Генотипирование вирусов гриппа методом анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения (HRM-анализ)

Ландграф Галина

Генотипирование вирусов гриппа методом анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения (HRM-анализ)

Высокая изменчивость вирусов гриппа вызывает необходимость ежегодного обновления штаммового состава гриппозных вакцин. На промежуточных этапах подготовки вакцинного штамма, когда нужно быстро проанализировать значительное число реассортантов (провести первичный скрининг), возникает потребность в разработке новейших быстрых и недорогих методов первичного скрининга. Данная работа посвящена разработке эффективной и экономичной методики генотипирования реассортантных вирусов гриппа- ПЦР в реальном времени с последующим анализом кривых плавления высокого разрешения (high resolution melting, HRM-анализ) при использовании интеркалирующего флуоресцентного красителя EvaGreen. Молекулярно-генетический метод HRM (high resolution melting curve analysis) основан на проведении амплификации фрагментов ДНК с последующим анализом их кривых плавления с высоким разрешением. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью. В отличие от других молекулярно-генетических методов HRM-анализ позволяет выявлять мутации в интересующих фрагментах генов в процессе одной реакции, позволяет определять однонуклеотидные замещения, не имеет контаминационной опасности.

Биология

Дипломы

Вуз: Санкт-Петербургский государственный университет (СПбГУ)

ID: 5a6f88197966e12684ee9f82

UUID: de41f483-cf48-4477-b4e4-9bad8cf0a035

Язык: Русский

Опубликовано: почти 7 лет назад

Просмотры: 347

Ландграф Галина

Источник: Санкт-Петербургский государственный университет

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 1,4 МБ

Поделиться работой

Санкт-Петербургский государственный университет Ландграф Галина Олеговна ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА МЕТОДОМ АНАЛИЗА КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПЦР ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ (HRM-АНАЛИЗ). Выпускная квалификационная работа по направлению подготовки: Биология, кафедра микробиология Работа выполнена: в отделе вирусологии Федерального Государственного Бюджетного Научного Учреждения "Институт экспериментальной медицины" Научный руководитель: Доктор медицинских наук, доцент вед.н.с. отдела вирусологии ФГБНУ "ИЭМ"Ю.А. Дешева Санкт-Петербург – 2017

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВОЗ (WHO) – Всемирная Организация Здравоохранения CDC - Центр по контролю за заболеваемостью и профилактики ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота РТГА - реакция торможения гемагглютинации ПЦР – полимеразная цепная реакция ОТ –ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией NGS Next-Generation Sequencing- секвенирование нового поколения ПААГ - Электрофорез белков в полиакриламидном геле РТГА Реакция торможения гемагглютинации MDCK – перевиваемая линия ткани почки собак культура клеток (Madin-DarbyCanineKidney) КЭ куриные эмбрионы ЖГВ живая гриппозная вакцина PB1, PB2, PA – белки полимеразного комплекса НА – гемагглютинин NP – нуклеопротеидный белок NA – нейраминидаза M1 – мембранный белок M2 – белок ионных каналов NS1, NS2 – неструктурные белки HRM анализ кривых плавления с высоким разрешением (high resolution melting curve analysis) ЭИД50 – 50%-ная эмбриональная инфекционная доза ХА - холодоадаптированный тип Wt – дикий тип ca (cold-adapted) – ХА – холодоадаптированный тип ts (temperature-sensitive) – температурочувствительный тип E2

M-MulV RT мышиный вирус лейкемии Молони, полученный с помощью обратной транскриптазы ОГЛАВЛЕНИЕ Глава I. Введение Актуальность темы магистерской работы 5 Цель и задачи исследования 6 Научная новизна и практическая значимость 6 Апробация работы 7 Глава II. Обзор литературы 2.1. Эпидемиология гриппа 8 2.2. Строение вируса гриппа 9 2.3. Антигенные изменения 12 2.4. Пандемический вирус гриппаA(H1N1)pdm 09 13 2.5.Вирусы гриппа птиц у человека 13 2.6.Потенциально пандемические вирусы гриппа птиц 14 2.7. Противогриппозная вакцинация 14 2.8. Методы идентификации вируса гриппа 16 2.8.1. Молекулярная идентификация вирусов гриппа 16 2.8.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 17 2.8.3. Секвенирование генома вируса гриппа 17 2.8.4. Методы анализа состава генома кандидатов в вакцинные штаммы 18 Глава III. Материалы и методы 23 3.1. Материалы 23 3.2. Методы работы 23 3.2.2. ПЦР с рестрикционным анализом 24 3.2.3. ОТ-ПЦР в реальном времени с HRM-анализом 26 3.2.4. Секвенирование по Сэнгеру 28 3.2.5. РТГА 28 E3

3.2.6. Изучение репродукции в куриных эмбрионах (КЭ) 29 3.2.7. Изучение прививочных свойств реассортантного вируса на мышах 29 3.2.8.Нахождение сходства 30 3.2.7.Обработка результатов 30 Глава IV. Результаты и их обсуждение 31 4.1. Результаты ПЦР в режиме реального времени с HRM-анализом 31 4.2. Верификация полученных данных ОТ-ПЦР-рестрикционным методом 33 4.3. Секвенирование и разработка новых праймеров для HRM-анализа генов PB1 и РА 34 4.4. Подтверждение соответствия генотипа реассортантного вируса фенотипическим свойствам 38 4.4.1. Изучение репродукции в куриных эмбрионах (КЭ) 38 4.4.2. Изучение прививочных свойств реассортантного вируса на мышах 39 Глава V. Выводы 40 Литература 42 E4

ГЛАВА I. Введение На сегодняшний день вирус гриппа является основной причиной заболеваний у людей любого возраста, ежегодно приводящей к смерти и экономическому ущербу по всему миру. Круглогодичный мониторинг является важным ключевым элементом эпидемиологического надзора, который включает в себя раннее обнаружение и идентификацию сезонных (циркулирующих) вирусов гриппа, а также вирусов гриппа новых подтипов, которые могут вызывать пандемии. Необходима информация, включающая в себя молекулярно-генетический анализ вирусов гриппа, уровень коллективного иммунитета, изучение чувствительности к противовирусным препаратам, антигенные характеристики вируса. Разработка эффективной вакцины против гриппа является приоритетной задачей, в связи с этим необходимо ежегодное обновление состава вирусов в вакцинах, так как циркулирующие вирусы гриппа постоянно эволюционируют. Актуальность темы магистерской работы Актуальность работы определяется тем, что особое внимание уделяется разработке методов молекулярно-генетического анализа штаммов вируса гриппа, которые будут включены в ежегодную вакцину. На протяжении многих лет Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) дважды в год обновляет свои рекомендации в отношении состава вакцины. На промежуточных этапах подготовки вакцинного штамма, когда нужно быстро проанализировать значительное число реассортантов (провести первичный скрининг), возникает потребность в разработке быстрых и недорогих методов первичного скрининга. На сегодняшний день известны молекулярные методы, которые используют в лабораторном надзоре за гриппом. К ним относятся качественные и количественные анализы в режиме реального времени с обратной транскрипции. Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) рекомендует протокол пиросеквенирования который является наиболее точным, тем не менее, этот метод является слишком дорогим для рутинного, широкомасштабного использования в диагностических лабораториях. Данная работа посвящена разработке эффективной и экономичной методики генотипирования реассортантных вирусов гриппа, включаемых в состав живой гриппозной вакцины E5

(ЖГВ). Цель и задачи исследования Целью данного исследования являлась разработка метода анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения (HRM анализ) для генотипирования реассортантных вакцинных вирусов, разрабатываемых для защиты против птиц. Для ее выполнения потребовалось решение следующих задач: 1. Изучить состав генома реассортантного вируса гриппа А/17/серебристая чайка/ Сарма/2006/887 (H6N1) методом ПЦР в режиме реального времени с HRMанализом. Подтвердить полученные результаты методом полиморфизма фрагментов рестрикции в агарозном геле и частичным секвенированием. 2. Разработать и апробировать праймеры для амплификации с помощью ПЦР в реальном времени генов внутренних и неструктурных белков реассортантных вирусов гриппа птиц, полученных на основе донора аттенуации А/Ленинград/ 134/17/57 (H2N2). 3. Подтвердить соответствие генотипа реассортантного вируса фенотипическим свойствам. Научная новизна и практическая значимость Научная новизна работы заключается в разработке метода определения генома реассортантных вакцинных штаммов на основе донора аттенуации А/Ленинград/ 1 3 4 / 1 7 / 5 7 ( H 2 N 2 ) с и с п ол ь зо ва н и е м H R M - а н а л и з а . В п е р в ы е п ол у ч е н холодоадаптированный реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Серебристая чайка/ Сарма/2006/887 (H6N1). Впервые выявлены уникальные нуклеотидные позиции в генах РВ1 и РА вируса птичьего гриппа А17/Серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1). В данной работе впервые были разработаны и апробированы универсальные праймеры для генов внутренних и неструктурных белков(PB2, PB1, PA, NP, M, NS) донора E6

аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вирусов птичьего гриппа. Hаучно-практическая значимость исследования. Разработан метод экспресс-анализа, которым можно идентифицировать олигонуклеотидные и однонуклеотидные различия в генах вируса гриппа, что позволяет применять этот метод для скрининга вакцинных кандидатов. Апробация работы Результаты работы представлены на конференции отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева федерального государственного бюджетного научного учреждения Института Экспериментальной Медицины 22 марта 2016 г. Результаты работы представлены на XIX Молодежной конференции-школе по органической химии «ОргХим-2016», Санкт-Петербург 27 июня – 1 июля 2016 г. Название работы«Анализ кривых плавления высокого разрешения продуктов ПЦР для изучения нуклеотидных замещений в геноме реассортантного штамма вируса гриппа А (H6N1)». Результаты работы опубликованы в «Microbiology Independent Research Journal»: Дешева Ю.А., Смолоногина T.А., Ландграф Г.О., Руденко Л.Г. Разработка холодоадаптированного реассортантного вируса гриппа А/H6N1 на основе донора аттенуацииA/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его генотипирование методом анализа кривых плавления высокого разрешения (HRM-анализ). Microbiology Independent Research Journal. 2016. Т. 3. № 1. С. 42-48. E7

Глава II. Обзор литературы 2.1. Эпидемиология гриппа. Вирус гриппа представляет собой серьезную угрозу для здоровья людей. Вирусы гриппа являются одними из наиболее распространенных возбудителей респираторных инфекций человека и наиболее значимыми, поскольку они являются причиной высокой заболеваемости и смертности (Jeffery, 2010). Вспышки гриппа происходят по крайней мере, со средних веков, если не с древних времен (Taubenberger and Morens, 2009). У пожилых, детей младшего возраста и людей с хроническими заболеваниями вирус гриппа является причиной высокой смертности. В Соединенных Штатах приблизительно 200000 госпитализаций и 36000 смертей происходит ежегодно в обычном эндемическом сезоне. Пандемии, вызванные вирусами новых антигенных подтипов возникают с периодичностью 8-41 лет в течение нескольких столетий, когда до 50% населения могут быть инфицированы в один год пандемии. За последние 500 лет, начиная с 1510 года, было приблизительно 14 пандемий вируса гриппа; за последние 120 лет - это пандемии в 1889, 1918, 1957, 1968, 1977 и 2009 (Tauben Bergerand Morens, 2009). Три крупных пандемии были зафиксированы в ХХ веке: 1918 до 1919 пандемический грипп А (H1N1), в 1957 - 1958 гг. пандемия А (H2N2), а также в 1968 г. пандемия А (H3N2) (La Force et.al. 1994).В 1918 году наиболее опустошительная пандемия в истории человечества вызвала гибель до 50 миллионов человек во всем мире (Johnson and Mueller, 2002). В 1957 и 1968 гг. пандемии вызвали около 70000 заболеваний и 34000 случаев смерти в Соединенных Штатах, соответственно (Noble 1982). Пандемия 2009 года, в первый год, вызвала приблизительно 12 000 смертей в Соединенных Штатах, из которых большинство были лица моложе 65 лет. Сезонные эпидемии гриппа вызывают высокие экономические потери, высокую заболеваемость, и смертельные случаи каждый год(Dai-LunShin, Bastian Hatesuer, 2015). Ежегодно во всем мире около 500 миллионов человек заражаются вирусом гриппа, из которых около 500 000 умирают (Fauci AS, 2006). Число заразившихся во время эпидемий составляет от 10% до 20%, но может быть и выше - до 40 -50% в особо уязвимых группах населения, таких как пожилые люди и дети раннего возраста (Philippe E8

et.al., 2010; La Force et.al., 2009; Taubenberger JK, 2006; Monto AS, 2005). Средняя смертность от гриппа в развитых странах составляет около 12 на 100000 человек, но в некоторых возрастных группах заболеваемость и смертность от сезонного гриппа (Stephenson I, 2002) значительно выше. Резкое увеличение смертности наблюдается у лиц старше 64 летнего возраста, а также лиц с астмой и другими хроническими заболеваниями (Cannell et.al., 2008; GartenRJ et.al., 2009; Nguyen-Van-Tam et.al., 2003). 2.2. Строение вируса гриппа. Вирус гриппа относится к семейству Orthomyxoviradae. Характерными особенностями этой группы вирусов являются одноцепочечный минус-нитевой сегментированный РНК-геном, спиральный нуклеокапсид, полиморфная липосодержащая оболочка, на поверхности вирусов имеются гликопротеины двух типов (гемагглютинин и нейраминидаза), обладают способностью к гемагглютинации и нейраминидазной активностью (Филдс,Найп 1989). На основании антигенных свойств двух внутренних белков вириона – нуклеопротеидного (NP) и мембранного (М1)–вирусы гриппа делятся на типы А, В и С (WHO 1980). Вирусы гриппа типа А вызывают эпидемии не только у человека, но и у других млекопитающих (лошадей, свиней) и птиц. В соответствии с антигенной специфичностью поверхностных гликопротеидов – гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) – вирусы гриппа А подразделяются на сероподтипы (WHO, 1980). Как показано на рисунке 1, вирусы гриппа А и В имеют 8 генов, которые кодируют 11 белков(рис. 1), в том числе поверхностные белки гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA). Вирус гриппа А, может быть разделен на различные подтипы в зависимости от различий в этих двух поверхностных белков. На сегодняшний день у вирусов гриппа А известно 16 подтипов HA и 9 подтипов NA (Пиневич А.В. и др., 2012). Вирус гриппа B инфицирует исключительно людей. E9

Рис. 1. HA - Гемагглютинин, NA - Нейраминидаза, M1 белок матрикса, M2 трансмембранный белок , NP Нуклеопротеины , NS1 - NS2 неструктурные белки, PA полимераза А, PB1 полимераза, PB2 полимераза (Saranya Sridhar et al.,2015) Восемь сегментов вирусов гриппа A и B (и семь сегментов вируса гриппа C) пронумерованы в порядке уменьшения длины. В вирусах гриппа A и B сегменты 1, 3, 4 и 5 кодируют только один белок на сегмент: белки PB2, PA, HA и NP. Все вирусы гриппа кодируют субъединицу полимеразы PB1 на сегменте 2. В некоторых штаммах вируса гриппа А этот сегмент также кодирует дополнительный протеин PB1-F2Аналогов для PB1-F2 не обнаружено в вирусах гриппа В или С. И наоборот, сегмент 6 вируса гриппа A кодирует только белок NA, тогда как вирус гриппа B кодирует как NA-белок, так и в -1 рамке считывания, белок матрицы NB, который представляет собой интегральный белок мембраны, соответствующий Вирусу M2 вируса гриппа A (Hatta et.al., 2003). Сегмент 7 обоих вирусов гриппа A и B кодирует белок M1. В геноме гриппа A ионный канал M2 также экспрессируется из сегмента 7 с помощью сплайсинга РНК (Lamb et al., 1981), тогда как вирус гриппа B кодирует мембранный белок BM2. Наконец, оба вируса гриппа A и B имеют один сегмент РНК - сегмент 8, на основе которого экспрессируется белок NS1 – антагонист интерферона (Dauber B et al., 2004; Garcia-Sastre, 2001; Kochs et al., 2007). РНК-полимераза состоит из трех субъединиц: PB1, PB2 и PA. Между PA и PB1 E10

имеется контакт, между PA и PB2 нет прямых взаимодействий. Этим субъединица полимеризации принадлежит ключевая роль в транскрипции и репликации вируса. РВ2субъединица РНК-полимеразы образует комплекс рибонуклеопротеина (RNP) с восемью сегментами генома и перемещается в ядро. Белок PB1 – охарактеризованной. субъединица полимеразного комплекса, является Биохимическое структурное изучение показало наиболее участие субъединицы PB1 в удлинении РНК-цепи. PB1 содержит аминокислотные участки, общие для всех РНК-зависимых РНК-полимераз и РНК-зависимых ДНК-полимераз (Muller et.al.,1994). Мутации в этих участках делают комплекс неактивным для транскрипции и репликации в клетках культуры ткани (Biswas et.al., 1994). Активность PB2 является существенной для транскрипции (Kobayashi et.al., 1996). PB2 связывается с метилированными структурами cap-1 на 5'-концах активно транскрибируемых клеточных мРНК, которые затем эндонуклеолитически расщепляются полимеразным комплексом. PA необходима для репликации вирусной РНК, хотя ее роль в этом процессе остается неясной (Danie R. Perezand Ruben O. Donis 2001). NP (белок нуклеопротеина) вируса гриппа является главным фактором в вирусном инфекционном цикле при переключении синтеза РНК вируса гриппа из режима транскрипции в режим репликации. Матричный белок M1, белок периферической мембраны, который покрывает вирусную оболочку на его внутренней стороне. Было обнаружено, что экспорт из ядра в цитоплазму зависит от этого белка Неструктурный белок NS1 вируса гриппа A в больших количествах синтезируется на начальных этапах инфекционного цикла (Murtietal.,1988; Medcalf L and Poole E,1999) является РНК-связывающим белком, который регулирует несколько посттранскрипционных этапов. Он ингибирует ядерный экспорт мРНК, и ингибирует сплайсинг до мРНК27 (Susanade Lucas et al., 2010). Наконец, белок NS1 связывается с двухцепочечной РНК тем самым блокируя ингибирование трансляции, имеет много функций во время вирусной инфекции - ингибирование иммунных ответов хозяина, особенно интерферона (IFN) и противовирусные эффекты IFN-индуцированных белков. E11

NS1 также действует на другие аспекты цикла репликации вируса, включая репликацию вирусной РНК, синтез вирусного белка. 2.3.Антигенные изменения. Отличительной чертой вирусов гриппа человека является их способность подвергаться антигенным изменениям, которые происходят следующими способами: Антигенный дрейф - это процесс постепенного и относительно непрерывного изменения вирусных HANA белков. Он возникает в результате накопления точечных мутаций в генах HA и NA во время репликации вируса. Оба типа вирусов гриппа А и В подвергаются антигенному дрейфу что приводит к появлению новых штаммов вируса. Появление этих новых штаммов требует частого обновления вакцинных штаммов. Поскольку антитела к предыдущим гриппозной инфекции не могут обеспечить полную защиту против новых штаммов в результате чего, люди могут иметь много инфекций гриппа в течение жизни. Антигенный сдвиг - в дополнение к антигенному дрейфу, вирусы гриппа А могут более резко и внезапно изменять тип. Сдвиг может произойти, когда вирус гриппа А появляется среди людей, имеющих либо белок HA или комбинацию HA и NA белков, которые не циркулировали среди людей в последние годы. Существуют по крайней мере три возможных механизма, с помощью которых могут происходить антигенный сдвиг: 1. вирус несущий новые HA и NA белки могут возникнуть через генетические рекомбинации вирусов гриппа животных и человека; 2. вирус гриппа от других животных (например, птицы или свиньи) могут заразить человека непосредственно без прохождения генетической рекомбинации; 3. вирус, не являющемся человеческим, может быть передан от одного вида животного (например, птицы) через промежуточного животного-хозяина (например, свиньи) и инфицировать человека. В то время как антигенный дрейф происходит непрерывно, антигенный сдвиг происходит нечасто и непредсказуемо. Поскольку антигенные результаты сдвига в появлении нового вируса гриппа, большая часть (или даже все) населения мира не будет E12

иметь никаких антител против него. Если новый штамм способен вызывать заболевания среди населения и устойчивый путь передачи человек-человек, ведущий к вспышке тогда такой вирус может распространиться по всему миру, вызывая пандемию. Частое появление антигенных вариантов является вирусологической основой для сезонных эпидемий и является причиной ежегодно пересматривать необходимость изменения одного или нескольких из рекомендованных штаммов для вакцин против гриппа(ManualforthelaboratorydiagnosisandvirologicalsurveillanceofinfluenzaWHOGlobalIn fluenzaSurveillanceNetwork, 2011). 2.4. Пандемический вирус гриппа A (H1N1) pdm 2009. В марте 2009 года новый вирус гриппа подтипа А (H1N1) был идентифицирован у пациентов с гриппозной инфекцией в Мексике и США. Вирус представлял собой новый генетический реассортант полученный из двух ранее существовавших вирусов гриппа свиней (Kelly HA et al. 2009). В течение весны, вспышка распространилась в США и во всем мире. В июне ВОЗ объявила о первой пандемии гриппа за 41 год (Vaillant L et.al. 2009). По состоянию на 8 ноября 2009 года, ВОЗ сообщила о более чем 503 536 подтверждений А (H1N1) инфекций и 6260 смертей 37, также пандемия продолжала распространяться по всему миру. Во время сезонного гриппа большинство случаев смерти приходилось на лиц старше 65 лет (Cannell et.al., 2008). Во время пандемии (2009) в основном пострадали молодые люди возраста 12 -22 года. Смертельные случаи также отмечались и в младшей возрастной группе (Runstadler et.al., 2007; James et.al., 2010). 2.5.Вирусы гриппа птиц у человека. В 1997 году птичий вирус гриппа А (H5N1) впервые инфицировал людей, вызывая вспышки болезней среди домашних птиц в Гонконге (Китай). С момента своего появления вирус А (H5N1) получил широкое распространение в 2003-2004 годах, в результате чего регистрировались миллионы случаи инфекций у птиц и более четырехсот случаев заболевания людей. Высокий процент осложнений и смертности при инфицировании людей вирусами А (H5N1) намного превышает долю смертей, E13

вызванных сезонными вирусами гриппа. В редких случаях, вирус А (H5N1) может передаваться от инфицированного человека к здоровому человеку, чаще всего это происходило в семьях. Фактором риска для человека является прямой контакт или близкий контакт с инфицированной домашней птицей. Через пять лет после того, как произошло широкое распространение вируса А (H5N1), его можно обнаружить у домашних птиц в нескольких странах. Контроль циркуляции вируса А (H5N1) среди домашних птиц имеет важное значение для снижения риска инфицирования человека и в предотвращении или сокращении тяжелых экономических потерь при вспышках (The highly pathogenic avian influenza A (H5N1) virus and influenza pandemic WHO Global Influenza Preparedness Plan, 2005). 2.6. Потенциально пандемические вирусы гриппа птиц. Вирус гриппа A (H6N1)обладает низкой патогенностью (Kawsar R., 2011). У домашней птицы за последнее десятилетие вспышки были зарегистрированы в Калифорнии в 2000-2002 года(Samdal HH,2005) и в Южной Африке в 2002-2004 годах (Halperin, 2005). В то же самое время как в 1997 году 18 человек в Гонконге были инфицированы птичьим гриппом A (H5N1), вирус гриппа A(H6N1) был выделен от птиц (ChenZ et.al., 2010). Анализ нуклеотидной последовательности показал, что сегменты внутреннего белка и NA гена вируса A/teal/HongKong/W312/97 (H6N1) были очень похожи на вирус гриппа A (H5N1), который был выделен в 1997 году в Гонконге (> 98% гомология последовательности аминокислот для шести сегментов внутреннего гена белка, > 97% для сегмента гена NA) По результатам филогенетического анализа вируса гриппа H6 предположили, что вирус может быть предшественником A (H5N1) Гонконгского вируса 1997 г. Оба вируса A (H5N1) и A (H6N1) имеют существенную гомологию в 6 внутренних генах белка с вирусом A (H9N2), который также был выявлен в Гонконге. 2.7. Противогриппозная вакцинация. Ежегодная вакцинация является основным средством снижения влияния сезонного гриппа. Вакцины против сезонного гриппа состоят из штаммов вируса циркулирующих в течение сезона. Вакцины против гриппа были трехвалентные (грипп A(H3N2), A(H1N1) и вирус гриппа B). Циркуляция E14

двух антигенных линий гриппа B – Виктория и Ямагата - привело к разработке четырехвалентной вакцины, содержащая в себе оба гриппа В. В феврале каждого года группа экспертов ВОЗ рассматривает данные в Южном полушарии и принимает решение о выборе циркулирующих штаммов для разработки вакцин следующего эпидемического сезона, а также в Северном полушарии. Производство вакцин начинается в марте и используются штаммы, рекомендованные ВОЗ. В настоящее время идет разработка новых подходов к подготовке вакцинных штаммов, включающая в себя сокращение времени изготовления, разработку универсальных вакцин, которые эффективны против широкого спектра вирусов Ежегодная вакцинация против гриппа рекомендуется для целевых групп населения используется два типа вакцин – инактивированная или живая ослабленная вакцина. Инактивированная вакцина против гриппа была произведена и использовалась с 1940 года и является наиболее распространенной вакциной против гриппа. Живая вакцина (ЖВ) лицензирована для использования в России, США, Европе и Индии. ЖГВ, вводимая интраназально вызывает более длительный и широкий иммунный ответ (гуморальный и клеточный), который напоминает естественный иммунитет после заражения. Применение данной вакцины имеет явные потенциальные преимущества по сравнению с традиционными парентерально введенными вакцинами, особенно у детей - длительный эффект и обеспечивает иммунный ответ, имитирующий естественную инфекцию (Mc Michael et al., 1983; Saranya Sridhar et al., 2005). Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (XA) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) - от безвредного XA донора аттенуации. Из полученных реассортантов выбирают вакцинный кандидат с E15

формулой генома 6:2, наиболее отвечающий требованиям антигенной специфичности, характерной для родительского вируса «дикого» типа, а также соответствующий признакам холодовой адаптации по способности к репродукции при пониженной температуре. В России на протяжении многих лет вакцинные штаммы против вируса гриппа А, входящие в со став ЖГВ для взро слых, подготавливают на о снове холодоадаптированного донора аттенуации – штамма А/Ленинград/134/17/57 (подтип H2N2), а для детей – на основе вируса A/Ленинград/134/47/57(H2N2)(Александрова Г.И. и Климов А.И., 1994). 2.8. Методы идентификации вируса гриппа Поскольку поверхностные гликопротеины вирусов гриппа часто видоизменяются в результате генетических мутаций, ВОЗ координирует систему эпиднадзора для мониторинга эпидемиологии вирусов гриппа (Hampson, 1996). Для производства вакцин необходимо подготовить реассортантный вирус и для определения поверхностных антигенов необходимо проводить лабораторное тестирование и анализ последовательностей чтобы подтвердить их сходство с эталонным штаммами (Catherine Gerdil, 2003) . 2.8.1.Молекулярная идентификация вирусов гриппа Обычные методы диагностики инфекции гриппа (в том числе культивирование вирусов и обнаружение вирусных антигенов) являются чувствительными и специфичными. Однако разработка молекулярных методов для обнаружения гриппа А или в образцах значительно облегчила изучение этиологии вспышек респираторных заболеваний. Данные методы используются для быстрой идентификации подтипов гриппа, обнаружения потенциально новых или вновь эволюционирующих вирусов гриппа . 2.8.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) метод предложенный в 1983 году Кэри Муллисом (Kary B. Mullis, 1987). Используется для амплификации специфических участков ДНК с очень низким уровнем исходной матрицы ДНК. ОбратноE16

транскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР) является продолжением этой методики, когда вначале получают ДНК-копию сегмента РНК, которую затем подвергают амплификации с помощью ПЦР. Использование техники ПЦР для детекции вирусов и их количественного анализа получило широкое распространение (Watzinger,2006). Как известно, ПЦР имеет целый ряд достоинств: высокая чувствительность, хорошая воспроизводимость результатов, сочетающаяся с необычайно широким динамическим диапазоном. Она позволяет количественно оценивать концентрацию вируса в конкретный момент времени, изучать динамику вирусной пролиферации, оценивать ответ организма на предлагаемое лечение вирусного заболевания, способность вируса воспроизводиться в разных типах клеток, различия между активной и латентной инфекциями. В начале 90-х годов прошлого столетия исследователи предложили регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР (Higuchi et. al., 1992). Метод ПЦР в режиме реального времени имеет ряд преимуществ, основное из которых - отсутствие отдельной стадии детекции результатов, а, следовательно, возможность избежать контаминации образцов и получения ложноположительных результатов. 2.8.3. Секвенирование генома вируса гриппа Метод определения нуклеотидных последовательностей, разработанный Frederick Sanger и его коллегами в 1977 году (Sanger et al. 1977), является наиболее используемым методом молекулярно-генетического анализа. Данный метод позволяет наблюдать эволюцию гриппа в рамках вирусологического надзора. Также данный метод используют для проведения частичного секвенирование генома вирусов гриппа, хотя новые технологии лучше подходят для этого. Автоматизированное секвенирование по Сенгеру считается "методом первого поколения". Секвенирование Сэнгера с помощью капиллярного электрофореза является золотым стандартом секвенирование ДНК. Методы нового или «второго поколения» (Next-Generation Sequencing, NGS) используемый с 2005 года, значительно расширили объем информации и детализации. NGS выявляет генетические вариации среди многих различных частиц вируса гриппа в одном образце, и эти методы также раскрывают всю кодирующую область геномов. E17

Основным преимуществом секвенирование нового поколения является получение огромного массива данных за короткое время. Полученные данные должны быть тщательно интерпретированы высококва лифицированными специалистами(ZhengWangetal.,2006).База данных GenBank (Dennis A et.al., 2013) содержит информацию о полученных нуклеотидных последовательностях. Ежедневный обмен данными с European Nucleotide Archive (ENA) и DNA Data Bank of Japan (DDBJ) обеспечивает всемирный охват. GenBank создан и распространен Национальным центром Информационной биотехнологии (NCBI), отделом Национальной библиотеки медицины (NLM), расположенной в университетском городке Национального института здравоохранения США (NIH), штат Мэриленд, США www.ncbi.nlm.nih.gov. Данная база доступна по всему миру, данными GenBank можно пользоваться бесплатно через Интернет. 2.8.4. Методы анализа состава генома кандидатов в вакцинные штаммы Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ). Долгое время для анализа реассортантных штаммов вируса гриппа применялся метод, основанный на разности подвижностей однонитевых РНК-сегментов разных вирусных гриппозных штаммов в электрофорезе в ПААГ (Palese et. al., 1976). Этот метод имеет ряд недостатков. Во-первых, разность в электрофоретических подвижностях генетически похожих, особенно больших, РНК-сегментов разных штаммов трудно различима. Вовторых, порядок миграции при электрофорезе в полиакриламидном геле для некоторых генов может меняться. Метод рестрикционного анализа ДНК копий генов. В 1994 году А.И. Климовым и Н. Дж. Кокс был предложен метод, позволяющий изучать одиночные нуклеотидные замены у доноров аттенуации и эпидемических штаммов, суть которого заключалась в довольно быстром и простом определении состава генома и генетической устойчивости живой гриппозной реассортантной вакцины (Klimov, Cox, 1994). Метод основан на амплификации отдельных РНК-сегментов (длиной примерно 150-300 нуклеотидов), содержащих мутации, методом ОТ-ПЦР и дальнейшем рестрикционном E18

анализе ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции. В процессе рестрикционного анализа генома кандидата в вакцинные штаммы сайты рестрикции, характерные для одного из родительских штаммов, узнаются выбранными нуклеазами. Метод нуждается в минимальном количестве вирусного материала (примерно 100 мкл аллантоидной жидкости) и показывает относительно быстрое определение (в течение 10-ти часов) наличия или отсутствия мутаций. Этот метод сочетает в себе высокую чувствительность ПЦР-анализа и высокую специфичность рестрикционного анализа, он позволяет изучать уникальные нуклеотидные различия между вакцинными донорами аттенуации и дикими штаммами для анализа состава генома и генетической стабильности реассортантов вируса гриппа. Чтобы гарантировать максимально возможное постоянство высокой урожайности вакцинного вируса, его аттенуации и антигенной актуальности, геном должен иметь структуру 6:2. Таким образом, определение состава генома – важный шаг при создании кандидатов в вакцинные штаммы. Важно отметить, что РТГА и реакция ингибирования нейраминидазы могут быть использованы для определения источника генов, кодирующих поверхностные гликопротеиды, однако внутренние гены должны определяться другими способами. А. И. Климовым и Н. Дж. Кокс были идентифицированы изменения в последовательностях нуклеотидов при сравнении родительского дикого штамма и двух холодоадаптированных доноров аттенуации Лен/17 и Лен/47. В шести генах холодоадаптированного донора аттенуации Лен/17 выявлено 10 нуклеотидных замен, 8 из которых являются значащими. Существенно, что все мутации, обнаруженные в геноме донора Лен/17, сохранились в геноме прошедшего 30 дополнительных пассажей в куриных эмбрионах при 25°С ХА-штамма Лен/47, который при этом приобрёл ещё четыре дополнительные мутации, три из которых являются значащими. Метод, предложенный в 1994 году, получил широкое распространение и повсеместно используется и сегодня при создании ЖГВ. Мультиплексная ПЦР. Данная методика используется как для типирования вирусов гриппа типа А и В, так и отбора вакцинных штаммов (Elliset.al., 1997; Lazarus et. E19

al., 1996; Read et. al., 1997). Принцип метода заключается в подборе флуоресцентномеченых пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных для внутренних генов донора аттенуации, и генов, кодирующих HA и NA эпидемического вируса, для образования ПЦР-продукта для каждого сегмента генома в мультиплексной конфигурации, которую затем исследуют с помощью электрофореза. Происхождение каждого сегмента можно определить по флюоресценции и электрофоретической подвижности. Затем последовательность всех генов реассортанта подтверждается секвенированием. Сравнительно недавно был разработан еще один метод оценки состава генома пиросеквенирование, который заключается в том, что в процессе синтеза ДНК происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов. Данный метод сочетает в себе все преимущества секвенирование и ПЦР в режиме реального времени, что позволяет получать точную информацию о последовательности, по меньшей мере, 50 нуклеотидов, а также проводить высокопродуктивный скрининг до 96 образцов в течение 1,5-2 часов. Пиросеквенирование в основном используется для типирования вируса гриппа и скрининга мутаций, например, для выявления мутаций, отвечающих за устойчивость вируса к различным противогриппозным препаратам. Возможно использование данной методики и для анализа состава генома кандидатов в вакцинные штаммы. (Bright RA et. al.,2006; Deng et. al., 2009; Deyde et. al.,2009; Duwe et. al., 2008; Lackenby et. al., 2008). Анализ кривых плавления высокого разрешения (HRM-анализ), предложенный в 1997 году (Ririe K.M., Rasmussen R.P., Wittwer C.T 1997), позволяет генерировать профили кривых плавления фрагментов ДНК, полученных с использованием ПЦР в реальном времени. Для этого температура в пробах постепенно увеличивается, что приводит к высвобождению флуорофора из денатурированной двухцепочечной ДНК. Скорость изменения флуоресценции позволяет выявить пик, который соответствует температуре плавления комплексов двухцепочечной ДНК. Праймеры-димеры обычно плавятся при более низкой температуре благодаря их меньшему размеру, что дает возможность дифференцировать амплифицированный фрагмент ПЦР от праймеровдимеров и других неспецифических продуктов. E20

Метод HRM-анализ достаточно специфичен и чувствителен для разделения фрагментов ДНК на основании незначительных различий в них, что делает возможным сканирование мутаций, анализ метилирования и генотипирование (Liew et. al. 2004). В отличие от других методов, ПЦР в реальном времени обеспечивает закрытую систему, которая снижает риск загрязнения, уменьшает время анализа и не требует обработки образца или разделения после ПЦР. HRM-анализ может использоваться для характеристики образцов на основании их CG-состава и комплементарности последовательностей ДНК. Например, HRM-анализ может быть использован для детекции однонуклеотидных замен. Однако точность методики зависит от соответствующего оборудования, красителей которые могут связываться с двухцепочечной ДНК и программного обеспечения для анализа. Важно отметить, что интеркалирующий краситель SYBRGreen, широко использующийся при проведении ПЦР-анализа для HRM не подходит (Eischeid, 2011). Для проведения анализа кривых плавления высокого разрешения рекомендуют использовать интеркалирующие красители третьего поколения, такие как EvaGreen, LCGreen и SYTO9. Популярные используемые красители включают: LC Green/LC Green Plus (Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA), Reso Light Dye (Roche Diagnostics Limited, Shanghai, China) и SYTO9 (Invitrogen, Beijing, China). Среди которых LC Green, LC Green Plus, безусловно, наиболее широко используются благодаря своей высокой чувствительности, стабильности, надежности и совместимости со многими инструментами HRM (Caren et.al., 2006; Herrmann et.al., 2006). Однако высокая стоимость этих красителей часто ограничивает применение этой технологии, особенно при работе с большим количеством образцов. EvaGreen (BiotiumInc., Hayward, CA, США) представляет собой недавно разработанный и недорогой краситель, который используется в количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, анализе кривой плавления ДНК после ПЦР. E21

Эти красители малотоксичны и могут использоваться в высоких концентрациях в реакциях ПЦР в реальном времени. Использование этих красителей в более высоких концентрациях позволяет достичь полного насыщения ими двухцепочечной ДНК и уменьшить динамическое перераспределение красителя в неденатурированные области ДНК при ее плавлении. Использование красителей третьего поколения также позволяет достичь более высокой чувствительности и разрешения в профиле плавления благодаря их высокому качеству. Таким образом, вышеперечисленные методы имеют ряд преимуществ и недостатков, так например пиросеквенирование является дорогим методом. Для упрощения процедуры определения вакцинных кандидатов мы разработали ПЦР в режиме реального времени с анализом кривых плавления высокого разрешения (HRMанализ). Данный метод позволяет экономить время по сравнению с визуализацией результатов в агарозном геле при ПЦР-анализе и снижает риск контаминации ампликонами. Кроме того, данный метод является сравнительно недорогим, так как не требует использования дорогостоящих флуоресцентных олигонуклеотидных зондов. E22

Глава III. Материалы и методы 3.1. Материалы. В исследовании использовали штаммы вируса гриппа из коллекции отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ»: реассортантный штамм А17/ серебристая чайка/06/887 (H6N1) 134/17/57 (H2N2) [Len17/H6]; донор аттенуации А/Ленинград/ [Len17]. А/Ленинград/134/57 (H2N2) [Len wt]. Апатогенный вирус птичьего гриппа А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006(H6N1) был получен из ФГБУ «НИИ гриппа» Министерства Здравоохранения России. Вирусы культивировали в развивающихся 10-дневных куриных эмбрионах (птицефабрика «Скворицы», Ленинградская область). Инфекционную активность вирусов определяли в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной (33°С), повышенной (до 39°С) и пониженной (до 26°С) температуре, 50%-ную эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД50) рассчитывали по методу Reed – Muench (Reed LJ, Muench ., H 1938). 3.2. Методы работы 3.2.1. Выделение РНК из вирусных изолятов. Для генотипирования вирусную РНК выделяли из 80 мкл вирусосодержащей аллантоисной жидкости с помощью набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Нидерланды). Для этого использовались следующие материалы и оборудование: Мини «QIAamp® ViralRNA» Lysis Buffer AVL Wash Buffer RW1 Wash Buffer RW2 Elution buffer вода (RNA free) Этанол (96-100%) Микроцентрифуга (регулируемая до 13000 оборотов в минуту) Регулируемые дозаторы Стерильные наконечники (RNAfree) для дозаторов с аэрозольным фильтром E23

Вортекс Пробирки для микроцентрифугрования (1.5 мл.) Термоциклер Эндонуклеазы рестрикции Ход эксперимента. В подготовленные пробирки вносили по 280 мкл Lysis Buffer AVL, добавляли по 80 мкл образца вортексировали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем в пробирки вносили по 280 мкл 100% этанола, вортексировали. Пробы центрифугировали 1 мин при 13 тыс об/мин далее меняли колонки. Добавляли 250 мкл Wash Buffer RW1 центрифугировали 1 мин при 8 тыс. об/ мин. и меняли колонки. Добавляли 250 мкл промывающего буфера RW2 центрифугировали 3 мин при 13 тыс. g и меняли колонки на чистые 1,5 Эпиндорфы. Добавляли 30 мкл Elution buffer, инкубировали 1 минуту при комнатной температуре, центрифугировали 1 мин при 13 тыс. об/мин. Полученные образцы РНК хранились при температуре -20°С. Полученную РНК использовали для постановки обратной транскрипции (ОТ) с последующим выполнением ПЦР в реальном времени. 3.2.2. ОТ-ПЦР в реальном времени с HRM-анализом и рестрикционным анализом. Обратная транскрипция. ДНК-копии генов вируса гриппа получали с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (M-MulV RT) и специфичных праймеров. Пробы, содержащие буфер для обратной транскриптазы (10x) в объеме 2,5 мкл, 2,0 мкл дезоксинуклеозидтрифосфатов, 14 мкл воды, 0,5 мкл ингибитора РНКаз, 1,0 мкл прямого праймера и 4 мкл РНК, помещали в амплификатор на 90 секунд, 92°С для отжига праймеров. Затем готовили смесь (на нужное количество проб), включающую 2,5 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл десятикратного буфера для обратной транскриптазы и 6,5 мкл воды. По 1 мкл этой смеси добавляли в каждую пробу (суммарный объем пробы E24

таким образом – 25 мкл) и помещали последние в прибор для амплификации, запрограммированный на режим работы 37°С 1 час. Второй этап работы (ПЦР в реальном времени) проводился на приборе CFX96TM Real-time PCR System (BioRad). В пробирки раскапать 10 мкл SsoFast EvaGreen, по 1 мкл прямого и обратного праймера, 4 мкл воды и 4 мкл кДНК (общий объём пробы 20 мкл) поместить в амплификатор, запрограммированный на следующий режим: 1. Активация фермента при 98°С 3 минуты; 2. 40 циклов ПЦР, включающих в себя этап денатурации (5 секунд при 98 °С) и этап отжига/элонгации (5 секунд при 55°С); 3. Снятие кривых плавления, представляющее собой повышение температуры от 75°С до 95°С с регистрацией интенсивности флуоресценции с шагом 0,5°С (5 секунд на шаг). Последовательности праймеров представлены в табл. 1. Таблица 1. Праймеры и рестриктазы, применяющиеся для ПЦР-ректрикционного анализа реассортантов эпидемических вирусов гриппа А на основе донора аттенуации A/Ленинград134/17/57. Название Последовательность длина фрагме нта фермент A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) Эпидемические вирусы Участок разрезани я Размер фрагменто в Участок разрезани я Размер фрагментов 1459 155, 85 Нет Не режется PB2-F1374 PB2-R1614 GGG ААТ TGA ACA TAT CGA TAT TGT CAG TTT CTC TGT 240 Tru 9I PB1-F740 PB1-R 1044 GAG CAA TTG CAA CAC CCG TGC GAT GCT CAG GAC GTT 304 Hind III None Не режется 819 225, 79 PA-F8 PA-R325 GCA GGT ACT GAT CCA AAA TGG AAG CGA CTC CTG TGG TGT TGC AGA TG 317 Bam HI 107 218, 99 Нет Не режется PA - F900 PA-R1077a TGA GGA CCC AAG TCA CGA CTC ATT CTC AAT GCT CTG CAG TTC TGC CAT TA 177 Vsp I 1045 145, 32 Нет Не режется E25

NP-F886 NP-R1200 TAT GGA CCT GCC GTA GCC GTA CCT GCT TCT CAG TTC NA-F14 NA-R-677 314 Eco RI 1066 180, 134 Нет Не режется GTGAAGATGAATCCA 663 AATCAA GAGACC ATGAACCAATACTGT C Tru 9I 130, 495 365, 182, 116 Нет Не режется M- F39 M-R249 CCG AGG TCG AAA 210 CTG ACG TTC TCT CGA TC GCG TCT ACG CTG CAG TCC TCG CTC Ple 191 68 181, 29 Нет Не режется NS-F673 NS-R890 CAA AAC AGA AAC 217 GGA AAA AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT TAT CAT TAA BstC 81 Нет Не режется 798 125, 92 Для рестрикционного анализа фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР в реальном времени и подвергнутых HRM-анализу, использовались следующие материалы и оборудование: бромистый этидий (1,5% растворагарозы) 1 TBE буфер для электрофореза динатриевая соль, молекулярный вес 372,2, набор рестриктаз, буфер для рестриктаз (10х), маркер молекулярного веса ДНК (длины фрагментов: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000х2, 1500х2, 2000х2). Камера для горизонтального электрофореза. Пробы, содержащие 5 мкл ПЦР-продукта, 3 мкл воды, 1 мкл соответствующей рестриктазы (см. Табл. 1) и 1 мкл буфера для рестриктазы (10х), помещали в прибор для амплификации, запрограммированный на режим работы 37°С 6 часов (общий объём реакционной смеси 10 мкл). E26

Электрофорез ДНК-копий сегментов РНК, обработанных соответствующими рестриктазами, проводился в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (из расчета 5 мкл на 100 мл) в 1Х TBE буфере. В каждую лунку геля вносились пробы кДНК, содержащие 1 мкл красителя (общий объём пробы 5 мкл), а в одну из лунок – 3 мкл маркера молекулярного веса. 3.2.3. ОТ-ПЦР в реальном времени с HRM-анализом с использованием вновь разработанных праймеров. Для ПЦР в реальном времени с помощью программы Primer3 (Andreas Untergasser et. al. 2012) были разработаны пары праймеров для генов внутренних и неструктурных белков амплифицирующие меньшие по размеру фрагменты (100-150 нуклеотидов). Оптимальная температура отжига вновь разработанных праймеров – 59-61°С. Программное обеспечение Primer3 разработано в Институте White head Institute и Howard Hughes Medical - широко используется для проектирования праймеров. PB2-F1423 (5’ GAC ATG ACT CCA AGCACA AGA G 3’), PB2-R1530 (5’ AAA CCG GTC AATG CTCACC ACTA 3’); PB1-F1736 (5’ TGT GGG AGC AAA CCC GCTCAA 3’), PB1-R1888 (5’ GAT TCA GGGG ATTA CAAA GCCTCC 3’), PA – F47 (5’ GCT TCA ATC CGA TGA TTG TCG AGC 3’) PA – R159 (5’ ATG CAC TCA CTT GGA AGT TAT GC 3’) NP – F873 (5’ TAAT GGT GATG ATG CAACAGC 3’) NP –R1008 (5’ ACCC TGC ATC AAA GAG CAC ATCC 3’) M – R408 (5’ TGGG CC TC ATA TA CAA CAACAGGATGG 3’) M-F505 (5’ CCC ATG CTG GGA GTC AGC CAA TCTG 3’) NS –F729 (5’ ATG GCT GAT TGA AGA AGT 3’) NS – R840 (5’ TCT TAT CTC TTG TT CC ACTT 3’) На первом этапе получали ДНК-копии генов вируса гриппа с помощью обратной транскриптазы M-MulV RT и случайных гексамеров (раздел 3.2.2). ПЦР в реальном E27

времени с HRM-анализом проводили на приборе CFX96TM Real-time PCR System (BioRad). Пробы, содержащие 10 мкл SsoFast EvaGreen, по 1 мкл прямого и обратного праймера, 4 мкл воды и 4 мкл кДНК (общий объём пробы 20 мкл) помещали в амплификатор. Плавление продуктов ПЦР осуществляли при температуре от 65°С до 95°С с инкрементом в 0.5°С. HRM-анализ кривых плавления проводили с использованием компьютерного программного обеспечения Precision Melt Analysis Software, Version 1.1 (Bio- Rad, США). Происхождение гена NA реассортанта было определено в одноступенчатой ОТ-ПЦР с праймерами NA- F101 (5’ GATTAGCTCAACCCAGAAAC (5’AGAAAAAGGAAAAGTAGTAAATCA 3’) с последующим 3’) и NA-R605 секвенированием полученного фрагмента. 3.2.4. Секвенирование по Сэнгеру Для частичного секвенирование были получены ДНК- копии сегментов РНК PB2, PB1, PA, NP и NA с помощью набора OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Нидерланды). После электрофореза в 1.5% агарозном геле ДНК-копий и очистки посредством QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Нидерланды) секвенирование было выполнено с помощью набора реактивов BigDye Terminatorv3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, США) на ДНК-анализаторе ABI 3730xl в лаборатории ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», в отделе вирусологии. Обработку электрофореграмм нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ 3730 Data Collectionv 3.0 software (Applied Biosystems, США). Частичные нуклеотидные последовательности генов РВ2, РВ1 и NP депонированы в базе данных GISAID EpiFlu под номерами PB2 EPI774106, PB1 EPI774107 и NPEPI774105. 3.2.5. РТГА. Определение принадлежности генов, кодирующих поверхностные антигены. Происхождение НА было подтверждено в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) со специфической крысиной антисывороткой. Метод основан на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител. Для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации сыворотки E28

обрабатывали препаратом RDE (receptor–destroyingenzyme) согласно протоколу производителя. Постановка РТГА (этапы): приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции. Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты: • антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость – аллантоисная или культуральная); • иммунные сыворотки к различным вирусам гриппа; • буферно-солевой раствор рН 7,2 0,2 (Na-фосфатный буфер 0,01 М с 0,16 М NaCl); • взвесь эритроцитов, 1 %. Готовили двукратные разведения сыворотки в объеме 25 мкл, вносили рабочую дозу антигена в объеме 25 мкл и после контакта антигена и сыворотки (30 мин) при температуре 20 °С в каждую лунку панели вносили по 50 мкл 0,5 %-ной взвеси эритроцитов. После оседания эритроцитов в контроле через 40 мин проводили учет результатов. За титр активности принимается разведение сыворотки, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов. 3.2.6. Изучение репродукции в куриных эмбрионах (КЭ). Эмбрионы кур породы Леггорн получали в возрасте 10-ти дней (птицефабрика «Скворицы»). Каждый эмбрион просвечивался на овоскопе с целью удаления неоплодотворённых и бракованных (недоразвитие сосудов, повреждение скорлупы) яиц и обозначения границ воздушной камеры, через которую далее осуществлялось введение вируса. Эмбрионы инкубировали в термостате при температуре 37 °С. Определение проводили на развивающихся куриных эмбрионах 10дневного возраста. Десятикратные разведения вируса готовили в 1 мл буферно-солевого раствора (рН 7,0).Вводили в аллантоисную полость 0,1 мл вируссодержащей жидкости из разведений от 10-1 до 10-7, использовали на каждое разведение по 4 эмбриона. Эмбрионы инкубировали при температуре 33 °С в течение 48 ч. По истечении срока инкубации E29

отдельно из каждого эмбриона отбирали по 0,05 мл аллантоисной жидкости. Затем в каждую лунку добавляли по 0,5 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Через 30 мин контакта при температуре 20 °С, после оседания эритроцитов в контроле, проводили учет гемагглютинации иммунобиологических (Методы препаратов определения для показателей профилактики и качества диагностики гриппа Методические указания МУ 3.3.2.1758—03). 3.2.7. Изучение прививочных свойств реассортантного вируса на мышах Мышей линии CBA в возрасте 10 недель (Рапполово, Ленинградская область) под легким эфирным наркозом заражали интраназально 50 мкл вируссодержащей 6 аллантоидной жидкости с содержанием вируса 10 ЭИД50. В качестве препарата плацебо использовали стерильный фосфатно-солевой буфер. Эвтаназию проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Концентрацию вирусов определяли в легких и в носовых ходах мышей на третьи сутки по показателям титрования суспензии органов в развивающихся куриных эмбрионах, начиная с разведения 1:10 для легких и 1:2 для носовых ходов. У оставшихся вакцинированных животных через 3 недели после иммунизации собирали образцы крови. Сыворотки обрабатывали RDE и тестировали на присутствие антигемагглютинирующих антител к вакцинному вирусу Лен17/Н6 (Rowe T et al., 1999). 3.2.8. Для нахождения областей локального сходства между последовательностями использовали программу BLAST (Eric et al. 2011). Данная программа сравнивает последовательности нуклеотидов или белков с базами данных последовательностей и вычисляет статистические совпадения. BLAST также может использоваться для определения функциональных и эволюционных связей между последовательностями https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. 3.2.7.Обработка результатов исследования проводилась с помощью статистического пакета «Statistica» (версия 6.0). Для представления полученных данных использовали показатели описательной статистики: среднее арифметическое, среднегеометрические титры (СГТ), среднеквадратичное отклонение. Сравнение двух E30

независимых групп проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при р <0.05. E31

Глава IV. Результаты и обсуждение. Реассортантный кандидат в вакцинные штаммы Лен17/Н6был получен методом классической генетической реассортации вируса гриппа птиц H6N1/дт и ХА донора аттенуации Лен/17. В РТГА со специфической крысиной антисывороткой было подтверждено происхождение гена НА реассортанта Лен17/Н6 от вируса гриппа птиц H6N1/wt. Путем секвенирование фрагмента гена NA было показано, что ген NAреассортанта также происходит от вируса H6N1/wt. Происхождение остальных генов реассортанта определяли методом ПЦР в реальном времени с последующим HRMанализом с применением интеркалирующего флуоресцентного красителя EvaGreen. 4.1. Результаты ПЦР в режиме реального времени с HRM-анализом. На рис. 2 представлен график кривых различия проб, полученный с помощью программы Precision Melt Analysis. Программа Precision Melt Analysis автоматически проводит кластеризацию для всех позитивных лунок. Для облегчения визуальной идентификации кластеров программа генерирует так называемые «кривые различия» для каждой лунки. Эти кривые показывают различия во флуоресценции между лункой и референсной кривой. Референсная кривая вычисляется как средняя флуоресценция всех кривых для выбранного кластера сравнения. Амплификацию проводили с помощью праймеров, представленных в таблице 1. На графике хорошо видно, что вирус H6N1/wt, обозначенный зелёным цветом, отличаются от донора аттенуации Лен/17, выделенных красным цветом, и по форме кривых, и по температурному профилю.На основании полученных данных можно сделать вывод, что гены внутренних и неструктурных белков реассортанта Лен17/H6 унаследованы от ХА донора аттенуации Лен/17.   E32

PB2 Лен 17, Лен 17/H6 NP H6N1/дт Лен 17, Лен 17/H6 H6N1/дт M PB1 Лен 17, Лен 17/H6 Лен 17, Лен 17/H H6N1/дт H6N1/дт PA NS Лен 17, Лен 17/H6 H6N1/дт H6N1/дт Лен 17, Лен 17/H6 E33

Рис.2. HRM-анализ вакцинного кандидата Лен17/Н6 Амплифицированные участки генов PB2, NP, M, NS, PB1 и и родительских вирусов. PA.   E34

Анализ кривых плавления высокого разрешения, позволяет генерировать профили кривых плавления, которые достаточно специфичны и чувствительны для разделения нуклеиновых кислот на основании незначительных различий в них, что делает возможным сканирование мутаций, анализ метилирования и генотипирование (Liew et.al., 2004). HRMанализ может использоваться для характеристики образцов на основании их CG-состава и комплементарности последовательностей ДНК. Возрастающий интерес к упрощению анализа однонуклеотидных полиморфизмов приводит к активному развитию HRMтехнологии. Для проведения анализа кривых плавления высокого разрешения рекомендуют использовать интеркалирующие красители третьего поколения, такие как EvaGreen, LCGreen и SYTO9 (Eischeid, 2011). Эти красители малотоксичны, не вызывают ингибирования течения ПЦР и могут использоваться в ПЦР в реальном времени в более высоких концентрациях по сравнению с SybrGreen, что позволяет достичь более полного насыщения ими двухцепочечной ДНК и уменьшить динамическое перераспределение красителя в неденатурированные области ДНК при ее плавлении. HRM-анализ начинает вводиться в практику при изучении вирусов гриппа, например, для детекции и количественного анализа вируса (Curd et.al., 2011), а также для скрининга появляющихся в популяции новых штаммов (Lin et.al., 2008). 4.2. Верификация полученных данных ОТ-ПЦР-рестрикционным методом. Проверка полученных в ходе ПЦР в режиме реального времени с HRM-анализом результатов была проведена при помощи классического ОТ-ПЦР-рестрикционного метода (глава3.2.1). Результаты электрофореза в 1,5% агарозном геле ДНК-копий сегмента РНК, кодирующего белок PB2, изучаемых вирусов представлены на рисунке 3. На рис.3 видно, что ДНК-фрагменты генов PB2, NP, M и NS донорского штамма и вакцинного кандидата разрезаются рестриктазами на фрагменты, с молекулярным весом около 100 и 200, что примерно соответствует их ожидаемым размерам (см. Табл. 1). Амплификаты птичьих вирусов не режутся. Полученные результаты свидетельствуют о том, что амплификация прошла успешно и специфично, и подтверждают данные ПЦР с HRM-анализом, что делает возможным дополнительный анализ амплификатов другими методами. В то же время на рис. 3 видно отсутствие амплификации фрагментов РВ1 и РА E35

вируса H6N1/дт с праймерами, специфичными для генов донора аттенуации Лен/17, повидимому вследствие выраженных различий между вирусами подтипов H2N2 и H6N1. 4.3. Секвенирование и разработка новых праймеров для HRM-анализа генов PB1 и РА. При анализе нуклеотидной последовательности генов PB1 и РА вируса H6N1/дт в участках амплификации с существующими праймерами(PB1 1767-1986, РА8-325) были обнаружены ранее не встречавшиеся у других вирусов птичьего гриппа нуклеотидные замены, в связи с чем нарушалась гомология и не происходила амплификация. Отсутствие амплификации может свидетельствовать о происхождении гена от птичьего вируса, поскольку используемые праймеры разрабатывались для генов внутренних и неструктурных белков вируса А(H2N2). Но при этом нельзя исключить, что причиной отсутствия амплификации может быть техническая ошибка (пипетирование и т.д.). По этой причине были выбраны менее вариабельные участки генов РВ1 и РА, и разработали новые праймеры с целью амплификации более коротких участков (781-952 и 47-206, соответственно). Амплификация фрагментов генов РВ1 и РА вируса H6N1/дт с новыми праймерами прошла успешно, что было подтверждено секвенированием полученных фрагментов. Рис. 4 показывает, что при HRM-анализе, выполненном с помощью программы Precision Melt Analysis, имеется отчетливое различие кривых плавления для фрагментов генов донора аттенуации Лен/17 и Лен/дт, отличающихся всего на одну нуклеотидную замену. E36

Рис. 3. Анализ генома вакцинного кандидата Лен17/Н6 методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Амплифицированные участки генов PB2 (1374-1614), NP (886-1200), M (39-249), NS (673-830), PB1 (740-1044) и PA (900-1077) вакцинного кандидата Лен17/Н6 и родительских вирусов обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Tru 9I, EcoRI, BstFNI и Cac8I соответственно и анализировали в агарозном геле. Пробы в лунках: 1 - молекулярный маркер, N – отрицательный контроль; «-» – фрагменты, не обработанные рестриктазами, «+» – фрагменты, обработанные соответствующими рестриктазами. PB1 H6N1/дт 781 819 Лен/ дт 17/H6 Лен/17, Лен E37

47 PA Лен/17, Лен 17/H6 H6N1/дт Рис. 4.HRM-анализ генов PB1 и РА вакцинного кандидата Лен17/H6, родительских вирусов и пандемического вируса Лен/дт с подтверждением секвенированием амплифицированных фрагментов. Амплифицировали участки генов PB1 (781-952) и РА (886-1200), вакцинного кандидата Лен17/H6, родительских вирусов и пандемического вируса Лен/дт и сравнивали кривые плавления высокого разрешения. Амплифицированные участки также секвенировали, и сиквенс нуклеотидных последовательностей анализировали множественным выравниванием. E38

1424 PB2 Len-wt MDV, Len 17/H6 H6N1-wt E E39

E Рис. 5.HRM-анализ генов PB2, NP, M, NS вакцинного кандидата Лен17/H6, родительских вирусов и пандемического вируса Лен/дт с подтверждением секвенированием амплифицированных фрагментов. Амплифицировали участки генов PB2 (1374-1614), NP (886 – 1036), M (408-505) и NS (729-840) вакцинного кандидата Лен17/H6, родительских вирусов и пандемического вируса Лен/дт и сравнили кривые плавления высокого разрешения. Амплифицированные участки секвенировали, и сиквенс нуклеотидных последовательностей анализировали множественным выравниванием. E40

Использованные праймеры (рис.5) к G A C AT G A C T C C A A G C A C A A G A G , PB2 (прямой 1423 oбратный 1 5 3 0 AAACCGGTCAATGCTCACCACTA) оказались только частично гомологичны, что указывает на то необходимость разработки новых праймеров для данного гена. Для остальных генов праймеры оказались гомологичными, это показано на результатах секвенирования (рис 5). Таким образом подтверждено, что реассортант Лен17/Н6 приобрел 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки от донора Лен/17. Поиск гомологичных последовательностей в GenBank, проведенный с помощью компьютерной программы BLAST (Morgulis et al. 2008), 1757-64, показал, что ген РВ1 вируса H6N1/дт наиболее близок гену вируса гриппа птиц A/утка/Цзянси/ 5945/2008 (H6N1) (GenBank, KP287703.1), а ген PА – гену вируса A/утка/Гуйчжоу / 2492/2007 (H6N1) (GenBank, CY109657.1) (99% гомологии). Сравнение последовательностей гена PB1 донора аттенуации Лен/17, реассортанта Лен17/H6 и вируса дикого типа H6N1/дт показало, что и донор аттенуации Лен/17 и реассортант Лен17/H6 отличаются от вируса дикого типа по положению 819 (Т вместо А), которое находится в специфическом сайте расщепления и позволяет различить данные гены с помощью традиционного рестрикционного анализа рис. 4. В то же время в гене РА в положении 107 присутствует нуклеотид С не только у реассортанта и донора аттенуации, но и у вируса H6N1/дт, а также у вируса гриппа птиц A/утка/Гуйчжоу/2492/2007 (H6N1). Поскольку указанный нуклеотид также входит в специфический сайт расщепления, то в данном случае определить происхождение генов с помощью традиционного рестрикционного анализа становится невозможным. Данные результаты подтверждают ограниченные возможности используемого ранее рестрикционного анализа при генотипировании вакцинных штаммов вирусов гриппа птиц и свидетельствуют о необходимости применения новых методов скрининга вакцинных кандидатов. 4.4. Подтверждение соответствия генотипа реассортантного вируса фенотипическим свойствам E41

4.4.1. Изучение репродукции в куриных эмбрионах (КЭ). При изучении репродукции вакцинного кандидата Лен17/H6 (глава методы 3.2.4) в куриных эмбрионах при различной температуре было показано, что данный вирус, так же как и донорский штамм Лен/17, проявляет свойства температурочувствительности и ХА, в отличие от штамма H6N1/дт. Показана разница титров вакцинного кандидата при оптимальной (33°C) и повышенной (39°C) температуре, которая составила 7,0 log ЭИД 10 /мл. 50 Отличие в показателях репродукции при пониженной и оптимальной температуре не превышало 3.0 log 10 ЭИД /мл табл. 2. 50 4.4.2. Изучение прививочных свойств реассортантного вируса на мышах 6 При интраназальном введении мышам (глава методы 3.2.5) в дозе 10 ЭИД титр вируса Лен17/H6 в легких животных был на 1,3 log 10 ЭИД 50 50 мл меньше по сравнению с родительским вирусом H6N1/дт, что соответствовало уровню репродукции в легких мышей ХА донорского штамма (Табл. 2). Таблица 2. Биологические свойства реассортантного вакцинного кандидата Лен17/ Н6 в сравнении с родительскими вирусами. Вирус Характеристика препарата Репродукция в куриных эмбрионах, log ЭИД /мл 10 50 Репродукция в дыхательных путях мышей на третьи сутки, log ЭИД / 10 50 мл, n=4 26°С 33° С 39°С Выделение вируса из легких Носовые ходы СГТ антит ел, n=7 Лен17/Н6 Вакцинный кандидат 6,5±0.8 9,3±0.3 2,3±0.3 2,8±0.8 3,3±0.5 17.4 Лен/17 Донор аттенуации 7.9±0.7 9.3±0.5 2.2±0.6 2.3±0.7 2,5±0.9 ≤10 Н6N1/дт Вирус дикого типа 1.5±0.0 6.7±0.1 7.2±0.4 4.1±0.3 2.8±0.9 16.8 E42

СГТ – среднегеометрический титр антител, n- число животных в группе В то же время вакцинный штамм Лен17/H6 хорошо репродуцировался в носовых ходах мышей, где температура существенно ниже, и вызывал системный иммунный ответ - СГТ 17.4, определяемый по уровню антигемагглютинирующих антител в сыворотках крови через 3 недели после однократного введения. Следует отметить, что среди других вакцинных кандидатов на основе апатогенных вирусов гриппа птиц штамм Лен17/Н6 характеризуется наиболее высокой иммуногенностью у мышей после однократного введения. Так, при изучении в экспериментах на модели мышей вирусы других потенциально пандемических подтипов иммуногенность была существенно ниже после однократной иммунизации вакцинными кандидатами Н5N2 (СГТ=6.6; p=0.047), Н7N3 (СГТ=8.7; p=0.047) и H9N2 (СГТ=5.0; p=0.0009) по сравнению с Лен 17/Н6. Таким образом, реассортантный вакцинный кандидат проявлял свойства температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации, то есть удовлетворял требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам, разрабатываемым для заключения в состав ЖГВ. Эти результаты полностью согласуются с результатами анализа генома реассортантного вакцинного кандидата. Глава 5. Выводы 1. Результаты анализа генома кандидата в вакцинные штаммы А/ 1 7 / серебристая чайка/Сарма/2006/887 (H6N1) (Лен17/Н6), полученные методом ПЦР в режиме реального времени с HRM-анализом, совпадают с р е зул ьт ат а м и , п ол у ч е н н ы м и к л а с с и ч е с к и м м е тод ом О Т - П Ц Р рестрикционного анализа. 2. Анализ нуклеотидных последовательностей выявил значительные различия в генах внутренних и неструктурных белков донора аттенуации А/ Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вируса птичьего гриппа А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006(H6N1). E43

3. Вновь разработанные праймеры для генов PB1, PA, NP, M, NS вируса гриппа А позволяют проводить анализ реассортантов подтипа А(H6N1) на основе донора аттенауции A/Ленинград/134/17/57(H2N2) методом HRM анализа.HRM-анализ позволяет обнаружить не только олигонуклеотидные, но и однонуклеотидные замещения в геноме вируса гриппа. 4. Данные генотипирования требованиям, предъявляемым реассортанта Лен17/Н6 соответствуют к вакцинным штаммам ЖГВ (ts-, ca-, att- фенотип). E44

Литература 1. Александрова Г. И., Климов А. И. (1994) Живая вакцина против гриппа, Изд-во «Наука», СПб, 151 с. 2. Пиневич А.В., Сироткин А.К., Гаврилова О.В., Потехин А.А. (2012). Вирусология. Изд-во: Санкт Петербургский Государственный Университет. 388c. 3. Филдс Б., Найп Д., Ченок Р., Ройзман Б., Мелкин Дж., Шоуп Р. (1989) Вирусология: в 3-х томах, т. 2: пер. с англ., М.: Мир, 496 с 4. Abolnik C, BisschopS, GerdesT, Olivier A, Horner R. Outbreaksofavian influenza H6N2 viruses in chickens arose by a reassortment of H6N8 and H9N2 ostrich viruses. VirusGenes 2007;34(January (1)). p.37–45. 5. Alonso-Caplen, F. V., Nemeroff, M. E., Qiu, Y. & Krug, R. M. Nucleocytoplasmic transport: the influenza virus NS1 protein regulates the transport of spliced NS2 mRNA and its precursor NS1 mRNA. GENES & DEVELOPMENT 1992. 6. p.255-267 6. ANN H. REID, THOMAS G. FANNING, JOHAN V. HULTIN, AND JEFFERY K. TAUBENBERGER: The origin and virulence of the 1918 “Spanish” influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, February 1999 Microbiology; p.1651-1656 7. Baker MG, Wilson N, Huang QS. Pandemic influenza A(H1N1)v in New Zealand: the experience from April to August 2009. Euro Surveill. 2009; 14(34). p.1–6. 8. Biswas S K, Nayak D P. Mutational analysis of the conserved motifs of influenza A virus polymerase basic protein 1. J Virol. 1994;68. p.1819–1826 9. Bright RA, Shay DK, Shu B, Cox NJ, Klimov AI Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005–2006 influenza season in the United States. JAMA 295. p. 891–894. 10. Catherine Gerdil, Aventis Pasteur S.A., The annual production cycle for influenza vaccinea France Vaccine 21 (2003) p.1776–1779 11. Cannell JJ, Zasloff M, Garland CF. On the epidemiology of influenza. Virol J 2008; p. 5-29. 12. Centers for Disease Control and Prevention. H1N1 flu (swine flu): resources for laboratories. Centers for Disease Control and Prevention Web site. http://www.cdc.gov/ h1n1flu/lab/. Accessed June 2, 2009. 13. ChenZ,WangW, ZhouH, SuguitanJrAL, ShambaughC,Kim. Generation of live attenuated novel influenza virus A/California/7/09 (H1N1) vaccines with high yield in embryonated chicken eggs. J Virol 2010;84(January (1)). p.44–51. 14. Chin PS, Hoffmann E, Webby R, Webster RG, Guan Y, Peiris M. Molecular evolution of H6 influenza viruses from poultry in Southeastern China: prevalence of H6N1 influenza viruses possessing seven A/Hong Kong/156/97 (H5N1)-like genes in poultry. J Virol 2002;76(January (2)). p.507–16 15. Curd E, Pollinger J, Toffelmier E, Smith T. Rapid influenza A detection and quantitation in birds using a one-step real-time reverse transcriptase PCR and High Resolution Melting. J virol methods 2011; 176(1), p.125-30. 16. Dai-Lun Shin, Bastian Hatesuer Silke Bergmann, Tatiana Nedelko, Klaus Schugharta Protection from Severe Influenza Virus Infections in Mice Carrying the Mx1 Influenza E45

Virus Resistance Gene Strongly Depends on Genetic Background , Journal of Virology October 2015 Volume 89, p. 9998 – 10009 17. DANIEL R. PEREZ AND RUBEN O. DONIS «Functional Analysis of PA Binding by Influenza A Virus PB1: Effects on Polymerase Activity and Viral Infectivity» JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2001, p. 8127–8136 18. Dauber B, Heins G, Wolff T. The influenza B virus nonstructural NS1 protein is essential for efficient viral growth and antagonizes beta interferon induction. J Virol 2004;78(Feb (4)) p.1865–72. 19. de la Luna, S., Fortes, P., Beloso, A. Ortin, J. Influenza virus NS1 protein enhances the rate of translation initiation of viral mRNAs. 1995. J Virol 69, p. 2427–2433. 20. Deng YM, Caldwell N, Hurt A, Shaw T, Kelso A. A comparison of pyrosequencing and neuraminidase inhibition assays for the detection of oseltamivir-resistant pandemic influenza A(H1N1) 2009 viruses. Antiviral Res 90. p.87–91. 21. Deyde VM, Okomo-Adhiambo M, Sheu TG, Wallis TR, Fry A. (2009) Pyrosequencing as a tool to detect molecular markers of resistance to neuraminidase inhibitors in seasonal influenza A viruses. Antiviral Res 81 p.16–24. 22. Duwe S, Schweiger. A new and rapid genotypic assay for the detection of neuraminidase inhibitor resistant influenza A viruses of subtype H1N1, H3N2, and H5N1. 2008, J Virol Methods 153. p.134–141 23. Eischeid AC. SYTO dyes and EvaGreen outperform SYBR Green in real-time PCR. BMC research notes 2011; 4(1) p.263. 24. Ellis, J. S., D. M. Fleming, and M. C. Zambon. 1997. Multiplex reverse transcriptionPCR for surveillance of Influenza A and B viruses in England and Wales in 1995 and 1996. J. Clin. Microbiol. 35. p.2076–2082. 25. Erich Hoffmann, Gabriele Neumann, Yoshihiro Kawaoka, Gerd Hobom, and Robert G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids PNAS May 23, 2000 vol. 97 no. 11 p.6108–6113 26. Fauci AS. 2006. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. J Infect Dis 194(Suppl 2). p.73–S76 27. Garaigorta, U. & Ortin, J. (2007). Mutation analysis of a recombinant NS replicon shows that influenza virus NS1 protein blocks the splicing and nucleo-cytoplasmic transport of its own viral mRNA. Nucleic Acids Res 35 p.4573–4582. 28. Garcia-Sastre A. Inhibition of interferon-mediated antiviral responses by influenza A viruses and other negative-strand RNA viruses. Virology 2001;279(Jan (2). p.375–84. 29. Garten RJ, Davis CT, Russell CA. Antigenic and genetic characteristics of swine- origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science 2009; 325.p. 197–201 30. James R. Gill; Zong-Mei Sheng, Susan F. Ely, Donald G. Guinee Jr, Mary B. Beasley, James Suh, Charuhas Deshpande,Daniel J. Mollura, David M. Morens, Mike Bray, William D. Travis, Jeffery K. Taubenberger, “Pulmonary Pathologic Findings of Fatal 2009 Pandemic Influenza A/H1N1 Viral Infections “Arch Pathol Lab Med—Vol 134, February 2010 p 235 – 243 E46

31. Jeffery K. Taubenberger, and John C. Kash “Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation” Cell Host & Microbe 7, June 17, 2010 . p.440-451 32. Halperin SA, Smith B, Clarke K, Treanor J, Mabrouk T, Germain M. Randomized, controlled trial to study the reactogenicity and immunogenicity of a nasal, inactivated trivalent influenza virus vaccine in healthy adults. Hum Vaccin 2005; (January–February (1)). p.37–42. 33. Hampson AW, Cox NJ. Global surveillance for pandemic influenza: are we prepared? In: Brown LE, Hampson AW, Webster RG, editors. Options for control of influenza, Part III. Amsterdam: Elsevier; 1996, p. 50–9. 34. Hatta M, Kawaoka Y. The NB protein of influenza B virus is not necessary for virus replication in vitro. JVirol 2003;77(May (10). p.6050 35. HoffmannE, StechJ, LenevaI, KraussS, ScholtissekC,ChinPS.Characterization of the influenza A virus gene pool in avian species in southern China: was H6N1 a derivative or a precursor of H5N1 J Virol 2000;74(July (14)). p.6309–6315 36. Kawsar R. Talaat, Ruth A. Karron, Catherine J. Luke, Bhagvanji Thumar, Bridget A. McMahon, Grace L. Chen, Elaine W. Lamirande, Hong Jin, Kathy L. Coelingh, George Kemble, Kanta Subbarao An open label Phase I trial of a live attenuated H6N1 influenza virus vaccine in healthy adults Vaccine 29 (2011) p.3144–3148 37. Kelly HA, Grant KA, Williams S, Fielding J, Smith D. Epidemiological characteristics of pandemic influenza H1N1 2009 and seasonal influenza infection. Med J Aust. 2009;191(3). p.146–149. 38. Kobayashi M, Toyoda T, Ishihama A. Influenza virus PB1 protein is the minimal and essential subunit of RNA polymerase. Arch Virol. 1996;141. p.525–539. 39. Kochs G, Garcia-Sastre A, Martinez-Sobrido L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J Virol 2007;81(Jul (13)).p. 7011–7021. 40. Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods. 1995. Vol.52. №1-2. P.41-49 41. Krafft AE, Duncan BW, Bijwaard KE, Taubenberger JK, Lichy JH. Optimization of the isolation and amplification of RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: the Armed Forces Institute of Pathology experience and literature review. Mol Diagn. 1997;2(3). p.217–230. 42. Krafft AE, Russell KL, Hawksworth AW, et al. Evaluation of PCR testing of ethanolfixed nasal swab specimens as an augmented surveillance strategy for influenza virus and adenovirus identification. J Clin Microbiol. 2005;43(4) p. 1768– 1775. 43. Lackenby A, Democratis J, Siqueira MM, Zambon MC (2008) Rapid quantitation of neuraminidase inhibitor drug resistance in influenza virus quasispecies. AntivirTher 13: p. 809–820. 44. Lamb RA, Lai CJ, Choppin PW. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for over- lapping proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1981;78(Jul (7)). p.4170–4174. 45. LaForce FM, Nichol KL, Cox NJ: Influenza: Virology, epidemiology, disease, and prevention. Am J Prev Med 1994; 10(Suppl) p.31–44 46. Lazarus, P., and S. Caruana. 1996. Typing of common human papilloma virus strains by multiplex PCR. Anal. Biochem. 243. p.198–201. E47

47. Lin JH, Tseng CP, Chen YJ, Lin CY, Chang SS, Wu HS, Cheng JC. Rapid differentiation of influenza A virus subtypes and genetic screening for virus variants by high-resolution melting analysis. J clin microbiol 2008; 46(3) p.1090-1097. 48. Liew M, Pryor R, Palais R, Meadows C, Erali M, Lyon E, Wittwer C. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin chem 2004; 50(7) p. 1156-1164. 49. Michael Liew, Robert Pryor, Robert Palais, Cindy Meadows, Maria Erali, Elaine Lyon, and Carl WittwerGenotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms by High-Resolution Melting of Small Amplicons Clinical Chemistry (2004) 50:7 p.1156–1164 50. Monto AS: Epidemiology of influenza. Vaccine 2008; 26(Suppl 4):D45–D48 ) Vaccine 2005; 23. p. 5133–5143 51. Morgulis A, Coulouris G, Raytselis Y, Madden TL, Agarwala R, Schäffer AA. Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinform 2008; 24(16). p.1757-64. 52. Muller R, Poch O, Delarue M, Bishop D H, Bouloy M. Rift Valley fever virus L segment: correction of the sequence and possible functional role of newly identified regions conserved in RNA-dependent polymerases. J Gen Virol. 1994;75. p.1345–1352. 53. Murti K G, Webster R G, Jones I M. Localization of RNA polymerases on influenza virala ribonucleoproteins by immune gold labeling. Virology. 1988;164 p.562–566. 54. Medcalf L, Poole E, Elton D, Digard P, Medcalf L, Poole E, Elton D, Digard P. Temperature-sensitive lesions in two influenza A viruses defective for replicative transcription disrupt RNA binding by the nucleoprotein. JVirol. 1999;73. p.7349–7356. 55. McMichael A.J., Gotch F.M., Dongworth D.W., Clark A., Potter C.W. Declining T-cell immunity to influenza, 1977–1982. Lancet. 1983;2 p.762–764. 56. Nicole M. Bouvier, Peter Palesea THE BIOLOGY OF INFLUENZA VIRUSES Vaccine 26S (2008). p.49–53 57. Nguyen-Van-Tam JS, Hampson AW: The epidemiology and clinical impact of pandemic influenza. Vaccine 2003; 21.p.1762–1768 58. Philippe R. S. Lagace ́-Wiens, MD, DTM&H, FRCPC; Ethan Rubinstein, LLB; Abba Gumel, Influenza epidemiology—past, present, and future Crit Care Med 2010 Vol. 38, No. 4 (Suppl.) p1 – 9 59. ReedLJ, MuenchH. Asimple method ofestimatingfifty percent endpoints. Am J Epidemiol 1938; 27(3).p. 493-7. 60. Read, S. J., K. J. M. Jeffery, and C. R. M. Bangham. 1997. Aseptic meningitis and encephalitis: the role of PCR in the diagnostic laboratory. J. Clin. Mi- crobiol. 35. p.691– 696. 61. Runstadler JA, Happ GM, Slemons RD. Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005. Arch Virol. 2007;152(10). p.1901–1910 62. RoweT,AbernathyRA,Hu-PrimmerJ,ThompsonWW, LuX, LimW, FukudaK, CoxNJ, KatzJM. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J clin microbiol. 1999; 37(4).p. 937-943. 63. Samdal HH, Bakke H, Oftung F, Holst J, Haugen IL, Korsvold GE, et al. A non-living E48

nasal influenza vaccine can induce major humoral and cellular immune responses in humans without the need for adjuvants. Hum Vaccin 2005;1(March–April (2). p.85–90. 64. Saranya Sridhar, Karl A. Brokstad, and Rebecca J. Cox Sarah Gilbert, Comparing Inactivated and Live Attenuated Influenza VaccinesVaccines (Basel). 2015 Jun; 3(2). p 373–389. 65. Stephenson I, Zambon M: The epidemiology of influenza. OccupMed (Lond) 2002; 52. p 241–247 66. Susana de Lucas, Joan Peredo, Rosa María Marión, Carmen Sánchez, and Juan Ortín Human Staufen1 Protein Interacts with Influenza Virus Ribonucleoproteins and Is Required for Efficient Virus Multiplication J Virol. 2010 Aug; 84 p.15. 67. SCHWEIGER. B., I. ZADOW, R. HECKLER, H. TIMM, AND G. PAULI Application of a Fluorogenic PCR Assay for Typing and Subtyping of Influenza Viruses in Respiratory Samples JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 2000, p. 1552–1558 68. Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG. Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucl Acid Res 2012; 40(15), p.115 69. Vaillant L, La Ruche G, Tarantola A, Barboza P. Epidemiology of fatal cases associated with pandemic H1N1 influenza 2009. Euro Surveill. 2009; 14(33). p.1–6. 70. Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, Vandersteen JG, Pryor RJ High resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen, Clin Chem 2003; 49. p. 853-860. 71. Woolcock PR, Suarez DL, Kuney D. Low-pathogenicity avian influenza virus (H6N2) in chickens in California, 2000–02. Avian Dis 2003;47(3 Suppl). p.872–81 72. Yi Sun, Raghuram Dhumpa, Dang Duong Bang, Jonas Høgberg, Kurt Handbergc and Anders Wolff A lab-on-a-chip device for rapid identification of avian influenza viral RNA by solid-phase PCR This journal is a The Royal Society of Chemistry 2011 ,11, p. 1457– 1463 73. Zheng Wang, Luke T. Daum, Gary J. Vora, David Metzgar, Elizabeth A. Walter,¶ Linda C. Canas, Anthony P. Malanoski, Baochuan Lin, and David A. Stenger Identifying Influenza Viruses with Resequencing Microarrays Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 12, No. 4, April 2006, p.638-636. E49

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв