Биологически активные соединения природно-трансгенных растений рода Linaria

Маргарита Рогачёва

Биологически активные соединения природно-трансгенных растений рода Linaria

В данной выпускной квалификационной работе охарактеризованы особенности природно-трансгенных растений по сравнению с дикими видами. Проанализирована роль клТ-ДНК в эволюции и ее возможные функции. Обсуждается роль клТ-ДНК в контроле морфогенетических реакций растений, ее участие в регуляции процессов, связанных с контролем взаимодействия растений с микроорганизмами. В ходе работы оценен метаболитный профиль растений рода Linaria, контрастных по содержанию T-ДНК. Выявлено 4 мажорных метаболита, представляющих собой 2 группы соединений - иридоиды и флавоноиды: антирринозид, линарин, антиррид, ацетопекталинарин. Подобрана система для разделения иридоидных гликозидов с помощью тонкослойной хроматографии и с помощью газовой хроматографии с масс-детекцией на приборе маэстро Agilent Technologies 7820A (GC-system) подтверждено, что это иридоиды. Так же в ходе работы установлено, что экстракты растений рода Linaria обладают антибактериальной, фунгицидной, инсектицидной и антирадикальной активностями. Структура работы представлена введением, тремя главами, заключением, списком литературы. В выпускной квалификационной работе использовано 2 таблицы, 27 рисунков, 87 источников литературы. Общее количество страниц выпускной квалификационной работы – 52.

Биотехнология

Дипломы

Вуз: Ленинградский государственный университет имени А.С. Пушкина (АОУ ВПО «ЛГУ им. АСПушкина»)

ID: 5b30c0397966e104d82b1d04

UUID: 4ada27f0-5a8e-0136-47d1-525400005860

Язык: Русский

Опубликовано: больше 6 лет назад

Просмотры: 183

14.56

Маргарита Рогачёва

Ленинградский государственный университет имени А.С. Пушкина (АОУ ВПО «ЛГУ им. АСПушкина»)

Комментировать 2

Рецензировать 0

Скачать - 1,6 МБ

Поделиться работой

ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ «ЛЕНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени А.С. ПУШКИНА» Кафедра естествознания и географии Представлена для защиты в ГЭК Зав. кафедрой к.б.н., доцент Н.И. Силина «____»_____________2018 г. дата ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА по теме: Биологически активные соединения природно-трансгенных растений рода Linaria БАКАЛАВРСКАЯ РАБОТА Студентки 4 курса очной формы обучения направления 19.03.01 «Биотехнология» профиль «Молекулярная биология» Научный руководитель кандидат биол. наук, доцент Защищена на ГИА Председатель ГЭК д-р биол. наук, профессор ______________ (подпись) ______________ (подпись) «____» __________2018 г. Рогачевой Маргариты Сергеевны Сокорнова Софья Валерьевна (дата) с оценкой______________ ______________ Архипов (подпись) Михаил Вадимович Санкт - Петербург 2018 г.

СОДЕРЖАНИЕ Введение 4 Глава 1. Биологически активные соединения растений 5 1.1. Природно-трансгенные виды 5 1.2. Генетическая информация Ti плазиды 6 1.3. Род Linaria – распространение видов 10 1.4. Биологически активные соединения рода Linaria 14 1.5. Применение биологически активных соединений 17 1.6. Биологические активности соединений 19 Глава 2. Материалы и методы исследований 26 2.1. Материалы исследований 26 2.1.1. Объекты исследований 26 2.1.2. Питательные среды 28 2.1.3. Подготовка образцов для хроматографии 29 2.1.4. Проверка на фунгицидную и антибиотическую активность 29 2.1.5. Проверка соединений на инсектицидную активность 30 2.2. Методы исследований 30 2.2.1. Спиртовая экстракция 31 2.2.2. Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) 31 2.2.3. Метод дисков на культурах 31 2.2.4. Спектрофотометрический метод 32 Глава 3. Результаты и обсуждение 33 Заключение 42 Список использованных источников 44 2

Введение Трансгенные растения являются одним из наиболее распространенных объектов исследований в биотехнологии, генетике и селекции растений, а также одной из наиболее популярных биологических тем, обсуждаемых в средствах массовой информации. Это вызвано, с одной стороны, широкими перспективами, которые открывают трансгенные технологии, с другой стороны – опасениями, связанными с возможными последствиями возделывания генетически модифицированных организмов (ГМО). В настоящее время по данным ISAAA (The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications) зарегистрировано более 400 коммерческих линий трансгенных растений [85]. Из них более 300 было получено при помощи агробактериальной трансформации или посредством гибридизации форм, полученных с помощью данного метода [11]. Таким образом, данный подход является на сегодняшний день наиболее распространенным для получения трансгенных линий, стабильно наследующих чужеродную ДНК. В основе метода лежит способность агробактерий переносить фрагмент ДНК своей плазмиды, называемый клТ-ДНК, и интегрировать его в хромосому растения хозяина [25]. Он наследуется в ряду клеточных делений [65]. Путем включения в последовательность клТ-ДНК генов, представляющих интерес для исследователя, трансформации такими конструкциями клеток растений и индукции регенерации побегов из трансгенных клеток получено большинство известных ныне трансгенных линий [76]. Вместе с тем были обнаружены примеры появления трансгенных растений в природе. Предковые формы таких растений были трансформированы в природных условиях и не только смогли выжить после трансформации, но и дать начало новым видам, в геномах которых стабильно из поколения в поколение передавалась Т-ДНК, которая получила название 3

клеточной (клТ-ДНК) [86]. Трансгенные формы на сегодняшний день выявлены в пределах родов Nicotiana, Ipomоea, Linaria [23, 34, 51, 56, 57, 79]. Актуальность данной темы заключается в том, что вторичные метаболиты, как известно, не только играют важную роль в адаптации растений к условиям окружающей среды, но и являются одним из основных источников фармацевтически активных препаратов [3, 66]. Так же изучение природно-трансгенных растений может способствовать пониманию функций и эволюционной роли генов клТ-ДНК. Целью дипломной работы являлся анализ мажорных вторичных метаболитов растений рода Linaria и оценка их биологической активности. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Оценить метаболитный профиль растений рода Linaria, контрастных по содержанию T-ДНК; 2. Провести анализ грубых экстрактов на фунгицидную активность; 3. Установить обладают ли экстракты антирадикальной активностью; 4. Проанализировать фракции на инсектицидную активность; 5. Проанализировать фракции на антибиотическую (антибактериальную) активность. Данная выпускная квалификационная работа состоит из 3 глав. В первой главе содержится анализ научной литературы по освещаемой теме, во второй – материалы и методы проведенного исследования, в третьей главе представлены результаты исследования. Объект исследования - растения рода Linaria. Предмет исследования – выделенные из вышеуказанных растений вторичные метаболиты, обладающие биологической активностью. 4

Глава 1. Биологически активные соединения растений 1.1. Природно-трансгенные виды Природно-трансгенные растения представляют собой виды, которые несколько миллионов лет тому назад были подвергнуты агробактериальной трансформации и сохранили в своих геномах последовательности, гомологичные агробактериальным, получившие название клеточной ДНК (клТДНК). Тысячелетиями растения передают ее в вертикальном ряду поколений. На сегодняшний день природно-трансгенные растения описаны в пределах трех родов: Nicotiana, Ipomoea, Linaria, относящихся к трем различным семействам: Solanaceae, Convolvulaceae и Plantaginaceae, соответственно. Семейства Solanaceae и Convolvulaceae относятся к одному порядку − Solanales, в то время как Plantaginaceae относится к порядку Lamiales. Оба эти порядка относятся к одному надпорядку − Ламииды (Lamiids), подклассу Астериды (Asterids) (рисунок 1) [17]. Рисунок 1.Филогенетические связи порядков цветковых растений подкласса Asterids Овалом выделены порядки, в которых обнаружены природно-трансгенные растения [11]. 5

Таким образом, с филогенетической точки зрения порядки, в которых выявлены Т-ДНК-содержащие виды, достаточно близки. В 1982 году Уайт с соавторами обнаружили последовательность, гомологичную агробактериальной в геноме нетрансформированного растения Nicotiana glauca [79]. Обнаруженная последовательность имела сходство более чем 80 % с Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes и была названа клеточной Т-ДНК. Растения табака имели нормальный фенотип, при этом клТ-ДНК присутствовала во всех исследованных растениях данного вида [79]. Фёрнер с соавторами исследовал Nicotiana glauca, собранные в географически удаленных районах. Методом гибридизации по Саузерну авторы показали присутствие клТ-ДНК во всех исследованных образцах N. glauca [34, 12]. 1.2. Генетическая информация Ti-плазмиды Агробактериальная трансформация − это основной метод получения трансгенных растений в лабораторных условиях. Она основана на регенерации целых растений из клеток, трансформированных векторами на основе Т-ДНК агробактерий. Способность Agrobacterium tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа "корончатого галла" коррелирует с наличием у них Ti-плазмиды (Ti - tumor inducing). Другой вид агробактерий – A. rhizogenes с Riплазмидой (pRi — root inducing) - вызывает заболевание, именуемое "бородатый корень", при котором в зоне повреждения корня образуется масса новых корешков. Опухолевая трансформация проявляется в гипертрофии, возникающей после проникновения агробактерий в пораненные участки растений, что чаще всего бывает в основании стебля (рисунок 2). 6

Рисунок 2. Генетическая колонизация растения A. tumefaciens: 1 - агробактерии существуют в ризосфере; 2 - строение A. tumefaciens; 3 - встраивание Т-ДНК в геном; 4 - образование опухоли [81] При поранении растения начинают выделять в среду фенольные вещества для защиты от патогенов. Эти фенолы являются для агробактерий сигналом для начала атаки. Фенолы стимулируют примерно 11 генов вирулентности (vir генов) Ti-плазиды. Эти гены кодируют вирулентные белки, которые переносят гены, индуцирующие опухоль, из бактерий в растение – хозяина. В плазмиде есть участок в 12-25 тысяч пар оснований (т.п.о), называемый Т-ДНК (Ttransfer) (рисунок 3). Рисунок 3. Схема Ti-плазмиды [81] На схеме указаны основные гены и их группы. Сайт инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении клетки Agrobacterium. 7

Колечками обозначены левая и правая фланкирующие последовательности ТДНК [81]. Из него vir-нуклеазой (двухкомпонентный комплекс из белков Vir-D1и Vir-D2) вырезается однонитевая ДНК. Сайт вырезания определяется граничными последовательностями на обоих концах Т-ДНК. Перенос однонитевой ДНК из бактерии в ядро растительной клетки происходит подобно конъюгации у бактерий. Чтобы соединить бактерию с клеткой растений, Vir-белки образуют нитевидный вырост – пилю, через который передается Т-ДНК. Попав в растительную клетку, Т-ДНК мигрирует в ядро. Vir-белки защищают Т-ДНК от растительных ферментов деградации ДНК и облегчают транспорт в ядро через ядерную пору. Важную роль при встраивании играет правый 5’граничный участок. Т-ДНК встраивается в хромосому случайным образом. Встроившись в какой-либо ген, Т-ДНК может нарушить функцию этого гена (инсерционный мутагенез). Это может быть использовано для идентификации гена. Т-ДНК, встроившись в ядерный геном, несет тесно сцепленные гены с эукариотическими характеристиками и наследуется по законам Менделя. Она реплицируется в клетках растений так же, как их собственная ДНК. Т.к. она содержит эукариотические промоторы, то она может транскрибироваться. м- РНК соответствует эукариотической м-РНК и может транслироваться. В Т-ДНК закодированы 2 фермента синтеза ауксина – индолилуксусной кислоты (ИУК) и триптофана [15]. Так же в Т-ДНК присутствуют гены, кодирующие ферменты синтеза опинов – производных аминокислот, являющихся источником азота, углерода и энергии для Agrobacterium [39]. Ферменты, нужные для катаболизма соответствующего опина, закодированы в той части Тi-плазмиды, которая остается в бактерии. Они синтезируются, когда бактерия поселяется в образовавшейся опухоли. В Т-ДНК одной плазмиды присутствуют, как правило, гены синтеза одного или двух типов опинов, а за пределами Т-ДНК − 8

гены ферментов для их расщепления. Таким образом, опины, секретируемые трансгенной клеткой, доступны только агробактериям с плазмидой, аналогичной той, что трансформировала ткани растения. Это дает подобным бактериям селективное преимущество, создает определенную экологическую нишу для болезнетворных штаммов Agrobacterium [35]. Хотя известно более двух десятков Ti- и Ri-плазмид, различающихся по набору генов синтеза опинов, в природно-трансгенных растениях встречаются в большинстве случаев гены синтеза микимопина и агроцинопина. На примере N. tabacum была показана экспрессия гена микимопин-синтазы [23, 51, 56, 73]. Suzuki с соавторами [73] выявили в клТ-ДНК N. glauca два гомолога генов микимопинсинтазы (mis) − NgmisL и NgmisR, что свидетельствует о происхождении клТ-ДНК от Ri плазмиды микимопинового типа из A. rhizogenes. Гибридизацией по Саузерну было показано, что клТ-ДНК содержит последовательности ORF 11 (rolB), 12 (rolC), 13, 14, и 15 (rolD), которые были названы NgrolB, NgrolC, Ngorf13, Ngorf14 и NgrolD, соответственно. Так же было установлено, что клТ-ДНК представлена несовершенным инвертированным повтором, который содержит одну копию гена NgrolB и по две копии остальных генов [35]. Эти повторы, названные левым и правым “плечом” клТ-ДНК, составляют в длину приблизительно 10 т.п.о. [34]. В эволюции рода Linaria из семейства Plantaginaceae также имела место агробактериальная трансформация. В геномах Linaria vulgaris и L. genistifolia выявлена и детально охарактеризована клТ-ДНК, показана ее интеграция в район похожий на ретротранспозон [14, 56]. У Linaria genistifolia, L. vulgaris, L. japonica, L. dalmatica клТ-ДНК организована как несовершенный прямой повтор. Левое плечо Т-ДНК включает последовательности гомологичные генам acs, orf2, orf3, orf8, rolA, rolB, rolC, orf 13, orf14, mis; но правое плечо короче, поскольку не содержит гомолога гена acs. Последовательность гена rolC является консервативной, совпадая на 93% с 9

соответствующей последовательностью из штамма А4 A. rhizogenes (Acc. # X03433) [13]. Было показано, что ген rolC кодирует белок цитокининглюкозидазу, который обладает способностью гидролизовать различные цитокинин-N-глюкозидные конъюгаты до свободного цитокинина [69]. Эта функция описана как для продукта агробактериального гена, так и для его гомолога из N. tabacum [61]. Можно предположить, что последовательность гена rolC, будучи привнесенной в геном растения, может приводить к повышенному содержанию эндогенных цитокининов и, как следствие, усиленному каллусо- и побегообразованию. Таким образом, общей особенностью структуры клеточных Т-ДНК у природно-трансгенных растений является их организация в виде повторов. Как известно, повторы в ДНК, особенно инвертированные, склонны к образованию вторичных структур, что обычно приводит к ослаблению экспрессии генов. Активно экспрессирующиеся в растениях онкогены привели бы к серьезному сбою в гормональной регуляции. Возможно, организация Т-ДНК в виде повторов позволила ей сохраниться в геномах предковых форм льнянок и табака, поскольку подавление экспрессии данных генов привело к более щадящему воздействию на гормональный статус растений. 1.3. Род Linaria – распространение видов Род Linaria включает в себя более 150 видов. Возникновение рода относят к эпохе Миоцена перед Мессианским кризисом солености [32]. В его состав входят секции Linaria, Speciosae, Diffusae, Supinae, Pelisserinae, Versicolores, Macrocentrum [58]. Трансгенные формы обнаружены в группе родственных видов секций Linaria и Speciosae (таблица 1). У них совпадает сайт локализации клТ-ДНК в геноме, что говорит о монофилетическом происхождении природно-трансгенных льнянок. У L. vulgaris, L. acutiloba, L. genistifolia наиболее консервативным и единственным функциональным геном является rolC [14, 20, 56]. 10

Таблица 1 Характеристика видов Linaria по наличию клТ-ДНК [12] Секция Linaria Speciosae Supinae Repentes Versicolores Льнянки Вид Linaria acutiloba Fisch. ex Rchb. Linaria altaica Fisch. ex Kuprian Linaria buriatica Turcz. ex Ledeb Linaria debilis Kuprian. Linaria hepatica Bunge Linaria incompleta Kuprian. Linaria. melampyroides Kuprian Linaria ruthenica Blonski Linaria vulgaris Mill. Linaria dalmatica (L.) Mill. Linaria genistifolia (L.) Mill. Linaria sabulosa Czern. ex Klokov Linaria aeruginea (Gouan) Cav. Linaria alpina Mill. Linaria purpurea (L.) Mill. Linaria maroccana Hook. распространены в районах Т-ДНК + + + + + + + + + + + + - Западного и Восточного Средиземноморья, где наблюдается их самое большое разнообразие. Так же произрастают в умеренных областях Европы, в Северной Африке и Азии. В пределах постсоветского пространства произрастает 70 видов. Они сосредоточены главным образом на Кавказе и в Средней Азии. На Дальнем Востоке произрастает только 4 вида, на Сахалине и Курилах — 2 вида [8]. Эндемик Linaria loeselii произрастает на дюнах побережья Балтийского моря в местах, экстремальных для роста растений, с обедненной и характерной только для этих мест почвенной биотой [28]. Из редких видов растений имеется указание о льнянке алтайской (Linaria altaica) в Красной книге Республики Башкортостан, о льнянке Биберштейна (Linaria biebersteinii) — в Красной книге Липецкой области, о льнянке душистой (Linaria odora) — в Красной книге Саратовской области, о льнянке 11

меловой (Linaria cretacea) — в Красной книге Ростовской и Саратовской областей, Казахстана и Украины. В список редких видов Европы включено 18 видов льнянок, в том числе 5 португальских, 8 испанских [1]. Так, например, Linaria alpina встречается на многих горных хребтах в южной и центральной Европе от Сьерра-де-Гредос и Монтес-де-Леон в Испании до гор Балканского полуострова, включая Альпы, горы Юра, Пиренеи и центральные Апеннины. Вид L. algarviana Chav является эндемиком в юго-западной части Португалии и растет на сухих песчаных почвах (рисунок 4). Рисунок 4. Linaria algarviana Chav Имеет фиолетовый венчик с белыми и желтыми пятнами (рисунок 5). L.hellenica Turrill – эндемик Греции, находящийся под угрозой исчезновения. Включена в Красную книгу Международного союза охраны природы (МСОП). Растет на приморских песках и песчаных почвах, вблизи моря, на плоских открытых местах [1]. 12

Рисунок 5. Венчик Linaria algarviana Chav [86] Льнянка — это многолетнее растение со стержневой корневой системой и с длинными ползучими побегами. Стебель 30—60(90) см высотой, прямостоячий, простой или ветвистый, густо олиственный. Листья линейноланцетные или линейные, заостренные, цветки собраны в густые длинные верхушечные кисти. Венчик желтый, с ярко-оранжевой выпуклиной на нижней губе. Цветет в июне—августе. Плод - коробочка продолговато-эллиптическая, содержит многочисленные мелкие, дисковидные, семена [6]. L. vulgaris Mill. - льнянка обыкновенная (рисунок 6) является одним из видов, произрастающих в большей части Европы и Северной Азии. Устойчивость к грибной инфекции дает растениям преимущества, перед другими растительными популяциями. Показано, что микобиота природнотрансгенной льнянки L. vulgais обеднена [83]. Так же показано, что L. vulgais подавляет развитие почвенной биоты [54]. В настоящее время L. vulgais распространена в Северной Америке как инвазивный вид [13]. 13

Рисунок 6. Linaria vulgaris Mill 1.4. Биологически активные соединения рода Linaria Обсуждая функции Т-ДНК, изначально предполагали, что она играет роль в регулировании гормонального статуса трансгенных клеток. Однако уже в 1987 году было замечено, что культуры косматых корней характеризуются повышенным содержанием вторичных метаболитов [33, 67]. C этого момента появилось предположение, что существуют и другие функции генов Т-ДНК и началось изучение механизмов влияния генов Т-ДНК на вторичный метаболизм растений. К наиболее распространенным биологически активным вторичным метаболитам растений относят алкалоиды, фенолы и полифенолы (флавоноиды, терпеноиды, кумарины, сапонины), и эфирные масла. Все эти группы соединений могут быть синтезированы с высокой эффективностью в культурах косматых корней [55, 59]. В природе эти соединения имеют важное значение для защиты растений от неблагоприятных факторов, а также осуществления взаимодействия растений с другими организмами. Например, показано важное экологическое значение 1,4-нафтохинонов, которые могут участвовать в формировании отношений растение-растение, растение-насекомое и растениепатоген [80]. 14

Вырабатываемые природно-трансгенными растениями биологически активные соединения относятся к различным химическим группам, и не являются уникальными для данных видов, а синтезируются в заметных количествах у различных представителей тех же родов и семейств. Но у природно-трансгенных растений отмечена определенная тенденция: содержание мажорных вторичных метаболитов повышено, по сравнению с их уровнем у нетрансгенных родственных форм [55, 59]. Аналогичную тенденцию увеличения пула мажорных соединений в трансформированных растениях можно наблюдать в культурах косматых корней. В некоторых случаях отмечается возрастание содержания в тканях трансформированных растений сразу нескольких соединений, вовлеченных в одну метаболическую схему [55]. На настоящий момент у 41 вида Linaria идентифицировано более 200 вторичных метаболитов [77]. К ним относятся иридоиды (антирринозид и его дериваты) [22, 28], флавоноиды (линарин, пектолинарин, апигенин и т.д.) [38, 50], органические кислоты (пальмитиновая, линолевая, линоленовая), сапонины (амирин) [70], дитерпеноиды (линариенон) [29, 47] и стероиды [31, 48]. Большинство этих соединений участвуют в защите растений от патогенов и вредных насекомых. Природно-трансгенные растения (секции Linaria и Speciosae) образуют больше биологически активных метаболитов, чем другие виды [55, 59, 60]. Концентрация антирринозида и его производных в наземной части растения может достигать 25% сухого веса [60]. Эти соединения отпугивают листогрызущих и неопыляющих насекомых. Антирринозид и аукубин преобразуются в антиррид и каталпол, которые в свою очередь обладают антимикробной и фунгицидной активностью [19, 50, 53, 69]. Примечательно, что образующиеся по одному метаболическому пути соединения каталпол и антирринозид (их предшественником является логаниновая кислота) являются хемотаксономическими маркерами Scrophulariacea и Plantaginacea [62, 68]. 15

Исходя из вышеизложенного, мы сделали вывод, что для нашего исследования наиболее перспективными являются следующие вторичные метаболиты: линариозид, ацетопекталинарин, антиррид и антирринозид (рисунок 7). Линариозид Антиррид Антирринозид Ацетопекталинарин Рисунок 7. Структурные формулы перспективных для изучения метаболитов 16

1.5. Применение биологически активных соединений Биологически активные вещества принадлежат к продуктам вторичного обмена, которые называют вторичными метаболитами или вторичными продуктами биосинтеза. В настоящее время известно более 100000 вторичных метаболитов, продуцируемых растениями. Многие из них являются экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности. Представители родов Linaria и Nicotiana, благодаря высокому содержанию вторичных метаболитов в их тканях широко используются в народной медицине. Такое использование началось задолго до обнаружения в них клТ-ДНК. Чаще всего из них используют в фармацевтике N. tabacum [49], N. glauca [42], L. vulgaris [72], L. japonica [47]. Все они содержат клТ-ДНК [14, 20, 23, 34, 42, 51, 56, 79]. Linaria vulgaris имеет выраженные лечебные свойства и представляет интерес для научной медицины. Сумма флавоноидов льнянки повышает артериальное давление, увеличивает амплитуду сердечных сокращений и замедляет ритм, возбуждает центральную нервную систему, повышает тонус скелетной мускулатуры [10]. Так, еще в 1859 году известный врач-эмпирик Радемахер отмечал льнянку как целебное средство для сосудистой системы [2]. Наряду с действием на сосуды, флавоноиды известны и как слабые кардиотонические средства, которые способны снижать ритм сердечных сокращений и увеличивать их амплитуду. По имеющимся данным, кверцетин, рутин и другие флавонолы восстанавливают силу утомленного или гиподинамического сердца, нормализуют пульс; некоторые флавоноиды обладают слабым гипотензивным действием. Экспериментально профессор М. Д. Российский 1920-е годы установил, что спиртовой экстракт льнянки обыкновенной воздействует как мягкое послабляющее на больных атонией кишечника, вздутием живота. Он впервые выделил вещество пеганин, которое оказывало положительный 17

терапевтический эффект при мышечной дистрофии и миопатиях и прошло фармакологические и клинические испытания [2]. Позже было доказано, что пеганин оказывает сильное возбуждающее действие на матку [9] и способствует снижению артериального давления и нормализует пульс при сердечно-сосудистых заболеваниях. В Болгарии льнянку применяют при начальной стадии гипертрофии предстательной железы. В тибетской медицине льнянку применяют как противоядие при отравлении. Считают ее полезной при отечности ног, рук, суставов. Порошок из травы льнянки с маслом применяют для смазывания нарывов, переломов, язв. Настой — при пародонтозе и грибковых поражениях слизистой оболочки полости рта, для укрепления волос. Водный настой льнянки врачи Германии применялся при желтухе, воспалении мочевого пузыря, запоре, вялости кишечника и геморрое. Спиртовой экстракт льнянки или таблетки в Корее применяют как седативное средство. В Монголии препараты льнянки применяют при асците, укусе собак, диких зверей и заболевании суставов. В небольших количествах льнянку применяют при головных болях с рвотой (синдром Меньера) [82]. Соединение линариозид, выделенное из L. japonica, обладает выраженным диуретическим эффектом за счет изменения осмотического давления плазмы крови соединение способствует переходу воды из тканей в сосудистое русло. Она используется в Японии как мочегонное средство [46]. Так же были представлены результаты специфичности гликозидов дикого растения исследования видовой Linaria vulgaris Mill. на традиционно выращиваемых овощах в Молдове - морковь, лук, баклажаны и помидоры. Их стимулирующее воздействие было отмечено в отношении прорастания, роста и развития овощей, способствующих полному 18

осуществлению их производственного потенциала, улучшению качества и товарного вида продукции [87]. Недавно на рынок вышел препарат Эндокринол крем-гель для локальной защиты щитовидной железы компании Эвалар. В его состав входят: водный экстракт звездчатки средней, масляный экстракт льнянки обыкновенной, водноспирто-глицериновый экстракт лапчатки белой, глицерин, триэтаноламин, эуксил К300, эмульгатор Т-8 (полисорбат 20, дипропиленгликоль, ПЭГ-40 гидрогенизированное касторовое масло), карбопол, ароматическая композиция. Мягкое воздействие обеспечивается отсутствием в его составе гормонов [84]. Таким образом, вырабатываемые природно-трансгенными растениями биологически-активные соединения относятся к различным химическим группам, и не являются уникальными для данных видов, а синтезируются в заметных количествах у различных представителей тех же родов и семейств. Но у природно-трансгенных растений отмечена определенная тенденция: содержание мажорных вторичных метаболитов повышено, по сравнению с их уровнем у нетрансгенных родственных форм [55, 59]. 1.6. Биологические активности соединений Богатый набор биологически флаваноидного, гликозидного активных характера и соединений иридоидного, широкий спектр их физиологического действия, наряду с практически неограниченной сырьевой базой, делают привлекательным изучение представителей рода Linaria из данного семейства на наличие в них биологически активных соединений с последующим доказательством химической структуры наиболее эффективных из них. Мерой эффективности вещества в ингибировании специфической биологической или биохимической функции является значение IC50 - максимальная ингибирующая концентрация половины. 19

1.6.1. Противоопухолевая активность Дитерпеноиды и флавоны представляют собой соединения, обладающие противоопухолевой активностью. Первое исследование в этой области было проведено группой ученых во главе с М. Gordaliza в 1997 году. В виде L. saxatilis были найдены несколько новых нео-хлородан - дитерпеноидов, что побудило исследовать их цитотоксичность: соединения 118, 122, 123, 134, 135, 140, 141 и 147 (рисунок 8). Значения в диапазоне 0,4-0,5 мМ были получены против клеток лейкемии, P-388, опухолевых клеток легких H-549 и клеток аденокарциномы толстой кишки HT-29 для соединений 134, 135 и 141. Полусинтетические производные оказались менее активными, чем природные [37]. Рисунок 8. Ациклические монотерпены (соединения 110-112), нео-хлородан дитерпеноиды (113-147) и лабданы (148-151) из видов Linaria [24] 20

Антипролиферативная активность пектолинарина – соединения 35 (рисунок 9), линайрина – 37 (рисунок 9), изолярина А - 38 (рисунок 9), изолярина В – соединения 39 (рисунок. 9), пектолинаригенина -49 (рисунок 9) и вторичного производного 50 (полученного гидролизом блока рутинозы и рамнозы в 35 , соответственно) и перацетил-полиолатинарина - соединение192 (рисунок 10), полученного ацетилированием пектолинарина - соединение 35, (рисунок9), выделенным из L. reflexa [75], оценивали на цитотоксичность in vitro колориметрическим анализом сульфододамина B против клеточных линий рака человека. Рисунок 9. Гликозидные флавоноиды (соединения 35-50) [24] Пектолинарин проявлял значительную активность против карциномы легкого (COR-L23), колоректальной аденокарциномы (Caco-2) и амеланотической меланомы (C32) (IC50 = 5.03, 6.18 и 7.17 мМ соответственно). Аналогичные активности были зарегистрированы для соединений 37-39, тогда как пектолинаригенин (49) показал наибольший эффект на клетки COR-L23 и C32 (IC50 ¼4,07 и 7,02 мМ) [75]. Эти результаты способствовали расширению оценки синтетических производных 49. Среди них соединение 193 (рисунок 10) проявляло значительную активность против фибробластов кожи человека (142 BR), гепатоцеллюлярной карциномы (Huh-7D12), Caco-2, COR-L23 , ACHN, C32, карцинома легкого (A549) и злокачественная меланома (A375). 21

Рисунок 10. Синтетические производные [24] Ни одно из испытуемых соединений (35, 49, 193 и пять синтетических производных) не повлияло на пролиферацию фибробластов кожи 142 BR, что указывает на селективную активность против опухолевых клеток [21]. Группа Gordaliza в 1997 году оценила цитотоксичность in vitro нескольких неохлородан дитерпенов, выделенных из корней и надземных частей L. saxatilis var. glutinosa, включая 147 (рисунок 8) и полусинтетический продукт 194 (рис.10). Исследованные соединения можно разделить на пять групп, относящихся к их структуре: с экзоциклической двойной связью D4 (18) (тип A), их эндоциклическим аналогом D3 (тип B), с эпоксидной функцией в положении 4,18 (тип C), соответствующие 4,18 диолов (тип D) и деградированный кетон C-18 (тип E). Они были протестированы против мышиной лейкемии P-388, карциномы легких A-549, карциномы толстой кишки НТ-29 и клеток клеточной культуры меланомы Мел-28, получая лучшие значения IC50 (0,2 мМ) с соединениями типа А-С. Продукт 194 (рисунок 10) показал, что селективность оказалась в четыре раза более чувствительной к многорезистентной системе HT-29, хотя без большой эффективности. Аналогичное поведение наблюдалось у соединения 147 по отношению к лейкемии мыши P-388, хотя и в меньшей степени [24]. В общем, большинство испытуемых полусинтетических производных были менее активными, чем их натуральные исходные соединения. 22

1.6.2. Анти-ацетилхолинэстеразная (Ахэ) активность Линарин - соединение 36 (рисунок 9), который обычно присутствует в Linaria sp., флавонон нарингенин и некоторые халконы, как сообщается, ингибируют анти-Ахэ, со значениями в диапазоне от 28.2 до 134.5 µM. Экстракты L. reflexa блокировали Ахэ в доз-зависимом методе. Наблюдаемая активность на экстракте н-гексана (IC50 ¼ 220,7 мг / мл) может быть связана с обнаруженным присутствием жирных кислот, которые показали слабое ингибирование ацетилхолинэстеразы. Был найден самый активный Ахэ экстракт (IC50 ¼ 185.6 мг/мл) и три флавона, ответственных за биологическую активность. Они были выделены из экстрактов линарина, изолинарина и изолинарина Б - соединений 37, 38 и 39 (рисунок 9), и показывали анти-Ахэ значения (IC50 ¼ 0.30, 0.27 и 0.28 мм, соответственно) сравнимые с коммерческим препаратом физостигмином. Следует отметить, что структуры этих трех соединений представляют собой одну и ту же часть рамногликозида, которая, как было показано, участвует во взаимодействии с ферментом ацетилхолинэстеразой [24,64]. 1.6.3. Противовоспалительная и обезболивающая активность Экстракты выделены из Linaria grandiﬂora Desf., L. genistifolia subsp. confertiﬂora. L. aucheri Boiss и Davis и показали противовоспалительные и обезболивающие эффекты, однако линарин - соединение 37 (рисунок 9) и антирринозид (рисунок 7), выделенные из биоактивного экстракта L. aucheri, не проявили активности на каррагинан и PGE2-индуцированный отек задней лапы 12- O-тетрадеканоил-13-ацетат (ТРА) - индуцировавший отек уха и индуцированные p-бензохиноном корковые рефлекторные тесты у мышей [16]. Пероральное введение экстракта L. aucheri ацетилхолинэстеразы или водного экстракта и антирринозида значительно заблокировали ТРА-индуцированный отек уха у мышей. Наоборот, экстракты и чистый линарин не проявляли никакой активности на каррагинан, PGE 2-индуцированного отека задних лап и 23

ТРА-индукции ушного отека тест-объекта. Более того, водный экстракт L. aucheri и антирринозид показали значительную анти-ноцицептивную активность п-бензохинон-индуцированного судорожного рефлекса у мышей [16]. Экстракты и органические соединения 15, 35-37, 47 и 50 (рисунок 9) L. vulgaris показали противовоспалительное и антиаллергические эффекты [45]. Было показано, что флавоноиды 35, 43, 47, 49, 52 и 57 растения L. vulgaris являются полезными противокашлевыми и противовоспалительными веществами в традиционной китайской медицине [41]. Установлено, что неохлородан дитерпеноиды Е-изолинаридиала – соединения 140 (рисунок 8), изолированные от L. saxatilis var. glutinosa и ее производное метилкетон – соединение 195 (рисунок 10) активены на фосфолипазе PLA2. Кроме того, оба соединения ингибируют sPLA2 у человека в синовиальной жидкости в зависимости от концентрации при соответственно. Дополнительно липоксигеназную активность биосинтез лейкотриена В4, они и а значениях IC50 уменьшили 0,20 0,49 мм, бесклеточную 5- A23187-индуцированный также значительно и нейтрофилами снизили рецептор- опосредованную дегрануляцию, еще одну функцию нейтрофилов человека. Напротив, ни одно из соединений не влияло на образование супероксидов в лейкоцитах или циклооксигеназы-1, циклооксигеназы-2 и индуцибельную активность синтазы оксида азота в бесклеточных анализах [18]. 1.6.4. Антиоксидантная активность Биологическое исследование экстракта L. japonica, входящего в косметическую композицию показало, что свободная радикальная очистка, перекисное окисление липидов, ингибирование гиалуронидазы, ингибирование липоксигеназы поддерживают и эффекты ингибирования антиоксидантные и дегрануляции иммуноцитов, противовоспалительный эффекты косметической композиции данного косметического состава [44]. 24

Недавно, Врховская и др. исследовали способность L. vulgaris действовать как поглотитель радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH), активных форм кислорода (супер-оксидный радикал, гидроксильный радикал, хлорноватистая кислота) и оксида азота. Мощную антиоксидантную активность можно было бы в основном отнести к производным флуороидов, присутствующим в настое [78]. 1.6.5. Антибактериальная активность Биологическое исследование экстракта этанола из Linaria corifolia показало селективную антибактериальную активность в отношении граммположительных бактерий. Этот же экстракт растения также оказывают сильное действие против кислотоустойчивой бактерией Mycobacterium smegmatis, оценивали в сравнении с антибиотиком Cephalosporic cefotoxime (CTX30). Кроме того, спиртовой экстракт из листьев, цветков, стебля и корней обладает анти-дрожжевыми эффектами, особенно в отношении Kluyveromyces fragilis [36]. 25

Глава 2. Материалы и методы исследований Работу проводили на базе лаборатории № 10 Фитотоксикологии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (ФГБНУ ВИЗР), в лаборатории аналитической фитохимии Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской академии наук. 2.1. Материалы исследований 2.1.1. Объекты исследований Объектами исследований служили растения рода Linaria - Linaria vulgaris (Lv), Linaria maroccana (Lm), Linaria genistifolia (Lg), и Linaria creticola (Lc), контрастные по содержанию T-ДНК. Проверке на биологическую активность предшествовали следующие этапы: 1. Получение растительного материала. Сбор семян по всей территории России, а семена Lm закупались в коммерческих организациях. 2. Выращивание в выравненных условиях до фазы бутонизации. 3. Проведение спиртовой экстракции для оценки биологических активностей вторичных метаболитов. Оборудование, использованное в работе, представлено на рисунке 11:  Ламинарный бокс с вертикальным потоком ВЛ-12  Роторный испаритель  Весы  Термостат  Газовый хроматограф Маэстро Agilent Technologies 7820A 26

Газовый хроматограф Ламинарный бокс Термостат Роторный испаритель Весы Рисунок 11. Оборудование, использованное в работе 27

2.1.2. Питательные среды Для лабораторных опытов in vitro использовали агаризованные и жидкие питательные среды, составы которых приведены в таблице 2. Таблица 2 Составы агаризованных питательных сред Название питательной среды Среда Чапека Состав питательной среды Компонент Количество, г/л глюкоза 30 NaNO3 2 KH2 PO4 1 MgSO4 0,5 KCl 0,5 Fe2 (SO4 )3 0,01 агар микробиологический 20 картофельный настрой КГА 200 глюкоза 20 агар-агар 15 Все компоненты питательной среды смешивали, затем разливали по лабораторным колбам емкостью 1 л, предварительно автоклавированным при 133 C (2 атм.) в течение 1 часа, из расчета 300 мл среды в каждую колбу. Горловины колб затыкали ватно-марлевыми пробками и закрывали бумажными колпачками. Режим стерилизации сред – 121°C (1 атм.) в течение 1 часа. Перед использованием агаризованные среды расплавляли на водяной бане до жидкого состояния, а затем остужали до температуры, не 28

превышающей 40 C во избежание образования конденсата на крышках чашек после разлива в них среды. 2.1.3. Подготовка образцов для хроматографии Добавление к сухому остатку 50мкл раствора со свидетелем; добавление 10 силицируещего агента (trimethylsilyl); кручение на вортексе 10 минут; постановка в термостат на 15 минут Т=100°C; постановка на прибор – газовый хроматограф Маэстро Agilent Technologies 7820A (GC-system). 2.1.4. Проверка на фунгицидную и антибиотическую активность Приготовили питательную среду с добавлением экстракта Linaria genistifolia (Lg), питательную среду для бактерий и грибов - картофельноглюкозный агар (КГА) в концентрации 0,6 и 1,5. Разлили по чашкам Петри среду с экстрактом Lg, затем КГА*0,6; Питательную среду КГА*1,5 разлили по стерильным чашкам Петри. Виды для проверки активностей: Escherichia coli (E. coli) (рисунок 12) Bacillus subtilis (B. subtilis) (рисунок 13) Fusarium culmorum (F. culmorum) (рисунок 14) Рисунок 12. E. coli Рисунок 13. B. subtilis Рисунок 14. F. culmorum 29

2.1.5. Проверка соединений на инсектицидную активность В качестве тест-объектов для определения инсектицидной активности лабораторных образцов биопрепаратов для защиты растений от насекомыхвредителей использовали виковую тлю (Megoura viciae Buckt.) – вредителя растений семейства бобовых. Эта популяция насекомых была получена на базе инсектария ФГБНУ ВИЗР. Определение инсектицидной активности также включает в себя использование следующего инвентаря: 40-мм пластиковые чашки Петри, фильтровальные диски, микробиологическая пипетка, препаративная игла, ручная лупа, птичьи перья. 2.2. Методы исследований Особенности извлечения биологически активных веществ из материалов с клеточной структурой связаны с тем, что на пути к веществам, содержащимся в клетке, находится клеточная стенка, физиологическое состояние которой может быть различным. Так, живая растительная клетка имеет пристенный слой протоплазмы определенной толщины. Он накладывает особый отпечаток на свойства клеточной стенки, как перегородки, отделяющей раствор внутри клетки (клеточный сок) от жидкости вне клетки [5]. Для большинства природных биологически активных соединений не существует универсальных методов выделения. В зависимости от свойств веществ, особенностей растительного сырья и ряда других факторов прибегают к наиболее подходящему из известных методов выделения: избирательная экстракция, хроматография и др. [4]. В данном исследовании для анализа вторичных метаболитов растений, из выравненного растительного материала, полученного в асептических условиях, проводили спиртовую экстракцию. 30

2.2.1. Спиртовая экстракция Грубые экстракты из растений получали путем измельчения растительного сырья в ступке с жидким азотом, с последующей 3-й экстракцией 70% метанолом при 40оС. Фильтрация через красный фильтр, с последующим объединением фракций. Упаривание фракций проводили на роторном испарителе. 2.2.2. Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) Грубый экстракт анализировали методом тонкослойной хроматографии в системе хлороформ: метанол: вода 11:4:2. Окраску проводили анисовым альдегидом (на серной кислоте). Отдельные фракции получали путем деления на препаративных пластинах и дальнейшей экстракции отдельных фракцией. Визуализацию проводили в парах йода [63]. Фракции идентифицировали с помощью газовой хроматографии (ГЖХ) с масс-детектором в лаборатории аналитической фитохимии БИН. 2.2.3. Метод дисков на культурах Данный метод исследования применялся для оценивания антибиотической, фунгицидной и инсектицидной активностей. Антибиотическую активность оценивали методом дисков на культуре E.coli и Bacillus subtilis, фунгицидную на культуре Fusarium equiseti и Boeremia exigua. Исходный раствор экстракта - 1г в 1 мл. Для антибиотической и фунгицидной активности наносили по 25мкл экстракта на диск. Для определения инсектицидной активности проб грубого экстракта на стеклянные чашки Петри выложили бумажные диски и нанесли на них по 100 мкл экстракта, оставляя небольшое свободное пространство между дисками и краями чашки (рисунок 15). В качестве контроля использовался 70% метанол. 31

Виковую тлю аккуратно снимали птичьим пером с бобовых ростков и переносили ее в количестве 20 особей в чашку Петри, после этого чашку закрывали крышкой. Через 24 часа вели учет гибели насекомых, проверяя с помощью препаративной иглы, живы насекомые или мертвы. Рисунок 15. Определение инсектицидной активности проб грубого экстракта 2.2.4. Спектрофотометрический метод Антирадикальную активность вторичных метаболитов оценивали по способности перехватывать азотсодержащий синтетический радикал 1,1дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ). Готовили раствор грубого экстракта Lv и Lg в хлороформе в концентрации 100 мкг/мл, затем к раствору исследуемого вещества добавляли 2 мл раствора ДФПГ (фиолетовой окраски). Кинетику взаимодействия метаболита с ДФПГ исследовали при помощи спекрофотометра по изменению во времени оптической плотности раствора на длине волны 520 нм. 32

Глава 3. Результаты и обсуждение В результате исследований было выявлено, что грубые экстракты отличаются по выходу экстрактивных веществ и метаболическому профилю (рисунки 16, 17). Lm Lv АНТИРРИД АНТИРРИНОЗИД Рисунок 16. Сравнение метаболических профилей L. maroccana (Lm) (слева) и L. vulgaris (Lv) (справа) с помощью ТСХ Lv Lc Рисунок 17. Результаты ТСХ экстрактов Linaria vulgaris и Linaria creticola (Lc) 33

Так, у Linaria vulgaris количество экстрактивных веществ существенно больше, чем у Linaria creticola (рисунок 17). При сравнении метаболитического профиля L. vulgaris и L.maroccana легко заметить, что ряд соединений у них разный, так как различается по подвижности и окраске. У всех видов была полоса с коэффициентом подвижности 0.12, которая по спектрам была идентифицирована как антирринозид. Известно, что этот иридоидный гликозид отвечает за инсектицидную активность. В тоже время у некоторых Т-ДНК содержащих видов (например, льнянке обыкновенной, рисунок 16) мы видим полосу, соответствующую по подвижности 0.2. Соединение, соответствующее этой полосе, обладает фунгицидной активностью. Мы полагаем, что это антиррид. Результаты антибактериальной активности экстрактов Показатели антибактериальной активности выше всего у Lv, а у Lm практически отсутствуют. Это объясняется наличием ацетопектолинарина в экстрактах Lv и отсутствием его в экстрактах Lm, что согласуется с литературными данными [62] (рисунки 18, 19). Кроме того, как уже отмечалось, бактерицидную активность может проявлять агликон антиррида. Но в грубых экстрактах он представлен в гликозилированной форме, поэтому не влияет на наблюдаемую активность. Рисунок 18. Результаты антибактериальной активности грубых экстрактов Lv 34

mm 6 5 4 3 2 1 0 Linaria maroccana L. genistifolia L. vulgaris Test Рисунок 19. Диаграмма активности 0.5% грубого экстракта на E.coli На культуре Bacillus subtilis зону давал только экстракт из Lg 4 мм с ошибкой 0.3 мм (рисунки 20, 21). Рисунок 20. Результаты антибактериальной активности экстрактов Lg и Lv 35

Диаграмма активности 0.5% грубого экстракта на B.subtilis mm 5 4 3 2 1 0 Linaria maroccana L. genistifolia L. vulgaris Рисунок 21. Диаграмма активности 0.5% грубого экстракта на Bacillus subtilis Результаты газовой хроматографии (ГЖХ) В результате ГЖХ мы наблюдали пик антирринозида на 32 минуте, пик 6ацетилантирринозида на 41 минуте и пик линариозида на 42 минуте (рисунок 22). Стандарт Антирринозид Рисунок 22. Хроматограмма 1. Спиртовой экстракт из L. vulgaris (время удерживания 28.7 – стандарт, 32.32 – антирринозид, 41.35 - 6 ацетилантирринозид, 42.75 – линаринозид) 36

На фракции иридоидов (рисунок 23) увидели пик антирринозида на 34 минуте. Антирринозид Стандарт Рисунок 23. Хроматограмма 2. Фракция иридоидов Рисунок 24. Хроматограмма с каталполом и аукубином На хроматограмме (рисунок 24) на 28 минуте мы наблюдаем пик внутреннего свидетеля, потом идет каталпол и аукубин. Это мажорные соединения у подорожниковых. Структурные аналоги антирринозида и антиррида у льнянок, с аналогичными функциями. Более изучены, чем изучаемые нами метаболиты. Каталпол обнаружен у L. macroura [26]. Обладает нейропротективной активностью. Аукубин обнаружен у L. vulgaris [30] и у 37

L. macroura [26]. Аукубин обладает цитотоксической активностью, агликон аукубина обладает антимикробной активностью [30, 26]. Результаты фунгицидной активности На рисунке 25 представлен пример стимуляции роста Boeremia exigua шт.32.112 (рисунок 25.1) и отсутствия воздействия на рост Boeremia exigua шт Ph 2 (рисунок 25.2) (A - КГА; B - 1% грубый экстракт КГА; C - 0.01% фракция иридоидных гликозидов КГА). А В С Рисунок 25.1. Пример стимуляции роста B. Exigua шт.32.112 А В С Рисунок 25.2. Пример отсутствия воздействия на рост B. Exigua шт Ph 2 38

Так же была обнаружена фунгиcтатическая активность против грибов рода Fusarium. Результаты инсектицидной активности На рисунке 26 представлена диаграмма по результатам инсектицидной активности. 100 % гибели виковой тли 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль (70%-ный метанол) Linaria genistifolia Linaria vulgaris Lenaria marrocana Виды Linaria Рисунок 26. Диаграмма гибели тест-объекта (виковой тли) под воздействием экстрактов Lv, Lg и Lm Как видно на диаграмме, наибольшая инсектицидная активность зафиксирована через 24 часа для экстрактов Lv – 45% гибели виковой тли. Экстракты Lg вызвали 30 %-ную гибель насекомых, а наименьшую гибель вызывали экстракты Lm - 10% (рисунок 26). Таким образом, экстракты различных видов Linaria обладают выраженной инсектицидной активностью. 39

Результаты антирадикальной активности Антирадикальная активность экстрактов в целом была невысокой. Наибольшая активность наблюдалась у L. genistifolia, что согласуется с повышенным содержанием флавоноидов в экстрактах этого растения. Полученные нами данные подтверждают соотношение вторичных метаболитов и их влияние на биологические активности. Спектр вторичных метаболитов имеет индивидуальные особенности у разных видов Linaria. В диаграмме на рисунке 27 показано содержание флавоноидов и иридоидных гликозидов у L.vulgaris и L. genistifolia. Так ацетопекталинарин присутствует в экстрактах у L.vulgaris и отсутствует у L. genistifolia, что соответствует литературным данным [62]. А антирринозид, присутствуя в обоих видах, содержится у L. genistifolia в значительно большем количестве (Lv 1.05, Lg7.7). И, как уже было сказано, может усиливать защиту растений на патогенов. RU 14 12 10 8 6 4 2 0 L. vulgaris Acetylpectolinarin Linarioside L. genistifolia Antirriniside 5-O-glucosylantirriniside Рисунок 27. Сравнительная диаграмма содержания ацетилпектолинарина и иридоидных гликозидов в L.vulgaris и L. genistifolia [63] 40

Таким образом, полученные нами результаты не противоречат гипотезе о влиянии Т-ДНК как на цитокининовый статус, так и на синтез вторичных метаболитов, участвующих в защите от патогенов. Обобщая картину влияния клТ-ДНК на вторичный метаболизм растений, можно отметить, что во многих случаях природно-трансгенные растения характеризуются более высоким содержанием мажорных фракций вторичных метаболитов. Однако, учитывая различные факторы, влияющие на регуляцию вторичного метаболизма растений, результаты исследований не всегда получаются однозначными. 41

Заключение Поиск, изучение и использование биологически активных соединений в растениях – важное направление исследований на сегодняшний день, которое способно разрешить многие задачи и вопросы, стоящие перед различными областями биотехнологии. На сегодняшний день природно-трансгенные формы описаны в пределах трех родов двудольных растений. Наибольший интерес вызывает обсуждение возможных функций клТ-ДНК, включая её влияние на синтез вторичных метаболитов. Исходя из проанализированной литературы и проведенных нами исследований, мы убедились, что иридоидные соединения характерны для узкого класса растений. Они обладают разнообразными биологическими активностями (противоопухолевой, антимикробной), что делает их весьма перспективными с практической точки зрения их дальнейшего изучения. Однако их детекция вызывает ряд вопросов, т.к. они не светятся под ультрафиолетом. Точную идентификацию затрудняет так же и то, что иридоиды находятся в растении вместе с другими соединениями, такими как флавоноиды. В соответствии с результатами нашего исследования нами были сделаны следующие выводы: 1. Оценен метаболитный профиль растений рода Linaria, контрастных по содержанию T-ДНК. Выявлено 4 мажорных метаболита, представляющих собой 2 группы соединений - иридоиды и флавоноиды: антирринозид, линарин, антиррид, ацетопекталинарин. 2. Проведенный анализ показал фунгиcтатическую активность против грибов рода Fusarium. 3. Из рассмотренных экстрактов только экстракты Lg в концентрации 0.5% обладают незначительной антирадикальной активностью. 4. Проанализированные фракции обладают инсектицидной активностью. 42

5. Антибактериальной активностью обладают экстракты Lv в концентрации 0.5%. Для более точного выяснения роли клТ-ДНК требуются дополнительные исследования, включающие описание новых примеров горизонтального переноса генов от агробактерий к растениям, а также более глубокое исследование уже описанных видов. Поиск новых примеров трансгенных растений может осуществляться путем применения биоинформатических подходов для анализа отсеквенированных геномов растений, а также молекулярно-биологическими методами. 43

Список использованных источников 1. Белоусова Л. С., Денисова Л. В. Редкие растения мира. - М. : Лесная промышленность, 1983. – 344 с. 2. Гаммерман А. Ф., Кадаев Г. Н., Яценко-Хмелевский А. А. Лекарственные растения (Растения-целители) : справ. пособие. – 3-е изд., перераб. и доп. – М. : Высш. шк., 1983. – 400 с. ил. 3. Георгиевский В. П., Комиссаренко П. Ф., Дмитрук С. Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. – Новосибирск: Наука, Сиб. отдние, 1990. – 333 с. 4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение : пер с англ. – М. : Мир, 2002. – 589 с. 5. Дмитриевский Д. И. Технология лекарственных препаратов промышленного производства : учебное пособие. – Харьков : НФаУ, 2005. – Ч.1. Основные процессы и аппараты в фармацевтическом производстве. Экстракционные препараты. – 145 с. 6. Губанов И. А. и др. Linaria vulgaris Mill. – Льнянка обыкновенная // Иллюстрированный определитель растений Средней России. В 3 т. – М. : Т-во науч. изд. КМК, Ин-т технолог. иссл., 2004. – Т. 3. Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные). – С. 181. 7. Кагирова К. С. и др. Особенности фенотипического проявления rol-генов agrobacterim rhizogenes в растениях // Биомика. – 2017. – Том 9 ; № 4. – С. 304316. 8. Куприянова Л. А. Род 1328. Льнянка – Linaria // Флора СССР : в 30 т. – М. ; Ленинград : Изд-во АН СССР, 1955. – Т. 22 / ред. тома Б. К. Шишкин, Е. Г. Бобров. – С. 201–202. 9. Лекарственные растения и их применение / [Д. К. Гесь, Н. В. Горбач, Г. Н. Кадаев и др.] ; Науч. ред. засл. деят. наук БССР, акад. И. Д. Юркевич, засл. деят. науки БССР, акад. И. Д. Мишенин ; АН БССР, Ин-т эксперим. ботаники им. В. Ф. Купревича. – 7-е изд. – Минск : Наука и техника, 1976. – 591 с. 44

10. Ломагина З. В., Беленовская Л. М. Род Linaria // Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование: Семейства Caprifoliaceae-Plantagnaceae / Отв. ред. П. Д. Соколов. - Л. : Наука, 1990. – Т. 5. – С. 142–147. 11. Матвеева Т. В. , Сокорнова С. В. Биологические особенности природнотрансгенных растений и их роль в эволюции // Физиология растений. – 2017. – Т. 64 ; № 5. - С. 323–336. 12. Матвеева Т. В. Горизонтальный перенос генов между Agrobacterium spp. и высшими растениями : автореферат дисс. доктора биологических наук : 03.02.07 / Матвеева Татьяна Валерьевна; [Место защиты: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет]. – СПб., 2013. - 35 с. 13. Матвеева Т. В. Природно-трансгенные растения, как модель для изучения отсроченных экологических рисков возделывания ГМО // Экологическая генетика. – 2015. – T. 13 ; №2. – С. 118-126. 14. Павлова О. А. Нуклеотидные последовательности Linaria dalmatica (L.) P. Mill, приобретенные в результате горизонтального переноса : aвтореф. дис.канд. биол. наук. СПб. : СПбГУ, 2013. – 18 с. 15.Хелдт Г. В. Биохимия растений / Ганс-Вальтер Хелдт ; пер. с англ. М. А. Брейгиной [и др.] ; под ред. А. М. Носова, В. В. Чуба. – 2-е изд. – Москва : Бином. Лаб. знаний, 2014. – 471 с. 16. Akkol E.K, Ercil D. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of some Linaria species from Turkey // Pharm Biol. – 2009. – V. 47. – P. 188–194. 17. Angiosperm Phylogeny Group. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG IV // Bot. J. Linn. Soc. – 2016. – V. 181 ; №1. – P. 1–20. 18. Benrezzouk R. et al. Inhibition of human sPLA2 and 5-lipoxygenase activities by two neo-clerodane diterpenoids // Life Sci. – 1999. – V. 64. – PL 205–211. 45

19. Biere A., Marak H.B., Van Damme J.M.M. Plant chemical defense against herbivores and pathogens: generalized defense or trade-offs? // Oecologia. - 2004. – V. 140. – P. 430–441. 20. Blanco-Pastor J. L., Vargas P., Pfeilm B. E. Coalescent simulations reveal hybridization and incomplete lineage // PLoS ONE. - 2012. - V. 7. – e39089. 21. Bonesi M. et al. In vitro biological evaluation of novel 7-O-dialkylaminoalkyl cytotoxic pectolinarigenin derivatives against a panel of human cancer cell lines // Bioorg Med Chem Lett. – 2008. – V. 18. - P. 5431–5434. 22. Boros C. A., Stermitz F. R. Iridoids. An updated review. Part II. // J. Nat. Prod. – 1990. - V. 53. – P. 1055–1147. 23. Chen K. et al. Deepsequencing of the ancestral tobacco species Nicotiana tomentosiformis reveals multiple T-DNA inserts and a complex evolutionary history of natural transformation in the genus Nicotiana // Plant J. 2014. – V. 80. ; № 4. – P. 669–682. 24. Cheriet T. et al. Chemical constituents and biological activities of the genus Linaria (Scrophulariaceae) // Natural Product Research. – 2015. – Vol. 29 ; № 17. – P. 1589– 1613. 25. Chilton M. D. et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis // Cell. – 1977. – V. 11 ; № 2. – P. 26371. 26. Degot A.V. et al. Study of Linaria macroura // Chem. Nat. Comp. –1983. –№ 3. – P. 388–389. 27. Dolnik C. et al. Neophytic Coripsermum pallasii (Stev.) (Chenopodiaceae) invading migrating dunes of the southern coast of the Baltic sea // Pol. J. Ecol. – 2011. – № 59(1). – Р. 95-103. 28. El-Naggar L. J., Beal J. L. Iridoids. An updated review. Part I. // J. Nat. Prod. – 1980. – V. 43. – P. 649–707. 29. Ercil D., Sakar M. K. Chemical constituents of Linaria aucheri // Turk. J. Chem. 2004. - V. 28. - P. 133–139. 46

30. Esposito P., Scarpati M. L. Iridoids. IX. 10-O-b-glucosylaucubin from Linaria vulgaris // Gazz Chim Ital. - 1970. – V. 100. - P. 836–845. Italian. 31. Feliciano A.S. et al. Neoclerodane diterpenoids from roots of Linaria saxatilis var glutinosa // Phytochem. –1993. – V. 33 ; № 3. м P. 631–633. 32. Fernandez-Mazuecos M., Vargas P. Historical Isolation versus Recent LongDistance Connections between Europe and Africa in Bifid Toadflaxes (Linaria sect. Versicolores) // Plos One. – 2011. – V. 6. – e22234. 33. Flores H. E., Hoy M.W., Pickard J. J. Secondary metabolites from root cultures // Trends Biotechnol. – 1987. – V. 5 ; № 3. – P. 64−69. 34. Furner I. J. An Agrobacterium transformation in the evolution of the genus Nicotiana // Nature. - 1986. – V. 319. ; № 6052. – P. 422–427. 35. Gelvin S. B. Chemical signaling between Agrobacterium and its host plant // Molecular signals in plant-microbe communications / Ed. Verma D.P.S. – 1992. – P. 137−167. 36. Gonuz A, Dujger B, Kargioglu M. The morphological, anatomical properties and antimicrobial activity of endemic Linaria corifolia Desf. (Scrophulariaceae) in Turkey // Pak J Biol Sci. – 2005. – V. 8. – P. 220–226. 37. Gordaliza M et al. Cytotoxic activity of neo-clerodane diterpenoids // Bioorg Med Chem Lett. – 1997. – V. 7. – P. 1649–1654. 38. Harborne J. B., Valdes B. Identification of scutellarein 40-methyl ether in Linaria aeruginea // Phytochem. Rev. – 1971. – V. 10. – P. 2850–2851. 39. Hong S. B. et al. A T-DNA gene required for agropine biosynthesis by transformed plants is functionally and evolutionary related to a Ti plasmid gene required for catabolism by Agrobacterium strains // J. Bacteriol. – 1997. – V. 179. – P. 4831−4840. 40. Hsu K. J. et al. History of the Mediterranean salinity crisis // Nature. – 1977. – V. 267. – P. 399–403. 41. Hua H, Sun J, Li X. [Flavonoids from yellow toadflax (Linaria vulgaris)]. // Chin Tradit Herb Drugs. – 1999. – V. 30. – P 332–334. Chinese. 47

42. Intrieri M. C., Buiatti M. The horizontal transfer of Agrobacterium rhizogenes genes and the evolution of the genus Nicotiana // Mol. Phylogenet. Evol. – 2001. – V. 20. – P. 100–110. 43. Janakat S., Al-Merie H. Evaluation of hepatoprotective effect of Pistacia lentiscus, Phillyrea latifolia and Nicotiana glauca // J. Ethnopharmacol. – 2002. – V. 83 ; № 1−2. – P. 135−138. 44. Jung U.S. et al.. Cosmetic composition containing Linaria japonica extract with antioxidant and antiinflammatory effects. – Repub Korea, 2007. – 782972 B1 1207. Korean. 45. Kelemen L, Scedo C. Data about the polyphenol content of Linaria vulgaris Mill species // Note I. Farmacia (Bucharest, Romania). – 2003. – V. 51. – P. 86–89. 46. Kitagawa I, et al. On the constituents of Linaria japonica Miq. II. The structure of linaridial, a new cis-clerodane-type diterpene dialdehyde // Chem. Pharm. Bull. – 1976. – V. 24 ; № 2. – P. 294–302. 47. Kitagawa I., Yoshihara M., Kamigauchi T. Linarienone, a newcis-clerodane-type diteppene from the subterranean part of Linaria japonica Miq. // Tetrahedron Lett. – 1977. – V. 14. – P. 1221–1224. 48. Kitagawa I., Yoshihara M., Tani T., Yosioka I. Linaridial, a new cis-clerodane-type diterpene dialdehyde, fromLinaria japonica Miq. // Tetrahedron Lett. – 1975. – V. 1. – P. 23–26. 49. Kuang K. R., Lu A. M. Flora of China. - Beijing, China // Beijing Science and Technology Press. – 2005. – V. 67. 50. Kuptsova L. P., Ban’kovskii A. I. A new flavonoid fromsome species of toadflax // Khim. Prir. Soedin. – 1970. – V. 6 ; № 1. – P. 128–129. 51. Kyndt T. et al. The genome of cultivated sweet potato contains Agrobacterium TDNAs with expressed genes: An example of a naturally transgenic food crop // P. Natl. Acad. Sci. USA. – 2015. – V. 112. ; № 18. – P. 5844−5849. 48

52. Marak H. B., Biere A., Van Damme J. M. M. Two herbivore-deterrent iridoid glycosides reduce the in vitro growth of a specialist but not of a generalist pathogenic fungus of Plantago lanceolata L. // Chemoecol. – 2002. – V. 12. – P. 185–192. 53. Marak H. B., Biere A., Van Damme J. M. M. Systemic, genotype-specific induction of two herbivore-deterrent iridoid glycosides in Plantago lanceolata L. in response to fungal infection by Diaporthe adunca (Rob.) Niessel. // J. Chem. Ecol. – 2002. – V. 28 ; № 12. – P. 2429–2448. 54. Maron J. L. et al. Invasive plants escape from suppressive soil biota at regional scales // J. Ecol. – 2014. – V. 102. – P. 19-27. 55. Matveeva T., Sokornova S. Agrobacterium rhizogenes Mediated Transformation of Plants for Improvement of Yields of Secondary Metabolites // Reference Series in Phytochemistry. Bioprocessing of Plant in vitro Systems / Eds. Pavlov A., Bley T. – Springer, 2016. – P. 1−42. 56. Matveeva T.V. et al. Horizontal gene transfer from genus Agrobacterium to the plant Linaria in nature // Mol. Plant. Microbe Interact. – 2012. – V. 25. – P. 1542–1551. 57. Matveeva T.V. Naturally transgenic plants as a model for the study of the delayed environmental risks of GMO cultivation // Russ. J. Genet. – 2016. – V. 6 ; № 6. – P. 698–704. 58. Matveeva T. V., Kosachev P. A. Sequences homologous to Agrobacterium rhizogenes rolC in the genome of Linaria acutiloba // International conference on frontiers of environment, energy and bioscience (ICFEEB 2013) / Ed. Zheng D. – Lancaster, DES tech Publications Inc., 2013. – P. 541–546. 59. Matveeva T. V., Lutova L. A. Horizontal gene transfer from Agrobacterium to plants // Front. Plant. Sci. – 2014. – V. 5. – P. 326. 60. Matveeva T. V., Sokornova S. V., Lutova L. A. Influence of Agrobacterium oncogenes on secondary metabolism of plants // Phytochem. Rev. – 2015. – V. 14. – P. 541. 49

61. Mohajjel-Shoja H. et al. Biological activity of the Agrobacterium rhizogenes-derived trolC gene of Nicotiana tabacum and its functional relation to other plast genes // Mol. Plant. Microbe Interact. – 2011. – V. 24 ; № 1. – P. 44–53. 62. Nicoletti M. et al. A chemosystematic study of Scrophulariaceae iridoid glycosides // G. Bot. Ital. – 1988. – V. 122 ; № 1–2. – P. 13–24. 63. Nikolova-Damyanova B. et al. Quantitative thin layer chromatography of iridoid and flavonoid glucosides in species of Linaria Phytochem Anal. – 1994. – № 5. – Р. 3840. 64. Oinonen P.P. et al. Linarin, a selective acetylcholinesterase inhibitor from Mentha arvensis // Fitoterapia. – 2006. – V. 77. – P. 429–434. 65. Otten L. et al. Mendelian transmission of genes introduced into plants by the Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens // MGG. – 1981. – V. 183 ; № 2. – P. 209– 213. 66. Rao S. R., Ravishankar G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. // Biotechnol Adv. – 2002. – V. 20. – P. 101–153. 67. Rhodes M. J. C. et al. Secondary product formation using Agrobacterium rhizogenes-transformed “hairy root” cultures // News Lett. – 1987. – V. 53. – P. 2−15. 68. Sampaio-Santos M. I., Kaplan M. A. C. Biosynthesis significance of iridoids in chemosystematics // J. Braz. Chem. Soc. – 2001. – V. 12 ; № 2. – P. 144−153. 69. Schmulling T. et al. Hormonal content and sensitivity of transgenic tobacco and potato plants expressing single rol genes of Agrobacterium rhizogenes T-DNA // Plant J. – 1993. – P. 371−382. 70. Smirnova I. P. et al. Structure of acetylpectolinarin, a newacylated flavonoid from plants of the genus Linaria // Chem. Nat. Comput. – 1974. – V. 10. ; № 3. – P. 320. 71. Sticher O. Plant monoterpenoids diterpenoids and sesquiterpenoids with pharmacological or therapeutical activity // New natural products and plant drugs with pharmacological, biological or therapeutical activity / Eds. Wagner H, Wolff P. – Berlin: Springer, 1977. – P. 148. 50

72. Stojanov N. Our Medicinal Plants, Part II / Ed. Stojanov N. - Sofia: Nauka i Iskustvo, 1973. - 99 p. 73. Suzuki K., Yamashita I., Tanaka N. Tobacco plants were transformed by Agrobacterium rhizogenes infection during their evolution // Plant J. – 2002. –V. 32. – № 5. – P. 775–787. 74. Tundis R. et al. Iridoid glycosides from Linaria multicaulis (L.) Miller subsp. multicaulis (Scrophulariaceae) // Biochem Syst Ecol. – 2008. – V. 36. – P. 142–145. 75. Tundis R. et al. Potential antitumor agents: flavones and their derivatives from Linaria reflexa Desf. Bioorg // Med Chem Lett. – 2005. – V. 15. – P. 4757–4760. 76. Vain P. Thirty years of plant transformation technologydevelopment // Plant Biotechnol. J. – 2007. – V. 5. – P. 221–229. 77. Venditti A., Serrilli A. M., Di Cecco M. Phytochemical analysis of Plantago sempervirens from Majella National Park // Nat. prod. res. – 2012. – V. 26. ; № 2. – P. 2035−2039. 78. Vrchovska V. Assessing the antioxidative properties and chemical composition of Linaria vulgaris infusion // Nat Prod Res. – 2008. – V. 22. – P. 735–746. 79. White F.F. et al. Sequence homologous to Agrobacterium rhizogenes T-DNA in the genomes of uninfected plants // Nature. – 1983. – V. 301. – P. 348–350. 80. Widhalm J. R., Rhodes D. Biosynthesis and molecular actions of specialized 1,4naphthoquinone natural products produced by horticultural plants // Horticulture Research. – 2016. – V. 3. – P. 16046. 81. Воинов Н. А., Волова Т. Г. Трансгенные растения и животные как биореакторы // MEDBE.RU. – 2017. – 27 дек. – URL: http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/transgennye-rasteniyai-zhivotnye-kak-bioreaktory/?PAGEN_2=2 (дата обращения: 22.04.2018). 82. Льнянка обыкновенная (Дикий лен : [Электронный ресурс] : Linaria vulgaris // U-LEKAR.RU. – Режим доступа: http://www.u-lekar.ru/content/view/649/2/ (дата обращения: 25.04.2018). 51

83. Сокорнова C. В. и др. Микобиота растений рода Linaria, содержащих в геноме клT-ДНК [Электронный ресурс] // ResearchGate. – 2015. – май. – URL: https://www.researchgate.net/publication/268745875_MIKOBIOTA_RASTENIJ_R ODA_LINARIA_SODERZASIH_V_GENOME_klT-DNK (дата обращения: 25.04.2018). 84. Эндокринол крем-гель [Электронный ресурс] // Эвалар : [официальный сайт компании]. – URL: https://shop.evalar.ru/catalog/item/endokrinol-krem-gel/ (дата обращения: 20.03.2018). 85. ISAAA: / International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications. – 2018. – URL: http://www.isaaa.org/ (дата обращения: 15.03.2018). 86. Linaria algarviana Chav // FLORA-ON / Sociedade Portuguesa de Botânica. – 2012-2018. – URL: http//flora-on.pt/(дата обращения: 17.03.2018). 87. Mascenko, N. et al. Specific Action Of Iridoid Glycosides From Linaria Vulgaris Mill. Depending On The Species // Agrobiodiversity for Improving Nutrition, Health and Life Quality. – 2017. – № 1. – URL: http://agrobiodiversity.uniag.sk/scientificpapers/article/view/94 (дата обращения: 22.04.2018). 52

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

0.5

Артём Дысин

В своем исследовании диссертант затрагивает целый ряд вопросов, актуальных в таких областях, как генетика и биохимия растений. Во-первых, подробно рассмотрены вторичные метаболиты растений рода Linaria, различающихся по содержанию Т-ДНК. Во-вторых, изучена биологическая активность, которой обладают данные метаболиты. Таким образом, диссертация отвечает требованиям, предъявляемым к докторским диссертациям, а автор заслуживает присуждения ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.01.06 — Биотехнология.

Артем Потапов

Работа выполнена качественно, грамотно проведены все исследования. Подробно описаны биологически активные соединения трансгенных растений. Исследования в области трансгенных растений актуальны в современном мире и помогут решить многие задачи как в биологии, так и в медицине. С ув. выпускник магистратуры биотехнологии САФУ