЛПС) образуют наружный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий (Emiola et al., 2016) и так или иначе принимают участие в процессе адсорбции фага. Молекулу ЛПС можно разделить на три структурные части: липид А, образующий бислой с фосфолипидами внутреннего слоя ОМ, кор-олигосахарид (core) и Оантиген (рис. 5). ЛПС, в свою очередь, был описан как эндотоксин, так как при взаимодействии с иммунной системой человека вызывает повышение температуры. Липид А является агонистом Toll-подобного рецептора 4 (MD-2/TLR4), присутствующего на поверхности многих клеток нашего организма, активация которого может приводить к определенному иммунному ответу (Uematsu, Akira, 2008). Рис. 5. Структура ЛПС E. coli O111:B4 (Schultz et al., 2017) 13

Липополисахарид, а именно его самая вариабельная часть (Оантиген) часто используется бактериофагами в качестве первичного рецептора (Tomás, Jofre, 1985; Letarov, Kulikov, 2017). 2.5. Адсорбция фагов семейства Podoviridae Зачастую подовирусы грамотрицательных бактерий, такие, как N4 или Т7, в качестве первичного рецептора распознают молекулу ЛПС. Затем хвостовые шипы бактериофага, снабженные ферментативными доменами, гидролитически деполимеризуют О-антиген, сближая вирион с вторичным (конечным) рецептором — белком в ОМ, после чего происходит необратимая адсорбция и эжекция ДНК вируса в цитоплазму бактерии (Casjens & Molineux, 2012). Похожие процессы происходят при адсорбции бактериофага P22 (рис. 6), хотя многие аспекты распознавания вторичного рецептора этим фагом до конца не ясны. Показано, что, помимо деполимеразной активности, рецептор-распознающие белки подовирусов могут иметь иную ферментативную активность — способность к деацетилированию моносахаридных остатков в составе О-антигена, такая особенность характерна для бактериофага G7C (Prokhorov et al., 2017). 14

Рис. 6. Схема адсорбции бактериофага P22; OM – внешняя мембрана, PG – пептидогликан, IM – внутренняя мембрана (Parent et al., 2014) 2.5.1. Специфика адсорбции бактериофага ϕ24B Известно, что фаг ϕ24B распознает экспонированный на поверхности клетки трансмембранный белок BamA (YaeT), который необходим для включения во внешнюю мембрану бактерии других белков (Smith et al., 2007; рис. 7). Однако, вирусный белок, узнающий BamA, пока не идентифицирован. Фаги, родственные ϕ24B, обуславливают токсигенность большого числа опасных штаммов энтеропатогенных E. coli (EPEC), в основном относящихся к серотипам О157:Н7 и O104:H4, что говорит об их способности адсорбироваться на клетках данных серотипов с последующей 15

лизогенизацией в естественных условиях. При этом фаг ϕ24B потенциально способен лизогенизировать и штаммы иных серотипов (неопубликованные данные нашей лаборатории), что может иметь существенное клиническое значение. Кроме того, остается открытым вопрос о преодолении данным вирусом барьера О-антигена, эффективно защищающего поверхность клетки (Kulikov et al., 2019). Рис. 7. Возможные пути белка внешней мембраны. Первичные полипептиды синтезируются в цитоплазме бактерии и доставляются к транслоказе SecYEG с помощью шаперонов SecA/SecB или рибосомы. При попадании в периплазму полипептид может транспортироваться к BAM-комплексу при помощи периплазматических шаперонов SurA или Skp. Если происходит неправильный фолдинг белка (mis-fold), он деградирует при участии протеазы DegP, не покидая пределы периплазмы (Rollauer et al., 2015) 16

Для лямбдоидных продемонстрировано, фагов что и, в exo-xis частности регион для генома ϕ24B, было содержит последовательности, отвечающие за морфогенез вирусных частиц. В том числе было показано, что бактериофаги с делециями orf60a и orf61 обладают кинетикой адсорбции отличной от таковой для бактериофагов исходного типа (рис. 8), что может говорить о вовлечении белков Orf60a и Orf61 в процесс сборки адсорбционного аппарата вируса (Dydecka et al., 2018). Рис. 8. А — регион exo-xis в геноме ϕ24B; Б — кривые адсорбции для дикого типа ϕ24B и для мутантов с делециями orf60a и orf61 (Dydecka et al., 2018) Совокупность этих особенностей делает данный бактериофаг очень интересным объектом для исследования. 17

Материалы и методы Среды для культивирования: Luria-Bertani (LB) жидкая: 1% NaCl, 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта. В случае мягкого агара (LS) на основе LB добавляли 0,6% агара, для твердого (LА) – 1,5% агара. Используемые штаммы E. coli: DH5α – лабораторный штамм, предназначенный для клонирования. BL21(DE3) – лабораторный штамм компании Kerafast, предназначенный для экспрессии белка. MG1655 – лабораторный штамм из коллекции ATCC, используемый для титрования бактериофага ϕ24B MG1655:24B, MG1655:24BΔorf61, MG1655:24BΔorf63 – лизогенные штаммы, содержащие профаг 24B и делеционных мутантов по orf61 и orf63, любезно предоставленные для данной работы сотрудниками кафедры молекулярной биологии Биологического фаультета Гданьского Университета, Польша. MG1655 (λ) — лизогенный штамм, содержащий профаг λ. MC1061 – лабораторный штамм, используемый для титрования заменой некоторых бактериофага ϕ24B MC1061 BamAΔ – штамм MC1061 c последовательностей белка BamA на последовательности из белка Erwinia. В результате этой замены данный штамм приобрел устойчивость к ϕ24B. MC1061 BamAΔRID – штамм MC1061 BamAΔ, комплементированный плазмидой с нормальным геном BamA, возвращающей чувствительность к ϕ24B. Последние два штамма были любезно предоставлены проф. H. Allison из Ливерпульского университета (Великобритания). 18

F4, C-600L – штаммы, используемые в нашей лаборатории для различных задач. A13 – штамм, выделенный в нашей лаборатории из фекалий лошади (2018 год, Нескучный сад, конюшня). M147 и 10-Beta – лабораторные штаммы, которые мы использовали для проведения экспресии рекомбинантных фаговых белков. Используемые штаммы бактериофагов: В нашей работе мы использовали фаг ϕ24B с геном stx, инактивированным вставкой гена хлорамфениколацетилтрансферазу, хлорамфениколу. ϕ24B, маркер ϕ24BΔorf61, cat, кодирующего устойчивости ϕ24BΔorf63 – к бактериофаги, полученные путем индукции профага в соответствующих лизогенов MG1655:24B, MG1655:24BΔorf61, MG1655:24BΔorf63. Делеция orf61 у бактериофагов приводила к изменению кинетики адсорбции (Dydecka et al., 2018), делеция orf63 – к увеличению эффективности лизогенизации (Dydecka et al., 2017). DT57½, 7c, ABF – T5-подобные бактериофаги, узнающие при инфекции только конечный рецептор (белок на поверхности клетки) и не нуждающиеся в наличии О-антигена для адсорбции. Культивирование бактерий Пересевы на чашки Петри с твердой средой (LA) производили методом истощающего штриха, после чего засеянные чашки помещали в термостат на 37°С. Для культивирования в жидкой среде (LB) при 37°С и качании 250 об/мин сначала получали ночную культуру, а затем разводили ее средой LB в 100 раз и инкубировали при стандартных параметрах до 19

необходимого значения OD600 суспензии. Штаммы, трансформированные плазмидами pGEM, pGEX и их производными, культивировали на средах с ампициллином. Селекцию получаемых лизогены по ϕ24B производили высеванием на чашки с содержанием хлорамфеникола. Штамм MC1061 BamAΔ культивировали, используя среды с канамицином, а штамм MC1061 BamAΔRID – с канамицином и ампициллином. Получение генетических конструкций с генами g56 и g61-59 С помощью ПЦР мы амплифицировали ген g56 c использованием специфических праймеров (табл. 1), внеся в ПЦР-продукт необходимые для дальнейших операций сайты рестрикции и гексагистидиновый таг. Полученный фрагмент в смеси с экспрессионным вектором рGEX4T3 подвергли гидролизу рестриктазами EcoRI и XhoI, после чего провели реакцию лигирования. Аналогичную генетическую конструкцию получили для последовательности g61-59. Название праймера Нуклеотидная последовательность, 5'-3' Температура отжига Для g61-59 61-59-24B-R1-Xho1 Forward Primer TATAGAATTCGGTGTGAGTGTT GTTGTTTCGGGGA 59°С 61-59-24B-R1-Xho1 Reverse Primer TATACTCGAGTCAGTGGTGGT GGTGGTGGTTTCTATTTCATCC CGCCAATATTTTCCCACGT 63°С Для g56 56-24B-R1-Xho Forward Primer TATAGAATTCTCTCGGTATGAC CAGAAAACCGTGG 60°С 56-24B-R1-Xho Reverse Primer TATACTCGAGGCTCAGCGTAAT CTGCCTATGCGAAC Табл. 1. 59°С Информация об используемых при ПЦР олигонуклеотидах 20

Трансформация клеток Плазмиды pGEX4T3g56 и pGEX4T3g61-59 использовали для трансформации штаммов MC1061 BamAΔ и DH5α для препаративного выделения плазмиды. Для этого предварительно получали компетентные клетки. 1 мл культуры с OD600=0,6 центрифугировали на центрифуге MiniSpin 5 мин на 8000 об/мин, после чего отбирали супернатант и ресуспендировали осадок в 1 мл MilliQ. Затем снова центрифугировали при тех же параметрах и повторяли эту операцию, несколько раз осаждая клетки и ресуспендируя их в MilliQ, после чего осадок ресуспендировали в 50 мкл MilliQ. К этому объему добавляли 1 мкл препарата. Трансформацию клеток производили путем электропорации (Tu et al., 2016), после чего суспензию клеток разводили средой SOC и высевали при помощи шпателя на твердую среду с ампициллином для селекции колоний трансформантов. Выделение плазмидной ДНК Выделение плазмиды осуществляли набором Evrogen Plasmid Miniprep в соответствии трансформантов. Продукт с инструкцией очистки из ночной анализировали с культуры помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле. Получение рекомбинантного белка Штаммы MC1061 BamAΔ и BL21 трансформировали полученными в большом количестве и очищенными плазмидами pGEX4T3g56 и pGEX4T3g61-59 соответственно. Параллельно получали трансформантов по плазмидам pGEM и pGEX4T3 для использования их в качестве отрицательного и положительного контроля экспрессии. Трансформанты 21

культивировали в LB до OD600=0,5, затем добавляли 1/1000 объема 1M IPTG. Инкубировали 4 часа при стандартных параметрах. Индуцированные клетки лизировали в холодном PBS-буфере с 1mM дитиотреитола, 1mM фенилметилсульфонилфторида, 1% «тритона», лизоцимом, обработкой ультразвуком. Лизат центрифугировали в целях получения осветленного препарата белка (10000g, 15 мин), который затем инкубировали с глутатион-сефарозой (фармация GE Life Sciences). Анализ рекомбинантных белков методом электрофореза в ПААГ После экспрессии g61-59 получили фракции неосветленного лизата, осветленного смешивали лизата, с 2х осадка и SDS-буфером глутатион-сефарозы. Лэммли и наносили Эти на фракции 10%-ый полиакриламидный гель (ПААГ) для их анализа (Laemmli, 1970). Выделенный из геля белок отдавали в виде окрашенной полосы на исследование методом MALDI в лабораторию протеомного анализа НИИ ФХМ. Также белковый продукт экспрессии g61-59 был очищен путем Niаффинной хроматографии и исследован методом вертикального электрофореза в ПААГ. Биоинформатический анализ Для исследования структуры генов ϕ24B мы использовали последовательность генома, загруженную в систему NCBI GeneBank (Escherichia phage vB_EcoP_24B, Taxonomy ID: 866553). При помощи программы SnapGene составляли последовательность праймеров для ПЦР, производили аннотацию генов. С помощью интернет-сервиса HHPred (https://omictools.com/hhpred-tool) осуществляли поиск аминокислотных 22

последовательностей, гомологичных таковым в белках исследуемого фага. Детали трехмерной структуры изучали в программе UCSF Chimera. Приготовление фаговых лизатов Фаговые лизаты получали путем индукции лизогенов. Для этого лизогенные штаммы культивировали в среде LB объемом 200 мл с 10 мM CaCl2 до OD600=0,1. Далее добавляли митомицин С до конечной концентрации 1 мкг/мл. Дальнейшую инкубацию проводили в условиях низкой аэрации (200 мл культуры в 250 мл колбе) при 37°С и качании 250 об/мин. После видимого глазом лизиса к лизатам добавляли 2 мл хлороформа, после чего инкубировали 15 мин при тех же параметрах. Полученный лизат центрифугировали при 10000g в течение 15 минут. Супернатант отбирали и переносили в другой сосуд. Лизаты хранили при 4°С. Определение титров фагов в лизатах Для биологического титрования ϕ24B методом Грациа (Каттер, 2012) использовали нижний агар (LA) с конечной сублетальной концентрацией хлорамфеникола 2,5 мкг/мл. В пробирку к 2 мл теплого верхнего агара (LS) приливали 1 мл ночной культуры клеток и раствор CaCl2 до конечной концентрации 10 мM, после чего выливали смесь на твердую среду равномерным слоем для получения бактериального газона. Для фаговых лизатов проводили 12 последовательных 10-тикратных разведений в LB. По 5 мкл полученных разведений наносили каплями на слой верхнего агара. Чашки подсушивали в ламинаре и инкубировали в термостате на протяжении ночи. Утром чашки доставали и производили подсчет негативных колоний (бляшек), 23 количество которых числу

бляшкообразующих единиц (БОЕ) в данном объеме. Это число умножали на разведение и на 200 для получения значения титра в БОЕ/мл. Получение очищенного препарата фаговых лизатов Затем проводили осаждение фаговых частиц в осветленных лизатах центрифугированием при 50000g (ротор Beckman Type 19, 18000 об/мин) в течение часа. Супернатант сливали, осадок фага ресуспендировали в 5 мл SM-буфера (8 мМ MgSO4, 100 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HСl pH 7,5). Полученный сконцентрированный лизат очищали центрифугированием в градиенте СsCl. Для этого 0,4 мл препарата фага наслаивали на преформированный ступенчатый градиент хлорида цезия по плотности (от 1,6 до 1,3 г/см3, 4,5 мл). Затем центрифугировали 45 мин при 75000g. Также производили очистку центрифугированием в градиенте сахарозы: 300 мл концентрированного препарата наслаивали на преформированный ступенчатый градиент сахарозы (50 мМ Tris-HCl, pH 7,2, 50 мМ NaCl; от 60% до 20% сахарозы). Затем центрифугировали при 75000g в том же роторе в течение 45 мин, после чего опалесцирующую полосу фага собирали из толщи раствора и переносили в диализный мешок. Диализ проводили в 1л SM-буфера с 2 сменами буфера в течение 24 часов при 4°С и постоянном перемешивании. Диализованный препарат переносили в чистую пробирку и хранили при 4°С. Электронная микроскопия Сконцентрированные и очищенные препараты бактериофага изучали при помощи просвечивающей электронной микроскопии, пробы подготавливали адсорбцией на коллодийных пленках и негативным контрастированием 1% уранилацетатом в метаноле. Эта часть работы 24

выполнялась как на базе нашей лаборатории, так и в ресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ. Получение лизогенов по бактериофагу ϕ24B Лизогены получали в соответствии со специальной методикой (James et al., 2001). Жидкую бактериальную культуру инкубировали в LB c 10 мМ CaCl2 при стандартных параметрах до OD600=0,5, после чего добавляли 50 мкл препарата бактериофага титра ~1х107 БОЕ/мл и раствор MgSO4 до конечной концентрации 10 мМ. Смесь инкубировали на 2 часа, после чего высевали аликвоту объемом 100 мкл на чашку с LA и хлорамфениколом концентрации 34 мкг/мл для селекции лизогенов. В параллель высевали фаговый лизат и штаммы, не подверженные лизогенизации для исключения ложных данных в эксперименте, связанных с наличием исходно устойчивому к антибиотику штамма или с примесью лизогенов в фаговом лизате. Выросшие бактериальные колонии пересевали. Выделение ЛПС и их анализ Клетки ночной культуры обрабатывали протеиназой К в присутствии SDS, проводили электрофорез в ПААГ и окрашивали гель серебром в соответствии с ранее разработанной в нашей лаборатории методикой (Kulikov et al., 2019). Определение чувствительности лизогенов к другим фагам На газон нелизогенных и лизогенных по ϕ24B клеток каплями по 10 мкл наносили лизаты некоторых T5-подобных фагов (DT57½, 7c, ABF) титром ~108 БОЕ/мл. После инкубации чашки проверяли на наличие зон лизиса. 25

Результаты и их обсуждение Структура генов g56, g61-59 В геноме ϕ24B были аннотированы три гена структурных белков, сходных с белками адсорбции бактериофагов. Это гены g56 и g61, а также ген g59, значительно перекрывающийся с g61. Потенциальные функции gp56 неизвестны. Белок gp56 длиной 422 а.о. и массой примерно 45,5 кДа по данным анализа с помощью алгоритма HHPred имеет структурные домены, сходные с фаговыми адгезинами. В частности, в его С-концевой области по структуре предсказывается домен, сходный с белком gp26 (4LIN) фага P22, формирующим центральную фибриллу хвоста этого подовируса (рис. 9). Рис. 9. Трёхмерная структура осевой фибриллы (хвостовой иглы) бактериофага P22 — тримера белка gp26 (4LIN). Рисунок выполнен 10.2210/pdb4LIN/pdb 26 в программе UCSF Chimera. DOI:

Функция белка хвостовых шипов gp61 остается также пока остается невыясненной. Этот полипептид имеет длину 595 а.о. и массу около 64 кДа. При этом ген значительно перекрывается с ORF59 (рис. 10), лишенной явно обнаруживаемой последовательности Шайн-Дальгарно. При анализе последовательности нуклеотидов в районе старт-кодона g59 обнаружены два потенциальных мотива программируемого сдвига рамки считывания (programmed ribosomal frameshifting, PF). Эти последовательности сходны с PF, которые присутствуют в генах шаперонов хвоста (т. н. G/GT гены) хвостатых бактериофагов семейств Myoviridae и Siphoviridae (Xu et al., 2004). PF-элемент вызывает с некоторой вероятностью “соскальзывание” транслирующей рибосомы на один или два нуклеотида назад или вперед, переключая рамку считывания РНК матрицы. PF позволяет создавать на стадии трансляции альтернативные варианты белка, отличающиеся С-концевой областью. Возможно, фаг ϕ24B может экспрессировать два варианта хвостовых шипов: “нормальный” продукт гена g61 и слитый белок gp61-59. Выполненный в нашей лаборатории биоинформатический анализ профагов, родственных ϕ24B, показал, что большинство профагов имеют организацию локуса g61-59, сходную с фагом ϕ24B. Однако у некоторых профагов имеется слитая рамка считывания 61-59, причем стыки последовательностей совпадают с одним или другим предсказанным нами PF элементом. Интересно, что профаги с локусом типа ϕ24B преобладали у О157 штаммов E. coli, тогда как слитой ген чаще обнаруживался в штаммах с другими серотипами О-антигена. В связи с этим мы поставили эксперимент по проверке функциональности предполагаемого сайта программируемого последовательности g61-59 фага ϕ24B. 27 фреймшифтинга для

Рис. 10. А — последовательность потенциального програмируеммого сдвига открытой рамки считывания; Б — аналогичная последовательность в гене G/GT белка бактериофага Sfi19 (Xu et al., 2004); В — схематичное изображение генов g61 и g59 бактериофага ϕ24B; Г — схематическое изображение двух форм белков, образующихся без фреймшифтинга (gр61) и с ним (gр61-59) В рамках данной работы мы получили плазмидные экспрессионные конструкции pGEXg56 и pGEXg61-59 (рис. 11). 28

Рис. 11. Генетические карты векторов pGEXg56 (слева) и pGEXg61-59 (справа). Рисунок получен в программе SnapGene Анализ белка gp56 Мы обнаружили методом электрофореза в ПААГ продукцию белка gp56 (рис. 12), однако получить gp56 в растворимом виде не удалось. Возможно, это связано с агрегацией белка, вызванной взаимодействием GST-доменов и/или гидрофобным 63-аминокислотным N-концом белка. Гидрофобный N-концевой участок белка, вероятно, нужен для белокбелкового гидрофобного взаимодействия с другими белками хвостовой структуры при сборке фаговой частицы. 29

Рис. 12. Картина электрофореза тотального белка штаммов, не синтезирующих и синтезирующих gp56 Анализ белка gp61/gp61-59 После аффинной трансформантов чистки pGEXg61-59, смеси на 30 белков, выделенных глутатион-сефарозе мы из провели

повторный анализ методом вертикального электрофореза в ПААГ, подтвердивший предположение о наличии в образцах рекомбинантного белка с молекулярной массой около 100 кДа (рис. 13), что примерно соответствует теоретически предсказанному GST-gp61. Рис. 13. Картина электрофореза продуктов экспрессии трансформантов по векторам pGEM, pGEX и pGEXg61-59 (“61-59”); total – тотальный белок, prec – фракция осадка, super – осветленный лизат, gsep – белок, очищенный на глутатион-сефарозе, красным цветом обведены места нахождения рекомбинантного белка Исходя из данных электрофореза, можно заключить, что большая часть белка была во фракции осадка, хотя мы смогли получить очищенный белок из осветленного лизата. Анализ методом MALDI показал, что 31

выделенный белок представляет собой укороченную форму — gp61. Однако результаты дальнейшей очистки белка с использованием 6His-тага, а не GST, говорят о возможном наличии gp61-59 в препарате выделенного белка (рис. 14). В этом случае экспрессию проводили в большем объеме в целях получения количества белка, достаточного для его обнаружения. Рис. 14. Разделение белков методом электрофореза для штаммов, не экспрессирующих (Ctrl) и экспрессирующих (61-59) g61-59; total – тотальный белок, eluate – очистка белка на Niаффинной колонке Таким образом, нам удалось обнаружить белок с молекулярной массой более 100 кДа, по всей видимости, обладающий гексагистидиновым тагом, что соответствует рекомбинантному gp61-59. Это дает новые основания полагать, что между рамками генов g61 и g59 присутствует программируемый сдвиг рамки считывания, осуществляемый in vitro с 32

малой вероятностью. Низкая вероятность фреймшифтинга присуща и последовательностям G/GT генов некоторых бактериофагов (Xu et al., 2004), поэтому подобный феномен при трансляции участка 61-59 у бактериофага ϕ24B может иметь место. Получение фаговых лизатов и определение титра бактериофага ϕ24B и его мутантов Путем индукции профага митомицином С из лизогенных штаммов MG1655:24B, MG1655:24BΔorf61, получить осветленные лизаты MG1655:24BΔorf63 нам удалось ϕ24B, ϕ24BΔorf61 и ϕ24BΔorf63 с значениями титра 8,3x108 БОЕ/мл, 8,5x108 БОЕ/мл, 6x108 БОЕ/мл соответственно. Интересно, что при индукции с стандартной аэрацией (200 мл культуры в 1 л колбе при качании) видимого лизиса не произошло, а свободная от клеток фракция содержала фаг с титром ~1x105 БОЕ/мл. В то же время индукция со слабой аэрацией (200 мл культуры в 250 мл колбе при качании) дала желаемый лизис клеток, и полученный лизат имел титр 8,3x108 БОЕ/мл. Лизат, полученный индукцией профага λ из лизогена MG1655 (λ) в условиях повышенной аэрации имел титр ~1x109 БОЕ/мл. Это может говорить о пониженной аэрации как о важном специфичном для профага 24B стресс-факторе, необходимом для получения нормальных лизатов бактериофага ϕ24B. При попытках определить титр бактериофага обычным способом бляшек либо не было видно, либо они были плохо различимы. Поэтому мы воспользовались описанной выше методикой коллег из Гданьского университета (Польша), которая оказалась эффективна для исследуемого бактериофага. Видимо, это связано с тем, что происходит диффузия малых 33

количеств антибиотика из “нижнего” агара в “верхний”, что замедляет рост бактерий, предотвращая быстрое зарастание всей площади. Также это создает условия стресса, при которых вероятность ухода бактериофага в лизогенный цикл ниже. Титрование ϕ24B, ϕ24BΔorf61, ϕ24BΔorf63 на разных штаммах Для определения спектра хозяев ϕ24B мы титровали этого фага и мутантов по orf61 и orf63 на разных бактериальных штаммах (табл. 2). Мы подтвердили, что MC1061 BamAΔ действительно устойчив к бактериофагу. Видимо, ϕ24B, подобно многим другим фагам, способен узнавать лишь небольшую аминокислотную последовательность в составе петель, не включенных в регулярные структуры белка внешней мембраны. Поэтому замена небольшой последовательности в белке BamA, не нарушающая его функцию, может привести к приобретению устойчивости к этому вирусу. Следующее, на что стоит обратить внимание — это то, что значение полученных титров лизатов для ϕ24B и его мутантов лежит в пределах одного порядка. Хотя ϕ24BΔorf61 обладает необычной кинетикой адсорбции (Dydecka et al., 2018), а ϕ24BΔorf63 имеет более высокую эффективность лизогенизации (Dydecka et al., 2017), число БОЕ/мл при титровании в параллели на одной культуре отличается меньше, чем на порядок. 34

ϕ24B ϕ24BΔorf61 ϕ24BΔorf63 8x108 5x108 7,3x108 — — — MC1061 BamAΔRID 2,5x107 3,7x107 2,5x107 MG1655 8,3x108 8,5x108 6x108 MG1655:24B — — — MG1655:24BΔorf61 — — — MG1655:24BΔorf63 — — — 2,5x108 8x108 4,2x108 6x108 7x108 5,5x108 MC1061 MC1061 BamAΔ MG1655 (λ) C-600L Табл. 2. Значение титра (БОЕ/мл) ϕ24B и его мутантов на разных штаммах. Прочерком обозначены штаммы, устойчивые к данному фагу На комплементированном штамме MC1061 BamAΔRID титр определяется на один-полтора порядка ниже, чем на других культурах, так как у клеток этого штамма лишь часть молекул белка BamA могут распознаваться бактериофагом, поскольку в клетках экспрессируется как мутантный BamA, так и нормальный, закодированный в комплементирующей плазмиде. Также мы подтвердили, что лизогены по ϕ24B и его мутантам устойчивы к этим фагам, чего нельзя сказать о лизогене MG1655 (λ), профаг которого, несмотря на генетическое родство, не дает устойчивости лизогенов к исследуемым вирусам. Воздействие CsCl на биологический титр ϕ24B Производя высокоскоростное центрифугирование в градиенте хлорида цезия мы обнаружили, что титр очищенного таким способом лизата оказывается на несколько порядков ниже исходного титра 35

сконцентрированного ультрацентрифугированием фага (табл. 3). Видимо, высокая ионная сила раствора приводит к агрегации и инактивации вирусных частиц. ϕ24B ϕ24BΔorf61 ϕ24BΔorf63 Сконцентрированный лизат 6,2x1010 7,6x1010 4,8x1010 Сконцентрированный лизат, очищенный центрифугированием в градиенте CsCl 4x107 1x108 2,6x108 Табл. 3. Значения титра (БОЕ/мл) концентрированного лизата ϕ24B и его мутантов до и после очистки высокоскоростным центрифугированием в градиенте СsCl Для решения проблемы потери большого количества фага при высокоскоростном изопикническом центрифугировании мы производили его не в градиенте CsCl, а в градиенте сахарозы, которая имеет более высокую по сравнению с хлоридом цезия гидрофильность и биосовместимость. В результате такой очистки и последующего диализа нами были получены препараты с титром ~1x109. Морфология фаговых частиц Методом просвечивающей электронной микроскопии мы получили изображения вирусных частиц для ϕ24B и его мутантов. По данным электронной микроскопии объект нашего исследования представляет собой икосаэдрические частицы диаметром около 70 нм, с коротким хвостом (рис. 17), препарат вирионов ϕ24B содержал фибриллы непонятного клеточного происхождения, отчетливо видимые на фотографии (рис. 15). Ранее нашей лабораторией были сделаны ЭМ36

фотографии этого бактериофага, на которых также присутствовали подобные структуры (рис. 16). При исследовании мутантов подобных фибрилл не обнаружили (рис. 16, рис. 17). Возможно, ϕ24B образует прочные ассоциации с фибриллярными структурами клеточного происхождения. Этим можно объяснить более заметное понижение титра ϕ24B после очистки центрифугированием в градиенте CsCl по сравнению с мутантами, так как большая часть фага за счет прочного связывания с клеточными структурами в процессе очистки оказалась в грубом осадке. Рис. 15. Электронная микрофотография вирионов ϕ24B, ассоциированных с фибриллами 37

Рис. 16. Электронная микрофотография вирионов ϕ24B (темные круглые частицы примерно одного размера). Фаговые частицы, видимо, были соочищены с фибриллами неизвестной природы Рис. 17. Электронные микрофотографии вирионов ϕ24B 38

Рис. 18. Электронные микрофотографии вирионов ϕ24BΔorf61 (слева) и ϕ24BΔorf63 (справа). На правом изображении можно увидеть форму хвостовой структуры фага. Получение лизогенов по ϕ24B и изучение их свойств Для штамма А13 эффективность лизогенизации составила примерно 1,5х10-5 КОЕ/БОЕ, в то время как для штамма f4 она равна 2,4х10 -3 КОЕ/БОЕ, что, вероятно, связано с отсутствием О-антигена у исходной культуры f4 (рис. 19). Для используемых штаммов и лизогенов, полученных на их основе, произвели ПЦР-скрининг на наличие гена g56 (рис. 20), который подтвердил наличие профага в исследуемых клетках. Используя метод электрофореза ЛПС в ПААГ, производили исследование ЛПС лизогенных клонов (рис. 19), которое показало, что полученные лизогены являются мутантами с отсутствующим или сильно редуцированным Оантигеном (т. н. rough-мутанты), поскольку именно мутанты с нарушенным 39

синтезом О-антигена чувствительны к фагу ввиду незащищенного липополисахаридным слоем конечного рецептора (белка BamA). Рис. 19. Профиль ЛПС штаммов f4, А13 и разных клонов (1-3) лизогенов (mutf4, mutA13). Последние по совместительству являются мутантами с нарушенной системой синтеза нормального О-антигена Рис. 20. Картина электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле, отражающая ПЦРскрининг различных штаммов на наличие профага (гена g56). Левая дорожка — 1Kb ДНК-маркер 40

Для полученных лизогенных штаммов А13 по ϕ24B определили чувствительность к некоторым T5-подобным фагам (DT57½, 7c, ABF), узнающим непосредственно конечный рецептор на поверхности клетки. Обычно адсорбция этих фагов может быть затруднена наличием на поверхности клетки липополисахаридного барьера. Нами было показано, что в результате мутации в системе синтеза О-антигена клетки, отобранные с помощью лизогенизации бактериофагом ϕ24B, оказались чувствительны к ряду фагов, ранее не способных инфицировать штаммы такого типа (рис. 21). Рис. 21. Наличие зон лизиса после воздействия бактериофагами на газон лизогена A13:24B (справа) и отсутствие подобной картины на обычном штамме А13 (слева). 41

Заключение В результате выполнения данной работы мы получили новые данные о биологии бактериофага ϕ24B. Нами были адсорбционного изучены аппарата особенности данного потенциальных бактериофага. В белков частности, биоинформатическим анализом в структуре потенциального белка осевой фибриллы бактериофага была выявлена гомология с белком хвостовой иглы фага P22 gp26. Также удалось получить рекомбинантные белки gp56 и gp61-59. Более того, исследования, касающиеся последнего, говорят в пользу гипотезы о наличии программируемого сдвига рамки считывания в области генов g61 и g59. В ходе работы мы выяснили, что центрифугирование препарата исследуемого вируса отрицательно сказывается на значение его титра, что, вероятно, связано с агрегацией фага в условиях повышенной ионной силы. Нами было показано, что ϕ24B, полученный индукцией лизогена, плохо отделим от соочищающихся фибрилл, чего нельзя сказать о его делеционных мутантах ϕ24BΔorf61 и ϕ24BΔorf63. Это означает, что продукты экспрессии orf61 и orf63 оказывают влияние на фенотип вируса. При получении лизогенов по ϕ24B мы обнаружили, что штаммы, лишенные нормального О-антигена, имеют значительно большую эффективность лизогенизации фагом ϕ24B, чем штаммы с развитым Оантигеном. Получить лизогенов из культуры клеток с полноценным Оантигеном удалось лишь благодаря небольшому количеству спонтанных rough-мутантов в этой культуре. Подобное условие лизогенизации связано с наличием у О-антигена функции конечного рецептора. 42 неспецифического экранирования

Выводы  Исследование потенциальных рецептор-распознающих белков показало, что структура gp56 ϕ24B сходна со структурой gp26 фага P22, что говорит о нем как о главном кандидате на роль белка осевой фибриллы ϕ24B.  Мы показали, что в области гена преполагаемого белка хвостовых шипов gp61 с низкой вероятностью in vitro осуществляется программируемый рибосомальный сдвиг рамки считывания. В результате фреймшифтинга может образовываться альтернативная более длинная форма полипептида — gp61-59.  Наши результаты указывают на то, что лизогены по ϕ24B образуются из спонтанных rough-мутантов. Таким образом, по отношению к Оантигену широкий спектр лизогении является кажущимся.  Нами показано, что классические методы очистки бактериофагов путём изопикнического центрифугирования в градиентах плотности (CsCl) и вязкости (сахароза) не приводят к получению высокоочищенных препаратов ϕ24B. Отмечена высокая способность ϕ24B связываться с фибриллярными происхождения. 43 структурами клеточного

Благодарности Мы благодарим Sylvia Bloch из Гданьского Университета, Польша, и Heather Allison из Ливерпульского университета, Великобритания, за предоставление бактериальных штаммов для нашего исследования. Также мы благодарим Дарью Матюшкину из лаборатории протеомного анализа НИИ ФХМ за исследование полученного нами белка gp61 методом MALDI. Отдельную благодарность выражаем и.о. директора ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ Волкову Кириллу Владимировичу за предоставление возможности исследования ϕ24B методом просвечивающей электронной микроскопии, а также Константину Бойко за помощь с электронной микроскопией. Благодарность выражается коллективу лаборатории вирусов микроорганизмов ФИЦ «Биотехнологии» РАН (особенно А. К. Голомидовой, Е. Е. Куликову и П. А. Иванову) за всестороннюю помощь при выполнении этой работы, обсуждение результатов и манускрипта. 44

Список литературы 1. Каттер Э. Бактериофаги: биология и практическое применение / Под ред. Элизабет Каттер, Александра Сулаквелидзе // Пер. с англ. коллектив переводчиков; науч. ред. А.В. Летаров. – М.: Научный мир., 2012. – 640 с. – С. 590-591. 2. Askora A., Kawasaki T., Fujie M., Yamada T. Lysogenic Conversion of the Phytopathogen Ralstonia solanacearum by the P2virus ϕRSY1 //Frontiers in Microbiology. – 2017. – T. 8. – 2212. 3. Baines D., Lee B., McAllister T. Heterogeneity in enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 to Escherichia coli O157:H7 fecal shedding colonization of in cattle the small and is related large intestine. //Canadian Journal of Microbiology. – 2008. – T. 54. – №. 12. – С. 984-995. 4. Barksdale L. Lysogenic Conversions in Bacteria. //Bacteriological Reviews. – 1959. – Т. 23. – №. 4. – С. 202-212. 5. Brüssow H., Canchaya C., Hardt W.D. Phages and the evolution of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion. //Microbiology and molecular biology reviews. – 2004. – T. 68. – №. 3. – C. 560-602. 6. Cuervo A., Pulido-Cid M., Chagoyen M., Arranz R., González-García V.A., Garcia-Doval C., Castón J.R., Valpuesta J.M., van Raaij M.J., MartínBenito J., Carrascosa J.L. Structural characterization of the bacteriophage T7 tail machinery. //The Journal of Bilogical Chemistry. - 2013. - T. 288. - №. 36. - С. 26290-26299. 7. Donnenberg M.S., Whittam T.S. Pathogenesis and evolution of virulence in enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli. //The Journal of Clinical Investigation. – 2001. – T. 107. – №. 5. – С. 539-548. 45

8. Duong F., Eichler J., Price A., Leonard M.R., Wickner W. Biogenesis of the gram-negative bacterial envelope. //Cell. – T. 91 – №. 5. – С. 567-573. 9. Dydecka A., Bloch S., Rizvi A., Perez S., Nejman-Falenczyk B., Topka G., Gasior T., Necel A., Wegrzyn G., Donaldson L.W., Wegrzyn A. Bad Phages in Good Bacteria: Role of the Mysterious orf63 of λ and Shiga Toxin-Converting Φ24B Bacteriophages. //Frontiers in Microbiology – 2017. – T. 8. – C. 1618. 10. Dydecka A., Nejman-Faleńczyk B., Bloch S., Topka G., Necel A., Donaldson L.W., Węgrzyn G., Węgrzyn A. Roles of orf60a and orf61 in Development of Bacteriophages λ and Φ24B. //Viruses. – 2018. – T. 10. – №. 10. – E553. 11. Eklund M.W., Poysky F.T., Reed S.M., Smith C.A. Bacteriophage and the toxigenicity of Clostridium botulinum type C. //Science.– 1971. – T. 172 – №. 3982 – С. 480-482. 12. Emiola A., Andrews S.S., Heller C., George J. Crosstalk between the lipopolysaccharide and phospholipid pathways during outer membrane biogenesis in Escherichia coli. //Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. – 2016. – T. 113. – №. 11. – С. 3108-3113. 13. Feiner R., Argov T., Rabinovich L., Sigal N., Borovok I., Herskovits A.A. A new perspective on lysogeny: prophages as active regulatory switches of bacteria. //Nature Reviews. Microbiology. – 2015. – T. 13. – №. 10. – С. 641650. 14. Flayhan A., Wien F., Paternostre M., Boulanger P., Breyton C. New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5, and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA. //Biochimie. – T. 94. – №. 9. – С. 1982-1989. 46

15. Fortier L.C., Sekulovic O. Importance of prophages to evolution and virulence of bacterial pathogens. //Virulence. – 2013. – T. 4. – №. 5. – С. 354365. 16. Freeman V.J., Studies on the virulence of bacteriophage-infected strains of Corynebacterium diphtheriae. //Journal of Bacteriology. – 1951. – T. 61. – №. 6. – С. 675-688. 17. Geue L., Menge C., Eichhorn I., Semmler T., Wieler L.H., Pickard D., Berens C., Barth S.A. Evidence for Contemporary Switching of the O-Antigen Gene Cluster between Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Strains Colonizing Cattle. //Frontiers in Microbiology. – 2017. – T. 8. – 424. 18. Guerrero-Ferreira R.C., Viollier P.H., Ely B., Poindexter J.S., Georgieva M., Jensen G.J., Wright E.R. Alternative mechanism for bacteriophage adsorption to the motile bacterium Caulobacter crescentus. //Proceedings of the National Academy of Sciences. – T. 108. – №. 24. – С. 9963-9968. 19. Harrison E., Brockhurst M.A. Ecological and Evolutionary Benefits of Temperate Phage: What Does or Doesn't Kill You Makes You Stronger. //BioEssays. – 2017. – T. 39. – №. 12. 20. Hatano M. Effect of iron concentration in the medium on phage and toxin production in a lysogenic, virulent Corynebacterium diphtheriae. //Journal of Bacteriology. – 1956 – T. 71. – №. 1. – С. 121-122. 21. Holloway B.W., Cooper G.N. Lysogenic conversion in Pseudomonas aeruginosa. //Journal of Bacteriology. – 1962. – №. 84 – С. 1321-1324. 22. Holt G.S., Lodge J.K., McCarthy A.J., Graham A.K., Young G., Bridge S.H., Brown A.K., Veses-Garcia M., Lanyon C.V., Sails A., Allison H.E., Smith D.L. Shigatoxin encoding Baceriophage ϕ24B modulates bacterial metabolism to raise antimicrobial tlerance. – Scientific Reports. – 2017. T. 7. – 40424. 47

23. Ibarra C., Amaral M.M., Palermo M.S. Advances in pathogenesis and therapy of hemolytic uremic syndrome caused by Shiga toxin-2. //IUBMB Life. – 2013. – T. 65. – №. 10. – С. 827-835. 24. James C.E., Stanley K.N., Allison H.E., Flint H.J., Stewart C.S., Sharp RJ, Saunders J.R., McCarthy A.J. Lytic and lysogenic infection of diverse Escherichia coli and Shigella strains with a verocytotoxigenic bacteriophage. //Applied and Environmental Microbiology. – 2001. – T. 67. – №. 9. – С. 4335-4337. 25. Kulikov E.E., Golomidova A.K., Prokhorov N.S., Ivanov P.A., Letarov A.V. - High-throughput LPS profiling as a tool for revealing of bacteriophage infection strategies. //Scientific Reports. – 2019. – T. 9. – №. 1. – 2958. 26. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. – 1970. – T. 227. – №. 5259. – С. 680-685. 27. Langenscheid J., Killmann H., Braun V. A FhuA mutant of Esc herichia coli is infected by phage T1-independent of TonB. //FEMS Microbiology Letters. – 2004. – T. 234. – №. 1. – С. 133-137. 28. Letarov A.V., Golomidova A.K., Tarasyan K.K. Ecological basis of rational phage therapy. //Acta naturae. – 2010. – T. 2. – №. 1. – С. 60-72. 29. Letarov A.V., Kulikov E.E. Adsorption of Bacteriophages on Bacterial Cells. //Biochemistry (Mocsow). – 2017. – T. 82. – №. 13. – С. 1632-1658. 30. McCutcheon J.G., Peters D.L., Dennis J.J. Identification and Characterization of Type IV Pili as the Cellular Receptor of Broad Host Range Stenotrophomonas maltophilia Bacteriophages DLP1 and DLP2. //Viruses. – T. 10 – №. 6 – C. 338. 31. McNulty R., Cardone G., Gilcrease E.B., Baker T.S., Casjens S.R., Johnson J.E. Cryo-EM Elucidation of the Structure of Bacteriophage P22 48

Virions after Genome Release. //Biophysical Journal. - 2018. - T. 114. - №. 6. С. 1295-1301. 32. Młynarczyk G, Młynarczyk A, Zabicka D, Jeljaszewicz J.Lysogenic conversion as a factor influencing the vancomycin tolerance phenomenon in Staphylococcus aureus. //The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. – 1997. – T. 40. – №. 1. – С. 136-137. 33. Nakayama K., Kanaya S., Ohnishi M., Terawaki Y., Hayashi T. Thecomplete nucleotide sequence of CTX, a cytotoxin-converting phage of Pseudomonas aeruginosa: implications for phage evolution and horizontal gene transfer via bacteriophages. //Molecular Microblogy. – 1999. – T. 31 – №. 2. – С. 399-419. 34. Olia A.S., Al-Bassam J., Winn-Stapley D.A., Joss L., Casjens S.R., Cingolani G. Binding-induced stabilization and assembly of the phage P22 tail accessory factor gp4. //Journal of Molecular Biology. — 2006. — T. 363. — №. 2. — С. 558-576. 35. Parent K. N., Erb M. L., Cardone G., Nguyen K., Gilcrease E.B., Porcek N.B., Pogliano J., Baker T.S., Casjens S.R. OmpA and OmpC are critical host factors for bacteriophage Sf6 entry in Shigella. //Molecular microbiolohgy. – 2014. – T. 92. – №. 1. – С. 47-60. 36. Pickard D., Toribio A.L., Petty N.K., van Tonder A., Yu L., Goulding D., Barrell B., Rance R., Harris D., Wetter M., Wain J., Choudhary J., Thomson N., Dougan G. A conserved acetyl esterase domain targets diverse bacteriophages to the Vi capsular receptor of Salmonella enterica serovar Typhi. //Journal of Bacteriology. — 2010. — T. 192. — №. 21. — С. 5746-5754. 37. Prokhorov N.S., Riccio C., Zdorovenko E.L., Shneider M.M., Browning C., Knirel Y.A., Leiman P.G., Letarov 49 A.V. Function of

bacteriophage G7C esterase tailspike in host cell adsorption. //Molecular Microbiology. – 2017. – T. 105. – №. 3. – С. 382-398. 38. Pyra A., Brzozowska E., Pawlik K., Gamian A., Dauter M., Dauter Z. Tail tubular protein A: a dual-function tail protein of Klebsiella pneumoniae bacteriophage KP32. //Scientific Reports. – 2017. – T. 7. – №. 1. – С. 2223. 39. Rollauer S.E., Sooreshjani M.A., Noinaj N., Buchanan S.K. Outer membrane protein biogenesis in Gram-negative bacteria. //Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. – 2015. – T. 370. – №. 1679. 40. Schultz K.M., Lundquist T.J., Klug C.S. Lipopolysaccharide binding to the periplasmic protein LptA. //Protein Science. – T. 26. – №. 8. – С. 1517-1523. 41. Smith D.L., James C.E., Sergeant M.J., Yaxian Y., Saunders J.R., McCarthy A.J., Allison H.E. Short-tailed stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among enterobacteria. //Journal of Bacteriology. – 2007. – T. 189. – №. 20. – С. 7223-7233. 42. Sváb D., Bálint B., Maróti G., Tóth I. A novel transducible chimeric phage from Escherichia coli O157:H7 Sakai strain encoding Stx1 production. – Infection, Genetics and Evolution //Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases. – 2015. – №. 29 – С. 42-47. 43. Tomás J.M., Jofre J.T. Lipopolysaccharide-specific bacteriophage for Klebsiella pneumoniae C3. //Journal of Bacteriology. – 1985. – Т. 162. – №. 3. – С. 1276-1279. 44. Trojet S.N., Caumont-Sarcos A., Perrody E., Comeau A.M., Krisch H.M. The gp38 adhesins of the T4 superfamily: a complex modular determinant of the phage's host specificity. //Genome Biology and Evolution. – 2011. – №. 3. – С. 674-686. 50

45. Tu Q., Yin J., Fu J., Herrmann J., Li Y., Yin Y., Stewart A.F., Müller R., Zhang Y. Room temperature electrocompetent bacterial cells improve DNA transformation and recombineering efficiency. //Scientific Reports. – 2016. – T. 6. – 24648. 46. Uematsu S., Akira S. Toll-Like receptors (TLRs) and their ligands. //Handbook of Experimental Pharmacology. – 2008. – №. 183. – С. 1-20. 47. Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. - Science. 1996 Jun 28;272(5270):1910-4. 48. Wollin R., Stocker B.A., Lindberg A.A. Lysogenic conversion of Salmonella typhimurium bacteriophages A3 and A4 consists of O-acetylation of rhamnose of the repeating unit of the O-antigenic polysaccharide chain. //Journal of Bacteriology. – 1987. – T. 169. – №. 3. – С. 1003-1009. 49. Xu J., Hendrix R.W., Duda R.L. Conserved translational frameshift in dsDNA bacteriophage tail assembly genes. //Molecular cell. – 2004. – Т. 16. – №. 1. – С. 11-21. 50. Yoshida T., Fukada M., Koide N., Ikeda H., Sugiyama T., Kato Y., Ishikawa N., Yokochi T. Primary cultures of human endothelial cells are susceptible to low doses of Shiga toxins and undergo apoptosis. //The Journal of Infectious Diseases. – 1999. – T. 180. – №. 6. – С. 2048-2052. 51. Zha Z., Li C., Li W., Ye Z., Pan J. LptD is a promising vaccine antigen and potential immunotherapeutic target for protection against Vibrio species infection. //Scientific Reports. – 2016. – T. 6 – C. 38577. 51

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

6315.12

Игорь Маслеников

Проныра, озорник, Любитель книг, Ловкач, игрок, Жизнь между строк. И потому Открыт ему Незримый путь В любую суть. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Подсыпать в душу яд Всегда он рад Всего за час Прочтёт он вас. Он волен взять И поменять Строку и с ней Смысл темы всей.Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Открыт роман Читатель пьян Разлив вино - Шагнул в окно. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения.

6315.12

Игорь Маслеников

Танец Злобного Гения КиШ

6315.12

Игорь Маслеников

А теперь я скину тексты своих любимых песен для этого:)

6315.12

Игорь Маслеников

и хорошего настроения

6315.12

Игорь Маслеников

удачи