Характеристика культивируемых штаммов цианобактерий озера Степпед (Антарктида)

Краснова Анастасия Дмитриевна

Характеристика культивируемых штаммов цианобактерий озера Степпед (Антарктида)

В работе проведена оценка разнообразия культивируемых представителей филы Cyanobacteria в антарктическом озере Степпед, расположенном между полярными станциями Прогресс 2 и Zhongshan. Получение накопительных культур из проб, отобранных из разных участков, проводилось при комнатной (22-24 оС) и пониженной (10-12 оС) температурах. В результате была сформирована коллекция из 19 штаммов одноклеточных и трихомных цианобактерий, относящихся к субсекции I (пор. Chroococcales) и субсекции III (пор. Oscillatoriales) соответственно. Идентификацию штаммов коллекции до рода проводили на основе анализа морфологических и молекулярно-генетических признаков, также была проведена оценка пигментного состава штаммов. По совокупности проанализированных признаков культивируемые цианобактерии озера Степпед были идентифицированы как Leptolyngbya spp. (10 штаммов), Pseudanabaena spp. (4 штамма) и Cyanobium spp. (5 штаммов). Представители p. Pseudanabaena выделялись только при пониженной температуре культивирования. Проверка зависимости роста Pseudanabaena spр. CALU 1785 и CALU 1787 от температуры свидетельствует о психрофильности данных штаммов.

Биология

Дипломы

Вуз: Санкт-Петербургский государственный университет (СПбГУ)

ID: 587d36305f1be77c40d588e4

UUID: b7306cc7-a99b-4ca5-ba68-6d366ec96a18

Язык: Русский

Опубликовано: больше 7 лет назад

Просмотры: 64

Краснова Анастасия Дмитриевна

Источник: Санкт-Петербургский государственный университет

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 1884906 bytes

Поделиться работой

Санкт-Петербургский Государственный университет Краснова Анастасия Дмитриевна Характеристика культивируемых штаммов цианобактерий озера Степпед (Антарктика) Выпускная квалификационная работа бакалавра Работа выполнена на кафедре микробиологии Научный руководитель: доцент, к.б.н., Аверина Светлана Геннадиевна Санкт-Петербург 2016

Содержание 1. Введение.....................................................................................................................................3 2. Обзор литературы....................................................................................................................4 2.1. Общая характеристика цианобактерий.............................................................................4 2.2. Цианобактерии Антарктики...............................................................................................5 2.2.1. Антарктика как экосистема............................................................................................. 5 2.2.2. Стрессовые факторы, влияющие на цианобактерий Антарктики и способы адаптации к ним......................................................................................................................... 6 2.2.3. Биоразнообразие цианобактерий в пресных водоемах Антарктики.........................10 3. Материал и методы исследования......................................................................................16 3.1. Выделение и культивирование штаммов цианобактерий из озера Степпед (Антарктика).............................................................................................................................16 3.2. Методы изучения морфологии и пигментного состава клеток цианобактерий..........18 3.3. Методы молекулярно-генетического анализа................................................................ 18 4. Результаты и обсуждение..................................................................................................... 22 4.1. Морфологические и культуральные признаки выделенных штаммов........................22 4.2. Пигментный состав культивируемых штаммов............................................................. 29 4.3. Результаты молекулярно-филогенетического анализа штаммов коллекции...............35 Выводы........................................................................................................................................ 43 Список литературы................................................................................................................... 44 Приложение..................................................................................................................................51 2

1. Введение В последнее время активно ведется изучение биологического разнообразия экстремальных экологических ниш. Еще в XX веке началось исследование полярных областей – Арктики и Антарктики – как местообитаний, характеризующихся пониженными температурами. Особое внимание уделяется изучению первичных продуцентов-фототрофов, в частности, цианобактерий, являющихся в настоящий момент объектами исследования как микробиологов, так и ботаников-альгологов. Разнообразие цианобактерий полярных областей достаточно велико. С расширением базы знаний о различных нишах, стало возможным создание гипотез об ожидаемом разнообразии в конкретном экотопе. Ка к и з в е с т н о , cовременная систематика цианобактерий основывается на полифазном генотипическом и фенотипическом анализе разнообразия популяций и штаммов. Однако, базой для последующих таксономических, экофизиологических и биохимических исследований должен быть полный морфологический анализ. Использование комбинированных методов может изменить наш взгляд на цианобактериальную флору Антарктики в будущем (Elster, Komarek, 2008). Таким образом, целью данной работы стало описание культивируемых штаммов цианобактерий, выделенных из фрагментов биопленок, собранных в разных участках озера Степпед, и оценка их биоразнообразия. Были поставлены следующие задачи: 1. Выделение чистых культур цианобактерий и формирование рабочей коллекции штаммов; 2. Исследование морфологии и пигментного состава выделенных штаммов; 3. Ф и л о г е н е т и ч е с к и й а н а л и з ш т а м м о в ко л л е к ц и и н а о с н о в е последовательности гена 16S рРНК; 4. Идентификация штаммов коллекции на основе полученных фенотипических и генотипических характеристик; 5. Изучение зависимости роста отдельных штаммов коллекции от температуры. 3

2. Обзор литературы 2.1. Общая характеристика цианобактерий Фила BX Cyanobacteria объединяет всех оксигенных фототрофных прокариот в единую таксономическую и филогенетическую группу. Их общей чертой является наличие двух фотосистем – первого и второго типа (ФСI и ФСII), а также возможность использовать H2O в качестве донора электронов в процессе фотосинтеза. И хотя некоторые представители филы Cyanobacteria способны к факультативному переходу к фото- и хемогетеротрофии, все они являются фотоавтотрофами (используют СО 2 в качестве основного источника углерода) (Castenholz, 2001). Однако не так давно была описана группа Melainabacteria, предположительно входящая в филу Cyanobacteria (Soo et. al., 2015), но не способная к фотосинтезу за счет утраты фотосинтетического аппарата, и осуществляющая метаболизм за счет брожения (Di Rienzi et al., 2013). На данный момент Melainabacteria входит в группу Melainabacteria/Cyanobacteria. Все цианобактерии имеют грамотрицательный морфотип, однако слой пептидогликана у них толще, чем у представителей Proteobacteria. Также цианобактерии всегда (за исключением р. Gloeobacter) содержат внутриклеточные мембраны, на которых локализован фотосинтетический аппарат. Размеры клеток различны и варьируют от 0,5 мкм до >100 мкм в диаметре. Встречаются одноклеточные и трихомные представители, форма клеток также варьирует. Для некоторых родов нитчатых цианобактерий показана способность образовывать гормогонии (миниатюрные трихомы, предназначенные для расселения), акинеты (дифференцированные клетки, способные переживать различные физико-химичекие воздействия), гетероцисты (дифференцированные клетки, способные ассимилировать N2) (Пиневич, 2006). Несмотря на «обязательность» оксигенной фототрофии, метаболизм цианобактерий крайне разнообразен. Они способны расти в темноте за счет темнового аэробного дыхания, а также использовать запасные гликозиды для гликолиза или серного дыхания. Для многих представителей также отмечена способность к диазотрофии (Пиневич, 2006). В отношении температуры большинство цианобактерий относятся к мезофилам (с оптимумом при температуре выше 20 оС), реже встречаются термофилы (растут в горячих источниках с температурой до 75 оС), а также психрофилы (с оптимумом при 4-15 оС, растущие при температуре около 0оС в пресных субполярных водоемах) (Пиневич, 2006). Цианобактерии часто являются доминирующими живыми организмами в различных экологических нишах. Многие представители этой филы проявляют устойчивость к широкому спектру условий окружающей среды, включая экстремальные, 4

что не способны выдержать эукариотические микроорганизмы. Способность выдерживать низкие и высокие температуры часто определяет доминирующую роль цианобактерий в различных местах обитания. Они могут расти как в горячих источниках ( Singh, Elster, 2007), на поверхностях скал или раскаленных почвах пустынь (Garcia-Pichel, Belnap, 1996), так и в замерзающих полярных пресноводных прудах, где не могут выживать большинство фототрофов (Vincent, 1988; Tang et al., 1997). В Антарктике часто встречаются бентосные и наземные микробные маты, состоящие в основном из цианобактерий. Их преобладание может быть объяснено устойчивостью к чередованию замораживания и оттаивания (Castenholz, 2001). 2.2. Цианобактерии Антарктики 2.2.1. Антарктика как экосистема Антартика представляет собой одну из самых сухих и холодных экосистем на Земле. Однако в ходе недавних исследований на Южном полюсе были обнаружены микроорганизмы (Singh, Elster, 2007). Большинство этих микроорганизмов являются прокариотами. Среди них одними из наиболее важных участников сообщества являются фотосинтезирующие бактерии – цианобактерии (Vincent, 1988; Gordon et al., 2000; Brambilla et al., 2001). Они обеспечивают экосистему большим количеством связанного углерода путем фотосинтеза (Vincent, 1988), а также азотом, так как обладают уникальной способностью фиксировать атмосферный азот. Бонилла с соавторами (2005) также показала, что микробные маты как место обитания позволяют микроорганизмам расти в условиях, богатых питательными веществами, несмотря на низкие их уровни в окружающей воде. Одно из первых исследований роста цианобактерий в криосфере провел Адольф Эрик Норденскёльд. Во время его экспедиции в Гренландию в 1870 году были найдены тёмные обрастания, которые он назвал «криокониты» (Leslie, 1879). При ближайшем рассмотрении он обнаружил, что собранный материал состоит не только из неорганических отложений, но также и темно-окрашенных цианобактерий, сейчас известных как Calothrix parietina (Gerdel, Drouet, 1960). Норденскёльд сделал заключение, что из-за такой окраски цианобактерии улавливают больше света и ускоряют таяние льда, делая доступной жидкую воду. Наличие или отсутствие воды, прямо или косвенно, определяет свойства экосистемы Антарктики, а также стадию развития цианобактерий и, следовательно, степень развития экосистем. На основании степени доступности воды была предложена следующая классификация полярных мест обитания (Elster, 2002). 5

Были выделены три категории: водная (озерная), водно-наземная (болотная), и наземная (Elster, 2002). Озеро стабильно во времени и имеет особый лимнологический характер, однако состав цианобактерий озерных бентосных сообществ часто перекрывается с биоразнообразием водно-наземных сообществ. Главное различие между болотом и озером в экосистеме Антарктики заключается в том, что болото промерзает зимой, в то время как озеро – нет (Hawes et al., 1992). В водно-наземной среде жидкая вода доступна в течение лета. В наземных условиях вода доступна в жидкой форме только в течение короткого периода (например, таяние снега, дождь или снегопад), или только в виде пара в воздухе (Singh, Elster, 2007). Озерные бентосные виды цианобактерий растут в условиях постоянного доступа жидкой воды и наименее подвержены воздействию стрессовых факторов. В то же время, виды цианобактерий, которые населяют тающие пруды и ручьи, подвержены широкому спектру экологических стрессов: циклы замораживания/оттаивания, высокая радиация и другие (Singh, Elster, 2007). 2.2.2. Стрессовые факторы, влияющие на цианобактерий Антарктики и способы адаптации к ним Цианобактерии Антарктики часто находятся внутри льда, что заставляет их использовать широкий спектр стратегий, чтобы смягчить воздействие окружения ( Vincent, 2007). В Антарктике цианобактерии адаптированы и приспособлены к окружающей среде в отношении температуры, циклов замораживания/оттаивания, а также аккумуляции света для фотосинтеза (Vincent et al., 1993; Tang et al., 1997; Nadeau et al., 1999; Tang, Vincent, 1999; Nadeau, Castenholz, 2000). Низкая температура Хотя цианобактерии играют крайне важную роль в динамике экосистемы Антарктики, лишь некоторые из них относятся к настоящим психрофилам (Tang et. al., 1997; Fritsen, Priscu, 1998). В основном они классифицируются как психротолерантные, или психротрофные, ввиду их способности к метаболизму при 0ºC, однако их температура оптимума для роста, как правило, выше 15°С. Цианобактерии имеют множество механизмов, позволяющих им сохранять жизнеспособность и рост (правда, зачастую очень медленный) в условиях низких температур и чередования замораживания/оттаивания (Vincent, 2007). К примеру, в их 6

мембране в большом количестве содержатся полиненасыщенные жирные кислоты, позволяющие сохранять текучесть мембраны при низких температурах (Welsh, 2000). Адаптация к низким температурам включает запуск экспрессии некоторых генов, продукты которых позволяют сохранять жизнеспособность клетки. К ним относятся:  Десатуразы жирных кислот, обеспечивающие гомеовязкостную адаптацию мембран;  РНК-связывающие белки, действующие как РНК-шапероны и помогающие поддерживать трансляцию в условиях холодового стресса;  РНК-геликазы, способные устранять вторичные структуры РНК, образующиеся при понижении температуры;  белки семейства Clp, участвующие в фолдинге и процессинге белков (Los, Murata, 1999). Циклы замораживания/оттаивания Помимо экстремально низких температур, цианобактерии криосферы должны справляться с последствиями замерзания и образования льда. Фазовый переход жидкой воды в состояние льда создает большую проблему для цианобактерий. Если кристаллы льда формируются внутри клеток, это может привести к механическим повреждениям мембраны и нарушениям целостности клетки (Vincent, 2007). Цианобактерии полярных экосистем имеют множество стратегий для уменьшения вреда от осмотического шока и физических повреждений. Основным механизмом защиты является синтез экзополисахаридов, предотвращающий потерю воды и образование кристаллов льда вне клетки (Wynn-Williams, 2000; Vincent, 2007). М н о г и е м ат - о б р а з у ю щ и е в и д ы с п о с о б н ы а к т и в н о с и н т е з и р о в ат ь мукополисахариды. Они делают окружающую клетку жидкость более вязкой и способствуют формированию кристаллов льда за пределами клетки. Эксперименты на Nostoc commune показали, что мукополисахариды необходимы для выживания во время высушивания и замораживания (Tamaru et al., 2005). Как и другие микроорганизмы, цианобактерии криосферы могут синтезировать некоторые макромолекулярные соединения, модифицирующие растущие кристаллы льда, играя роль криопротекторов (Raymond, Fritsen, 2000). К примеру, это лёд-связывающий белок – IBP, описанный у эукариотических фототрофов Melosira и Chlamydomonas (Raymond, 2011), а также у бактерии Colwellia (Raymond, 2007). На микроорганизмах, выделенных из морского льда (Raymond, Knight, 2003; Raymond et al., 2007), ледников (Raymond et al., 2008), полярных озер (Raymond, Fritsen, 2000, 2001) и замерзшей почвы 7

(Walker et al., 2006) была показана повышенная устойчивость к замораживанию и оттаиванию в присутствии IBP. Данный белок способен предотвращать рост больших кристаллов льда и рекристаллизацию (Raymond et al., 2007). Помимо этого, психротрофные бактерии способы синтезировать ряд других белков, взаимодействующих со льдом, включая лед-образующие белки (INPs) (Gurian-Sherman, Lindow 1993; Kawahara, 2002) и антифризовые белки (AFPs), понижающие точку замерзания (Raymond et al., 2007). Многие полярные местообитания, такие как, например, мелководные пруды или ручьи, промерзают каждый год. В результате этого процесса, растворенные вещества, выходящие из растущего льда, являются причиной осмотического стресса микроорганизмов (Quesada, Vincent, 2012). Такое часто происходит в полярных озерах и прудах, где бентосные бактериальные маты находятся в относительно пресной воде поздним летом, в том время как зимой, при понижении температуры воды до -12 оС, соленость увеличивается в пять раз (Schmidt et al., 1991). Цианобактерии способны синтезировать осмолитики, снижающие осмотическое давление, возникающее при замораживании. Эта стратегия помогает избежать потери клеткой воды (Welsh, 2000). Помимо этого, некоторые растворимые вещества предохраняют белки от денатурации и деактивации, как, например, глицин-бетаин предотвращает диссоциацию комплекса фотосистемы II (Papageorgiou, Murata, 1995). Было отмечено (Tang et al., 1997; Vincent et al., 1997; Vincent, 2000, Sabacká, Elster, 2006), что полярный цикл замораживания-оттаивания не имеет каких-либо серьезных неблагоприятных воздействий на антарктических цианобактерий в течение длительного времени. Скорее всего, замораживание может быть параметром, позволяющим цианобактериям быть доминирующими фотосинтезирующими микроорганизмами в антарктической наземной экосистеме, где преобладает низкая освещенность и/или полная темнота. Освещенность Цианобактериальные сообщества полярных регионов подвержены значительным изменениям в доступности света: от полной темноты зимой до непрерывного освещения летом, в сочетании с длительными периодами замораживания и коротким сезоном роста. Низкая освещенность Чистый лед способен практически свободно пропускать свет, необходимый для фотосинтеза. Однако пузыри, различные частицы или снежный покров могут отражать и 8

рассеивать этот свет, результатом чего является серьезное уменьшение количества поступающей энергии (Belzile et al., 2001). Периоды длительной темноты, в свою очередь, больше ограничивают жизнедеятельность цианобактерий, чем замораживание. Продолжительное дыхание и трата энергии на основной метаболизм, поддержание исправности и репарацию клеточных систем быстро приводит к исчерпанию резервов клетки (Quesada, Vincent, 2012). Цианобактерии имеют в составе фотосинтетического аппарата фикобилисомы п и г м е н т и р о в а н н ы е б е л ко в ы е ком п л е кс ы , с од е р ж а щ и е м н о гоч и с л е н н ы е фикобилипротеины. Фикобилисомы позволяют эффективно улавливать свет в диапазоне 500-650 нм под толщей воды, внутри биопленок или подо льдом. Хьюс и Шварц (1999) обнаружили, что бактериальные маты на дне антарктических озер, покрытых льдом, окрашены в розовый цвет из-за высокого уровня красного хромопротеина - фикоэритрина. Фикобилисомы – это динамичные системы, способные горизонтально мигрировать в фотосинтетических мембранах цианобактерий (Joshua et al., 2005). Взаимодействие фикобилисом и реакционных центров фотосинтетического аппарата приводит к распространению энергии возбуждения и влияет на степень передачи энергии между фотосистемами I и II. Было показано, что у цианобактерий данный процесс является физиологическим ответом на условия низкой освещенности (Mullineaux, Emlyn-Jones, 2005). В то время как светопротекторные пигменты часто расположены на поверхностных слоях цианобактериальных матов (Bonilla et al., 2005), базальные слои богаты фикоцианином, с чем связано сине-зеленое окрашивание (Quesada et al., 1999). Высокая освещенность Летом, когда лед отсутствует, фитопланктон и бентосные маты могут подвергаться воздействию высоких уровней радиации, в том числе УФ-излучения (Roos, Vincent, 1998). Поэтому сообщества нуждаются в широком наборе стратегий, включающих эффективную фотозащиту. На поверхности биопленок клетки получают полный спектр солнечного излучения в высоких дозах, однако в нижних слоях матов абсорбция некоторой части спектра ослабляется. На глубине 2 мм клетки поглощают лишь 5% от общего излучения. Дело в том, что на поверхности сосредоточено большое количество фотопротекторных пигментов, что позволяет клеткам, находящимся на глубине, расти в более мягких условиях, свободных от ультрафиолетового излучения (Quesada et al., 1999; Tanabe et al., 2010). Сюда относятся такие пигменты, как глеокапсин и сцитонемин, а также микоспорин-подобные аминокислоты (Vincent, 2007). Сцитонемин синтезируется на 9

ярком свету и поглощает ультрафиолетовое излучение в диапазоне 325–425 нм. Он имеет свойство накапливаться в полисахаридных чехлах за пределами клетки, защищая цианобактерии от радиации (Proteau et al., 1993; Stal, 2000). На колониях Nostoc было показано, что такие пигменты в больших концентрациях окрашивают биопленки в черный цвет (Vincent, Quesada, 1993). Одними из наиболее разрушительных последствий воздействия высоких доз солнечного света является образование активных форм кислорода, таких как синглетный кислород, супероксид анион и перекись водорода. Цианобактерии обладают широким набором ферментов и пигментов, участвующих в гашении таких высокотоксичных соединений, включая супероксиддисмутазу и каротиноиды (Vincent, Quesada, 1993; Hirschberg, Chamovitz, 1994). Последнее особенно заметно на цианобактериальных матах мелководных и хорошо освещенных местностей, часто окрашенных в оранжевый или розовый цвета из-за высокой концентрации каротиноидов (Vincent, 2007). Лабораторные эксперименты показали, что у антарктических «Oscillatoria» концентрация каротиноидов возрастает вместе с увеличением дозы ультрафиолета и видимого света, а также с понижением температуры (Roos, Vincent, 1998). Ультрафиолет и высокие дозы видимого света могут ингибировать фотосинтез, а также способствовать деградации фикобилипротеинов, хлорофилла и разрушению ДНК (Vincent, 2007). Цианобактерии обладают широким спектром механизмов репарации ДНК при воздействии ультрафиолета, такими как эксцизионная репарация и фото-реактивация. Однако низкая температура затормаживает эти процессы. В связи с этим, во избежание лишней освещенности многие антарктические цианобактерии склонны мигрировать в более глубокие слои микробных матов (Castenholz, Garcia-Pichel, 2000). 2.2.3. Биоразнообразие цианобактерий в пресных водоемах Антарктики За последние десятилетия были достигнуты большие успехи в анализе биоразнообразия, структуры и функционирования микробных сообществ полярных озер, прудов и рек. Сейчас уже хорошо известно, что цианобактерии являются главным и часто доминирующим компонентом полярных водных экосистем, при этом было отмечено явное сходство между сообществами Арктики и Антарктики (Vincent, Quesada, 2012). Северный и Южный полярные регионы представляют собой идеальные области для исследования микробного эндемизма в виду того, что имеют схожие условия, разделенные, однако, протяженным расстоянием, что создает потенциальный барьер для смешения (Staley, Gosink, 1999). 10

С точки зрения экологии, водные цианобактерии подразделяются на три функциональные группы: пикоцианобактерии, цианобактерии, вызывающие цветение и мат-образующие (Vincent, 2009). Первая группа, пикоцианобактерии, широко распространена в олиготрофных пресных водоемах, характерных для полярных регионов, а в некоторых местах эти мельчайшие фототрофы достигают очень высоких концентраций. Большие значения соотношения поверхности к объему помогают им выживать при низких концентрациях питательных веществ (Vincent, Quesada, 2012). Одноклеточные цианобактерии родов Synechococcus и Synechocystis были выделены среди планктона озер Сухих Долин МакМёрдо (Антарктика) в ходе первого исследования их биолого-лимнологических характеристик (Goldman et al., 1967). Также было отмечено, что концентрация пикоцианобактерий возрастает в глубоких, богатых фосфором водоемах (Veillette et al., 2011). Осциллаториевые цианобактерии часто являются доминирующим компонентом фитопланктона полярных озер (Vincent, 2000). К примеру, они были найдены в пяти из шести исследованных Шиаффино с соавторами (Schiafﬁno et al., 2009) озерах морской части Антарктики. Часто осциллаториевые представлены крайне тонкими трихомами (около 1 мкм в диаметре), что позволяет им улавливать свет так же эффективно, как это делают мелкие коккоидные клетки Synechococcus (Vincent, 2000). В то же время, некоторые из этих популяций могут быть результатом поднятия со дна бактериальных пленок, что часто происходит в реках и литоральной зоне озер (Vincent, Quesada, 2012). Цианобактерии, образующие цветения, например, Anabaena, Microcystis и Aphanizomenon отсутствуют в большинстве полярных водных экосистем. Результаты Шиндлера (Schindler, 1974) и Калфа с соавтоврами (Kalff et al.,1975) показали, что это объясняется не только низким содержанием питательных веществ в большинстве водоемов, но и другими факторами, как, например, низкими температурами. Некоторые цианобактерии, образующие цветение, способны расти при низких температурах, по крайней мере в культуре (к примеру, Aphanizomenon ﬂos-aquae, Mehnert et al., 2010). Однако в умеренных широтах цветение происходит при температуре воды более 15 оС, так как цианобактерии рассматриваемой группы имеют высокотемпературный оптимум роста (Vincent, Quesada, 2012). Тем не менее, они найдены в субантарктических водоемах, и их число может возрастать в виду глобального изменения климата (Quayle et al., 2002). В долгосрочной перспективе полярные озера могут стать более благоприятным местообитанием для цианобактерий, образующ и х цветение, в результате повышения температуры воды и уровня питательных веществ. Естественно богатые озера, расположенные близко к морю, образуют цианобактериальное цветение (Anabaena, 11

Oscillatoria). Это указывает на перспективу развития таких сообществ в полярных водоемах, однако регуляторные механизмы пока не выяснены (Vincent, Quesada, 2012). Мат-образующие виды цианобактерий наиболее успешны в полярных озерах. Образуемые ими сообщества могут достигать огромных размеров, хотя представлены в основном матами и пленками миллиметровой толщины (Vincent, 2000; Singh, Elster, 2007; Nakai et al., 2012). Донные маты в водоемах представляют собой плотно сцепленные, кожистые слизистые структуры различных цветов и состоят из представителей субсекций «Oscillatoriales», «Nostocales» и «Chroococcales» (Howard-Williams et al., 1989; Taton et al., 2003, 2006; Jungblut et al., 2005). Структура микробных матов определяется доминантными видами, субстратом, на котором располагается сообщество, и факторами окружающей среды (Stal, 2000; Stolz, 2000). Трихомные Oscillatoiales, способные синтезировать внеклеточный матрикс, часто являются структурной основой матов и составляют большую часть биомассы (Vincent, 2000). Их способность к скольжению в сочетании с обильной экскрецией экзополисахаридов чехла дает возможность этим микроорганизмам распространяться по различным субстратам (Golubic et al., 2000). Существует разнообразие в видовом составе бентосных матов. Некоторые маты являются продуктом одиночных видов цианобактерий: так, например, Nostoc образует моновидовые маты черного цвета. Однако чаще всего маты представляют собой комплексные микробные сообщества с несколькими доминирующими видами цианобактерий. В частности, основу матов часто составляют рода Leptolyngbya, Pseudanabaena, Phormidium, Oscillatoria и Nostoc (Vincent, 2000). Начиная с 80-х годов 20-го века поводились довольно обширные исследования биоразнообразия цианобактерий антарктических водоемов традиционными флористическими методами. Броди и Кибблуайт (Broady, Kibblewhite, 1991) в своем исследовании острова Росса и долины Виктории описали популяции осциллаториевых, населяющие пресные и соленые озера и пруды, а также почву, основываясь на морфологических и морфометрических характеристиках цианобактерий. Они выделили 15 морфотипов, различавшихся по форме поперечного сечения трихома, присутствию или отсутствию выростов апикальной клетки, количеству трихомов под общей оболочкой и по ширине трихома. Были описаны такие традиционные виды, как Lyngbya murrayi, Microcoleus vaginatus, Oscillatoria defexa, О. koettlitzi, О. priestleyi, О. sancta, Phormidium autumnale and P. subproboscidea. Они также отметили важность изолирования различных морфотипов для исследования их физиологии и роста. В то же время, базовое описание морфологии 12

штаммов в стандартных условиях культивирования должно быть дополнено описанием и при других условиях. Несколько лет спустя, Эллис-Эванс (Ellis-Evans, 1996) описал микробиоту пресных водоемов Антарктики, основываясь на множестве предыдущих работ. Он отмечает, что в изученных им ранних исследованиях не упоминается пико-планктон, скорее всего, по причине недостатка технического оснащения и невозможности детекции. В то же время, в работах Эллиса-Эванса (Ellis-Evans, 1991) и Хьюса (Hawes, 1990) пикоцианобактерии были отмечены как преобладающий компонент биомассы озер острова Сигни. Наряду с широким разнообразием в планктоне одноклеточных эукариот, среди цианобактерий были описаны рода Synechococcus и Synechocystis. Однако бентосные цианобактерии оказались изученными гораздо более подробно. В основном это были осциллаториевые Oscillatoria, Phormidium, Lyngbya – доминирующие в донных матах континентальных озер. Различные виды рода Phormidium были найдены в мелких водоемах и реках, однако в более глубоких водах их сменяли Tolypothrix tenuis и Plectonema sp. (Priddle, Belcher, 1982). Винокур и Пизарро (Vinocur, Pizarro, 1995), исследуя перифитон различных озер и бассейнов, составили довольно подробный список микроорганизмов. Он включал 43 вида цианобактерий, среди которых Phormidium (11 видов) являлся наиболее знаменательным, однако, что интересно, ни один вид не встречался больше, чем в 2-3 озерах. Таким образом, разнообразие в целом довольно высокое, но в то же время различные озера содержат различные композиции бактерий. Причиной этого может являться характерный для осциллаториевых полиморфизм, или же степень репрезентативности выборки ( EllisEvans, 1996). Были исследованы также озера Холмов Ларсеманна, глубиной от трех до десяти метров (Gillieson et al., 1990). Здесь были найдены глубоководные бентосные маты, имеющие вид округлых пластин толщиной 1-2 см и около 10-15 см в диаметре. Основную часть такой пластины формируют трихомные осциллаториевые наряду с Nostoc, Gleocapsa или Microcystis. Также была отмечена способность осциллаториевых формировать маты красного цвета со сферами Nostoc в верхних слоях матов (Ellis-Evans, 1996). Винсент и Джеймс (Vincent, James, 1996) также одними из первых исследовали биоразнообразие водоемов Антарктики, подробно изучив сектор моря Росса (The Ross Sea Sector). Ими были найдены в основном эукариотические микроорганизмы, а также такие цианобактерии, как Synechococcus sp., Oscillatoria limnetica, O. deflexa, O. priestleyi, Nostoc commune, N. sphaericum, Phormidium angustissimum, P. auturnnale, P. laminosum, P. fragile, Schizothrix sp., Gloeocapsa sp.. 13

Предыдущие исследования позволили составить описание молекулярного биоразнообразия цианобактерий в некоторых биотопах Антарктики и намекнули на существование эндемичных генотипов (Priscu et al., 1998; Bowman et al., 2000; Smith et al., 2000; Vincent et al., 2000; Nadeau et al., 2001; Christner et al., 2003; Dela-Torre et al., 2003; Taton et al., 2003; Casamatta et al., 2005; Jungblut et al., 2005), а также на преобладание психротолерантности над психрофильностью среди большинства антарктических цианобактерий (Nadeau et al., 2001; Taton et al., 2003). В подтверждение этого, результаты исследований Танга с соавторами (1997) и Танга и Винсента (1999) показали, что лишь немногие цианобактериии, обитающие в полярных водоемах, являются истинными психрофилами. Установлено, что для штамов, идентифицированных как Oscillatoria sp. Ant-G16 , Phormidium autumnale Ant-Lunch и Ant-Orange оптимальная температура роста в лабораторных условиях составляла 8-12 °С (Nadeau, Castenholz, 2000; Nadeau et al., 2001). В подавляющем большинстве цианобактерии полярных водоемов относятся к психротолерантным организмам, способным выживать, а также медленно расти при низких температурах, однако их температурный оптимум лежит выше температур, свойственных их месту обитания (Tang et al., 1997). Это может быть вполне объяснимо для экосистемы, где температура может достаточно сильно изменяться в течение нескольких часов, достигая таких значений, при которых психрофильные организмы будут испытывать физиологический стресс и отмирать. В субоптимальных условиях скорость роста цианобактерий невелика, однако она постоянна, что помогает им заселять большинство экологических ниш (Quesada, Vincent, 2012). Арнауд Татон с соавторами (2006) первыми изучили биоразнообразие цианобактерий в бактериальных матах озер Восточной Антарктики, объединив результаты фенотипического описания морфотипов с данными молекулярно-генетического анализа. Они исследовали такие территории, как холмы Ларсеманна, холмы Вестфолд и острова Роер. В пяти бактериальных матах из четырех пресных озер было идентифицировано 17 морфотипов, относящихся к 12 родам и 28 таксономических единиц, выделенных на основе последовательности 16S рРНК, принадлежащих к субсекциям «Oscillatoriales», «Nostocales» и «Chroococcales». Тогда впервые были выделены такие виды, как Aphanocapsa cf. holastica, Aphanocapsa cf. hyalina и Arthronema sp., еще 6 видов (Geitlerinema deﬂexum, Leptolyngbya antarctica, L. frigida, Phormidium priestleyi, P. pseudopriestleyi, Oscillatoria subproboscidea) были отнесены к эндемичным, остальные же встречались и за пределами Антарктики (Taton et al., 2006). 14

3. Материал и методы исследования 3.1. Выделение и культивирование штаммов цианобактерий из озера Степпед (Антарктика) Озеро Степпед локализовано в районе оазиса Холмы Ларсеманн в Восточной Антарктиде (69°22’32.81” ю.ш., 76°23’8.94” в.д.) поблизости от российской полярной станции Прогресс 2 и китайской – Zhongshan. Пробы, собранные 21 марта 2014г. сотрудником кафедры ихтиологии и гидробиологии Даниилом Андреевичем Фатеевым, представляли собой биопленки, взятые со дна вдоль береговой линии (рис. 1а), а также оторвавшиеся с глубины 2-4 метра, фрагменты биомассы, вмерзшие при всплытии в лед (рис. 1б). Хранение и транспортировка проб осуществлялись при температуре 4°С. Рис. 1. Биопленки на береговой линии озера (а) и образцы биомассы, вмерзшей в лед при всплытии (б). Для получения накопительных культур цианобактерий аликвоты проб (5 мл) помещались в 100 мл разбавленной в 2 раза жидкой питательной среды BG- 1 1 c добавлением циклогексимида (50 мкг/мл, для ингибирования роста эукариот). Одновременно проводился высев проб в чашки Петри на поверхность плотной (1%) агаризованной среды ВG-11. Культивирование проводили параллельно при температурах 22-24°С и 10-12°С и постоянном освещении белым светом интенсивностью 1000 лк. 15

Таблица 1. Состав модифицированной среды BG-11 для культивирования цианобактерий (Rippka et al., 1979) Вещество Концентрация, г/л NaNO3 0,3 K2HPO4·2H2O 0,04 CaCl2·2H2O 0,036 Лимонная кислота 0,006 Fe2(SO4)3·9H2O 0,006 NH4Cl 0,006 Na2ЭДТА 0,001 Na2CO3 0,02 MgSO4·7H2O 0,075 Раствор микроэлементов (1 мл/л) H3BO3 0,286 MnCl2·4H2O 0,181 ZnSO4·7H20 0,0222 Na2MoO4·2H2O 0,039 CuSO2·5H2O 0,0079 Co(NO3)2·6H2O 0,0494 Выделение чистых культур цианобактерий осуществляли путем повторных истощающих высевов на плотную среду ВG-11 с переносом отдельных колоний в жидкую среду. В результате было выделено 19 штаммов цианобактерий. Штаммы депонированы в коллекции CALU в составе ресурсного центра "Культивирование микроорганизмов" Научного парка Санкт-Петербургского государственного университета под номерами 1770, 1771, 1773, 1774, 1776-1787, 1789-1791. Штаммы поддерживаются в коллекции на полужидкой (0,6%) агаризованной среде ВG-11 при освещении 300-500 лк и температурах 22-24°С (13 штаммов) и 10-12°С (6 штаммов). С целью изучения особенностей морфологии, анализа пигментного состава клеток, а также накопления биомассы для выделения тотальной ДНК альгологически чистые культуры цианобактерий выращивали в течение 2-3 недель на жидкой среде BG-11 при температурах 22-24°С (штаммы 1770, 1771, 1777-1784, 1786, 1789, 1790) и 10-12°С (штаммы 1773, 1774, 1776, 1785, 1787, 1791) и постоянном освещении лампами дневного света интенсивностью 1000 лк. С целью изучения влияния температуры на рост проводили культивирование отдельных штаммов на жидкой среде BG-11 в течение 28 суток при температурах 8°С, 12°С и 20°С и постоянном освещении лампами дневного света интенсивностью 1000 лк. Динамику накопления биомассы оценивали, периодически измеряя оптическую плотность культур при 680 нм (в максимуме поглощения хлорофилла а). 16

3.2. Методы изучения морфологии и пигментного состава клеток цианобактерий. Готовили прижизненные препараты, отбирая пробы из накопительных и чистых культур, выращенных в пробирках и колбах на жидкой среде BG-11. Микроскопию препаратов в светлом поле проводили с использованием светового микроскопа Leica DM2500, снабженным цифровой фотокамерой Leica DFC500 с соответсвующим программным обеспечением. Полученные изображения обрабатывали в программе Adobe Photoshop CS2. Далее проводили анализ размеров клеток на компьютере с помощью программы Corel DRAW X7. Измерения проводили для 30-57 клеток, затем в Microsoft Excel вычисляли среднее значение и стандартное отклонение ширины и длины клеток. Анализ пигментного состава штаммов проводили на спектрофотометре UNICO 2802S UV/VIS. Для этого клетки и трихомы исследуемых штаммов цианобактерий ресуспендировали с использованием гомогенизатора Поттера в жидкой среде BG-11. Полученные суспензии заливали в стеклянные кюветы спектрофотометра и производили измерение поглощения пробы в диапазоне длин волн 400-750 нм. В качестве контроля использовалась чистая среда BG-11. Результаты обрабатывали в программе UV-Vis Analyst (Ver. 4.67-5.05). Присутствие определенных пигментов регистрировали путем сравнения экспериментально полученных спектров поглощения с литературными данными. Полученные данные по морфологии и морфометрии использовали для идентификации штаммов по «Руководству Берги по систематике бактерий» (2 издание, I том, глава X.Cyanobacteria, Castenholz, 2001). 3.3. Методы молекулярно-генетического анализа. Для выяснения таксономического положения цианобактерий использовали молекулярно-филогенетический подход. С этой целью проводили выделение, амплификацию и анализ последовательностей фрагментов гена 16S рРНК исследуемых штаммов. Выделение ДНК (СТАВ-метод) Биомассу штаммов, выращенных в жидкой питательной среде (BG-11) в пробирках в течение 2-3 недель при температуре 20-22°Спереносили в одноразовые пробирки объемом 1.5 мл и центрифугировали при 12500 об/мин в течение 5 мин (MiniSpin; Eppendorf). Осадок клеток промывали стерильным ТЕ-буфером (10 мМTrisHCl, 1 мМ ЭДТА; рН 8)и еще раз центрифугировали при тех же условиях. Образовавшиеся осадки 17

хранили при температуре -20°C и использовали для выделения тотальной ДНК методом СТАВ (Murray, Thompson, 1980). Осадок клеток ресуспендировали в 500 мкл лизирующего CTAB буфера (2%-ный цетилтриметиламмонийбромид, 0,1 М Трис-НСl, рН 8, 20 мМ ЕДТА, 1,5 М NaCl, 0,2% βмеркаптоэтанол, 2 мкг/мл протеиназа К), инкубировали в течение 3-4ч при 65ºС и постоянном перемешивании. К полученному лизату добавляли равный объем холодной смеси хлороформ:изоамилового спирта (24:1), инкубировали при -20ºС в течение 30 мин, периодически перемешивая на вортексе (Combi-spin, FVL-2400N, BioSan), а затем центрифугировали 15 мин при 13500 об/мин (MiniSpin; Eppendorf). Водную фазу, содержащую ДНК, аккуратно отбирали и переносили в чистые пробирки объемом 1,5 мл. Для осаждения ДНК в пробирки добавляли изопропиловый спирт в соотношении 2/3 от объема водной фазы, перемешивали и инкубировали при -20°C (в течение ночи). Затем центрифугировали пробы при 13500 об/мин в течение 15 мин. Осадок ДНК дважды промывали 500 мкл холодного 86% этилового спирта, центрифугируя при тех же условиях. Отмытый осадок ДНК высушивали, а затем растворяли в 20 мкл бидистиллированной воды. Затем проводили обработку проб РНК-азой, добавляя по 3 мкл раствора РНК-азы (10 мг/мл в 10 мМТрис-НСl, рН 7,5, 15 мМNaCl) и инкубируя пробы 1 ч при температуре 37ºС. Оценку качества и приблизительного количества выделенной ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле. Проведение реакции амплификации ДНК, выделенная с помощью метода СТАВ, служила матрицей для амплификации участка гена 16S рРНК. Используя цианобактериальные праймеры CYA106F и CYA781R (5’-CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA-3’ и 5’-GACTACTGGGGTATCTAATCCCA/ТTT-3’) (Nubel et al., 1997), мы получили продукт размером около 675п.н. Для проведения реакции ПЦР использовали набор ScreenMix-HS (Евроген, Россия). В реакционную смесь объемом 25 мкл вносили по 0,1 мкл каждого праймера с концентрацией 20пкмоль/мкл, и 1 мкл ДНК-матрицы. Амплификацию проводили в термоциклере MJ MiniResearch (ВioRad) по схеме: предварительная денатурация («hotstart») при 94°С - 5 мин; 36 циклов амплификации в режиме: денатурация ДНК при 94°С - 45 с; отжиг праймеров при 62°С 30 с; элонгация при 72°С - 1 мин; заключительная стадия элонгации при 72°C - 10 мин. Электрофорез в агарозном геле 18

С помощью метода электрофореза в агарозном геле образцы тотальной ДНК штаммов, продукты реакции амплификации и очищенные ДНК-фрагменты разделяли по размеру. Электрофорез проводили в 1%-ом агарозном геле (агароза TopVision, Fermentas, Литва) в ТАЕ буфере (40 мМ трис-ацетат, рН 8; 2 мМ ЕДТА). Интеркалирующий краситель - бромистый этидий - добавляли непосредственно в гель до конечной концентрации 0,5 мкг/мл перед заливкой в подложку. При работе с продуктами ПЦР реакции в карманы геля вносили по 5-25 мкл исследуемого раствора ДНК, уже содержащего низкомолекулярный краситель и утяжелитель проб (входят в состав набора для проведения ПЦР). При работе с тотальной ДНК и очищенными ПЦР-фрагментами 5 мкл исследуемой пробы сначала смешивали с 1 мкл утяжелителя, содержащего низкомолекулярный краситель бромфеноловый синий, а затем наносили на гель. Для определения размера ампликонов использовали коммерческие маркеры с набором ДНК-фрагментов известной длины и концентрации - FastRuler (100-5000 п.н.) и O’GeneRuler (100-3000 п.н.) (Fermentas, Литва). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 80 В в течение 30-40 мин, используя камеру Wide Mini Sub Cell GT (ВioRad). С целью визуализации результатов использовали GelDoc-It2Imager (UVP, UK). Экстракция ДНК из агарозного геля Выделение ампликонов из геля и их очистку проводили с помощью набора (Цитокин, Россия), содержащего спин-колонки. Фрагмент геля, содержащий ДНК, помещали в микроцентрифужную пробирку и добавляли к нему связывающий буфер из расчета 100 мкл на 100 мг геля. Смесь инкубировали в течение 10 мин при 60°С на водяной бане до полного растворения геля, периодически перемешивая. Полученный образец переносили в спин-колонку, помещенную в собирательную пробирку. Пробу инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 1 мин. Спин-колонку с адсорбированной ДНК промывали дважды 500 мкл отмывочного буфера. Буфер удаляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 1 мин. Переносили колонку в чистую микроцентрифужную пробирку и проводили элюцию ДНК в 30-40 мкл 5 mMTris-HCl буфера (pH 8,0) при комнатной температуре в течение 2 мин. Растворенную ДНК удаляли с колонки центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 с. Полученные образцы ДНК хранили при -20 °C. Секвенирование и анализ 16S рДНК 19

Секвенирование очищенных ПЦР-фрагментов гена 16s рРНК проводилось на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» с использованием прибора ABI Prism 310 (AppledBiosystems, USA) в соответствии с протоколом фирмы производителя. Данные секвенирования обрабатывали с помощью программы Chromas. Полученные в ходе секвенирования последовательности сравнивали с последовательностями GenBank, используя сервер BLAST. 20

4. Результаты и обсуждение 4.1. Морфологические и культуральные признаки выделенных штаммов Штаммы цианобактерий были выделены из проб, представляющих собой биопленки, собранные вдоль береговой линии озера Степпед со дна в центральной части озера. Глубина озера Степпед чуть более 5 м, площадь поверхности 0,005 км 2, вода прогревается за летние месяцы до 8–9 °С, значение pH составляет 7,5.Основное питание озера осуществляется талыми водами с окружающих снежников и через водотоки с ледникового края. Зимой водоем покрыт ледовым покровом мощностью более 1,4 м; в летние месяцы, как правило, полностью очищается ото льда (http://www.paleopolar.ru/index.php/uroven/39-antarktika/kholmy-larsemann/32-ozero-stepped). Поскольку озеро локализовано в непосредственной близости от полярных станций Прогресс 2 и Zhongshan, оно подвергается значительной антропогенной нагрузке. Согласно литературным данным по индексу видового разнообразия Шеннона-Уивера (значение индекса 0,94) озеро Степпед относится к загрязненным водоемам. По гидрохимическим характеристикам и критериям оценки трофности озеро Степпед является олиготрофным, о чем свидетельствуют низкие концентрации неорганического фосфора (0,05 мг/л) и азота (0,14-0,58 мг/л), а также высокий уровень (9,5-11,3 мг/л) растворенного кислорода в воде (Нигаматзянова, Федорова, 2015). Установлено, что основным биогенным элементом, лимитирующим в летний период первичную продукцию в водоеме, является фосфор. Исходя из характеристик проб и водоема, мы предполагали обнаружить цианобактерий, характерных для пресных водоемов и способных образовывать биопленки и микробные маты. С целью лучшего выявления биоразнообразия, выделение культур осуществлялось как при комнатной температуре (20-22 °С), так и при температуре, приближенной к естественной (8-10 °С). В результате была сформирована коллекция из 19 штаммов цианобактерий, включающая одноклеточные и трихомные формы. были Штаммы депонированы в коллекции САLU под номерами, указанными в таблице 2. На основе морфологических признаков мы разделили штаммы на четыре группы (морфотипа), условно обозначенные как Leptolyngbya вариант I, Leptolyngbya вариант II, Pseudanabaena, Synechococcus, что соответствует названиям формальных родов цианобактерий, представленных во 2-ом издании «Руководства Берги по систематике бактерий» (Castenholz, 2001). Таблица 2. 21

Морфологическая характеристика и предварительная идентификация штаммов цианобактерий озера Степпед Номер штамма САLU Морфотип Морфология клеток Длина клетки, мкм Ширина клетки, мкм Отношение длина/ ширина 1770 1771 1774 1776 1779 1780 1781 1789 1782 1790 Трихомный, трихомы однорядные, покрытые тонким чехлом. Клетки изодиаметрические, или дисковидные. Перетяжки между клетками слабо выражены. Клетки цилиндрические. Перетяжки между клетками слабо выражены. 2,0±0,08 1,7±0,14 1,3±0,11 1,3±0,10 1,7±0,15 1,9±0,18 1,6±0,04 2,0±0,16 1,1±0,07 1,1±0,15 0,6 0,7 1,2 1,3 0,7 0,7 0,8 0,7 1,8 2,5 1773 1785 1787 1791 Трихомный, трихомы однорядные, покрытые тонким чехлом. Трихомный, трихомы однорядные, чехол отсутствует. 1,2±0,20 1,2±0,31 1,5±0,26 1,7±0,30 1,2±0,20 1,4±0,28 1,2±0,17 1,4±0,21 2,0±0,53 2,8±1,13 Клетки боченковидные, Перетяжки между клетками сильно выражены, газовые вакуоли присутствуют Одноклеточ Клетки ный, сферические,эли клетки псоидные или одиночные, палочковидные, либо делятся бинарно парами, эквивалентно с либо в сохранением скоплениях, плоскости чехлы или деления капсулы отсутствуют 2,9±0,33 1,8±0,35 2,3±0,38 2,3±0,47 2,5±0,15 1,6±0,35 1,6±0,14 1,7±0,12 1,2 1,1 1,4 1,4 Pseudanabaena 1,7±0,23 0,8±0,15 1,2±0,19 1,5±0,18 1,2±0,17 0,9±0,09 0,7±0,07 0,7±0,07 0,8±0,07 0,9±0,06 1,9 1,1 1,7 1,9 1,3 Synechococcus 1777 1778 1783 1784 1786 Принадлежность штаммов морфотипа к роду* Leptolyngbya (вариант I) Leptolyngbya (вариант II) Примечания: * - по Castenholz (2001); голубым цветом помечены штаммы, выделенные и культивируемые при температуре 8-10°С. 22

Рис. 2. Микрофотографии штаммов цианобактерий морфотипа Leptolyngbya I: CALU 1770 (а), CALU 1771 (б), CALU 1779 (в), CALU 1776 (г), CALU 1780 (д), CALU 1781 (е), CALU 1789 (ж), CALU 1774 (з). Mасштаб – 5 мкм К морфотипу Leptolyngbya I относятся 8 штаммов нашей коллекции (рис. 2). Для них характерны прямые трихомы, состоящие из дисковидных или изодиаметрических клеток, покрытые жестким чехлом. В старых культурах чехлы становятся мощнее, размножение осуществляется путем фрагментации трихомов и сопровождается образованием клеток-некридиев. Перетяжки между отдельными клетками трихома выражены слабо. Представители данного морфотипа доминировали в жидких накопительных культурах и формировали быстрорастущие колонии на поверхности агаризованной среды при комнатной температуре, а также обнаруживались при пониженной температуре роста. По совокупности морфологических признаков штаммы 23

CALU 1770, 1771, 1774, 1776, 1779, 1780, CALU 1781, CALU 1789 были предварительно отнесены к р. Leptolyngbya. Исходно в данный род входили представители так называемой "LPP-группы B" осциллаториевых цианобактерий (Rippka et al., 1979), в составе которой объединены штаммы из родов Lyngbya, Phormidium и Plectonema с тонкими прямыми трихомами, состоящими из изодиаметрических или цилиндрических клеток. Диаметр трихомов у предствавителей р. Leptolyngbya составляет 0,5-3,5 мкм, степень выраженности перехватов между соседними клетками также варьирует. По утверждению авторов 2-ого издания «Руководства Берги по систематике бактерий»: «род Leptolyngbya в настоящее время служит репозиторием для мелких (имеющих тонкие трихомы) осциллаториевых цианобактерий без очевидной подвижности, которых трудно классифицировать». Род, несомненно, является сборным, о чем свидетельствует его широкая генетическая гетерогенность (Casamatta et al., 2005; Perkerson et al., 2011). Рис. 3. Микрофотографии штаммов цианобактерий морфотипа Leptolyngbya II: CALU 1782 (а), CALU 1790 (б). Mасштаб – 5 мкм. Штаммы САLU 1782 и 1790 в отличие от представителей первой группы, имели более тонкие трихомы, состоящие из клеток цилиндрической формы (рис. 3). Поскольку по основным морфологическим признакам данные штаммы соответствовали диагнозу р. Leptolyngbya, мы отнесли их к морфотипу Leptolyngbya II. Данные штаммы 24

характеризовались более медленным ростом по сравнению с представителями группы Leptolyngbya I и были выделены только при комнатной температуре культивирования. Рис. 4. Микрофотографии штаммов цианобактерий морфотипа Pseudanabaena: CALU 1773 (а, б), CALU 1785 (в), CALU 1787 (г), CALU 1791 (д). Mасштаб – 5 мкм. Третья группа штаммов объединяет цианобактерий, имеющих трихомы с ярко выраженными перехватами между соседними клетками (рис. 4). Клетки бочонковидной формы содержат локализованные на полюсах, преломляющие свет газовые вакуоли. Трихомы не имеют чехла. По совокупности морфологических признаков штаммы CALU 1773, 1785, 1787, 1791 относятся к морфотипу Pseudanabaena. Представители этой группы были выделены только при пониженной температуре культивирования, что позволило выдвинуть гипотезу о психрофильности данных штаммов. Таким образом, трихомные цианобактерии в нашей коллекции представлены штаммами, относящимися исключительно к субсекции III (пор.Oscillatoriales), что соответствует данным литературы (Howard-Williams et al., 1989; Taton et al., 2003, 2006; Jungblut et al., 2005). Однако, нам не удалось выделить из проб представителей субсекции 25

IV (пор. Nostocales). Это может быть связано как с селективностью процедуры получения накопительных культур, так и с действительным отсутствием или низким относительным количеством представителей этой группы в конкретном водоеме. Помимо трихомных цианобактерий, в составе коллекции присутствуют одноклеточные формы, относящиеся к субсекции I (пор.Chroococcales), исходно отнесенные к морфотипу Synechococcus (рис. 5). Рис. 5. Микрофотографии штаммов цианобактерий морфотипа Synechococcus: CALU 1777 (а), CALU 1783 (б), CALU 1778 (в), CALU 1784 (г), CALU 1786 (д). Mасштаб – 5 мкм. 26

