Генетически кодируемый флуоресцентный индикатор пероксида водорода HyPer7 как инструмент для изучения молекулярных механизмов ферроптоза

Левкина Анастасия

Генетически кодируемый флуоресцентный индикатор пероксида водорода HyPer7 как инструмент для изучения молекулярных механизмов ферроптоза

Внутриклеточные активные формы кислорода (ROS), такие как пероксид водорода (H2O2), опосредуют множество видов клеточной смерти, к примеру таких как апоптоз, некроз, ферроптоз. Многие из них, представляют огромный интерес для изучения. Знание молекулярных основ развития клеточного стресса и последующей смерти можно использовать для терапии и лечения многих заболеваний. В данной работе мы предлагаем принципиально новый метод для определения начальных процессов развития клеточной гибели. Генетически кодируемый флуоресцентный индикатор пероксида водорода HyPer7, направленный в разные субкомпартменты клетки, способен улавливать наномолярные концентрации пероксида водорода, который таким образом, способен пролить свет на роль H2O2 в инициации клеточной гибели. С помощью литературных данных были выбраны заякоривающие последовательности для локализации HyPer7 в разных субкомпартментах клетки: внешней и внутренней мембранах митохондрий, аппарате Гольджи, плазматической мембране, эндоплазматическом ретикулуме, ядерной мембране, пероксисомах и др. Были сконструированы плазмиды, несущие в себе ген HyPer7, и контрольные плазмиды, несущие ген HyPer7-С121S, нечувствительный к пероксиду водорода. Была осуществлена транзиентная трансфекция клеток линии HeLa Kyoto полученными векторами. На следующий день флуоресцентный сигнал визуализировали с помощью широкопольной микроскопии (Nikon TI2 TIRF BA) и, в отдельных случаях, конфокальной микроскопии (Nikon A1 HD25/A1R HD25). HyPer7 является отличным инструментом для прижизненного изучения многих биологических процессов. В отличие от других доступных методов детекции гидроперекисей, HyPer7 является сверхчувствительным прямым индикатором для изучения прижизненно внутриклетоных процессов в режиме реального времени. Наше исследование позволило создать панель новых индикаторов пероксида водорода на основе HyPer7, которые позволят изучать вопрос развития ферроптоза с нового ракурса, и таким образом прояснить его молекулярные механизмы.

Биология

Дипломы

Вуз: Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова (ГБОУ ВПО РНИМУ им. НИ Пирогова)

ID: 60dcc1b9e4dde5000191f8b9

UUID: cdef5410-bc04-0139-3860-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: почти 3 года назад

Просмотры: 18

10.46

Левкина Анастасия

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова (ГБОУ ВПО РНИМУ им. НИ Пирогова)

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 4,9 МБ

Поделиться работой

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Медико-биологический факультет Кафедра общей и медицинской биофизики Дипломная работа по специальности 30.05.02 (060602) «Медицинская биофизика», Левкина Анастасия Андреевна Тема: ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ИНДИКАТОР ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА HYPER7 КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ФЕРРОПТОЗА Работа выполнена: на базе лаборатории экспериментальной онкологии ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова НИИ трансляционной медицины; Научный руководитель: Новикова М.В., к.б.н., СНС лаборатории экспериментальной онкологии ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Консультант: Осипов А.Н., д.б.н., проф., зав. кафедрой общей и медицинской биофизики МБФ Москва 2021 г. 1

Оглавление Введение ................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................................... 6 1.1 ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРЫ .................................................................................................... 6 1.1.1 Флуоресцентные биосенсоры ................................................................. 6 1.1.2 Изучение флуоресцентных белков: открытие GFP .............................. 8 1.1.3 Структура GFP и его производных ........................................................ 9 1.1.4 Круговая пермутация............................................................................. 11 1.1.5 Редокс-сенсоры специфичные к H2O2: семейство генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров HyPer...................................... 13 1.1.6 HyPer, HyPer2, HyPer3 и HyPerRed ...................................................... 17 1.1.7 HyPer7 ..................................................................................................... 18 1.2 ФЕРРОПТОЗ................................................................................................. 21 1.2.1 Клеточная гибель. Апоптоз................................................................... 21 1.2.2 Ферроптоз. История открытия и основные признаки ........................ 23 1.2.3 Отличительные особенности ферроптоза ........................................... 25 1.2.4 GPX4 и система xc- ................................................................................ 27 1.2.5 ACSL4 ..................................................................................................... 29 1.2.6 FSP1 (AIFM2) ......................................................................................... 30 1.2.7 Железо ..................................................................................................... 31 1.2.8 Методы детекции ферроптоза .............................................................. 32 1.3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................ 35 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ................................................................................................. 37 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .............................................................. 38 2.1 ОБОРУДОВАНИЕ ....................................................................................... 38 2.2 МАТЕРИАЛЫ .............................................................................................. 38 2.2.1 Коммерческие реактивы для молекулярного клонирования ............ 39 2.2.2 Бактериальные штаммы и микробиологические среды..................... 39 2.2.3 Клеточные линии и среды ..................................................................... 40 2.2.4 ДНК-вектора ........................................................................................... 40 2.2.5 Поиск литературы .................................................................................. 40 2.2.6 Программное обеспечение .................................................................... 41 2

2.3 МЕТОДЫ ...................................................................................................... 41 2.3.1 Методы молекулярного клонирования ................................................ 41 Амплификация ДНК ....................................................................................... 41 Электрофорез в агарозном геле ..................................................................... 42 Очистка ДНК из геля ...................................................................................... 43 Рестрикция ....................................................................................................... 43 Лигирование .................................................................................................... 43 Выделение плазмидной ДНК ......................................................................... 44 2.3.3 Работа с бактериальными клетками ..................................................... 44 Трансформация бактериальных клеток ........................................................ 44 Химическая трансформация .......................................................................... 44 Электропорация .............................................................................................. 45 Выделение плазмидных ДНК ........................................................................ 45 2.3.4 Работа с эукариотическими культурами клеток ................................. 46 Транзиентная трансфекция эукариотических клеток ................................. 46 Микроскопия эукариотических клеток ........................................................ 47 Индукция ферроптоза с помощью тамоксифена ......................................... 47 Оценка выживаемости с помощью AquaBluer®.......................................... 47 BODIPY C11® ................................................................................................. 48 Подсчет клеток ................................................................................................ 48 2.3.5 Обработка микрофотографий ............................................................... 49 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................................... 51 3.1 Создание молекулярно-генетических конструктов HyPer7 с различной внутриклеточной локализацией........................................................................ 51 3.2 Определение внутриклеточной локализации конструктов HyPer7 ........ 58 3.3 Оценка функциональной активности конструктов HyPer7 ..................... 64 3.4 Подбор модели ферроптоза......................................................................... 70 3.5 Детекция H2O2 с помощью HyPer7 при развитии ферроптоза ................ 74 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................. 77 ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 81 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .................................................. 82 3

ВВЕДЕНИЕ Пероксид водорода (H2O2), один из представителей семейства активных форм кислорода (АФК), образуется в результате многочисленных биологических процессов и является основной сигнальной молекулой в окислительно-восстановительных реакциях, преимущественно окисляя остатки цистеина белков. В высоких концентрациях H2O2 участвует в патологических каскадах, например, опосредуя повреждение клеточных структур с помощью реакции Фентона. Одним из подходов для изучения динамики образования и локализации пероксида водорода является использование редокс-сенсоров семейства HyPer, чувствительных к H2O2. С момента создания первого сенсора HyPer прошло более 15 лет [1], но его применение оказалось настолько полезным, что работы по созданию усовершенствованных форм до сих пор продолжаются. Одним из последних разработанных вариантов является высокоспецифичный и высокочувствительный HyPer7 [2]. В данной работе мы используем варианты этого сенсора для изучения роли H2O2 в каскаде развития одной из недавно открытых форм клеточной гибели – ферроптоза, который наблюдается у представителей царства растений [3], цианобактерий [4] и C.elegans [5], а также при развитии многих патологических состояний человека [6]: болезнь Альцгеймера [7], болезнь Гентингтона [8], онкологические заболевания [9], ишемия-реперфузия [10], диабет [11] и др. Одной из характерных особенностей ферроптоза является неконтролируемое железозависимое перекисное окисление липидов (ПОЛ), которое вызывает окислительный стресс, приводящий к клеточной гибели. Предполагается, что H2O2 принимает участие в развитии неферментативных ферроптотических каскадов. В данном работе впервые с помощью набора вариантов HyPer7, локализованных в различных компартментах, планируется охарактеризовать образование и локализацию 4

H2O2 в клетке в различные временные точки в процессе развития ферроптозa. Доказательство или опровержение роли H2O2 в ферроптотических каскадах раскроет механизм развития этого типа клеточной гибели, что внесет вклад в изучение многих патофизиологических процессов. 5

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР В представленном ниже литературном обзоре рассматриваются вопросы создания генетически-кодируемых флуоресцентных биосенсоров, начиная с открытия флуоресцентных белков (ФБ) и заканчивая разработкой новейшего биосенсора для детекции пероксида водорода HyPer7. Также раскрывается тема ферроптоза как нового типа клеточной гибели, включая основные регуляторы и методы детекции. 1.1 ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРЫ 1.1.1 Флуоресцентные биосенсоры Генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры состоят из двух функциональных частей: сенсорного домена, который взаимодействует со специфическими молекулами (аналитами) или реагирует на определенные внутриклеточные процессы, и репортерного домена. В основе сенсорного домена находятся структурный элемент, который модифицируется в ответ на сигнал, и мотив, распознающий соответствующую модификацию [12]. В результате ответа в большинстве случаев сенсорный домен претерпевает конформационные изменения, которые влияют на активность репортерного домена. Одними из примеров сенсорных доменов являются кальмодулин (в составе биосенсоров-индикаторов Ca2+, например, GCaMP и GECO [13]), CitAP (в составе цитрат-чувствительных биосенсоров Citron1 и Citroff1 [14]), а также OxyR (в составе биосенсоров HyPer для детекции H2O2 [1]). Репортерный домен обычно состоит из одного или двух ФБ или их частей. Одними из самых распространенных являются конструкты, состоящие 6

из единственного флуоресцентного ядра (например, YFP), и FRET биосенсоры, работа которых основана на Ферстеровском резонансном переносе энергии [15]. Биосенсор, в котором ФБ одновременно выполняет функции сенсорного и репортерного доменов, а именно реагирует на сигнал и испускает флуоресценцию, называется «внутренним», тогда как химера, состоящая из ФБ и отдельного сенсорного модуля, относится к «внешним» биосенсорам [16]. Внешние биосенсоры, обладающие наибольшей чувствительностью и интенсивностью флуоресценции, чаще используются в научных исследованиях. Для создания новых флуоресцентных сенсоров, в частности, для подбора чувствительного и репортерного доменов, используются библиотеки конструкций-гомологов доменов и их мутантных вариантов, а также подбираются длина и состав аминокислотной последовательности линкера, соединяющего два домена биосенсора. Группой под руководством Р.Цзяня было показано, что даже незначительные изменения в районе линкера влияют на спектральные характеристики ФБ [17]. По биофизическим интенсиометрические и параметрам биосенсоры рациометрические. делятся на Интенсиометрические биосенсоры в ответ на реакцию сенсорного домена изменяют интенсивность флуоресценции, которая зависит от концентрации сенсора в клетке и длины светового пути. В рациометрических биосенсорах, которые предпочтительны для количественных измерений, происходит изменение амплитуды в спектрах поглощения и/или излучения [16]. Рациометрические биосенсоры имеют несколько ограничений, включая низкую чувствительность и необходимость подбора микроскопа с необходимыми характеристиками [18]. Флуоресцентные биосенсоры широко используются для визуализации процессов в клетках, тканях или организмах с помощью флуоресцентной микроскопии. Преимуществами данных молекулярно-генетических инструментов являются возможность изучения процессов и получения 7

изображений в течение длительного времени без негативного влияния на биологические объекты, а также проведение анализа процессов в различных компартментах клетки за счет создания конструктов с направленной локализацией [19]. 1.1.2 Изучение флуоресцентных белков: открытие GFP Первым широко используемым репортерным доменом в биосенсорах был зеленый флуоресцентный белок GFP (Green fluorescent protein). Архетипический GFP (avGFP) был открыт в 1960-м году группой О.Шимомуры в организме медузы Aequorea Victoria [20]. avGFP получает энергию от хромофора биолюминесцентного фотобелка экворина, имеющего максимум излучения в синем видимом диапазоне, и испускает кванты света в зеленом диапазоне длин волн [21]. В 90-х годах GFP стал активно использоваться в качестве инструмента в области молекулярной биологии. В 1992-м году группой под руководством Д.Прашера была заклонирована нуклеотидная последовательность гена GFP [22]. Используя эту конструкцию, в группе под руководством М.Чалфи впервые была произведена экспрессия рекомбинантного GFP в клетках E.coli и организме C.elegans, и продемонстрировано, что созревание хромофора происходит самопроизвольно. Эти работы указали на возможность использования GFP в экспериментах как с про-, так и с эукариотическими системами [23]. В 1996-м году в группах под руководством Дж.Филлипса [24] и Дж.Ремингтона [25] была определена кристаллическая структура GFP. Эти работы послужили началом разработки хромофоров на основе этого ФБ и создания новых поколений белков с самыми разнообразными характеристиками. Одним из первых, кто разработал большое количество улучшенных и измененных вариантов ФБ с помощью целенаправленного мутагенеза, был Р.Цзянь [17]. В 2008-м году О.Шимомуре, М.Чалфи и 8

Р.Цзяню была присуждена Нобелевская премия по химии за открытие и исследования GFP. 1.1.3 Структура GFP и его производных Центральным элементом в составе GFP является хромофор, который состоит из хромогенного трипептида, сер65-тир66-гли67, расположенного на α-спирали внутри одиннадцатицепочечного β-бочонка (Рисунок 1) [26]. Рисунок 1. Структуры белка GFP (слева) и хромогенного пептида (справа). С модификациями из [27]. Процесс образования функционально активного хромофора начинается с формирования β-бочонка [25] и заканчивается образованием хромогенного трипептида за счет ковалентной модификации трех соседних аминокислот сер65-три66-гли67 [28]. Гли-67 играет важную роль для образования хромофора [29], а три-66 может быть замещен любой другой ароматической аминокислотой [30]. Важной особенностью хромофора GFP является созревание, происходящее автокаталитически. Для завершения процесса необходимо лишь присутствие молекулярного кислорода [27]. На основании данных по исследованию структуры GFP были созданы его первые производные: BFP (blue fluorescent protein, синий ФБ) и CFP (cyan 9

fluorescent protein, голубой ФБ), содержащие замены тир-66-гис и тир-66-тре, соответственно. Другой широко используемый белок – YFP (yellow fluorescent protein, желтый ФБ) – был получен путем замены тре-203-тир. В результате внесенных модификаций произошло изменение спектральных характеристик данных ФБ (Таблица 1. Спектральные характеристики avGFP и его производных.). Таблица 1. Спектральные характеристики avGFP и его производных. Яркость Название ФБ λex (нм) λem (нм) avGFP 395 509 19,75 CFP 456 480 Нет данных BFP 381 445 5,32 [Heim, Tsien, 1996] 513 527 44,89 [Ormö и др., 1996] EYFP (enhanced) (103*М-1*см-1) Ссылка [Tsien, 1998] [Heim, Prasher, Tsien, 1994] При создании новых вариантов ФБ, помимо изменений спектральных характеристик, проводится оптимизация фотостабильности, интенсивности флуоресценции и pH устойчивости, а также уменьшение фототоксичности, что крайне важно для экспериментальной работы в in cellulo системах. Так, за счет введения точечных мутаций вблизи или непосредственно в хромофоре были получены улучшенные (enhanced) версии белков GFP, CFP и YFP – ECFP, EGFP и EYFP, соответственно [31]. Например, к получению EGFP привела единичная мутация сер-65-тре в GFP, которая значительно увеличила яркость свечения и фотостабильность и сдвинула пик возбуждения до 488 нм [32]. С помощью дополнительной мутации фен-64-лей в EGFP был получен вариант белка с улучшенным созреванием хромофора при 37 °С, который стал широко использоваться для экспрессии в клетках млекопитающих [33]. 10

Широкий спектр обнаруженных и созданных к настоящему времени вариантов ФБ позволил использовать их в качестве универсальных инструментов для решения различных биологических задач, включая эксперименты с визуализацией при разных длинах волн. Так, ФБ используются для определения локализации, изменения конформации [17] и динамики белков [34], измерения pH внутри клетки [35], изучения внутриклеточной сигнализации [36], клеточной смерти [37], каспазной активности [38] и других процессов. 1.1.4 Круговая пермутация Глобула avGFP обладает невероятно высокой устойчивостью к внешним изменениям, однако для функционирования репортерного домена в составе биосенсора важна конформационная подвижность [39]. Для увеличения подвижности окружения хромофора GFP и придания большей лабильности его спектральных характеристик avGFP был модифицирован с помощью круговой пермутации (cp, circular permutantation): приблизительно в середине генной последовательности был внесен разрыв, затем две половины гена переставлены местами и соединены небольшим искусственным линкером (рис. 2) [40]. В результате таких перестроек сохраняется структура β-бочонка, а к новообразованным N- и C-концевым последовательностям, расположенным вблизи хромофора, присоединяются сенсорные домены [41]. 11

Рисунок 2. Круговая пермутация в составе ФБ. В результате модификации первоначальные N- и C-концевые последовательности белка соединены линкером, а новые N- и C-концы образуются вблизи хромофора. [42] с изменениями. Ниже приведены примеры биосенсоров, которые были созданы на основе кругового пермутанта (рис. 3) [41]:  биосенсоры с сенсорными доменами, которые связывают специфический лиганд (например, Ca2+, АТФ) [43] (см. рис. 3а);  биосенсоры с трансмембранными вольт-чувствительными доменами (например, изменение мембранного потенциала) [44] (см. рис. 3б);  биосенсоры с доменами, способными претерпевать определенные модификации, например, в результате окисления фосфорилирования (редокс-сенсоры) [2] (см. рис. 3в). 12 или

а в б Рисунок 3. Виды сенсорных доменов в составе биосенсора, содержащего круговую пермутацию ФБ (cpFP, circular permutated fluorescent protein) (а) Лиганд-связывающий сенсорный домен, где ligand – лиганд; (б) вольтчувствительный трансмембранный домен; (в) сенсорный домен, подвергающийся окислению. [41] 1.1.5 Редокс-сенсоры специфичные к H2O2: семейство генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров HyPer Первый неспецифический редокс-сенсор, названный roGFP (reductionoxidation sensitive GFP; зеленый ФБ, чувствительный к восстановлениюокислению), был разработан группой под руководством Р.Цзяня в 2004 году на основе avGFP путем введения двух редокс-чувствительных цистеинов сер147-цис и глу-204-цис вблизи хромофора и мутации цис-48-сер, необходимой для предотвращения образования лишних цистеиновых мостиков [45]. Однако этот биосенсор экспонированные не обладает какой-либо на поверхность белковой специфичностью, глобулы так как чувствительные цистеины взаимодействовали со многими внутриклеточными окислителями, что делает его неподходящим для целенаправленного изучения H2O2 в клетке [46]. Первыми избирательно специфичными биосенсорами для детекции H2O2 являются представители семейства HyPer (Hydrogen Peroxide). Репортерный домен биосенсоров HyPer [1], HyPer2 [47], HyPer3 [48], TriPer [49] и HyPer7 [2] представляет собой круговой пермутированный YFP (cpYFP), а в состав HyPerRed [50] входит красный круговой пермутированный белок cpmApple. 13

Сенсорным доменом семейства HyPer является регуляторный домен бактериального транскрипционного фактора OxyR, который отвечает за транскрипцию генов в условиях окислительного стресса [1, 52]: например, при повышении концентрации H2O2 OxyR индуцирует экспрессию oxyS (короткая нетранслируемая регуляторная РНК), katG (ген пероксидазы водорода I) и gorA (ген глутатионредуктазы) [51]. Решающее значение для активации/передачи сигнала OxyR в бактериальной клетке, а также в составе биосенсора, имеют консервативные аминокислотные остатки цис-199 (обозначается как цис-121 в гл. Результаты) и цис-208 [52]. В присутствии H2O2 происходит окисление остатков цис-199 и цис-208 с последующим образованием дисульфидной связи, в результате чего восстановленная форма OxyR превращается в окисленную, претерпевая конформационные изменения, и интенсивность флуоресценции cpYFP в составе биосенсора меняется (рис. 4). 14

Б Рисунок 4. Образование дисульфидной связи в регуляторном домене OxyR. (А) Структура димерного белка OxyR E.coli в восстановленной (слева) и окисленной (справа) формах. Из [51]. (Б) Схематическое представление восстановленной и окисленной форм сенсорного домена OxyR-RD (RD, регуляторный домен) в составе биосенсора. [12]. Все варианты репортерных доменов HyPer на основе cpYFP характеризуются наличием двух пиков в спектре возбуждения флуоресценции с максимумами при 420 нм и 500 нм и одного пика в спектре испускания с максимумом при 516 нм (рис. 5). При окислении биосенсора интенсивность флуоресценции, возбуждаемой при 420 нм (F420), уменьшается, а интенсивность флуоресценции, возбуждаемой при 500 нм (F500), пропорционально увеличивается. Таким образом, измерение спектров испускания флуоресценции проводится с использованием двух отдельных каналов, соответствующих максимумам возбуждения. Сигнал рациометрического 15

биосенсора HyPer флуоресценции в определяется двух каналах как отношение возбуждения интенсивностей (F500/F420), которое пропорционально увеличивается при повышении концентрации H2O2 [53]. Рисунок 5. Спектры поглощения и испускания HyPer. [1] с изменениями. Несмотря на уникальную высокую специфичность к H2O2, у большинства представителей семейства HyPer присутствует важный недостаток – чувствительность к pH. Эта проблема решается постановкой контрольных экспериментов с использованием варианта HyPer с мутацией цис-199-сер в OxyR, которая приводит к нечувствительности сенсорного домена к H2O2, сохраняя чувствительность к pH [54]. Представители высокочувствительные семейства и HyPer специфичные представляют сенсоры, которые собой широко используются для изучения множества процессов. В частности, первый разработанный HyPer был использован для визуализации изменений H2O2 в цитозоле и митохондриях во время инициации апоптоза [1]. Помимо клеточных экспериментов, различные варианты HyPer активно применяются для визуализации в in vivo моделях. В одних из первых исследований было продемонстрировано при изучении процессов воспаления и регенерации в организмах Danio rerio [55] и Xenopus laevis [56]. Также с помощью HyPer 16

было показано существенное повышение уровня H2O2 в C. elegans в процессе старения [57]. Кроме того, эти сенсоры показали себя подходящими для изучения роли H2O2 в комбинациях с другими доступными сенсорами при многопараметрической визуализации в живых клетках [53]. 1.1.6 HyPer, HyPer2, HyPer3 и HyPerRed Первая версия HyPer была разработана Всеволодом Белоусовым в лаборатории под руководством Сергея Лукьянова в ИБХ РАН [1]. В cpYFP был интегрирован регуляторный домен транскрипционного фактора E.coli OxyR с помощью линкеров сер-ала-гли и гли-тре. Дальнейшие модификации HyPer привели к созданию более чувствительных бисенсоров – HyPer2, содержащий точечные мутации ала-406-вал и асн-353-сер [47], и HyPer3 с мутациями ала-406-вал и гис-114-тир (рис. 6) [48]. В результате этих модификаций динамический диапазон HyPer2 (отношение максимального уровня сигнала биосенсора в полностью окисленном состоянии к уровню исходного сигнала в полностью восстановленном состоянии) увеличился примерно в два раза, но параллельно произошло и увеличение времени полуокисления (активации) и полувосстановления (реактивации) сенсора. По сравнению с HyPer и HyPer2, HyPer3 имеет больший динамический диапазон и более быстрый ответ на биологическое событие. Рисунок 6. Мутации в биосенсорах HyPer2 и HyPer3. [47] с изменениями. 17

При создании HyPerRed [50] была произведена замена cpYFP на cpmApple, в результате чего произошло изменение спектра испускания в более красноволновую область с максимумом при 605 нм. Это позволило проводить микроскопию в многоцветном многопараметрическом режиме, например, одновременно с биосенсорами, созданными на основе CFP и GFP. 1.1.7 HyPer7 В 2020-м году в группе под руководством Всеволода Белоусова был разработан новый вариант HyPer на основе cpYFP – HyPer7 [2], в который был интегрирован регуляторный домен OxyR Neisseria meningitidis. Данная версия сенсора на 30% чувствительнее, чем HyPer3, и ответ на H2O2 в 60 раз быстрее, чем у HyPer. Чувствительность биосенсора выросла предположительно в связи с тем, что OxyR Neisseria meningitidis более чувствителен к АФК, чем OxyR E. coli [58], и, вероятно, более эффективно справляется с окислительным стрессом. Для увеличения интенсивности флуоресценции также были введены три мутации асп-135-асн, гли-298-сер и тре-379-про. Спектр возбуждения флуоресценции HyPer7 содержит два пика с максимумами при 400 нм и 499 нм, а спектр эмиссии флуоресценции – однопиковый с максимумом при 516 нм (рис. 7). Так как HyPer7 является рациометрическим сенсором, то при окислении происходит уменьшение интенсивности флуоресценции, пропорциональным возбуждаемой увеличением при интенсивности возбуждаемой при 499 нм. 18 400 нм, с флуоресценции,

Рисунок 7. Спектры поглощения и испускания HyPer7. [2] с изменениями. Для доказательства специфичности HyPer7 к H2O2 были протестированы различные окислители (рис. 8). Было показано, что только высокие концентрации органических гидропероксидов, которые не характерны в физиологическом состоянии клетки, вызывают существенные изменения в сигнале биосенсора. 19

Рисунок 8. Чувствительность HyPer7 к различным окислителям. F500/F400 отношение интенсивностей испускания при возбуждении флуоресценции в двух каналах. Сокращения: tBOOH – трет-бутилгидропероксид; CumOOH – гидропероксид кумола; BenzООН – бензоилгидропероксид; 4H2N – 4гидроперокси 2-ноненаль. [2] с изменениями. В первой экспериментальной статье с помощью HyPer7 была проанализирована динамика изменений H2O2 во время спонтанной миграции мышиных фибробластов линии NIH 3T3, а также во время воспалительных и регенеративных процессов в Danio rerio [2]. 20

1.2 ФЕРРОПТОЗ 1.2.1 Клеточная гибель. Апоптоз Согласно принятой в 2018 году рекомендации Номенклатурного комитета по клеточной гибели, известно 22 вида клеточной смерти [59], и этот список продолжает расти (рис. 9). Классификация основана на морфологических, биохимических и функциональных критериях. Рисунок 9. История открытий некоторых видов клеточной гибели. [60] с изменениями. В 1972 году Д.Керр, А.Вилли и А.Кюри впервые описали такой вид клеточной гибели как апоптоз [61]. Апоптоз — это регулируемый процесс программируемой каспазозависимой клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. В отличие от некроза, при котором происходит набухание клетки и ее органелл в результате нарушения целостности плазматической мембраны, морфологической особенностью апоптоза является сжатие клетки и ее ядра без изменений в плазматической мембране [62]. Центральный каспазный каскад, приводящий, в конечном итоге, к апоптозу инициируется несколькими способами, самыми известными из которых являются внутренний (митохондриальный) (опосредуемый рецепторами смерти) пути (рис. 10) [63]. 21 и внешний

Рисунок 10. Внешний и внутренний пути инициации апоптоза. Обозначения на рисунке: BID – проапоптотический белок Bcl-2, содержащий домен BH3; FASL – Fas-лиганд; Apaf-1 - Apoptotic protease activating factor 1 (Фактор активации апоптотической протеазы 1); cytochrome C – цитохром с, dATP – дАТФ, DISC - Death-inducing signaling complex (Сигнальный комплекс, вызывающий смерть). [64] с изменениями. В результате апоптоза происходят следующие процессы: фрагментация ДНК, деградация цитоскелетных и ядерных белков, перекрестное сшивание белков, образование апоптотических телец, экспрессия лигандов для рецепторов фагоцитарных клеток и, в конечном итоге, захват клетки фагоцитами [65]. Нарушение регуляции апоптоза приводит к ряду патологических состояний, например, к онкологическим, 22 нейродегенеративным и

аутоиммунным заболеваниям, а также ишемическим повреждениям, инфаркту и инсульту [61]. 1.2.2 Ферроптоз. История открытия и основные признаки В 2003 году впервые в результате скрининга около 23550 соединений был идентифицирован эрастин (рис. 11), при добавлении которого происходила неизвестная клеточная гибель в RAS-экспрессирующих раковых клетках [66]. В 2007-2008-х годах подобные признаки клеточной гибели были описаны при добавлении соединения RSL3 (рис. 12) [67], а также показано, что хелаторы железа, к примеру дефероксамин, способны ингибировать этот вид клеточной гибели [68]. В то же время группа под руководством Маркуса Конрада впервые охарактеризовала новый путь клеточной гибели при инактивации глутатионпероксидазы 4 (GPX4), в следствие чего запускается процесс образования ПОЛ [69]. Рисунок 11. Структурная формула эрастина. Это соединение представляет собой пиперазинилхиназолинон, который взаимодействует с антипортерной системой хc- (см. ниже), блокируя импорт цистеина, что приводит к истощению пула глутатиона (GSH). 23

Рисунок 12. Структурная формула RSL3. Оказалось, что эти ранее неописанные случаи данной клеточной гибели являются одной и той же формой, получившей в 2012 году название ферроптоз [70]. Ферроптоз — тип регулируемой окислительной гибели клетки, характерной особенностью которой является железо-зависимое ПОЛ. ПОЛ – это процесс, в котором свободные радикалы (например, перекись водорода (H2O2), супероксид (O2•-) и гидроксильный радикал (•OH)) атакуют липиды, содержащие двойные углеродные связи, особенно полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) плазматической мембраны или мембранных органелл, что в конечном счете приводит к гибели клетки (рис. 13) [71]. При ферроптозе на биохимическом уровне наблюдается истощение пула внутриклеточного GSH и снижается активность GPX4, восстанавливающего гидроперекиси [72]. В результате окисленные формы липидов подвергаются дальнейшему окислению двухвалентным железом, что приводит образованию АФК и в конечном счете к клеточной гибели (рис. 13). 24 к

Рисунок 13. ПОЛ при ферроптозе. ПНЖК, изображенные голубым цветом, ацетилируются ацил-КоА-синтетазой и встраиваются в фосфолипиды. В отсутствие GPX4, ПНЖК-OOH могут приводить к высвобождению АФК (отмечено красным) и разрушению мембраны. Ферростатин-1 и витамин Е ингибируют образование гидропероксидов липидов. [73] с изменениями. Точная локализация реакции ПОЛ при ферроптозе остается до сих пор неизвестной. В качестве возможных вариантов выступают митохондрии, плазматическая мембрана, ЭПР и лизосомы [74]. Интересно, что ферроптоз является одной из древнейших форм гибели клеток, и наблюдается не только у представителей царства животных, но и у филогенетически противоположного царства растений [3]. Ферроптоз вовлечен во многие патологические процессы, такие как онкологические заболевания [75], нейродегенеративные заболевания [7], ишемическое повреждение как самостоятельное заболевание [10], а также как следствие трансплантации органа [76]. 1.2.3 Отличительные особенности ферроптоза Ферроптоз значительно отличается по морфологическим признакам от апоптоза. Так, в процессе ферроптоза не изменяется морфология ядра, но уменьшаются размеры митохондрий, а также происходит уменьшение или полное исчезновение крист и разрыв внешней митохондриальной мембраны 25

[77]. В большинстве ферроптотических клеток также наблюдаются характерные признаки некроза: увеличение размеров клеток и разрыв плазматической мембраны [78]. Поэтому на основе морфологических признаков процесс развития ферроптоза трудно отличим от некроза. Однако ферроптоз можно дифференцировать по фармакологическим и генетическим признакам. Ферроптотическая гибель запускается такими соединениями как эрастин, RSL3, SAS, но не инициируется молекулярными агентами, вызывающими апоптоз или некроз (например, Z-VAD-FMK, ворманнин или некростатин-1) [79]. На генетическом уровне определены гены-регуляторы ферроптоза (PTGS2, CHAC1, NFE2L2, RPL8, IREB2, ATP5G3, CS, TTC35, ACSF2), которые не связаны с другими формами клеточной гибели [70, 80]. На основании отличительных признаков перечисленных на рис. 14 было доказано, что ферроптоз представляет собой принципиально новый вид клеточной гибели со своими уникальными механизмами развития. 26

Рисунок 14. Признаки ферроптоза. Обозначения на рисунке: PTGS2 (простагландин-эндопероксид-синтаза-2), CHAC1 (глутатион-специфическая гамма-глутамилциклотрансфераза 1), NFE2L2 (ядерный фактор, связанный с эритроидом 2), TFRC (трансферриновый рецептор 1), ARNTL (белок, подобный ядерному транслокатору), VDAC2/3 (белок, зависимый от напряжения, анион-селективного канала 2). [80] с изменениями. 1.2.4 GPX4 и система xcОдними из главных белков-регуляторов ферроптоза являются системы антитранспортера xc- (цистин-глутамат антипортер, SLC7A11 или xCT) и GPX4, ингибирование которых с помощью соединений эрастин и RSL3, соответственно, приводит к ферроптотической гибели клеток [66, 70, 81]. 27

В 2014 году в группе под руководством Маркуса Конрада было показано, что GPX4 (селеносодержащий мономерный белок млекопитащих) является ключевым элементом регуляции ферроптоза, и способность фермента восстанавливать гидропероксиды фосфолипидов (PLOOH) критически необходима для подавления клеточной смерти [75]. Кроме того, GPX4 обладает способностью восстанавливать H2O2 и другие небольшие гидропероксиды, а также пероксиды сложных липидов, такие как гидропероксиды фосфолипидов и гидропероксиды холестерина и его эфиров, растворимые, интегрированные в биомембраны или входящие в состав липопротеинов. В активном центре фермента находится остаток селеноцистеина [75], при участии которого за счет двух электронов, получаемых преимущественно от GSH, происходит восстановление гидроперекисей [6]. Однако в условиях ограниченного количества GSH GPX4 использует тиолы с низкой молекулярной массой. Благодаря альтернативному сплайсингу и инициации транскрипции образуются три различные изоформы фермента – митохондриальная (mGPX4), ядерная (nGPX4) и цитозольная (cGPX4), которые отличаются Nконцевыми последовательностями. mGPX4 (23 кДа) содержит лидерную митохондриальную последовательность, которая удаляется при транспортировке в митохондрии. mGPX4 преимущественно экспрессируется в сперматозоидах и играет важную роль в сперматогенезе. cGPX4 (19 кДа) является самой маленькой изоформой, которая экспрессируется во всех органах и тканях, с преобладанием в почках, головном мозге и семенниках. nGPX4 (35 кДа) экспрессируется в гаплоидных мужских половых клетках и участвует в конденсации хроматина [82, 83, 84]. Антипортерная система xc- состоит из субъединицы легкой цепи SLC7A11 и субъединицы тяжелой цепи SLC3A2 и осуществляет обмен внутриклеточного глутамата на внеклеточный цистин. В цитоплазме клетки цистин восстанавливается до цистеина, который является субстратом для синтеза GSH. Ингибирование xc- низкомолекулярными соединениями 28

(например, эрастином) или лекарственными препаратами (например, сорафенибом и сульфасалазином) вызывает истощение пула GSH, и последующее подавление активности GPX4, что приводит к снижению антиоксидантной способности клетки и, в конечном счете, к ферроптозу [85] [6]. 1.2.5 ACSL4 В 2017 году группа под руководством Маркуса Конрада с помощью CRISPR-опосредованного скрининга и анализа генов, экспрессия которых снижена в устойчивых к ферроптозу клеточных линиях, идентифицировала ацил-КоА-синтетазу 4 (ACSL4, Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 4) как важный компонент в регуляции ферроптоза [86]. За счет активности ACSL4 (рис. 15) происходит образование ацил-Ко-А производных арахидоновой (AA) и адреновой (AdA) кислот, которые впоследствии этерифицируются в фосфатидилэтаноламины (PE) – AA-PE и AdA-PE соответственно – с помощью изофосфатидилхолинацилтрансферазы 3 (LPCAT3) [87]. В дальнейшем AA-PE и AdA-PE окисляются 15липоксигеназой (15-LOX) с образованием соответствующих гидропероксидов липидов (PE-AA-OOH, PE-AdA-OOH) – одних из главных маркеров ферроптоза [88]. 29

Рисунок 15. Схема образования пероксидов PE-AA-OOH и PE-AdA-OOH, липидных биомаркеров ферроптоза. [88]. В условиях отсутствия активности ACSL4 за счет нокаута гена или фармакологического ингибирования фермента снижается количество AA-PE и AdA-PE [86, 87], что приводит к блокировке ферроптотических процессов. 1.2.6 FSP1 (AIFM2) В 1999-м году группой под руководством Г.Кромера был проведен скрининг агентов, которые запускают каспазонезависимый апоптоз, и был идентифицирован митохондриальный фактор индукции апоптоза 2 (AIFM2, apoptosis-inducing factor 2) как проапоптотический индуктор [89]. Однако в 2019 году параллельно две группы под руководством Маркуса Конрада и Д.Ольцманна показали, что AIFM2 является антиферроптотическим глутатион-независимым регулятором (переименованный в белок-супрессор ферроптоза 1, ferroptosis suppressor protein, FSP1) [90]. Было показано, что сверхэкспрессия FSP1 не вызывала апоптоз, а активация ключевого белка апоптоза p53 не влияла на экспрессию FSP1. За счет миристилирования Nконцевого остатка гли-2 FSP1 располагается на плазматической мембране, где выполняет функцию оксидоредуктазы, которая снижает уровень окисленного CoQ10 (убихинон-10), а также является липофильным антиоксидантом, 30

нейтрализующим радикалы, что препятствует образованию ПОЛ (рис. 16) [90]. В подтверждение антиферроптотических свойств этого белка было показано, что линии клеток с нокаутом Fsp1 значительно чувствительнее к индукторам ферроптоза и экспрессия FSP1 коррелирует с устойчивостью к ферроптозу у ряда линий опухолевых клеток [85]. Рисунок 16. FSP1 – глутатион-независимый супрессор перекисного окисления PLOOH. Обозначения на рисунке: iFSP1 ингибитор FSP1. [91] с изменениями. 1.2.7 Железо Железо играет важнейшую роль в развитии ферроптоза, однако детально вопрос не изучен. Согласно одной из теорий происходит накопление Fe2+ за счет активной ферритинофагии (процесса связывания ионов железа с ферритином в аутофагосомах с последующей доставкой в лизосомы), которое впоследствии принимает участие в неферментативном образовании PLOOH за счет Фентоноподобной реакции (рис. 17) [92]. При окислении Fe2+ с образованием Fe3+ образуются радикалы PLO• или PLOO•, что в конечном итоге приводит к ферроптозу. Возможно, при подавлении активности GPX4 PLOOH сохраняются в клетке более продолжительное время и запускают реакцию Фентона, что приводит к их накоплению (рис. 18) [6]. 31

или Окисление или Рисунок 17. Реакция Фентона. [93] с изменениями. Рисунок 18. Цикл образования АФК при развитии ферроптоза. [94]. 1.2.8 Методы детекции ферроптоза Из-за ограниченного набора прямых методов детекции ферроптоза выводы о протекании ферроптотических процессов могут быть сделаны на основе результатов совокупности методик, косвенно свидетельствующих о развитии процесса (табл. 2) [95]. 32

Таблица 2. Методы детекции ферроптоза. [95] с изменениями. Названия методов Метод детекции ферроптоза BODIPY 581/591 C11 Детекция уровней липопероксидов LiperFluo Флуоресцентный индикатор липопероксидов TBARS протокол Детекция малондиальдегида при ПОЛ FENIX Детекция переокисления фосфолипидов Метаболомика/липидомика Детекция метаболитов или липидов Набор детекции отношения GSH/GSSH Измерение уровней глутатиона Набор измерения Fe2+/Fe3+ Измерение ионов железа Антитела против TfR1 (3B9 2A1 и 3F3- Детекция трансферринового FMA) маркера ферроптоза Антитела против MDA (1F83) Детекция малондиальдегида Антитела против 4-HNE (ab46545) Детекция 4-гидроксиноненала Примечание: TfR1 – трансферриновый малондиальдегид; 4-HNE – 4-гидроксиноненал. рецептор 1; рецептора, MDA – В настоящее время самым точным методом детекции ферроптоза является липидомный анализ, с помощью которого оценивается уровень PLOOH, образующихся в результате неконтролируемого ПОЛ [80]. Одними из самых распространенных и простых способов детекции ферроптоза являются методики с использованием красителей BODIPY 581/591 C11 и LiperFluo, которые позволяют определить уровень PLOOH в биологических образцах [96]. В отличие от большинства других длинноволновых красителей, флуорофор BODIPY 581/591 C11 (рис. 19) является липофильным соединением и используется для оценки антиоксидантной активности. При взаимодействии с пероксильными радикалами происходит уменьшение интенсивности флуоресценции флуорофора [97]. Таким образом, BODIPY C11 является косвенным индикатором уровня липидных радикалов в клетке. 33

Рисунок 19. Bodipy 581/591 C11: структурная формула (слева) и спектры поглощения (голубой) и испускания (красный) (справа). [96]. LiperFluo – это единственное соединение, которое является прямым специфическим индикатором образования перекисей липидов за счет способности флуоресцировать в результате специфического окисления (Рис. 20.) [98]. Рисунок 20. Восстановленная (сверху) и окисленная (снизу) формы Liperfluo. Окисленная форма Liperfluo практически не флуоресцирует в водной среде, но излучает сильную флуоресценцию в липофильных участках, таких как клеточные мембраны. Поэтому этот реагент легко применим для визуализации перекисей липидов с помощью флуоресцентной микроскопии и проточного цитометрического анализа клеток. Поскольку ни один из способов детекции ферроптоза не является самодостаточным для подтверждения 34 протекания процессов, обычно

проводят одновременно несколько видов анализов: например, профиль метаболитов или липидомный анализ вместе с анализом экспрессии генов, продукты которых ответственны за развитие ферроптоза. 1.3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ С момента введения термина «ферроптоз» в 2012 году был сделан значительный прогресс в понимании механизмов этого типа клеточной гибели. Так, были обнаружены и охарактеризованы ключевые регуляторы ферроптоза GPX4, ACSL4 и FSP1, была доказана центральная метаболическая роль глутатиона в развитии ферроптоза, и с помощью липидомного анализа были определены липидные биомаркеры процесса, такие как AA-PE-OOH, AdA-PE-OOH [72]. Однако роль одной из форм АФК, H2O2, в развитии ферроптотических процессов остается до конца неизученной. Косвенным доказательством участия H2O2 в развитии ферроптоза являются новые терапевтические методы для лечения онкологических новообразований [99]. Терапия представляет собой использование магнитных наночастиц, которые запускают реакцию Фентона путем увеличения концентрации Fe2+, Fe3+ и H2O2 для последующей индукции ферроптоза в раковых клетках [42, 99]. Для детекции H2O2 при ферроптозе в 2020-м году был создан флуоресцентный индикатор HP (hydrogen peroxide), который обладает низкой токсичностью, высокой селективностью и высокой чувствительностью [85]. HP представляет собой искусственно синтезированный флуоресцентный краситель, который в результате взаимодействия с пероксидом водорода претерпевал структурные изменения и испускал кванты света в ответ на индукцию ферроптоза, что являлось первым прямым доказательством участия пероксида водорода в ферроптозе. Главным недостатком этого красителя является его неспецифическое распределение в клетке, что делает 35

невозможным определение точной локализации образования H2O2 в ходе ферроптоза. Благодаря сотрудничеству между лабораториями Всеволода Белоусова (ФЦМН, ИБХ, Москва) и Маркуса Конрада (Гельмгольц Центр, Мюнхен), ведущих групп в областях редокс-индикаторов и ферроптоза, соответственно, нами были начаты исследования, посвященные изучению роли АФК в процессе развития ферроптоза. В частности, данная работа посвящена детекции H2O2 при ферроптозе с помощью недавно разработанного генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора HyPer7. 36

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ Цель настоящей работы заключалась в проведении пространственновременной детекции H2O2 внутри клетки с помощью генетически кодируемого флуоресцентного индикатора HyPer7 при развитии ферроптоза in cellulo. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Создать молекулярно-генетические конструкты, которые кодируют версии флуоресцентного сенсора HyPer7 с различной внутриклеточной локализацией. 2. Определить внутриклеточную локализацию полученных вариантов HyPer7 в клеточной линии HeLa Kyoto. 3. Оценить функциональную активность различных версий HyPer7 в клеточной линии HeLa Kyoto. 4. Подобрать модель индукции и развития ферроптоза для последующих исследований с использованием сенсоров на основе HyPer7 и флуоресцентной микроскопии высокого разрешения. 5. Визуализировать образование H2O2 в различных внутриклеточных субкомпартментах с помощью HyPer7 в режиме реального времени при развитии ферроптоза. 37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 ОБОРУДОВАНИЕ Автоматические пипетки (Eppendorf); настольная центрифуга MiniSpin (Eppendorf); вортекс Model CV1500; нaстoльный тepмoстaт Тepмo48 (Biokom); лабораторный pН-метр pH410 (Аквилон); бaктepиaльный тepмoстaт; УФтрансиллюминатор TF-20M; амплификатор (BioRad); электропоратор MicroPulser (BioRad); кювeты для элeктpoпopaции (BioRad); CO2 инкубатор; культуральный ламинарный шкаф; свeтoвoй микpoскoп Leika; флуоресцентный микроскоп Nikon Laser TIRF System; конфокальный флуоресцентный микроскоп Nikon Laser System; объективы CFI Plan Apochromat λ 40x, NA 0.95, W.D.0.21; CFI Plan Apochromat λ 100х oil, NA1.45, W.D.0.13; проточный цитофлуориметр CytoFLEX S (Beckman Coulter). 2.2 МАТЕРИАЛЫ В работе были использованы следующие реактивы: H2O2, этанол, изопропиловый спирт, уксусная кислота, NaOH, NaCl, глицерин, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), β-меркаптоэтанол, ампициллин (Sigma), канамицин (Sigma), бычий сывopoтoчный aльбумин (SibEnzyme, NEB), глюкоза (Sigma), агароза, трис-гидроксилметиламинометан (Tris), бромистый этидий, бакто-агар, деионизованная вода mQ, пропидий йодид (BioLegend), (+/-)-альфа-токоферол (Sigma), липрокстатин-1 (Sigma), (z)-4гидрокситамоксифен (Sigma). 38

2.2.1 Коммерческие реактивы для молекулярного клонирования В работе использовали: Tersus polymerase (Evrogen), Encyclo polymerase (Evrogen), Taq polymerse (Evrogen) с прилагаемыми соответствующими буферами; дезоксирибонуклеотиды (dNTPs) (Evrogen); олигонуклеотидные праймеры для проведения ПЦР были синтезированы фирмой Evrogen; эндонуклеазы рестрикции BamHI (SibEnzyme), HindIII (SibEnzyme), ClaI (SibEnzyme), XbaI (SibEnzyme), NotI (SibEnzyme), XhoI (SibEnzyme), NheI (SibEnzyme) и прилагаемые для их работы буферы (SibEnzyme); РНК-аза А (SibEnzyme); высокоактивная ДНК-лигаза фага Т4 (Evrogen) с соответствующим буфером; смесь Screen Mix для проведения скрининга конструкций (Evrogen); коммерческий набор реактивов для очистки ДНК и выделения плазмиды (Evrogen); маркер для электрофореза нуклеиновых кислот 1 kbase ladder (Evrogen). 2.2.2 Бактериальные штаммы и микробиологические среды Среда LB (1% триптон; 0,5% дрожжевой экстракт; 0,1% NaCl; 0,01 мМ Трис-НCl pH 8,0). Среду автоклавировали 45 мин при 1 атм. и хранили при комнатной температуре. Перед автоклавированием в среду дополнительно добавляли агар до концентрации 1,5%. Для селекции клеток, содержащих плазмиду, в среду добавляли ампициллин до концентрации 50-100 мкг/мл. Среда SOB (2% триптон, 0,55% дрожжевой экстракт; 0,01 мМ Tрис-HCl рН 8,0; 10 мМ NaCl; 10 мМ KCl; 20 мМ Mg2+ (в виде MgCl2 и MgSO4)). Среду автоклавировали 45 мин при 1 атм. и хранили при температуре -20˚С. В работе использовали штaмм E. coli XL1 Blue. 39

2.2.3 Эукариотические клеточные линии и среды В работе использовали клетки линии HeLa Kyoto, AML12 и Pfa-1 (последние получены в дар от лаборатории Маркуса Конрада). При работе с эукариотическими клетками использовали: трансфецирующий реагент FuGeneHD (Promega), среду DMEM (ПанЭко), среду RPMI (ПанЭко), DMEM High Glucose (Gibco); FBS - fetal bovine serum (Biosera), FCS – fetal bovine serum (Gibco), антибиотики стрептомицин и ампициллин, пуромицин (ПанЭко), глутaмин (ПанЭко), раствор Версена (ПанЭко), раствор Трипсин-ЭДТА (ПанЭко), раствор Хэнкса без бикарбоната натрия (ПанЭко), Opti Mem (Invitrogen), Minimum Eagle MEM (Sigma-Aldrich) c дoбaвлeниeм 20 мM HepesNa (ПанЭко); Live Cell Imaging Solution (Gibco). 2.2.4 ДНК-вектора Оригинальный биосенсор pcs2-HyPer7 Addgene (#136466), а также в каталоге Addgene митохондриальный присутствуют матрикс локализованные (#136470), версии межмембранное сенсора: в пространство митохондрий (#136469), ядро (#136468), цитоплазму (#136467), сигнал ядерного экспорта, направленный в цитозоль (#136465). pCS2-HyPer7-Lck, pCS2-HyPer7- Palmytoilation s., pCS2-HyPer7-Giantin, pCS2-HyPer7-Tom20N33, pCS2-HyPer7-AKAP1, pCS2-HyPer7-Micos60, pCS2HyPer7-MICU1, pCS2-HyPer7-KDEL, pCS2-HyPer7-PTS1, а также их контрольные версии с мутацией C199S были разработаны в данной работе. 2.2.5 Поиск литературы Для поиска литературы были использованы открытые поисковые ресурсы NCBI PubMed и Google Scholar. Примеры поисковых предложений: 40

1. ("Ferroptosis"[Mesh] OR Ferropt*[TI]) AND (Conrad[AU] OR Kagan[AU]) (12) 2. ("Apoptosis"[MeSH Terms] AND "Apoptosis"[Title] AND mitoch*[tiab] AND mitoch*[TI]) AND (review[Filter]) AND Science[ta] (1) 3. ("Mitochondria"[Mesh] OR mitoch*[TI]) AND "microscopy"[Mesh] AND (Micos*[tiab] OR Mic6*[tiab]) (1) 4. ("ferroptosis/physiology"[MeSH Terms] AND "Neurodegenerative Diseases"[MeSH Terms]) AND (humans[Filter]) (1) 5. "fluor*"[Title] AND "Hydrogen Peroxide"[MeSH Terms] AND "indic*"[Title] (2) 2.2.6 Программное обеспечение Для сборки схем векторов и анализа ДНК-последовательностей использовали SnapGene (Biotech LCC), SeqMan пакета Lasergene (DNASTAR), онлайн-сервис Benchling. Анализ изображений проводился в программе ImageJ (EMBL) и Nikon Analysis (Nikon). 2.3 МЕТОДЫ 2.3.1 Методы молекулярного клонирования Амплификация ДНК На стадиях получения конструкций, клонирования и тестирования применяли метод стандартного ПЦР. Амплификация проводилась на амплификаторе BioRad в соответствии с протоколом производителя Tersus, Q5 полимераз. Каждая проба содержала ДНК-полимеразу в фирменном буфере, 0,7 мкМ каждого праймера, 0,5 мкМ dNTP, 5-100 нг матричной ДНК и milliQ. 41

Версии нуклеотидных последовательностей HyPer7 с Lck, Tom20N33, AKAP1, KDEL, PTS1, FS были амплифицированы с двух пар праймеров путем стандартного ПЦР с программой: 95˚С 1 минута, 95˚С 30 секунд, средняя температура отжига праймеров (61-62˚С) 30 секунд, 72˚С 1 минута с циклом х21. Кодирующие последовательности Giantin, Micos60, MICU1 были получены с помощью «overlap extension» ПЦР. Этот метод заключается в использовании в качестве матрицы и затравки фрагментов с комплементарными друг другу участками. Для ПЦР-скрининга положительных бактериальных колоний, содержащих вектора с целевой вставкой, была использована смесь Screen Mix (Евроген). Ген, кодирующий Lamin B, был амплифицирован по стандартному протоколу с использованием праймеров, содержащих участки, гомологичные целевому вектору создан по протоколу Гибсона Gibson Assembly® Protocol (E5510) (NEB). Электрофорез в агарозном геле Для проверки длин фрагментов ДНК, а также для разделения ДНК фрагментов использовали электрофорез в 1% агарозном геле. В качестве рабочего буфера использовали TAE буфер с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 0,7 мкг/мл. Образец ДНК в необходимом объеме смешивали с буфером для нанесения, содержащим глицерин (Евроген), в пропорции 1:4. В качестве маркера использовался 1 kbase ladder (Евроген). Для визуализации фрагментов гель фотографировали с помощью анализатора Fusion Fx (Vilber Lourmat). Для вырезания необходимого фрагмента ДНК использовался трансиллюминатор ECX-F20.M-V1 ультрафиолетом низкой интенсивности. 42 (Vilber Lourmat) с

Очистка ДНК из геля После проведения электрофореза в 1% агарозном геле необходимый фрагмент вырезали канцелярским ножом. Для дальнейшей очистки использовался кит компании Евроген Standart Cleanup. Элюирование производилось в 60 мкл milliQ. Полученные фрагменты анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Рестрикция Рестрикцию использовали как этап молекулярного клонирования или же для рестрикционного анализа полученных молекулярно-генетических конструктов. В работе использовали эндонуклеазы рестрикции Fast Digest и соответствующий буфер фирмы Thermo Scientific, следуя протоколу. После рестрикции пробы очищали с помощью коммерческого набора Евроген Standart Cleanup. Лигирование Для дальнейшей экспрессии в эукариотических клетках все сконструированные кДНК после амплификации и обработки эндонуклеазами рестрикции ClaI и XbaI были заклонированы в pCS2+ вектор, предварительно обработанный аналогичными эндонуклеазами рестрикции. При использовании коммерческого набора GeneArt Gibson assembly HiFi kit (Invitrogen) для получения конструкции с сигналом Lamin B эндонуклеазами рестрикции ClaI/XhoI обрабатывали только вектор pCS2+, согласно протоколу изготовителя. Лигирование полученных фрагментов в экспрессионный вектор pCS2+ осуществляли с использованием высокоактивной лигазы фага Т4 (Evrogen). Реакцию проводили в объеме 10 мкл в течение 14-16 часов при 14С. К 43

реакционной смеси добавляли 1 мкл лигазы (20 ед/мкл), соотношение вставка:вектор составляло 3:1. Выделение плазмидной ДНК Плазмида выделялась из бактериальной культуры E. Coli XL1 Blue методом щелочного лизиса с помощью кита Евроген Plasmid MiniPrep/MidiPrep в соответствии с прилагаемым протоколом с одним отличием: элюцию проводили milliQ. 2.3.2 Работа с бактериальными клетками Трансформация бактериальных клеток После лигирования вставок и вектора молекулярно-генетические конструкты были трансформированы в XL1 Blue компетентные клетки с помощью химической трансформации или электропорации, которые были посажены на твердую селективную среду с ампициллином. Химическая трансформация Компетентные клетки для химической трансформации, предварительно расфасованные по 85 мкл в буфере, содержащем 0,1 М CaCl2, хранили при 70˚С. Перед непосредственной трансформацией клетки размораживали на льду с минимальным контактом, чтобы избежать потери компетентности. В клеточную суспензию добавляли 20-100 нг плазмидной ДНК (используемая концентрация зависела от типа плазмид) и инкубировали несколько минут на льду. После этого прогревали в течение 1 минуты при 42˚С и возвращали на лед для краткого охлаждения. После этого трансфекционную смесь рассевали 44

на твердую селективную среду с или без промежуточного этапа подращивания в течение 45 минут при 37 ˚С. Электропорация Электропорацию использовали для работы с низкоконцентрированными растворами плазмидной ДНК. Компетентные клетки для электропорации, расфасованные по 45 мкл в бессолевом растворе глицерина, хранили при -70˚С. Перед трансформацией клетки размораживали на льду, добавляли 20100 нг плазмидной ДНК и помещали в предварительно охлажденную кювету для электропорации (BioRad). Электропорацию проводили на приборе MicroPulser (BioRad). Затем клеточную суспензию переносили в 200-500 мкл среды SOB, инкубировали 45 минут с перемешиванием при 37˚С и рассеивали на твердую селективную среду с антибиотиком. Бактерии выращивали на чашках Петри с 2,5% агаром и антибиотиком в течение 24-х часов при 37˚С. Затем клоны проверяли на наличие вставки с помощью ПЦР. Выделение плазмидных ДНК Единичные колонии скалывали и переносили в 4 мл или 50 мл жидкой питательной среды в случае выделения с помощью Plasmid Miniprep набора (Евроген) или Plasmid Midiprep (Евроген), соответственно. Бактериальную культуру инкубировали в течение 24-х часов при 37˚С с постоянным перемешиванием. Далее производили выделение плазмид из бактериальных культур с помощью набора Plasmid miniprep/midiprep (Evrogen). 45

2.3.3 Работа с эукариотическими культурами клеток В работе использовали клеточные культуры HeLa Kyoto, Aml12, Pfa-1. Pfa-1 – тамоксифен-индуцибельные нокаутные Gpx4−/− эмбриональные мышиные фибробласты, полученные в лаборатории Маркуса Конрада, для экспериментов по запуску ферроптоза. Aml12 (гепатоциты мыши) были выбраны для дальнейшего исследования возможности визуализации процесса ферроптоза. HeLa Kyoto (коллекция EMBL) культивировали в среде RPMI1640 с добавлением 10% FBS, 2 мM L-глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина при 37°C в атмосфере 5% CO2. Клетки пассировали раз в 2 дня с использованием 0,25% раствора трипсин-ЭДТА. Aml12 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мM L-глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина при 37°C в атмосфере 5% CO2. Клетки пассировали раз в 2 дня с использованием 0,25% раствора трипсинЭДТА. Pfa-1 культивировали в среде DMEM с 10% FBS, 2 мM L-глутамина, 100 U/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2,5 мкг/мл пуромицина при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Клетки пассировали раз в 2 дня с использованием 0,25% раствора трипсин-ЭДТА. Транзиентная трансфекция эукариотических клеток Клетки были посеяны на 35 мм конфокальные чашки со стеклянным дном (Costar). 24 часа спустя клетки были трансфецированы смесью ДНК и FuGene HD (Promega) согласно протоколу производителя. Для этого смешивали 3,5 мкл реагента трансфекции, 100 мкл Opti-MEM и добавляли 1 мкг плазмидной ДНК. В случае котрансфекции с плазмидами, несущими ген флуоресцентного белка mKate (Евроген), смешивали 7 мкл реагента трансфекции, 100 мкл Opti-MEM и 1 мкг каждой плазмидной ДНК. 46

Трансфекционную смесь добавляли к клеткам и инкубировали в течение 24-х часов. Микроскопия эукариотических клеток Через 24 часа после трансфекции заменяли ростовую среду на среду для микроскопии, Hank’s (HBSS) с NaHCO3-/CO2 буфером, микроскопировали через 24 часа после трансфекции. Визуализация клеточной культуры после трансфекции конструкциями, несущими ген HyPer7, проводили с помощью системы Nikon Ti2-E Laser TIRF System и Confocal System. Возбуждение флуоресценции HyPer7 проводили соответствующими лазерами/диодами при 500 и 400 нм и детектировали интенсивность флуоресценции HyPer7 в соответствующем канале. Для проверки функциональной активности индикаторов спустя 2 минуты после начала записи к клеткам добавляли пероксид водорода до конечной концентрации 200 мкМ. Индукция ферроптоза с помощью тамоксифена TAM-индуцибельные Gpx4-/- клетки (Pfa-1) [69], высевали на 12луночные планшеты (5000 клеток на лунку) и обрабатывали 1 мкМ 4-OHтамоксифеном (Там) спустя 24 часа. Оценка выживаемости клеток с помощью AquaBluer® Для определения жизнеспособности клеток, краситель AquaBluer® был добавлен к клеткам Pfa-1 через 24, 48, 60, 72 часа после индукции ферроптоза в соответствии с протоколом производителя. Флуоресценция реагента была измерена при 590 нм с использованием ридера для микропланшетов Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientifiс). Подсчет выживаемости производился по следующей схеме: из средних значений флуоресценции в клеточных образцах вычиталось среднее значение 47

флуоресценции контрольного образца без клеток, затем процент выживаемости рассчитывался по формуле: % выживаемости = ср обр ср контроль ∗ 100%, где 𝐼ср обр – среднее значение интенсивности флуоресценции клеточной культуры; 𝐼ср контроль – среднее значение интенсивности флуоресценции контрольного образца клеток, без добавления химических агентов. BODIPY C11® За день до измерений 50000 Pfa-1 рассаживали на 6-ти луночный планшет, спустя сутки заменяли среду с добавлением и без добавления RSL3 в конечной концентрации 500 нМ. После 4 часов инкубации к клеткам добавляли 10 мМ BODIPY C11 и планшет возвращали в инкубатор на 1 час. Впоследствии клетки были обработаны трипсином, осаждены с помощью центрифугирования и ресуспендированы в HBSS. Клеточную суспензию фильтровали и собирали в круглодонную пробирку для цитометрии. BODIPY C11 обладает максимумами возбуждения флуоресценции при 581 нм и эмиссии при 591 нм. При окислении пик эмиссии флуоресценции BODIPY C11 смещается с 591 нм до 510 нм. Детекция интенсивности флуоресцентного сигнала была проведена с помощью проточной цитометрии в канале FITC (с максимумом эмиссии при 525 нм), по росту интенсивности флуоресценции в данном канале судили об окислении данного зонда. Подсчет клеток Для прижизненного подсчета клеток с помощью EVOS Cell Imaging Systems (Thermo Fisher Scientific) использовался краситель PureBlu Hoechst 33342 Nuclear Staining Dye (Biorad). Краситель добавляли к клеткам после 72 48

часов инкубации после индукции ферроптоза в соответствии с протоколом производителя. После производили съемку 25 снимков с каждой лунки 12луночного планшета при длине волны возбуждения 350 нм и испускания 461 нм. Подсчет клеток производили с помощью программного обеспечения Evos Analysis. Для рутинного подсчета клеток в суспензии использовали раствор трипанового синего 0,4% (Thermo Fisher Scientific) в разведении 1:1 с клеточной суспензией. Подсчет клеток проводился автоматизировано с помощью Countess 3 Automated Cell Counter (Thermo Fisher Scientific). 2.3.4 Обработка микрофотографий Динамика флуоресценции HyPer была рассчитана для интересующих областей (ROI) клетки. Микрофотографии и серии снимков анализировали с помощью программного обеспечения FiJi (https://imagej.net/Fiji). С серий микрофотографий, соответствующих каналам возбуждения флуоресценции при 400 (F400) и 500 (F500) нм, был вычтен фоновый сигнал. Изображения были конвертированы в 32 битные, после чего с помощью функции Not-aNumber в них были отсечены численные значения пикселей, соответствующих фону. Затем серии, соответствующие каналу F500, были покадрово «поделены» на серии, соответствующие каналу F400 (функция Image Calculator). Полученные изображения были окрашены в псевдоцвета (функция Rainbow Lookup table). Для создания монтажа использовали функцию Stacks – Make Montage, выбирая отдельные микрофотографии в требуемых временных точках. Для каждого смонтированного таким образом изображения была получена масштабная полоса (Tools - Calibration bar). Подсчет интенсивности флуоресценции (ROI Manager, Multi Measure) производили для отдельных областей интереса, ROIs, индивидуально выбираемых внутри трансфецированных клеток. 49

Дальнейшие подсчеты и получение графиков производили в программе Excel и GraphPad Prism. 50

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1 Создание молекулярно-генетических конструктов HyPer7 с различной внутриклеточной локализацией Для изучения процесса образования и локализации пероксида водорода в клетке при ферроптозе нами была создана панель различных вариантов HyPer7, локализованных в различных субкомпартментах клетки (рис. 21). Рисунок 21. Внутриклеточная локализация конструктов HyPer7, созданных ранее и в данной работе. Для выполнения этой задачи был проведен тщательный анализ опубликованных работ, в которых изучали белки и сигнальные последовательности с определенной внутриклеточной локализацией. Ниже представлена собранная информация по данному вопросу. Для локализации на внутренней мембране митохондрий нами были выбраны белки Micos60 (митофилин, Mic60) и MICU1 (Mitochondrial Calcium Uptake 1, белок поглощения кальция митохондриями 1). Ранее с помощью микроскопии высокого разрешения MINFLUX ранее была доказана 51

локализация Micos60 на внутренней мембране митохондрий [100], который необходим для обеспечивания нормальной морфологии крист [101]. Кроме того, была показана важность C-концевого расположения последовательности Micos60 в химерном белке слияния с APEX на N-конце [102]. Второй выбранный белок, MICU1, является ключевым регулятором транспорта кальция в митохондриях и находится на внутренней мембране митохондрий [103]. Светлопольная световая микроскопия окрашенных HEK клеток, экспрессирующих MICU1-APEX2 показала, что MICU1 является хорошим якорем для точной локализации на внутренней мембране митохондрий. Якорный белок А-киназы 1 AKAP1 (AKAP12) был выбран в качестве «якоря» на внешнюю мембрану митохондрий [104]. Ранее было показано, что для верной локализации необходимо N-концевое расположение данной последовательности в рекомбинантном белковом конструкте [105]. В качестве альтернативного «якоря» на внешнюю мембрану митохондрий был выбран белок транслоказы внешней мембраны (TOM20) [106], который транспортирует белки в межмембранное пространство митохондрий. Для обеспечения правильной локализации как для AKAP1, так и для Tom20 было выбрано N-концевое расположение в составе конструкта с HyPer7 [107]. Для локализации HyPer7 в ЭПР была выбрана так называемая последовательность KDEL [108], распознаваемая специальным рецептором KDEL аппарата Гольджи, который транспортирует белки в ЭПР посредством ретроградного транспорта [109]. Данная последовательность является распространенной для целенаправленной локализации в люмене ЭПР. Для заякоривания на плазматической мембране был выбран пептид Lck (полученный из Lymphocyte kinase, тирозин протеинкиназы) [110], последовательность которого содержится в составе коммерческих векторов компании AddGene с доказанной локализацией. Для направления HyPer7 в пероксисомы была использована сигнальная последовательность PTS1 (Peroxisomal targeting signal, периксимальный таргетный сигнал) [111, 112]. 52

Одним из известных маркеров аппарата Гольджи является гиантин [113], который расположен на цис-поверхности компартмента [114]. Согласно литературным источникам, было выбрано C-концевое расположение последовательности этого белка в составе комплекса с HyPer7 [115]. Помимо выбора «якорных» последовательностей одним из важных этапов является также подбор линкера между HyPer7 и «якорем». Линкеры обычно состоят из трех-десяти неполярных (например, гли) или полярных (например, сер или тре) аминокислот. Размер линкера должен обеспечивать гибкость и подвижность соединенных функциональных доменов [116]. Большая часть линкерных последовательностей нами была подобрана на основе коммерческих плазмидных конструкций. В табл. 3 представлены использованные нами якорные последовательности, а также линкеры. На основе собранной информации также были созданы карты конструктов, примеры некоторых из них (HyPer7Micos60, HyPer7-AKAP1, HyPer7-PTS1) представлены на рис. 22. . 53

54 GGT ACCGGT ATCCATTCGTTGGGGGATACCGGT Сигналмитохондрий ядерного экспорта, направленный в цитоплазму Митохондриальный матрикс Плазматическая мембрана NES MLS FS - ACCGGTGAT TCCGGACTCAGATCTCGAGGA Межмембранное пространство CCTGTCATAGGAAGTCTGAAA - IMS Плазматическая мембрана Lck GGAGGAAGCGGATCCGGACTCAGATCT Ядро ЭПР KDEL ACCGGT NLS Внешняя мембрана митохондрий Tom20 GGAGGAAGCGGATCCGGACTCAGATCT Аппарат Гольджи Внешняя мембрана митохондрий AKAP1 GGAGGAAGCGGATCCGGACTCAGATCT Giantin Внутренняя мембрана митохондрий MICU1 CCTGCAGGCCCTCGTAGCCCTCGGACTCCTCGTAGC Пероксисомы Внутренняя мембрана митохондрий Micos60 Линкерная последовательность PTS1 Локализация Сигналы Таблица 3. Заякоривающие последовательности HyPer7 с нуклеотидными последовательностями линкеров, использованных в данной работе. Зеленым цветом помечены ранее варианты HyPer7 [2].

Рисунок 22. Карты полученных плазмидных конструкций слева направо: HyPer7-AKAP1, HyPer7-PTS1, HyPer7-Micos60. 55

Нуклеотидная последовательность HyPer7 вместе с нуклеотидными последовательностями выбранных белков или сигналов были заклонированы в вектор pCS2+, содержащий промотор CMV для экспрессии в эукариотических клетках. Для каждого варианта HyPer7 был получен нечувствительный к H2O2 конструкт, содержащий мутацию C121S в ключевом редокс-чувствительном остатке. Для создания молекулярно-генетических конструктов было использовано несколько подходов: амплификация фрагмента с помощью одноэтапного ПЦР или амплификация фрагмента c помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами (overlap extension PCR) с последующим лигированием в векторную часть (рис. 23). Для клонирования конструктов Micos60, MICU1 и Giantin была выбрана стратегия амплификации с помощью перекрывающихся праймеров (рис. 23 А). Для создания конструктов Lck, Tom20N33, AKAP1, KDEL, PTS1 и FS была выбрана схема клонирования c одноэтапной ПЦР с двух праймеров (рис. 23 Б). Рисунок 23. Схема этапов молекулярно-генетического клонирования конструктов. Для создания конструктов HyPer7 была проведена рестрикция вектора pCS2+ по сайтам рестрикции ClaI и XbaI, затем фрагмент был выделен путем очистки из препаративного электрофорезного геля (верхняя панель рисунка). Фрагменты, содержащие последовательность HyPer7 вместе с 56

якорной последовательностью («вставка») были амплифицированы с помощью (А) ПЦР с перекрывающимися праймерами и последующим выделением из геля, или (Б) одноэтапного ПЦР с последующей очисткой вставки из смеси. Далее полученные вставки и вектор были залигированы. Все полученные конструкции были проверены с помощью рестрикционного анализа с последующим секвенированием по Сэнгеру (Евроген). Для анализа были отобраны клоны, которые имели ожидаемую длину фрагментов после рестрикции и не имели каких-либо мутаций по результатам секвенирования. Для примера на рис. 24 представлен результат рестрикционного анализа плазмид, полученных Валерием Паком [2]. * * * * Рисунок 24. Рестрикционный анализ HyPer7-конструктов (верхняя часть геля). В качестве контроля были использованы «непорезанные» плазмиды (нижняя часть геля). Помеченные конструкции (*) были выбраны для последующей работы. Крайняя левая дорожка – маркер длин ДНК (1 kb DNA Ladder) Таким образом, нами было получено девять вариантов молекулярногенетических конструктов, содержащих последовательность HyPer7 и HyPer7C121S с сигнальными или белковыми последовательностями последующей экспрессии в различных субкомпартментах. 57 для

3.2 Определение внутриклеточной локализации конструктов HyPer7 Следующим этапом данной работы являлась проверка внутриклеточной локализации вариантов HyPer7. Для этого культура клеток HeLa Kyoto была котрансфецирована полученными молекулярно-генетическими конструктами с плазмидами, несущими ген красного флуоресцентного белка mKate2 с разной локализацией (табл. 4). Вариант HyPer7-гиантин был трансфецирован по аналогичной схеме без использования дополнительных плазмид. Через 2024 часа после трансфекции образцы клеток были подготовлены для последующей микроскопии. Сигнал флуоресценции HyPer7 детектировали при возбуждении в двух каналах: при 400 нм (F400) и при 500 нм (F500). Флуоресцентный сигнал mKate2 детектировали после возбуждения при 590 нм (F590). На основании колокализации белков HyPer7 и mKate2 были сделаны выводы о локализации сконструированных заякоренных вариантов биосенсора. Таблица 4. Котрансфекция полученных вариантов конструктов HyPer7 с mKate2. Вариант HyPer7 для Версия mKate2 Локализация mKate2 котрансфекции HyPer7-Micos60 mKate2-dmito Матрикс митохондрий HyPer7-MICU1 HyPer7-AKAP1 HyPer7-Tom20 Плазматическая HyPer7-FS мембрана HyPer7-Lck mKate2-ER ЭПР HyPer7-KDEL mKate2-PTS1 Пероксисомы HyPer7-PTS1 mKate2-FS 58

Для конструктов HyPer7-Micos60, HyPer7-MICU1, HyPer7-AKAP1, HyPer7-Tom20, HyPer7-FS, HyPer7-Lck, HyPer7-KDEL и HyPer7-PTS1 было доказано заявленное внутриклеточное расположение белка: пространственный сигнал вариантов HyPer7 совпал с соответствующим сигналом белка mKate2 (рис. 25). Кроме того, используя описанную выше схему котрансфекции, мы отдельно провели конфокальную микроскопию, обладающую более высокой разрешающей способностью, для клеток, экспрессирующих митохондриальные конструкты на внутренней и внешней мембранах: HyPer7Micos60 (рис. 26 А), HyPer7-AKAP1 (рис. 26 Б) и HyPer7-Tom20 (рис. 26 В) для подтверждения сублокализации. Несмотря на то, что флуоресцентный сигнал каждого из данных вариантов HyPer7 отличался по расположению от сигнала, локализованного в матриксе митохондрий mKate2, оказалось достаточно сложно визуально отличить друг от друга сигнал HyPer7 на внешней мембране митохондрий от сигнала HyPer7 на внутренней мембране митохондрий. Анализируя полученные изображения и субъективно сравнивая HyPer7-AKAP1 с HyPer7-Tom20 в клетках HeLa Kyoto, а также в культуре мышиных гепатоцитов Aml12 (данные не представлены), для заякоривания на внешней мембране митохондрий был выбран вариант HyPer7 с сигналом локализации AKAP1. Среди двух кандидатов для изучения процессов на плазматической мембране (Lck, FS) эффективнее заякоривается конструкт HyPer7-FS (рис. 25 Е, Ж), который и был выбран для дальнейших экспериментов. Для конструкта HyPer7-KDEL была замечена низкая специфичность локализации: кроме ЭПР, сигнал HyPer7 был обнаружен также в цитоплазме и ядре (рис. 25 Д). В дальнейшем мы планируем протестировать другие сигналы ЭПР-локализации, например, Sec61b. Из-за отсутствия доступного маркерного флуоресцентного белка с локализацией в аппарате Гольджи, мы тестировали HyPer7-Giantin в одиночестве (рис. 27). Распределение химерного белка строго ограничено в 59

цистернах размером около 5 мкм вокруг ядра и визуально совпадает с ранее опубликованными данными [117]. 60

А Б В Г Д Рисунок 25. Проверка локализации полученных вариантов HyPer7 с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. А – HyPer7Micos60; Б – HyPer7-MICU1, В – HyPer7-Tom20, Г – HyPer7-AKAP1; Д – HyPer7-KDEL. Каналы слева направо: объединенные каналы HyPer7(F500)+mKate2(F590), HyPer F500 (зеленый канал), HyPer F400 (голубой канал), mKate2 с доказанной локализацией F590 (красный канал). 61

Е Ж З Продолжение рисунка 25. Проверка локализации полученных конструктов с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Е – HyPer7-Lck; Ж – HyPer7-FS; З – HyPer7-PTS1. Каналы слева направо: объединенные каналы HyPer7(F500)+mKate2(F590), HyPer F500 (зеленый канал), HyPer F400 (голубой канал), mKate2 с доказанной локализацией F590 (красный канал). 62

А Б В Рисунок 26. Изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа: клетки HeLa Kyoto, синтезирующие (А) HyPer7-Micos60 (внутренняя мембрана митохондрий) (Б) HyPer7-AKAP1 (внешняя мембрана митохондрий) (В) HyPer7-Tom20 (внешняя мембрана митохондрий) и mKate2dmito (матрикс митохондрий) при увеличении х100. 63

Рисунок 27. Изображение HeLa Kyoto, трансфецированных HyPer7-Giantin (сигнал локализации в аппарате Гольджи), полученное с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. Слева: HyPer7 (F500) зеленый канал, справа – HyPer7 (F400) голубой канал. В результате проведенных экспериментов и наблюдений нами была доказана заявленная локализация белков HyPer7-Micos60, HyPer7-AKAP1, HyPer7-MICUI, HyPer7-Tom20, HyPer7-Lck, HyPer7-Giantin и HyPer7-PTS1, чья функциональная активность была проверена на следующем этапе работы. 3.3 Оценка функциональной активности конструктов HyPer7 Для проверки ответа на пероксид водорода созданных нами конструктов HyPer7, а также ранее полученных Валерием Паком [2], была проведена детекция флуоресценции с помощью микроскопа Nikon Eclipse на клетках HeLa Kyoto (рис. 28). Через 24 часа после трансфекции соответствующими конструктами культура клеток была подготовлена для визуализации. Последующую съемку с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии проводили в соответствии с протоколами, разработанными в лаборатории Всеволода Белоусова, в течение которой регистрировали сигнал флуоресценции в двух каналах возбуждения при 400 нм и 500 нм. Спустя две 64

минуты после начала съемки к клеткам добавляли экзогенный пероксид водорода до конечной концентрации 200 мкМ. При окислении интенсивность флуоресценции HyPer7, возбуждаемой при 400 нм должна уменьшаться, с пропорциональным ростом интенсивности флуоресценции, возбуждаемой при 500 нм, что отражается в увеличении отношения F500/F400. Параллельно проводили эксперименты с соответствующим мутантным HyPer7-С121S, нечувствительным к H2O2. В результате все проанализированные нами конструкты, кроме HyPer7MICU1 (данные не приведены), действительно показали рост сигнала F500/F400 в ответ на добавление H2O2 при отсутствии ответа HyPer7-C121S в аналогичных условиях (рис. 28). Интересно, что в случае HyPer7-AKAP1, расположенном на внешней мембране митохондрий, динамический диапазон ответа сенсора при внесении H2O2 значительно больше по сравнению с HyPer7, несущим сигналы локализации Micos60 (внутренняя мембрана митохондрий), IMS (межмембранное пространство митохондрий) и MLS (матрикс митохондрий). Это может отражать характер диффузии пероксида водорода внутри клетки, в частности, через наружную мембрану митохондрий. Судя по полученным нами данным, диффузия пероксида водорода из цитоплазмы через наружную мембрану митохондрий затруднена. Сравнительно низкий динамический диапазон ответа HyPer7, локализованного в аппарате Гольджи и пероксисомах (рис. 28 Д, Е), может быть обусловлен специфическим редокс-статусом данных компартментов, благодаря которому редокс-чувствительные цистеины сенсора находятся преимущественно в предокисленном состоянии. В то время как в цитозоле (сигнал NES) и ядре (сигнал NLS) ответ HyPer7 на экзогенный пероксид приводит к значительно большему изменению сигнала F500/F400 (рис. 28 З, Ж). Это полностью согласуется с литературными данными восстановительном редокс-потенциале данных компартментов [118]. 65 о

Матрикс Межмембранное пространство Внешняя мембрана Внутренняя мембрана Рисунок 28. +H2O2 А Рисунок 2 Б В Г 66

Сигнал ядерного экспорта Ядро Пероксисомы Аппарат Гольджи Продолжение рисунка 28. Д Е Ж З 67

Плазматическая мембрана Продолжение рисунка 28. И Рисунок 28. Слева: графики изменения флуоресцентного сигнала (F500/F400) при добавлении к клеточной линии HeLa Kyoto, экспрессирующей локализованные версии HyPer7 или HyPer7(C121S), экзогенного H2O2 до конечной концентрации 200 мкМ спустя 2 минуты после начала съемки. Справа: микрофотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, окрашенные в псевдоцвета. Цветовая шкала соответствует численным значениям F500/F400. Конструкты на панелях А, Б, Д, Е созданы в данной работе, конструкты В, Г, Ж, З, И из [2]. Таким образом, в ходе данной работы были созданы и проанализированы варианты генетически кодируемого флуоресцентного индикатора пероксида водорода HyPer7, пригодные для использования в пределах различных внутриклеточных компартментов. Согласно нашим представлениям, все отобранные конструкты, обладающие заявленной внутриклеточной локализацией и отвечающие на экзогенный H2O2, могут быть использованы для изучения механизма развития ферроптоза (табл. 5). 68

Таблица 5. Характеристики полученных вариантов HyPer7 (H7) в данной работе, а также ранее созданных Валерием Паком. Конструкт Локализация Внутренняя мембрана митохондрий Внутренняя H7-MICU1 мембрана митохондрий Внешняя H7-AKAP1 мембрана митохондрий Внешняя Tom20 мембрана митохондрий Матрикс H7-MLS митохондрий Межмембранное H7-IMS пространство митохондрий Аппарат H7-Giantin Гольджи H7-KDEL ЭПР H7-PTS1 Пероксисомы H7-NLS Ядро H7-NES Цитоплазма Плазматическая H7-FS мембрана Плазматическая H7-Lck мембрана H7Micos60 Потенциальные Верная Реакция конструкты для локализация на H2O2 изучения ферроптоза + + + + - - + + + + Нет данных - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/- + - +/- + - 69

3.4 Подбор модели ферроптоза Ферроптоз может быть индуцирован эрастином (рис. 11), ингибирующим систему xc-, и RSL3 (рис. 12), блокирующим работу GPX4, а также путем нокаута антиферроптотических генов. В качестве экспериментальной клеточной культуры нами была выбрана линия генетически-модифицированных мышиных фибробластов Pfa-1, в которых при добавлении тамоксифена происходит нокаут Gpx4 (Gpx4-/-), приводящий к развитию ферроптоза [69]. В первую очередь мы подтвердили гибель культуры этих клеток после добавления тамоксифена. Для этого клетки были посеяны на малой плотности (при высокой плотности ферроптоз не может быть индуцирован [119]), через 24 часа в ростовую среду был добавлен 4-гидрокситамоксифен (далее Там) до конечной концентрации 1 мкМ. Спустя 72 часа после Там-индуцированного Gpx4-/- нами была проведена оценка выживаемости клеток с помощью реагента AquaBluer и подсчета клеток с применением прижизненного красителя Hoechst. В качестве контроля был использован ингибитор ферроптоза липрокстатин-1 (лип-1). 70

Б А Рисунок 29 Выживаемость клеток (процент от общего количества) в культуре клеток Pfa-1 Gpx4-/- при Там-индуцированном ферроптозе. Тест на выживаемость был проведен после 72 часов Там-опосредованного нокаута Gpx4 (1 мкM). (А) Определение выживаемости Pfa-1 Gpx4-/- клеток (1000 клеток на лунку) с применением красителя AquaBluer. Липрокстатин-1 (лип1) полностью предотвратил клеточную гибель. В качестве контролей использовали образцы необработанных клеток. n=4, ±SD. (Б) Подсчет прижизненно окрашенных клеток Pfa-1 Gpx4-/- (1000 на лунку) витальным краcителем Hoechst. N=2, ±SD (В) Светопольная микроскопия культуры Pfa1 спустя 72 часа после индукции ферроптоза. Согласно данным, полученным на основании использования реагента AquaBluer, добавление Taм приводило к значительному снижению жизнеспособности Pfa-1 клеток, однако, в присутствии лип-1 рост клеток был восстановлен (рис. 29 А), что свидетельствовало о развитии Taминдуцируемой клеточной гибели по ферроптотическому пути. С помощью прижизненного красителя Hoechst также было показано, что внесение Taм приводит к гибели клеток, которая может быть предотвращена ингибитором 71

лип-1 (рис. 29 Б). Любопытно, что лип-1 не только предотвращает гибель клеток по ферроптическому пути при внесении Taм, но и повышает выживаемость контрольных (рис. 29 Б). Помимо постановки генетически-индуцированного ферроптоза, мы также протестировали модель химически-индуцированного ферроптоза путем добавления индуктора ферроптоза RSL3. С целью выбора оптимальной концентрации RSL3 мы добавили индуктор до конечных концентраций 1 нМ - 1 мМ к клеткам Pfa-1 на низкой плотности, и через 24 часа оценили выживаемость клеток с помощью реактива Aquabluer. 150 100 50 м M 1 нM 0 50 0 нM нM 10 50 нM 10 нM 5 нM 1 0 нM 0 RSL3 Рисунок 30. Выживаемость Pfa-1 клеток (процент от общего количества), определенная с помощью реактива AquaBluer, при RSL3-индуцированном ферроптозе клеток культуры Pfa-1. RSL3 вносили в ростовую среду в указанных концентрациях, выживаемость оценивали через 24 часа инкубации. N=2, ±SD. (Данные Новиковой Марии). Было показано, что диапазон концентраций RSL3 от 1 нМ до 50 нМ не оказывает драматического влияния на выживаемость клеток (рис. 30), в то время как при добавлении 500 нМ RSL3 наблюдали гибель практически 100% клеток (рис. 30). Дополнительно в условиях RSL3-индуцированного ферроптоза в культуре клеток Pfa-1 мы использовали липофильный флуорофор BODIPY 72

C11 (cенсор ПОЛ) в комбинации с проточной цитометрией для детекции перекисей липидов, являющихся маркерами ферроптоза. Для индукции ферроптоза была использована подобранная концентрация RSL3 – 500 нМ. Через 5 часов после внесения индуктора ферроптоза к клеткам был добавлен BODIPY C11, и проведена детекция флуоресцентного сигнала. В случае накопления в клетках продуктов ПОЛ, а именно, перекисей липидов, пик эмиссии флуоресценции BODIPY C11 должен смещаться с 591 нм на 510 нм. В нашем случае было показано, что через пять часов после добавления RSL3 происходило смещение спектра флуоресценции BODIPY C11 в более коротковолновую область, что свидетельствовало об образовании продуктов ПОЛ (рис. 31). Рисунок 31. Распределение флуоресцентного сигнала BODIPY C11 в популяции клеток Pfa-1 при RSL3-индуцированном ферроптозе. Результат проточной цитометрии клеток Pfa-1 после 5 часов инкубации с индуктором ферроптоза RSL3 (500 нМ) и последующей обработки индикатором ПОЛ – BODIPY C11. При перекисном окислении липидов интенсивность флуоресценции в канале FITC (525/40 нм) растет. В качестве контроля использовали необработанные клетки. Каждый спектр был получен по результатам анализа 35000 клеток. 73

По итогам проведенных экспериментов мы заключили, что ферроптотическая гибель клеток происходила как в случае химически-, так и генетически-индуцированного ферроптоза. Однако, данные коллег из лаборатории Маркуса Конрада свидетельствуют о более синхронном протекании RSL3-индуцированного ферроптоза в популяции культивируемых клеток из-за более быстрого развития процесса. Поэтому для дальнейшей работы мы сосредоточились на модели ферроптоза, индуцируемого посредством RSL3. 3.5 Детекция H2O2 с помощью HyPer7 при развитии ферроптоза Полученный набор вариантов HyPer7 может быть использован для анализа образования пероксида водорода во времени и пространстве при запуске ферроптотического каскада. Для отработки системы мы начали с одного конструкта – HyPer7-AKAP1, локализованного на внешней мембране митохондрий, в одной временной точке. Этот конструкт был выбран по причине известной способности митохондрий образовывать АФК при развитии окислительного стресса. Мы производили транзиентную трансфекцию клеток Pfa-1 конструктами HyPer7-AKAP1 и HyPer7(C121S)-AKAP1, через 24 часа клетки пассировали для достижения более низкой плотности, еще через 24 часа индуцировали ферроптоз внесением в ростовую среду RSL3 в конечной концентрации 500 нМ. Широкопольную флуоресцентную микроскопию проводили спустя пять часов после индукции ферроптоза. По техническим причинам мы не имели возможности детектировать изменение флуоресцентного сигнала HyPer7 непрерывно в течение некоторого времени, поэтому получили отдельные кадры нескольких полей зрения каждого образца в одной временной точке. Также возбуждение производилось на одной длине волны около 400 нм по причине отсутствия необходимого микроскопа. 74

Используя данную схему эксперимента, согласно сигналу HyPer7, мы не обнаружили генерацию пероксида водорода рядом с внешней мембраной митохондрий в выбранной временной точке после индукции ферроптоза (рис. 32 А, Б). Б А В Г HyPer7-AKAP1 HyPer7HyPer7(C121S)HyPer7(C121S)AKAP1+RSL3 AKAP1 AKAP1+RSL3 Рисунок 32. Микрофотографии, сделанные с помощью флуоресцентного микроскопа, клеток Pfa-1, экспрессирующих HyPer7-AKAP1 или HyPer7(C121S)-AKAP1, после индукции ферроптоза с помощью RSL3 (панели Б, Г), и клеток, экспрессирующих HyPer7-AKAP1 или HyPer7(C121S)-AKAP1, без индукции ферроптоза в качестве контроля (панели А, В). Исключительная селективность и чувствительность индикатора HyPer7 делают его привлекательным инструментом для детекции минорных количеств аналита, пероксида водорода, в режиме реального времени. Однако, остается неизвестным временной диапазон, в рамках которого можно ожидать генерацию H2O2 вблизи внутриклеточных мембран при индукции ферроптоза. Мы полагаем, что изменение схемы эксперимента со включением строго 75

необходимого компонента - постоянной детекции флуоресцентного сигнала в ходе некоего продолжительного времени с помощью подходящего оборудования, позволит пролить свет на этот вопрос. Также для проверки работы конструктов HyPer7 следует проводить параллельный эксперимент с экзогенным пероксидом. 76

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенной работы был создан набор функционально активных версий HyPer7 с подтвержденной локализацией в различных субклеточных компартментах: HyPer7-Micos60 на внутренней мембране митохондрий, HyPer7-AKAP1 и HyPer7-Tom20 на внешней мембране митохондрий, HyPer7-Giantin в аппарате Гольджи и HyPer7-PTS1 в пероксисомах. Эти конструкты могут быть использованы для временной и пространственной детекции H2O2 при ферроптозе в соответствующих компартментах. В будущем все полученные конструкты будут дополнительно проверены с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения с использованием TIRF-микроскопа для определения точного расположения внутри клетки. Также в настоящий момент ведутся работы по получению HyPer7, заякоренного на плазматической мембране, мембране ЭПР и ядерной оболочке. Нами была получена версия HyPer7 с Lck-пептидом для заякоривания на плазматической мембране. Этот сигнал успешно применяли ранее в комбинации с мономерными флуоресцентными белками. Однако, мы обнаружили, эффективного что последовательности удержания HyPer7 в Lck-пептида недостаточно плазматической мембране для – флуоресцентный сигнал индикатора был обнаружен также в цитоплазме и в везикулах в ходе интернализации. Для сравнения мы протестировали полученную ранее в лаборатории версию HyPer7-FS, несущую фарнезиловый сигнал, также для заякоривания в плазматической мембране, и увидели аналогичную картину. Очевидно, для получения версии HyPer7, строго ограниченной пределами плазматической мембраны, необходимо протестировать другие сигналы локализации, например, из белков Gap43, Src, KRas [110]. 77

Мы также показали, что использование одиночного KDEL-пептида недостаточно для удержания HyPer7 в пределах ЭПР, поэтому целесообразно дополнить его, например, сигнальной последовательностью кальретикулина [120], как это сделано в коммерческом векторе с геном mKate2-ER (Евроген). Однако в люмене ЭПР, благодаря окисляющему редокс-потенциалу данного компартмента, редокс-чувствительные цистеины HyPer7 находятся в предокисленном состоянии, что может быть затруднением для дальнейшего анализа генерации H2O2. По этой причине необходимо также подобрать таги, эффективно заякоривающие HyPer7 на мембране ЭПР в сторону цитоплазмы. Для этой цели мы планируем использовать, например, Sec61b и BCAP31 [27]. Версия HyPer7-LaminB для локализации на ядерной оболочке в настоящий момент в процессе доработки. Таким образом, нами были получены эффективные инструменты для прижизненной визуализации локальной генерации пероксида водорода, в том числе, в ходе развития ферроптоза. В ходе данной работы мы протестировали две схемы инициации ферроптоза: генетически-индуцируемый путем нокаута гена Gpx4 тамоксифеном и химически-индуцируемый веществом RSL3. В ходе постановки данных модельных экспериментов мы оценивали состояние клеток, определяя уровень их метаболической активности, выживаемость и генерацию продуктов ПОЛ. Это было необходимо, чтобы убедиться, что гибель клеток происходит именно по ферроптотическому пути. В результате нам удалось успешно инициировать ферроптоз в культуре клеток Pfa-1 двумя независимыми способами. Для дальнейших экспериментов мы приняли решение использовать RSL3-индуцированный ферроптоз, который отличается сравнительной быстротой и синхронностью развития процесса в клеточной популяции. Мы использовали HyPer7-AKAP1, заякоренный на внешней мембране митохондрий, для того чтобы проверить, является ли данный субкомпартмент источником H2O2 в ходе развития ферроптоза. По техническим причинам мы 78

проводили возбуждение флуоресценции только при одной длине волны 400 нм и визуально детектировали сигнал HyPer7 в одной временной точке, а именно – через 5 часов после RSL3-опосредованной индукции ферроптоза. В результате нам не удалось зафиксировать разницу сигнала HyPer7 между обработанными RSL3 и контрольными клетками, что может свидетельствовать о том, что в данной временной точке генерации пероксида водорода вблизи внешней мембраны митохондрий не происходит. Однако, как мы уже отмечали ранее, этот эксперимент необходимо повторить, детектируя флуоресцентный сигнал HyPer7 при возбуждении флуоресценции в двух каналах на протяжении нескольких часов после индукции ферроптоза c помощью микроскопа Nikon TIRF Laser System, поддерживая температуру и уровень CO2 на требуемых уровнях. Кроме того, мы планируем использовать систему для высокопроизводительного скрининга, которая позволит тестировать одновременно несколько вариантов HyPer7 с различными локализациями. Также для продолжения исследовательской работы мы планируем оптимизировать схему трансфекции вариантами HyPer7 культуры клеток Pfa-1. Использованный нами подход, в ходе которого трансфецированные липофильным агентом клетки подвергали обработке трипсином с последующим посевом клеток на низкой плотности для запуска RSL3индуцированного ферроптоза, может быть источником дополнительного окислительного стресса. Для того, чтобы добиться эффективной трансфекции в условиях низкой плотности клеточной популяции мы планируем протестировать электропорацию, а также применить трансдукции лентивирусами для получения стабильной экспрессии. Изучение временно-пространственной локализации H2O2 при инициации ферроптоза после завершения оптимизации системы на модельных экспериментах с Pfa-1 будет продолжено в рамках других моделей запуска ферроптоза и на других клеточных линиях, в том числе с нокаутами ключевых генов-регуляторов ферроптоза, таких как Gpx4, Fsp1 и Acsl4. Данная работа 79

позволит ответить на вопрос индивидуального вклада пероксида водорода в процесс инициации и развития ферроптоза локально в рамках отдельных клеточных субкомпартментов, который до сих пор остается неизвестным. 80

ВЫВОДЫ 1. Были получены молекулярно-генетические конструкты, кодирующие версии флуоресцентного индикатора пероксида водорода HyPer7, несущие сигналы локализации в различные субкомпартменты клетки. 2. Была определена внутриклеточная локализация полученных версий HyPer7 и были отобраны варианты с наиболее эффективной локализацией: HyPer7-Micos60 и MICUI (внутренняя мембрана митохондрий), HyPer7-AKAP1 и Tom20 (внешняя мембрана митохондрий), HyPer7-PTS1 (пероксисомы), HyPer7-Giantin (аппарат Гольджи). 3. Отобранные версии HyPer7 обладали функциональной активностью: при добавлении H2O2 происходило изменение отношений интенсивности флуоресценции в двух каналах возбуждения 4. Были успешно освоены две модели запуска ферроптоза в клетках мышиных фибробластов Pfa-1: посредством нокаута гена Gpx4 и с помощью RSL3. Для дальнейшей работы была выбрана модель RSL3индуцируемого ферроптоза. 5. С помощью индикатора HyPer7-AKAP1 было показано, что через 5 часов после RSL3-опосредованной индукции ферроптоза в клетках Pfa-1 появления пероксида водорода вблизи внешней мембраны митохондрий не происходит. 81

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Belousov V. V., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Staroverov D. B., Shakhbazov K. S., Terskikh A. V., Lukyanov S. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide // Nat Methods. ‒ 2006. ‒ Vol. 3, № 4. ‒ C. 281-6. 2. Pak V. V., Ezerina D., Lyublinskaya O. G., Pedre B., Tyurin-Kuzmin P. A., Mishina N. M., Thauvin M., Young D., Wahni K., Martinez Gache S. A., Demidovich A. D., Ermakova Y. G., Maslova Y. D., Shokhina A. G., Eroglu E., Bilan D. S., Bogeski I., Michel T., Vriz S., Messens J., Belousov V. V. Ultrasensitive Genetically Encoded Indicator for Hydrogen Peroxide Identifies Roles for the Oxidant in Cell Migration and Mitochondrial Function // Cell Metab. ‒ 2020. ‒ Vol. 31, № 3. ‒ C. 642-653 e6. 3. Distefano A. M., Martin M. V., Cordoba J. P., Bellido A. M., D'Ippolito S., Colman S. L., Soto D., Roldan J. A., Bartoli C. G., Zabaleta E. J., Fiol D. F., Stockwell B. R., Dixon S. J., Pagnussat G. C. Heat stress induces ferroptosislike cell death in plants // J Cell Biol. ‒ 2017. ‒ Vol. 216, № 2. ‒ C. 463-476. 4. Aguilera A., Berdun F., Bartoli C., Steelheart C., Alegre M., Salerno G., Pagnussat G., Martin M. V. Heat stress induces ferroptosis in a photosynthetic prokaryote // Book Heat stress induces ferroptosis in a photosynthetic prokaryote / EditorCold Spring Harbor Laboratory, 2019. 5. Jenkins N. L., James S. A., Salim A., Sumardy F., Speed T. P., Conrad M., Richardson D. R., Bush A. I., McColl G. Ferrous-glutathione coupling mediates ferroptosis and frailty in Caenorhabditis elegans // Book Ferrous-glutathione coupling mediates ferroptosis and frailty in Caenorhabditis elegans / EditorCold Spring Harbor Laboratory, 2019. 6. Jiang X., Stockwell B. R., Conrad M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease // Nat Rev Mol Cell Biol. ‒ 2021. ‒ Vol. 22, № 4. ‒ C. 266-282. 7. Yan N., Zhang J. Iron Metabolism, Ferroptosis, and the Links With Alzheimer's Disease // Front Neurosci. ‒ 2019. ‒ Vol. 13. ‒ C. 1443. 8. Mi Y., Gao X., Xu H., Cui Y., Zhang Y., Gou X. The Emerging Roles of Ferroptosis in Huntington’s Disease // NeuroMolecular Medicine. ‒ 2019. ‒ Vol. 21, № 2. ‒ C. 110-119. 9. Chen X., Kang R., Kroemer G., Tang D. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer // Nat Rev Clin Oncol. ‒ 2021. ‒ Vol. 18, № 5. ‒ C. 280296. 82

10. Yan H. F., Tuo Q. Z., Yin Q. Z., Lei P. The pathological role of ferroptosis in ischemia/reperfusion-related injury // Zool Res. ‒ 2020. ‒ Vol. 41, № 3. ‒ C. 220-230. 11. Li D., Jiang C., Mei G., Zhao Y., Chen L., Liu J., Tang Y., Gao C., Yao P. Quercetin Alleviates Ferroptosis of Pancreatic beta Cells in Type 2 Diabetes // Nutrients. ‒ 2020. ‒ Vol. 12, № 10. 12. Palmer A. E., Qin Y., Park J. G., McCombs J. E. Design and application of genetically encoded biosensors // Trends Biotechnol. ‒ 2011. ‒ Vol. 29, № 3. ‒ C. 144-52. 13. Hoi H., Matsuda T., Nagai T., Campbell R. E. Highlightable Ca2+ indicators for live cell imaging // J Am Chem Soc. ‒ 2013. ‒ Vol. 135, № 1. ‒ C. 46-9. 14. Zhao Y., Shen Y., Wen Y., Campbell R. E. High-Performance Intensiometric Direct- and Inverse-Response Genetically Encoded Biosensors for Citrate // ACS Cent Sci. ‒ 2020. ‒ Vol. 6, № 8. ‒ C. 1441-1450. 15. Nasu Y., Shen Y., Kramer L., Campbell R. E. Structure- and mechanismguided design of single fluorescent protein-based biosensors // Nat Chem Biol. ‒ 2021. ‒ Vol. 17, № 5. ‒ C. 509-518. 16. Walia A., Waadt R., Jones A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery // Annu Rev Plant Biol. ‒ 2018. ‒ Vol. 69. ‒ C. 497-524. 17. Miyawaki A., Tsien R. Y. Monitoring protein conformations and interactions by fluorescence resonance energy transfer between mutants of green fluorescent protein Elsevier, 2000. ‒ C. 472-500. 18. Park J. G., Palmer A. E. Quantitative measurement of Ca2+ and Zn2+ in mammalian cells using genetically encoded fluorescent biosensors // Methods Mol Biol. ‒ 2014. ‒ Vol. 1071. ‒ C. 29-47. 19. Okumoto S., Jones A., Frommer W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors // Annu Rev Plant Biol. ‒ 2012. ‒ Vol. 63. ‒ C. 663-706. 20. Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan,Aequorea // Journal of Cellular and Comparative Physiology. ‒ 1962. ‒ Vol. 59, № 3. ‒ C. 223-239. 21. Gorokhovatsky A. Y., Marchenkov V. V., Rudenko N. V., Ivashina T. V., Ksenzenko V. N., Burkhardt N., Semisotnov G. V., Vinokurov L. M., Alakhov Y. B. Fusion of Aequorea victoria GFP and aequorin provides their Ca2+induced interaction that results in red shift of GFP absorption and efficient 83

bioluminescence energy transfer // Biochemical and Biophysical Research Communications. ‒ 2004. ‒ Vol. 320, № 3. ‒ C. 703-711. 22. Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W., Prendergast F. G., Cormier M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. ‒ 1992. ‒ Vol. 111, № 2. ‒ C. 229-233. 23. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W., Prasher D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. ‒ 1994. ‒ Vol. 263, № 5148. ‒ C. 802-805. 24. Yang F., Moss L. G., Phillips G. N. The molecular structure of green fluorescent protein // Nature Biotechnology. ‒ 1996. ‒ Vol. 14, № 10. ‒ C. 12461251. 25. Remington S. J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics // Curr Opin Struct Biol. ‒ 2006. ‒ Vol. 16, № 6. ‒ C. 714-21. 26. Ward W. W., Bokman S. H. Reversible denaturation of Aequorea greenfluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein // Biochemistry. ‒ 1982. ‒ Vol. 21, № 19. ‒ C. 4535-4540. 27. Lam S. S., Martell J. D., Kamer K. J., Deerinck T. J., Ellisman M. H., Mootha V. K., Ting A. Y. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling // Nature Methods. ‒ 2015. ‒ Vol. 12, № 1. ‒ C. 51-54. 28. Reid B. G., Flynn G. C. Chromophore Formation in Green Fluorescent Protein // Biochemistry. ‒ 1997. ‒ Vol. 36, № 22. ‒ C. 6786-6791. 29. Grigorenko B. L., Krylov A. I., Nemukhin A. V. Molecular Modeling Clarifies the Mechanism of Chromophore Maturation in the Green Fluorescent Protein // J Am Chem Soc. ‒ 2017. ‒ Vol. 139, № 30. ‒ C. 10239-10249. 30. Sarkisyan K. S., Yampolsky I. V., Solntsev K. M., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A., Mishin A. S. Tryptophan-based chromophore in fluorescent proteins can be anionic // Sci Rep. ‒ 2012. ‒ Vol. 2. ‒ C. 608. 31. Lambert T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database // Nature Methods. ‒ 2019. ‒ Vol. 16, № 4. ‒ C. 277-278. 32. Heim R., Cubitt A. B., Tsien R. Y. Improved green fluorescence // Nature. ‒ 1995. ‒ Vol. 373, № 6516. ‒ C. 663-664. 33. Roquemore L., Thastrup O., Goodyer I., Pagliaro L. Switching on the Lights:Exploiting Aequorea victoria GFP for automated live-cell screening // Life Science News. ‒ 2002. ‒ Vol. 11. 84

34. Khmelinskii A., Keller P. J., Bartosik A., Meurer M., Barry J. D., Mardin B. R., Kaufmann A., Trautmann S., Wachsmuth M., Pereira G., Huber W., Schiebel E., Knop M. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics // Nat Biotechnol. ‒ 2012. ‒ Vol. 30, № 7. ‒ C. 708-14. 35. Bizzarri R., Serresi M., Luin S., Beltram F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review // Anal Bioanal Chem. ‒ 2009. ‒ Vol. 393, № 4. ‒ C. 1107-22. 36. Allen M. D., Dipilato L. M., Ananthanarayanan B., Newman R. H., Ni Q., Zhang J. Dynamic Visualization of Signaling Activities in Living Cells // Science Signaling. ‒ 2008. ‒ Vol. 1, № 37. ‒ C. pt6-pt6. 37. Strebel A., Harr T., Bachmann F., Wernli M., Erb P. Green fluorescent protein as a novel tool to measure apoptosis and necrosis // Cytometry. ‒ 2001. ‒ Vol. 43, № 2. ‒ C. 126-133. 38. Bardet P. L., Kolahgar G., Mynett A., Miguel-Aliaga I., Briscoe J., Meier P., Vincent J. P. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging // Proceedings of the National Academy of Sciences. ‒ 2008. ‒ Vol. 105, № 37. ‒ C. 13901-13905. 39. Li X., Zhao X., Fang Y., Jiang X., Duong T., Fan C., Huang C. C., Kain S. R. Generation of destabilized green fluorescent protein as a transcription reporter // J Biol Chem. ‒ 1998. ‒ Vol. 273, № 52. ‒ C. 34970-5. 40. Yu Y., Lutz S. Circular permutation: a different way to engineer enzyme structure and function // Trends Biotechnol. ‒ 2011. ‒ Vol. 29, № 1. ‒ C. 18-25. 41. Kostyuk A. I., Demidovich A. D., Kotova D. A., Belousov V. V., Bilan D. S. Circularly Permuted Fluorescent Protein-Based Indicators: History, Principles, and Classification // Int J Mol Sci. ‒ 2019. ‒ Vol. 20, № 17. 42. Shen Z., Liu T., Li Y., Lau J., Yang Z., Fan W., Zhou Z., Shi C., Ke C., Bregadze V. I., Mandal S. K., Liu Y., Li Z., Xue T., Zhu G., Munasinghe J., Niu G., Wu A., Chen X. Fenton-Reaction-Acceleratable Magnetic Nanoparticles for Ferroptosis Therapy of Orthotopic Brain Tumors // ACS Nano. ‒ 2018. ‒ Vol. 12, № 11. ‒ C. 11355-11365. 43. Pinton P., Rimessi A., Romagnoli A., Prandini A., Rizzuto R. Biosensors for the Detection of Calcium and pH Elsevier, 2007. ‒ C. 297-325. 44. Baker B. J., Mutoh H., Dimitrov D., Akemann W., Perron A., Iwamoto Y., Jin L., Cohen L. B., Isacoff E. Y., Pieribone V. A., Hughes T., Knopfel T. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential // Brain Cell Biol. ‒ 2008. ‒ Vol. 36, № 1-4. ‒ C. 53-67. 85

45. Hanson G. T., Aggeler R., Oglesbee D., Cannon M., Capaldi R. A., Tsien R. Y., Remington S. J. Investigating mitochondrial redox potential with redoxsensitive green fluorescent protein indicators // J Biol Chem. ‒ 2004. ‒ Vol. 279, № 13. ‒ C. 13044-53. 46. Gutscher M., Sobotta M. C., Wabnitz G. H., Ballikaya S., Meyer A. J., Samstag Y., Dick T. P. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2scavenging peroxidases // J Biol Chem. ‒ 2009. ‒ Vol. 284, № 46. ‒ C. 3153240. 47. Markvicheva K. N., Bilan D. S., Mishina N. M., Gorokhovatsky A. Y., Vinokurov L. M., Lukyanov S., Belousov V. V. A genetically encoded sensor for H2O2 with expanded dynamic range // Bioorganic & Medicinal Chemistry. ‒ 2011. ‒ Vol. 19, № 3. ‒ C. 1079-1084. 48. Bilan D. S., Pase L., Joosen L., Gorokhovatsky A. Y., Ermakova Y. G., Gadella T. W., Grabher C., Schultz C., Lukyanov S., Belousov V. V. HyPer-3: a genetically encoded H(2)O(2) probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging // ACS Chem Biol. ‒ 2013. ‒ Vol. 8, № 3. ‒ C. 535-42. 49. Melo E. P., Lopes C., Gollwitzer P., Lortz S., Lenzen S., Mehmeti I., Kaminski C. F., Ron D., Avezov E. TriPer, an optical probe tuned to the endoplasmic reticulum tracks changes in luminal H2O2 // BMC Biol. ‒ 2017. ‒ Vol. 15, № 1. ‒ C. 24. 50. Ermakova Y. G., Bilan D. S., Matlashov M. E., Mishina N. M., Markvicheva K. N., Subach O. M., Subach F. V., Bogeski I., Hoth M., Enikolopov G., Belousov V. V. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide // Nat Commun. ‒ 2014. ‒ Vol. 5. ‒ C. 5222. 51. Helmann J. D. OxyR: A Molecular Code for Redox Sensing? // Science Signaling. ‒ 2002. ‒ Vol. 2002, № 157. ‒ C. pe46-pe46. 52. Jo I., Chung I. Y., Bae H. W., Kim J. S., Song S., Cho Y. H., Ha N. C. Structural details of the OxyR peroxide-sensing mechanism // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2015. ‒ Vol. 112, № 20. ‒ C. 6443-8. 53. Bilan D. S., Belousov V. V. HyPer Family Probes: State of the Art // Antioxid Redox Signal. ‒ 2016. ‒ Vol. 24, № 13. ‒ C. 731-51. 54. Poburko D., Santo-Domingo J., Demaurex N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations // J Biol Chem. ‒ 2011. ‒ Vol. 286, № 13. ‒ C. 11672-84. 86

55. Niethammer P., Grabher C., Look A. T., Mitchison T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish // Nature. ‒ 2009. ‒ Vol. 459, № 7249. ‒ C. 996-9. 56. Love N. R., Chen Y., Ishibashi S., Kritsiligkou P., Lea R., Koh Y., Gallop J. L., Dorey K., Amaya E. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration // Nat Cell Biol. ‒ 2013. ‒ Vol. 15, № 2. ‒ C. 222-8. 57. Back P., De Vos W. H., Depuydt G. G., Matthijssens F., Vanfleteren J. R., Braeckman B. P. Exploring real-time in vivo redox biology of developing and aging Caenorhabditis elegans // Free Radical Biology and Medicine. ‒ 2012. ‒ Vol. 52, № 5. ‒ C. 850-859. 58. Sainsbury S., Ren J., Nettleship J. E., Saunders N. J., Stuart D. I., Owens R. J. The structure of a reduced form of OxyR from Neisseria meningitidis // BMC Structural Biology. ‒ 2010. ‒ Vol. 10, № 1. ‒ C. 10. 59. Galluzzi L., Vitale I., Aaronson S. A., Abrams J. M., Adam D., Agostinis P., Alnemri E. S., Altucci L., Amelio I., Andrews D. W., Annicchiarico-Petruzzelli M., Antonov A. V., Arama E., Baehrecke E. H., Barlev N. A., Bazan N. G., Bernassola F., Bertrand M. J. M., Bianchi K., Blagosklonny M. V., Blomgren K., Borner C., Boya P., Brenner C., Campanella M., Candi E., CarmonaGutierrez D., Cecconi F., Chan F. K., Chandel N. S., Cheng E. H., Chipuk J. E., Cidlowski J. A., Ciechanover A., Cohen G. M., Conrad M., Cubillos-Ruiz J. R., Czabotar P. E., D'Angiolella V., Dawson T. M., Dawson V. L., De Laurenzi V., De Maria R., Debatin K. M., DeBerardinis R. J., Deshmukh M., Di Daniele N., Di Virgilio F., Dixit V. M., Dixon S. J., Duckett C. S., Dynlacht B. D., El-Deiry W. S., Elrod J. W., Fimia G. M., Fulda S., Garcia-Saez A. J., Garg A. D., Garrido C., Gavathiotis E., Golstein P., Gottlieb E., Green D. R., Greene L. A., Gronemeyer H., Gross A., Hajnoczky G., Hardwick J. M., Harris I. S., Hengartner M. O., Hetz C., Ichijo H., Jaattela M., Joseph B., Jost P. J., Juin P. P., Kaiser W. J., Karin M., Kaufmann T., Kepp O., Kimchi A., Kitsis R. N., Klionsky D. J., Knight R. A., Kumar S., Lee S. W., Lemasters J. J., Levine B., Linkermann A., Lipton S. A., Lockshin R. A., Lopez-Otin C., Lowe S. W., Luedde T., Lugli E., MacFarlane M., Madeo F., Malewicz M., Malorni W., Manic G., Marine J. C., Martin S. J., Martinou J. C., Medema J. P., Mehlen P., Meier P., Melino S., Miao E. A., Molkentin J. D., Moll U. M., Munoz-Pinedo C., Nagata S., Nunez G., Oberst A., Oren M., Overholtzer M., Pagano M., Panaretakis T., Pasparakis M., Penninger J. M., Pereira D. M., Pervaiz S., Peter M. E., Piacentini M., Pinton P., Prehn J. H. M., Puthalakath H., Rabinovich G. A., Rehm M., Rizzuto R., Rodrigues C. M. P., Rubinsztein D. C., Rudel T., Ryan K. M., Sayan E., Scorrano L., Shao F., Shi Y., Silke J., Simon H. U., 87

Sistigu A., Stockwell B. R., Strasser A., Szabadkai G., Tait S. W. G., Tang D., Tavernarakis N., Thorburn A., Tsujimoto Y., Turk B., Vanden Berghe T., Vandenabeele P., Vander Heiden M. G., Villunger A., Virgin H. W., Vousden K. H., Vucic D., Wagner E. F., Walczak H., Wallach D., Wang Y., Wells J. A., Wood W., Yuan J., Zakeri Z., Zhivotovsky B., Zitvogel L., Melino G., Kroemer G. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018 // Cell Death Differ. ‒ 2018. ‒ Vol. 25, № 3. ‒ C. 486-541. 60. Tang D., Kang R., Berghe T. V., Vandenabeele P., Kroemer G. The molecular machinery of regulated cell death // Cell Res. ‒ 2019. ‒ Vol. 29, № 5. ‒ C. 347364. 61. Kerr J. F. R., Wyllie A. H., Currie A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wideranging Implications in Tissue Kinetics // British Journal of Cancer. ‒ 1972. ‒ Vol. 26, № 4. ‒ C. 239-257. 62. Green, John C., Nbsp, Reed D. R. Mitochondria and Apoptosis // Science. ‒ 1998. ‒ Vol. 281, № 5381. ‒ C. 1309-1312. 63. Ashkenazi A., Dixit V. M. Apoptosis control by death and decoy receptors // Current Opinion in Cell Biology. ‒ 1999. ‒ Vol. 11, № 2. ‒ C. 255-260. 64. Apoptosis Assays and Probes. ‒ 2017. ‒ URL: https://www.aatbio.com/resources/application-notes/apoptosis-assays-andprobes (дата обращения: April 28.2021). 65. Hiebert P. R., Granville D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair // Trends in Molecular Medicine. ‒ 2012. ‒ Vol. 18, № 12. ‒ C. 732-741. 66. Dolma S., Lessnick S. L., Hahn W. C., Stockwell B. R. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells // Cancer Cell. ‒ 2003. ‒ Vol. 3, № 3. ‒ C. 285296. 67. Yagoda N., von Rechenberg M., Zaganjor E., Bauer A. J., Yang W. S., Fridman D. J., Wolpaw A. J., Smukste I., Peltier J. M., Boniface J. J., Smith R., Lessnick S. L., Sahasrabudhe S., Stockwell B. R. RAS-RAF-MEK-dependent oxidative cell death involving voltage-dependent anion channels // Nature. ‒ 2007. ‒ Vol. 447, № 7146. ‒ C. 864-8. 68. Yang W. S., Stockwell B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells // Chem Biol. ‒ 2008. ‒ Vol. 15, № 3. ‒ C. 234-45. 88

69. Seiler A., Schneider M., Förster H., Roth S., Wirth E. K., Culmsee C., Plesnila N., Kremmer E., Rådmark O., Wurst W., Bornkamm G. W., Schweizer U., Conrad M. Glutathione peroxidase 4 senses and translates oxidative stress into 12/15-lipoxygenase dependent- and AIF-mediated cell death // Cell Metab. ‒ 2008. ‒ Vol. 8, № 3. ‒ C. 237-48. 70. Dixon S. J., Lemberg K. M., Lamprecht M. R., Skouta R., Zaitsev E. M., Gleason C. E., Patel D. N., Bauer A. J., Cantley A. M., Yang W. S., Morrison B., 3rd, Stockwell B. R. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death // Cell. ‒ 2012. ‒ Vol. 149, № 5. ‒ C. 1060-72. 71. Ayala A., Munoz M. F., Arguelles S. Lipid peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2nonenal // Oxid Med Cell Longev. ‒ 2014. ‒ Vol. 2014. ‒ C. 360438. 72. Proneth B., Conrad M. Ferroptosis and necroinflammation, a yet poorly explored link // Cell Death Differ. ‒ 2019. ‒ Vol. 26, № 1. ‒ C. 14-24. 73. Agmon E., Solon J., Bassereau P., Stockwell B. R. Modeling the effects of lipid peroxidation during ferroptosis on membrane properties // Sci Rep. ‒ 2018. ‒ Vol. 8, № 1. ‒ C. 5155. 74. Feng H., Stockwell B. R. Unsolved mysteries: How does lipid peroxidation cause ferroptosis? // PLoS Biol. ‒ 2018. ‒ Vol. 16, № 5. ‒ C. e2006203. 75. Friedmann Angeli J. P., Krysko D. V., Conrad M. Ferroptosis at the crossroads of cancer-acquired drug resistance and immune evasion // Nat Rev Cancer. ‒ 2019. ‒ Vol. 19, № 7. ‒ C. 405-414. 76. Yamada N., Karasawa T., Wakiya T., Sadatomo A., Ito H., Kamata R., Watanabe S., Komada T., Kimura H., Sanada Y., Sakuma Y., Mizuta K., Ohno N., Sata N., Takahashi M. Iron overload as a risk factor for hepatic ischemiareperfusion injury in liver transplantation: Potential role of ferroptosis // Am J Transplant. ‒ 2020. ‒ Vol. 20, № 6. ‒ C. 1606-1618. 77. Xie Y., Hou W., Song X., Yu Y., Huang J., Sun X., Kang R., Tang D. Ferroptosis: process and function // Cell Death & Differentiation. ‒ 2016. ‒ Vol. 23, № 3. ‒ C. 369-379. 78. Conrad M., Angeli J. P. F., Vandenabeele P., Stockwell B. R. Regulated necrosis: disease relevance and therapeutic opportunities // Nature Reviews Drug Discovery. ‒ 2016. ‒ Vol. 15, № 5. ‒ C. 348-366. 79. Yu H., Guo P., Xie X., Wang Y., Chen G. Ferroptosis, a new form of cell death, and its relationships with tumourous diseases // J Cell Mol Med. ‒ 2017. ‒ Vol. 21, № 4. ‒ C. 648-657. 89

80. Chen X., Comish P. B., Tang D., Kang R. Characteristics and Biomarkers of Ferroptosis // Front Cell Dev Biol. ‒ 2021. ‒ Vol. 9. ‒ C. 637162. 81. Yang W. S., SriRamaratnam R., Welsch M. E., Shimada K., Skouta R., Viswanathan V. S., Cheah J. H., Clemons P. A., Shamji A. F., Clish C. B., Brown L. M., Girotti A. W., Cornish V. W., Schreiber S. L., Stockwell B. R. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4 // Cell. ‒ 2014. ‒ Vol. 156, № 1-2. ‒ C. 317-331. 82. Ingold I., Berndt C., Schmitt S., Doll S., Poschmann G., Buday K., Roveri A., Peng X., Porto Freitas F., Seibt T., Mehr L., Aichler M., Walch A., Lamp D., Jastroch M., Miyamoto S., Wurst W., Ursini F., Arnér E. S. J., Fradejas-Villar N., Schweizer U., Zischka H., Friedmann Angeli J. P., Conrad M. Selenium Utilization by GPX4 Is Required to Prevent Hydroperoxide-Induced Ferroptosis // Cell. ‒ 2018. ‒ Vol. 172, № 3. ‒ C. 409-422.e21. 83. Puglisi R., Maccari I., Pipolo S., Conrad M., Mangia F., Boitani C. The nuclear form of glutathione peroxidase 4 is associated with sperm nuclear matrix and is required for proper paternal chromatin decondensation at fertilization // J Cell Physiol. ‒ 2012. ‒ Vol. 227, № 4. ‒ C. 1420-7. 84. Savaskan N. E., Ufer C., Kuhn H., Borchert A. Molecular biology of glutathione peroxidase 4: from genomic structure to developmental expression and neural function // Biol Chem. ‒ 2007. ‒ Vol. 388, № 10. ‒ C. 1007-17. 85. Li J., Cao F., Yin H. L., Huang Z. J., Lin Z. T., Mao N., Sun B., Wang G. Ferroptosis: past, present and future // Cell Death Dis. ‒ 2020. ‒ Vol. 11, № 2. ‒ C. 88. 86. Doll S., Proneth B., Tyurina Y. Y., Panzilius E., Kobayashi S., Ingold I., Irmler M., Beckers J., Aichler M., Walch A., Prokisch H., Trumbach D., Mao G., Qu F., Bayir H., Fullekrug J., Scheel C. H., Wurst W., Schick J. A., Kagan V. E., Angeli J. P., Conrad M. ACSL4 dictates ferroptosis sensitivity by shaping cellular lipid composition // Nat Chem Biol. ‒ 2017. ‒ Vol. 13, № 1. ‒ C. 91-98. 87. Kagan V. E., Mao G., Qu F., Angeli J. P. F., Doll S., Croix C. S., Dar H. H., Liu B., Tyurin V. A., Ritov V. B., Kapralov A. A., Amoscato A. A., Jiang J., Anthonymuthu T., Mohammadyani D., Yang Q., Proneth B., Klein-Seetharaman J., Watkins S., Bahar I., Greenberger J., Mallampalli R. K., Stockwell B. R., Tyurina Y. Y., Conrad M., Bayır H. Oxidized arachidonic and adrenic PEs navigate cells to ferroptosis // Nature Chemical Biology. ‒ 2017. ‒ Vol. 13, № 1. ‒ C. 81-90. 90

88. Latunde-Dada G. O. Ferroptosis: Role of lipid peroxidation, iron and ferritinophagy // Biochim Biophys Acta Gen Subj. ‒ 2017. ‒ Vol. 1861, № 8. ‒ C. 1893-1900. 89. Susin S. A., Lorenzo H. K., Zamzami N., Marzo I., Snow B. E., Brothers G. M., Mangion J., Jacotot E., Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D. R., Aebersold R., Siderovski D. P., Penninger J. M., Kroemer G. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor // Nature. ‒ 1999. ‒ Vol. 397, № 6718. ‒ C. 441-446. 90. Bersuker K., Hendricks J. M., Li Z., Magtanong L., Ford B., Tang P. H., Roberts M. A., Tong B., Maimone T. J., Zoncu R., Bassik M. C., Nomura D. K., Dixon S. J., Olzmann J. A. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis // Nature. ‒ 2019. ‒ Vol. 575, № 7784. ‒ C. 688-692. 91. Doll S., Freitas F. P., Shah R., Aldrovandi M., da Silva M. C., Ingold I., Goya Grocin A., Xavier da Silva T. N., Panzilius E., Scheel C. H., Mourao A., Buday K., Sato M., Wanninger J., Vignane T., Mohana V., Rehberg M., Flatley A., Schepers A., Kurz A., White D., Sauer M., Sattler M., Tate E. W., Schmitz W., Schulze A., O'Donnell V., Proneth B., Popowicz G. M., Pratt D. A., Angeli J. P. F., Conrad M. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor // Nature. ‒ 2019. ‒ Vol. 575, № 7784. ‒ C. 693-698. 92. Masaldan S., Clatworthy S. A. S., Gamell C., Meggyesy P. M., Rigopoulos A. T., Haupt S., Haupt Y., Denoyer D., Adlard P. A., Bush A. I., Cater M. A. Iron accumulation in senescent cells is coupled with impaired ferritinophagy and inhibition of ferroptosis // Redox Biol. ‒ 2018. ‒ Vol. 14. ‒ C. 100-115. 93. Litter M. I., Slodowicz M. An overview on heterogeneous Fenton and photoFenton reactions using zerovalent iron materials // Journal of Advanced Oxidation Technologies. ‒ 2017. ‒ Vol. 20, № 1. 94. Maiorino M., Conrad M., Ursini F. GPx4, Lipid Peroxidation, and Cell Death: Discoveries, Rediscoveries, and Open Issues // Antioxid Redox Signal. ‒ 2018. ‒ Vol. 29, № 1. ‒ C. 61-74. 95. Hadian K., Stockwell B. R. SnapShot: Ferroptosis // Cell. ‒ 2020. ‒ Vol. 181, № 5. ‒ C. 1188-1188.e1. 96. Martinez A. M., Kim A., Yang W. S. Detection of Ferroptosis by BODIPY 581/591 C11 // Methods Mol Biol. ‒ 2020. ‒ Vol. 2108. ‒ C. 125-130. 97. Drummen G. P. C., Van Liebergen L. C. M., Op Den Kamp J. A. F., Post J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (micro)spectroscopic characterization and validation of methodology // Free Radical Biology and Medicine. ‒ 2002. ‒ Vol. 33, № 4. ‒ C. 473-490. 91

98. Lipid Peroxide Detection - Liperfluo. ‒. ‒ URL: https://www.dojindo.eu.com/store/p/832-Liperfluo.aspx (дата обращения: May 26.2021). 99. Wang S., Luo J., Zhang Z., Dong D., Shen Y., Fang Y., Hu L., Liu M., Dai C., Peng S., Fang Z., Shang P. Iron and magnetic: new research direction of the ferroptosis-based cancer therapy // American journal of cancer research. ‒ 2018. ‒ Vol. 8, № 10. ‒ C. 1933-1946. 100. Pape J. K., Stephan T., Balzarotti F., Buchner R., Lange F., Riedel D., Jakobs S., Hell S. W. Multicolor 3D MINFLUX nanoscopy of mitochondrial MICOS proteins // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2020. ‒ Vol. 117, № 34. ‒ C. 2060720614. 101. Tarasenko D., Barbot M., Jans D. C., Kroppen B., Sadowski B., Heim G., Möbius W., Jakobs S., Meinecke M. The MICOS component Mic60 displays a conserved membrane-bending activity that is necessary for normal cristae morphology // Journal of Cell Biology. ‒ 2017. ‒ Vol. 216, № 4. ‒ C. 889-899. 102. Sastri M., Darshi M., Mackey M., Ramachandra R., Ju S., Phan S., Adams S., Stein K., Douglas C. R., Kim J. J., Ellisman M. H., Taylor S. S., Perkins G. A. Sub-mitochondrial localization of the genetic-tagged mitochondrial intermembrane space-bridging components Mic19, Mic60 and Sam50 // J Cell Sci. ‒ 2017. ‒ Vol. 130, № 19. ‒ C. 3248-3260. 103. Hung V., Zou P., Rhee H. W., Udeshi N. D., Cracan V., Svinkina T., Carr S. A., Mootha V. K., Ting A. Y. Proteomic mapping of the human mitochondrial intermembrane space in live cells via ratiometric APEX tagging // Mol Cell. ‒ 2014. ‒ Vol. 55, № 2. ‒ C. 332-41. 104. Nguyen T. M. T., Kim J., Doan T. T., Lee M. W., Lee M. APEX Proximity Labeling as a Versatile Tool for Biological Research // Biochemistry. ‒ 2020. ‒ Vol. 59, № 3. ‒ C. 260-269. 105. Gao S., Wang H. Y., Malbon C. C. AKAP12 and AKAP5 form higher-order hetero-oligomers // J Mol Signal. ‒ 2011. ‒ Vol. 6. ‒ C. 8. 106. Pfanner N., Meijer M. Mitochondrial biogenesis: The Tom and Tim machine // Current Biology. ‒ 1997. ‒ Vol. 7, № 2. ‒ C. R100-R103. 107. Hung V., Udeshi N. D., Lam S. S., Loh K. H., Cox K. J., Pedram K., Carr S. A., Ting A. Y. Spatially resolved proteomic mapping in living cells with the engineered peroxidase APEX2 // Nat Protoc. ‒ 2016. ‒ Vol. 11, № 3. ‒ C. 45675. 92

108. Hung V., Lam S. S., Udeshi N. D., Svinkina T., Guzman G., Mootha V. K., Carr S. A., Ting A. Y. Proteomic mapping of cytosol-facing outer mitochondrial and ER membranes in living human cells by proximity biotinylation // Elife. ‒ 2017. ‒ Vol. 6. 109. Trychta K. A., Back S., Henderson M. J., Harvey B. K. KDEL Receptors Are Differentially Regulated to Maintain the ER Proteome under Calcium Deficiency // Cell Rep. ‒ 2018. ‒ Vol. 25, № 7. ‒ C. 1829-1840 e6. 110. Chertkova A. O., Mastop M., Postma M., van Bommel N., van der Niet S., Batenburg K. L., Joosen L., Gadella T. W. J., Okada Y., Goedhart J. Robust and Bright Genetically Encoded Fluorescent Markers for Highlighting Structures and Compartments in Mammalian Cells //. ‒ 2020.10.1101/160374. 111. Ito M., Ito R., Huang Y., Miura S., Imamura A., Suzuki Y., Shimozawa N. Rapid isolation and characterization of CHO mutants deficient in peroxisome biogenesis using the peroxisomal forms of fluorescent proteins // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. ‒ 2000. ‒ Vol. 1496, № 2-3. ‒ C. 232-242. 112. Leon S., Zhang L., McDonald W. H., Yates J., 3rd, Cregg J. M., Subramani S. Dynamics of the peroxisomal import cycle of PpPex20p: ubiquitin-dependent localization and regulation // J Cell Biol. ‒ 2006. ‒ Vol. 172, № 1. ‒ C. 67-78. 113. Wu C. C., Maccoss M. J., Mardones G., Finnigan C., Mogelsvang S., Yates J. R., Howell K. E. Organellar Proteomics Reveals Golgi Arginine Dimethylation // Molecular Biology of the Cell. ‒ 2004. ‒ Vol. 15, № 6. ‒ C. 2907-2919. 114. Gillingham A. K., Pfeifer A. C., Munro S. CASP, the Alternatively Spliced Product of the Gene Encoding the CCAAT-Displacement Protein Transcription Factor, Is a Golgi Membrane Protein Related to Giantin // Molecular Biology of the Cell. ‒ 2002. ‒ Vol. 13, № 11. ‒ C. 3761-3774. 115. Linstedt A. D., Foguet M., Renz M., Seelig H. P., Glick B. S., Hauri H. P. A C-terminally-anchored Golgi protein is inserted into the endoplasmic reticulum and then transported to the Golgi apparatus // Proceedings of the National Academy of Sciences. ‒ 1995. ‒ Vol. 92, № 11. ‒ C. 5102-5105. 116. Chen X., Zaro J. L., Shen W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality // Adv Drug Deliv Rev. ‒ 2013. ‒ Vol. 65, № 10. ‒ C. 1357-69. 117. Hara-Chikuma M., Yang B., Sonawane N. D., Sasaki S., Uchida S., Verkman A. S. ClC-3 chloride channels facilitate endosomal acidification and chloride accumulation // J Biol Chem. ‒ 2005. ‒ Vol. 280, № 2. ‒ C. 1241-7. 93

118. Go Y. M., Jones D. P. Redox compartmentalization in eukaryotic cells // Biochim Biophys Acta. ‒ 2008. ‒ Vol. 1780, № 11. ‒ C. 1273-90. 119. Vucetic M., Daher B., Cassim S., Meira W., Pouyssegur J. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis // Cell Death Dis. ‒ 2020. ‒ Vol. 11, № 9. ‒ C. 789. 120. Fliegel L., Burns K., MacLennan D. H., Reithmeier R. A., Michalak M. Molecular cloning of the high affinity calcium-binding protein (calreticulin) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum // Journal of Biological Chemistry. ‒ 1989. ‒ Vol. 264, № 36. ‒ C. 21522-21528. 94

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв