Дизайн биосенсора нуклеиновых кислот на основе двух dCas9 белков

Для диагностики многих болезней человека, животных и растений, мониторинга окружающей среды необходимы высокочувствительные, специфичные, быстрые и простые в использовании диагностические методы детекции нуклеиновых кислот патогенов. Альтернативой методу полимеразной цепной реакции, который требует дорогостоящего лабораторного оборудования, являются подходы, основанные на использовании естественной способности бактериальных CRISPR/Cas9-систем к узнаванию последовательностей ДНК с высокой специфичностью в изотермических условиях. Разработка методов регистрации сигнала при образовании комплекса ДНК/РНК/Cas9-белок является отдельной биоинженерной задачей. В данной работе был разработан дизайн и исследована применимость биосенсорной системы, основанной на связывании двух dCas9-белков с целевыми последовательностями ДНК (без их разрезания) и детекции их солокализации с помощью репортерных систем на основе сплит-ферментов. Методами молекулярного моделирования определены возможные взаимные расположения двух dCas9-белков на детектируемом локусе геномной ДНК, позволяющие оптимальным образом взаимодействовать присоединенным к ним доменам сплит-ферментов. Определены оптимальные расстояния на ДНК между сайтами связывания dCas9-белков в различной ориентации, смоделирована зависимость структуры комплекса от расстояния между сайтами связывания dCas9-белков. Результаты работы свидетельствуют о принципиальной возможности создания высокоспецифичных биосенсоров нуклеиновых кислот на основе комбинации технологий CRISPR/Cas9 и сплит-ферментов.