Клетки округлой или эллипсоидной формы были расположены одиночно, либо по две, кроме того обнаруживались клетки, находящиеся в стадии деления. Деление клеток осуществлялось бинарно и эквивалентно, не сопровождалось сменой плоскости деления. Клетки не синтезировали заметных чехлов или полисахаридных капсул, скопления клеток не обладали четко выраженной структурой (рис. 5). По основным морфологическим признакам клетки штаммов CALU 1777, 1778, 1783, 1784 и 1786 более всего соответствуют описанию двух родов цианобактерий, входящих в состав субсекции I: Synechococcus и Cyanobium (Castenholz, 2001). Однако представители р. Cyanobium имеют клетки меньших размеров, диаметр которых составляет 0,8-1,4 мкм, а для р. Synechococcus ширина клеток отдельных представителей составляет 0,6-2,1 мкм. Остальные различия между этими родами определяются на уровне физиолого-биохимических и молекулярно-генетических признаков, которые будут рассматриваться в следующих разделах. 27

4.2. Пигментный состав культивируемых штаммов С целью уточнения систематической принадлежности штаммов исследуемой коллекции был проведен анализ их пигментного состава. Известно, что конститутивный синтез определенных форм хлорофилла в клетках является диагностическим признаком при разграничении родов цианобактерий (Пиневич и др., 2010). Наличие определенных форм вспомогательных пигментов – фикобилипротеинов - также учитывается в диагнозах рода или отдельных кластеров внутри рода (Castenholz, 2001). Рис. 6. Витальный спектр поглощения клеток штаммов морфотипа Leptolyngbya I: CALU 1780 (а), CALU 1779 (б), CALU 1789 (в), 1781 (г), CALU 1781 (г), CALU 1770 (д), CALU 1771 (е). Позиции максимумов поглощения соответствуют: 1 и 4 – хлорофилл а, 2 – каротиноиды , 3 – фикоцианин. В качестве контроля использовалась чистая питательная среда BG-11. 28

Рис.7. Витальный спектр поглощения клеток штаммов морфотипа Leptolyngbya I: CALU 1774 (а), CALU 1776 (б). Позиции максимумов поглощения соответствуют: 1 и 4 – хлорофилл а, 2 – каротиноиды , 3 – фикоцианин. В качестве контроля использовалась чистая питательная среда BG-11. Витальные спектры поглощения суспензий клеток представителей морфотипа Leptolyngbya I, выращенных при комнатной (рис. 6) и пониженной (рис. 7) температурах, оказались сходными для всех штаммов. На спектрах присутствовали максимумы поглощения хлорофилла a (при 440 и 680 нм) и синего фикобилипротеина – фикоцианина (при 625 нм), а также каротиноидов. Окраска суспензий клеток представителей данной группы варьировала от сине-зеленой (в молодых культурах) до темно-коричневой (в старых культурах). 29

Рис. 8 .Витальный спектр поглощения клеток штаммов морфотипа Leptolyngbya II: CALU 1790 (а), CALU 1782 (б). Позиции максимумов поглощения соответствуют: 1 и 5 – хлорофилл а, 2 – каротиноиды , 3 - фикоэритрин, 4 – фикоцианин. В качестве контроля использовалась чистая питательная среда BG-11. Пигментный состав представителей двух штаммов морфотипа Leptolyngbya II отличался (рис. 8), поскольку на спектре CALU 1790 (рис. 8, кривая а) помимо хлорофилла а, фикоцианина и каротиноидов выявлялся в небольшом количестве красный фикобилипротеин – фикоэритрин (570 нм), который отсутствовал у штамма CALU 1782 (рис. 8, кривая б). По данным литературы пигментный состав представителей р. Leptolyngbya может достаточно сильно отличаться по количественному и качественному содержанию вспомогательных пигментов – фикобилипротеинов. Род, несомненно, является сборным, и 30

в настоящее время пигментный состав как диагностический критерий для р . Leptolyngbya не рассматривается. Рис. 9. Витальный спектр поглощения клеток штаммов морфотипа Pseudanabaena: CALU 1773 (а), CALU 1785 (б), CALU CALU 1787 (в), CALU 1791 (г). Позиции максимумов поглощения соответствуют: 1 и 5 – хлорофилл а, 2 – каротиноиды , 3 фикоэритрин, 4 – фикоцианин. В качестве контроля использовалась чистая питательная среда BG-11. Штаммы морфотипа Pseudanabaena отличались по окраске: суспензии клеток штамма CALU 1773 имели сине-зеленый цвет, а для штаммов CALU 1785, 1787 и 1791 была характерна малиновая окраска. При анализе спектров поглощения у «малиновых» штаммов обнаружены ярко выраженные максимумы поглощения при 560-565 нм, соответствующие фикоэритрину (рис. 9, кривые б, в, г, позиция 3). Данный пик 31

отсутствовал у сине-зеленого штамма (рис 9, кривая а). Способность к синтезу фикоэритрина показана у пресноводных форм, отнесенных к кластерам 3 и 5 в составе рода Pseudanabaena (Castenholz, 2001). Рис. 10. Витальный спектр поглощения клеток штаммов морфотипа Synechococcus: CALU 1778 (а), CALU 1777 (б), CALU 1784 (в), CALU 1783 (г), CALU 1786 (д).Позиции максимумов поглощения соответствуют: 1 и 4 – хлорофилл а, 2 – каротиноиды, 3 – фикоцианин. В качестве контроля использовалась чистая питательная среда BG-11. Витальные спектры поглощения штаммов, отнесенных к морфотипу Synechococcus, были сходны и имели максимумы поглощения хлорофилла а, каротиноидов и фикоцианина, однако не имели максимума поглощения фикоэритрина (рис. 10). Согласно 32

«Руководства Берги по систематике бактерий» представители р. Synechococcus по совокупности фено- и генотипических признаков делятся на 5 кластеров. Способность к синтезу фикоэритрина показана лишь у штаммов, принадлежащих к кластерам 4 и 5.1, которые представлены морскими цианобактериями. Представители р. Cyanobium действительно не имеют способности к синтезу фикоэритрина. (Castenholz, 2001). Таким образом, изучение пигментного состава морфотипа Synechococcus не позволяет точно определить родовую принадлежность входящих в него штаммов. 33

4.3. Результаты молекулярно-филогенетического анализа штаммов коллекции С целью подтверждения родовой принадлежности исследуемых штаммов, отнесенных к морфотипам Leptolyngbya I, Leptolyngbya II и Pseudanabaena, а также для уточнения систематического положения штаммов морфотипа Synechococcus была проведена амплификация фрагментов гена 16S рРНК с использованием пары универсальных цианобактериальных праймеров 106f и781r. Полученные ПЦР-фрагменты размером около 660 п.н. были очищены и секвенированы по Сенгеру. Последовательности фрагментов гена 16S рРНКдля всех 19 штаммов коллекции приведены в Приложении. Сравнение полученных последовательностей с последовательностями из GenBank проводили с использованием BLAST. Полученные результаты сравнения представлены в таблице 3. Для каждого штамма из нашей коллекции в таблице указаны ближайшие гомологи (по последовательности фрагмента гена 16S рРНК), а также наиболее близкие референсные штаммы цианобактерий (в основном из коллекции РСС), фигурирующие в «Руководстве Берги по систематике бактерий» (Castenholz, 2001). Следует заметить, что для представителей филы Cyanobacteria в «Руководстве Берги по систематике бактерий» фактически полностью отсутствует описание отдельных видов цианобактерий. Такая ситуация возникла в связи с тем, что исторически цианобактерии сначала рассматривались ботаниками как одна из групп водорослей. Огромное количество видов было описано с использованием правил ICBN (International Code of Botanical Nomenclature - Международный Кодекс Ботанической Номенклатуры). Между тем прямое перенесение этих видов в бактериологическую систему противоречит правилам ICNP (International Code of Nomenclature of Prokaryotes - Международный Кодекс Номенклатуры Прокариот) (Pinevich, 2015). П р и д е п о н и р о в а н и и последовательностей генов представителей цианобактерий в базе данных GenBank могут быть указаны как бактериологические, так и ботанические названия исследуемых объектов. Поэтому в таблице 3 встречаются ботанические названия цианобактерий. Из таблицы 3 следует, что данные молекулярно-филогенетического анализа в целом не противоречат результатам идентификации, проведенной на основе фенотипических признаков. Так штаммы, отнесенные нами к морфотипу Pseudanabaena (CALU 1773, 1785, 1787 и 1791), кластеризуются с представителями этого рода, в том числе со штаммами из коллекции РСС: 6903 и 7408 (97-99% сходства). Данные штаммы принадлежат к кластерам 1 и 3 соответственно в составе р. Pseudanabaena. Таблица 3. Результаты сравнения последовательностей фрагментов гена 16s рРНК штаммов коллекции с последовательностями из базы данных GenBank 34

Номер штамма, CALU 1770 1771 1773 1774 1776 1777 99% 99% 98% 97% 97% 97% 99% 99% 98% 97% 97% 97% 97% 97% 97% Номер последовательности в GenBank AY493578.1 AY493579.1 AY493580.1 LN849930.1 JQ692233.1 LN849932.1 AY493579.1 AY493578.1 AY493580.1 JQ692233.1 LN849930.1 AM709632.1 AF132778.1 AB039017.1 GU935355.1 96% 99% 99% 98% 98% 97% 97% 97% 99% 99% 98% 98% 98% 97% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% LC016776.1 LN849930.1 JF810642.1 JQ692233.1 AY493579.1 AY493581.1 AY493578.1 AY493580.1 LN849930.1 JF810642.1 AY493579.1 AY493578.1 AY493580.1 AY493581.1 DQ526417.1 AF216952.1 KM020007.1 KF690272.1 KF690270.1 NR_102447.1 JQ070060.1 Систематическая принадлежность Степень и код штамма в коллекции сходства Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Phormidium sp. D1_2 Phormidesmis sp. LD3 4800 EK Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidium sp. D1_2 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Pseudanabaena sp. PCC 6903 Pseudanabaena sp. PCC 6903 Pseudanabaena sp. PCC 6903 Pseudanabaena sp. Sai008 Pseudanabaena limnetica NIVACYA276/6 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Leptolyngbya sp. M1.3 Phormidium sp. D1_2 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.L66.1 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Leptolyngbya sp. M1.3 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L66.1 Synechococcus sp. LS0564 Synechococcus sp. PS715 Aphanocapsa salina SAG 33.79 Synechococcus sp. CALU 1737 Synechococcus sp. CALU 1736 Cyanobium gracile PCC 6307 Cyanobium sp. UAM 406 Таблица 3 (продолжение). Номер штамма, CALU 1778 Систематическая принадлежность Степень и код штамма в коллекции сходства Synechococcus sp. 1tu39s01 99% Номер последовательности в GenBank AM259222.1 35

1779 1780 1781 1782 1783 1784 Synechococcus sp. LEGE 06315 Synechococcus elongatus C C A P 1479/1B Aphanocapsa salina SAG 33.79 Cyanobium sp. CENA149 Synechococcus sp. CALU 1736 Cyanobium gracile PCC 6307 Synechococcus sp. PCC 7009 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Phormidesmis priestleyi ANT.L66.1 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L66.1 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L66.1 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Leptolyngbya frigida ANT.L53B.2 Leptolyngbya nostocorum UAM 387 Phormidium sp. SAG 37.90 Leptolyngbya sp. CENA375 Synechococcus sp. BX11 Aphanocapsa salina SAG 33.79 Cyanobium gracile PCC 6307 Cyanobium sp. UAM 406 Cyanobium sp. PCC 6904 Synechococcus sp. PCC 8966 Synechococcus sp. PCC 8916 Synechococcus sp. PCC 7918 Synechococcus sp. PCC 7009 Synechococcus sp. BX11 Aphanocapsa salina SAG 33.79 Cyanobium gracile PCC 6307 Cyanobium sp. UAM 406 99% HM217049.1 98% 98% 98% 98% 98% 98% 100% 99% 98% 98% 97% 99% 99% 98% 97% 97% 99% 99% 98% 97% 97% 99% 98% 98% 98% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% KM020008.1 KM020007.1 KC695843.1 KF690270.1 NR_102447.1 AM709628.1 AY493578.1 AY493579.1 AY493580.1 LN849930.1 AY493581.1 AY493578.1 AY493579.1 AY493580.1 AY493581.1 LN849930.1 AY493578.1 AY493579.1 AY493580.1 AY493581.1 LN849930.1 AY493576.1 JQ070063.1 EF654082.1 KR137596.1 HM151384.1 KM020007.1 NR_102447.1 JQ070060.1 AF216944.1 AF448072.1 AF448071.1 AF216947.1 AM709628.1 HM151384.1 KM020007.1 NR_102447.1 JQ070060.1 Таблица 3 (продолжение). Номер штамма, CALU 1785 Систематическая принадлежность Степень и код штамма в коллекции сходства Pseudanabaena sp. KO03 Pseudanabaena sp. Sai011 Pseudanabaena sp. PUPCCC 106.7 99% 98% 98% Номер последовательности в GenBank KR872397.1 GU935357.1 KJ705103.1 36

1786 1787 1789 1790 1791 Pseudanabaena sp. PCC 7408 Pseudanabaena limnetica NIVACYA276/6 Pseudanabaena sp. PCC 6903 Synechococcus sp. BX11 Aphanocapsa salina SAG 33.79 Cyanobium gracile PCC 6307 Cyanobium sp. UAM 406 Pseudanabaena sp. KO03 Pseudanabaena sp. PCC 6903 Pseudanabaena sp. PCC 6903 Pseudanabaena sp. Sai010 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L52.6 Phormidesmis priestleyi ANT.LG2.4 Phormidesmis priestleyi ANT.L66.1 Phormidesmis sp. LD30 5700 TP Leptolyngbya frigida ANT.L53B.2 Leptolyngbya nostocorum UAM 387 Leptolyngbya sp. CENA375 Phormidium sp. SAG 37.90 Leptolyngbya frigida ANT.REIDJ.1 Leptolyngbya frigida NT.L64B.1 Pseudanabaena sp. KO03 Pseudanabaena sp. Sai005 Pseudanabaena sp. Sai011 Pseudanabaena sp. PUPCCC 106.7 Pseudanabaena sp. PCC7408 Pseudanabaena sp. PCC 6903 Pseudanabaena sp. PCC 6903 Pseudanabaena limnetica NIVACYA276/6 97% AB039020.1 97% 97% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 98% 99% 99% 99% 97% 97% 99% 98% 98% 98% 98% 98% 99% 98% 98% 98% 97% 97% 97% LC016776.1 AM709632.1 HM151384.1 KM020007.1 NR_102447.1 JQ070060.1 KR872397.1 AM709632.1 AF132778.1 GU935356.1 AY493578.1 AY493579.1 AY493580.1 AY493581.1 LN849930.1 AY493576.1 JQ070063.1 KR137596.1 EF654082.1 AY493611.1 AY493577.1 KR872397.1 GU935353.1 GU935357.1 KJ705103.1 AB039020.1 AM709632.1 AF132778.1 97% LC016776.1 Штаммы морфотипа Leptolyngbya II (САLU 1782 и 1790) имеют наиболее близких гомологов среди представителей ботанического вида Leptolyngbya frigida (99% сходства), описанных и выделенных из антарктических местообитаний. Поэтому данные штаммы сохраняют за собой родовое название Leptolyngbya. Последовательности фрагментов гена 16S рРНК представителей морфотипа Synechococcus кластеризовались с последовательностями штаммов, принадлежащих к родам Synechococcus, Aphanocapsa, Cyanobium. Ближайший гомолог штамма CALU 1777, Synechococcus sp. LS0564, был выделен из озера Супериор (США), а штамма САLU 1778, Synechococcus sp. 1tu39s01, – из озера Туусуланярви (Финляндия). Оба этих штамма кластеризуются с представителями коллекции CALU: Synechococcus sp. CALU 1737 и 1736, полученными из проб воды озера Ладога. Для штаммов САLU 1783, 1784 и 1786 37

наибольшая степень гомологии наблюдалась с последовательностью штамма Synechococcus sp. BX11, выделенного из воды озера Тайху (Китай). Во всех случаях наиболее близкие гомологи исследуемых штаммов были представителями микробиоты пресных олиготрофных водоемов. Среди референсных штаммов, упоминаемых в «Руководстве Берги по систематике бактерий» штамм Cyanobium gracile PCC 6307 имеет 98-99% сходства со всеми штаммами морфотипа Synechococcus. Корме того, другие штаммы из коллекции РСС (7009, 8966), относящиеся к р. Cyanobium, также являются ближайшими гомологами исследуемых штаммов. Сопоставление данных по морфологии (средняя ширина клеток 0,7-0,9 мкм), пигментному составу (отсутствие фикоэритрина) и молекулярной филогении позволяет окончательно отнести штаммы морфотипа Synechococcus к р. Cyanobium. Штаммы, отнесенные нами к морфотипу Leptolyngbya I, имеют ближайших гомологов в базе данных, относящихся к ботаническим родам Phormidesmis (99-100 % сходства) и Phormidium. Род Phormidesmis впервые был выделен Туричия с коллегами (Turicchia et al., 2009) из ботанического рода Phormidium на основе особенностей морфологии (тонкие трихомы, тонкий чехол, изодиаметрические клетки, незначительно выраженные перехваты между клетками). Анализ последовательностей фрагментов гена 16s рРНК подтвердил обособленность представителей р. Phormidesmis от представителей р. Phormidium. Было показано, что исследуемый ими вид Phormidesmis molle филогенетически близок к цианобактериям ботанического сем. Pseudanabaenaceae (в состав которого входит р. Leptolyngbya) . Эти данные подтвердили Татон с коллегами (Taton et al., 2006), а также Комарек с коллегами (Komarek et al., 2009) в исследованиях антарктического вида Phormidium priestleyi, показав, что Phormidesmis molle и Phormidium priestleyi образуют р. Phormidesmis и отстоят на филогенетическом древе от группы Phormidium. Дело в том, что с момента публикации в 2001 году «Руководства Берги по систематике бактерий» неоднократно делались попытки реструктуризации сборного, полифелитичного рода Leptolyngbya. В частности, с использованием определенного набора фенотипических признаков, подкрепленных данными молекулярнофилогенетического анализа, специалистами-альгологами были описаны р. Nodosilinea (Perkerson et al., 2011), р.Pantanalinema и р. Alkalinema (Vaz et al., 2015), р. Oculatella (Zammit et al., 2012), представители которых исходно рассматривались как представители р. Leptolyngbya. Поскольку в нашей работе мы используем бактериологический подход к идентификации штаммов коллекции, а р. Phormidesmis описан по правилам ICBN, мы 38

сочли возможным сохранить за штаммами морфотипа Leptolyngbya I (CALU 1770, 1771, 1774, 1776, 1779, 1780, 1781, 1789) родовое название Leptolyngbya. 39

4.4. Влияние температуры на рост штаммов Pseudanabaena spp., выделенных из озера Степпед Четыре штамма нашей коллекции, идентифицированные как Pseudanabaena spp. (CALU 1773, 1785, 1787 и 1791), были выделены из накопительных культур и исходно росли при пониженной температуре (8-10°С). Попытки выращивать их при комнатной температуре (20-22°С) не увенчались успехом. С целью проверки гипотезы о возможной психрофильности данных штаммов, были проведены эксперименты по количественной оценке роста жидких культур при различных температурах. Из-за недостатка времени были получены предварительные результаты для лишь двух из четырех штаммов Pseudanabaena sp. CALU 1785 и Pseudanabaena sp. CALU 1787. Рис. 11. Зависимость накопления биомассы Pseudanabaena sp. CALU 1785 от температуры культивирования (синие столбцы - 8°С, красные столбцы - 12°С, зеленые столбцы - 20°С) Как показано на рис. 11 и 12, эти штаммы активно накапливали биомассу при температурах 8 и 12°С, а при температуре 20°С рост был очень слабым. Следует отметить, что в соответствии с динамикой накопления биомассы для штамма Pseudanabaena sp. CALU 1785 (рис. 11) более оптимальной для роста является температура 12°С. В то же время, штамм Pseudanabaena sp. CALU 1787 (рис. 12) активней всего накапливал биомассу при температуре культивирования 8°С. 40

Рис. 12. Зависимость накопления биомассы Pseudanabaena sp. CALU 1787 от температуры культивирования (синие столбцы - 8°С, красные столбцы - 12°С, зеленые столбцы - 20°С) Таким образом, по крайней мере, для двух штаммов нашей коллекции (CALU 1785 и 1787) оптимальный рост наблюдается при температурах ниже 20°С, что позволяет отнести их группе психрофильных организмов. Из литературы известно, что цианобактерии полярных водоемов чаще всего являются психротолерантнымм организмами, способными выживать, а также медленно расти при низких температурах, однако их температурный оптимум лежит выше температур, свойственных их месту обитания (Tang et al., 1997). Лишь для нескольких штаммов цианобактерий, идентифицированных как Oscillatoria sp. Ant-G16, Phormidium autumnale Ant-Lunch и Ant-Orange, при тестировании в лабораторных условиях оптимальная температура роста составляла 8-12°С, что позволяет считать их психрофилами (Nadeau, Castenholz, 2000; Nadeau et al., 2001). Исследованные нами штаммы Pseudanabaena sp. CALU 1785 и 1787 таким образом расширяют список психрофильных цианобактерий. 41

Выводы 1. Культивируемые цианобактерии озера Степпед представлены одноклеточными и трихомными формами и на основании анализа морфологических признаков и пигментного состава идентифицированы как Leptolyngbya spp. (CALU 1770, 1771, 1774, 1776, 1779, 1780, 1781,1782, 1789, 1790), Pseudanabaena spp. (CALU 1773, 1785, 1787, 1791) и Cyanobium spp. (СALU 1777, 1778, 1783, 1784, 1786). 2. Данные молекулярно-генетического анализа последовательностей фрагментов гена 16S рРНК исследуемых штаммов не противоречат результатам идентификации по фенотипическим признакам. 3. Штаммы коллекции Pseudanabaena sp. CALU 1785 и Pseudanabaena sp. CALU 1787 являются психрофильными цианобактериями. Исполнитель Научный руководитель 42

Список литературы 1. Нигаматзянова Г.Р., Федорова И.В. Оценка экологического состояния озер оазисов Холмов Ларсеманн и Ширмахера (Восточная Антарктида) //Успехи современного естествознания. - 2015. - № 12. - С.140-144 2. Пиневич А.В. Микробиология. Биология прокариотов //СПб: Издательство СанктПетербургского университета, 2006. - Т.1. - C. 106-110. 3. Belzile C., Vincent W.F., Gibson J.A.E. et al. Bio-optical characteristics of the snow, ice and water column of a perennially ice-covered lake in the high Arctic //Can. J. Fish. Aquat. Sci. 2001. - V.58. - P.2405-2418. 4. Bonilla S., Villeneuve V., Vincent W.F. Benthic and planktonic algal communities in a high arctic lake: pigment structure and contrasting responses to nutrient enrichment //J. Phycol. 2005. - V.41. - P.1120-1130. 5. Bowman J.P., Rea S.M., McCammon S.A. et al. Diversity and community structure within anoxic sediment from marine salinity meromictic lakes and a coastal meromictic marine basin, Vestfold Hills, Eastern Antarctica //Environ. Microbiol. - 2000. - V.2. - P.227-237. 6. Brambilla E., Hippe H., Hagelstein A. et al. 16S rDNA diversity of cultured and uncultured prokaryotes of a mat sample from Lake Fryxell, McMurdo Dry Valleys, Antarctica. //Extremophiles - 2001. - V.5 - P.23-33. 7. Broady P.A., Kibblewhite A. Morphological characterization of Oscillatoria (Cyanobacteria) from Ross Island and southern Victoria Land, Antarctica //Antarct. Sci. - 1991. - V.3. - P.3545. 8. Casamatta D. A., Johansen J. R., Vis M. L. et al. Molecular and ultrastructural characterization of ten polar and near-polar strains within the Oscillatoriales (Cyanobacteria) //J. Phycol. - 2005. - V.41. - P.421-438. 9. Castenholz, R.W., Garcia-Pichel F. 2000. Cyanobacterial responses to UV-radiation //The Ecology of Cyanobacteria: Their Diversity in Time and Space. - Dordrecht, 2000. - P.591611. 10. Castenholz R.W. Phylum BX.Cyanobacteria //Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. - 2001. - V.2. - P.473-599. 11. Christner B.C., Kvitko B.H. II, Reeve J.N. Molecular identification of Bacteria and Eukarya inhabiting an Antarctic cryoconite hole //Extremophiles. - 2003. - V.7. - P.177-183. 12. De la Torre J.R., Goebel B.M., Friedmann E.I. et al. Microbial diversity of cryptoendolithic communities from the McMurdo Dry Valleys, Antarctica //Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - V.69. - P.3858-3867. 43

13. De los Rios A., Ascaso C., Wierzchos J. et al. Microstructural characterization of cyanobacterial mats from the McMurdo Ice Shelf, Antarctica //Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V.70. - P.569-580. 14. Di Rienzi S.C., Sharon I., Wrighton K.C. et al. The human gut and groundwater harbor nonphotosynthetic bacteria belonging to a new candidate phylum sibling to Cyanobacteria //eLife. - 2013. 15. Ellis-Evans J.C. Numbers of activity of bacterio- and phytoplankton in contrasting maritime Antarctic lakes //Verh. Intemat. Verein. Theor. Angew. Limnol. - 1991. - V.24. - 1149-1154. 16. Ellis-Evans J.C. Microbial diversity and function in Antarctic freshwater ecosystems //Biodiversity and Conversation. - 1996. - V.5. - P.1395-1431. 17. Elster J. Ecological classification of terrestrial algae communities of polar environment //GeoEcology of Antarctic Ice-Free Coastal Landscapes, Ecological Studies. - Berlin, 2002. - V.154. - P.303-326. 18. Elster J., Komarek O. Diversity of the cyanobacterial microflora of the northern part of James Ross Island, NW Weddell Sea, Antarctica //Polar Biology. - 2008. - V.31. - P.853-865. 19. Fritsen C.H., Priscu J.C. Cyanobacterial assemblages in permanent ice covers of Antarctic lakes: distribution, growth rate, and temperature response of photosynthesis //J. Phycol. 1998. - V.34. - P.587-597. 20. Garcia-Pichel F., Belnap J. Microenvironments and microscale productivity of cyanobacterial desert crusts // J. Phycol. - 1996. - V.32. - P.774-782. 21. Gerdel R.W., Drouet F. The cyanobacteria of the Thule area, Greenland //Trans. Am. Microsc. Soc. - 1960. - V.79. - P.256-272. 22. Gillieson D., Burgess J., Spate A. et al. An Atlas of the Lakes of the Larsemann Hills, Princess Elizabeth Land, Antarctica //The Publications Office, Australian Antarctic Division, Kingston. - 1990. 23. Goldman C.R., Mason D.T., Hobbie J.E. Two Antarctic desert lakes //Limnol. Oceanogr. 1967. - V.12. - P.295-310. 24. Golubic S., Seong-Joo L., Browne K. M. Cyanobacteria: architects of sedimentary structures //Microbial sediments. - Springer-Verlag, Berlin, 2000. - P.57-67. 25. Gordon D.A., Priscu J.C., Giovannoni S. Distribution and phylogeny of bacterial communities associated with mineral particles in Antarctic lake ice //Microb. Ecol. - 2000. V.9. - P.197-202. 26. Gurian-Sherman D., Lindow S.E. Bacterial ice nucleation: significance and molecular basis //FASEB J. - 1993. - V.7 - P.1338-1343. 44

27. Hawes I. Eutrophycation and vegetation development in maritime Antarctic lakes //Antarctic Ecosystems. - Springer-Verlag, Berlin, 1990. - P.83-90. 28. Hawes I., Howard-Williams C., Vincent W.F. Desiccation and recovery of Antarctic cyanobacterial mats //Polar Biol. - 1992. - V.12. - P.587-594. 29. Hawes I., Schwarz A.M. Photosynthesis in an extreme shade environment: benthic microbial mats from Lake Hoare, a permanently ice-covered Antarctic lake //J. Phycol. - 1999. - V. 35. - P.448-459. 30. Hirschberg J., Chamovitz D. Carotenoids in cyanobacteria //The Molecular Biology of Cyanobacteria. - Dordrecht, 1994. - P.559-579. 31. Howard-Williams C., Pridmore R.D., Downes M.T. et al. Microbial biomass, photosynthesis and chlorophyll a related pigments in the ponds of the McMurdo Ice Shelf, Antarctica //Ant. Sci. - 1989. - V.1. - P.125-131. 32. Joshua S., Bailey S., Mann N.H. et al. Involvement of phycobilisome diffusion in energy quenching in cyanobacteria //Plant Physiol. - 2005. - V.138. - P.1577-1585. 33. Jungblut A.D., Hawes I., Mountfort D. et al. Diversity within cyanobacterial mat communities in variable salinity meltwater ponds of McMurdo Ice Shelf, Antarctica //Environ. Microbiol. - 2005. - V.7. - P.519-529. 34. Kalff J., Kling J., Holmgren S.H. et al. Phytoplankton, phytoplankton growth and biomass cycles in an unpolluted and in a polluted lake //Verh. Int. Ver. Limnol. - 1975. - V.19. P.487-495. 35. Kawahara H. The structures and functions of ice crystal controlling proteins from bacteria //J. Biosci. Bioeng. - 2002. - V.94 - P.492-496. 36. Komarek J., Kastovsky J., Ventura S. et al. The cyanobacterial genus Phormidesmis //Algol. Stud. - 2009. - V.29. - P.41- 59. 37. Leslie A. The Arctic Voyages of Adolf Erik Nordenskiold //MacMillan and Co. - London, UK., 1879. - P.447. 38. Los D.A., Murata N. Responses to Cold Shock in Cyanobacteria // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - V.1(2). - P.221-230. 39. Mehnert G., Leunert F., Cirfis S. et al. Competitiveness of invasive and native cyanobacteria from temperate freshwaters under various light and temperature conditions //J. Plankton. Res. - 2010. - V.32. - P.1009-1021. 40. Mullineaux C.W., Emlyn-Jones D. State transitions: an example of acclimation to lowlight stress //J. Exp. Bot. - 2005. - V.56. - P.389-393. 45

41. Nadeau T.-L., Howard-Williams C., Castenholz R.W. Effects of solar UV and visible irradiance on photosynthesis and vertical migration of Oscillatoria sp (cyanobacteria) in an Antarctic microbial mat //Aquat. Microb. Ecol. - 1999. - V.20. - P.231-243. 42. Nadeau T.-L., Castenholz R.W. Characterization of psychrophilic oscillatorians (cyanobacteria) from antarctic meltwater ponds //J. Phycol. - 2000. - V.36. - P.914-923. 43. Nadeau T.-L., Milbrandt E.C., Castenholz R.W. Evolutionary relationships of cultivated antarctic Oscillatorians (Cyanobacteria) //J. Phycol. - 2001. - V.37. - P.650-654. 44. Nakai R., Abe T., Baba T. et al. Microflorae of aquatic moss pillars in a freshwater lake, East Antarctica, based on fatty acid and 16S rRNA gene analyses //Polar Biol. - 2012. - V.35. P.425-433. 45. Nubel U., Garcia-Pichel F., Muyzer G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria //Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - V.63. - P.3327- 3332. 46. Paerl H.W., Pinckney J.L., Steppe T.F. Cyanobacterial-bacterial mat consortia: examining the functional unit of microbial survival and growth in extreme environments //Environ. Microbiol. - 2000. - V.2. - P.11-26. 47. Papageorgiou G.C., Murata N. The unusually strong stabilizing effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygen-evolving photosystem II complex //Photosynth. Res. - 1995. - V.44. - P.243-252. 48. Perkerson III R.B., Johansen J.R., Kovcik L. et al. A unique pseudanabaenalen (Cyanobacteria) Genus Nodosilinea gen. nov. based on morphological and molecular data //J. Phycol. - 2011. - V.47(6). - P.1397-1412. 49. Pinevich A.V. Proposal to consistently apply the International Code of Nomenclature of Prokaryotes (ICNP) to names of the oxygenic photosynthetic bacteria (cyanobacteria), including those validly published under the International Code of Botanical Nomenclature (ICBN) / International Code of Nomenclature for algae, fungi and plants (ICN), and proposal to change Principle 2 of the ICNP //IJSEM. - 2015. - V.65. - P.1070-1074. 50. Priscu J.C., Fritsen C.H., Adams E.E. et al. Perennial Antarctic lake ice: an oasis for life in a polar desert //Science. - 1998. - V.280. - P.2095-2098. 51. Proteau P.J., Gerwick W.H., Garcia-Pichel F. et al. The structure of scytonemin, an ultraviolet sunscreen pigment from the sheaths of cyanobacteria //Experientia. - 1993. - V.9. - P. 25-829. 52. Quayle W.C., Peck L.S., Peat H. et al. Extreme responses to climate change in Antarctic lakes //Science. - 2002. - P.295:645. 46

53. Quesada A., Vincent W.F., Lean D.R.S. Community and pigment structure of Arctic cyanobacterial assemblages: the occurrence and distribution of UV-absorbing compounds //FEMS Microbiol. Ecol. - 1999. - V.28. - P.315-323. 54. Quesada A., Vincent W.F. Cyanobacteria in the cryosphere: snow, ice and extreme cold //Ecology of Cyanobacteria II. - Springer, Dordrecht, 2012. - P.387-399. 55. Raymond J.A., Fritsen C.H. Ice-active substances associated with Antarctic freshwater and terrestrial photosynthetic organisms //Antarct. Sci. - 2000. - V.12. - P.418-424. 56. Raymond J.A., Fritsen, C.H. Semi-purification and ice recrystallization inhibition activity of ice active substances associated with Antarctic photosynthetic organisms //Cryobiology. 2001. - V.43. - P.63-70. 57. Raymond J.A., Fritsen C.H., Shen K. A nice-binding protein from an Antarctic sea ice bacterium //FEMS Microbiol. Ecol. - 2007. - V.61. - P.214-221. 58. Raymond J.A., Christner B.C., Schuster S.C. A bacterial ice-binding protein from the Vostok icecore //Extremophiles. - 2008. - V.12. - P.713-717. 59. Raymond J.A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice // PNAS. - 2011. V.108. - P.24. 60. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B. et al. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria //J. Gen. Microbiol. - 1979. - V.111. - P.1-61. 61. Roos J.C., Vincent W.F. Temperature dependence of UV radiation effects on Antarctic cyanobacteria //J. Phycol. - 1998. - V.34. - P.118-125. 62. Sabacka M., Elster J. Response of cyanobacteria and algae from Antarctic wetland habitats to freezing and desiccation stress //Polar Biology. - 2006. - V.30(1) - P.31-37. 63. Schiaffno M.R., Unrein F., Gasol J. et al. Comparative analysis of bacterioplankton assemblages from maritime Antarctic freshwater lakes with contrasting trophic status //Polar Biol. - 2009. - V.32. - P.923-936. 64. Schindler D.W. Eutrophication in the high Arctic - Meretta Lake, Cornwallis Island (75°N Lat.) //J. Fish. Res. Board. Can. - 1974. - V.31. - P.647-662. 65. Schmidt S., Moskall W., de Mora S.J.D. et al. Limnological properties of Antarctic ponds during winter freezing //Antarct. Sci. - 1991. - V.3. - P.379-388. 66. Singh S.M., Elster J. Cyanobacteria in Antarctic Lake Environments//Algae and Cyanobacteria in Extreme Environments. - 2007. - P.303-320. 67. Smith M.C., Bowman J.P., Scott F.J. et al. 2000. Sublithic bacteria associated with Antarctic quartz stones //Antarct. Sci. - 2000. - V.12. - P.177-184. 68. Stal L.J. Cyanobacterial mats and stromatolites //The Ecology of Cyanobacteria, Kluwer Acad. Publ. - Dordrecht, 2000. - P.61-120. 47

69. Staley J.T., Gosink J.J. Poles apart: biodiversity and biogeography of sea ice bacteria //Annu. Rev. Microbiol. - 1999. - V.53. - P.189-215. 70. Tamaru, Y., Takani Y., Yoshida T. et al. Crucial role of extracellular polysaccharides in desiccation and freezing tolerance in the terrestrial cyanobacterium Nostoc commune //Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - V.71. - P.7327-7333. 71. Tanabe Y., Ohtan S., Kasamatsu N. et al. Photophysiological responses of phytobenthic communities to the strong light and UV in Antarctic shallow lakes //Polar Biol. - 2010. V.33. - P.85-100. 72. Tang E.P.Y, Tremblay R., Vincent W.F. Cyanobacteria dominance of polar freshwater ecosystems: are high latitude mat-formers adapted to low temperature? //J. Phycol. - 1997. V.33. - P.171-181. 73. Tang E.P.Y., Vincent W.F. Strategies of thermal adaptation by high latitude cyanobacteria //New Phytol. - 1999. - V.142. - P.315-323 74. Taton A., Grubisic S., Brambilla E. et al. Cyanobacterial diversity in natural and artificial microbial mats of Lake Fryxell (McMurdo Dry Valleys, Antarctica): a morphological and molecular approach //Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - V.69. - P.5157-5169. 75. Taton A., Grubisic S., Balthasart P. et al. Biogeographical distribution and ecological ranges of benthic cyanobacteria in East Antarctic lakes //FEMS Microbiol. Ecol. - 2006. - V.57. P.272-289. 76. Taton A., Grubisic S., Ertz D. et al. Polyphasic study of Antarctic cyanobacterial strains //J. Phycol. - 2006. - V.42. - P.1257-1270. 77. Turicchia S., Ventura S., Komarkova, J. et al. Taxonomic evaluation of cyanobacterial microflora from alkaline marshes of northern Belize. 2. Molecular and phenotype diversity of oscillatorialean genera //Nova Hedwigia. - 2009. - V.89. - P.165-200. 78. Vaz M.G.G.V., Genurio D.B., Andreote A.P.D.A. et al. Pantanalinema gen. nov. and Alkalinema gen. nov.: novel pseudanabaenacean genera (Cyanobacteria) isolated from saline-alkaline lakes //IJSEM. - 2015. - V.65. - P.298-308. 79. Veillette J., Martineau M.-J., Antoniades D. et al. Effects of loss of perennial lake ice on mixing and phytoplankton dynamics: insights from High Arctic Canada //Ann. Glaciol. 2011. - V.51. - P.56-70. 80. Vincent W.F. Microbial Ecosystems of Antarctica //Cambridge University Press. Cambridge, 1988. - P.304. 81. Vincent W.F., Howard-Williams C., Broady P.A. Microbial communities and processes in Antarctic flowing waters //Antarctic Microbiology. - Wiley-Liss, New York, 1993. - P.543569. 48

82. Vincent W.F., Quesada A. Cyanobacterial responses to UV radiation: implications for antarctic microbial ecosystems //Antarct. Res. Ser. - 1993. - V.62. - P.111-124. 83. Vincent W.F., James M.R. Biodiversity in extreme aquatic environments: lakes, ponds and streams of the Ross streams of the Ross sea sector, Antarctica //Biodiv. Conserv. - 1996. V.5. - P.1451-1472. 84. Vincent W.F., Rae R., Laurion I. et al. Transparency of Antarctic ice-covered lakes to solar UV radiation //Limnol. Oceanogr. - 1997. - V.43. - P.618-624. 85. Vincent W.F. Cyanobacterial dominance in the Polar Regions //The Ecology of Cyanobacteria. - Dordrecht, 2000. - P.321-340. 86. Vincent W.F., Gibson J.A.E., Pienitz R. et al. Ice shelf microbial ecosystems in the high Arctic and implications for life on snowball Earth //Naturwissenschaften. - 2000. - V.87. P.137-141. 87. Vincent W.F. Cold tolerance in cyanobacteria and life in the cryosphere //Algae and cyanobacteria in extreme environments. - Springer, Heidelberg, 2007. - P.289-304. 88. Vincent W.F. Cyanobacteria //Encyclopedia of inland waters. - Elsevier, Oxford, 2009. - V.3. - P.226-232. 89. Vincent W.F, Quesada A. Cyanobacteria in high latitude lakes, rivers and seas //Ecology of Cyanobacteria II. - Springer, Dordrecht, 2012. - P.371-385. 90. Vinocur A., Pizzaro H. Periphyton Xora of some lotic and lentic environments of Hope Bay (Antarctic Peninsula) //Polar Biol. - 1995. - V.15. - P.401-414. 91. Walker V.K., Palmer G.R., Voordouw G. Freeze-thaw tolerance and clues to the winter survival of a soil community //Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - V.72. - P.1784-1792. 92. Welsh D.T. Ecological significance of compatible solute accumulation by micro-organisms: from single cells to global climate //FEMS Microbiol Rev. - 2000. - V.24. - P.263-290. 93. Wynn-Williams D.D. Cyanobacteria in deserts- life at the limit? //The ecology of cyanobacteria. Their diversity in time and space. - Dordrecht, 2000. - P.341-366. 94. Zammit G., Billi D., Albertano P. The subaerophytic cyanobacterium Oculatella subterranea (Oscillatoriales, Cyanophyceae) gen. et sp. nov.: a cytomorphological and molecular description //Eur. J. Phycol. - 2012. - V.47. - P.341-354. 95. http://www.paleopolar.ru/index.php/uroven/39-antarktika/kholmy-larsemann/32-ozerostepped 96. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome 49

Приложение Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1770 (длина последовательности 621 н.) ACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAAAACCCGATGTGCCTACGGGTGAAATATTTATAGC CTGAAGAGGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGCGGTAACGGCGTACCAAGGCG ACGATCAGTAACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGAC GGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTATCAGGG AAGAACACAATGACGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCA GGTGGTTTTGAAAGTTTGCTGTTAAATCGCGAGGCTCAACTTCGTAACGGCGGTGAA AACTTCAAGACTAGAGTTTGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGATATTGGGAAGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGTGACTGGGCCTGAACTGA CACTCATGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCCTGTAGTC Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1771 (длина последовательности 666 н.) TCGGACGGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGACGGGGACAACAGTTGG AAACGGCTGCTAAAACCCGATGTGCCCTTGGGTGAAATATTTATAGCCTGAAGAGGA GCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGCGGTAACGGCGTACCAAGGCGACGATCAGTA ACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAATAC CGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAACACAA TGACGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG GAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTGA AAGTTTGCTGTTAAATCGCGAGGCTCAACTTCGTAACGGCGGTGAAAACTTCAAGAC TAGAGTTTGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTG GGAAGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGTGACTGGGCCTGAACTGACACTCATGGACG AAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTTGTAGTC Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1773 (длина последовательности 544 н.) 50

TTCGGGACAACAGTTAGAAAAGGACTGCTAATACCGGATGTGCCGAGAGGTGAAAG CTTTAGTGCCTGTAGATGAGCTTGCGTCCGATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCCTA CCATGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGAACTGAGA CACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAA GCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGACGAAGGTCTGTGGATTGTAAACCTCTTTT GTTGGGGAAGATAATGACGGTACCCAACGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGC AGCCGCGGTAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTA CGTAGGCTGTTTCATAAGTCTGTTGTCAAAGCGCGAGGCTCAACCTTGTAAAGGCAA TGGAAACTGCGAGACTAGAGAGAGATAGGGGCAGGAGGAATTCCAGGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGATATCTGGAAGAACACCAGTGG Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1774 (длина последовательности 576 н.) AACGGCTGCTAAAACCCGATGTGCCCTTTGGGGTGAAATATTTATAGCCTGAAGATGA GCTCGCGTCTGATTAGCTAGTAGGTGCGGTAACGGCGTACCTAGGCGACGATCAGTAA CTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAATACC GCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGAGTCGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAACACAAT GACGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG GAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTGA AAGTTTGCTGTCAAAGCGCGAGGCTCAACTTCGTACCGGCGGTGAAAACTTCAAGAC TAGAGCTAGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTG GGAAGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGTGACTGGGCCTGAGCTGACACTCATGAACG AAAGGT Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1776 (длина последовательности 478 н.) GGGTGAAATATTTATAGCCTGAAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTAGGTGCGGT AACGGCGTACCTAGGCGACGATCAGTAACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTG GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAA TGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTA AACCTCTTTTATCAGGGAAGAACACAATGACGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAA CTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGG CGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTGAAAGTTTGCTGTCAAAGCGCGAGGCTCAACTT 51

CGTACCGGCGGTGAAAACTTCAAGACTAGAGCTAGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCA GTGTAGCGGTGAAATGCGTAG Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1777 (длина последовательности 577 н.) AACGGCCGGAACGGCCGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGAAACGAATTTCGCCT GAGGATGAGCCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGAC GATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGA GCAACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTCTGGGCTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAG AAGACATGACGGTACTTGAGGAATAAGCCACGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGGGAGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGCG GCCTTGTAAGTCTGTCGTTAAAACGTGGAGCTCAACTCCATTTCAGCGATGGAAACTA CAAGGCTTGAGTGTGGTAGGGGCAGAGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTGGGCCATAACTGACGCTCA TTGACGA Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1778 (длина последовательности 572 н.) ACGGCCGGAAACGGCCGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGAAACGAATTTCGCCT GAGGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCATC GATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGA GCAACGCCGCGTGAGGGACGAAGGCCTCTGGGCTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAA GAAGACATGACGGTACTTGAGGAATAAGCCACGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGGAGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGC GGCCTTGAAAGTCTGTTGTTAAAGCGTGGAGCTCAACTCCATTTCAGCAATGGAAAC TACAAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGCAGAGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCG TAGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTGGGCCATAACTGACGCT CATG Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1779 (длина последовательности 663 н.) 52

CGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAA ACGGCTGCTAAAACCCGATGTGCCCTTGGGTGAAATATTTATAGCCTGAAGAGGAGCT CGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGCGGTAACGGCGTACCAAGGCGACGATCAGTAACT GGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAATACCGC GTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAACACAATGA CGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGA GGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTGAAA GTTTGCTGTTAAATCGCGAGGCTCAACTTCGTAACGGCGGTGAAAACTTCAAGACTA GAGTTTGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGG GAAGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGTGACTGGGCCTGAACTGACACTCATGGACGA AAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1780 (длина последовательности 664 н.) CGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAA ACGGCTGCTAAAACCCGATGTGCCCTTGGGTGAAATATTTATAGCCTGAAGAGGAGCT CGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGCGGTAACGGCGTACCAAGGCGACGATCAGTAACT GGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAATACCGC GTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAACACAATGA CGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGA GGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTGAAA GTTTGCTGTTAAATCGCGAGGCTCAACTTCGTAACGGCGGTGAAAACTTCAAGACTA GAGTTTGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGG GAAGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGTGACTGGGCCTGAACTGACACTCATGGACGA AAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCCTGTAGTC Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1781 (длина последовательности 664 н.) CGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAA ACGGCTGCTAAAACCCGATGTGCCCTTGGGTGAAATATTTATAGCCTGAAGAGGAGCT CGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGCGGTAACGGCGTACCAAGGCGACGATCAGTAACT GGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAATACCGC 53

GTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAACACAATGA CGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGA GGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTGAAA GTTTGCTGTTAAATCGCGAGGCTCAACTTCGTAACGGCGGTGAAAACTTCAAGACTA GAGTTTGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGG GAAGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGTGACTGGGCCTGAACTGACACTCATGGACGA AAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCCTGTAGTC Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1782 (длина последовательности 660 н.) CGGACGGGGTTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGTTGGGGACAACAGTTGG AAACGACTGCTAATACCCAATGTGCCGAGAGGTGAAAGCTTTAGTGCCTGAAGATGA GCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCAGTAG CTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAAGACCG CGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAAGATCTGA CGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGA GGATGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTTCAAG TCTGCTGTTAAAGCGCGAGGCTTAACCTCGTAACGGCGGTGGAAACTGAGAGACTTG AGTATGGTAGGGGTAGCGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGA AGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGCTACTGGGCCATAACTGACACTCATGGACCAAA GCTAGGGGGAGCGAAAGGGATTATATTCCCCCT Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1783 (длина последовательности 661 н.) GACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCCTCAGGAGGGGGATAACGGCCGGAAAC GGCCGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGAAACGAATTTCGCCTGAGGATGAGCCC GCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTG GTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCG TGAGGGATGAAGGCCTCTGGGCTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGACATGACG GTACTTGAGGAATAAGCCACGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGAG TGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGCGGCCTTGTAAGTC TGTCGTTAAAACGTGGAGCTCAACTCCATTTCAGCGATGGAAACTACAAGGCTTGAG TGTGGTAGGGGCAGAGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAA 54

GAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTGGGCCATAACTGACGCTCATGGACGAAAG CCAGGGGAGCGAAAGGGATTAAATACCCCTGTTATCC Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1784 (длина последовательности 666 н.) GACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCCTCAGGAGGGGGATAACGGCCGGAAAC GGCCGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGAAACGAATTTCGCCTGAGGATGAGCCC GCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTG GTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCG TGAGGGATGAAGGCCTCTGGGCTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGACATGACG GTACTTGAGGAATAAGCCACGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGAG TGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGCGGCCTTGTAAGTC TGTCGTTAAAACGTGGAGCTCAACTCCATTTCAGCGATGGAAACTACAAGGCTTGAG TGTGGTAGGGGCAGAGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAA GAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTGGGCCATAACTGACGCTCATGGACGAAAG CCAGGGGAGCGAAAGGGATTAAAATACCCCCTGTAGACCCGG Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1785 (длина последовательности 587 н.) CCTATAGGTTCGGGACAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGGATGTGCCTTCGGGT GAAAGTTTTAATGCCTGTAGATGAGCTTGCGTTCGATTAGCTAGATGGTGAGGTAATG GCTCACCATGGCGACGATCGATAACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGG CGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGACGAAGGTCTGTGGATTGTAAACC TCTTTTGTTGGGGAAGATAATGACGGTACCCAACGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTG CCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAA GCGTACGTAGGCTGTTTCATAAGTCTGTTGTCAAAGCGCGAGGCTCAACCTTGTAAA GGCAATGGAAACTGCGAGACTAGAGAGAGATAGGGGCAGGAGGAATTCCAGGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGTCCTGCTGGAT CTCAACTGACGCTGAAG Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1786 (длина последовательности 661 н.) 55

GGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCCTCAGGAGGGGGATAACGGCCGGAAACGGC CGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGAAACGAATTTCGCCTGAGGATGAGCCCGCG TCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCT GAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG GGATGAAGGCCTCTGGGCTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGACATGACGGTAC TTGAGGAATAAGCCACGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGAGTGGC AAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGCGGCCTTGTAAGTCTGTC GTTAAAACGTGGAGCTCAACTCCATTTCAGCGATGGAAACTACAAGGCTTGAGTGTG GTAGGGGCAGAGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAAGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTGGGCCATAACTGACGCTCATGGACGAAAGCCAG GGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGGTAGTCCGG Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1787 (длина последовательности 486 н.) TAATAGGCTCACCATGGCGACGATCGATAACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGC AATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGACGAAGGTCTGTGGATTG TAAACCTCTTTTGTTGGGGAAGATAATGACGGTACCCAACGAATAAGCATCGGCTAAC TCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGG CGTAAAGCGTACGTAGGCTGTTTCATAAGTCTGTTGTCAAAGCGCGAGGCTCAACCTT GTAAAGGCAATGGAAACTGCGAGACTAGAGAGAGATAGGGGCAGGAGGAATTCCAG GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGTCCTGC TGGATCTCAACTGACGCTGAAG-ACGAATGCG Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1789 (длина последовательности 664 н.) CGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAA ACGGCTGCTAAAACCCGATGTGCCTACGGGTGAAATATTTATAGCCTGAAGAGGAGCT CGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGCGGTAACGGCGTACCAAGGCGACGATCAGTAACT GGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAATACCGC GTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAACACAATGA CGGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGA GGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTGAAA 56

GTTTGCTGTTAAATCGCGAGGCTCAACTTCGTAACGGCGGTGAAAACTTCAAGACTA GAGTTTGGTAGGGGTCACGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGG GAAGAACACCAGCGGCGAAAGCGCGTGACTGGGCCTGAACTGACACTCATGGACGA AAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCC Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1790 (длина последовательности 599 н.) CGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGTTGGGGACAACAGTTGGAA ACGACTGCTAATACCCAATGTGCCGAGAGGTGAAAGCTTTAGTGCCTGAAGATGAGC TCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCAGTAGCT GGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAAGACCGC GTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTATCAGGGAAGAAGATCTGAC GGTACCTGATGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAG GATGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTTTTCAAGT CTGCTGTTAAAGCGCGAGGCTTAACCTCGTAACGGCGGTGGAAACTGAGAGACTTGA GTATGGTAGGGGTAGCGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAA GAACACCAGCGGCGGAAAGCGGCGGCTTA Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16s рРНК штамма CАLU 1791 (длина последовательности 569 н.) ATGACTGCTAATACCGGATGTGCCTTCGGGTGAAAGTTTTAATGCCTGTAGATGAGCT TGCGTTCGATTAGCTAGATGGTGAGGTAATGGCTCACCATGGCGACGATCGATAACTG GTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCG TGAGGGACGAAGGTCTGTGGATTGTAAACCTCTTTTGTTGGGGAAGATAATGACGGT ACCCAACGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGAT GCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTACGTAGGCTGTTTCATAAGTCTG TTGTCAAAGCGCGAGGCTCAACCTTGTAAAGGCAATGGAAACTGCGAGACTAGAGA GAGATAGGGGCAGGAGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAAG AACACCAGTGGCGAAAGCGTCCTGCTGGATCTCAACTGACGCTTAAAATTTCAAAA 57

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв