Формирование консорциума микроорганизмов для деструкции лигнинсодерожащего сырья

Александра Арбатская

Формирование консорциума микроорганизмов для деструкции лигнинсодерожащего сырья

Составлен аналитический обзор литературы по способам деструкции лигнинсодержащего сырья и исследованы физиолого-биохимические свойства микроорганизмов-деструкторов лигнина. Произведен расчет материального баланса, выполнены технологические расчеты. Составлена технологическая схема. Были выделены 8 штаммов микроорганизмов, определены их культуральные, тинкториальные, морфологические и физиолого-биохимические свойства. Определена ферментативная активность и биосовместимость чистых культур. На основании полученных результатов исследования предложены варианты консорциумов микроорганизмов для деструкции лигнинсодержащего сырья. Разработана технология производства биопрепарата, способствующего деструкции лигнинсодержащего сырья, предложены мероприятия по обеспечению безопасности в микробиологической лаборатории. Технико-экономические расчеты показали, что рентабельность производства составляет 27,17%, при капитальных вложениях равных 16809825 рублей, окупаемость производства составляет 5,3 года.

Биотехнология

Дипломы

Вуз: Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления (ВСГТУ)

ID: 5f3f2860cd3d3e000153d06c

UUID: 9a4aea90-c57e-0138-1df9-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 196

14.02

Александра Арбатская

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 1,2 МБ

Поделиться работой

Содержание ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 4 ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.................................................................... 6 1.1 Биологические консорциумы .................................................................... 6 1.1.1 Естественные консорциумы микроорганизмов ................................ 6 1.1.2 Искусственные консорциумы микроорганизмов ............................ 10 1.2.2 Танины ................................................................................................. 13 1.2 Микроорганизмы-деструкторы лигнинсодержащего сырья ................ 14 1.2.1 Стрептомицеты ................................................................................... 15 1.2.2 Бактерии .............................................................................................. 16 1.2.3 Грибы мягкой гнили и другие микроскопические грибы .............. 17 1.2.4 Базидиомицеты – деструкторы лигнинсодержащего сырья .......... 19 1.2.5 Возбудители бурой гнили.................................................................. 19 1.2.6 Возбудители белой гнили .................................................................. 22 1.3 Роль ферментов в деструкции лигнина .................................................. 24 1.3.1 Лигнинпероксидаза ............................................................................ 25 1.3.2 Марганецпероксидаза ........................................................................ 26 1.3.3 Лакказа................................................................................................. 29 ГЛАВА 2 ПАТЕНТНО-ИНФОРМАЦИОННЫЙ ПОИСК ................................ 32 ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ................................................... 37 3.1 Объекты, материалы и методы исследования ....................................... 37 3.1.1 Объекты и материалы исследования ................................................ 37 3.1.2 Методы исследования ........................................................................ 38 3.2 Результаты и их обсуждение ................................................................... 40 3.2.1 Выделение чистых культур микроорганизмов, изучение их культуральных, тинкториальных и морфологических свойств ................. 40 3.2.2 Определение ферментативной активности...................................... 44 3.2.3 Молекулярно-генетическая идентификация штаммовдеструкторов .................................................................................................... 46 2

3.2.4 Определение биосовместимости микроорганизмов из почвы и разложившейся древесины и формирование консорциума микроорганизмов ............................................................................................ 48 ГЛАВА 4 Технологическая часть ..................................................................... 51 4.1 Характеристика готового продукта ........................................................ 51 4.2 Характеристика основного и вспомогательного сырья ........................ 51 4.3 Описание технологического процесса получения биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья ........................................................... 55 4.4 Расчет материального баланса ................................................................ 59 ГЛАВА 5 Экономика ......................................................................................... 60 5.1 Производственная программа ................................................................. 60 5.2 План материально-технического снабжения ......................................... 61 5.3 План по труду и заработной плате.......................................................... 63 5.4 Планирование издержек на производство и реализацию продукции . 65 5.5 Финансовый план ..................................................................................... 68 5.5.1 5.6 Планирование цен на продукцию ........................................................ 68 Планирование прибыли ........................................................................... 69 5.7 Расчет капитальных затрат и анализ экономической эффективности производства ....................................................................................................... 70 5.7.1 Расчет капитальных затрат на оборудование ..................................... 70 5.8 Сметно-финансовый расчет на строительные работы.......................... 71 5.9 Основные технико-экономические показатели бизнес-плана ............. 72 ГЛАВА 6 Безопасность жизнедеятельности ................................................... 74 6.1 Техника безопасности в лаборатории .................................................... 74 ВЫВОДЫ ............................................................................................................ 79 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ........................................ 81 3

ВВЕДЕНИЕ К настоящему времени существует проблема утилизации отходов целлюлозно-бумажной и деревоперерабатывающей промышленностей. Наибольший интерес вызывают, все же, пути деструкции лигнина и его производных. На сегодняшний день в России используется два пути утилизации лигнина: сжигание и вывоз на свалки, где он остается в неизменном состоянии десятилетиями. Естественный процесс разрушения лигнина сопровождается образованием веществ ароматической природы, таких как бензойная, ванилиновая, феруловая кислоты, соответствующих альдегидов и фенолов. Повышение концентрации этих соединений в почве приводит к изменению ее кислотности, разрушению питательных элементов, нарушению естественного биоценоза, и как следствие, снижению плодородности. Деструкция лигнина и его производных осуществляется в аэробных условиях под сегодняшний действием день в ферментных литературе систем описаны микроорганизмов. результаты На успешной биологической утилизации лигнина с помощью микроскопических грибов. Основным недостатком большинства исследований является низкая скорость разрушения макромолекул лигнина, поэтому использование этих методов в промышленных масштабах не представляется возможным. Использование биологического метода разрушения лигнина и его производных решит не только экологическую проблему, связанную с его утилизацией, но и позволит получить новые ценные продукты для использования их в сельском хозяйстве в качестве высокоэффективного биоудобрения. Целью данной работы является выделение микроорганизмов- деструкторов и формирование на их основе консорциума для эффективной утилизации лигнинсодержащего сырья. Задачи исследования: 4

1) Выделить из природных источников чистые культуры микроорганизмов-деструкторов, изучить их культуральные, тинкториальные, морфологические и физиолого-биохимические свойства, установить их ферментативную активность. 2) Провести молекулярно-генетическую идентификацию выделенных чистых культур микроорганизмов. 3) Установить биосовместимость выделенных микроорганизмов. 4) Сформировать предполагаемые варианты консорциумов микроорганизмов для утилизации лигнинсодержащего сырья. 5) Разработать технологическую схему производства биопрепарата для утилизации лигнинсодержащего сырья. 6) Рассчитать основные технико-экономические показатели. 5

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Биологические консорциумы 1.1.1 Естественные консорциумы микроорганизмов В естественных условиях микроорганизмы не существуют в виде чистых культур, а входят в сложное сообщество, которое представляет собой консорциум микроорганизмов различных систематических групп. Консорциум – это сообщество двух или более микроорганизмов, которое существует как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией. Учение о консорциумах было создано в 50-е годы XX в. ботаником Л.Г. Раменским и зоологом В.Н. Беклемишевым [8]. Естественные консорциумы представляют собой набор микроорганизмов, связанных между собой трофическими связями и занимающих определенные ниши в экосистеме. Система взаимодействия микроорганизмов также обусловлена последовательно протекающими химическими реакциями. К таким естественным консорциумам можно отнести почву и активный ил очистных сооружений. Почвенная микрофлора представляет сложную систему взаимодействия многих тысяч видов бактерий, грибов, простейших, водорослей и вирусов [4]. Русский микробиолог С.Н. Виноградский разделил микрофлору почвы на 2 группы: R-стратеги и K-стратеги. R-стратеги являются метаболически активными организмами, которые способны усваивать низкомолекулярные органические и неорганические соединения, а также использовать в качестве источника углерода высокомолекулярные органические соединения (белки, целлюлозу, липиды). К-стратеги обладают малой метаболической активностью, но способны к деструкции и синтезу гумусовых веществ – органических веществ почвы, 6

содержащих питательные вещества, необходимые для растений. Гумус представляет собой сложный комплекс из органических соединений – гуминовых кислот, фульвокислот, гумина и гиматомилановой кислоты [4]. По потребляемому субстрату почвенные микроорганизмы можно разделить на следующие группы: • деструкторы; • азотфиксирующие микроорганизмы; • хемоавтотрофы. Микроорганизмы-деструкторы (редуценты) – одна из самых многочисленных групп систематически разнообразных микроорганизмов, объединенных тем, что они разрушают органические соединения, попавшие в верхние слои почвы. Их основная роль – преобразование останков растений и животных в неорганические вещества. Среди микроорганизмов-редуцентов широко распространены рода Clostridium, Bacillus и Pseudomonas. Аэробные деструкторы обитают в основном в прикорневой области и области корней растений, а анаэробные и факультативно анаэробные деструкторы – в более глубоких слоях почв, куда плохо проникает кислород. Азотфиксация – это процесс восстановления молекулярного азота и включение его в состав биомассы прокариотическими микроорганизмами. Азотфиксаторы подразделяются на свободноживущие и симбиотические микроорганизмы. Свободноживущие микроорганизмы-азотфиксаторы также можно разделить на ассоциативные азотфиксаторы (бактерии рода Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus, Azospirillum, Arthrobacter, Enterobacter и др.) и микроорганизмы, способные свободно существовать в почве (бактерии рода Clostridium, Azotobacter, Beijerinckia и др.; азотфиксирующие фототрфоные бактерии, цианобактерии). Симбиотические микроорганизмы-азотфиксаторы способны фиксировать атмосферный азот только в симбиозе с высшими растениями 7

(бактерии рода Rhizobium, Mezorhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, Bradirhizobium)[2, 9]. Еще одна группа микроорганимов – хемоавтотрофы. Это организмы, питающиеся неорганическими веществами (серой S, сероводородом H2S, аммиаком NH3, железом Fe и др.). Представителями хемоавтотрофных микроорганизмов являются только бактерии, на сегодняшний день их подразделяют на 4 основные группы: • нитрифицирующие бактерии (используют энергию, образовавшуюся за счет окисления аммонийных солей NH4+ и аммиака NH3 сначала до нитритов NO2-, а затем до нитратов NO3-); • водородные бактерии (используют энергию, образовавшуюся за счет окисления молекулярного водорода H2); • серобактерии и тионовые бактерии (окисляют серу S и неорганические серосодержащие вещества (сульфаты SO42-, сульфиты SO32-, сульфиды S2-, тиосульфаты S2O32-) до серной кислоты H2SO4); • железобактерии (принимают участие в окислении железа двухвалентного Fe2+ до трехвалентного Fe3+). Также к хемоавтотрофным бактериям можно отнести недавно открытый микроорганизм Stibiobacter, способный окислять оксид сурьмы (III) Sb2O3 до оксида сурьмы (V) Sb2O5. Таким образом, консорциум почвенных микроорганизмов представляет собой систему, осуществляющую множество различных биохимических реакций, причем каждая из функциональных групп, входящих в консорциум имеет свое назначение. Еще одним из наиболее изученных естественных консорциумов можно считать активный ил очистных сооружений. Активный ил – это биологическая ассоциация, состоящая из бактерий, грибов, простейших, коловраток и дождевых червей. Активный ил основан на способности некоторых видов микроорганизмов, в определенных условиях использовать загрязняющие вещества в качестве источника 8

энергии. Множество микроорганизмов, составляющих активный ил очистных сооружений, находясь в сточной воде, поглощает загрязняющие вещества внутрь клетки, где они под действием ферментов подвергаются биохимическим превращениям [3]. В зависимости от состава сточной воды формируется микробиоценоз, в котором та или иная функциональная группа микроорганизмов может преобладать, а остальные только сопутствовать ей. Наиболее многочисленной группой в активном иле являются бактерии. В его состав могут входить следующие рода микроорганизмов: Actinomyces, Alcaligenes, Bacillus, Cellulomonas, Desulfotomaculum, Zoogloea, Flavobacterium, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Sarcina, Sphaerotilus, Beggiatoa, Thiothrix, Nitrosomonas, Nitrobacter, Thiobacillus, Ferrobacillus, Bdellovibrio и т.д. Формирование активного ила происходит с учетом вида загрязняющих веществ, входящих в состав сточных вод. Наиболее распространены бактерии рода Pseudomonas, их доля в активном иле составляет около 54%, далее Mycobacterium – около 11%, Bacterium – около 9% и Bacillus – около 8%. Данные рода микроорганизмов являются доминирующими, поскольку способны утилизировать широкий спектр загрязняющих веществ. На 1 г сухого вещества активного ила количество бактерий составляет 1*109 – 4*1010. Как правило, активный ил для очистки сточных вод различных очистных сооружений имеет схожий состав. Это обусловлено тем, что основным компонентом активного ила являются бактериальные клетки. Колебания видового состава активного могут происходить по следующим причинам: • отличие режимов процесса очистки сточных вод; • состав сточных вод; • концентрации загрязняющих веществ. 9

Организация трофической системы естественных консорциумов составлена таким образом, что для каждого вещества в системе имеется группа микроорганизмов, способных к его деструкции. На основе изучения природы загрязнителей, входящих в состав сточных вод, условий протекания процесса очистки, путей метаболизма микроорганизмов и их возможных симбиотических отношений можно создать искусственный консорциум, способный эффективно справляться с очисткой сточных вод. 1.1.2 Искусственные консорциумы микроорганизмов Для биологической очистки сточных вод на городских очистных сооружениях, а также на локальных очистных сооружениях различных предприятий, как правило, применяется активный ил, который формируется в зависимости от состава стоков. Поскольку эффективность таких биологических ассоциаций не всегда удовлетворительна, применяют специально подобранные культуры микроорганизмов, способных к более полной биоремедиации ксенобиотиков. Как правило, такие микроорганизмы выделяются из аборигенных сред, поскольку, они более приспособлены к условиям среды, на которой будет проводиться культивирование. Нередко используются и микроорганизмы из других источников [8]. Такой подход использования микроорганизмов также применяется для формирования консорциумов-биоремедиаторов почвы и получения органических удобрений. За последние 100 лет проводилось немало исследований в области биодеградации лигнинсодержащего сырья и отходов целлюлозно-бумажного производства. Предложено использование различных консорциумов, состоящих из штаммов микроскопических грибов, способных продуцировать лигнолитические ферменты (фенолоксидазы, пероксидазы, и другие вспомогательные ферменты) [2]. 10

Тем не менее, даже на сегодняшний день актуальной задачей является формирование такого консорциума микроорганизмов, который смог бы эффективно разрушать лигнинсодержащие вещества, получая при этом ценные продукты для разных отраслей промышленности (сельское хозяйство, строительство, производство пищевых продуктов и т.д.). Поскольку лигнин относится к группе полифенольных соединений, на первом этапе формирования консорциума микроорганизмов для разрушения лигнинсодержащего сырья необходимо изучить их химическую природу, типы связей в молекулах и пути их деструкции, как химической, так и ферментативной [9]. Рисунок 1 – Фрагмент макромолекулы лигнина Разрушение молекулы лигнина осуществляется путем разрыва химических связей. Это происходит при сближении молекулы фермента с макромолекулой лигнина. При воздействии лигнинразрушающих ферментов в молекуле лигнина уменьшается содержание гидроксильных групп, а содержание карбоксильных и карбонильных групп увеличивается. Также замечено, что содержание фенольных гидроксилов непостоянно: их количество может, как уменьшаться, так и увеличиться [12]. За счет ионного отщепления метильных заместителей увеличивается массовая доля кислорода, а также, соответственно, снижается содержание 11

метильных групп. Это обусловлено разрывом связей в пропановой цепи между β- и γ-углеродными атомами, и разрыва β-О-4 связи с фенилпропановыми участками лигнина. Далее происходит образование олиголигнолов и различных низкомолекулярных соединений за счет разрыва α-О-4, β-β, β-1, β-5 связей. Большинство образовавшихся олигомерных частиц содержат карбоксильные группы. За счет вовлечения в процесс деструкции лигнина перекиси водорода и свободных радикалов происходит разрыв эфирных связей в макромолекуле. Поскольку процесс протекает хаотично, разрушение лигнина имеет более глубокий характер [13]. В результате реакции поликонденсации и полимеризации часть лигнина образует высококонденсированную массу, устойчивую к действию грибных ферментов. Использование микроскопическими грибами моно и олиголигнолов в качестве субстрата возможно после расщепления бензольного кольца. Его разрыв катализируется группой ферментов диоксигеназы. Разрыв бензольного кольца может идти двумя путями: орторасщепление и мета-расщепление. Разрушение связи между двумя гидроксильными группами называется орто-расщепление, при этом образуется дикарбоновая кислота – цис,цисмуконовая. В результате разрыва ароматического кольца, происходящего возле гидроксилированного атома углерода (мета-расщепление), образуются полуальдегиды 2-гидроксимуконовой кислоты. Далее возможно образование различных продуктов промежуточного метаболизма: ацетата, фумарата, пирувата, сукцината и т.д. Разрушение гидролизом, макромолекулы диметилированием, лигнина также сопровождается декарбоксилированием, деструкцией боковых цепей, а также их окислением. В результате чего образуется целый комплекс химических соединений: ароматических кислот (феруловой, 12

ванилиновой, серенгиловой), соответствующих альдегидов, фенолов, катехинов и спиртов. Дальнейшее разрушение происходит вплоть до полной их минерализации [18, 10]. 1.2.2 Танины Танины являются еще одной группой полифенольных соединений растительного происхождения. Эти вещества сходны по своему химическому строению с лигнином, поэтому в научных исследованиях их нередко используют как модельный субстрат для изучения путей ферментативной деструкции лигнина. Согласно предполагаемому механизму разложения, танин под действием фермента танназы гидролизуется до катехина. Далее катехин разлагается на флороглюциновую и протокатеховую кислоты. Данная реакция катализируется ферментом катехолоксидазой. Деградация флороглюциновой кислоты протекает через образование флороглюцина, резорцина и гидроксигидрохинона. Гидроксигидрохинон расщепляется гидроксихиноном-1,2-диоксигеназой до образования малеилацетата. Это вещество преобразуется в 2-кетоадипат. Метаболизм протокатеховой кислоты протекает двумя различными путями. Эти пути, наконец, сходятся с образованием 2-кетоадипата. В первом типе пути протокатеховая кислота преобразуется в β-карбокси-цис,цис-муконат и преобразуется в 2-кетоадипат. На втором пути протокатеховая кислота преобразуется в катехол, который затем расщепляется для образования цис,цис-муконата и 2-кетоадипата. Далее 2-кетоадипат вступает в цикл трикарбоновых кислот, где преобразуется до ацетил-КоА (рис. 2) [13, 10]. 13

Рисунок 2 – Механизм деструкции танина 1.2 Микроорганизмы-деструкторы лигнинсодержащего сырья Деградация лигнина занимает центральное место в углеродном цикле Земли, так как большая часть возобновляемого углерода находится либо в лигнине, либо в соединениях защищенных лигнином от ферментативной деградации (целлюлоза и гемицеллюлоза). Биоразложение лигнина также является одной из основных причин разрушения древесины и может играть огромную роль в патогенезе растений. С другой стороны, имеет большой потенциал использование микроорганизмов, продуцирующих ферменты, способные катализировать деструкцию лигнина. Это может помочь технологиям переработки древесины стать более экологически чистыми [8]. Для дереворазрушающих микроорганизмов древесина может рассматриваться как ряд удобно ориентированных пор, окруженных субстратом. Форма, размер и ориентация пор напрямую зависят от анатомии 14

древесных пород, а также от химического состава клеточных мембран или содержимого клетки. Мягкая древесина (гимноспормы) формируется в основном трахеидами, просвет такой клетки полностью закрыт клеточной стенкой. Поэтому микроорганизмы должны проходить через клеточную стенку или мембрану поры. Твердая древесина (ангиоспермы) состоит из сосудов, волокон и паренхимических клеток, а также некоторых трахеидов. Грибковые гифы или бактерии, таким образом, могут перемещаться также без прохождения через клеточную стенку или мембрану поры. Компоненты гемицеллюлозы, а также лигнина заметно отличаются у пород мягкой и твердой видов древесины. Хвойная древесина содержит в основном глюкоманнаны, такие как гемицеллюлоза и гваяциловый (G) тип лигнина, в то время как лиственная древесина содержит глюкуроноксиланы и гваяцилсирингиловый (GS) тип лигнина. Заболонь содержит накопленные питательные вещества, такие как крахмал или липиды, хранящиеся в лучевых паренхиматозных клетках в дополнение к экстрактивным веществам, в то время как сердцевина содержит все больше и больше различных экстрактивных веществ (смолы) [8, 2]. Химически и морфологически различные типы распада возникают в результате атаки различных микроорганизмов. Грибы распада древесины обычно разделяются на три основные группы, вызывая белую, мягкую или бурую гниль. Сообщалось также о бактериальной деградации древесины, которая представляет собой эрозию, прокладку тоннелей и образование полостей [10]. 1.2.1 Стрептомицеты Некоторые бактерии способны к деструкции одеревеневших клеток растений. Известно, что нитевидные бактерии рода Streptomyces являются эффективными деструкторами лигнина. Они способны минерализировать до 15% нативного лигнина. Обычно Streptomyces разлагают лишь часть лигнина, 15

а конечным продуктом деструкции является водорастворимый кислотный осаждаемый лигнин. Присутствие фенолоксидаз и пероксидаз было обнаружено у S. cyaneus, причем их активность была в 100 раз выше, чем при окислении 2,4-дихлорфенола [1, 3]. Актиномицеты продуцируют внеклеточные пероксидазы, например, лигнинпероксидазы. Streptomyces sp. EC1 производят пероксидазы и внутриклеточные деметилазы на относительно высоких уровнях в присутствии нативного лигнина или пшеничной соломы. Внеклеточная пероксидазная и каталазная активности обнаружены также во многих штаммах актиномицетов. биодеградации Исследования образуются мономерные показали, что соединения – в результате ванильная и протокатеховая кислоты, что свидетельствует о расщеплении углеродуглеродных связей, а также о деметилировании и окислении атома углерода в боковой цепи до карбонильной группы [2]. 1.2.2 Бактерии На сегодняшний день возможность деградации лигнина бактериями мало изучена, тем не менее, в недавних публикациях сообщалось о способности к делигнификации некоторыми представителями родов Pseudomonas, Arthrobacterium, Xanthomonas, Aeromonas, Flavobacterium и Streptomyces. Считается, что Pseudomonas spp., являются наиболее эффективными деструкторами лигнина. В свою очередь нитчатые бактерии способны минерализировать лишь те части лигнина, которые имеют небольшой молекулярный вес. В ряде исследований было продемонстрировано использование щелочного лигнина из сульфатных сточных вод бактериями Pseudomonas, Corallina, Nocardia, Torula, однако до сих пор нет никаких исследований по деградации лигнина, которые могли бы быть проведены термофильными или анаэробными бактериями, поскольку процесс деструкции лигнина имеет окислительный характер и 16

осуществляется только в присутствии кислорода. Также известно, что Aeromonas spp. может использовать нативный лигнин в качестве единственного источника углерода и разлагать его до 98%. Известно также, что смешанные культуры цианобактерий способны разрушать лигнин из сточных вод целлюлозно-бумажных предприятий. В 1982 году американскими учеными было сделано заявление, что представители родов Pseudomonas, Nocardia и Corynebacterium способны расти на фенолах, связанных с лигнином, но не могут разлагать лигнин [8, 2, 6, 9]. 1.2.3 Грибы мягкой гнили и другие микроскопические грибы Аскомицеты и дейтеромицеты обычно вызывают распад при котором древесина становится мягкой и приобретает коричневую окраску. Описаны две формы мягкой гнили, тип I представляет собой состоящие из биконических или цилиндрических полостей, которые образуются во вторичных стенках, в то время как тип II относится к эрозионной форме разложения (Бланшет, 1995). В отличие от неизбирательных грибов белой гнили, межклеточная стенка не подвергается нападению грибов мягкой гнили типа II [1]. Ксиляриевые аскомицеты таких родов, как Daldinia, Hypoxylon и Xylaria раньше часто рассматривались как грибы белой гнили, но в настоящее время эти грибы сгруппированы в грибы мягкой гнили, так как они вызывают типичную мягкую гниль II типа. Они встречаются в основном на лиственных породах [14]. Высокая концентрация гваяциловых единиц в межклеточных стенках хвойной древесины может вызывать сопротивление распаду со стороны грибов мягкой гнили. Лигнинпероксидазы или лакказы могут не иметь окислительного потенциала для атаки на гваяцилового лигнина. С другой стороны, сирингиловый лигнин, по-видимому, легко окисляется и 17

минерализуется ферментами грибов мягкой гнили. К сожалению, лигнолитические ферменты ксиляриевых аскомицетов малоизвестны. Микроскопические грибы или плесень и некоторые аскомицеты, которые обычно считаются деструкторами углеводов в почве, лесной подстилке и компосте, также могут деградировать лигнин в этих средах. Так, некоторые микроскопические грибы способны минерализовать до 27% лигнина в травяных средах (Трояновский, 1980). Хотя актиномицеты были преобладающими среди 82 штаммов, отобранных в ходе скрининга на лигнолитические микроорганизмы в лесной почве, были также выявлены некоторые микроскопические грибы, например, Penicillium chrysogenum, Fusarium oxysporum и Fusarium solani (Родригез и др., 1996). За 28 суток эти грибы минерализовали 27,4%, 23,5% и 22,6% лигнина соответственно, приготовленного из измельченной пшеничной соломы. Однако лигнин, приготовленный из сосны, был гораздо менее подвержен деструкции, и уровень его минерализации составил менее 3%. Другие почвенные микроскопические грибы вида Fusarium proliferatum, минерализовала 10% лигнина в течение 30 суток.. В суспензии F. proliferatum были обнаружены лакказа и арил-спиртовая оксидаза, однако ни марганецпероксидаза, ни лигнинпероксидаза обнаружены не были Активность лакказы также описана в работе P. chrysogenum. Гриб минерализовал 7.9% лигнина за 29 суток. Была изучена деградация лигнина аскомицетом Chrysonilia sitophila, который является анаморфной стадией, в то время как ее телеморфная стадия - Neurospora sitophila (Родригез и др., 1997). Три изомера лигнинпероксидазы этого грибка были выделены и охарактеризованы. Активность фенолоксидаз, вероятно, лакказы, была признана стабильной, и грибок производит эту активность на питательных средах, содержащих хвойную древесину или лигносульфонат, марганецпероксидазы в этом грибке не обнаружено. C. sitophila вызвала потерю массы сосновой древесины на 20% в течение 3 месяцев, при этом потери углеводов и лигнина составили 18% и 25%, соответственно. Анализ 18

распавшегося лигнина показал, что во время распада лигнина имели место разрывы углерод-углеродных и β-O-ариловых связей. Внеклеточные пероксидазы и оксидазы, например, лакказа, также производятся другими микроскопическими грибами. Они могут быть не столь эффективны в окислении лигнина, как грибы белой гнили, но могут обладать особыми свойствами [17]. Thermoascus aurantiacus - это термофильный аскомицет, который обычно растет в отапливаемых частях древесной щепы в Скандинавии. Штамм T. aurantiacus, выделенный из эвкалиптовой древесины в Бразилии, разлагает экстракты эвкалиптовой массы и отбеливает эвкалиптовую целлюлозу. Этот штамм вырабатывает высокое содержание фенолоксидаз, которые имеют оптимальные значения рН в диапазоне от 2,6 до 3,0 и оптимальную температуру до 70-80°С [2]. 1.2.4 Базидиомицеты – деструкторы лигнинсодержащего сырья Самая многочисленная группа дереворазрушающих грибов – это базидиомицеты. На сегодняшний день насчитывается порядка 2000 видов грибов, способных разрушать древесину [1, 7]. Дереворазрушающие базидиомицеты обычно делятся на возбудителей бурой и белой гнили. Они таксономически тесно связаны между собой, их представителями могут быть как те, так и другие. Большинство древесных гнилостных грибов относятся к родам Agaricales и Aphyllophorales ( тип Basidiomycota) [14, 11]. 1.2.5 Возбудители бурой гнили Грибы бурой гнили в основном разлагают целлюлозу и гемицеллюлозу древесины, но также в небольшой степени имеют способность к деградации лигнина. Несмотря на большую практическую значимость, на сегодняшний 19

день они гораздо менее изучены, чем возбудители белой гнили. Древесина, которая поражена бурой гнилью, сжимается и, как правило, разбивается на фрагменты, которые легко превращаются в коричневый порошок. Коричневый цвет указывает на присутствие в древесине модифицированного лигнина, многие грибы бурой гнили, такие как Serpula lacrymans, Coniophora puteana, Meruliporia incrassata и Gloeophyllum являются trabeum, разрушителями древесины, используемой в строительстве. C. puteana и S. lacrymans, два наиболее вредоносных вида, встречающихся в древесине в регионах с умеренным климатом, предпочитают в качестве среды обитания хвойные породы деревьев. Грибковые гифы проникают из одной растительной клетки в другую через существующие поры в древесноклеточных стенках на ранней стадии процесса распада. Проникновение начинается с просвета ячейки, где гифы находятся в тесной связи со слоем S3. Считается, что в коричневой гнили процесс распада сначала влияет на слой S2 деревянной клеточной стенки (Эриксон и др., 1990) [13, 24]. Грибы бурой гнили обладают уникальным механизмом расщепления древесных полисахаридов. В отличие от грибов белой гнили, которые последовательно разрушают углеводы клеточной стенки только в той степени, в которой они используют продукты гидролиза в метаболизме грибов, грибы бурой гнили быстро деполимеризуют целлюлозу и гемицеллюлозу, а продукты распада накапливаются, так как грибок не использует промежуточные продукты в метаболизме [17]. В биотехнологии грибы бурой гнили используется в биоконверсии сосновых опилок для производства кормов для крупного рогатого скота, а также бурый модифицированный лигнин используется в качестве одного из основных компонентов клея – заменителя фенолформальдегидной смолы для ДСП. В некоторой степени грибы бурой гнили обладают такими же деградирующими свойствами и путями метаболизма, как и грибы белой гнили. Оба механизма распада древесины зависят от образования радикалов, 20

низкого pH и производства органических кислот. Они вызывают повышенную растворимость лигнина в щелочах, а распад усиливается высоким натяжением кислорода, что свидетельствует о важнейшем участии радикалов, особенно на ранних стадиях распада [2, 7]. В 1984 году группа американских ученых описала воспроизводство лигнинпероксидазы и марганецпероксидазы у гриба бурой гнили Polyporus ostreiformis, который удалял 18,6% лигнина из рисовой соломы за 21 сутки Также в 1996 году было обнаружено, что возбудители белой гнили способны продуцировать лакказу [21]. По аналогии с различными группами грибов белой гнили, использующими различные механизмы при разложении лигнина, грибы бурой гнили также обладают разными механизмами распада древесины. К первой группе можно отнести Gloeophyllum trabeum, а ко второй – Coniophora puteana и Poria placentatype. Среди грибов белой гнили наиболее изучен G. trabeum. Предполагается, что инициаторами распада как целлюлозы, так и лигнина являются соединения с небольшой молекулярной массой, которые могут легко диффундировать от гиф, проникая в клетку и начиная разрушать ее. Все модели, предложенные для объяснения механизмов разрушения древесины грибами бурой гнили, включают генерацию гидроксильных радикалов. Однако все предложенные модели не прошли полную экспериментальную проверку. Многие из этих низкомолекулярных массагентов были выделены из культур грибов белой и бурой гнили, что затрудняет понимание их специфической роли в распаде древесины грибами бурой гнили. Такими соединениями могут быть, например, фенолаты или другие типы железо-хелатных соединений, оксалаты и простые ароматические соединения. В некоторых грибах бурой гнили накапливается щавелевая кислота, вызывающая заметное снижение pH, но у G. trabeum, этого не наблюдалось, вероятно, из-за ферментов, разлагающих оксалаты (Шимада и др., 1997). 21

Предполагается, что эти грибы могут использовать щавелевую кислоту в качестве протонного донора при ферментативном и неферментативном гидролизе полисахаридов и в качестве хелатора системы Fe(II)-H2O2, генерирующей гидроксильные радикалы. Радикалы, образованные возбудителями бурой гнили, могут удалять метоксильные группы из лигнина и производить метанол, в результате чего они образуют остаток, состоящий в основном из модифицированного лигнина. Деметоксилирование метоксильных групп и ароматическое гидроксилирование приводят к увеличению фенольных гидроксильных групп, что делает лигнин более реакционноспособным. Присутствие карбоксильных и карбонильных групп также подтверждается повышенным содержанием кислорода [9]. Из опубликованных отчетов известно, что P. placenta способен вызывать деметоксилирование еловых лигнинов, увеличение ванильноподобных структур и α-карбонильных фрагментов, но доказательств открытия кольца не обнаружено. Березовая древесина деградировала подругому, и наиболее заметной реакцией было расщепление связей лигнина βO-4, а не деметоксилирование лигнина. Наличие древесной среды может оказывать существенное влияние на уровень деметоксилирования модельных соединений лигнина и лигнина грибами бурой гнили [21]. 1.2.6 Возбудители белой гнили Грибы белой гнили – организмы, способные эффективнее всего минерализировать лигнин. Они представляют собой гетерогенную группу грибов, классифицированных как базидиомицеты. Различные грибы белой гнили имеют разную эффективность в отношении деградации лигнина. Некоторые из них утилизируют лигнин быстрее, чем углеводы, по сравнению с исходным количеством каждого из них [13]. 22

Многие возбудители белой гнили колонизируют межклеточные стенки, вызывая их эрозию. В эродированных зонах по мере развития распада, образуются пустоты, заполненные мицелием. Этот тип гниения называется неизбирательным или одновременным гниением [18]. Trametes являются versicolor типичными возбудителями неизбирательного гниения. Некоторые грибы белой гнили преимущественно утилизируют лигнин без существенной потери целлюлозы, например, Phellinus nigrolimitatus. Существуют также грибы, способные вызывать оба вида гниения древесины. Типичными примерами таких грибов являются Ganoderma appanatum и Heterobasidion annosum. Поскольку грибы, избирательно разрушающие лигнин, считаются наиболее перспективными грибами для применения в целлюлозно-бумажной промышленности, их поиск вызвал значительный интерес. Однако соотношение лигнин- гемицеллюлоза-целлюлоза, при деструкции древесины выбранным грибком, может сильно отличаться, и даже различные штаммы одних и тех же видов, например, Phanerochaete chrysosporium и Ceriporiopsis subvermispora, могут вести себя по-разному на одном и том же виде древесины [13]. Было сделано несколько скрининговых исследований с целью выявления грибков, которые при определенных условиях избирательно разлагают лигнин в древесине или соломе. Такими селективными деструкторами лигнина являются, например, Phanerochaete chrysosporium, Ceriporiopsis subvermispora, Pycnoporus cinnabarinus, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Phlebia radiate, Phlebia tremellosus, Phlebia suberialis, Phellinus pini и Dichomitus squalens [14, 10]. Фундаментальные исследования деградации лигнина, например, его механизмов, физиологии, энзимологии и молекулярной биологии, в основном проводились с кортициоидным грибком P. chrysosporium. После более детального изучения таксономически различных грибов было выявлено, что как физиологические условия деградации лигнина, так и выраженные ферментные системы являются специфическими и отличаются 23

от тех, которые встречаются у P. chrysosporium. Различия могут быть связаны с таксономическим положением и/или экологией грибов, например, специализацией субстрата (лиственная древесина, хвойная древесина и т.д.), стадией разложения и т.д. Например, производство марганецпероксидазы (MnP) в среде с древесиной тополя было значительным у Ganoderma lucidum, но гриб не производил фермент в среде на основе сосновой древесины. Очевидно, что грибок имеет генетический потенциал для производства LiP, но лигнинпероксидазная активность не была обнаружена [27]. Лигнолитическая активность и ферменты грибов лесной подстилки были изучены в очень малой степени. В исследовании с некоторыми грибами, например, из родов Stropharia и Agrocybe, минерализация синтетического лигнина составила около половины уровня, полученного с обитающими в древесине грибами белой гнили. Основные лигнолитические ферменты грибов разлагающих, лесную подстилку, такие как Agaricus biosporus и Stropharia rugosoannulata – лакказа и марганецпероксидаза. В результате недавнего исследования, стало известно что, лакказа – единственный лигнинолитический фермент, продуцируемый Marasmius quercophilus [13]. 1.3 Роль ферментов в деструкции лигнина Ферменты, участвующие в процессе делигнификации были классифицированы на фенолоксидазы и пероксидазы. К фенолоксидазам относят лакказу и тирозиназу, а к пероксидазам – лигнинпероксидазу и марганецпероксидазу. Кроме того, в разложении лигнина участвуют некоторые вспомогательные ферменты, отвечающие за воспроизводство перекиси водорода (H2О2), необходимой для пероксидаз. К этим ферментам относят глиоксальоксидазу и глюкозо-1-оксидазу. Наряду с этими ферментами, активные формы кислорода также считаются важным агентом для гниения древесины. Образуются различные комбинации этих ферментов, 24

которые Ферменты, предполагают различные разрушающие лигнин, механизмы вызывают деградации окисление лигнина. фенольных соединений до фенольных радикалов, тогда как нефенольные соединения окисляются через катионные радикалы [9, 13]. 1.3.1 Лигнинпероксидаза Лигнинпероксидазы (LiP, ЕС 1.11.1.14) вырабатываются грибными культурами во время вторичного метаболизма при недостатке питательных веществ в среде. Впервые LiP были обнаружены в культуре Phanerochaete chrysosporium и с тех пор стали одними из наиболее изученных грибных пероксидаз. Из опубликованных отчетов известно, что лигнинпероксидазы вырабатываются многими грибками белой гнили, включая Phanerochaete flavidoalba, Bjerkandera sp. strain BOS55, Trametes, Phlebia tremellosa и Phlebia ochraceofulva. Несколько изоферментов были также обнаружены в культурах грибов Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Bjerkandera adusta и Phlebia radiate [30]. Существует несколько аспектов, влияющих на каталитическую активность и количество изоферментов лигнинпероксидаз, вырабатываемых Phanerochaete сhrysosporium: • штамм; • возраст культуры; • состав питательной среды; • метод культивирования. В процессе окисления модельных соединений лигнина лигнинпероксидазами активное участие принимает перекись водорода H2O2. LiP относительно неспецифичны и вступают в реакцию с широким спектром модельных соединений лигнина. LiP могут катализировать разрыв углеродуглеродных, β-O-4-арильных и других связей, имеющихся в лигнине и 25

модельных соединениях. При участии данного фермента также происходит расщепление боковых цепей, деметоксилирование, реакции разрыва бензольных колец и окислительное дехлорирование [22]. Механизм деполимеризации лигнина действием лигнинпероксидазы показан на рисунке 3. Рисунок 3 – Механизм действия лигнинпероксидазы 1.3.2 Марганецпероксидаза Марганецпероксидаза (MnP, ЕС 1.11.1.13) была обнаружена в P. chrysosporium в распространенной большинством 1984 году и по сей лигнинразрушающей грибов белой гнили. день считается пероксидазой, Данный наиболее продуцируемой фермент похож на лигнинпероксидазу: он внеклеточный и в качестве простетической группы имеет гликозилированное комплексное соединение порфирина с двухвалентным железом. Отличие MnP от LiP заключается в том, что в качестве специфического субстрата используется ионы Mn (II), а в качестве медиатора – ионы Mn(III). Помимо P. chrysosporium, марганецпероксидаза также была обнаружена во многих других базидиомицетах, например, T. versicolor, Panus tigrinus, Lentinula edodes, Ceriporiopsis subermispora, Pleurotus ostreatus, Agaricus bisporus, Stropharia rugosoannulata, Clitocybula dusenii. У MnP в реакциях восстановления донором электронов является Mn (II). Ионы Mn (III) стабилизируются до высоких окислительно26

восстановительных потенциалов путем хелатирования с органическими кислотами, такими как оксалат, малат, тартрат и лактат. Хелатированный Mn (III), в свою очередь, действует как высокореакционный окислительновосстановительный медиатор, который окисляет фенолы, некоторые метоксилированные ароматические вещества, органические кислоты и их производные. Цикл реакций схематически показан на рисунке 4 [19, 22]. Рисунок 4 – Схема механизма действия марганецпероксидазы Активность марганецпероксидазы может быть значительно усилена присутствием соответствующих аддитивных медиаторов, таких как тиолы или липиды, ненасыщенные жирные кислоты или их производные. В результате взаимодействия с данными веществами модифицированный фермент способен расщеплять химические связи, которые обычно недоступны для воздействия MnP (например, нефенольные арилэфиры, некоторые полициклические ароматические гидроуглероды). Было также показано, что MnP производит H2O2 путем окисления глутатиона и НАДН+, что свидетельствует о том, что марганецпероксидаза способна эффективно катализировать реакции без внесения перекиси 27

водорода извне. Также испанскими учеными было обнаружено, что существуют гибридные формы MnP и LiP, которые окисляют как Mn(II), так и нефенольные ароматические соединения [23]. Марганецпероксидаза успешно используется в исследованиях деполимеризации лигнита. Виллман и Факусса доказали способность штамма-продуцента MnP разрушать угольные гуминовых кислот. Наилучшая деполимеризация наблюдалась при концентрации макромолекул лигнита 0,5 г/л. Ферментативный анализ показал, наличие марганецпероксидазной активности, индуцированной добавлением угольных гуминовых кислот. Активность лигнинпероксидаз и лакказ не наблюдалась. В экспериментах базидиомицетов деполимеризовали in Nematoloma гуминовые vivo Mn(II)-индуцированные frowardii и вещества, Clitocybula образуя dusenii культуры быстро низкомолекулярные фульвокислоты. При дозированном добавлении в течение 1 недели было утилизировано до 2 г/л угольных гуминовых кислот. После того как в культуральную жидкость были внесены гуминовые вещества, активность марганецпероксидазы заметно возрастала, что свидетельствует об индуктивном эффекте для угольных гуминовых веществ и вовлечении MnP в процесс деполимеризации. Также сообщается о способности MnP окислять и деполимеризовать нативный и синтетический лигнин. Известно, что некоторые семейства базидиомицетов, такие как Meruliaceae, Polyporaceae, Coriolaceae, Tricholomataceae и Strophariaceae выделяют MnP. Выделение марганецпероксидазы происходит в условиях минимального количества азотсодержащих соединений. Действие фермента марганецпероксидазы начинается со связывания перекиси водорода H 2О2 с нативным железосодержащим ферментом, в результате чего образуется железо-пероксидный комплекс [22]. 28

1.3.3 Лакказа Лакказа (пара-дифенол оксидаза, пара-бензендиол:кислород оксидоредуктаза, EC 1.10.3.2) – еще один из наиболее распространенных ферментов, участвующих в процессах утилизации лигнина, продуцируемый почти всеми лигнолитическими грибами (например Trametes versicolor, Phlebia radiata, Pycnoporus cinnabarinus, Nematoloma frowardii), а также многими микрсокопическими грибами и высшими растениями (например, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Nicotiana tabacum, Acer pseudoplatanus) [26]. Лакказа – гликозилированный высоковариабельный белок, который экспрессируется во множественных формах. Фермент окисляет различные соединения, одновременно восстанавливая O2 до H2O (рис. 4). У данного фермента нет ярко выраженной субстратной специфичности. Лакказы могут катализировать модификацию замещенных моно-, ди- и полифенольных соединений. Активный центр фермента содержит четыре иона меди (Cu2+) и поэтому пара-дифенол оксидаза относится к семейству медьсодержащих оксидаз. Действие лакказы на ароматические фенольные соединения приводит к образованию феноксидных радикалов, которые легко поддаются к реакциям без участия ферментов, таким как диспропорционирование, нуклеофильная атака молекулами H2O и депротонирование. В конечном итоге данные реакции приводят к деполимеризации, алкил-ариловому расщеплению, Cα-окислению или деметоксилированию фенольного восстановителя [29]. Рисунок 4 – Механизм действия лакказы 29

Лакказа гриба T. versicolor может окислить нефенольные ароматические вещества (например, модельные димеры β-О-4 лигнина) в присутствии соответствующих медиаторов (например, сиреневый альдегид), что является сходным с лигнинпероксидазой. В присутствии грибкового метаболита P. cinnabarinus также наблюдалась эфирная деполимеризация высокомолекулярного синтетического лигнина (Эггерт и др. 1996). Однако помимо деполимеризации макромолекулярного субстрата имела место димеризация 3-гидроксиантраниловой кислоты в результате чего снижалась эффективность окислительно-восстановительной пары лакказы/3- гидроксиантраниловой кислоты. Недавние успехи в деполимеризации лигнина лакказой и различными окислительно-восстановительными медиаторами делают не менее перспективными аналогичные исследования в области окислительно-восстановительной конверсии низкоуглеродистых бурых углей [2]. В более поздних исследованиях было доказано, что лакказы способны окислять нефенольные ароматические вещества (вератриловый спирт, β-O-4 лигнины) непосредственно в присутствии кислорода, но без какого-либо посреднического субстрата (Леонтьевский и др. 1997). Также показана способность T. versicolor продуцировать лакказу при ферментировании на гуминовых кислотах бурого угля, содержащих агар. Все эти данные указывают на существенную роль лакказы в утилизации лигнина и лигнита соответственно. Также помимо лакказы, к группе медьсодержащих фенолоксидаз относят тирозиназу (о-дифенол оксидазу). Этот фермент впервые был выделен из гриба Neurospora crassahas, который разрушал частицы макромолекул лигнита на агаре с образованием продуктов черного цвета. Очевидно, что эксперименты с грибной тиразиназой подтвердили эти результаты. Однако следует учитывать, что этот ферментный препарат получен из почвенного материала из гриба (Agaricus bisporus) и содержит 30

большое количество почвенных гуминовых веществ, которые мешают проведению испытаний по растворению [9]. Изучение литературных данных по ферментативной деструкции лигнина показало, что решением проблемы утилизации отходов целлюлознобумажной и деревоперерабатывающей промышленностей является создание эффективных консорциумов микроорганизмов. 31

ГЛАВА 2 ПАТЕНТНО-ИНФОРМАЦИОННЫЙ ПОИСК Согласно теме дипломной работы был проведен патентно- информационный поиск с помощью информационных ресурсов сайта www.findpatent.ru [31], системы поиска патентных документов «ESPACENET» www.worldwide.espacenet.com [32] и научной электронной библиотеки «Киберленинка» www.cyberleninka.ru [33]. Глубина патентного поиска составила 10 лет. Результаты патентно-информационного поиска, представлены в таблице 1. Таблица 1 – Патентно-информационный поиск Название 1 Способ переработки лигнина в жидкие углеводород ы (Дата публикации 20.01.2016) Страна поиска 2 Классификационный индекс 3 Россия Патент РФ № 2573405 Источник информации 4 Основное содержание 5 Предлагаемое изобретение предполагает переработку гидролизного лигнина в углеводороды. Для деструкции лигнина используются каталитические системы на основе металла (Pt, Pd, Ni, Fe), которые способны нагреваться под воздействием СВЧ излучения до высоких www.findpatent. температур. Смесь ru отходов деревоперерабатывающе й промышленности и катализатора нагревают до 250-340°С и обрабатывают СВЧ излучением. Длительность воздействия не превышала 30 минут. Результатом воздействия является продукт, основным компонентом которого является смесь жидких углеводородов. 32

Продолжение таблицы 1 1 2 3 Штамм Penicillium sizovae – деструктор лигнина древесины (Дата публикации 09.04.2019) Россия Патент РФ № 2684588 Способ получения комплексно го микробиоло гического препарата санитарногигиеническ ого назначения (Дата публикации 21.05.2018) Россия Патент РФ № 2654604 4 5 Авторами выделен штамм микромицета с высокой лигнолитической активностью по отношению к лигнинам www.findpatent. хвойной древесины. На ru 8 сутки культивирования микромицета Penicillium sizovae на древесных отходах убыль лигнина составила около 7,4% от массы среды. Данный комплексный биопрепарат получают путем твердофазной ферментации консорциума микроорганизмов на обработанном целлюлозолитическими ферментами свекловичном жоме. Процентное соотношение суспензий культур в консорциуме: Bacillus subtilis ВКПМ В8140 – 30%, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 – 5%, Bacillus licheniformis www.findpatent. ВКПМ В-4162 – 5%, ru Bacillus megaterium ВКПМ В-204 – 10%, Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5337 – 50%. Ферментацию проводят в течение 2-3 суток при 32-42°С. По окончанию культивирования смесь перемешивают и высушивают до содержания сухих веществ 90-92%. Полученный продукт измельчают, стандартизуют и фасуют. Использование данного продукта 33

Продолжение таблицы 1 1 2 3 Pretreatment method for improving biodegradati on effect of Chinese locust (Дата публикации 01.02.2019) Китай CN110283334A Россия Научная статья по специальности «Промышленные биотехнологии» в журнале Лесной вестник / Forestry bulletin (ВАК) Биодеградац ия древесины ферментны ми комплексам и дереворазру шающих грибов (Опубликов ана в 2019 году) 4 5 позволит повысить биологизацию сельскохозяйственного производства, снизить антропогенную нагрузку и повысить эффективность удобрений. Данный метод предварительной обработки гваяцилсирингилового лигнина предполагает его более эффективное разрушение. В результате химического воздействия на сырье растворами неорганических солей, гладкая и компактная www.worldwide структура .espacenet.com лигноцеллюлозы становится рыхлой и пористой, таким образом дальнейшее биологическое воздействие проходит легче, эффект биодеградации усиливается. Данное изобретение используется в области естественной деградации целлюлозы. Авторами выдвинуто предположение, что степень деструкции лигноцеллюлозы зависит от окличества накопленной пероксидазы, входящей www.cyberlenin в группу ka.ru лигнолитических ферментов дереворазрушающих грибов. Были изучены штаммы дереворазрушающих микромицетов в целях 34

Продолжение таблицы 1 1 Исследован ие природных изолятов микромицет ов Fusarium sp. – продуценто в лигнолитиче ских ферментов (Опубликов ана в 2017 году) 2 3 Россия Научная статья по специальности «Промышленная биотезнология» в журнале «Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки» (Scopus, BAK, CAS, ESCI, GeoRef) 4 5 выявления микроорганизмов с высоким и устойчивым уровнем содержания пероксидазы. Установлено, что лучшие результаты по накоплению пероксидазы наблюдались у Phellinus igniarius. Была получена биологически разрушенная древесина методом твердофазной ферментации. Авторами сделан вывод, что скорость прироста биомассы Phellinus igniarius коррелирует с содержанием полифенольных фрагментов и пероксидазы в полученном экстракте, а продукты деградации лигнина подавляют активность пероксидазы, подтверждая тем самым ее физиологическое значение при разрушении лигнина микромицетами. Из природных источников в Кировской области были выделены чистые культуры микромицетов Fusarium sp., способных к деструкции лигнина и www.cyberlenin продуцирующих ka.ru одновременно все основные лигнолитические фременты (марганецпероксидазу, лигнинпероксидазу, лакказу). 35

Продолжение таблицы 1 1 Исследован ие природных изолятов микромицет ов Fusarium sp. – продуценто в лигнолитиче ских ферментов (Опубликов ана в 2017 году) 2 3 Россия Научная статья по специальности «Промышленная биотехнология» в журнале «Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки» (Scopus, BAK, CAS, ESCI, GeoRef) 4 5 Была исследована динамика ферментативной активности в культуральной жидкости при глубинной ферментации микромицетов. Авторами сделаны выводы, что ферментативная активность выделенных штаммов-деструкторов лигнина превосходили www.cyberlenin базидиомицет ka.ru T.versicolor. Все микромицеты секретировали лигнолитические ферменты в культуральную среду с выходом ≈ 75,5-91,9%. Таким образом, показано, что представители микромицетов рода Fusarium являются перспективными продуцентами лигнинпероксидазы. Проанализировав результаты патентного поиска, можно сделать вывод, что на сегодняшний день данная область исследований малоизучена и является актуальной. Использование лигнолитических микроорганизмов имеет большой потенциал, как в промышленной, так и экологической биотехнологии и требует новых научных исследований в этой сфере. 36

ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1 Объекты, материалы и методы исследования 3.1.1 Объекты и материалы исследования В работе использовались пробы дерновой лесной почвы и древесины, подвергшиеся микробиологическому разрушению. Отбор проб проводили в августе 2018 года в Октябрьском районе г. Улан-Удэ (Республика Бурятия, Российская Федерация) По данным сайта www.world-weather.ru средняя дневная температура в этот период времени составила 25°С. Поэтому для выделения культур был выбран именно этот температурный режим. Почву отбирали из гумусового слоя, который представляет собой самый плодородный поверхностный слой темного цвета и характеризуется большим содержанием органических веществ. Древесина, взятая для исследований, была подвержена разрушению грибками белой гнили. Такой тип деструкции предполагает разрушение целлюлозы и лигнина, при этом пораженная древесина становится мягкой и волокнистой, легко крошится (рисунок 5). Рисунок 5 – Проба древесины, подвергшейся воздействию грибов белой гнили 37

В данной дипломной работе материалами исследования выступали чистые культуры бактерий и микроскопических грибов, выделенных из лесной почвы и разложившейся древесины. Для их выделения применялись следующие питательные среды: сусло-агар, Сабуро, Чапека и Чапека-Докса. Сусло для приготовления сусло-агара было предоставлено пивоваренным заводом «Даринское пиво» (г. Улан-Удэ, ул. Дальненагорная, 62). Для приготовления питательной среды сусло-агар смешивают 1 часть сусла и 3 части воды, к полученному раствору добавляют агар-агар в количестве 2% от объема среды. Далее суслоагар стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 ати в течение 20 минут. Для приготовления питательной среды Чапека использовали следующие реактивы: NaNO3 – 2 г/л, K2HPO4 – 1 г/л, MgSO4 – 0,5 г/л, KCl – 0,5 г/л, FeSO4 – 0,01 г/л, агар – 15 г/л, рН – 7,3 ±0,2. Для приготовления питательной среды Чапека-Докса. использовали следующие реактивы: сахароза – 30 г/л, NaNO3 – 2 г/л, K2HPO4 – 1 г/л, MgSO4 – 0,5 г/л, KCl – 0,5 г/л, FeSO4 – 0,01 г/л, агар – 15 г/л, рН – 7,3 ±0,2. 3.1.2 Методы исследования В ходе выполнения исследовательской работы были применены следующие стандартные микробиологические и физиолого-биохимические методы [20]: 1) Метод Коха. В основе метода лежит принцип, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. 2) Простое окрашивание раствором метиленового синего. С помощью данного метода можно определить форму, размер и расположение клеток микроорганизмов. 38

3) Окраска по Граму. Теоретически возможно разделение бактерий на две группы: грамположительные и грамотрицательные. 4) Окраска по Трухильо. Метод заключается в разделении бактерий на две группы: спорообразующие и не спорообразующие. 5) Определение лакказной активности микроорганизмов. Для определения используется плотная минеральная питательная среда Чапека с добавлением 0,5% танина. По окончанию инкубации о способности выделенных штаммов судили по потемнению питательной среды в области роста колоний. 6) Определение тирозиназной активности. Для определения используется плотная минеральная питательная среда Чапека с добавлением 0,2% тирозина. О наличии тирозиназной активности судили по появлению фиолетового окрашивания в области роста культуры. 7) Определение заключается в целлюлазной использовании активности. минеральной Метод определения питательной среды с добавлением фильтровальной бумаги как единственного источника углерода. 8) Определение амилолилитической активности. Метод определения заключается в использовании минеральной питательной среды Чапека с добавлением 1% водорастворимого крахмала как единственного источника углерода. 9) Определение каталазной активности. Метод основан на способности некоторых микроорганизмов продуцировать фермент каталазу, который катализирует реакцию разложения перекиси водорода. 10) Молекулярно-генетическая идентификация выделенных чистых культур микроорганизмов проводили методом стандартного секвенирования по Сэнгеру с использованием 16S праймеров 27F и 1492R. 11) Определение биосовместимости микроорганизмов. Метод основан на способности микроорганизмов сосуществовать в одной среде, при этом не подавляя рост друг друга. 39

3.2 Результаты и их обсуждение 3.2.1 Выделение чистых культур микроорганизмов, изучение их культуральных, тинкториальных и морфологических свойств Для выделения чистых культур-деструкторов лигнинсодержащего сырья использовали дерновую лесную почву и древесину, подвергшуюся микробиологическому разрушению грибами белой гнили. Выбор источников обусловлен тем, что в них содержится наибольшее число аборигенных видов культур, способных к деградации лигнина. Образцы почвы брали из 3 точек на площади 50 м2. Далее пробы перемешивали и отбирали среднюю почвенную пробу в количестве 10 г. В колбе на 250 мл получили суспензию путем перемешивания в течение 10 минут навески и 100 мл стерильной водопроводной воды. Далее делали десятикратные разведения (10-2 –10-6) полученной суспензии. Из полученных разведений делали посев на агаризованную питательную среду Сабуро методом Коха и инкубировали в термостате при температуре 25°С в течение 7 суток. Широкий интервал времени для инкубации взят в связи с тем, что у бактерий и грибов различная скорость роста, соответственно на протяжении всего времени культивирования может быть выделен широкий спектр микроорганизмов, но на 7 сутки рост замедлялся, что соответствует литературным данным. Пробы древесины, подверженной микробиологическому разрушению измельчали с помощью шпателя и помещали на поверхность агаризованной питательной среды в чашки Петри со средой Сабуро. Далее посевы помещали в термостат с температурой 25°С на 7 суток. Далее для культуральные, установления тинкториальные, родовой принадлежности морфологические, и изучали физиолого- биохимические свойства выделенных чистых культур микроорганизмов. 40

Было проведено описание характера роста выделенных колоний на питательной среде, их внешние признаки (цвет, размер, форма, консистенция, структура и т.д.). Для изучения микроорганизмов тинкториальных готовили мазки, и морфологических окрашенные по Граму, свойств препарат «раздавленная капля», а также при наличии бактериальных культур, проводили окрашивание по Трухильо для выявления способности к спорообразованию. В результате было выделено 8 культур микроорганизмов. Культуральные, тинкториальные и морфологические свойства выделенных культур были описаны и зафиксированы в таблице 2. Таблица 2 – Культуры микроорганизмов, выделенные из дерновой лесной почвы и разложившейся древесины № п/п 1 1 Шифр культуры 2 A22L 2 P2 3 G3 4 G1 Описание колоний Описание клеток 3 4 Мицелий очень ветвистый, состоит из гиф с перегородками. От мицелия вверх отходят конидиеносцы на которых расположены шаровидные экзоспоры, располагающиеся цепочкой. Грамположительные. Клетки палочковидные, расположены одиночно. По Граму окрашиваются негативно, спор не образуют. Подвижные. Клетки мелкие палочковидные, расположены одиночно, либо парами. Грамотрицательные. Неспорообразующие. Подвижные. Колонии округлые, размером 40-50 мм, по краям имеют белый бархатистый мицелий, центральная часть желтозеленая шерстистая. Колонии круглые, с ровными краями, диаметром 5-7 мм, выпуклые. На суслоагаре полупрозрачные, слизистые. На суслоагаре колонии мелкие, округлые с ровными краями, размером 1-2 мм. Полупрозрачные, слизистые. Колонии диаметром 60 мм, колонии белые, со временем приобретают желтый цвет. Поверхность колонии пушистая, профиль конусовидный. Мицелий разветвленный, состоит из септированных гифов, конидии округлые. Клетки грамположительные. 41

Продолжение таблицы 2 1 2 5 G25 6 8.1.1 7 8.1.2 8 A2TV 3 4 Мицелий ветвящийся и Крупные сине-зеленые переплетающиеся между собой. На колонии диаметром до 100 мм, концах гиф расположены цепочки спор. по краям белые. По Граму окрашиваются положительно. Мицелий сильно разветвлен. От концов Крупные колонии темногифов вверх отходят конидиеносцы на зеленого, почти черного цвета которых расположены шаровидные диаметром 50-70 мм. конидии. Клетки по Граму окрашиваются положительно. Колонии округлые размером Мицелий разветвленный, экзоспоры 10-20 мм зеленовато-серые, по продолговатые, цилиндрические, краям белые. Со временем образуют длинные цепочки. центр колонии розовеет. Колонии неправильной Мицелий сильно разветвленный. формы, размером 25-35 мм. Конидиеносцы также разветвленные, Поверхность колонии ровная, извилистые. Конидии элипсойдные. цвет ярко-зеленый. Из таблицы 2 видно, что предположительно штаммы A22 L, G1, G25, 8.1.1, 8.1.2 и A2TV относятся к микромицетам, а штаммы P2 и G3 к бактериям. Стоит отметить, что рост бактерий микроскопическими грибами не подавлялся. Также для предварительного установления родовой принадлежности выделенных культур дополнительно были определены амилолитическая и каталазная активности. Результаты исследования представлены в таблице 3. Таблица 3 – Способность выделенных штаммов продуцировать амилазы и каталазу № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 Штамм Каталазная активность Амилазная активность A22L P2 G3 G1 G25 8.1.1 8.1.2 A2TV + + + + + + + + + + + + 42

Из таблицы 3 видно, что каталазной активностью обладают штаммы A22L, P2, G3, 8.1.2 и A2TV. Амилолитической активностью обладают все штаммы, кроме G3. Согласно полученным данным по культуральным, тинкториальным морфологическим свойствам, а также по результатам проведения тестов на ферментативную активность, культуры A22L и G1 предположительно относятся к роду Aspergillus, культура 8.1.2. – к роду Penicillium и культура A2TV к роду Trichoderma. Родовую принадлежность культур P2, G25, G3 и 8.1.1 по полученным данным установить не удалось. На следующем этапе исследовательской работы был изучен характер роста культур на различных средах. Для изучения были взяты сусло-агар, среда Сабуро, среда Чапека и среда Чапека-Докса. Чтобы определить интенсивность роста культуры на всех средах проводили параллельно, при одинаковой температуре и в течение одного и того же времени. Оценку результатов проводили на 1, 3, 7 сутки инкубирования. Результаты представлены в таблице 4. Таблица 4 – Рост выделенных штаммов микроорганизмов на различных питательных средах Среда ЧапекаДокса Шифр 1 3 7 1 3 7 1 3 7 1 3 7 культур сутк сутк сутк сутк сутк сутк сутк сутк сутк сутк сутк сутк ы и и и и и и и и и и и и A22L + ++ ++ + ++ ++ + + + + + P2 + + + + + + G3 + + + + + + G1 + ++ ++ + ++ ++ + + + + G25 + ++ ++ + ++ + + 8.1.1 + ++ + ++ ++ + + + + 8.1.2 + ++ + ++ + + + + A2TV ++ ++ + ++ + + + + Примечание: оценка интенсивности роста: «-» – роста нет, «+» – рост только в Суслоагар Среда Сабуро Среда Чапека области проведения бактериологической петлей по штриху, «++» – рост на всей поверхности питательной среды (распространение спор микромицетов). 43

Из таблицы 4 видно, что наиболее предпочтительной питательной средой для выделенных штаммов является сусло-агар (интенсивный рост большинства из них наблюдался уже на 3 сутки культивирования. Это объясняется тем, что натуральные питательные среды наиболее богаты питательными веществами, по сравнению с синтетическими. Также отмечено, что бактериальные штаммы лучше растут только на сусло-агаре, на среде Сабуро рост бактерий также наблюдался, но был менее интенсивный. На средах Чапека и Чапека-Докса рост не наблюдался. Поэтому было принято решение, что для дальнейших исследований будет использоваться среда сусло-агар. 3.2.2 Определение ферментативной активности Далее для определения способности выделенных чистых культур утилизировать лигнинсодержащее сырье была определена лакказная, тирозиназная и целлюлазная активности. Для определения лакказной активности использовали агаризованную минеральную питательную среду с добавлением 0,5% танина. Культивирование проводили при температуре 25°С в течение 7 суток. По окончанию инкубации о способности выделенных штаммов судили по потемнению питательной среды в области роста колоний. Способность выделенных культур продуцировать тирозиназу проверяли на агаризованной минеральной питательной среде с добавлением 0,2% тирозина. Культивирование проводили при температуре 25°С в течение 7 суток. О наличии тирозиназной активности судили по появлению фиолетового окрашивания в области роста культуры. Целлюлазную активность для предполагаемых штаммов-деструкторов определяли на среде Солнцевой. В качестве единственного источника углерода использовали полоски фильтровальной бумаги, помещенные в пробирки с раствором минеральных солей. Предварительно фильтровальную 44

бумагу проверяли на отсутствие следов крахмала путем нанесения раствора Люголя. Посевной материал вносили бактериальной петлей в раствор солей. Культивирование проводили при температуре 25°С в течение 7 суток. Наличие целлюлазной активности определяли визуально, по появлению колоний на поверхности полосок фильтровальной бумаги на 7 сутки культивирования. В таблице 5 приведены результаты исследования ферментативной активности выделенных штаммов. Таблица 5 – Ферментативная активность чистых штаммов, выделенных из почвы и разложившейся древесины № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 Штамм A22L P2 G3 G1 G25 8.1.1 8.1.2 A2TV Лакказная активность + + + + Тирозиназная активность + - Целлюлазная активность + + + + Из таблицы 5 видно, что лакказную активность проявили культуры P2, G25, 8.1.1 и A2TV. Также стоит отметить, что наибольшая степень потемнения питательной среды наблюдалась у культуры P2. Тирозиназную активность проявила только культура 8.1.2, на 3 сутки культивирования было отмечено появление фиолетового окрашивания среды в области роста культуры. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что культуры P2, G25, 8.1.1, A2TV и 8.1.2 продуцируют фенолоксидазы, а это значит, что они предположительно способны деградировать лигнин. Дополнительно были проведены исследования по способности выделенных культур к деструкции целлюлозы. Из таблицы 3 видно, что целлюлозолитические ферменты способны продуцировать культуры G25, 8.1.1, 8.1.2 и A2TV. При формировании консорциума это является одним из 45

важных свойств микроорганизма-деструктора, потому что в лигнинсодержащем сырье, которое образуется на целлюлозно-бумажном и деревоперерабатывающем некоторое количество производствах, как целлюлозы, которую правило, содержится необходимо подвергнуть деструкции для эффективной биоремедиации. 3.2.3 Молекулярно-генетическая идентификация штаммов- деструкторов На данном этапе исследовательской работы выделенные культуры были отправлены на молекулярно-генетическую идентификацию в центр коллективного пользования ЦКП СО РАН «Геномика». Секвенограммы исследуемых образцов ДНК проанализированы на предмет гомологии/идентичности c помощью программы BLAST базы данных Gene Bank и классификатора базы 16S рибосомальных последовательностей – RDB. По результатам исследования рибосомальная последовательность у штамма P2 на 94% совпадает с Acromobacter spanius strain LMG 5911. На рисунках 6 и 7 представлены сшитая из секвенограмм последовательность образца и филогенетическое древо штамма. Рисунок 6 – Сшитая из секвенограмм последовательность образца культуры P2 46

Рисунок 7 – Филогенетическое древо штамма Acromobacter spanius strain LMG 5911 Штамм G3 на 100% совпадает с Pseudomonas lurida strain P513/18. На рисунках 8 и 9 представлены сшитая из секвенограмм последовательность образца и филогенетическое древо штамма. Рисунок 8 – Сшитая из секвенограмм последовательность образца культуры G3 47

Рисунок 9 – Филогенетическое древо штамма Pseudomonas lurida strain P513/18 По штаммам A22L, G1, G25, 8.1.1.,8.1.2 и A2TV планируется молекулярно-генетическая идентификация. 3.2.4 Определение биосовместимости микроорганизмов из почвы и разложившейся древесины и формирование консорциума микроорганизмов На следующем этапе выполнения исследовательской работы была проанализирована биосовместимость выделенных культур по отношению к друг другу. Для установления биосовместимости выделенных чистых культур микроорганизмов определяли их антагонистические отношения друг к другу. Для этого в пробирку с 9 мл физиологического раствора вносили 48

петлей культуру и 0,1 мл полученной суспензии засевали «газоном» на чашки Петри с питательной средой сусло-агар. Далее поверх засеянной культуры методом истончающего штриха засевали исследуемую культуру. Культивирование проводили при 25°С в течение 72 часов. По полученным данным можно судить о возможности формирования консорциума для разрушения лигнинсодержащего сырья с использованием выделенных штаммов микроорганизмов. Всего было проанализировано 56 вариантов взаимодействий между культурами. Биосовместимость чистых штаммов микроорганизмов оценивали по интенсивности роста культуры по штриху: «-» – отсутствие роста или образование зоны задержи роста, «+» – слабый рост (отмечен небольшой рост в начале штриха), «++» – средний рост (наличие единичных колоний по всему штриху), «+++» – хороший рост (сплошной рост по всему штриху, для культур микромицетов – спорообразование на всей поверхности агара в чашке Петри). В таблице 6 отражены результаты взаимодействия выделенных культур. Таблица 6 – Биологическая совместимость чистых культур микроорганизмов, выделенных из почвы и пораженной древесины Посев суспензии «газоном» Посев штрихом A22L P2 G3 G1 A22L +++ +++ +++ P2 +++ G3 + +++ + G1 +++ ++ +++ G25 +++ +++ 8.1.1 +++ +++ + 8.1.2 ++ +++ A2TV +++ +++ +++ ++ Примечание: оценку биосовместимости G25 8.1.1 8.1.2 A2TV +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ - +++ + + + - +++ ++ +++ чистых ++ +++ культур +++ микроорганизмов оценивали по интенсивности роста культуры по штриху: «-» – отсутствие роста или образование зоны задержи роста, «+» – слабый рост (отмечен небольшой рост в начале штриха), «++» – средний рост (наличие единичных колоний по всему штриху), «+++» – хороший рост (сплошной рост по всему штриху, для культур микромицетов – спорообразование на всей поверхности агара в чашке Петри). 49

Из таблицы 6 видно, что штаммы A22L, G1 и A2TV являются антагонистами по отношению к другим штаммам. У штаммов 8.1.1 и 8.1.2 рост не наблюдался. В результате были сформированы следующие пары биосовместимых штаммов: A22L+A2TV, A22L+G1, P2+G3, P2+G25, 8.1.1+G25, G25+G3, 8.1.1+G3, 8.1.2+G3, G25+8.1.1, 8.1.1+P2, 8.1.2+P2. На основании полученных результатов по ферментативной активности и биосовместимости (таблицы 5 и 6) предлагаются возможные варианты консорциумов микроорганизмов, представленных в таблице 7. Таблица 7 – Варианты консорциумов микроорганизмов для деструкции лигнинсодержащего сырья Консорциум Вариант №1 Вариант №2 Штаммы G3, G25, 8.1.1 и P2 G3, G25, 8.1.2 и P2 Сформированные консорциумы микроорганизмов, представленные в таблице 7 обладают наиболее широким спектром ферментативной активности, что предполагает их способность к эффективной деструкции лигнинсодержащего сырья. Консорциум вариант №1 обладает лакказной, целлюлазной, каталазной и амилолитической активностями, а консорциум вариант №2 помимо этого еще и тирозиназной активностью. 50

ГЛАВА 4 Технологическая часть 4.1 Характеристика готового продукта Биопрепарат для деструкции лигнинсодержащего сырья представляет собой жидкий микробиологический концентрат. Он содержит в себе специально отобранные микромицеты и бактерии из природных источников. Концентрация данного препарата составляет ≈ 1*107 КОЕ/мл. Препарат хранят в сухом, вентилируемом, защищенном от света помещении, при температуре от +5 до +25°С не более 6 месяцев. После вскрытия упаковки биопрепарат рекомендуется хранить в холодильнике. Область применения: очистка сточных вод, биоремедиация почвы, загрязненной лигнинсодержащими отходами. 4.2 Характеристика основного и вспомогательного сырья ГОСТ 5833-75 Реактивы. Сахароза. Технические условия. Сахароза представляет собой мелкокристаллический порошок белого цвета, хорошо растворимый в воде. Относительная молекулярная масса: 342,3. Эмпирическая формула: С6H12O6. Структурная формула представлена на рисунке 10. Рисунок 10 – Структурная формула молекулы сахарозы По физико-химическим показателям сахароза должна соответствовать нормам, указанным в таблице 8. 51

Таблица 8 – Физико-химические показатели сахарозы согласно ГОСТ Наименование показателя Цветность водного раствора Норма Химически чистый Чистый для (х.ч.) анализа (ч.д.а.) Должен выдерживать испытание по п.3.3 ГОСТ 5833-75 Массовая доля нерастворимых в воде веществ, %, не более Массовая доля остатка после прокаливания, %, не более Массовая доля кислот в пересчете на уксусную кислоту, %, не более Массовая доля сульфатов (SO4), %, не более Массовая доля хлоридов (Сl), %, не более Массовая доля железа (Fe), %, не более Массовая доля кальция (Са), %, не более Массовая доля тяжелых металлов (Рb), %, не более Массовая доля инвертированного сахара, %, не более 0,001 0,003 0,005 0,010 0,005 0,005 0,002 0,0005 0,00005 0,002 0,003 0,0010 0,00010 0,003 0,0001 0,0002 0,01 0,05 ОСТ 18-005-94 «Экстракт кукурузный сгущенный». Характеризуется следующими показателями, указанными в таблице 9. Таблица 9 – Нормативные показатели качества кукурузного экстракта Наименование показателя Внешний вид Цвет экстракта Содержание сухих веществ, %, не менее Золы (в % к сухому веществу), не более Сернистого ангидрида (в % к сухому веществу), не более Кислотность (в % молочной кислоты в пересчете на сухое вещество экстракта), не более Норма Непрозрачная жидкость с хлопьевидной взвесью, способная расслаиваться От желтого до темно-коричневого с характерным для кукурузы запахом 48 2 0,35 17 ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия. Однозамещенный фосфорнокислый калий представляет собой бесцветные кристаллы; растворим в воде; слабо гигроскопичен. Формула: KH2PO4. Относительная молекулярная масса: 136,09 г/моль. 52

По физико-химическим показателям однозамещенный фосфорнокислый калий должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 10. Таблица 10 – Физико-химические нормативные показатели для гидрофосфата калия однозамещенного согласно действующему ГОСТ Наименование показателя Массовая доля однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4 ), %, не менее Массовая доля не растворимых в воде веществ, %, не более Массовая доля потерь при высушивании, %, не более Массовая доля общего азота (N), %, не более Массовая доля сульфатов (SO4), %, не более Массовая доля хлоридов (Сl), %, не более Массовая доля железа (Fe), %, не более Массовая доля тяжелых металлов (Рb), %, не более Массовая доля мышьяка (As), %, не более химически чистый (х.ч.) Норма чистый для анализа (ч.д.а.) чистый (ч.) 99,5 99,0 98,0 0,002 0,005 0,01 0,2 0,5 1 0,001 0,001 0,002 0,002 0,005 0,01 0,0005 0,001 0,002 0,001 0,002 0,003 0,0005 0,001 0,001 0,0001 0,0002 0,0005 Массовая доля натрия (Na), %, не более 0,05 0,05 Массовая доля кальция (Са), %, не более pH раствора препарата с массовой долей 5% 0,005 0,01 4,4-4,7 4,4-4,7 Не нормируется 0,01 Не нормируется ГОСТ 4523-77 Магний сернокислый 7-водный. Технические условия. 7-водный сернокислый магний представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде; на воздухе выветривается. Формула: MgSO4*7H2O. Молекулярная масса: 246,46 г/моль. По химическим показателям 7-водный серно-кислый магний должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 11. 53

Таблица 11 – Нормативные показатели магния сернокислого 7водного согласно действующему ГОСТ Наименование показателя Химически чистый (х.ч.) Массовая доля 7-водного сернокислого магния (MgSO4 7H2O), %, не менее Массовая доля нерастворимых в воде веществ, %, не более Кислотность (H2SO4), %, не более Щелочность (MgO), %, не более Массовая доля нитратов (NО3), %, не более Массовая доля фосфатов (PO4), %, не более Массовая доля хлоридов (Сl2), %, не более Массовая доля аммонийных солей (NH4), %, не более Массовая доля железа (Fe), %, не более Массовая доля кальция (Са), %, не более Массовая доля марганца (Мn), %, не более Массовая доля тяжелых металлов (Pb), %, не более Массовая доля цинка (Zn), %, не более ГОСТ 30561-2013. Меласса Норма Чистый для анализа (ч.д.а.) Чистый (ч.) 99,5 99,5 99,0 0,002 0,002 0,002 0,002 0,001 0,002 0,001 0,001 0,002 0,002 0,001 Не нормируется 0,0005 0,0005 0,0005 0,0005 0,0020 0,0030 0,001 0,002 Не нормируется 0,0002 0,0003 0,0005 0,01 0,02 0,02 0,0005 0,0010 Не нормируется 0,0001 0,0001 0,0001 0,001 0,005 Не нормируется свекловичная. Мелассой называют последний маточный раствор – оттек, получающийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифугах. В мелассе содержатся несахара сока сахарной свеклы или сахарного тростника, не удаляемые при его химической очистке, и сахароза, которую выделять классическим методом кристаллизации уже экономически невыгодно. При выработке сахара из свеклы выход мелассы в расчете на безводную колеблется от 3,5 до 5 % от ее массы. С мелассой отходит от 10 до 15 % всего сахара, содержащегося в перерабатываемой свекле. 54

4.3 Описание технологического процесса получения биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья По результатам эксперимента были разработаны технологическая блоксхема (рис. 11) и аппаратурно-технологическая схема (рис. 12) производства биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья. Рисунок 11 – Технологическая блок-схема производства биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья 55

1 – резервуар для воды, 2 – дозатор сахарозы, 3 – дозатор кукурузного экстракта, 4 – дозатор гидрофосфата калия, 5 – дозатор сульфата магния, 6 – смеситель, 7 – стерилизатор, 8 – пластинчатый теплообменник, 9 – ферментер, 10 – дозатор свекловичной мелассы, 11 – дозатор гидрофосфата калия, 12 – дозатор сульфата магния, 13 – смеситель, 14 – упаковочно-маркировочный аппарат, 15 – насосы, 16 – инокулятор Рисунок 12 – Аппаратурная схема производства биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья ВР 1. Прием и хранение сахарозы. Приемка сахарозы осуществляется в соответствии с ГОСТ 3885-73. Препарат хранят в упаковке изготовителя в крытых складских помещениях. Сахароза дозатором (2) подается в смеситель (6). ВР 2. Прием и хранение кукурузного экстракта. Приемка кукурузного экстракта осуществляется в соответствии с ГОСТ 3885-73. При хранении экстракта не допускается попадание в него воды. Гарантийный срок хранения – 6 месяцев. Кукурузный экстракт дозатором (3) подается в смеситель (6). ВР 3. Прием и хранение гидрофосфата калия однозамещенного. Приемка гидрофосфата калия осуществляется в соответствии с ГОСТ 388573. Препарат хранят в упаковке изготовителя в крытых складских помещениях. Гидрофосфат калия дозатором (4) подается в смеситель (6) ВР 4. Прием и хранение сульфата магний 7-водного. Приемка сульфата магния осуществляется в соответствии с ГОСТ 3885-73. Препарат хранят в крытых складских помещениях в упаковке изготовителя. Сульфат магния дозатором (5) подается в смеситель (6). 56

ВР 5. Подготовка воды. Для очистки (деминерализации) воду пропускают последовательно через две колонки, соединенные последовательно в одну установку. Подготовленная вода из емкости (1) поступает в смеситель (6). ВР 6. Прием и хранение мелассы. Мелассу сливают из цистерн самотеком в расположенные ниже приемные сборники - стальные резервуары, объем которых рассчитан на суточную работу завода. Хранится в наземных стальных резервуарах (баках) вместимостью 1000 - 3000 т, покрытых исправной конусовидной крышей с барьером. Меласса поступает из дозатора (10) в смеситель (13). ТП 1. Подготовка питательной среды. ТП 1.1. Смешивание компонентов питательной среды. Компоненты питательной среды, поступившие из дозаторов (2,3,4 и 5) смешиваются с очищенной водой из резервуара (1) в следующих соотношениях (г/л): сахароза – 10, кукурузный экстракт – 10, KH2PO4 – 3, MgSO4 – 1,5, вода – остальное. Смешивание проходит при скорости оборотов мешалки n = 120 об/мин, в течение 30 минут. По окончанию времени перемешивания раствор подается в стерилизатор (7). ТП 1.2. Стерилизация. Питательную среду стерилизуют в стерилизаторе (7) в течение 1,5 часов, при температуре t° = 121°C и избыточном давлении P = 1 ати. Стерильная питательная среда подается на охлаждение в пластинчатый теплообменник (8). ТП 1.3. Охлаждение. В пластинчатом теплообменнике (8) питательная среда охлаждается до температуры t° = 25-27°C, после чего подается в ферментер (9). ТП 2. Подготовка посевного материала. В качестве посевного материала используют консорциум лигнинразрушающих микроорганизмов из расчета 5 об. % посевного материала от объема питательной среды. Предварительно масштабируется в инокуляторе (16) при температуре 2557

27°С, в течение 7 суток для последующего культивирования в ферментере (9). ТП 3. Ферментация. Выращивание производственной смешанной культуры осуществляется периодическим способом в ферментере. Посевной материал из инокулятора (16) в количестве 5 об. % от объема питательной среды поступает в ферментер (9). Продолжительность ферментации составляет 14 суток, процесс проводят при интенсивном перемешивании среды и аэрации, температура составляет 25-27°С. Ферментация считается оконченной при концентрации клеток 1*108 КОЕ/мл. После ферментации культуральная жидкость подается в смеситель (13). ТП 4. Стандартизация. Полученную культуральную жидкость стандартизуют до концентрации клеток в растворе 1*10 7 КОЕ/мл. Для разбавления используется раствор следующего состава (г/л): меласса свекловичная – 20, KH2PO4 – 3, MgSO4 – 1,5. Препараты подаются в смеситель (13) с дозаторов (10, 11 и 12) соответственно и из резервуара (1) подается вода. Туда же подается культуральная жидкость. Смешивание проходит при скорости оборотов мешалки n = 120 об/мин, в течение 30 минут. По окончанию времени перемешивания раствор подается в упаковочно-маркировочный аппарат (14). УМО. Упаковка, маркировка. Полученный биопрепарат для деструкции лигнинсодержащего сырья разливается в бутылки объемом 1 литр, срок хранения 6 месяцев. Каждую единицу фасовки маркируют с указанием организации-производителя, ее адреса, товарного знака, названия препарата, номера серии, срока годности, условий хранения, способа применения, обозначения стандарта организации и снабжают инструкцией по применению. 58

4.4 Расчет материального баланса Расчет технологического материального баланса производства биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья был проведен на 1000 кг питательной среды и приведен в таблице 10. Таблица 12 – Материальный баланс из расчета на 1000 кг питательной среды Процесс Смешивание компонентов питательной среды Сахароза Кукурузный экстракт KH2PO4 MgSO4 Вода Стерилизация Охлаждение Ферментация Посевной материал (5% от массы питательной среды) Стандартизация Раствор для стандартизации культуральной жидкости: Меласса свекловичная KH2PO4 MgSO4 Вода Приход (кг) 10 кг 10 кг 3 кг 1,5 кг 975,5 кг 1000 кг 1000 кг 1000 кг 1000 кг*0,05 = 50 кг Σ = 1050 кг Расход (кг) 1000 кг 1000 кг 1000 кг Потеря сухих веществ = 5,55 кг Масса культуральной жидкости = 1044,45 кг 1044,45 кг 20,9 кг 3,1 кг 1,6 кг 1018,85 кг 2088,9 кг 59

ГЛАВА 5 Экономика 5.1 Производственная программа Планирование производственной программы начинается с определения годовой производственной мощности (максимально возможного количества выпускаемой продукции при полном использовании имеющегося оборудования и площадей). М год = М см  Ксм , где Мгод – годовой объем производства продукции в натуральном выражении (т, кг, л, мл и т.д.); Мсм – сменный (цикл) объем производства продукции, л; Ксм – количество рабочих смен за год. За смену предприятие производит 2088,9 л биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья «БАЙЛИГ», а количество смен в году равняется 248. Соответственно, Мгод = 2088,9 х 248= 518047,2 [л] Оптовые цены рассчитываются на основе розничных цен по формуле: Цопт=Црозн – (S·Црозн), где Цопт и Црозн – соответственно оптовая и розничная цена продукции, руб; S – размер торговой скидки при формировании розничной цены (8%). Результаты расчетов оптовых цен на продукцию сводятся в таблицу 13. Таблица 13 – Расчет оптовых цен на продукцию Наименование изделий Развес, л БАЙЛИГ 1 Розничная цена за 1 л, руб. 45 Розничная цена за Мсут, руб 94000,5 Торговая скидка, руб./л 3,6 Оптовая цена за 1 л продукции, руб. 41,4 На основе рассчитанных выше показателей определяется товарная продукция (ТП): ТПгод = Мгод x Цопт, 60

где Цопт – оптовая цена за 1 л, руб; Мгод – годовой объем выработки. Результаты расчетов заносят в таблицу 14. Таблица 14 – Расчет товарной продукции Наименование изделия БАЙЛИГ 5.2 Выработка в год, Л 518047,2 Оптовая цена за 1 л, Руб 41,4 Товарная продукция, руб 21447154,08 План материально-технического снабжения Количество материалов на единицу продукции определяется по данным материального баланса: qед = qсут m , где qсут - количество материалов, необходимых на суточный объем производства продукции; m – масса продукции, произведенной за сутки. Стоимость материалов, потребляемых при производстве единицы продукта, рассчитывается по формуле: Sед = Цмед.  qед , где Цмед. – цена за единицу материалов; qед – количество материалов для производства единицы продукции. Далее рассчитывается суммарная стоимость сырья и материалов за год: Sгод = Sед  Мгод , К полученной сумме добавляют ТЗР – транспортно-заготовительные расходы В стоимость сырья и материалов не входят затраты по их транспортировке, их включают отдельно, т.е. затраты на погрузку и разгрузку, перевозку, расход по таре, заработную плату работников снабжения по доставке сырья принимают укрупнено. Транспортно61

заготовительные расходы по укрупненным показателям составляют – 7 % от стоимости сырья и материалов. Таблица 15 – Расчет стоимости основных материалов на 1 кг готовой продукции и на годовой объем производства Наименование Основных материалов Стоимость Сырья, руб./кг Сахароза — 10 кг Кукурузный экстракт — 10 кг KH2PO4 — 6,1 кг MgSO4 – 3,1 кг Меласса свекловичная – 20,9 кг Итого ТЗР 215 Наименование изделий На годовой объем На 1 л продукции производства Кол-во Стоимость Кол-во Стоимость сырья, руб. сырья, кг руб. кг 0,0047 1,01 2434,82 523486,3 197 0,0047 0,93 2434,82 479659,54 84 28 0,0029 0,0014 0,24 0,04 1502,34 725,27 126196,56 20307,56 19 0,01 0,19 5180,47 98428,93 Расчет 2,41 0,17 количества и стоимости электроэнергии 1248078,89 87365,52 и воды на технологические нужды. Количество и стоимость электроэнергии на технологические нужды ведется по нормам расхода на 1 л готового продукта, умноженным на объем производства в год, а затем на тариф за 1 кВт-час 4,5 руб. Результаты расчетов заносят в таблицу 16. Таблица 16 – Расчет электроэнергии на технологические нужды Наименование изделий Выработка в год, л Норма расхода электроэнергии, кВт-час/л БАЙЛИГ 518047,2 0,2 Потребность в электроэнергии в год, тыс. кВт-час 103609,44 Стоимость, руб. 466242,48 Расчет объема воды на технологические нужды производиться из норм расхода на 1 кг готовой продукции. Что бы получить значение объема воды на технологические нужды, которая необходима для получения готового объема продукции, которая необходима для получения годового объема продукции, умножают объем воды, приходящийся на изготовление 1 л 62

продукции, на годовую норму выработки и установленный тариф за 1 м3 воды 21,70 руб. Результаты вычислений сводятся в таблицу 17. Таблица 17 – Расчет воды Выработка в год, Л 518047,2 Наименование изделия БАЙЛИГ 5.3 Норма расхода, куб. м/литр 0,45 Потребность в год, куб. м 233121,24 Стоимость, руб. 4895546,04 План по труду и заработной плате Число работников ППП (промышленно-производственного персонала) устанавливают на основании норм технологического проектирования предприятий. Затем рассчитывается ФЗП (фонд заработной платы) производственных рабочих. Для этого нужно знать суточные тарифные ставки (ТС), норму выработки бригады в смену/сутки (Нвыр), размеры доплат и надбавок. На основе первых двух показателей определяется бригадная сдельная расценка (Рбр): Рбр =  ТС i Нвыр Таблица 18 – Расчет суммы тарифных ставок Наименование профессии 1. 2. 3. 4. Технолог Лаборант-микробиолог Разнорабочий Аппаратчик Итого Число рабочих в смену 1 1 2 1 5 Часовая тарифная ставка одного рабочего, руб. 210 190 110 150 770 Сменная тарифная ставка бригады, руб. 1680 1520 1760 1200 6160 Расчет суммарной тарифной ставки бригады за смену производиться путем суммирования произведений суточных тарифных ставок рабочих каждой профессии на количество работников соответствующей профессии. 63

Норма выработки каждого вида продукта в смену известна из материального баланса, следовательно, бригадная сдельная расценка рассчитается по формуле: Рбр = 6160/2088,9 = 2,95 руб/л Расчет фонда заработной платы. Фонд заработной платы определяется по каждому виду продукции. Доплаты, которые выплачиваются производственным рабочим за качество продукции, за работу в ночное время, в праздничные дни и др., включают в дополнительный фонд заработной платы. Кроме того, учитываются доплаты за выслугу лет, районный коэффициент. Сумма доплат по укрупненным показателям составляет от 50 до 100 % от фонда. Расчет по заработной плате можно свести в таблицу 17. Таблица 19 – Расчет заработной платы производственных рабочих Фонд Годовой заработной Доплаты и Сдельная фонд Наименование Выработка платы по дополнительная расценка, заработной изделий в год, л сдельным заработная руб./л платы, расценкам, плата, руб. тыс. руб. руб. БАЙЛИГ 518047,2 1528239,24 1528239,24 3056478,48 2,95 После определения годового фонда заработной платы устанавливают сумму отчислений на социальные нужды, размер страховых взносов составляет 30 % от годового фонда общей (основной и дополнительной) заработной платы, в том числе: • органам социального страхования; • в пенсионный фонд; • медицинское страхование. Страховые взносы: ФОПгод*30% = 3056478,48*0,3 = 916943,54 руб. Далее необходимо определить производительность труда и среднегодовую заработную плату на одного рабочего. 64

Производительность труда рассчитывается по формуле: П= ТП , ППП где ТП – товарная продукция, руб; ППП – численность промышленно-производственного персонала, чел. П=23830171,2/5 = 4766034,24 (руб) Среднегодовая заработная плата одного рабочего рассчитывается по формуле: ЗП сред.год = ФЗП год ППП , где ФЗПгод – годовой фонд заработной платы, руб. ЗПср.год =3056478,48/5 = 611295,7 (руб) 5.4 Планирование издержек на производство и реализацию продукции Совокупность издержек на производство и реализацию продукции в денежном выражении называется себестоимостью продукции. Уровень себестоимости показывает, насколько рационально предприятие использует свои производственные фонды, трудовые и финансовые ресурсы. В этом разделе производится расчёт затрат на производство продукции. В предыдущем разделе были рассчитаны затраты на сырьё, материалы, расходы на воду и электроэнергию, заработную плату, отчисления ЕСН. Необходимо рассчитать следующие статьи затрат: • расходы на подготовку и освоение новых производств • общезаводские расходы; • производственные расходы; • прочие производственные расходы; • внепроизводственные расходы. 65

Перечисленные расходы определяются по укрупнённым показателям исходя из фактической величины, сложившейся на действующих предприятиях. Статья расходов на подготовку и освоение новых производств и видов продукции включает следующие затраты: затраты на освоение новых производств, цехов, агрегатов; на подготовку и освоение новых видов продукции и новых технологических процессов. Расходы принимаются равными 0,7-1,5% от фонда основной и дополнительной заработной платы производственных рабочих. ПОНП = ФЗПгод*1,5 % =3056478,48*0,015 = 45847,18 (руб), Статья расходов на содержание и подготовку оборудования к ней относятся: ✓ амортизационные отчисления на производственное оборудование и транспортные средства; ✓ расходы по эксплуатации оборудования, включающие стоимость обтирочных и прочих материалов, основную и дополнительную заработную плату с отчислениями на социальные нужды дежурно-ремонтной группы рабочих, стоимость производственной электроэнергии, стоимость услуг вспомогательных цехов, связанных с содержанием и эксплуатацией оборудования; ✓ затраты на текущий ремонт оборудования и транспортных средств; ✓ износ быстроизнашивающихся деталей и инвентаря. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования принимают 40% от фонда основной и дополнительной заработной платы. СЭОгод = ФЗПгод*40% = 3056478,48*0,4 = 1222591,39 (руб), Статья общезаводских расходов включает: • административно-управленческие управленческого персонала с расходы отчислениями на (заработная социальные плата нужды, канцелярские расходы и др.); 66

• общепроизводственные расходы (заработная плата неуправленческого персонала с отчислениями на социальные нужды, содержание, текущий ремонт и амортизация зданий и сооружений, расходы по охране труда). Эти расходы принимаются равными 150% фонда основной и дополнительной заработной платы производственных рабочих. ОЗР = ФЗПпроиз.год*150% = 3056478,48*1,5 = 4584717,72 (руб.), Прочие производственные расходы включают производственные затраты, которые не вошли в предыдущие статьи, в частности, отчисления на научно-исследовательские работы, затраты на стандартизацию. Общая сумма расходов определяется в размере 0,05% товарной продукции. ППР = ТП*0,05% = 21447154,08*0,0005 = 10723,58 (руб.) Величина внепроизводственных расходов принимается равной 2% от производственной себестоимости. Таблица 20 – Производственная и полная себестоимость продукции Статьи калькуляции 1 Выработка продукции, л 1. Сырье и материалы, руб. 2. ТЗР на сырье и материалы, руб. Итого: 3. Вода и электроэнергия на технологические нужды, руб. 4. Основная и дополнительная заработная плата производственных рабочих, руб. 5. Отчисления на социальные нужды, руб. 6. Расходы на подготовку и освоение производства, руб. 7. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования, руб. Наименование продукции На единицу На годовой объем продукции производства 2 3 1 518047,2 2,41 1248078,89 0,17 87365,52 2,58 1335444,41 10,35 5361788,52 5,9 3056478,48 1,77 916943,54 0,09 45847,18 2,36 1222591,39 67

Продолжение таблицы 20 1 8. Цеховые расходы, руб. 9. общепроизводственные расходы, руб. Производственная себестоимость, руб. 10. Внепроизводственные расходы, руб. Полная себестоимость, руб. 5.5 2 8,85 0,02 31,9 0,64 32,54 3 4584717,72 10723,58 16534534,82 330690,7 16865225,52 Финансовый план 5.5.1 Планирование цен на продукцию По каждому виду продукции и по всему объему производства определяется прибыль как разность между товарной продукцией и ее полной себестоимости: П = ТП – С, где П – прибыль от реализации продукции, руб.; ТП – товарная продукция предприятия, руб.; С – полная себестоимость, руб. П = 21447154,08 – 16865225,52= 4581928,56 (руб) Результаты расчетов вносим в таблицу 21. Таблица 21 – Расчет прибыли от реализации продукции Наименование продукции БАЙЛИГ Товарная продукция, руб. 21447154,08 Полная себестоимость, руб. 16865225,52 Затраты на 1 руб. товарной продукции, руб. 0,79 Прибыль, руб. 4581928,56 Перед планированием цен на продукцию рассчитывают величину рентабельности продукции: R = П/С * 100%, где П – прибыль от реализации продукции, руб; С – полная себестоимость, руб. R = 4581928,56 /16865225,52 * 100% = 27,17 % Расчет оптовых цен на продукцию. Структура оптовой цены: 68

Цопт = С + П, где С – полная себестоимость продукции, млн. руб.; П – прибыль от реализации продукции, млн. руб. Цопт = 32,54+ 8,84 = 41,38 (руб/л), Затем определяем оптово-отпускную цену продукции: Цопт-отп = (Цопт + НДС)/0,9 где Цопт – оптовая цена продукции, НДС – налог на добавочную стоимость, которой составляет 20% от оптово-отпускной цены продукции. 0,9 – оптовая скидка на продукцию. Цены рассчитываются на 1 л продукции. Цопт-отп = (41,38 + 8,28)/0,9 = 55,2 [руб.] Результаты расчетов занести в таблицу 22. Таблица 22 – Расчет оптово-отпускных цен на продукцию Наименование изделий БАЙЛИГ 5.6 Полная себестоимость 1 л, руб. 32,54 Оптовая цена 1 л, руб. 41,38 Оптовоотпускная цена 1 л, руб. 55,2 Оптово-отпускная цена за 100 мл., руб. 5,52 Планирование прибыли Данный раздел включает расчет налогов и чистой прибыли. Расчеты сводятся в таблицу 23. Таблица 23 – Расчет налогов и чистой прибыли № Показатели 1 1 2 Прибыль от реализации продукции Из валовой прибыли, подлежащей налогообложению, исключается: а) доходы (дивиденды), полученные по акциям, принадлежащим предприятию; б) средства, направленные на техническое перевооружение, реконструкцию, расширение производства; 2 Единицы измерения 3 Руб. 4 4581928,56 руб. 229096,43 Значения 69

Продолжение таблицы 23 1 2 3 4 5 6 2 в) взносы на благотворительные цели Сумма отчислений в резервный фонд Налогооблагаемая прибыль Сумма налога на прибыль, всего Чистая прибыль 5.7 Расчет капитальных 3 руб. руб. руб. руб. руб. затрат и анализ 4 91638,57 305614,63 3955578,93 791115,79 3164463,14 экономической эффективности производства 5.7.1 Расчет капитальных затрат на оборудование Расчет капитальных затрат на оборудование Стоимость каждого вида оборудования определяется как произведения стоимости единицы оборудования на количество единиц: Собх. = Седх. ∙ Nx , где Cедх – стоимость единицы оборудования данного вида; Nx – число единиц данного вида оборудования; Cобх – стоимость оборудования данного вида. Результаты расчетов необходимого оборудования приведены в таблице 22. Таблица 24 – Расчет общей стоимости оборудования Наименование оборудования 1 Резервуар для воды Дозатор сахарозы Дозатор кукурузного экстракта Дозатор KH2PO4 Дозатор MgSO4 Дозатор мелассы свекловичной Смеситель питательной среды Стерилизатор Количество единиц 2 2 2 Стоимость единицы, тыс. руб. 3 100,0 50,0 Полная стоимость, тыс. руб. 4 200,0 100,0 2 50,0 100,0 4 4 50,0 50,0 200,0 200,0 2 50,0 100,0 2 150,0 300,0 2 200,0 400,0 70

Продолжение таблицы 24 1 Пластинчатый теплообменник Инокулятор Ферментер Смеситель Упаковочномаркировочный аппарат Итого 2 3 4 2 80,0 160,0 8 15 2 100,0 250,0 90,0 800,0 3750,0 180,0 2 100,0 200,0 6690,0 К итогу прибавляется: а) стоимости коммуникаций – 20% от стоимости оборудования = 1338 тыс. руб.; б) транспортные расходы - 5% от стоимости оборудования = 334,5 тыс. руб.; в) затраты на запчасти – 3% от стоимости оборудования = 200,7 тыс. руб.; г) накладные расходы – 1,25% от стоимости оборудования = 83,625тыс. руб.; д) стоимость монтажа оборудования – 20% от стоимости оборудования,= 1338 тыс. руб. Общие затраты на оборудование = 9984825 рублей 5.8 Сметно-финансовый расчет на строительные работы При расчете финансовых средств на строительные работы учитывают затраты на строительство самого здания, а также расходы на установку освещения, отопительно-вентиляционной системы, водопровода и канализации. Стоимость строительной части определяется в тысячи рублей, сначала определяется объем здания в м 3, затем рассчитывается стоимость строительной части. 71

Объем производственного здания составляет 210 м 3. На проектирование и постройку производственного здания заданного объема потребуется 5250000 рублей (25000 рублей за 1 м3). Стоимость осветительной части (5% от стоимости строительных работ) – 262500 рублей Затраты на установку и отопления и вентиляции (13% от стоимости строительных работ) –682500 рублей. Расходы на установление водопроводно-канализационной системы (12% от стоимости оборудования) – 630000 руб. Общие затраты на строительные работы определяются суммированием всех расходов на строительство –6825000 руб. Итоговые капитальные затраты на предприятие равны сумме общих затрат на оборудование и общих затрат на строительные работы. Таблица 25 – Расчет капитальных затрат Наименование объектов Оборудование Здание Всего капитальных затрат Сумма, руб. 9984825 6825000 16809825 % к итогу 59,4 40,6 100 Срок окупаемости предприятия рассчитывается по формуле: Ток = К/П, где П – размер чистой прибыли, руб. К – итоговые капитальные затраты на предприятие, руб. Ток = 16809825/3164463,14= 5,3 года. 5.9 Основные технико-экономические показатели бизнес-плана Дипломная работа заканчивается сведением полученных техникоэкономических показателей в таблицу 26. 72

Таблица 26 – Основные технико-экономические показатели бизнесплана Показатели 1 1. Товарная продукция 2. Численность работников 3. Фонд заработной платы 4. Среднегодовая заработная плата 1 работника 5. Себестоимость продукции 6. Прибыль от реализации продукции 7. Рентабельность продукции 8. Чистая прибыль 9. Капитальные вложения 10. Срок окупаемости вложений Ед. изм. 2 руб. чел. руб. руб. руб. руб. % руб. руб. лет Значение 3 21447154,08 5 3056478,48 611295,7 16865225,52 4581928,56 27,17 3164463,14 16809825 5,3 73

ГЛАВА 6 Безопасность жизнедеятельности 6.1 Техника безопасности в лаборатории Помещения лабораторий по своему устройству, планировке и техническому оснащению должны соответствовать положениям СНиП РФ (Строительные нормы и правила Российской Федерации) [34]. Поверхности стен, потолков и полов помещений, в которых работают с ядовитыми или агрессивными веществами, должны быть облицованы материалами, предотвращающими поглощение вредных паров и веществ, коррозию, иметь гладкую поверхность, и легко очищаться водой или растворителями. Лаборатории, в которых предполагается работа с вредными летучими веществами, должны быть оснащены вытяжными шкафами. Вытяжные шкафы в лабораториях выполняют не металлических конструкций. Остеклять шкафы в лабораториях желательно армированным стеклом. При работе в вытяжном шкафу разрешается открывать окна не более чем на половину проема. Освещение вытяжного шкафа должно быть во взрывобезопасном соответствии исполнении, а электропроводку с требованиями к электропроводке во выполняют в взрывоопасном помещении. Для тушения возможных загораний и пожаров лаборатории должны быть обеспечены необходимыми средствами пожаротушения (огнетушитель пенный ОХН-10, предназначенный для тушения начинающихся пожаров твердых, жидких и газообразных веществ и огнетушитель ручной углекислотный ОУ-5 для тушения загоревшихся горючих и тлеющих материалов всех видов, а также электроустановок находящихся под напряжением не более 380В). К работе в лаборатории допускаются лица достигшие возраста 18 лет, прошедшие инструктаж и обучение технике безопасности и имеющие соответствующее должности профессиональное образование. Ежеквартально 74

должны проводиться повторные инструктажи. Сотрудники лаборатории обязаны знать: • свойства применяющихся в работе реактивов, технических продуктов, продуктов реакции и синтезируемых веществ, поступающих в лабораторию для анализа, особенно их возможную токсичность, огнеопасность и взрывоопасность; • профессиональные вредности данных работ и методы борьбы с ними, меры первой (доврачебной) помощи в случае возникновения несчастных случаев, например отравлениях, ожогах и поражениях электричеством; • инструкции по противопожарным мерам; • правила пользования противопожарным инвентарем. Инструктаж по технике безопасности сотрудников должен подтверждаться личными подписями инструктируемого и проводившего инструктаж в журнале инструкций по технике безопасности, имеющимся в лаборатории. Работа в лаборатории связана с непрерывным применением различных реактивов. Поэтому каждая лаборатория имеет их запах. На каждом сосуде, где хранятся химические материалы, должны быть наклейки с названием данного препарата и сроком его изготовления. Для обеспечения стерильности исследований работа в микробиологической лаборатории должна проводиться с соблюдением правил асептики, поскольку в воздухе, на поверхностях предметов, одежде, руках, волосах имеется большое количество разнообразной микрофлоры. Культуры микроорганизмов, пробирки, а также бактериологические петли необходимо ставить в штативы. Использованные пипетки, покровные и предметные стекла, ватные тампоны, шпатели и прочее помещают в сосуды с дезинфицирующей жидкостью, например, в 1%-ный раствор хлорамина. Металлические бактериологические петли, иглы и пинцеты после соприкосновения с культурой стерилизуют путем прокаливания в пламени 75

горелки и только после этого помещают в штатив или банку. Категорически запрещается оставлять указанные предметы не стерилизованными. Отработанные культуры микроорганизмов складывают в специальные бюксы и затем стерилизуют в автоклавах. В случаях, когда культура микроорганизмов попадает на стол и другие предметы, необходимо при помощи ватного тампона, смоченного дезинфицирующим раствором, собрать ее, а загрязненное место тщательно обеззаразить. Категорически запрещается засасывать жидкости в пипетки ртом. Для этой цели удобнее и безопасней пользоваться резиновой грушей или медицинским шприцем, на который вместо иглы надевают небольшой отрезок резинового шланга. Удобны и пипетки-дозаторы с цилиндрическим шлифом. На случай необходимости должна быть укомплектована аптечка для оказания первой медицинской помощи. Одним из необходимых условий нормальной работы человека в лаборатории является обеспечение метеорологических условий в помещениях, температурно-влажностный режим, оказывающий влияние на тепловое самочувствие человека, а оно прямо влияет на терморегуляцию и таким образом на производительность труда. Согласно ГОСТу 12.1.005-88 [5] оптимальными для организма человека являются следующие значения показателей микроклимата: • температура воздуха в холодный период должна составлять 20- 23°С, а в теплый период – 22-25°С; • скорость движения воздуха в холодный и теплый период должна быть равна 0,2 м/с; • относительная влажность в холодный и теплый период 40-60%. Также важным параметром для благоприятной работы сотрудников является освещенность рабочего пространства. Освещение должно соответствовать ГОСТ 2.04.05-98. Применяют искусственное, естественное и 76

совмещенное освещение. При освещении микробиологической лаборатории используют естественное боковое освещение. Искусственное освещение создается электрическими источниками света. При недостаточном по нормам естественном освещении используют совмещенное освещение. При работе в микробиологической лаборатории, работники должны соблюдать ряд санитарно-гигиенических норм: • работать только в специальной одежде: шапочке или косынке, халате в соответствии с ГОСТ 12.4.011-89 [6] и ГОСТ 1164-86 [7]; • не выходить за пределы лаборатории в специальной одежде, выносить из лаборатории бактериальные препараты (мазки), пробирки с культурами микроорганизмов и т.д.; • необходимые для занятия предметы (книги, портфели и т.д.)складывают на отдельный, специально отведенный для этих целей стол; • в лаборатории запрещается курить, принимать пищу и воду; • перед уходом из лаборатории необходимо снять халат, обработать руки дезинфицирующим раствором и тщательно их промыть. Автоклавы должны быть герметичны на протяжении всего периода эксплуатации. Также автоклавы, используемые в лаборатории, должны соответствовать правилам электробезопасности, быть обязательно заземлены. Для исключения угрозы аварии необходимо регулярно проводить профилактические и ремонтные работы, а также эксплуатировать в строгом соответствии с нормативной документацией. К работе с автоклавом должен допускаться специально обученный работник. В лаборатории должна быть организована механическая приточновытяжная вентиляция. Для того чтобы исключить возможность проникания газообразных веществ за пределы лаборатории рекомендуется делать интенсивность притока воздуха меньше, чем оттока. При определении необходимой подачи вытяжной и приточной вентиляции следует учитывать все опасные факторы, имеющиеся в лаборатории. Вентиляция должна обеспечивать требуемый приток чистого воздуха, удаление загрязнений 77

воздушной среды и поддерживания в лаборатории необходимого микроклимата. Современная лаборатория должна быть обеспечена: • централизованной подачей горячей и дистиллированной воды; • электроэнергией; • системой, осуществляющей нагревание (горючий газ, электронагревательные приборы); • системой канализации; • системой вентиляции; • аварийной вентиляцией. Работающие в лаборатории должны знать основные свойства применяемых ими реактивов, особенно степень их ядовитости и способности к образованию взрывоопасных смесей с другими реактивами. Большой урон здоровью и тяжелые последствия приносит неумелое обращение с ядовитыми и вредными веществами. Ядовитые вещества могут действовать на организм человека при вдыхании их, при попадании на кожу или внутрь. Перед уходом из лаборатории работники обязаны убрать за собой свое рабочее место, проверить выключены ли все электрические приборы. 78

ВЫВОДЫ 1) Выделены 8 культур микроорганизмов из почвы и разложившейся древесины и присвоены им шифры A22L, A2TV, G1, G3, G25, 8.1.1, 8.1.2 и P2. При этом определили, что штаммы A22L, G1, G25, 8.1.1, 8.1.2 и A2TV относятся к микромицетам, а штаммы P2 и G3 к бактериям. На основании культуральных, тинкториальных и морфологических свойств, способности выделенных культур продуцировать амилазы и каталазу, штаммы A22L и G1 предположительно относятся к роду Aspergillus, культура 8.1.2. – к роду Penicillium и культура A2TV к роду Trichoderma. Родовую принадлежность культур P2, G25, G3 и 8.1.1 по полученным данным установить не удалось. 2) Проведена выделенных молекулярно-генетическая бактериальной штаммов. По результатам идентификация исследования рибосомальная последовательность у культуры P2 на 94% совпадает с Acromobacter spanius strain LMG 5911, а у культуры G3 – на 100% с Pseudomonas lurida strain P513/18 по данным GeneBank, для остальных штаммов проведение молекулярно-генетической идентификации планируется. 3) Установлена определения их ферментативная способности разрушать активность штаммов лигнинсодержащее для сырье: тирозиназной активностью обладает только штамм 8.1.2, лакказную активность имеют штаммы P2, G25, 8.1.1 и A2TV, штаммы G25, 8.1.1, 8.1.2 и A2TV – целлюлазной активностью. 4) Установлена биосовместимость выделенных штаммов микроорганизмов, штаммы A22L, G1 и A2TV подавляют рост других штаммов. Штаммы 8.1.1 и 8.1.2 не биосовместимы между собой. Также была отмечена биосовместимость между следующими культурами: A22L+A2TV, A22L+G1, P2+G3, P2+G25, 8.1.1+G25, G25+G3, 8.1.1+G3, 8.1.2+G3, G25+8.1.1, 8.1.1+P2, 8.1.2+P2. 79

5) Сформированы предполагаемые варианты консорциумов микроорганизмов: вариант консорциума №1, состоит из штаммов G3, G25, 8.1.1 и P2 обладает лакказной, целлюлазной и каталазной активностями, вариант консорциума №2, состоит из штаммов G3, G25, 8.1.2 и P2 обладает лакказной, тирозиназной, целлюлазной и каталазной активностями. 6) Составлена технологическая блок-схема и аппаратурная схема производства биопрепарата для деструкции лигнинсодержащего сырья, проведен расчет материального баланса на 1000 кг питательной среды, выход продукта составил 2088,9 кг. 7) Рассчитаны предприятия по основные производству технико-экономические биопрепарата для показатели деструкции лигнинсодержащего сырья. При чистой прибыли – 3164463,14 руб. и полной себестоимости – 16865225,52 руб. рентабельность составила – 27,17%, а окупаемость – 5,3 лет. 80

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд. Моск. ун-та, 1988. – 230 с. 2. Болобова А.В., Аскадский А. А., Кондращенко В. И., Рабинович М. Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов // Кн. 2: Ферменты, модели, процессы. – М.: Наука, 2002. – 344 с. 3. Большой практикум по микробиологии. – М.: Высшая школа, 1962. – 491 с. 4. Гельцер Ф. Ю. Симбиоз с микроорганизмами – основа жизни растений. – М.: Изд. МСХА, 1990. – 134 с. 5. ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны. – Взамен ГОСТ 12.1.005-76; введ. 1989-01-01. – Москва: Министерство здравоохранения СССР, Всесоюзный Центральный Совет Профессиональных Союзов, 1988. – 48с. 6. ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Средства защиты работающих. Общие требования и классификация. – Взамен ГОСТ 12.4.011-87; введ. 1990-07-01. – Москва: Государственный комитет СССР по стандартам, Всесоюзный Центральный Совет Профессиональных Союзов, 1988 – 6с. 7. ГОСТ 1164-86 Уборы головные и шарфы трикотажные. Определение сортности. – Взамен ГОСТ 1164-75; введ. 1987-07-01. – Москва: Министерство легкой промышленности СССР, 1986 – 7с. 8. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука, 2003. – 348 с. 9. Клячко Н. Л. Ферменты – биологические катализаторы: основные принципы действия // Соросовский образовательный журнал. –1997. – №3. – С. 58-63. 81

10. Криульков В. А., Каплин В. Т., Ганин Г. И. Механизм превращения лигнина и его производных в природной воде // Химия и использование лигнина. – 1974. – 182 с. 11. Леонтьевский А. А. Лигниназы базидиомицетов. Дис...докт. биол. наук. – Пущино: – 2002. – 266 с. 12. Манская С. М. Биосинтез и распад лигнина // Успехи современной биологии. – 1957. – Т. XLIV. – Вып. 1(4). – С.19-36. 13. Медведева С. А., Бабкин В. А. Пути деструкции фенольных соединений и лигнина грибами белой гнили // Превращение древесины при энзимат. и микробиол. воздействиях: Тез. докл. 3 научн. сем. – 1988. – С.8592. 14. Научные основы устойчивости лесов к дереворазрушающим грибам. М.: Наука,1992. – 222 с. 15. Новицкий Н.И. Организация производства на предприятиях: Учеб.-метод. пособие. – М.: Финансы и статистика, 2012. – 192 с. 16. Панкратов А.Я. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Пищ. пром., 1975. – 215с. 17. Рабинович М. Л., Болобова А. В., Васильченко Л. Г. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. – 2004. – № 1. – С.5-23. 18. Резников В. М. Реакционная способность лигнина и его превращение в процессах делигнификации древесины // Химия древесины. – 1977. – № 3. – С.3-23. 19. Сайманова Р.А., Захарова Н.Г. Выделение чистых культур бактерий и их идентификация. – Казань: Изд-во КЗУ, 1980. – 24с. 20. Саруханов А.В., Быков В.А. Оборудование микробиологических производств. – М.: Колос, 1993. – 384с. 21. Шеховцова Т. Н. Ферменты: их использование в химическом анализе // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – №1. – С. 44-48. 82

22. Andersson L. A., Renganathan V., Loehr T. M., Gold M. H. Lignin peroxidase: resonance Raman spectral evidence for compound II and for a temperature-dependent coordination-state equilibrium in the ferric enzyme // Biochemistry. – 1987. – V.26. – № 8. – P.2258-2263. 23. Banci L, Ciofi-Baffoni S., Tien M. Lignin and Mn peroxidase- catalyzed oxidation of phenolic lignin oligomers // Biochemistry. – 1999. – V.38. – № 10. – P.3205-3210. 24. Berglund G. I., Carlsson G. H., Smith A. T., Szoke H., Henriksen A., Hajdu J. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution // Nature. – 2002. – V.417. – Р. 463-468. 25. Collins P. J., O'Brien M. M., Dobson A. D. W. Cloning and characterization of a cDNA encoding a novel extracellular peroxidase from Trametes versicolor // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65. – Р.1343-1347. 26. De Souza D. T., Tiwari R., Sah A. K., Raghukumar C. Enhanced production of laccase by a marine fungus during treatment of colored effluents and synthetic dyes // Enzyme and Microbial Technology. – 2006. – V.38. – № 3-4. – P.504–511. 27. Hatakka A. Ligninolytic enzymes from selected white-rot fungi: production and role in lignin degradation // FEMS Microbiol. Rev. – 1994. – V.13. – P.125-135. 28. Moredo N., Lorenzo M., Dominguez A., Moldes D., Cameselle C., Sanroman A. Enhanced ligninolytic enzyme production and degrading capability of Phanerochaete chrysosporium and Trametes versicolor. // World Journal of Microbiology & Biotechnology. – 2003. – V.19. – Р.665-669. 29. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-А resolution containing a full complement of coppers // J. Biol. Chem. – 2002. – V.277. – Р.37663-37669. 30. Sheng D., Gold M. H. Oxidative polymerization of ribonuclease A by lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Role of veratryl alcohol in polymer oxidation // Eur. J. Bio-chem. – 1999. – V.259. – № 3. – P.626-634. 83

31. Научная электронная библиотека «Киберленинка» [Электронный ресурс] Режим доступа: https://cyberleninka.ru/ (Дата обращения 25.04.20). 32. Общедоступная патентная база данных Европейского патентного ведомства [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://worldwide/espacenet.com/patent/ (Дата обращения 25.04.20). 33. Патентный поиск, Поиск патентов и изобретений РФ и СССР [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://findpatent/ru/ (Дата обращения: 25.04.20). 34. Строительные нормы и правила РФ [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://sniprf.ru/ (Дата обращения 20.05.20). 84

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв