Генетические факторы риска развития гепатита В

Пивоварова

Генетические факторы риска развития гепатита В

Дипломная работа 52 с., введение, 3 главы, выводы, список литературы, список опубликованных работ, 5 таблиц, 13 рисунков, 65 источников, в том числе 22 отечественных, 41 зарубежный и 2 базы данных. Ключевые слова: ВИРУС ГЕПАТИТА В, ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ, MBL2, STAT3 Целью работы было выявление ассоциации полиморфизмов в генах MBL2 и STAT3 с риском развития гепатита В у жителей Ростовской области. Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи: • исследование частоты регистрации полиморфизмов rs1800451 и rs1800450 гена MBL2 в образцах ДНК людей, инфицированных гепатитом В, и контрольной группы; • анализ частоты регистрации полиморфизма rs2293152 гена STAT3 в образцах ДНК, полученных из крови людей, инфицированных гепатитом В, и контрольной группы. • Проведение анализа межгенного взаимодействия исследуемых аллельных вариантов генов. В работе использованы молекулярно-генетические и статистические методы исследования. В качестве материала для исследования были использованы образцы ДНК, выделенные из крови 99 людей в возрасте от 20 до 80 лет. Из них – 47 человек, инфицированных ВГВ и 52 человека без вирусной нагрузки, составивших контрольную группу. Образцы крови были предоставлены клинико-диагностической лабораторией «Наука». По результатам исследования было установлено, что аллель А по полиморфизму rs1800450 гена MBL2 ассоциирована с высоким риском развития гепатита В, а наличие генотипа GG снижает такой риск, обладая защитным эффектом; взаимодействие полиморфных вариантов гена STAT3 с гомозиготным по норме вариантом гена MBL2 снижает риск развития гепатита В.

Биология

Дипломы

Вуз: Южный федеральный университет (ЮФУ)

ID: 5eb539d8ca23590001cd8eeb

UUID: e3206790-7347-0138-34fd-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: почти 4 года назад

Просмотры: 7

10.24

Пивоварова

Комментировать 15

Рецензировать 0

Скачать - 1,9 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Южный федеральный университет» Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского кафедра генетики Веропаха Дарья Дмитриевна ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ГЕПАТИТА В ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА по направлению 060301 – Биология Научный руководитель Профессор кафедры генетики Академии биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского, д.б.н., Машкина Елена Владимировна

Ростов-на-Дону – 2019 РЕФЕРАТ Дипломная работа 52 с., введение, 3 главы, выводы, список литературы, список опубликованных работ, 5 таблиц, 13 рисунков, 65 источников, в том числе 22 отечественных, 41 зарубежный и 2 базы данных. ВИРУС ГЕПАТИТА В, ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ, MBL2, STAT3 Целью работы было выявление ассоциации полиморфизмов в генах MBL2 и STAT3 с риском развития гепатита В у жителей Ростовской области. Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:  исследование частоты регистрации полиморфизмов rs1800451 и rs1800450 гена MBL2 в образцах ДНК людей, инфицированных гепатитом В, и контрольной группы;  анализ частоты регистрации полиморфизма rs2293152 гена STAT3 в образцах ДНК, полученных из крови людей, инфицированных гепатитом В, и контрольной группы.  Проведение анализа межгенного взаимодействия исследуемых аллельных вариантов генов. В работе использованы молекулярно-генетические и статистические методы исследования. В качестве материала для исследования были использованы 2 образцы ДНК,

выделенные из крови 99 людей в возрасте от 20 до 80 лет. Из них – 47 человек, инфицированных ВГВ и 52 человека без вирусной нагрузки, составивших контрольную группу. Образцы крови были предоставлены клинико-диагностической лабораторией «Наука». По аллель результатам А по исследования полиморфизму было установлено, rs1800450 гена что MBL2 ассоциирована с высоким риском развития гепатита В, а наличие генотипа GG снижает такой риск, обладая защитным эффектом; взаимодействие полиморфных вариантов гена STAT3 с гомозиготным по норме вариантом гена MBL2 снижает риск развития гепатита В. ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. РЕФЕРАТ…………………………………………………………………….. .2 ОГЛАВЛЕНИЕ…. ………………………………………………………….....3 СПИСОК СОКРАЩЕНИ……………………... ……………………………...4 ВВЕДЕНИЕ……... ………………………………………………………….....6 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………….. ………….................9 1.1 Особенности строения и жизненного цикла вируса гепатита В.........9 1.2 МСЛ и его роль в восприимчивости организма к вирусу гепатита В……………………………………………………………………………………...1 4 1.3 Роль STAT3 в иммунном ответе организма на ВГВинфекцию…...18 3

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………... ………..….24 2.1 Материал исследования………………………………………………24 2.2 Методы исследования………………………………………………...24 2.2.1 Выделение ДНК термо-коагуляционным методом………………....24 2.2.2 Анализ полиморфизмов в генах. Проведение ПЦР………………...25 2.2.3 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов………..27 2.2.4 Электрофоретическое разделение в агарозном геле продуктов рестрикции………………………………………………………………………… .28 2.3 Методы статистического анализа результатов……………………..31 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…….....33 3.1 Анализ частот генотипов по полиморфизму rs2293152 гена STAT3................................................................................................. ........................33 3.2 Анализ частот генотипов по полиморфизму rs1800451 гена MBL2………………………………………………………………………………... 35 3.3 Анализ частот генотипов по полиморфизму rs1800450 гена MBL2………………………………………………………………………………... 37 3.4 Анализ межгенного взаимодействия маннозсвязывающего лектина и транскрипционного фактора STAT3 при ВГВ-инфекции……………………..39 ВЫВОДЫ…………………………………………………………….. ……...43 4

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ………………………..44 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ………….. ……………………..52 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВГВ – вирусный гепатит В, вирус гепатита В ГЦК – гепатоцеллюлярная карцинома ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота МСЛ – манноз-связывающий лектин ОГВ – острая форма гепатита В ПАМП – патоген-ассоциированные молекулярные паттерны ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота сссДНК – комплементарно закрученная спиральная ДНК ХГВ – хронический гепатит В ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate – дезоксирибонуклеотид трифосфат HBcAg – коровый антиген гепатита В HBeAg – е-антиген гепатита В; анти- HBeAg – антитела к еантигену гепатита В HBsAg – поверхностный антиген гепатита В HBV – hepatitis B virus – вирус гепатита В HBxAg – x-антиген гепатита В 5

HLA – human leucocyte antigen – антигены тканевой совместимости, главный комплекс гистосовместимости Hsp – heat shock proteins – белки теплового шока Ig – immunoglobulin – иммуноглобулин IL – interleukin – интерлейкин IFN – interferon – интерферон JAK – Janus kinase – Янус киназа MASP – mannose-associated serine protease – маннозассоциированная сериновая протеаза NTCP – Na-таурохолат котранспортирующий пептид pgРНК – прегеномная рибонуклеиновая кислота SNP – single nucleotide polymorphism – однонуклеотидный полиморфизм STAT – Signal Transducer and Activator of Transcription – активатор транскрипции, участвующий в передаче сигнала Taq-полимераза – термостабильная ДНК-зависимая-ДНКполимераза бактерии Thermus aquaticus 6

ВВЕДЕНИЕ Гепатит В является одним из самых распространенных заболеваний печени. Известно, что около 5,5 млрд. человек имели контакт с ВГВ-инфекцией. По данным ВОЗ около 2 млрд. человек в мире имеют хотя бы один маркер ВГВ (Демиденко Т.П., Неверов В.А., 2011). Ежегодно регистрируется порядка 45 млн. случаев заболевания данной инфекцией и 1-2 млн. смертей, связанных с ВГВ. При этом в РФ и СНГ от ВГВ ежегодно погибает около 5 тыс. человек от острой формы гепатита В (ОГВ) и 4,5 тыс. – от хронического гепатита В (ХГВ). 10% перенесших возникновения ОГВ становятся носителями гепатоцеллюлярной ВГВ. карциномы Риск (ГЦК) у инфицированных ВГВ в 223 раза превышает риск развития рака печени при отсутствии вируса в организме (Ратникова Л.И. и др.,2013). Восприимчивость людей к ВГВ высока. Наиболее чувствительными являются дети первого года жизни. Чаще вирусом гепатита В заражаются мужчины, что можно объяснить очень высоким уровнем экспрессии гена S вируса под воздействием стероидных гормонов, которых у мужчин больше, чем у женщин (Демиденко Т.П., Неверов В.А., 2011). По результатам мониторинга за 2012 г. в России наибольшие показатели заболеваемости ВГВ регистрировались в возрастных группах населения 30-39 лет (22,8 на 100 тыс. населения) и 20-29 лет (18,5 на 100 тыс. населения) (Ющук Н.Д. и др., 2014). В последнее время наблюдается тенденция снижения заболеваемости в России (рис. 1) ОГВ с 35,3 на 100 тыс. в 2001 году до 1,33 на 100 тыс. в 2013 году и ХГВ с 16 на 100 тыс. в 2001 году до 11,71 на 100 тыс. в 2013 году (Еремеева 7

Ж.Г. и др., 2015). По данным Роспотребнадзора наименьшие показатели заболеваемости были зарегистрированы для ОГВ в 2017 году – 0,9 на 100 тыс. Рисунок 1 – Многолетняя динамика заболеваемости вирусным гепатитом В в РФ за 2001 – 2013 гг. (на 100 тыс. населения) – ОГВ – острый гепатит В, ХГВ – хронический гепатит В. (Еремеева Ж.Г. и др., 2015) Основными источниками инфекции при гепатите В являются лица с бессимптомными и клинически выраженными острыми и хроническими формами болезни. Однако наибольшее эпидемиологическое значение имеют больные с хроническим течением заболевания. Для заражения достаточно всего 10-6 - 10-7 мл крови, содержащей вирусные частицы (Демиденко Т.П., Неверов В.А., 2011). Несмотря на то, что экспрессия вируса происходит, в основном, в гепатоцитах, возбудитель не оказывает прямого цитопатического печёночных действия клеток цитотоксических на клетки происходит иммунных печени. под механизмов, Цитолиз действием мишенями для которых служат антигенные детерминанты вируса гепатита В, ассоциированные с антигенами главного комплекса гистосовместимости (HLA) на поверхности гепатоцитов. Они играют существенную роль в 8 развитии внепечёночных

поражений, которые при хроническом гепатите В встречаются в 22-35% случаев (Лопатина Е.Ю. и др., 2010; Балабина Н.М., 2017). Таким образом, полиморфизмы в генах различных факторов иммунитета могут повлечь за собой изменение восприимчивости организма к инфекционным заболеваниям, в том числе, гепатиту В, а также повлиять на течение инфекции. Так, одним из важнейших факторов врождённого иммунитета белковой природы является манноз-связывающий лектин (МСЛ). Он синтезируется в печени и связывается с сахарами на поверхности микроорганизмов, запуская лектиновый путь активации системы комплемента, что способствует удалению патогенов с помощью комплемент-опосредованного фагоцитоза (Eisen D.P., Minchinton R.M, 2003, Scorza M. et al., 2015). Другим важным фактором иммунитета является сигнальный белок и активатор транскрипции STAT3. Он участвует в передаче сигнала при действии широкого спектра цитокинов и факторов роста (Ярилин А.А., 2010, Wake M.S., Watson C.J., 2015). Целью работы было выявление ассоциации полиморфизмов в генах MBL2 и STAT3 с риском развития гепатита В у жителей Ростовской области. Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:  исследование частоты регистрации полиморфизмов rs1800451 и rs1800450 гена MBL2 в образцах ДНК людей, инфицированных гепатитом В, и контрольной группы; 9

 анализ частоты регистрации полиморфизма rs2293152 гена STAT3 в образцах ДНК, полученных из крови людей, инфицированных гепатитом В, и контрольной группы.  Проведение анализа межгенного исследуемых аллельных вариантов генов. 10 взаимодействия

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Особенности строения и жизненного цикла вируса гепатита В Вирус гепатита В является представителем семейства Hepadnaviridae рода Orthohepadnavirus. Генетическая вариабельность генома вируса гепатита В привела к появлению 10 различных географически распространенных генотипов, обозначенных буквами от А до J. Внутри ряда генотипов выделяют субгенотипы, различающиеся между собой на 4-8% полных геномных последовательностей, что проявляется в незначительных аминокислотных заменах в структуре поверхностного антигена вируса HBsAg. Исследования распространения отдельных генотипов по России немногочисленны, однако имеются данные, что в нашей стране существует всего три генотипа ВГВ: D, А и С, среди которых наиболее распространён генотип D (субтипы HBsAg ayw2 и ayw3) и составляет 88% от всех зарегистрированных и генотипированных случаев выявления вируса гепатита В (Герасимова В.В. и др., 2015, Мануйлов В.А. и др., 2015). Вирус гепатита В имеет сферическую форму диаметром 42-50 нм и состоит из капсида, включающего в себя нуклеопротеид и основной ядерный белок – HbcAg, а также другие белки: HBeAg, HBxAg; и суперкапсида, состоящего из липидной мембраны со встроенными в неё молекулами белков – HBsAg, включающих в себя три домена: S, pre-S1, pre-S2 и рецептор полимеризованного альбумина рАR (рис. 2). Нуклеокапсид представляет собой икосаэдр (имеет гексагональную симметрию) размером 11

34-38 нм и антигена; образован меньшая нуклеокапсид 240 субъединицами корового часть вирионов содержит диаметром 30 нм, образованный 180 субъединицами корового антигена. Внутри нуклеокапсида также находятся клеточные белки-шапероны, или белки теплового шока, Hsp70 и Hsp90 (Львов Д.К. и др., 2008). Рисунок 2 – Схема строения вируса гепатита В (Курманова Г.М. и др., 2013) Генетический двуцепочечной материал кольцевой вируса молекулой представлен ДНК (включает около 3200 нуклеотидов), плюс-цепь которой на 30% короче минус-цепи. Кольцевая конфигурация молекулы формируется не ковалентным связыванием 5’- и 3’-концов, а наличием нахлёста между 5’-концами цепей ДНК, составляющего 240 н.о. 5’-конец минус-цепи ДНК имеет небольшую избыточность по сравнению со строго кольцевой формой и ковалентно связан с молекулой полимеразы, 5’-конец плюс-цепи ДНК ковалентно связан с 19-членной 5’-кэпированной РНК (Рахманова А.Г., Александров П.А., Шаройко В.В., 2015). Вирус гепатита В представляет собой ретроидный вирус – имеет в жизненном 12 цикле стадию синтеза

молекулы ДНК на матрице РНК с помощью ревертазы. Имеет собственные ферменты – ДНК-полимеразу и протеинкиназу, находящиеся в нуклеокапсиде вируса. ДНК-полимераза вируса состоит из N-концевого ТР- домена, обладающего способностью инициировать синтез ДНК без нуклеотидного праймера, спейсерного домена и ОТ-домена, обладающего активностью РНКазы (Burrel C.J. et al., 1999). Геном вируса гепатита В включает в себя 4 гена: Р, S, C и X (рис. 3). Ген Р кодирует РНК-зависимую ДНК-полимеразу вируса, а также участвует в кодировании HBcAg. Ген С кодирует С-белок (HBcAg) и Е-белок (HBeAg). Ген S и предшествующие ему зоны pre-Sl и ргеS2 кодируют 3 белка: S (226 аминокислот), pre-Sl (400 аминокислот) и pre-S2 (281 аминокислота); их также называют S-белок, L-белок и M-белок соответственно. Lбелок отвечает за рецепцию вириона с белком плазматической мембраны гепатоцита аннексином V, а также участвует в формировании вириона. М-белок несет информацию об участке связывания с полимеризованным альбуминовым рецептором, который локализован на гепатоците. S-белок определяет формирование HBsAg, кодирует рецептор полиальбумина pAR. Соотношение субъединиц M:L:S определяется как 1:1:4. Ген X кодирует неструктурный X-белок (154 аминокислоты), обладающий трансактиваторной функцией и вызывающий нарушение клеточной регуляции, а также выступающий в роли инициатора образования гепатокарцином. В геноме вируса присутствуют также регуляторные последовательности ДНК, контролирующие репликацию 13 вируса и синтез

белков. Информационная ёмкость генома вируса гепатита В крайне высока, что обеспечивается перекрыванием открытых рамок считывания генов (Львов Д.К. и др., 2008, Курманова Г.М. и др, 2013). Рисунок 3 – Генетическая карта вируса гепатита В. ECOR1 – рестрикционный сайт, указан как референс-точка начала и конца нуклеотидных последовательностей генома (Герасун Б. А. и др., 2012) HBsAg и HBcAg синтезируются в избытке, к тому же HBcAg способен количествах к самосборке, формируются поэтому дефектные в больших сферические частицы размером 22 нм, лишённые нуклеокапсида, а также нитевидные частицы. Концентрация инфекционных частиц Дейна может достигать значительной величины (105 – 109 частиц/мл), однако концентрация дефектных частиц во много раз превосходит эти значения – до 10 13 частиц/мл (Kim C.Y., Tilles J.G., 1970). Среди основных путей передачи вируса гепатита В можно выделить: парентеральный (в 15,1% случаев - при переливании крови или плазмы, в 23,8% — при различных 14

парентеральных манипуляциях, в 20,5% — при оперативных вмешательствах, в 5,3% — при внутривенном введении наркотиков), половой (26%) и трансплацентарный (9,3%) (Колмогорова Е.Л, Красавцева А.В., Мурзина О.Ю., 2016). ВГВ высокоустойчив к физическим и химическим факторам, сохраняет жизнеспособность в сыворотке крови при комнатной температуре в течение 3 месяцев, в высушенной плазме — до 25 лет, не погибает при действии многих дезинфицирующих средств и консервантов крови. Он инактивируется при автоклавировании (5 мин) и стерилизации сухим жаром (+160 °С), чувствителен к эфиру и не ионным детергентам (Соринсон С.Н., 1997). В механизме развития патологического процесса при вирусном гепатите В можно выделить несколько основных стадий патогенеза: 1. внедрение возбудителя — заражение – фиксация возбудителя на гепатоците и проникновение внутрь клетки; 2. размножение вируса и «выталкивание» его на поверхность гепатоцита, а также в кровь; 3. включение направленных на иммунологических элиминацию реакций, возбудителя; иммунокомплексное поражение органов и систем; 4. формирование иммунитета, освобождение от возбудителя, выздоровление (Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В., Смирнов А.В., 2012). Вирусные частицы передаются парентеральным путём – при попадании любых биологических жидкостей 15

больного на мельчайшие повреждения слизистой оболочки и кожных покровов здорового человека. По кровотоку вирус диссеминирует в печень, фиксируясь на гепатоцитах, рецептор которые для содержат на полиальбумина своей – мембране Na-таурохолат котранспортирующий пептид (NTCP). С помощью pAR вирус гепатита В проникает в гепатоцит. Суперкапсид вируса при этом транспортируется нуклеоплазме разрушается. вдоль Нуклеокапсид микротрубочек ДНК-полимераза к вируса вируса ядру и в достраивает одноцепочечные участки положительной цепи ДНК вируса с образованием РНК-репликативного посредника, проводя одновременно транскрипцию вирусспецифичных белков). транскрипция с полимеразы, обладающей Прегеномная помощью РНК отрицательной и Далее следует (синтез обратная вирусспецифичной свойством (pgРНК) цепи трансляцию ДНК- ревертазы. разрушается. новосинтезированной На ДНК комплементарно синтезируется короткая положительная цепь, образуется неполный дуплекс. Он включается в нуклеокапсид гепатоцита. вируса Там и проникает формируется в цитоплазму суперкапсид. Так происходит репликация вируса гепатита В (рис. 4). Длина положительной цепи варьирует в зависимости от времени выхода вируса из гепатоцита. Однако вновь синтезированная ДНК вируса не обязательно покрывается оболочками и выходит из гепатоцита, но может также встроиться в геном гепатоцита. Кроме того, вирус может синтезироваться не только в клетках печени, но и в 16

клетках почек, селезенки, поджелудочной железы, кожи, костного мозга и мононуклеарах периферической крови. Тем не менее, максимальная экспрессия генов вируса проходит именно в гепатоцитах (Демиденко Т.П., Неверов В.А., 2011, Рахманова А.Г., Александров П.А., Шаройко В.В., 2015). Рисунок 4 – Жизненный цикл вируса гепатита В (Рахманова А.Г., Александров П.А., Шаройко В.В., 2015) Наличие фазы репликации вируса гепатита В говорит об активном, прогредиентном течении болезни. При хроническом вирусном гепатите В критерием наличия фазы репликации считается обнаружение в сыворотке крови HBsAg, HBeAg, ДНК вируса гепатита В, ДНКполимеразы, в ткани печени - HBcAg. Критерием фазы интеграции является определение в сыворотке крови HBsAg, в ряде случаев в сочетании с анти-НВеAg, в ткани печени – HBsAg (Балабина Н.М., 2017). 1.2 МСЛ и его роль в восприимчивости организма к вирусу гепатита В 17

Манноз-связывающий лектин паттерн-распознающей играющей важную (МСЛ) рецепторной роль в является молекулой, системе врожденного иммунитета. Он представляет собой лектин С-типа и состоит из четырех доменов, которые в свою очередь образуют гликозилированную полипептидную цепь с молекулярной массой 32кДа (Берлов М.Н. и др., 2011, Pradhan V. et al., 2015). N-концевой домен полипептидной цепи обогащен остатками цистеина; коллагенподобный домен отвечает за связывание сериновых протеаз MASP-1 и MASP-2, внося существенный вклад в активацию комплемента по лектиновому пути (Fujita T., Matsushita M., Endo Y., 2004, Beltrame M.H. et al., 2015); шеечный домен выполняет функции стабилизации первичного олигомера и связывания С-концевого домена с остальной молекулой (Malhortra R. et al., 1992); С-концевой домен является углевод-распознающим, именно он отвечает за распознавание и связывание патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП) в присутствии ионов кальция (Берлов М.Н. и др., 2011). Три такие цепи, объединяясь и образуя тройную спираль в области коллагенподобного домена, составляют олигомер первого порядка. От 2 до 6 таких олигомеров формируют сложную структуру, области похожую богатого на букет цистеином тюльпанов, домена образуя в межцепочечные дисульфидные связи. Вся эта структура в конечном счете представляет собой гомоолигомер (рис. 5) (Jensenius H. et all, 2009). 18

А Б Рисунок 5 – А – общая структура человеческого МСЛ: микрофотография (справа) и схема (слева); Б – Общая схема системы комплемента с фокусировкой на лектиновом пути (Jensenius J. C., 2005) МСЛ остатки с помощью D-маннозы, С-домена а также способен L-фукозы, связывать N-ацетил-D- глюкозамина и, с меньшей аффинностью, D-глюкозы. Однако этот белок не способен связываться с остатками галактозы и их производными. Его специфичность определяет способность связываться в составе олиго- и полисахаридов только моносахаридов. Дело с в терминальными том, что у остатками млекопитающих олигосахаридные цепи гликопротеидов несут на своих терминалях, как правило, производные остатков галактозы либо сиаловой кислоты, в отличие от клеток микроорганизмов. Связывание МСЛ с любыми ПАМП 19

приводит к лектиновому активации пути (рис. системы 5). Для комплемента этого по необходимо поливалентное связывание лектина с патогенном, что обеспечивается наличием 9-18 сайтов связывания в молекуле МСЛ (Jensenius J. C., 2005, Garred P. et al., 2016). Далее комплекс МСЛ-ПАМП подвергается фагоцитозу благодаря рецепторам к коллагеноподобному домену лектина у макрофагов и нейтрофилов. В этом процессе огромную роль играют сериновые протеазы (Zhang X.-L., Ali Mohammed A.M. , 2008, Beltrame M.H. et al., 2015). Таким образом, МСЛ способен повышать эффективность нейтрализации опсонизации возбудителя и микроорганизмов хозяином последующего нейтрофилами, посредством фагоцитоза клеток моноцитами и макрофагами, а также регулировать иммунный ответ за счет снижения продукции провоспалительных цитокинов (Lundbo L.F. et al., 2015). Поэтому от концентрации и стабильности структуры МСЛ в сыворотке крови зависит устойчивость организма к различным возбудителям, в том числе и к вирусу гепатита В. Состояние МСЛ, в свою очередь, зависит от наличия функционально важных полиморфизмов в гене MBL2. У мышей имеется два гомологичных гена MСЛ: MBL1 и MBL2, однако у человека первый из них является псевдогеном и только второй – функциональный ген (Kalia N. et al., 2016). МСЛ человека закодирован единственным геном MBL2, расположенным на 10 хромосоме вблизи центромеры, в регионе 10q11.2–q21. Этот ген состоит из четырех экзонов и трех интронов (рис. 6). В первом экзоне 20

закодирован сигнальный пептид, а также N-концевой и часть коллагенподобного домена; во втором экзоне – оставшаяся часть коллагенподобного домена; в третьем экзоне – шеечный домен; в четвертом – С-концевой домен (Pradhan V., Surve P., Ghosh K., 2010). Рисунок 6 – А – Структура гена MBL2; В – SNPs в 1 экзоне (Pradhan V., Surve P., Ghosh K., 2010) На сегодняшний день найден всего 661 полиморфизм в гене MBL2, 12 из которых являются функционально важными SNPs. Так, например, полиморфизм Gly54Asp негативно влияет на экспрессию MBL2 и стабильность синтезируемого полиморфизм коллагеновой им белка Gly57Glu области (Kalia N. et воздействует МСЛ таким al., на образом, 2016), а структуру что она генерирует дефектные взаимодействия с MASP, доменом распознавания углеводов и его мишенью, вследствие чего уровень циркулирующего МСЛ снижается (Moura T.C. et al., 2017). К тому же, 4 SNPs в области 3′-UTR играют роль 21

в связывании микроРНК, 7 SNPs на 5′ конце и в области интрона предположительно связаны с регулированием присоединения фактора транскрипции и экспрессии гена MBL2 (Kalia N. et al., 2016). Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) выявлены в следующих точках экзона 1: в позиции +223 замена С>T в кодоне 52 (Arg52Cys); в позиции +230 замена G>A в кодоне 54 (Gly54Asp); в позиции +239 замена G>A в кодоне 57 (Gly57Glu). Данные мутации соответствуют аллелям D, B и С или же все могут быть обозначены как аллель О, нормальным аллелем является А. SNPs в промоторной области MBL2 расположены в позициях: –550 замена G>C (H/L вариант), –221 замена G>C (Y/X вариант), а также в 5'-нетранслируемом регионе +4 замена C>T (P/ Q вариант). Они формируют различные гаплотипы, среди которых LX гаплотип ассоциирован с низким уровнем МСЛ в плазме крови (Pradhan V., Surve P., Ghosh K., 2010). В данной работе исследованы полиморфизмы Gly54Asp (rs1800450) и Gly57Glu (rs1800451). Частота первого полиморфизма наиболее высока для жителей Южной Америки (22%) и наиболее низка для жителей Африки (1%). Для европеоидов она составляет 14% (База данных 1000 Genomes – Для второго http://www.internationalgenome.org/). полиморфизма частота высока среди жителей Африки (26%) и крайне низка среди европеоидов (1%), азиатов и инуитов (Zhang N. et all, 2013). Крайне редкая встречаемость полиморфизма rs1800451 также описана для коренных жителей 22 арктических регионов и

европеоидов в РФ (Смольникова М.В., Епанешникова В.Б., Терещенко С.Ю., 2017). 1.3 Роль STAT3 в иммунном ответе организма на ВГВ-инфекцию Белки семейства STAT являются транскрипционными факторами, которые в цитоплазме находятся в неактивном состоянии. Впервые они были обнаружены в ходе исследования передачи сигнала от рецепторов IFN (Levy D.E., Lee C., 2002). В последствие оказалось, что они участвуют в передаче сигнала от многих факторов роста и цитокинов. На данный момент насчитывается всего семь белков данного семейства: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b и STAT6. Каждый из них имеет специфичные для него рецепторы цитокинов и факторов роста, которые активируют именно этот белок. Гены, кодирующие белки семейства STAT расположены на разных хромосомах: на хромосоме 2 находятся гены белков STAT1 и STAT4, на хромосоме 12 – гены STAT2 и STAT6, гены остальных белков семейства STAT располагаются на 17 хромосоме. Все белки STAT сходны по аминокислотной последовательности и молекулярной массе, имеют общую структуру, что выражается в наличии нескольких консервативных доменов, общих для всех белков семейства (Шапошников А. В., 2013). Белок STAT3 интересен тем, что он является ключевой молекулой сигнального пути Janus kinase/STAT (Гук К. Д., Купраш Д. В., 2010, Шапошников А. В., 2013, Chanthra N. et al., 2015), активируется самым широким 23

спектром цитокинов и факторов роста, включая IL-6 и фактор роста гепатоцитов (Xie J. et al.,2013), а также, в отличие от остальных белков семейства, немаловажную роль выполняет при канцерогенезе печени исследование было воспалительных (Li M. et проведено al., процессах 2018). Киоши и Важное Такеда с сотрудниками в 1997 году (Takeda K. et al., 1997), в котором было показано, что мыши, нокаутные по гену STAT3 на 6,5 – 7,5 день эмбрионального развития погибали. Это позволяет в очередной раз подчеркнуть важность белка STAT3, а также сделать предположение о том, что он является первичным белком семейства STAT, а также многофункциональным белком (Levy D.E., Lee C., 2002). По строению STAT3 схож с остальными белками семейства. В его структуре можно выделить всего шесть доменов: N-концевой, биспиральный, ДНК-связывающий, линкерный, SH2- и С-концевой домены. N-концевой домен включает с 1 по 130 аминокислотные остатки, он ответственен за образование ди- и тримеров STAT3, а также за его взаимодействие Биспиральный домен аминокислотные STAT3 с с включает остатки рецептором, и другими со 130 обеспечивает а белками. также по 320 связывание облегчает фосфорилирование тирозина (Tyr-705). ДНК-связывающий домен включает с 320 по 465 аминокислотные остатки, он определяет уровень специфичности STAT3 к ДНК и осуществляет регуляцию транспорта данного белка в ядро. Линкерный домен включает с 465 по 585 аминокислотные 24

остатки и является связкой между ДНК-связывающим и SH2-доменом. SH2-домен аминокислотные включает остатки и с 585 способствует по 688 связыванию STAT3 с активированными рецепторами и последующему образованию димеров фосфорилированному благодаря тирозину. сродству С-концевой к домен включает с 688 по 770 аминокислотные остатки, он неструктурирован и приобретает стабильную пространственную структуру только связавшись с другими молекулами, в взаимодействия его функции STAT3 с входит другими обеспечение участниками транскрипционного комплекса. Важно отметить также, что именно этот домен содержит остатки тирозина (Tyr705) и серина (Ser-727), по которым происходит фосфорилирование при активации STAT3 (Subramaniam A. et al., 2013). Белок STAT3 может находиться по меньшей мере в четырех изоформах: STAT3α (92 кДа), которая включает в себя С-концевой домен и несет остаток серина в 727 положении, и STAT3β (83 кДа), которая представляет собой укороченную форму белка и не имеет части Сконцевого домена с 723 по 770 аминокислотные остатки, что, однако, не препятствует возможности фосфорилирования по тирозину, находящемуся в 705 положении, и активации белка (рис. 7), а также STAT3γ (72 кДа) и STAT3δ (64 кДа) (Arora L. et al., 2018, Shi Y. et al., 2018, Wang X. et al., 2018). 25

Рисунок 7 – Доменное строение различных изоформ STAT3 (Shi Y. et al., 2018) Как уже основной Каскад было молекулой запускается указано выше, сигнального STAT3 каскада взаимодействием является JAK/STAT. цитокина с рецептором. При этом цитокин должен обладать высоким сродством к рецептору, в противном случае, каскад не запустится и передача сигнала будет невозможна. Инициация индукции сигнала начинается димеризацией рецепторов и аутокаталитическим фосфорилированием ассоциированных с ними Jak-киназ, они активируются и способствуют фосфорилированию субъединиц рецепторов по остаткам тирозина. Затем сформировавшийся комплекс “JAK–рецептор” цитоплазме в фосфорилирует неактивном STAT, находящийся мономерном в состоянии. Фосфорилиование STAT способствует их димеризации и дальнейшему транспорту в ядро, где они связываются с 26

промоторами генов-мишеней и запускают их транскрипцию (рис. 8) (Гук К. Д., Купраш Д. В., 2010, Шапошников А. В., 2013). Рисунок 8 – Сигнальный каскад JAK/STAT (Гук К. Д., Купраш Д. В., 2010) При инфицировании нарушение сигнального организма пути ВГВ STAT3, возможно что ведет к неэффективности иммунного ответа на ВГВ-инфекцию, при этом снижается цитопротекторное воздействие фактора роста гепатоцитов и эпидермального фактора роста на CD95-маркер, опосредующий апоптоз, а также на активность цитотоксических Т-лимфоцитов. Было также показано, что STAT3 участвует в усилении ответа Th17лимфоцитов при острой хронической печеночной недостаточности. Исходя из этого можно предположить, что полиморфизмы в гене STAT3 могут стать причиной 27

повышения восприимчивости организма к вирусу гепатита В и риска развития связанных с ним заболеваний печени (Li M. et al., 2018). Активация STAT3 постоянно должна находиться под контролем, потому как его конститутивная активация ведет например, к транскрипции полиморфизм онкогенов. rs2293152 гена Так, STAT3 ассоциирован с нарушением сигнального пути JAK/STAT, ведущим к дисбалансу иммунитета, что способствует генерации мутаций вируса гепатита В и, соответственно, связано с повышенным риском развития ГЦК. В таком случае белок STAT3 может быть активирован HBx белком вируса, причем мутантные белки обладают повышенной активационной способностью по сравнению с белками HBx дикого типа. Активированный STAT3 специфично присоединяется к энхансеру 1 ВГВ, что ведет за собой запуск экспрессии всех генов вируса (Xie J. et al.,2013, Chanthra N. et al., 2015). Кодирующий ген STAT3 находится на 17 хромосоме (17q21.1). Он включает в себя всего 24 экзона и 23 интрона и является высококонсервативным: для человека и мыши различие состоит всего в одной аминокислоте (Fathi N. et al., 2018). В гене STAT3 обнаружено на данный момент всего 55 полиморфизмов (База данных – SNPedia – https://www.snpedia.com/index.php/SNPedia). Полиморфизм rs2293152 этого гена располагается в 13 интроне и представляет собой замену С>G в положении 1145 (Siegel A.M. et al., 2011), причем генотип GG ассоциирован с повышенным женщин. риском Кроме развития повышенного 28 ГЦК, риска особенно развития для ГЦК,

полиморфизм rs2293152 связан также обычно с высокой вирусной нагрузкой и высоким риском развития цирроза печени (Xie J. et al., 2013). Стоит отметить, что данных о частоте полиморфизма rs2293152 для исследование жителей данного России практически полиморфизма было нет; проведено только для жителей Республики Башкортостан (Заплахова О.В. и др., 2017). Известно, что частота данного полиморфизма наиболее высока для восточно-азиатской популяции (48%) и для латиноамериканцев (49%) и наиболее низка для африканцев (11%). Для европеоидов она составляет 40% (База данных http://www.internationalgenome.org/). 29 1000 Genomes –

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материал исследования В качестве материала были использованы образцы ДНК, выделенные из крови людей двух групп: 47 человек с положительным результатом ПЦР на HBV и 52 человека без вирусной нагрузки – контрольная группа. Образцы крови были предоставлены клинико-диагностической лабораторией «Наука». Среди пациентов, у которых осуществлялся забор крови, были как мужчины, так и женщины в возрасте от 20 до 80 лет. Стоит отметить, что в персистировании вируса гепатита В и хронизации заболевания ключевую роль играет образование внутриядерного пула комплементарно закрученной спиральной ДНК (сссДНК), на которой затем синтезируется матричная РНК вируса. ДНК вируса можно выявить уже на ранних стадиях заражения, а именно в поздний инкубационный период, также в продромальный период и в разгар заболевания. Также она определяется при хроническом гепатите В репликативного типа. И только в период реконвалесценции ее обнаружить не удается (в этот период определяются другие серологические маркеры: анти-HBc IgG и анти-HBs и анти-HBe). При острой форме заболевания концентрация ДНК вируса обычно больше, чем при хронической (Малеев В.В., Ситников И.Г., Бохонов М.С., 2016). 2.2 Методы исследования 2.2.1 Выделение ДНК термо-коагуляционным методом 30

Выделение ДНК производили из лейкоцитов цельной крови по термокоагуляционному принципу. Этапы выделения ДНК: 1. Кровь в вакуумной пробирке с ЭДТА аккуратно перемешать (покачиванием пробирки). 2. В микропробирку с защелкой объемом 1,5 мл внести 600 мкл цельной крови. Подписать микропробирку. 3. Закрыть скоростью 3000 пробирку об/мин центрифугирования и в кровь центрифугировать течение 5 разделится минут. на со После плазму и форменные элементы. На поверхности осадка форменных элементов расположен тонкий слой лейкоцитов (белого цвета). 4. Аккуратно удалить плазму пипеткой, не захватывая при этом лейкоциты. 5. Закрыть пробирку и выдержать ее при -20 ͦ С (в морозилке) до полного замораживания форменных элементов (не менее 1 часа). 6. Полностью разморозить содержимое пробирки при комнатной температуре. 7. Внести в пробирку реактив «ДНК-экспресс». Его объем должен быть равен объему оставшихся в пробирке форменных элементов и плазмы. Закрыть пробирку. 8. Содержимое пробирки тщательно перемешать на вортексе. 9. Установить пробирку в предварительно нагретый до 99 ͦ С твердотельный термостат и выдержать 15 минут. 10. После охлаждения пробирку центрифугировать при 12000 об/мин в течение 1 минуты. 31

11. Полученный супернатант (раствор ДНК) перенести в чистую микропробирку. 2.2.2 Анализ полиморфизмов в генах. Проведение ПЦР В отобранных полиморфизмов образцах rs1800451 и ДНК проводили rs1800450 в гене анализ MBL2 и полиморфизма rs2293152 в гене STAT3. Анализ основан на проведении реакции амплификации с парой праймеров (прямой и обратный) (табл. 1). Анализ позволяет наработать необходимый фрагмент ДНК в высокой концентрации. Таблица 1. Праймеры для проведения ПЦР на полиморфизмы rs1800451 и rs1800450 в гене MBL2 и полиморфизм rs2293152 в гене STAT3 Праймеры для проведения ПЦР на полиморфизмы в гене MBL2 Прямой 5'-ATAGCCTGCACCCAGATTGTAG-3' Обратный 5'-AGAGACAGAACAGCCCAACAC-3' Праймеры для проведения ПЦР на полиморфизм в гене Прямой Обратный STAT3 5’-TCCCCTGTGATT CAGATCCC-3’ 5’-CATTCCCACATCTCTGCTC C-3’ Этапы проведения ПЦР: 1. Подготовить и подписать пробирки. 2. Подготовить рабочую смесь реагентов для проведения амплификации из расчета на 1 пробу: 2,5 мкл 2,5 мМ dNTP; 2,5 мкл 10×ПЦР буфера Б; 2,5 мкл 25 MgCl2; 15,2 мкл ddH2O; 0,3 мкл Taq-полимеразы (5 Е/мкл); по 1,0 мкл прямого и обратного праймеров в рабочей концентрации (разведенных в 10 раз). 32

3. Полученную реакционную смесь перемешать и разлить по 25 мкл в каждую пробирку. 4. В каждую пробирку добавить по 20 мкл минерального масла. 5. В каждую пробирку, кроме контроля, добавить по 3 мкл образца исследуемой ДНК. В контрольную пробирку добавить такое же количество буфера. 6. Поставить пробирки в амплификатор «Терцик» (ДНК- технология, Россия) для проведения амплификации. Используется горячий старт: пробирки вносят в нагретый до 94-95 ͦ С амплификатор. Режим амплификации участка гена MBL2: 94°C – 5 минут; далее 34 цикла, где денатурация – 94°C по 30 секунд, отжиг – 60°C по 1 минуте и элонгация – 72°C по 1 минуте; финальная элонгация – 72°C в течение 5 минут. Режим амплификации для гена STAT3: 95°C – 5 минут; далее 40 циклов, где денатурация – 95°C по 30 секунд, отжиг – 59°C по 30 секунд и элонгация – 72°C по 30 секунд; финальная элонгация – 72°C в течение 5 минут. 2.2.3 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов Продукты амплификации подвергали воздействию рестриктаз: BanI для rs1800450, MboII для rs1800451 гена MBL2 и HpaII для rs2293152 гена STAT3. Принцип метода состоит в «узнавании» рестриктазой определенного сайтa при его наличии нуклеиновой в продукте кислоты по амплификации этому сайту. и При разрезании этом сайт рестрикции специфичен для каждого полиморфизма и, таким образом, можно проводить анализ 33 полиморфизмов при

дальнейшем электрофоретическом разделении в агарозном геле полученных продуктов. Этапы проведения рестрикции: Для рестриктазы MBOII: 1. Приготовить реакционную смесь: 18,5 мкл H2O, 2 мкл 10× буфера B и 1,5 мкл рестриктазы из расчета на 1 пробу. Легко перемешать. 2. К 10 мкл ПЦР-продукта из каждой пробирки добавить полученную реакционную смесь. 3. Провести инкубацию пробирок в твердотельном термостате при 37 ͦ С в течение 3 часов. 4. Для инактивации рестриктазы инкубировать образцы в термостате при 65 С ещё 20 минут. Для рестриктазы HPAII: 1. Приготовить реакционную смесь: 17 мкл H2O, 2 мкл 10× FastDigest Green Buffer и 1 мкл рестриктазы из расчета на 1 пробу. Легко перемешать. 2. К 10 мкл ПЦР-продукта из каждой пробирки добавить полученную реакционную смесь. 3. Провести инкубацию пробирок в твердотельном термостате при 37 ͦ С в течение 5 минут, затем для инактивации рестриктазы инкубировать в термостате при 65 С ещё 5 минут. Для рестриктазы BanI: 5. Приготовить реакционную смесь: 18,5 мкл H2O, 2 мкл 10× буфера B и 1,5 мкл рестриктазы из расчета на 1 пробу. Легко перемешать. 6. К 10 мкл ПЦР-продукта из каждой пробирки добавить полученную реакционную смесь. 34

7. Провести инкубацию пробирок в твердотельном термостате при 37 ͦ С в течение 3 часов. 8. Для инактивации рестриктазы инкубировать образцы в термостате при 65 С ещё 20 минут. После проведения рестрикции образцы готовы к помещению в агарозный гель для проведения электрофореза. 2.2.4 Электрофоретическое разделение в агарозном геле продуктов рестрикции Разделение продуктов рестрикции проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в течение 30 минут. Этапы проведения электрофореза: 1. В колбу Эрленмейера внести 3 г агарозы, 2 мл 50× TAE буфера и 100 мл дистиллированной воды. 2. Нагреть смесь до полного растворения агарозы и поставить на магнитную мешалку. 3. Добавить 10 мкл бромистого этидия в колбу. 4. Подготовить заливочный столбик, залить в него агарозу, установить гребенки и оставить на 15 минут до полного застывания агарозы. 5. Приготовить раствор буфера для электрофоретической камеры, смешав 6 мл 50× TAE буфера и 300 мл дистиллированной воды, и добавить в камеру. 6. Застывшую агарозу поместить в камеру для горизонтального электрофореза (Хеликон, Россия). В каждую лунку внести по 10 мкл продуктов рестрикции. 35

7. Подключить камеру для электрофореза к источнику питания Эльф-8 (ДНК-Технология, Россия) и оставить для электрофореза на 30 минут. Выявление результатов электрофореза проводили в УФ с помощью трансиллюминатора Gel Doc (BioRad, США). После проведения рестрикции возможно получение трех типов продуктов полиморфизма для rs1800451 каждого гена полиморфизма. MBL2: Для гомозиготы по нормальному аллелю (генотип GG) дают продукт длиной 315 п.н., гомозиготы по мутантному аллелю (генотип AA) дают два типа продуктов – 272 п.н. и 43 п.н. и гетерозиготы (генотип GA) дают три типа продуктов – 315 п.н., 272 п.н. и 43 п.н. (рис. 9). Рисунок 9 – Результат электрофоретического разделения продуктов рестрикции (на полиморфизм rs1800451) ампликонов, полученных при проведении ПЦР гена MBL2: А, В – обозначения дорожек; цифрами обозначены: нечетными – ПЦР-продукты, четными – продукты после рестрикции; М – маркер (слева направо: 300; 200; 150; 100; 75; 50; 35; 25; 20; 15; 36

10 п.н.); лунки 7 и 8 дорожки В – контроль; в остальных лунках с цифровыми обозначениями выявлены фрагменты ДНК размером 315 п.н., что соответствует генотипу GG Для полиморфизма рестрикции возможно rs1800450 получение гена следующих MBL2 после результатов: гомозиготы по нормальному аллелю (генотип GG) дают два типа продуктов - 263 п.н. и 52 п.н., гомозиготы по мутантному аллелю (генотип AA) дают продукт длиной – 315 п.н. и гетерозиготы (генотип GA) дают три типа продуктов – 315 п.н., 263 п.н. и 52 п.н. (рис. 10). Рисунок 10 – Результат электрофоретического разделения продуктов рестрикции (на полиморфизм rs1800450) ампликонов, полученных при проведении ПЦР гена MBL2: А, В, С и D – обозначения дорожек; цифрами обозначены: нечетными – ПЦР-продукты, четными – продукты после рестрикции; М – маркер (слева направо: 300; 200; 150; 100; 75; 50; 35; 25; 20; 15; 10 п.н.); в лунках 2, 6 и 8 дорожки А, 4, 6 и 8 дорожки В, 2,4 и 6 дорожки С, 2 и 8 дорожки D – генотип GG; в лунках 4 дорожки А, 2 дорожки В, 8 дорожки С, 6 дорожки D – генотип GA; в лунке 4 дорожки D – генотип АА 37

Гомозиготы по нормальному аллелю (генотип GG) по полиморфизму рестрикции rs2293152 для гена рестриктазы STAT3 HpaII, не имеют сайта соответственно на электрофореграмме выявляется один фрагмент размером 233 п.н. Гомозиготы по мутантному аллелю (генотип СС) в обеих копиях гена имеют сайт рестрикции – на электрофореграмме выявляются два рестрикционных фрагмента. Гетерозиготы по rs2293152 гена STAT3 (генотип GC) дают три типа продуктов (рис. 11). Рисунок 11 – Результат электрофоретического разделения продуктов рестрикции (на полиморфизм rs2293152) ампликонов, полученных при проведении ПЦР гена STAT3: А, В, С и D – обозначения дорожек; цифрами обозначены: нечетными – ПЦР-продукты, четными – продукты после рестрикции; М – маркер (слева направо: 700; 500; 400; 350; 300; 250; 200; 150; 100; 50); в лунках 8 дорожки А, 2 и 6 дорожки В, 8 дорожки С, 4 и 8 дорожки D – генотип GG; в лунках 2 и 6 дорожки А, 4 дорожки В, 4 дорожки С, 2 дорожки D – генотип 38

GС; в лунках 4 дорожки А, 8 дорожки В, 2 и 6 дорожки С, 6 дорожки D – генотип СС 2.3 Методы статистического анализа результатов Данные обрабатывали статистически с помощью закона Харди-Вайнберга обрабатывали, обработки и критерия применяя данных калькуляторов χ2. Полученные программы с для результаты статистической использованием электронных «Харди-Вайнберг калькулятор» (http://www.oege.org/software/hardy-weinberg.html) и «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях случайконтроль» (http://gen-exp.ru/index.html). Анализ межгенных взаимодействий был проведен с помощью метода сокращения многофакторной размерности (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR). Данный метод основан на изучении и оценке взаимодействий полиморфизмов и выведении новых собирательных переменных на основе суммарных сочетаний генотипов, связанных с повышенным либо пониженным риском развития заболевания. В результате строятся модели, показывающие взаимодействия между всеми возможными вариантами полиморфизмов. воспроизводимость Для генотипов каждой модели и модели точность анализируемых рассчитываются предсказания, значениям которых выбирается наилучшая модель. 39 по

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Анализ частот генотипов и аллелей по полиморфизму rs2293152 гена STAT3 Белок STAT3 является транскрипционным фактором, играющим ключевую роль в сигнальном пути JAK/STAT. Он участвует в передаче сигнала от широкого спектра факторов роста и цитокинов. Полиморфизмы в гене STAT3 могут привести к нарушениям в работе иммунной системы, а также повлиять на транскрипционную активность генов многих молекул, в том числе, онкогенов. Распределение полиморфизму частот rs2293152 генотипов гена 40 STAT3 и в аллелей обеих по группах

обследуемых соответствует равновесию Харди-Вайнберга (табл. 2). Таблица 2 – Частоты генотипов и аллелей по полиморфизму rs2293152 в гене STAT3 среди обследуемых, инфицированных ВГВ и без вируса (контрольная группа) Аллели Аллель С Аллель ВГВ Контрол n = 47 ь n = 52 0.660 0.587 χ2 OR р знач. 1.37 1.12 2.43 0.41 – 0.29 0.340 0.413 0.73 С/С 0.489 0.404 1.41 C/G 0.340 0.365 G/G 0.170 0.231 G Генотип 95 % СI 0.77 – 1.31 ы 0.90 0.64 0.64 – 3.14 0.39 – 0.90 2.05 0.25 – 0.68 1.85 РХВ 2.75 3.16 Примечание: РХВ - Равновесие Харди-Вайнберга В таблице 2 представлены частоты генотипов и аллелей по полиморфизму rs2293152 гена STAT3 среди обследуемых, инфицированных ВГВ, и без вируса. Исходя из данных таблицы видно, что в исследуемых группах преобладают гомозиготы по аллели С. В группе инфицированных ВГВ частота генотипа С/С составляет 49 %, а в контрольной группе – 40 %. Частота гетерозигот в группе инфицированных ВГВ составляет 34 %, а в контрольной группе – 36,5 %. Частота встречаемости генотипа G/G в группе инфицированных ВГВ составляет 41 17 %, а в

контрольной группе – 23 %. При этом, частота аллеля G в группе инфицированных ВГВ составляет 34%, в контрольной группе – 41%; частота аллеля С в группе инфицированных ВГВ составляет 66%, в контрольной группе – 59% (табл. 2). Таким значимых образом, различий в в ходе исследования частотах генотипов статистически и аллеей по полиморфизму rs2293152 гена STAT3 между двумя группами обследуемых не было обнаружено. Следовательно, взаимосвязи полиморфизма rs2293152 в гене STAT3 с риском развития гепатита В у жителей Ростова-на-Дону не обнаружено. В исследовании Дж. Кси с соавторами (Xie J. et al., 2013) была показана положительная корреляция полиморфизма rs2293152 гена STAT3 с высокой вирусной нагрузкой при гепатите В, а также с развитием ГЦК. В данном исследовании было проанализировано всего 3023 образца, среди которых 2011 образцов пациентов, инфицированных ВГВ, включая пациентов с ГЦК (1021), остальные составили контроль. Всего было исследовано три полиморфизма гена STAT3, включая rs2293152. Полиморфизмы были генотипированы с помощью ПЦР в реальном времени. Было установлено, что rs2293152 присутствует в значительно большем количестве у пациентов с ГЦК, чем без карциномы, причем его влияние было намного выше для женщин. Однако в других исследованиях показано, что такая зависимость встречается не во всех популяциях. Так, Н. Чантра с коллегами (Chanthra N. et al., 2015) проводили исследование сначала для полиморфизм хроническим китайской rs2293152 ВГВ и популяции гена риском 42 и STAT3 развития обнаружили, ассоциирован ГЦК. Однако что с в

последующем исследовании связи данного полиморфизма с ВГВ и ГЦК для тайской популяции были получены другие результаты. Всего было исследовано 582 образца, среди которых 392 образца пациентов, инфицированных ВГВ, у 200 к тому же присутствует ГЦК. Исследуемые полиморфизмы были генотипированы цепной с реакции использованием - полиморфизма методов длины полимеразной рестрикционных фрагментов. Статистическая обработка данных показала, что распределение rs2293152 различных соответствовало генотипов для равновесию полиморфизма Харди-Вайнберга (Р>0,05). При этом никакой существенной корреляции между данным полиморфизмом и ГЦК не наблюдалось. В работе Дж.-В. Као (Cao G.-W., 2017) также упоминается ассоциация полиморфизма rs2293152 с высокой вирусной нагрузкой при гепатите В, а также развитием ГЦК. Для популяций европеоидов исследований, направленных на выявление связи ВГВ с вышеуказанным SNP, не проводилось. 3.2 Анализ частот генотипов и аллелей по полиморфизму rs1800451 гена MBL2 МСЛ – главный белок-активатор системы комплемента по лектиновому пути. Он играет важную роль в уничтожении патогенов различной природы. Наличие полиморфизмов в гене MBL2 приводит к нарушению экспрессии гена и снижению концентрации белка в сыворотке крови, что может привести к повышению уязвимости организма по отношению к различного рода патогенам. 43

Распределение полиморфизму частот rs1800451 генотипов гена MBL2 и среди аллелей обеих по групп обследуемых соответствует равновесию Харди-Вайнберга (табл. 3). Таблица 3 – Частоты генотипов и аллелей по полиморфизму rs1800451 гена MBL2 среди обследуемых, инфицированных ВГВ, и без вируса (контрольная группа) Контрол ВГВ Аллели Аллель G n = 47 ь n = 52 1.000 1.000 χ2 знач. 95 % СI 0.02 – 0.90 0.00 Аллель A OR р 46.03 0.02 – 1 0.000 0.000 1.11 G/G 1.000 1.000 0.90 G/A 0.000 0.000 A/A 0.000 0.000 56.29 Генотип ы 0.00 1 0.02 – 46.50 0.02 – 1.11 56.81 0.02 – 1.11 56.81 РХВ 0.00 0.00 Примечание: РХВ - Равновесие Харди-Вайнберга В таблице 3 представлены частоты генотипов и аллелей по полиморфизму rs1800451 гена MBL2 среди обследуемых, инфицированных ВГВ, и без вируса. Исходя из данных таблицы видно, что в исследуемых группах представлены только гомозиготы по нормальной аллели. Следовательно, ассоциации полиморфизма rs1800451 гена MBL2 с риском гепатита В у жителей Ростова-на-Дону не обнаружено. 44 развития

Результаты нашего исследования подтверждают крайне низкую частоту полиморфизма rs1800451 гена MBL2 среди европеоидов, показанную в исследованиях других авторов. Так, ещё в 1994 году Х. Мэдсен с соавторами (Madsen H.O. et al., 1994) показали, что частота мутации в кодоне 57 гена MBL2 в европейской популяции составляет всего 0.02. Однако в исследования России проводились данного только полиморфизма, единичные что делает необходимость анализа его частоты и связи с различными патологическими состояниями актуальным. По данным Р. Липскомб (Lipscombe полиморфизм нарушению R.J. rs1800451, вторичной коллагенподобного домена et al., 1993) вероятнее всего, структуры МСЛ. с коллегами приводит тройной к спирали Соответственно, как гомозиготы, так и гетерозиготы в таком случае будут иметь сниженную концентрацию МСЛ в сыворотке крови, что было подтверждено иммуноанализом. Поэтому данный полиморфизм связан с различными заболеваниями, такими как туберкулез, гепатиты В и С, ревматоидный артрит и другие. 3.3 Анализ частот генотипов и аллелей по полиморфизму rs1800450 гена MBL2 Распределение полиморфизму частот rs1800450 генотипов гена MBL2 и в аллелей обеих по группах обследуемых соответствует равновесию Харди-Вайнберга (табл. 4). Таблица 4 – Частоты генотипов и аллелей по полиморфизму rs1800450 гена MBL2 среди обследуемых, инфицированных ВГВ, и без вируса (контрольная группа) 45

Аллели Аллель G Контрол ВГВ n = 47 ь n = 52 0.745 0.885 χ2 знач. 0.38 6.50 Аллель A OR р 95 % СI 0.18 – 0.81 1.23 – 0.01 0.255 0.115 2.63 G/G 0.574 0.769 0.41 G/A 0.340 0.231 A/A 0.085 0.000 5.62 Генотип ы 6.86 0.03 0.17 – 0.96 0.71 – 1.72 4.16 0.57 – 10.86 207.39 РХВ 0.52 0.88 Примечание: РХВ - Равновесие Харди-Вайнберга В таблице 4 представлены частоты генотипов и аллелей по полиморфизму rs1800450 гена MBL2 среди обследуемых, инфицированных ВГВ, и без вируса. Исходя из данных таблицы видно, что в исследуемых группах преобладают гомозиготы по аллели G. В группе инфицированных ВГВ частота генотипа G/G составляет 57 %, а в контрольной группе – 78 %. Частота гетерозигот в группе инфицированных ВГВ составляет 34 %, а в контрольной группе – 23 %. Частота встречаемости генотипа A/ A в группе инфицированных ВГВ составляет 8,5 %, в контрольной же группе данный генотип не обнаружен. При этом частота аллеля G в группе инфицированных ВГВ составляет 74,5%, в контрольной группе – 88,5%; частота аллеля A в группе инфицированных ВГВ составляет 25,5%, в контрольной группе – 11,5% (табл. 4). 46

В ходе исследования обнаружены статистически значимые различия частот аллелей по полиморфизму rs1800450 гена MBL2 в двух представленных группах. Причем для аллели А наблюдается ассоциация с повышенным риском развития ВГВ, поскольку OR составил для нее 2.63, а для аллели G OR составляет 0.38, так что данная аллель ассоциирована со снижением риска развития ВГВ. Статистически значимые различия обнаружены и для частот генотипов по исследуемому полиморфизму гена MBL2 между двумя сравниваемыми группами лиц. Если в контрольной группе не было выявлено ни одного человека, гомозиготного по аллели А, то среди больных гепатитом В данный генотип встречается с частотой 8,5% (табл. 4). Можно также отметить, что генотип G/G снижает риск развития гепатита В – OR имеет значение 0.41. Таким образом, данный генотип обладает защитным эффектом. В 2016 году К. Гу (Gu X. et al., 2016) с коллегами было проведено исследование двух полиморфизмов гена MBL2, включая rs1800450, среди лиц азиатской популяции с целью выявления связи SNP с патологиями МСЛ и, как следствие, с предрасположенностью к развитию гепатита В. Исследование проводилось на 735 образцах, из которых 171 образец составил контрольную группу, различными формами остальные ВГВ и были взяты у заболеваниями людей с печени, вызванными этим вирусом. Генотипирование проводили с помощью метода ПЦР с последующей лигазной детекцией. При этом репрезентативные ПЦР-продукты подвергались также прямому секвенированию. В результате исследования была установлена четкая связь данного полиморфизма с низким 47

уровнем МСЛ, а также с риском развития цирроза печени и ГЦК после ВГВ инфекции. Подобные исследования проводились для африканской популяции (Bellamy R. et al., 1998), где ассоциации полиморфизма rs1800450 гена MBL2 выявлено не было. Для популяции европеоидов исследования, направленные на выявление связи данного полиморфизма с риском развития гепатита В, проводились, однако их количество слишком мало, а результаты требуют дальнейших уточнений (Сomuzzi F., 2017; Moura T.C.F. et al., 2017). Кроме того, четко установлена ассоциация полиморфизма rs1800450 гена MBL2 с туберкулезом в различных популяциях (Da Cruz H.L.A. et al., 2013; Hijikata M. et al., 2014; Areeshi M.Y. et al., 2016), есть единичные данные, свидетельствующие об ассоциации данного полиморфизма с волчанкой и гепатитом С (Lee Y.H. et al., 2005; Gauthiez E. et al., 2017). 3.4 Анализ межгенного взаимодействия маннозсвязывающего лектина и транскрипционного фактора STAT3 при ВГВ-инфекции При сравнении инфицированной ВГВ группой пациентов и контрольной rs1800451 группой гена MBL2 для полиморфизмов статистически rs1800450 значимых и различий выявлено не было, для полиморфизма rs2293152 гена STAT3 были выявлены статистически значимые различия в частотах аллелей и генотипов между этими двумя группами. Для анализа суммарного вышеупомянутых взаимодействий генов с вклада был аллельных проведен помощью 48 анализ метода вариантов межгенных сокращения

многофакторной размерности (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR). Причем проанализированы были только два полиморфизма: rs1800450 гена MBL2 и rs2293152 гена STAT3, так как при исследовании полиморфизма rs1800451 гена MBL2 все пациенты оказались гомозиготными по нормальной аллели. По результатам взаимодействия проведенного при статистически ВГВ-инфекции значимая «STAT3_rs2293152, анализа межгенного была получена двухлокусная модель MBL2_rs1800450» с максимальной воспроизводимостью – 10/10 и точностью предсказания 0,6 (табл. 5). Таблица 5 – Модель межгенного взаимодействия среди исследуемых групп пациентов с ВГВ-инфекцией и без нее, полученная с помощью программы MDR Комбинации генов в модели Тестируемо е Воспроизво взаимодейст вие генов димость χ2 (p) модели STAT3_rs2293 152, MBL2_rs18004 OR 0.6 10/10 4,2 (0,04) 50 2,36 (1,035,39) Исходя из модели распределения частот двухлокусного взаимодействия генов STAT3 и MBL2, можно сделать вывод, что полиморфные варианты гена STAT3 понижают риск развития ВГВ при сочетании с гомозиготностью по норме rs1800450 гена MBL2 (рис. 12). 49

Рисунок 12 – Распределение частот двухлокусных сочетаний генотипов генов STAT3 и MBL2 в группе инфицированных ВГВ и контрольной: темно-серые ячейки демонстрируют генотипы повышенного риска, светло-серые – пониженного риска, левые столбики в ячейках – инфицированные ВГВ, правые столбики – контроль, 0 – гомозиготы по нормальной аллели, 1 – гетерозиготы, 2 – гомозиготы по мутантной аллели Комбинированные генотипы G/G и С/G rs2293152 STAT3 / G/G rs1800450 MBL2 являются потенциальными генотипами с защитным эффектом при гепатите В. Остальные комбинации генотипов повышают риск развития гепатита В. Анализ уровня энтропии показал, что полиморфизм rs1800450 гена MBL2 вносит основной вклад в повышение риска развития гепатита В при комбинации генотипов исследуемых генов (энтропия 6,12%), причем, как видно из графика межгенных взаимодействий, характер взаимосвязи внутри модели – антагонизм (рис. 13). 50

Рисунок 13 – Графическое изображение взаимодействия полиморфизмов изучаемых генов при ВГВ: в центральной ячейке в процентах указано значение межфакторной энтропии, а в боковых ячейках – уровень энтропии для соответствующего полиморфизма; знак перед числом в центральной ячейке указывает на характер взаимосвязей внутри модели (синергизм/ антагонизм) Таким образом, в результате исследования установлен снижающий эффект риска развития ВГВ полиморфизма гена STAT3 при комбинированном взаимодействии с геном MBL2. Известно, что STAT3 способен специфически связываться с геном сериновой протеазы MASP2, способствуя его экспрессии (Unterberger C. et al., 2007). MASP2 является эффекторным компонентом лектинового пути, способствует опсонизации комплекса МСЛ-ПАМП. При наличии полиморфизма rs1800450 в гене MBL2 экспрессия белка нарушается и, соответственно, снижается эффективность лектинового пути. Этот эффект, по-видимому, можно снизить при повышенной экспрессии сериновых протеаз, в том числе и MASP2. Так как полиморфизм rs2293152 гена STAT3 приводит к неконтролируемой транскрипции онкогенов (Chanthra N. et al., 2015), то, возможно, повышается его транскрипционная активность и по отношению к MASP2, что ведет к повышению концентрации данной сериновой протеазы. Можно предположить, что объяснением межгенного взаимодействия 51

STAT3 и MBL2 со снижением риска развития гепатита В является описанный механизм. ВЫВОДЫ 52

1. Выявлены статистически значимые различия в частотах генотипов и аллелей по полиморфизму rs1800450 гена MBL2 при сравнении группы инфицированных ВГВ и контрольной группы. Исходя из полученных данных, аллель А (р=0.01; OR=2.63 (1.23 – 5.62)) ассоциирована с высоким риском развития гепатита В, а наличие генотипа GG снижает такой риск, обладая защитным эффектом (OR=0.41 (0.17 – 0.96)). 2. Ассоциации полиморфизма rs2293152 гена STAT3 с риском развития гепатита В в исследуемых группах выявлено не было. 3. Ассоциации полиморфизма rs1800451 гена MBL2 с риском развития гепатита В в исследуемых группах выявлено не было. Во всех проанализированных образцах были обнаружены только гомозиготы по нормальной аллели. 4. По результатам анализа межгенных взаимодействий установлено, что взаимодействие полиморфных вариантов гена STAT3 с гомозиготным по норме вариантом гена MBL2 снижает риск развития гепатита В. 53

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. База данных 1000 Genomes – SNPedia – http://www.internationalgenome.org/ 2. База данных – https://www.snpedia.com/index.php/SNPedia 3. Балабина Н.М. Цирроз печени: диагностика, лечение, профилактика и экспертиза трудоспособности в амбулаторной практике. - Иркутск: ИГМУ, 2017. - 134 с. 4. Берлов М.Н., Шехова Е.А., Соколов А.В., Филимонов В.Б., Кокряков В.Н. Взаимодействие маннозо-связывающего лектина и миелопероксидазы // Вестник Санкт-Петербургского университета. – 2011. – Сер. 3 Вып. 4. – С. 63-72. 5. Герасимова Максимова В.В., Н.Р. Левакова И.А., Бичурина М.А., Молекулярно-эпидемиологические особенности вирусного гепатита В // Инфекция и иммунитет. – 2015. – Т. 5 № 4. – С. 297-302. 6. Герасун Б.А., Грицко Р.Ю., Герасун А.Б., Малинникова Е.Ю., Михайлов М.И. Вирусные гепатиты в схемах, таблицах и рисунках. Руководство по проблеме вирусных гепатитов для врачей-интернов и слушателей ФПДО. – Львов: Кварт, 2012. – 122 с. 7. Гук К. Д., Купраш Д. В. Интерлейкин-11, член семейства IL-6-подобных цитокинов // Молекулярная биология. - 2011. - Т. 45 № 1. - С. 44-55. 8. Демиденко Т.П., Неверов В.А. Вирусные гепатиты: Пособие для врачей. - СПб.: 2011. - 229 с. 54

9. Еремеева Ж.Г., Минуллин И.К., Платонова О.В., Богданова Е.В., Фазылов В.Х. Диагностика и специфическая профилактика вирусного гепатита в в условиях специализированного лечебно-профилактического учреждения // Казанский медицинский журнал. - 2015. - №Том 96, № 6 . - С. 923-929. 10. Заплахова О.В., Тимашева Я.Р., Бахтиярова К.З., Туктарова И.А., Мустафина О.Е. Клинический и молекулярногенетический анализ случая семейного рассеянного склероза в Республике Башкортостан // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2017. - №117 (2). - С. 31-41. 11. Колмогорова Е.Л, Красавцева А.В., Мурзина О.Ю. Острый вирусный гепатит в (краткий литературный обзор) // Сборник научных трудов по материалам I международной научно-практической конференции: «Современные технологии в науке и образовании: проблемы, достижения, перспективы», 15 декабря 2016 г.: сборник трудов конференции. – Караганда: ООО «Вектор науки» , 2016. – С. 43-55. 12. Курманова Г.М. и др. Серологическая диагностика вирусных гепатитов В, C и D // Медицина. – 2013. - № 6. – С. 1826. 13. Лопатина Е.Ю., Забозлаев Ф.Г., Верхотин А.А., Юдинцева Е.В., Бондаренко Н.Л. Внепеченочные поражения при хронических вирусных заболеваниях печени // Клиническая практика. - 2010. - №Том 1, № 2. - С. 47-51. 14. Львов Д.К. и др. Медицинская вирусология: Руководство / Под ред. Д.К. Львова. – М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. – 253-259 с. 55

15. Малеев В.В., Ситников И.Г., Бохонов М.С. Вопросы гепатологии: учебное пособие / под ред. В.В. Малеева – СанктПетербург: СпецЛит, 2016. – 367 c. 16. Мануйлов В.А., Осипова Л.П., Нетесова И.Г., Чуб Е.В., Безуглова Л.В., Norder H., Magnius L.O., Распространенность различных генотипов Нетесов С.В. и субтипов HBs- антигена вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2015. - №1. – С. 28-34. 17. Ратникова Л.И., Миронов И.Л., Лаврентьева Н.Н., Конькова-Рейдман А.Б., Пермитина М.И., Елисеев В.А., ТерБагдасарян Л.В., Ермакова Н.В., Бондаренко В.В., Дубовикова Т.А., Шип С.А. Вирусные гепатиты. - Челябинск: 2013. – 67 с. 18. Рахманова А.Г., Александров П.А., Шаройко В.В. Оккультный гепатит В, его роль в распространении инфекции и развитии гепатоцеллюлярной карциномы (обзор) // MedicoBiological and Socio-Psychological Problems of Emergency Situations. – 2015. - № 3. – С. 78-87. 19. Смольникова М.В., Епанешникова В.Б., Терещенко С.Ю. Этнически ассоциированные факторы риска высокого уровня младенческой смертности у детей коренного населения крайнего севера: предрасположенности исследование (MBL2, FCN2) генетической к инфекционным заболеваниям // Медицинская иммунология. - 2017. - Т. 19. - С. 82-83. 20. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. – Спб., 1997. – 42 с. 56

21. Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В., Смирнов Инфекционная гепатология: Руководство для врачей А.В. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 155 с. 22. Шапошников А.В., Комарьков И.Ф., Лебедева Л.А., Шидловский Ю.В. Строение сигнального пути JAK/STAT и его взаимосвязь с аппаратом транскрипции // Молекулярная биология. - 2013. - Т. 47 № 3. - С. 388-397. 23. Ющук Н.Д., Климова Е.А., Знойко О.О., Кареткина Г.Н., Максимов С.Л., Маев И.В. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 160 с. 24. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с. 25. Areeshi M.Y., Mandal R.K., Akhter N., Dar S.A., Jawed A., Wahid M., Mahto H., Panda A.K., Lohani M., Haque S. A Metaanalysis of MBL2 Polymorphisms and Tuberculosis Risk // Scientific Reports. - 2016. - №6. - P. 1-22. 26. Arora L., Kumar A.P., Arfuso F., Chng W.J., Sethi G. The Role of Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) and Its Targeted Inhibition in Hematological Malignancies // Cancers. - 2018. - Vol. 10 № 9. - P. 1-17. 27. Bellamy R., Ruwende C., McAdam K.P., Thursz M., Sumiya M., Summerfield J., Gilbert S.C., Corrah T., Kwiatkowski D., Whittle H.C., Hill A.V. Mannose binding protein deficiency is not associated with malaria, hepatitis B carriage nor tuberculosis in Africans. // QJM. - 1998. - №Vol. 91 №1. - P. 13-18. 28. Beltrame M.H., Boldt A.B.W., Catarino S.J., Mendes H.C., Boschmann S.E., Goeldner I., Messias-Reason I. MBL-associated serine proteases (MASPs) and infectious diseases // Molecular Immunology. – 2015. – Vol. 67 № 1. – P. 85-100. 57

29. Burrel C.J., Chisari F.V., Gerlich W.H. et al. Hepadnaviridae. // In: Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. – San Diego: Academic Press, 1999. – p. 325-374. 30. Сao G.-W. Cancer Evo-Dev, a novel hypothesis derived from studies on hepatitis B virus-induced carcinogenesis // Hepatoma Research . - 2017. - №3. - С. 241-259. 31. Chanthra N., Payungporn S., Chuaypen N., Piratanantatavorn K., Pinjaroen N., Poovorawan Y., Tangkijvanich P. Single Nucleotide polymorphisms in STAT3 and STAT4 and risk of hepatocellular carcinoma in Thai patients with chronic hepatitis B // Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. - 2015. - Vol. 16 № 18. - P. 8405-8410. 32. Comuzzi F. Host genetic polymorphisms and chronic hepatitis B: a systematic review and metaanalysis: Master thesis N°3373 Medicine - Lausanne, 2017. - 23 p. 33. Da Cruz H.L.A., Da Silva R.c., Segat L., Carvalho M.S.Z.M.G., Brandão L.A.C., Guimarães R.L., Santos F.C.F., Lira L.A.S., Montenegro L.M.L., Schindler H.C., Crovella S. MBL2 gene polymorphisms and susceptibility to tuberculosis in a northeastern Brazilian population // Infection, Genetics and Evolution . - 2013. №19. - P. 323-329. 34. Eisen D.P., Minchinton R.M. Impact of mannose-binding lectin on susceptibility to infectious diseases // Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America . - 2003. - Vol. 37 № 11. - Р. 1496–1505. 35. Fathi N., Rashdi G., Khodadadi A., Shahi S., Sharifi S. STAT3 and apoptosis challenges in cancer // International Journal of Biological Macromolecules. - 2018. - №117. - P. 993-1001. 58

36. Fujita T., Matsushita M., Endo Y. The lectin–complement pathway – its role in innate immunity and evolution // Immunological Reviews. - 2004. - Vol. 198 № 1. - P. 185-202. 37. Garred P., Genster N., Pilely K., Bayarri-Olmos R., Rosbjerg A., Ma Y.J., Skjoedt M.-O. A journey through the lectin pathway of complement – MBL and beyond // Immunological Reviews. – 2016. – Vol. 274 № 1. – P. 74-97. 38. Gauthiez E., Habfast-Robertson I., Rüeger S., Kutalik Z., Aubert V., Berg T., Cerny A., Gorgievski M., George J., Heim M.H., Malinverni R., Moradpour D., Müllhaupt B., Negro F., Semela D., Semmo N., Villard J., Bibert S., Bochud P.-Y. A systematic review and meta-analysis of HCV clearance // Liver International. - 2017. Vol. 37 № 10. - P. 1431-1445. 39. Gu X., Ji Q., Wang H., Jiang M., Yang J., Fang M., Wang M., Gao C. Genetic variants of mannose-binding lectin 2 gene influence progression and prognosis of patients with hepatitis B virus infection in China // CLINRE. - 2016. - Vol. 40 № 5. - Р. 614621. 40. Hijikata M., Matsushita I., Hang N.T.L., Maeda S., Thuong P.H., Tam D.B., Shimbo T., Sakurada S., Cuong V.C., Lien L., Keicho N. Age-dependent association of mannose-binding lectin polymorphisms with the development of pulmonary tuberculosis in Viet Nam // Human Immunology. - 2014. - Vol. 72 № 8. - P. 840-846. 41. Jensenius H., Klein D.C.G., van Hecke M., Oosterkamp T.H., Schmidt T., Jensenius J.C. Mannan-binding lectin: structure, oligomerization and flexibility studied by atomic force microscopy // JMB. – 2009. – Vol. 391 № 1. – P. 246-259. 42. Jensenius J. C. The mannan-binding lectin (MBL) pathway of complement activation: biochemistry, biology and 59

clinical implications // Glycobiology and Medicine. – 2005. – Р. 2122. 43. Kalia N., Sharma A., Kaur M., Kamboj S.S., Singh J. A comprehensive in silico analysis of non-synonymous and regulatory SNPs of human MBL2 gene // SpringerPlus. - 2016. - №5:811. - P. 1-14. 44. Kim C.Y., Tilles J.G. Purification and biophysical characterization of hepatitis B antigen // J. Clin. Invest. – 1970. №52. – р. 1176-1186 45. Lee Y.H., Witte T., Momot T., Schmidt R.E., Kaufman K.M., Harley J.B., Sestak A.L. The mannose-binding lectin gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus: Two casecontrol studies and a meta-analysis // Arthritis and Rheumatology. 2005. - Vol. 52 № 12. - С. 3966-3974. 46. Levy D.E., Lee C. What does Stat3 do? // JCI. - 2002. Vol. 109 № 9. - P. 1143-1148. 47. Li M., Li F., Li N., Sang N., Fan X., Deng H., Zhang X., Han Q., Lv Y., Liu Z. Association of polymorphism rs1053005 in STAT3 with chronic hepatitis B virus infection in Han Chinese population // BMC Medical Genetics. - 2018. - Vol. 19 № 1. - P. 1-8. 48. Lipscombe R.J., Sumiya M., Hill A.V., Lau Y.L., Levinsky R.J., Summerfield J.A., Turner M.W. High frequencies in African and non-African populations of independent mutations in the mannose binding protein gene. // Hum Mol Genet. - 1993. - №2 (3). - P. 342. 49. Lundbo L.F., Sørensen H.T., Clausen L.N., Hollegaard M.V., Hougaard D.M., Konradsen H.B., Harboe Z.B., Nørgaard M., Benfield T. Mannose-Binding Lectin Gene, MBL2, Polymorphisms Do Not Increase Susceptibility to Invasive Meningococcal Disease 60

in a Population of Danish Children // OFID. - 2015. - Vol. 2 № 4. - P. 1-6. 50. Madsen H.O., Garred P., Kurtzhals J.A., Lamm L.U., Ryder L.P., Thiel S., Svejgaard A. A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannanbinding protein. // Immunogenetics. - 1994. - №40 (1). - P. 37-44. 51. Malhotra R., Haurum, J., Thiel, S., Sim, R.B. Interaction of C1q-receptor (C1qR) with lung surfactant protein A (SP-A) // Eur. J. Immunol. – 1992. - № 22. – Р. 1437-1445. 52. Moura T.C.F., Amoras E.S.G., Araújo M.S., Queiroz M.A.F., Conde S.R.S.S., Demachki S., Martins-Feitosa R.N., Machado L.F.A., Cayres-Vallinoto I.M.V., Ishak R., Vallinoto A.C.R. HBV Viral Load and Liver Enzyme Levels May Be Associated with the Wild MBL2 AA Genotype // Hindawi. Mediators of Inflammation. - 2017. - Vol. 2017. - P. 1-11. 53. Pradhan V., Surve P., Ghosh K. Mannose Binding Lectin (MBL) in Autoimmunity and its Role in Systemic Lupus Erythematosus (SLE) // JAPI. - 2010. - Vol.58. - P. 688-690. 54. Pradhan V., Surve P., Rajadhyaksha A., V., Patwardhan M., Umare V., Ghosh K., Nadkarni K. Rajendran Mannose binding lectin (MBL) 2 gene polimorphisms and its association with clinical manifestations in systemic lupus erithematosus (SLE) patients from western India // IJMR. – 2015. – Vol. 141 № 2. – p. 199-204. 55. Scorza M., Liguori R., Elce A., Salvatore F., Castaldo G. Biological role of mannose binding lectin: From newborns to centenarians // Clinica Chimica Acta. - 2015. - Vol. 451 Part A. - P. 78-81. 61

56. Shi Y., Zhang Z., Qu X., Zhu X., Zhao L., Wei R., Guo Q., Sun L., Yin X., Zhang Y., Li X. Roles of STAT3 in leukemia // International Journal of Oncology. - 2018. - Vol. 53 № 1. - P. 7-20. 57. Siegel A.M., Heimall J., Freeman A.F., Hsu A.P., BrittainE., Brenchley J.M., Douek D.C., Fahle G.H., Cohen J.I., Holland S.M., Milner J.D. A Critical Role for STAT3 Transcription Factor Signaling in the Development and Maintenance of Human T Cell Memory // Immunity. - 2011. - Vol. 35 №5. - P. 806-818. 58. Subramaniam A., Shanmugam M.K., Perumal E., Li F., Nachiyappan A., Dai X., Swamy S.N., Ahn K.S., Kumar A.P., Tan B.K.H., Hui K.M., Sethi G. Potential role of signal transducer and activator of transcription (STAT)3 signaling pathway in inflammation, survival, proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). - 2013. - Vol. 1835 № 1. - P. 46-60. 59. Takeda K., Noguchi K., Shi W., Tanaka T., Matsumoto M., Yoshida N., Kishimoto T., Akira S. Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality // PNAS. 1997. - Vol. 94 № 8. - P.3801-3804. 60. Unterberger C., Hanson S., Klingenhoff A., Oesterle D., Frankenberger M., Endo Y., Matsushita M., Fujita T., Schwaeble W., Weiss E.H., Ziegler-Heitbrock L., Stover C. Stat3 is involved in control of MASP2 gene expression // BBRC. - 2007. - №364. - P. 1022 - 1025. 61. Wake M.S., Watson C.J. STAT3 the oncogene – still eluding therapy? // The FEBS Journal. - 2015. - Vol. 282 №14. - P. 2600-2611. 62. Wang X., Du L., Wei H., Zhang A., Yang K., Zhou H. Identification of two Stat3 variants lacking a transactivation 62

domain in grass carp: New insights into alternative splicing in the modification of teleost Stat3 signaling // Fish & Shellfish Immunology . - 2018. - Vol. 77. - P. 13-21. 63. Xie J., Zhang Y., Zhang Q., Han Y., Yin J., Pu R., Shen Q., Lu W., Du Y., Zhao J., Han X., Zhang H., Cao G. Interaction of signal transducer and activator of transcription 3 polymorphisms with hepatitis B virus mutations in hepatocellular carcinoma // Hepatology. - 2013. - Vol. 57 № 6. - P. 2369-2377. 64. Zhang N., Zhuang M., Ma A., Wang G., Cheng P., Yang Y., Wang X., ZhangJ., Chen X., Lu M. Association of Levels of Mannose-Binding Lectin and the MBL2 Gene with Type 2 Diabetes and Diabetic Nephropathy // PLoS ONE. - 2013. - Vol.8 №12. - P. 17. 65. Zhang X.-L., Ali Mohammed A.M. Ficolins: structure, function and associated diseases // AEMB / Current Topics in Complement II. - 2008. - Vol. 632. - P. 99-109. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 63

1. Веропаха Д.Д. Исследование полиморфизма rs1800451 в гене MBL2 у больных гепатитом В // Материалы международного молодежного научного форума "Ломоносов2018". - М.: МАКС Пресс, 2018. 2. Веропаха Д.Д. Ассоциация полиморфизма rs2293152 гена STAT3 с риском развития гепатита В для жителей Ростована-Дону // Неделя науки 2019. – Ростов-на-Дону: Южного Федерального Университета, 2019 (в печати). 64 Изд-во

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

6315.12

Игорь Маслеников

Проныра, озорник, Любитель книг, Ловкач, игрок, Жизнь между строк. И потому Открыт ему Незримый путь В любую суть. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Подсыпать в душу яд Всегда он рад Всего за час Прочтёт он вас. Он волен взять И поменять Строку и с ней Смысл темы всей.Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Открыт роман Читатель пьян Разлив вино - Шагнул в окно. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения.

6315.12

Игорь Маслеников

Танец Злобного Гения КиШ

6315.12

Игорь Маслеников

А теперь я скину тексты своих любимых песен для этого:)

6315.12

Игорь Маслеников

и хорошего настроения

6315.12

Игорь Маслеников

удачи