In vitro селекция направляющей РНК для системы геномного редактирования CRISPR/Cas9

Юшкова Анастасия

In vitro селекция направляющей РНК для системы геномного редактирования CRISPR/Cas9

Система геномного редактирования CRISPR/Cas9 основана на использовании РНК-направляемой нуклеазы – одного из компонентов бактериальной адаптивной иммунной системы. За счёт способности вносить в геномную ДНК направленный двуцепочечный разрыв нуклеаза Cas9 находит широкое применение в качестве инструмента для редактирования геномной ДНК. Одной из актуальных задач при использовании данной системы остается повышение эффективности и специфичности расщепления ДНК-мишени. Ключевым компонентом системы CRISPR/Cas9, адаптированной для целей геномного редактирования, является молекула химерной направляющей РНК. В ее состав входит адресующий фрагмент, комплементарный ДНК-мишени, и неадресующий фрагмент, который имеет сложную пространственную структуру и взаимодействует с Cas9. При выборе направляющих РНК основное внимание сейчас уделяют дизайну адресующего фрагмента. Тем не менее, известно, что нуклеотидная последовательность неадресущего фрагмента направляющей РНК влияет на точность и эффективность расщепления ДНК, поэтому оптимизация нуклеотидной последовательности неадресующего фрагмента этой молекулы также является важной задачей. До настоящего момента ее решали методом рационального дизайна, который основан на тестировании ограниченного набора вариантов РНК. В данной работе впервые предложено использовать молекулярную селекцию новых вариантов sgРНК с измененной последовательностью неадресующего фрагмента из специально сконструированной комбинаторной РНК-библиотеки.

Биология

Дипломы

Вуз: Новосибирский национальный исследовательский государственный университет (НГУ)

ID: 60e41417e4dde5000173cefc

UUID: 03c415f0-c062-0139-3a3d-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: почти 3 года назад

Просмотры: 211

32.34

Юшкова Анастасия

Новосибирский национальный исследовательский государственный университет (НГУ)

Комментировать 2

Рецензировать 1

Скачать - 2,5 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ, НГУ) Факультет естественных наук .. Кафедра молекулярной биологии и биотехнологии . Направление подготовки 06.04.01 Биология (магистратура) . ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ . Юшковой Анастасии Дмитриевны . (Фамилия, Имя, Отчество автора) Тема работы In vitro селекция направляющей РНК для системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 «К защите допущена» Научный руководитель к.х.н., к.х.н., с.н.с. зам. заведущего кафедрой ЛХРНК ИХБФМ СО РАН Мызина С.Д./………….. Воробьева М.А./………... (фамилия, И., О.) / (подпись) (фамилия, И., О.) / (подпись) «…» июня 2021 г. «…» июня 2021 г. Новосибирск, 2021

Оглавление Список используемых сокращений .............................................................................................4 Введение .........................................................................................................................................5 1. Дизайн направляющих РНК для систем геномного редактирования CRISPR (обзор литературы) ....................................................................................................................................7 1.1. Система геномного редактирования CRISPR/Cas9 .........................................................7 1.2. Рациональный дизайн sgРНК ..........................................................................................11 1.2.1. Инструменты и алгоритмы для дизайна sgРНК ......................................................11 1.2.2. Дизайн структуры спейсера ......................................................................................12 1.2.3. Дизайн повтор-антиповторного дуплекса ...............................................................14 1.2.4. Химические модификации sgРНК ............................................................................15 1.3. Система геномного редактирования CRISPR/Cpf1 (Сas12a) ........................................16 1.4. Рациональный дизайн crРНК ...........................................................................................18 1.4.1. Дизайн 5’-концевой области .....................................................................................18 1.4.2. Дизайн структуры спейсера ......................................................................................19 1.4.3. Влияние длины crРНК на эффективность и специфичность СRISPR/Cpf1 .........20 1.4.4. Химические модификации crРНК ............................................................................21 2. Материалы и методы ...............................................................................................................23 2.1. Материалы .........................................................................................................................23 2.2. Основные методы работы ................................................................................................25 2.2.1. Аналитический электрофорез в ПААГ ....................................................................25 2.2.2. Препаративный электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях .................25 2.2.3. Аналитический электрофорез в агарозном геле ......................................................25 2.2.4. Выделение ДНК-мишени препаративным гель-электрофорезом .........................26 2.2.5. Синтез Сy5-конъюгатов олигонуклеотидов ............................................................26 2.2.6. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с биотином ................................................27 2.2.7. Синтез дцДНК-библиотеки .......................................................................................27 2.2.8. Транскрипция in vitro с использованием РНК-полимеразы фага T7 ....................28 2.2.9. Иммобилизация биотилинированной дцДНК-мишени на стрептавидинмодифицированных магнитных частицах .........................................................................28 2.2.10. Селекция in vitro .......................................................................................................29 2.2.11. Выделение РНК из иммобилизованного комплекса .............................................30 2.2.12. Обратная транскрипция ...........................................................................................30 2.2.13. Полимеразная цепная реакция ................................................................................30 2

2.2.14. Очистка дцДНК после проведения ОТ-ПЦР на магнитных частицах CleanMag DNA .......................................................................................................................................31 2.2.15. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ..............................31 2.2.16. Исследование и сравнение эффективности формирования тройного комплекса РНК:Cas9:ДНК методом задержки в геле ..........................................................................31 2.2.17. Исследование и сравнение эффективности расщепления ДНК-мишени в тройном комплексе РНК:Cas9:ДНК ...................................................................................32 3. Результаты и обсуждение .......................................................................................................33 3.1. Конструирование модельной системы для in vitro cелекции .......................................33 3.1.1. Исследование возможности конструирования комбинаторной библиотеки на основе sgРНК ........................................................................................................................34 3.1.2. Выделение ДНК-мишени и синтез Cy5-конъюгатов ..............................................37 3.1.3. Исследование сборки комплекса sgРНК:Cas9:ДНК методом задержки в геле....38 3.1.4. Исследование расщепления ДНК в тройном комплексе Cas9:sgРНК:ДНК .........39 3.2. Получение комбинаторной библиотеки sgРНК .............................................................40 3.2.1. Конструирование комбинаторной библиотеки РНК ..............................................40 3.2.2. Синтез комбинаторной библиотеки sgРНК .............................................................41 3.3. Оптимизация условий in vitro селекции .........................................................................43 3.3.1. Выделение комплексов с использованием магнитных частиц Dynabeads М-28044 3.3.2. Выделение комплексов с использованием магнитных частиц NEB Streptavidin 48 3.4. In vitro селекция направляющих sgРНК в оптимизированных условиях ...................49 3.4.1. Сравнительное исследование функциональной активности sgРНК-библиотек ..52 3.5. Заключение ........................................................................................................................56 4. Выводы .....................................................................................................................................57 Список литературы ......................................................................................................................58 3

Список используемых сокращений В работе использованы следующие сокращения: BP – краситель бромфеноловый синий Cas – CRISPR associated proteins; CRISPR-ассоциированные белки Cpf1 – CRISPR associated proteins from Prevotella and Francisella 1; CRISPRассоциированные белки из Prevotella and Francisella 1 CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами crРНК – CRISPR-ассоциированная РНК Cy5 – флуоресцентный краситель цианин 5 DMF – N, N-диметилформамид DMSO – диметилсульфоксид EDTA – этилендиаминтетрауксусная кислота EtBr – 3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид (бромистый этидий) hp-crРНК – crРНК со шпилькой на 3’-конце в направляющей области hp-sgРНК – sgРНК с расширенной шпилькой на 5’-конце в области повторантиповторного дуплекса PAM – protospacer adjacent motif; мотив, прилегающий к протоспейсеру SELEX – Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment; систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения sgРНК – single guide РНК; химерная единая направляющая РНК, которая объединяет в своем составе адресующую crРНК и транс-активирующую tracrRNA tracrРНК – транс-активируемая РНК XC – краситель ксиленцианол FF дцДНК – двуцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота е.а. – единица активности фермента нт – нуклеотид о.е. – оптические единицы пре-crРНК – незрелая форма crРНК, транскрибируемая с локуса CRISPR ПААГ – полиакриламидный гель ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота Трис – трис(гидроксиметил)аминометан 4

Введение Создание инструментов для направленного редактирования геномной ДНК является одной из наиболее динамично развивающихся областей молекулярной биологии. Особенный интерес вызывает система CRISPR/Cas9, основанная на использовании РНКнаправляемой нуклеазы – одного из компонентов бактериальной адаптивной иммунной системы. В настоящее время разработан ряд технологий редактирования генома с использованием нуклеазы Cas9, способной вносить в геномную ДНК направленный двуцепочечный разрыв [1]. Тем не менее, до сих пор полностью не решены такие важные проблемы, как недостаточно высокая эффективность и специфичность расщепления ДНКмишени. Одним из ключевых компонентов системы CRISPR/Cas9, адаптированной для целей геномного редактирования, является молекула химерной единой направляющей РНК (single guide РНК, sgРНК), последовательность которой определяет точность и эффективность расщепления ДНК-мишени. sgРНК объединяет в составе единой молекулы вариабельную адресующую CRISPR-РНК (crРНК), которая состоит из короткой программируемой 20-нуклеотидной области, комплементарной ДНК-мишени, и трансактивирующую РНК (tracrРНК), непосредственно взаимодействующую с Cas9 [2]. Неадресующий фрагмент sgРНК имеет сложную пространственную структуру, взаимодействует с белком Cas9 и определяет строение РНК-белкового комплекса в целом, а следовательно, и его свойства. Поэтому, изменяя последовательность sgРНК в области неадресующего фрагмента, можно повлиять на ключевые характеристики системы CRISPR/Cas9 – точность и эффективность расщепления ДНК. До настоящего момента для оптимизации неадресующей части sgРНК использовали метод рационального дизайна, основанный на тестировании ограниченного набора вариантов sgРНК со структурными и химическими модификациями [3]. Однако перспективной основой для повышения эффективности и специфичности нуклеазы Cas9 могут стать sgРНК, полученные методом молекулярной селекции из специально сконструированных комбинаторных РНК-библиотек. Традиционно метод молекулярной селекции, известный также как молекулярная эволюция in vitro или SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), используют для получения аптамеров – функциональных РНК или ДНК, способных с уникальной специфичностью узнавать заданные молекулярные и супрамолекулярные мишени [4]. Кроме того, с помощью молекулярной селекции можно выявлять природную специфичность взаимодействия НК-связывающих белков с определенными последовательностями и/или структурами нуклеиновых кислот [5]. 5

В лаборатории химии РНК ИХБФМ СО РАН ведется разработка нового метода повышения эффективности и точности расщепления ДНК адресуемой нуклеазой Cas9, основанного на контролируемой эволюции неадресующего фрагмента sgРНК, и создание новых вариантов sgРНК для системы CRISPR/Cas9. Целью данной работы является in vitro селекция новых вариантов направляющей РНК для системы геномного редактирования CRISPR/Cas9. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1) Создание модельной системы для in vitro селекции; 2) Получение комбинаторной библиотеки sgРНК; 3) Разработка протокола in vitro селекции новых вариантов sgРНК в системе, включающей в себя рекомбинантную нуклеазу Cas9, ДНК-мишень и комбинаторную библиотеку РНК; 4) In vitro селекция sgРНК и исследование функциональной активности полученных РНКбиблиотек. Основные результаты получены лично автором работы. 6

1. Дизайн направляющих РНК для систем геномного редактирования CRISPR (обзор литературы) 1.1. Система геномного редактирования CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas – это система приобретенного иммунитета бактерий и архей, направленная на уничтожение проникшей в клетку чужеродной ДНК. Масштабное изучение CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, короткие регулярно расположенные палиндромные кластерные повторы) началось в 1993 году, когда в геноме археи Haloferax mediterranei были обнаружены повторяющиеся последовательности, разделѐнные промежутками. К 2005 году система CRISPR была обнаружена у 20 микроорганизмов, были открыты гены Cas и установлено, что спейсеры соответствуют последовательностям геномов бактериофагов и участкам плазмид, указывая на связь локусов CRISPR с приобретенным иммунитетом прокариот [6, 7]. Все известные системы CRISPR/Cas делятся на два класса, которые включают в себя пять типов и 16 подтипов [8]. В настоящее время в качестве инструмента для направленного редактирования геномной ДНК, как при решении фундаментальных задач, так и для целей персонализированной медицины, широко применяется система CRISPR/Cas II типа – СRISPR/Cas9, в которой мультибелковый эффекторный комплекс заменѐн единственной РНК-направляемой нуклеазой Cas9, вовлечѐнной во все этапы работы данной системы [Ошибка! Закладка не определена.]. CRISPR или CRISPR-кассета представляет собой особые локусы, состоящие из повторяющихся нуклеотидных последовательностей, которые разделены в свою очередь уникальными последовательностями – спейсерами. Спейсеры идентичны различным участкам фагов и другим генетическим элементам, когда-либо проникавшим в эту клетку [8]. Основными компонентами природной системы являются CRISPR-ассоциированная нуклеаза (Cas9) и две молекулы РНК: CRISPR-ассоциированная РНК (crРНК), которая содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную ДНК-мишени, и трансактивирующая РНК (tracrРНК), взаимодействующая с crРНК и белком Cas9. Механизм работы системы CRISPR/Cas, схематично изображенный на рис. 1, включает в себя три этапа: 1) адаптация, или приобретение спейсеров, 2) экспрессия и образование crРНК и 3) интерференция. Во время стадии адаптации чужеродная ДНК нарезается на мелкие фрагменты (30– 40 нуклеотидов длиной), которые встраиваются в локус CRISPR в качестве новых спейсеров. Встраивание нового спейсера происходит между лидерной последовательностью и первым спейсером, при этом первый повтор удваивается [9]. 7

Рисунок 1. Механизм работы системы CRISPR/Cas9 [9]. Во время второго этапа происходит транскрипция локуса CRISPR в предшественник CRISPR-РНК (пре-crРНК), после чего tracrРНК комплементарно связывается с участками повторов в пре-crРНК, и процессинг незрелой пре-crРНК РНКазой III. Пре-crРНК нарезается на короткие фрагменты, содержащие спейсер и участок повтора, связанный с tracrРНК (рис. 1). На этапе интерференции образовавшаяся crРНК и связанная с ней tracrРНК связываются с нуклеазой Cas9, в результате чего образуется рибонуклеопротеидный комплекс crРНК:tracrРНК:Cas9, который узнает нуклеотидную последовательность протоспейсера ДНК-мишени, содержащую PAM (protospacer adjacent motif, прилежащий к протоспейсеру мотив) (рис. 1). PAM представляет собой короткую (2–3 нуклеотида) консервативную последовательность, которая необходима для узнавания и встраивания протоспейсера в локус CRISPR, а также для распознавания чужеродного генетического элемента в клетке [10]. После комплементарного связывания последовательности сrРНК с протоспейсером мишени происходит разрушение мишени нуклеазой Cas9 путѐм внесения двуцепочечного разрыва доменами HNH и RuvC на расстоянии в три нуклеотида от PAM с образованием тупых концов (рис. 1) [11]. В настоящее время в большинстве исследований по редактированию геномной ДНК для нуклеазы Cas9, как правило, используют единую направляющую РНК (single guide РНК, sgРНК) длиной от 95 до 250 нт, которая объединяет в своем составе вариабельную адресующую crРНК и инвариабельную транс-активирующую tracrRNA [2]. 8

На рисунке 2 представлена sgРНК для нуклеазы Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9) длиной 98 нт. Последовательность вариабельной части состоит из направляющей области или спейсера (20 нт), который включает в себя затравку в PAM-проксимальной области (10–12 нт от PAM), и повтора (12 нт). Последовательность инвариабельной части состоит из анти-повтора (14 нт) и трѐх шпилек с петлями на конце, образующих сложную пространственную структуру [12]. Направляющая область sgРНК (1–20 нт) и ДНК-мишень формируют гетеродуплекс. Повтор (21–32 нт) и антиповтор (37–50 нт) образуют повтор–антиповторный дуплекс (U22:A49 – A26:U45 и G29:C40 – A32:U37). В этой области нуклеотиды G27, A28, A41, A42, G43 и U44 являются неспаренными, а A28 и U44 выворачиваются из дуплекса. Нуклеотиды G27 и A41 участвуют в стэкинг-взаимодействиях с парами A26:U45 и G29:C40, соответственно, стабилизируя дуплексную структуру. Фосфатные группы направляющей области sgРНК (2, 4–6 и 13–20 нт) в основном взаимодействуют с доменом REC1 и со спиралью SpCas9 (Arg63, Arg66 , Arg70, Arg71, Arg74 и Arg78). Таким образом, PAM-проксимальная область размером 10–12 нт является критической для расщепления ДНК-мишени, опосредованного Сas9 [13]. Повтор– антиповторный дуплекс также распознается REC1-доменом. PAM-дистальная область (C30:G39 – A32:U37) не распознается SpCas9 и выступает из комплекса. Концевой фрагмент sgРНК (68–96 нт) активно взаимодействует с положительно заряженной поверхностью Cas9 и состоит из трѐх шпилек: первая шпилька (G53:C61 – C55:G58) с петлей из двух нуклеотидов (U56, A57) и однонуклеотидной петлей (U59) соединена со второй шпилькой линкером длиной 5 нт (63–67 нт); вторая шпилька (A69:U80 – U72:A77) с петлей из четырех нуклеотидов (G73, A74, A75, A76); третья шпилька (G82:C96 – G87:C91) с петлей из одного нуклеотида (G89) [12]. Шпилька 1 необходима для образования функционального комплекса Cas9:sgРНК, в то время как шпильки 2 и 3 стабилизируют образовавшийся комплекс. Шпилька 1 распознается SpCas9 доменами REC1 и PI. Фосфатные группы линкера между первой и второй шпильками (63–65 и 67 нт) взаимодейcтвуют главным образом с доменом RuvC и доменом PI. Шпилька 2 и шпилька 3 распознаются SpCas9 доменом RuvC [12]. 9

Рисунок 2. Схематичное изображение комплекса sgРНК c ДНК-мишенью. Направляющая область и повтор sgРНК окрашены в голубой и синий цвета, соответственно. Последовательность tracrРНК окрашена в красный цвет, область линкера – в фиолетовый цвет. Канонические и неканонические пары оснований обозначены черными и серыми линиями, соответственно. В пунктирных рамках – неупорядоченные нуклеотиды [12]. В сайте-мишени ДНК-субстрата обычно выделяют протоспейсер, комплементарный 5’-концевой протоспейсеру последовательности последовательность sgРНК, и непосредственно примыкающую PAM – 5’-NGG-3’ 3). (рис. к Оптимальной нуклеотидной последовательностью PAM для нуклеазы Cas9 является 5’-NGG-3’. Однако SpCas9 может также связываться с PAM-последовательностями 5’-NAG-3’ или 5’-NGA-3’. sgРНК связывается с ДНК-мишенью с образованием R-петли, содержащей целевой гетеродуплекс, повтор–антиповторный дуплекс и шпильки с петлями на конце. 10

Рисунок 3. Схематичное изображение комплекса Cas9 с направляющей sgРНК и дцДНКмишенью. Одна из актуальных проблем в области использования системы CRISPR/Cas9 для редактирования эукариотических геномов – недостаточная специфичность расщепления ДНК-мишени (наличие «off-target» сайтов). Комплекс Cas9:sgРНК может вносить разрыв в ДНК-мишень, содержащую до трех, реже – пяти несовпадающих нуклеотидов [14]. В большинстве случаев нецелевая активность CRISPR/Cas9 представляет собой нежелательный побочный эффект, от которого пытаются избавиться. Для этого было предложено несколько стратегий. Так, было показано, что простое уменьшение количества активных молекул Cas9 в клетке позволяет снизить нецелевую активность Cas9. Однако в итоге также падает и целевая активность системы [15]. Также с нецелевой активностью коррелирует и стабильность комплекса Cas9:sgРНК на геномной ДНК [16]. В ряде работ было показано, что модификации sgРНК также позволяют уменьшить нецелевую активность системы CRISPR/Cas9 и улучшить эффективность расщепления ДНК-мишени. Более подробно различные подходы к конструированию и модификациям sgРНК будут рассмотрены ниже. 1.2. Рациональный дизайн sgРНК 1.2.1. Инструменты и алгоритмы для дизайна sgРНК Основная задача при конструировании sgРНК заключается в поиске сайтовмишеней в геноме, что довольно легко реализовать путем поиска последовательностей PAM. Но как показывает практика, обнаруженные сканированием генома на РАМпоследовательности сайты не равнозначны с точки зрения эффективности и специфичности их расщепления с помощью Cas9. Теоретически, если 5’-конец направляющей области sgРНК является комплементарным последовательности ДНК, то 11

нуклеаза Cas9 в комплексе с sgРНК должна связываться с целевым сайтом и производить расщепление, но на практике эффективность расщепления значительно варьирует среди различных sgРНК [2, 14]. Как уже было сказано выше, другой проблемой является низкая специфичность или высокая активность расщепления нецелевых сайтов, обусловленная как последовательностью sgРНК, так и особенностями конкретных вариантов Cas9 [17]. Таким образом, остается актуальной задача повышения специфичности sgРНК и разработки аналитических моделей для определения целевых сайтов и прогнозирования эффективности их расщепления. Для этого были разработаны различные алгоритмы дизайна направляющей области и последовательности PAM sgРНК, основанные на экспериментальных данных. Например, в работе [18] анализировали сайты-мишени 128 генов, где каждому гену соответствовало 10 различных sgРНК. Полученные данные использовали для построения модели, позволяющей прогнозировать активность sgРНК с учѐтом выбранных признаков. Данная модель интегрирована в онлайн-инструмент под названием «CRISPRscan». Также было показано, что высокое содержание гуанозина в последовательности sgРНК способствует еѐ стабильности и повышенной активности. После анализа 1841 различных последовательностей sgРНК и сайтов-мишеней для шести генов мыши и трех генов человека была предложена модель для прогнозирования эффективности sgРНК. В ней учитывались такие критерии, как расположение сайтамишени в гене, количество нуклеотидов в последовательности sgРНК, положение которых не влияет на эффективность расщепления ДНК-мишени [19]. В настоящее время данная модель используется для оценки активности sgРНК в онлайн-инструментах «GuideScan», «CHOPCHOP» и «CRISPOR». Таким образом, алгоритмы дизайна sgРНК позволяют конструировать sgРНК с повышенной специфичностью расщепления ДНК-мишени, однако использование какойто одной определенной модели не всегда позволяет это сделать надежно и эффективно. Поэтому, многие онлайн-инструменты предоставляют расширенные возможности для выбора подходящей модели по разработке sgРНК или предлагают несколько результатов, рассчитанных по широко используемым моделям. 1.2.2. Дизайн структуры спейсера Длина направляющей области sgРНК является важным критерием специфичности Cas9-опосредованного расщепления ДНК-мишени. Добавление двух дополнительных гуаниновых нуклеотидов на 5’-конец молекулы sgРНК (модификация «GGX20») приводило к уменьшению неспецифической активности без снижения целевой активности 12

для большей части протестированных sgРНК. Этот эффект, по-видимому, достигался за счет изменения стабильности связывания sgРНК с ДНК-мишенью или вторичной структуры sgРНК [20]. Укорочение 5’-конца sgРНК на три нуклеотида (длина спейсера – 17 нт) также сильно снижало нецелевую активность из-за уменьшения энергии связывания комплекса Cas9:sgРНК с ДНК, обеспечивая более точное редактирование генома (1–2 несовпадающих нуклеотида в ДНК-мишени) [21, 22]. В то же время sgРНК со спейсером длиной 20 нт не обеспечивали такого точного расщепления ДНК: количество несовпадающих нуклеотидов в несовершенных ДНК-мишенях, которые подвергались расщеплению, достигало пяти [23]. Однако sgРНК с 17–18 нт спейсером одновременно со сниженной нецелевой активностью демонстрировали меньшую эффективность расщепления ДНК-мишени по сравнению с sgРНК со спейсером длиной от 19 до 20 нт [24]. Примечательно, что укорочение направляющей области sgРНК до 14 или 15 нт может обеспечивать эффективное связывание SpCas9 с ДНК-мишенью без внесения двуцепочечного разрыва в последовательность ДНК, что позволяет контролировать нуклеазную активность SpCas9 [25]. В работе [26] было продемонстрировано влияние удлинения 5’-концевого фрагмента sgРНК на связывание Cas9 с ДНК-мишенью, зависящее как от длины, так и от вторичной структуры спейсера. Удлинение 20-нуклеотидного спейсера фрагментом без образования вторичной структуры снижало эффективность связывания. Добавление к спейсеру фрагментов, которые формируют слабые вторичные структуры, не оказывало дополнительных значимых эффектов на связывание Cas9, кроме тех, которые вызваны влиянием длины. В то же время более стабильные шпильки в области спейсера вызывали заметное снижение эффективности связывания Cas9 с ДНК. Кроме того, снижение эффективности связывания происходит, когда РНК-шпилька находится в затравочной области sgРНК, важной для инициирования взаимодействия Cas9 с ДНК-мишенью. Для улучшения алгоритмов по разработке дизайна sgРНК была предпринята попытка статистического анализа связи между нуклеотидной последовательностью sgРНК и эффективностью разрезания целевого участка генома. В работе [27] с помощью нуклеазного теста распределенных по оценивали геному активность мыши, при более этом двухсот были sgРНК, равномерно обнаружены следующие закономерности. На активность sgРНК влияют нуклеотиды в положениях 2, 3, 6 и 20, если считать от 5’-конца sgРНК. Двадцатый нуклеотид sgРНК, предваряющий PAMпоследовательность, важен для инициирования расплетания дцДНК и стабилизации тройного комплекса Cas9:sgРНК:ДНК. Варианты sgРНК, содержащие в этом положении аденозин, как правило, показывают низкую активность. 13

Интересно, что наличие определенных нуклеотидов в положениях 2 (Т), 3 (G), и 6 (A), тоже отрицательно влияло на активность sgРНК. Положения 1, 2, 7, 18 и 19 в PAMдистальной области оказались наименее чувствительными к делециям, которые почти не влияли на эффективность расщепления ДНК-мишени и даже в некоторых случаях еѐ увеличивали. Однако делеции и добавление дополнительных нуклеотидов в PAMпроксимальной области ингибировали активность sgРНК [28]. Традиционно считается, что 5’-конец sgРНК (дистальный от PAM) не играет большой роли в распознавании целевого участка в геноме [27]. Авторы процитированной работы предполагают, что ослабленные взаимодействия нуклеотидов 2 и 4–6 с Rec1-доменом нуклеазы Cas9 снижают эффективность связывания комплекса с ДНК. Также с эффективностью расщепления ДНК положительно коррелировали сбалансированный G/C-состав sgРНК (40–60%), наличие аденозина в положениях 5–12 и гуанозина в положениях 14–17 [27]. Эти закономерности можно использовать при создании sgРНК для решения конкретных экспериментальных задач. 1.2.3. Дизайн повтор-антиповторного дуплекса В работе [26] также изменяли структурные параметры, оказывающие влияние на стабильность шпильки и кинетику образования R-петли: наличие неканонических пар оснований и внутренней петли, длину и расположение стебля шпильки вдоль области спейсера (рис. 4). Были сконструированы sgРНК с расширенной шпилькой на 5’-конце в области повтор-антиповторного дуплекса (hp-sgРНК). Рисунок 4. Варианты дизайна шпильки на 5’-конце в области повтор-антиповторного дуплекса sgРНК [26]. Полученные шпилечные структуры могут служить стерическим и энергетическим барьером для формирования R-петли при связывании в нецелевых сайтах. Образование Rпетли является критически значимым процессом, регулирующим конформационный переход Cas9 в активную форму. Его ингибирование блокирует активность нуклеазы вне мишени и приводит к увеличению специфичности системы CRISPR/Cas9. Кроме того, 14

чтобы контролировать любые эффекты длины sgРНК, были разработаны укороченные с 5’-конца sgРНК (tru-sgРНК). Все hp-sgРНК повышали специфичность Cas9 на несколько порядков, по сравнению с tru-sgРНК. hp-sgРНК, которая обеспечивала максимальное увеличение специфичности, содержала как укороченный 5’-концевой фрагмент, так и фрагмент с искусственно созданной вторичной структурой, что говорит о принципиальной возможности объединения двух этих подходов. В работе [12] было исследовано значение каждого структурного компонента sgРНК для работы SpCas9. Для этого были протестированы sgРНК с мутациями в повторантиповторном дуплексе, в линкере и в трѐх шпильках с петлями на конце. Было показано, что в то время как шпильки 2 и 3, а также линкерная область толерантны к большому количеству мутаций, нуклеотидные последовательности повтор- антиповторного дуплекса и шпильки 1 критически значимы для SpCas9-опосредованного расщепления ДНК-мишени. Например, замена в повтор-антиповторном дуплексе sgРНК нуклеотида G43, образующего водородные связи с SpCas9, на цитозин снижала активность SpCas9 более чем в 3 раза. Замена U44 на гуанозин приводила к более чем 5кратному падению активности расщепления ДНК-мишени, тогда как замена U44 на цитозин не оказывала значительного влияния на активность расщепления. Пара оснований G21:U50 в этой области также является высококонсервативной среди систем CRISPR/Cas II типа [29]. Важно отметить, что sgРНК, лишенные линкерной области и шпилек 2 и 3, способны инициировать Cas9-опосредованное расщепление ДНК, хотя и с меньшей эффективностью, тогда как удаление шпильки 1 полностью ингибирует расщепление ДНК-мишени [30]. Эти результаты подчеркивают функциональную значимость повтор– антиповторного дуплекса и шпильки 1 при образовании комплекса Cas9 с sgРНК. Предыдущие исследования показали, что sgРНК, которая содержит 48- нуклеотидный фрагмент tracrРНК (sgРНК (+48)), образующий шпильку 1, является минимальной структурой для индукции Cas9-катализируемого расщепления ДНК in vitro [2]. Однако sgРНК с добавлением удлиненных tracrРНК – sgРНК (+67) со шпильками 1–2 и sgРНК (+85) со шпильками 1–3 – резко улучшали эффективность расщепления Cas9 in vivo, повышая стабильность связывания sgРНК с белком и способствуя образованию активного комплекса Cas9:sgРНК [15]. 1.2.4. Химические модификации sgРНК Модификация сахарофосфатного остова РНК является общепринятой стратегией повышения ее устойчивости в биологических средах [31]. На сегодняшний день различными исследовательскими группами был предложен и проанализирован ряд 15

химических модификаций sgРНК. Было показано, что, подобно мутациям, любые химические модификации в PAM-дистальной области sgРНК влияют на нуклеазную активность в меньшей степени, чем модификации в PAM-проксимальной области [28]. В работе [32] было продемонстрировано, что введение 2’-O-метил и 2’-Fмодификаций в положения 1, 12, 15 и 18 в PAM-дистальной области sgРНК не препятствовало образованию каталитически активного комплекса Cas9:sgРНК и приводило к умеренному повышению эффективности расщепления ДНК-мишени. Однако 2’-O-метил-модификации негативно влияли на целевую активность sgРНК по сравнению с 2’-F-модификациями. Что касается химических модификаций в PAM-проксимальной области sgРНК, то 2’-O-метил-модификации в положениях 22–27, 43–45, 47, 49, 51, 58, 59 (область повтор-антиповторного дуплекса и шпильки 1), 62–65, 68, 69, 82 приводили к полной инактивации sgРНК. Дальнейшее изучение показало, что 2’-ОН-группы нуклеотидов в данных положениях взаимодействуют с Cas9. Модификация же оставшихся нуклеотидов в PAM-проксимальной области sgРНК, не взаимодействующих с нуклеазой, сохраняет активность sgРНК, значительно увеличивая эффективность расщепления ДНКмишени in vivo. Специфичность sgРНК также может быть улучшена путем модификации нуклеотидов 2’-O-метил/тиофосфоноацетатом (MSP) в составе 3’- или 5’-концевых фрагментов молекулы. Снижение нецелевой активности наблюдалось при введении модифицированных нуклеотидов в положения 4, 5, 7, 9–12, 14 и 16, модификации в положениях 5 и 11 были особенно эффективны. Модифицированные sgРНК, содержащие 2’-O-метильные группы в сочетании с тиофосфатными модификациями фосфодиэфирных связей на 5’- и 3’-концах, демонстрировали высокую стабильность и эффективность расщепления ДНК, но при этом снижали специфичность расщепления мишени [33]. Описанные выше данные показывают, что возможно повысить специфичность и эффективность Сas9-опосредованного редактирования генома путем включения химических модификаций в sgРНК. В некоторых случаях количество модифицированных нуклеотидов в составе sgРНК может достигать 80%. Основное правило, которому необходимо следовать при разработке химически модифицированных sgРНК – избегать модификаций нуклеотидов, гидроксильные группы которых взаимодействуют с Cas9 [28]. 1.3. Система геномного редактирования CRISPR/Cpf1 (Сas12a) CRISPR-ассоциированные нуклеазы из других семейств также имеют большой потенциал для сайт-специфичного редактирования генома. В частности, эндонуклеаза 16

Cpf1 или Сas12a (V тип CRISPR систем) является функциональным аналогом нуклеазы Cas9 и имеет ряд преимуществ. Cpf1 представляет собой мономерный белок, состоящий из 1200–1500 аминокислот. Зрелая направляющая РНК Cpf1 (~44 нт) короче, чем направляющая РНК Cas9 (~100 нт). Ассоциированный с Cpf1 CRISPR-массив состоит из девяти спейсерных последовательностей, которые разделены 36 длинными повторами. Cpf1 распознает PAM вида 5’-TTN-3’, при этом сайт прилегает к 5’-концу направляющей РНК. Двуцепочечный разрыв вносится в ДНК на расстоянии примерно 20 п.н. от PAM с образованием липких концов (рис. 5). Рисунок 5. Сравнение систем CRISPR/Cas9 и СRISPR/Cpf1. Стрелками показаны сайты расщепления ДНК. Поскольку белок Cpf1 одновременно обладает активностью РНКазы и ДНКазы, он не использует tracrРНК для расщепления ДНК и для биогенеза crРНК: вместо этого преcrРНК образует псевдоузел, который в свою очередь распознается и расщепляется самим Cpf1. Зрелая crРНК, которая представлена на рисунке 6, состоит из 42–44 нуклеотидов, которые содержат 19-нуклеотидный повтор и спейсер (направляющая последовательность) длиной в 23–25 нуклеотидов. Повтор образует шпильку с петлей на конце, которая состоит из пяти Уотсон-Криковских пар оснований, неканонической пары оснований U-U, тетрануклеотидной петли UCUU и одноцепочечного 5’-концевого фрагмента из четырех нуклеотидов. Спейсер, комплементарный ДНК-мишени, содержит область затравки длиной восемь нуклеотидов [34]. Область затравки располагается в начальной части спейсера и играет значительную роль в специфичности работы системы 17

CRISPR/Cpf1. Важно отметить, что в случае системы Cpf1 разрыв в ДНК возникает на значительном удалении от затравочной области, и последующее введение вставки не нарушает сайта узнавания (в отличие от Cas9), что позволяет в дальнейшем при необходимости редактировать данный фрагмент ДНК с использованием той же самой направляющей crРНК [35, 36]. Рисунок 6. Схематичное изображение зрелой направляющей crРНК [36]. 1.4. Рациональный дизайн crРНК 1.4.1. Дизайн 5’-концевой области В работе [37] для структурных модификаций был выбран 5’-конец crРНК, так как в комплексе Cpf1:crРНК этот фрагмент crРНК открыт и потенциально пригоден для модификаций. Для того, чтобы определить, влияет ли удлинение 5’-концевого фрагмента crРНК на повышение эффективности геномного редактирования, использовали репортерную систему GFP-HEK. Все crРНК с удлинениями от 4 до 25 нуклеотидов, не образующими шпильки на 5’-конце, демонстрировали повышение эффективности Сpf1опосредованного расщепления ДНК-мишени в электропорированных клетках на 25–60% по сравнению с crРНК без удлинения. Кроме того, эффективность редактирования генома как in vitro, так и in vivo, после доставки катионными носителями значительно увеличивалась в комплексе Cpf1 с crРНК с удлинением в 59 нт на 5’-конце. По данным рентгеноструктурного анализа, Cpf1 напрямую взаимодействует с 5’концевым фрагментом crРНК [34, 38]. Таким образом, химические модификации на 5’конце неудлиненной crРНК нарушают взаимодействие между crРНК и Cpf1, что может привести к потере нуклеазной активности Cpf1 [39]. Однако возможно введение химических модификаций без снижения эффективности работы системы CRISPR/Cpf1, если 5’-концевой фрагмент crРНК удлинен, поскольку в этом случае нуклеотиды, 18

взаимодействующие с белком Cpf1, можно оставить немодифицированными. Это дает возможность введения в состав 5’-концевого фрагмента crРНК химических модификаций, которые могут потенциально улучшить доставку Cpf1 в терапевтических целях ex vivo и in vivo и повысить устойчивость crРНК к гидролизу сывороточными рибонуклеазами [37]. 1.4.2. Дизайн структуры спейсера В работе [40] была сконструирована crРНК, содержащая спейсер длиной в 20 нт с нависающими нуклеотидами на 3’-конце. Было протестировано четыре crРНК, каждая из которых содержала AAA (A3), U3, G3 или C3 3’-нависающие фрагменты. сrРНК с U3 3’нависанием показала высокую эффективность расщепления по сравнению с канонической crРНК, длина направляющей последовательности которой составляет 23 нуклеотида. Этот результат был подтвержден в экспериментах, проведенных для трех дополнительных генов-мишеней. Таким образом, оптимальная длина спейсера для crРНК – 20 нуклеотидов вне зависимости от последовательности мишени в том случае, если с 21 положения следует олигоуридилатный 3’-концевой фрагмент. Для определения оптимальной длины олигоуридилатного 3’-нависающего фрагмента, которая обеспечивала бы максимальную эффективность расщепления дцДНКмишени in vivo и in vitro, использовали ампликоны, кодирующие crРНК, и химически синтезированную crРНК с различной длиной олигоуридилатного фрагмента, соответственно. Максимальный процент расщепления дцДНК был получен для crРНК, содержащей на 3’-конце октауридилат. Дальнейшее увеличение длины не оказало значительного влияния на эффективность расщепления дцДНК. Кроме того, эффективность расщепления crРНК с U8 3’-нависанием примерно в 2 раза выше, чем у канонической crРНК, а наличие олигоуридилатной последовательности на 3’-конце не влияет на нецелевую активность Cpf1: количество нецелевых сайтов для канонической и удлиненной crРНК существенно не различалось. Можно предположить, что присутствие олигоуридилатного нависающего фрагмента на 3’-конце crРНК придает стабильность сrРНК, что, в свою очередь, приводит к повышенной эффективности Cpf1. В работе [41] было показано, что первые 3–5 нуклеотидов на 3’-конце crРНК, образующиеся в результате процессинга пре-crРНК, вероятнее всего, не влияют на работу системы CRISPR/Cpf1. Для оптимизации системы CRISPR/Cpf1 и экспрессии гомогенных направляющих crРНК в работе [42] использовали введение в состав РНК-транскрипта саморасщепляющихся рибозимов HH и HDV. Опосредованный Cpf1 процессинг пресrРНК приводит к образованию набора зрелых crРНК с различной длиной олигоуридинилатного 3’-концевого фрагмента, что потенциально может «расширить» 19

направляющую область crРНК, ответственную за распознавание ДНК-мишени, и негативно повлить на эффективность расщепления. Рибозимы обеспечивают точное внутримолекулярное расщепление пре-сrРНК во время процессинга с образованием гомогенных 3’-концевых фрагментов. Было продемонстрировано, что 3’-концевой фрагмент, обогащенный уридином, удаляется при условии включения 3’-концевого HDV в состав пре-crРНК, при этом эффективность расщепления дцДНК-мишени повышается в 1.1–5.2 раза и усиливается активация генов системы CRISPR/AsCpf1 (ортолог Cpf1 из бактерий рода Acidaminococcus). Активность нуклеаз Cpf1 также может регулироваться вторичной структурой спейсера. В работе [26] была разработана серия crРНК, содержащих на 3’-конце в направляющей области (hp-crРНК) шпильки с различной стабильностью вторичной структуры. Нецелевая активность AsCpf1 и LbCpf1 (ортолог Cpf1 из бактерий семейства Lachnospiraceae) при использовании hp-crРНК уменьшалась, при этом целевая активность не изменялась; аналогичный эффект наблюдается для влияния hp-sgРНК на активность Cas9. Важно отметить, что по мере увеличения стабильности шпилечной структуры hpcrРНК, происходит уменьшение нецелевой активности, что позволяет увеличить специфичность систем CRISPR/AsCpf1 и CRISPR/LbCpf1. В то же время, укорочение crРНК с 3’-конца не всегда приводило к увеличению специфичности расщепления ДНКмишени как для AsCpf1, так и для LbCpf1, а более сильные укорочения спейсера приводили к полной потере нуклеазной активности. 1.4.3. Влияние длины crРНК на эффективность и специфичность СRISPR/Cpf1 В работе [43] был проведен поиск оптимальной длина crРНК для системы AsCpf1, которая обеспечивала как более простой и доступный химический синтез, так и максимальную стабильность in vivo. Было показано, что укорочение 5’-конца crРНК на 1 нт не влияет на эффективность расщепления, однако дальнейшее удаление 2 нт приводит к потере активности Cpf1 приблизительно на 40% по сравнению с crРНК дикого типа, а удаление трѐх или более нуклеотидов – к полной потере активности Cpf1. Данный результат может свидетельствовать о том, что укорочение 5’-конца негативно влияет на структуру псевдоузла crРНК, которая является критичной для активности Cpf1. Напротив, укорочение с 3'-конца не снижало активность AsCpf1: активность AsCpf1 сохранялась после укорочения направляющей последовательности с 23 до 18 нт. Так, crРНК длиной в 37 нуклеотидов (делеция 1 нт с 5’-конца и делеция 5 нт с 3’-конца) сохраняла высокую эффективность расщепления дцДНК-мишени, а у crРНК длиной в 36 нуклеотидов (делеция 1 нт с 5’-конца и делеция 6 нт с 3’-конца) эффективность 20

расщепления составила 60%. Дальнейшее удаление нуклеотидов с 5'-конца приводило к полной потере активности AsCpf1. Таким образом, конструирование Cpf1 для целей геномного редактирования требует наличия только одной crРНК, длина и последовательность которой является существенным фактором, определяющим специфичность и целевую эффективность редактирования генома, опосредованного Cpf1. Так, эффективность расщепления ДНКмишени зависит от длины crРНК: укорочение 5’-конца crРНК без потери активности Cpf1 возможно только на 1–2 нт, а укорочение 3’-конца на 5–6 нт. Однако удлинение 5’-конца от 4 до 25 нуклеотидов демонстрирует повышение эффективности Сpf1 на 25–60% по сравнению с crРНК без удлинения. Что касается специфичности расщепления ДНК, то crРНК со шпилькой на 3’-конце направляющей области уменьшает нецелевую активность, а наличие олигоуридилатного 3’-концевого фрагмента не оказывает влияния на специфичность Cpf1, повышая при этом эффективность расщепления ДНК-мишени. 1.4.4. Химические модификации crРНК Аналогично экспериментам по химическим модификациям sgРНК Cas9, был сконструирован набор библиотек crРНК с тиофосфатными (PS) модификациями, 2’-Oметил, 2’-F-модифицированными взаимодействуют с белком. нуклеотидами Анализ в модификации положениях, crРНК по которые не соотношению структура/эффективность показал следующие результаты: тиофосфатные модификации межнуклеотидных фосфатных групп снижают эффективность редактирования генома, а введение пяти 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов на 3’-конец повышает активность расщепления дцДНК-мишени [39]. В работе [43] была исследована серия crРНК длиной в 36 нуклеотидов, где 5’концевой, 3’-концевой или оба концевых нуклеотида crРНК были заменены PS-, 2’-Oметил, 2’-F-модифицированными нуклеотидами. Полученные crРНК демонстрировали эффективность расщепления дцДНК, сравнимую с аналогичной немодифицированной crРНК и были более устойчивы к действию рибонуклеаз in vivo по сравнению с природной crРНК. Также было показано, что не только концевые, но и многие внутренние нуклеотиды в направляющей последовательности crРНК вне затравочной области могут быть модифицированы, и эти модификации не нарушают работу системы CRISPR/AsCpf1. На основе анализа литературных данных можно сделать следующий вывод. Связывание и взаимодействие sgРНК с Cas9 и crРНК с Cpf1 задает необходимую для узнавания и расщепления ДНК архитектуру рибонуклеопротеидного комплекса, что 21

говорит о наличии значительного потенциала для оптимизации нуклеотидных последовательностей sgРНК и crРНК, в том числе и неадресующих фрагментов этих РНК. Для оптимизации нуклеотидных последовательностей РНК-компонента нуклеаз в настоящее время в основном используется метод рационального дизайна, основанный на тестировании ограниченного набора вариантов РНК. 22

2. Материалы и методы 2.1. Материалы В работе были использованы следующие реактивы и растворители: трис(гидроксиметил)аминометан, перхлорат натрия, DTT (Acros Organics, Бельгия), акриламид, N, N’-метиленбисакриламид, борная кислота, ацетонитрил (Panreac, Испания), мочевина (Merck, Германия), Na2EDTA, ксиленцианол FF, бромфеноловый синий, агароза LE2 (Хеликон, Россия), Stains-All, HEPES, хлорид калия (Acros, США), хлорид магния, Tween 20 (Sigma, США), dATP, dGTP, dCTP, dTTP (BioSan, Россия), ATP, GTP, CTP, UTP (Thermo Fisher Scientific, США), TRIzol® (Invitrogen, США), EtBr (Serva, Германия) и другие реагенты и растворители российского и зарубежного производства. Для ферментативных реакций использовали ревертазу M-MuLV-RH (К.Ф. 2.7.7.49), Hot Start Taq ДНК полимеразу (К.Ф. 2.7.7.7) (БиоЛабМикс, Россия), ДНК-полимеразу I E. coli (фрагмент Кленова) (К.Ф. 2.7.7.7), РНК-полимеразу фага T7 (К.Ф. 2.7.7.6), ДНКазу I (К.Ф. 3.1.21.1), неорганическую пирофосфатазу (К.Ф. 3.6.1.1), ингибитор РНКаз RiboLock (Thermo Fisher Scientific, США). Для проведения транскрипции использовали набор T7transcription kit (БиоЛабМикс, Россия). В работе были использованы следующие буферные растворы: буфер А: 20 мМ HEPES рН 7.5, 100 мM KCl, 1 мM DTT, 5% глицерин; буфер Б: 5 мМ Трис-HCl, 0.5 мМ Na2EDTA, 1 M NaCl; буфер В: 20 мМ HEPES рН 7.5, 100 мM KCl, 5 мM MgCl2, 1 мM DTT, 5% глицерин. В качестве калибровочных ДНК-маркеров для электрофореза использовали наборы фрагментов дцДНК: набор от 50 до 1500 п.н. с шагом в 50 п.н. и набор от 100 до 1000 п.н. с шагом в 100 п.н. (БиоЛабМикс, Россия). В работе использовали колонки Illustra AutoSeq G-50 (GE Healthcare, Великобритания) и микроцентрифужные модули Amicon® Ultra-0,5 Centrifugal Filter Device, 10K (Millipore, США). Очистку ПЦР-продукта от праймеров проводили на магнитных частицах CleanMag DNA (Евроген, Россия). В качестве стрептавидинмодифицированного носителя для иммобилизации комплекса sgРНК:Сas9:ДНК использовали магнитные частицы Dynabeads™ M-280 Streptavidin (Thermo Fisher Scientific, США) и магнитные частицы Hydrophilic Streptavidin Magnetic Beads (New England Biolabs, США). Рекомбинантный белок Cas9 (Streptococcus pyogenes) и исходная модельная sgРНК любезно предоставлены И. П. Вохтанцевым (ЛГБИ ИХБФМ СО РАН). 23

Таблица 1. Последовательности олигодезоксирибонуклеотидов, использованных в работе Олигодезоксирибонуклеотиды Последовательность 5’-праймер P1-1 5’-GCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG1 ATA ACT CAA TTT GTA AAA AAG-3’ 5’-AAA AGC ACC GAC TCG GTG-3’ 3’-праймер P1-2 5’-TTA TAT GAA GAT AAC TCA ATT TGT AAA AAA TGG TAT TGG GGA ATT CAT TA-LNH2-3’ М0 5’-ТАА ТGA ATT CCC CAA TAC CAT TTT TTA CAA ДНК2 ATT GAG TTA TCT TCA TAT AA-LNH2-3’ 5’-TTA TAT GAA GAT AAT2 TCA ATT TGT AAA AAA ДНК3 TGG TAT TGG GGA ATT CAT TA-LNH2-3’ М1 5’-TAA TGA ATT CCC CAA TAC CAT TTT TTA CAA ДНК4 ATT GAA2 TTA TCT TCA TAT AA-3’ 5’-TTA TAT GAA GAT AAС TT2A ATT TGT AAA AAA ДНК5 TGG TAT TGG GGA ATT CAT TA-LNH2-3’ М2 5’-TAA TGA ATT CCC CAA TAC CAT TTT TTA CAA ДНК6 ATT A2AG TTA TCT TCA TAT AA-3’ 5’-AAA AGC ACC GAC TCG GTG [CCA CTT TTT CAA Комбинаторная оцДНКGTT GAT AAC GGA CTA GCC TTA TTT TAA CTT GCT ATT TCT AGC TCT AAA A]3 CT TTT TTA CAA ATT библиотека GAG TTA TCC-3’ 3’-концевой остаток дезоксирибозы олигонуклеотидов ДНК1, ДНК2, ДНК3 и ДНК5 модифицирован аминосодержащим линкером LNH2= –p–(OCH2CH2)6–p–O(CH2)6NH2, где p= – PO3–3. 1 Подчеркиванием в 5’-праймере выделена нуклеотидная последовательность промотора РНКполимеразы фага T7. 2 Подчеркиванием в ДНК3, ДНК4, ДНК5 и ДНК6 выделены однонуклеотидные замены вне затравочной области. 3 Квадратными скобками в последовательности комбинаторной оцДНК-библиотеки ограничены нуклеотидные позиции, содержащие 85% исходного нуклеотида и по 5% каждого из трех оставшихся нуклеотидов. ДНК1 Используемые в работе олигодезоксирибонуклеотиды и оцДНК-библиотека были синтезированы к.х.н. В.В. Тимошенко в лаборатории химии РНК ИХБФМ СО РАН твердофазным фосфитамидным методом на ДНК/РНК синтезаторе ASM-800 (Биоссет, Россия) по оптимизированным протоколам. В работе использовали приборы: систему очистки воды Simplicity System (Millipore, Ирландия), спектрофотометр Nano Drop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США), термостатируемые шейкеры Thermomixer F1.5, Thermomixer comfort, центрифуги MiniSpin plus, Centrifuge 5424R, центрифужный испаритель Concentrator plus, амплификатор Mastercycler Gradient (Eppendorf, Германия), прибор для проведения ПЦР в режиме реального времени Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия), вортекс (Heidolph, Германия), суховоздушный термостат (Jouan, Франция), камеры для вертикального электрофореза 24

(Хеликон, Россия) и горизонтального электрофореза, прибор для сушки гелей Gel Dryer 583 (BioRad, США), лазерный сканер Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare, США). Для приготовления реакционных смесей и буферных растворов использовали дистиллированную воду, дополнительно очищенную с помощью системы Millipore Simplicity System. 2.2. Основные методы работы 2.2.1. Аналитический электрофорез в ПААГ Анализ олигонуклеотидов проводили в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (акриламид:N,N’-метиленбисакриламид (30:1), 8 М мочевина, 89 мМ Трисборат, 1 мМ Na2EDTA) и в 8%-ном ПААГ в нативных условиях (акриламид:N,N’метиленбисакриламид (30:1), 44.5 мМ Трис-борат, 1 мМ Na2EDTA) в электрическом поле с напряженностью 10–20 В/см, толщина геля 0.4 мм. Для нанесения использовали денатурирующий раствор, содержащий 0.025%-ный XC FF, 0.025%-ный BP, формамид, и раствор, содержащий 0.05% XC, 0.05% BP в 50%-ном водном глицерине. Гель окрашивали раствором Stains-all в 50%-ном водном формамиде, отмывали водой до полного выцветания фоновой окраски и сушили 30 мин при 80 °C. 2.2.2. Препаративный электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях ДцДНК-библиотеку после матричного ферментативного синтеза очищали с помощью препаративного гель-электрофореза в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (акриламид:N,N'-метиленбисакриламид (30:1), 8 М мочевина, 89 мМ Трис-борат pH 8.3, 2 мМ Na2EDTA, толщина геля 0.4 мм). Для нанесения использовали денатурирующий раствор (0.025% XC FF, 0.025% BP и формамид). Результаты разделения визуализировали в УФ-свете. Полосы геля, содержащие целевой продукт, вырезали и проводили элюцию в воде при 30 °С в течение 20 ч. Растворы после элюции обессоливали и концентрировали с использованием микроцентрифужных фильтров Amicon Ultra Centrifugal Device-0.5, 10K. Гомогенность полученных дцДНК-библиотек после очистки проверяли гель- электрофорезом в 3.5%-ной агарозе. 2.2.3. Аналитический электрофорез в агарозном геле Анализ олигонуклеотидов проводили в 3.5%-ном агарозном геле (агароза, 89 мМ Трис-борат, 1 мМ Na2EDTA, 0.5 мкг/мл EtBr) в электрическом поле с напряженностью 5 В/см. Для нанесения использовали раствор, содержащий 0.01% красителя Orange G в 30%25

ном водном глицерине. Результаты электрофоретического разделения визуализировали в УФ-свете. 2.2.4. Выделение ДНК-мишени препаративным гель-электрофорезом Аминомодифицированные деблокирования выделяли олигодезоксирибонуклеотиды препаративным гель ДНК1–ДНК6 электрофорезом в после ПААГ в денатурирующих условиях. Полосы геля, содержащие целевой продукт, вырезали и дважды проводили элюцию 2x-кратным объемным избытком 0.3 M NaClO4 в течение 16–24 ч на термомиксере при 30 °С и 450 об./мин. Растворы объединяли и обессоливали на колонке SepPac C18 (Waters, США), предварительно замоченной в 50%-ном водном ацетонитриле. Колонку промывали сначала 50%-ным ацентонитрилом, а затем 0.3 М NaClO4. Раствор после элюции окрашивали следовым количеством XC для визуального контроля нанесения, пропускали через колонку, промывали колонку 0.3 М NaClO4 и элюировали ДНК 50%-ным ацентонитрилом. Полученные фракции элюата концентрировали до 100 мкл на вакуумном центрифужном испарителе, осаждали ДНК 2%-ным NaClO4 в ацетоне, центрифугировали 1 мин при комнатной температуре со скоростью 13500 об./мин, супернатант отбрасывали, осадок дважды промывали 1 мл ацетона, сушили на воздухе и растворяли поэтапно, объединяя осадки, в 50 мкл воды. Гомогенность полученных растворов ДНК-мишени контролировали гель-электрофорезом в 15% денатурирующем ПААГ. Полученные аминомодифицированные олигонуклеотиды ДНК-мишени использовали для синтеза Су5-конъюгатов. 2.2.5. Синтез Сy5-конъюгатов олигонуклеотидов 5 о.е. (10 нмоль) аминомодифицированных олигодезоксирибонуклеотидов ДНК1, ДНК2, ДНК3 и ДНК5 растворяли в 20 мкл 0.5 М Трис-HCl pH 8.0. Активированный эфир красителя Cy5-NHS (0.3 мг) растворяли в 160 мкл DMSO, добавляли к раствору олигонуклеотидов, инкубировали 1.5 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании (650 об./мин). Полученную смесь осаждали 2%-ным NaClO4 в ацетоне, центрифугировали 1 мин при комнатной температуре со скоростью 13500 об./мин, супернатант отбрасывали, осадок дважды промывали 1 мл ацетона, сушили на воздухе и растворяли в 25 мкл воды. Очистку проводили на колонке Illustra AutoSeq G-50: колонку встряхивали, открывали крышку на четверть оборота, отламывали наконечник. Колонку помещали в приемник, центрифугировали в течение 1 мин при комнатной температуре с 26

центробежным ускорением 2000g. Переносили колонку в пробирку объемом 1.5 мл, наносили реакционную смесь на колонку и центрифугировали с незакрученной крышкой (1 мин при комнатной температуре, 2000g). Продукты анализировали гель-электрофорезом в 15%-ном денатурирующем ПААГ. Флуоресценцию Cy5 в геле регистрировали с помощью лазерного сканера Typhoon FLA 7000. 2.2.6. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с биотином 8.6 о.е. (17 нмоль) аминомодифицированных олигонуклеотидов ДНК1, ДНК3 или ДНК5 растворяли в 50 мкл 0.1 М Na2B4O7. 2 мг N-гидроксисукцинимидного эфира биотина растворяли в 30 мкл DMF. Добавляли 15 мкл раствора эфира биотина к раствору олигонуклеотидов, инкубировали 1 ч при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 500 об./мин. Затем добавляли еще раз 15 мкл раствора эфира биотина и инкубировали 1.5 ч в тех же условиях. Полученную смесь осаждали 2%-ным NaClO4 в ацетоне, центрифугировали 1 мин при комнатной температуре со скоростью 13500 об./мин, супернатант отбрасывали, осадок дважды промывали 1 мл ацетона, сушили на воздухе и растворяли в 20 мкл воды. Очистку проводили на колонке Illustra AutoSeq G-50. Анализ продуктов проводили гель-электрофорезом в 15%-ном денатурирующем ПААГ. 2.2.7. Синтез дцДНК-библиотеки Готовили 90 мкл реакционной смеси для отжига 5’-праймера P1-1: 10 мМ Трис-HCl pH 8.0, 10 мМ MgCl2, 2 нмоль праймера, 1 нмоль оцДНК-библиотеки. Инкубировали 5 мин при 95 °С, помещали в лед на 5 мин. Готовили 600 мкл реакционной смеси: 90 мкл реакционной смеси после отжига, 10-кратный буфер Кленова (Thermo Fisher Scientific, США), по 0.5 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 30 е.а. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli. Инкубировали 30 мин при 37 °С. Инактивировали фермент в течение 10 мин при 75 °С. Для осаждения реакционную смесь делили на 2 части по 300 мкл, добавляли по 0.1 объема 3 M NaOAc pH 7.8 и 2.5 объема этанола, выдерживали при –20 °C не менее двух часов, центрифугировали (15 мин, 4 °С, 15000 об./мин), супернатанты отбрасывали, осадки промывали 75%-ным водным этанолом, центрифугировали (8 мин, 4 °С, 15000 об./мин), сушили 30 мин на воздухе, растворяли в 100 мкл воды. Продукты анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ и в 3.5%-ной агарозе. Очистку реакционных смесей проводили с помощью препаративного электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Гомогенность полученных образцов дцДНКбиблиотеки после очистки проверяли гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ. 27

Полученную дцДНК использовали в качестве матрицы для ферментативного синтеза комбинаторной РНК-библиотеки. 2.2.8. Транскрипция in vitro с использованием РНК-полимеразы фага T7 Для проведения транскрипции готовили 250 мкл реакционной смеси: 50 мкл 5кратного T7 RNAP буфера (Thermo Fisher Scientific, США), 2 мМ CTP, UTP, ATP, GTP, 100 пмоль дцДНК, 800 е.а. T7 РНК полимеразы, 0.5 е.а. неорганической пирофосфатазы и 6 мкл ингибитора РНКазы RibоLock. Инкубировали при 37 °С в течение 16–20 ч в суховоздушном термостате. Для удаления дцДНК добавляли 10 е.а. ДНКазы I и инкубировали 1 ч при 37 °С. Инактивировали ДНКазу I экстракцией хлороформом: добавляли к реакционной смеси двукратный избыток CHCl3, перемешивали 1 мин для образования эмульсии, центрифугировали в течение при 10 °C со скоростью 15000 об./мин. Водный слой отбирали, с ним проводили экстракцию еще раз. Осаждали: добавляли 0.1 объема 3 M NaOAc и 2.5 объема этанола. Выдерживали при –20 °C не менее 2-х часов. Центрифугировали (15 мин, 4 °C, 15000 об./мин), супернатант отбрасывали, осадок промывали 75%-ным водным этанолом. Центрифугировали (8 мин, 4 °C, 15000 об./мин). Осадок сушили на воздухе 20–30 мин и растворяли в 50 мкл воды. Очистку проводили на колонке Illustra AutoSeq G-50. Анализ продуктов проводили гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ. Очистку РНК-транскриптов от коротких продуктов проводили с помощью препаративного гель-электрофореза в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Гомогенность РНК-библиотек после очистки проверяли гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ. Полученную РНК-библиотеку использовали для in vitro селекции. 2.2.9. Иммобилизация биотилинированной дцДНК-мишени на стрептавидинмодифицированных магнитных частицах Для формирования дцДНК отдельные комплементарные цепи ДНК смешивали в воде в эквимолярном соотношении, нагревали до 95 °C и охлаждали в течение 5 мин на льду. Стрептавидин-модифицированные магнитные частицы перемешивали до состояния суспензии, отбирали 20 мкл суспензии частиц в пробирку и промывали: добавляли 20 мкл 2-кратного буфера Б, перемешивали 30 с на вортексе, помещали в магнитный сепаратор на 2 мин и удаляли супернатант. Повторяли промывку еще раз. После промывки к частицам добавляли 40 мкл 2-кратного буфера Б, ресуспендировали. Для иммобилизации добавляли 28

34 пмоль в 40 мкл воды дцДНК с биотинилированной цепью и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Помещали пробирку в магнитный сепаратор на 2 мин, супернатант удаляли. Частицы дважды промывали: добавляли 40 мкл буфера Б, перемешивали 30 с на вортексе, помещали в магнитный сепаратор на 2 мин и удаляли супернатант. После промывки к частицам добавляли 170 мкл раствора с предформированным комплексом РНК:Сas9 в буфере A. Емкость частиц по иммобилизованной ДНК определяли, измеряя оптическую плотность раствора биотинилированной ДНК-мишени при 260 нм до и после его иммобилизации с 20 мкл (0.2 мг) магнитных частиц Dynabeads™ M-280 Streptavidin и (0.08 мг) Hydrophilic Streptavidin Magnetic Beads. Используя значение коэффициента экстинкции ДНК-мишени (Ԑ=650000 М-1см-1), рассчитывали количество несвязавшейся ДНК. По разнице между количеством исходной дцДНК и дцДНК, не связавшейся с магнитными частицами, рассчитывали емкость 1 мг частиц по ДНК. 2.2.10. Селекция in vitro Готовили 170 мкл раствора РНК-библиотеки (340–37.7 пмоль) и нуклеазы Cas9 (34 пмоль) в буфере А с 0.05% Tween 20 и 3 мкМ полиаденилата и инкубировали 15 мин при 37 °C. При подборе условий для селекции in vitro эксперименты проводили с использованием модельной sgРНК и детергента Tween 20 в конечной концентрации 0.05%, в качестве НК- и белковых компетиторов использовали суммарную тРНК дрожжей, полиаденилат и казеин в конечной концентрации 0.1 мг/мл. Затем проводили стадию контрселекции в течение 30 мин при 37 °C. Для этого на раундах 1–6 смешивали полученные комплексы с суспензией исходных магнитных частиц, не содержащей дцДНК-мишени. На раундах 7–8 для контрселекции использовали магнитные частицы, содержащие 34 пмоль несовершенной дцДНК-мишени M1 (ДНК3:ДНК4), на раундах 9–10 – частицы, несущие 34 пмоль несовершенной дцДНКмишени M2 (ДНК5:ДНК6). После магнитной сепарации супернатант отбирали и использовали на стадии селекции: инкубировали 1 ч при 37 °C с суспензией частиц, содержащих 34 пмоль дцДНКмишени (ДНК1:ДНК2). Затем суспензию сепарировали. Обе порции магнитных частиц (после контрселекции и после селекции) промывали: добавляли 40 мкл буфера А с 0.05% Tween 20 и 3 мкМ полиаденилата, перемешивали 30 с на вортексе, помещали в магнитный сепаратор на 2 мин, отбирали супернатант. Повторяли промывку еще раз, после третьей промывки суспензию переносили в чистую пробирку и отбирали супернатант. 29

2.2.11. Выделение РНК из иммобилизованного комплекса Для выделения РНК из комплекса с белком и ДНК к частицам после последней промывки добавляли 100 мкл воды, перемешивали, добавляли 300 мкл реагента TRIzol®, перемешивали, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Добавляли 80 мкл CHCl3, перемешивали, инкубировали 2 мин при комнатной темепературе и центрифугировали 10 мин при 4 °C со скоростью 12000g. Водную (бесцветную) фазу отбирали и осаждали: добавляли 0.1 объема 3 М NaOAc и 2.5 объема этанола, выдерживали при –20 °С не менее 2-х часов, центрифугировали (4 °С, 15 мин, 15000 об./мин), супернатанты отбрасывали, осадки промывали 75%-ным водным этанолом, центрифугировали (8 мин, 15000 об./мин), осадки сушили 30 мин на воздухе и растворяли в 10 мкл воды для проведения обратной транскрипции. 2.2.12. Обратная транскрипция Для отжига 3’-праймера к выделенной из комплекса РНК добавляли 2 мкл 5 мМ соответствующего 3’-праймера (P1-2), инкубировали 5 мин при 90 °С и охлаждали 5 мин на льду. Для проведения обратной транскрипции в пробирку к полученному раствору после отжига 3’-праймера добавляли 8 мкл реакционной смеси, содержащей 5-кратный буфер для обратной транскрипции (Биолабмикс, Россия) и 100 е.а. ревертазы M-MuLV-RH. Инкубировали 1 ч при 50 °С. Фермент инактивировали в течение 5 мин при 85 °С. Полученный раствор использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР. 2.2.13. Полимеразная цепная реакция Для проведения ПЦР готовили 1 мл реакционной смеси, содержащей 110 мкл 10кратного Hot Start Taq-буфера (Биолабмикс, Россия), 1 мM MgCl2, по 25 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 50 мкМ соответствующих 5’- и 3’-праймеров, 2.5 ед. а. Hot Start Taq ДНК полимеразы и реакционную смесь после обратной транскрипции объемом 20 мкл. Для амплификации использовали следующую программу: инициирование 3 мин при 93 °C, денатурация 30 с при 93 °C, отжиг 1 мин при 60 °C, элонгация 1 мин при 72 °C (25 циклов). ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в 3.5%-ном агарозном геле. Для осаждения полученного ПЦР-продукта к растворам после амплификации добавляли 0.1 объема 3 M NaOAc и 2.5 объема этанола, выдерживали при –20 °С не менее 2-х часов, центрифугировали в течение 15 мин при 4°С со скоростью 15000 об./мин, супернатанты удаляли, осадки дважды промывали 75%-ным водным этанолом, 30

центрифугировали (8 мин, 4 °С, 15000 об./мин), супернатанты отбрасывали, осадки сушили 20–30 мин на воздухе и объединяли, растворяя в 50 мкл воды. 2.2.14. Очистка дцДНК после проведения ОТ-ПЦР на магнитных частицах CleanMag DNA Частицы перемешивали до состояния суспензии, отбирали 100 мкл суспензии частиц и добавляли к 50 мкл ПЦР-продукта после осаждения. Инкубировали 40 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая. После инкубации пробирку помещали в магнитный сепаратор на 5 мин и удаляли супернатант. Не вынимая пробирки из магнитного сепаратора, промывали частицы: добавляли 300 мкл 80%-ного водного этанола, инкубировали 2 мин и удаляли супернатант. Повторяли промывку еще раз. После промывки магнитные частицы сушили 10 мин на воздухе, добавляли к ним 50 мкл воды, перемешивали до состояния суспензии, инкубировали 5 мин при комнатной температуре, помещали в магнитный сепаратор, отбирали супернатант и переносили его в новую пробирку. Продукты анализировали электрофорезом в 3.5%-ном агарозном геле. Полученную дцДНК использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro. Раствор очищенной ДНК секвенировали по Сэнгеру (ЦКП «Геномика» СО РАН). 2.2.15. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени Для количественной оценки содержания ДНК в пробах после обратной транскрипции и ДНК-стандартах использовали метод ПЦР в режиме реального времени в присутствии 1-кратного флуоресцентного красителя SYBR Green I. Постановка реакции амплификации и регистрация изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от количества циклов проводились на приборе Rotor-Gene Q. Для анализа полученных данных использовали программное обеспечение Rotor-Gene Q Series. Количество кДНК после обратной транскрипции рассчитывали по формуле: Х = 2 ∙ , где С – концентрация ДНК по данным ПЦР в реальном времени, V - объем ПЦР-пробы, Y – доля ОТ-смеси, использованная в ПЦР в режиме реального времени. 2.2.16. Исследование и сравнение эффективности формирования тройного комплекса РНК:Cas9:ДНК методом задержки в геле Готовили смеси, содержащие 1000 нМ sgРНК и 1000 нМ Сas9 в буфере Б. Полученные растворы инкубировали 15 мин при 37 °C. К 9 мкл каждого раствора добавляли 1 мкл 1000 нМ дцДНК с флуоресцентной меткой на 3’-конце неадресуемой цепи и инкубировали 1 ч при 37 °C. После инкубации образцы наносили при постоянной силе тока на 8%-ный ПААГ в нативных условиях при 4 °C. Флуоресценцию Cy5 в геле 31

регистрировали с помощью лазерного сканера Typhoon FLA 7000. Интенсивность флуоресценции оценивали, используя программный пакет Quantity One. Степень образования тройного комплекса рассчитывали по формуле: Х = (Ip / IΣ) ∙ 100%, где Х – степень образования тройного комплекса, Ip – интенсивность полос, соответствующих образовавшемуся комплексу, IΣ – суммарная интенсивность всех полос в дорожке. 2.2.17. Исследование и сравнение эффективности расщепления ДНК-мишени в тройном комплексе РНК:Cas9:ДНК Предварительно 2.5 мкМ sgРНК инкубировали 30 с при 95 °C, охлаждали 10 мин при комнатной температуре, добавляли к 2.5 мкМ Cas9 в буфере В и инкубировали 15 мин при 37 °C. К 9 мкл полученной смеси добавляли 1 мкл 1000 нМ Су5-меченной ДНКмишени М0, М1 или М2 и инкубировали 1 ч при 37 °C. Реакцию останавливали добавлением 20 мкл денатурирующего раствора, содержащего 5 мМ Na2EDTA, 0.025% SDS, 5% глицерина в формамиде, и наносили пробы на 15% денатурирующий ПААГ. Флуоресценцию Cy5 в геле регистрировали с помощью лазерного сканера Typhoon FLA 7000. Интенсивность флуоресценции оценивали, используя программный пакет Quantity One. Степень расщепления ДНК-мишени рассчитывали по формуле: Х = (Ip / IΣ) ∙ 100%, где Х – степень расщепления ДНК-мишени, Ip – интенсивность полос, соответствующих продуктам расщепления, IΣ – суммарная интенсивность всех полос в дорожке. 32

3. Результаты и обсуждение 3.1. Конструирование модельной системы для in vitro cелекции Анализ литературных данных по конструированию направляющих РНК для нуклеазы Cas9 показывает, что в настоящее время для оптимизации нуклеотидной последовательности sgРНК используют только метод рационального дизайна, основанный на тестировании ограниченного набора конкретных вариантов РНК (см. обзор литературы). В нашей работе для получения новых вариантов sgРНК, обеспечивающих повышенную точность и эффективность расщепления ДНК-мишени, предложено использовать метод молекулярной селекции sgРНК из специально сконструированной комбинаторной библиотеки РНК. Комбинаторная библиотека представляет собой большой набор молекул РНК одной длины с одинаковыми 3’- и 5’-концевыми фрагментами, необходимыми для связывания олигонуклеотидных праймеров при амплификации, и различными нуклеотидными последовательностями центрального фрагмента, что обеспечивает разнообразие последовательностей и структур, необходимых для связывания мишени [44]. Метод in vitro селекции позволяет отбирать молекулы с заданными свойствами из пула РНК, содержащего несопоставимо большее по сравнению с рациональным дизайном количество вариантов. В нашем случае в результате селекции можно ожидать получения новых вариантов sgРНК, которые позволят улучшить ключевые характеристики системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 – точность и эффективность расщепления ДНК-мишени. Первым этапом для проведения in vitro селекции новых вариантов sgРНК стало создание комбинаторной библиотеки направляющих РНК. При конструировании библиотеки sgРНК мы учитывали следующие факторы: - в качестве исходного инвариабельного фрагмента sgРНК использована последовательность, содержащая уменьшенный по сравнению с природным дуплекс повтор-антиповтор [12] (рис. 7). Общее количество нуклеотидов в таком варианте sgРНК составляет 102, что позволяет синтезировать ДНК-матрицу для РНК-библиотеки методом химического синтеза на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе; - для проведения in vitro селекции библиотека должна содержать два концевых константных участка, необходимых для гибридизации с праймерами и амплификации обогащенного пула РНК на каждом раунде отбора. В качестве 5’константного участка библиотеки был выбран ДНК-узнающий 5’-концевой фрагмент sgРНК; 33

- для использования в качестве 3’-константного участка библиотеки наиболее очевидным вариантом является собственный 3’-концевой фрагмент sgРНК. Он расположен вне комплекса Cas9:sgРНК, в наименьшей степени взаимодействует с белком и не является строго необходимым для расщепления ДНК [2]. Однако этот фрагмент содержит шпилечную структуру, а 3’-концевая шпилька может затруднять связывание праймера для обратной транскрипции и, соответственно, амплификацию в ходе селекции. Поэтому необходимо было предварительно протестировать 3’-концевой фрагмент в качестве праймер-связывающего участка. В качестве дцДНК-мишеней для тестирования ДНК-гидролизующей активности Cas9 и для селекции in vitro в данной работе мы выбрали 50-нуклеотидные дуплексы синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащие протоспейсерную последовательность в адресуемой цепи и PAM-мотив в неадресуемой цепи (рис. 7). Выбранная длина дцДНК позволяет вводить на удаленный от протоспейсерной последовательности конец дуплекса модифицирующие группы без влияния на активность фермента. Рисунок 7. Схематическое изображение комплекса Cas9 с направляющей sgРНК и дцДНКмишенью. Стрелками показаны сайты расщепления ДНК. Голубым цветом в последовательности sgРНК выделены константные участки РНК-библиотеки. 3.1.1. Исследование возможности конструирования комбинаторной библиотеки на основе sgРНК Чтобы проверить, подходят ли выбранные нами концевые фрагменты нуклеотидной последовательности sgРНК в качестве константных участков будущей РНК-библиотеки, необходимо сначала было протестировать sgРНК и соответствующие олигонуклеотидыпраймеры в ферментативных реакциях, используемых при селекции: обратная транскрипция, ПЦР и транскрипция in vitro с полученными дцДНК. 34

С учетом особенностей конкретной системы мы провели оптимизацию протокола ОТ-ПЦР. Основная проблема для стадии обратной транскрипции заключалась в том, что 3’-концевой фрагмент sgРНК имеет шпилечную структуру (рис. 8), что потенциально может затруднять связывание соответствующего праймера с РНК. Данную стадию проводили с модельной sgРНК длиной в 102 основания в присутствии ревертазы и обратного праймера P1-2. Рисунок 8. Последовательность модельной sgРНК. Голубым цветом выделен участок связывания праймера для обратной транскрипции (P1-2). Полученную после обратной транскрипции кДНК амплифицировали с помощью ПЦР в присутствии ДНК-праймеров, один из которых (P1-1) содержал нуклеотидную последовательность промотора Т7 РНК-полимеразы (рис. 9А). Было показано, что в результате обратной транскрипции и последующей ПЦР модельной sgРНК происходит образование продукта ПЦР ожидаемой длины – 120 п.н. (рис. 9Б, дорожка 3). A Б Рисунок 9. Стадия ПЦР. А. Расположение праймеров на кДНК и продукте ПЦР. Голубым цветом выделен обратный праймер (P1-2). Оранжевым цветом выделен участок связывания прямого праймера (P1-1), где коричневым отмечена область промотора Т7 РНК-полимеразы. Б. Электрофоретический анализ реакционных смесей после ОТ-ПЦР в 3.5%-ном агарозном геле, окрашивание бромидом этидия, 0.5 мкг/мл: 1) маркер длины дцДНК от 100 до 1000 п.н. (минимальный фрагмент – 100 п.н.); 2) контрольная ПЦРпроба, не содержащая продукта обратной транскрипции; 3) проба после 25 циклов ПЦР. 35

Нуклеотидная последовательность полученного продукта ПЦР была подтверждена секвенированием по Сэнгеру, выполненным в ЦКП «Геномика» СО РАН (рис. 10). Рисунок 10. Результат секвенирования по Сэнгеру полученного продукта ПЦР. А. Прочтение с праймера P1-1. Б. Прочтение с праймера P2-1. Перекрывание полученных последовательностей позволяет восстановить ожидаемую последовательность ампликона. Необходимо отметить, что при работе с относительно короткими фрагментами дцДНК (около 100 п.н.) их очистка от используемых для ПЦР ДНК-праймеров представляет собой нетривиальную задачу из-за недостаточного различия в свойствах данных молекул. Мы использовали для отделения дцДНК после ПЦР от праймеров магнитные частицы CleanMag DNA, при этом протокол очистки был оптимизирован так, чтобы добиться максимального выхода целевого продукта. На представленной электрофореграмме (рис. 11, дорожка 3) видно, что очистка по данному протоколу позволяет эффективно отделить дцДНК-продукт ПЦР от праймеров. Рисунок 11. Электрофоретический анализ очищенного продукта ПЦР в 3.5%-ном агарозном геле, окрашивание бромидом этидия, 0.5 мкг/мл: 1) маркер длины дцДНК от 36

100 до 1000 п.н. (минимальный фрагмент – 100 п.н.); 2) контроль дцДНК до очистки на частицах; 3) дцДНК после очистки; 4) фракция реакционной смеси после ПЦР, не связавшаяся с частицами. На следующем этапе была проверена возможность in vitro транскрипции с использованием в качестве матрицы полученной дцДНК. В результате транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы фага Т7 происходило образование полноразмерного РНК-продукта, совпадающего по электрофоретической подвижности с исходной sgРНК (рис. 12, дорожка 5). Рисунок 12. Электрофоретический анализ продуктов транскрипции in vitro в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующей окраской StainsAll: 1) маркер длины дцДНК от 50 до 1500 п.н. (минимальный фрагмент – 50 п.н.); 2) продукт ПЦР; 3, 4) контроль sgРНК; 5) sgРНК после транскрипции in vitro; 6) исходная sgРНК. Таким образом, использование выбранных нами ДНК-праймеров, позволяет проводить с модельной sgРНК основные ферментативные реакции, необходимые для in vitro селекции. Это означает, что sgРНК с данной последовательностью может быть использована в качестве основы для создания РНК-библиотеки без дополнительных изменений еѐ концевых фрагментов. 3.1.2. Выделение ДНК-мишени и синтез Cy5-конъюгатов В качестве дцДНК-мишеней для тестирования ДНК-гидролизующей активности Cas9 и для селекции in vitro в данной работе был выбран 50-нуклеотидный дуплекс синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, аминолинкер для присоединения Аминомодифицированные содержащий функциональных олигонуклеотиды – компоненты на 3’-конце групп (рис дцДНК-мишени гибкий 13). были химически синтезированы в ЛХРНК ИХБФМ СО РАН. Для выделения компонентов ДНК37

мишени использовали препаративный гель-электрофорез в 15%-ном денатурирующем ПААГ с элюцией в 0.3 M NaClO4. Рисунок 13. Последовательность ДНК-мишени с гибким аминолинкером на 3’-конце. Голубым цветом выделен участок связывания sgРНК. Для визуализации сборки комплекса и исследования способности модельных sgРНК индуцировать расщепление нуклеазой Сas9 на 3’-конец одной из цепей ДНК-мишени через гибкий аминолинкер вводили флуоресцентную метку – цианиновый краситель Cy5, максимум флуоресценции которого приходится на красную область спектра (662 нм). Флуоресценцию регистрировали с помощью лазерного сканера Typhoon FLA 7000. При этом мы наблюдали флуоресценцию как индивидуальных цепей ДНК (рис. 14, дорожки 1 и 2), так и цепей в составе ДНК-дуплекса (рис. 14, дорожки 3 и 4). Рисунок 14. Результаты электрофоретического анализа гомогенности ДНК-мишени, содержащей флуоресцентную метку на одной из цепей, в 15%-ном денатурирующем ПААГ: 1) 0.5 мкМ ДНК1-Сy5; 2) 0.5 мкМ ДНК2-Су5; 3) 1 нМ ДНК1-Сy5+ДНК2; 4) 1 нМ ДНК2-Сy5+ДНК1. XC FF – краситель ксиленцианол FF, BP – краситель бромфеноловый синий. Изображение получено сканированием флуоресценции Cy5 на Typhoon FLA 7000. 3.1.3. Исследование сборки комплекса sgРНК:Cas9:ДНК методом задержки в геле Функциональная активность полученного РНК-транскрипта была протестирована с использованием рекомбинантного белка Cas9 (S.pyogenes). Для исследования сборки тройного комплекса sgРНК:Cas9:дцДНК использовали метод задержки в геле с разными концентрациями Cas9 и sgРНК и ДНК-мишенью с 3’-Cy5-меченной неадресуемой цепью 38

(ДНК1) в буфере А, не содержащем магния. Как показал электрофоретический анализ, в отсутствие катионов магния образуется тройной комплекс Cas9:sgРНК:дцДНК, в котором расщепления ДНК не происходит (рис. 15А). Долю образовавшегося тройного комплекса при различных концентрациях sgРНК и Сas9 рассчитывали, используя программный пакет Quantity One (рис. 15Б). На основании полученных результатов было принято решение использовать буферный раствор без катионов магния в качестве буфера для связывания в протоколе in vitro селекции при отборе вариантов sgРНК, наиболее аффинно связывающихся с Cas9. Рисунок 15. Исследование сборки комплекса sgРНК:Cas9:ДНК. А. Анализ подвижности комплексов sgРНК:Сas9:дцДНК в 8%-ном нативном ПААГ. Концентрация Cas9 и sgРНК: 1) 4.1 нМ; 2) 12.3 нМ; 3) 37 нМ; 4) 111 нМ; 5) 338 нМ; 6) 1100 нМ; 7) 0 нМ. Реакционные смеси также содержали 10 нМ ДНК-мишени с 3’-Cy5 меченной неадресуемой цепью. Изображение получено сканированием флуоресценции Cy5 на Typhoon FLA 7000. Б. Кривая связывания комплекса sgРНК:Сas9:ДНК. 3.1.4. Исследование расщепления ДНК в тройном комплексе Cas9:sgРНК:ДНК Мы исследовали также функциональную активность полученного РНК-транскрипта в реакции расщепления ДНК-мишени нуклеазой Cas9 в присутствии катионов магния. Анализ расщепления модельных ДНК-мишеней в присутствии sgРНК и Cas9 проводили методом электрофореза в 12% денатурирующем полиакриламидном геле (рис. 16). Следует отметить, что анализ расщепления проводили как с 3’-Cy5-меченной неадресуемой цепью (ДНК1), так и с 3’-Cy5-меченной адресуемой цепью (ДНК2). Показано, что в обоих случаях происходит расщепление ДНК-мишени в присутствии катионов магния. В дальнейшей работе использовали ДНК-мишень меченную по неадресуемой цепи (ДНК1), т.к. ее 3’-конец несколько более удален от Cas9, чем 3’-конец адресуемой цепи. 39

Рисунок 16. Анализ расщепления в 12%-ном денатурирующем ПААГ 10 нM модельных ДНК-мишеней в присутствии 500 нM sgРНК и 500 нM Cas9: 1, 3) контрольные пробы, не содержащие комплекса sgРНК:Cas9; 2) расщепление мишени с 3’-Cy5-меченной адресуемой цепью (ДНК1); 4) расщепление мишени с 3’-Cy5-меченной неадресуемой цепью (ДНК2). BP – лидерный краситель бромфеноловый синий. Изображение получено сканированием флуоресценции Cy5 на Typhoon FLA 7000. Полученные результаты подтверждают функциональную активность полученного РНК-транскрипта, как при связывании в тройной комплекс с белком Cas9 и дцДНК, так и при направленном расщеплении дцДНК. 3.2. Получение комбинаторной библиотеки sgРНК 3.2.1. Конструирование комбинаторной библиотеки РНК При конструировании библиотек для in vitro селекции наиболее распространен подход, подразумевающий полную замену фрагмента между 3’- и 5’-константными участками случайной областью с равновероятной представленностью всех четырех нуклеотидов в каждой позиции [45]. С другой стороны, как показывает анализ литературы по свойствам системы CRISPR/Cas9 (см. литературный обзор), для функциональной активности sgРНК в составе данной системы важно наличие определенных элементов вторичной структуры и конкретных нуклеотидов в ряде позиций. Поэтому равномерная рандомизация центрального фрагмента в библиотеке sgРНК неизбежно приведет к доминированию в библиотеке пула последовательностей, которые заведомо не обладают нужной функциональной активностью. С учетом этого при создании библиотеки мы применили стратегию, хорошо зарекомендовавшую себя именно при in vitro селекции для исследований НК-белковых комплексов: допирование ряда нуклеотидных позиций случайными нуклеотидами [45]. В этом случае в каждом положении случайной области с 40

большей вероятностью находится исходный нуклеотид, а с меньшей вероятностью – любой из трех оставшихся. Такой подход позволяет сохранить исходную нуклеотидную последовательность в целом, варьируя только отдельные еѐ позиции. Для конструирования библиотеки на основе sgРНК было выбрано равномерное допирование центрального 61-нуклеотидного фрагмента: все нуклеотидные позиции рандомизированной области содержали 85% исходного нуклеотида и по 5% трех остальных нуклеотидов. Другими словами, в каждой позиции этого фрагмента с вероятностью 85% находится исходный нуклеотид, а с вероятностью 15% – любой из трех остальных нуклеотидов. Расчет конкретной степени допирования, наилучшим образом подходящей для решения задач данной работы, был проведен к.х.н. П.Е. Воробьевым на основании алгоритмов и рекомендаций, описанных в работе Knight et al. [46]. Согласно теоретическим расчетам, РНК-библиотека с 15%-ным допированием 61-звенного фрагмента случайными нуклеотидами должна содержать около 30% многократно повторенных наборов молекул, отличающихся по нуклеотидной последовательности от исходной sgРНК на 1–7 нуклеотидов. Остальные 70% составляют уникальные последовательности, что придает комбинаторной библиотеке в целом большое разнообразие и повышает вероятность отбора молекул с нужными нам свойствами. 3.2.2. Синтез комбинаторной библиотеки sgРНК Получение комбинаторной библиотеки sgРНК состояло из двух этапов. На первом этапе в ЛХРНК ИХБФМ СО РАН был проведен химический твердофазный фосфитамидный синтез 102-звенной ДНК-библиотеки с использованием смесей нуклеотидных мономеров при синтезе центрального допированного фрагмента. Р1-1 Рисунок 17. Схематическое изображение стадий матричного ферментативного синтеза комбинаторной библиотеки sgРНК. На втором этапе мы использовали данную оцДНК-библиотеку для матричного ферментативного синтеза (см. схему на рис. 17). С использованием праймера Р1-1 и фрагмента Клeнова ДНК-полимеразы I E.coli была получена дцДНК-библиотека, 41

содержащая нуклеотидную последовательность промотора для Т7 РНК-полимеразы (рис. 18, дорожка 3). Рисунок 18. Электрофоретический анализ подвижности одно- и двуцепочечной ДНКбиблиотек в 3.5%-ном агарозном геле, окрашивание бромидом этидия, 0.5 мкг/мл: 1) маркер длины дцДНК от 100 до 1000 п.н. (минимальный фрагмент – 100 п.н.); 2) библиотека оцДНК; 3) реакционная смесь после синтеза дцДНК-библиотеки фрагментом Клѐнова. На следующем шаге по матрице полученной дцДНК-библиотеки с использованием Т7 РНК-полимеразы синтезировали комбинаторную библиотеку sgРНК. При электрофоретическом анализе полученной РНК в реакционной смеси были обнаружены укороченные продукты дополнительная транскрипции электрофоретическая (рис. очистка 19А), поэтому была РНК-библиотеки с проведена помощью препаративного гель-электрофореза в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 19Б). Рисунок 19. Электрофоретический анализ подвижности библиотеки sgРНК в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующей окраской StainsAll. А. Анализ реакционной смеси после РНК-транскрипции: 1) маркер длины дцДНК от 50 до 1000 п.н. (минимальный 42

фрагмент – 50 п.н.); 2) дцДНК после ОТ-ПЦР sgРНК; 3) sgРНК; 4) реакционная смесь после синтеза библиотеки sgРНК. Б. Анализ РНК-продукта после дополнительной электрофоретической очистки: 1) маркер длины дцДНК от 50 до 1000 п.н. (минимальный фрагмент – 50 п.н.); 2) дцДНК после ОТ-ПЦР sgРНК; 3) sgРНК; 4) РНК библиотека после очистки препаративным гель-электрофорезом. В результате была получена новая комбинаторная библиотека для селекции направляющих нуклеазу Cas9 sgРНК с равномерно допированной на 15% вариабельной 61-нуклеотидной центральной областью, которая соответствует фрагменту sgРНК, ответственному за взаимодействие с белком. 3.3. Оптимизация условий in vitro селекции Принципиальная схема in vitro селекции sgРНК включала в себя предформирование комплексов sgРНК-библиотеки с белком Cas9, инкубацию полученных комплексов с дцДНК-мишенью, выделение целевых трехкомпонентных комплексов, их денатурацию с выделением РНК, амплификацию РНК через ОТ-ПЦР и транскрипцию in vitro (рис. 20). Чтобы исключить возможность расщепления ДНК-мишени, селекцию проводили в отсутствие строго необходимых для расщепления (но не для образования комплекса) катионов магния. Рисунок 20. Схема in vitro селекции sgРНК для нуклеазы Cas9. 43

Важным моментом при составлении протокола селекции является выбор способа выделения целевых комплексов НК:белок. В данной работе для выделения трехкомпонентных комплексов sgРНК:Сas9:ДНК мы использовали магнитную сепарацию с использованием стрептавидин-модифицированных магнитных частиц. Этот метод позволяет существенно упростить и ускорить отделение целевых комплексов от несвязавшихся компонентов. В качестве «якоря» для иммобилизации использовали дцДНК, для этого на 3’-конец неадресуемой цепи ДНК-мишени через гибкий аминолинкер вводили биотин. Чтобы снизить возможность неспецифического связывания РНК и РНК-белкового комплекса с частицами, в цикл отбора была включена дополнительная стадия контрселекции на частицы, не нагруженные ДНК. Порядок сборки комплекса на стрептавидин-модифицированных магнитных частицах был следующим: ДНК иммобилизовали на магнитных частицах, затем комплекс sgРНК:Cas9 инкубировали с иммобилизованной биотинилированной дцДНК (рис. 20). Такой порядок сборки позволяет использовать для иммобилизации ДНК через биотинстрептавидиновые взаимодействия буферный раствор, рекомендованный производителем частиц. По составу и ионной силе он отличается от буфера для связывания, необходимого для формирования тройного комплекса РНК:белок:ДНК. В случае иммобилизации на частицы уже сформированного тройного комплекса взаимодействие частиц с биотинилированной ДНК пришлось бы проводить в буфере для связывания, который не оптимален для иммобилизации. 3.3.1. Выделение комплексов с использованием магнитных частиц Dynabeads М-280 Первоначально для выделения специфических комплексов мы использовали стрептавидин-модифицированные магнитные частицы Dynabeads M-280 (Thermo Fisher Scientific). После иммобилизации биотинилированной дцДНК емкость частиц составила 170 пмоль дцДНК на 1 мг частиц. Для селекции in vitro исходную РНК-библиотеку (340 пмоль) инкубировали с нуклеазой Cas9 (34 пмоль), затем проводили контрселекцию для удаления комплексов, неспецифически связывавшихся с поверхностью частиц, смешивая полученные комплексы с суспензией магнитных частиц, не содержащих ДНК. После магнитной сепарации комплексы sgРНК:Cas9 инкубировали с суспензией частиц, содержащих биотинилированную ДНК-мишень (34 пмоль). Затем суспензию сепарировали. Обе порции магнитных частиц (после контрселекции и после селекции) промывали буферным раствором для связывания, затем выделяли РНК реагентом Trizol и осаждали этанолом. Оба образца РНК подвергали ОТ-ПЦР в одинаковых условиях. 44

Электрофоретический анализ реакционных смесей после ОТ-ПЦР показал большое количество продукта в образце, который соответствовал неспецифической сорбции на частицах без ДНК-мишени. Целевой продукт ОТ-ПЦР после специфической сорбции практически отсутствовал (рис. 21А). Высокое содержание продуктов в неспецифической пробе и низкое – в специфической было подтверждено реамплификацией аликвот из проб 3 и 4 (рис. 21Б). Стала очевидной высокая степень неспецифического связывания комплекса sgРНК:Сas9 либо самой sgРНК с магнитными частицами. Рисунок 21. Соотношение фракций (контрселекция и положительная селекция) РНКбиблиотеки после первого раунда c использованием магнитных частиц Dynabeads M-280 Streptavidin. Анализ реакционных смесей ОТ-ПЦР в 3.5%-ном агарозном геле, окрашивание бромидом этидия, 0.5 мкг/мл. А. ПЦР реакционных смесей после обратной транскрипции: 1) маркер длины дцДНК; 2) контроль ПЦР без матрицы; 3) ПЦР ОТ смеси библиотеки после контрселекции (неспецифическое связывание); 4) ПЦР ОТ смеси библиотеки после положительной селекции (специфическое связывание). Б. Кинетика реамплификации образцов 3А (контрселекция, неспецифическое связывание) и 4А (положительная селекция, специфическое связывание): 1) маркер длины дцДНК; 2) контроль ПЦР без матрицы, 3–7) 15, 20, 25, 30, 35 циклов реамплификации аликвотной пробы, 2 мкл из образца 3А, 8–12) 15, 20, 25, 30, 35 циклов реамплификации аликвотной пробы, 2 мкл из образца 4А. Соответственно, возникла необходимость провести дополнительную серию экспериментов для выбора условий, позволяющих решить проблему неспецифического связывания sgРНК с магнитными частицами. Эти эксперименты проводили с использованием модельной sgРНК и детергента Tween 20 в конечной концентрации 0.05%, а также НК- и белковых компетиторов, таких, как суммарная тРНК дрожжей и казеин, в конечной концентрации 0.1 мг/мл. При использовании одновременно Tween 20, суммарной тРНК дрожжей и казеина соотношение полос изменилось в пользу 45

специфической пробы, однако степень неспецифического связывания по-прежнему оставалась довольно значительной (рис. 22). Рисунок 22. Специфическое и неспецифическое связывание sgРНК с частицами Dynabeads M-280 Streptavidin в присутствии 0.05% Tween 20, 0.1 мг/мл суммарной тРНК и 0.1 мг/мл казеина. Анализ реакционных смесей ОТ-ПЦР (25 циклов) в 3.5%-ном агарозном геле, окрашивание бромидом этидия, 0.5 мкг/мл: 1) маркер длины дцДНК от 50 до 1000 п.н. (минимальный фрагмент – 50 п.н.); 2) контроль ПЦР без матрицы; 3) ОТ-ПЦР sgРНК, неспецифическое связывание; 4) ОТ-ПЦР sgРНК, специфическое связывание. Далее исследовали влияние полиаденилата в качестве компонента, блокирующего поверхность частиц, в эксперименте по прямой сорбции модельной sgРНК на исходные магнитные частицы. Сначала частицы выдерживали при указанной концентрации полиаденилата, затем избыток полиаденилата удаляли промывкой буферным раствором, далее инкубировали эти частицы с раствором sgРНК. Как показал электрофоретический анализ реакционных смесей ОТ-ПЦР (рис. 23), использование предварительного блокирования полиаденилатом в высокой концентрации (200 мкМ) существенно снижает неспецифическую сорбцию. Однако при использовании столь высоких концентраций неспецифической нуклеиновой кислоты возникает риск ингибирования связывания sgРНК с Cas9. 46

Рисунок 23. Влияние блокирования частиц Dynabeads M-280 Streptavidin полиаденилатом на неспецифическое связывание sgРНК. Анализ реакционных смесей ОТ-ПЦР в 3.5%-ном агарозном геле, окрашивание бромидом этидия 0.5 мкг/мл: 1) маркер длины дцДНК от 50 до 1000 п.н. (минимальный фрагмент – 50 п.н.); 2) контроль ПЦР без матрицы (25 циклов); 3, 4) связывание sgРНК с частицами без предварительного блокирования полиаденилатом; 5, 7) частицы предварительно блокированы 200 мкМ полиаденилата; 6, 8) частицы предварительно блокированы 20 мкМ полиаденилата. Все частицы не содержали ДНКмишень. Дорожки 3, 5, 6 – 20 циклов ПЦР, 4, 7, 8 – 25 циклов ПЦР. В последующих экспериментах для более информативной оценки количества кДНК в пробе после обратной транскрипции мы использовали ПЦР в реальном времени в присутствии 1-кратного флуоресцентного красителя SYBR Green I. Был повторен модельный эксперимент по селекции с использованием sgРНК вместо комбинаторной библиотеки и с предварительным блокированием частиц высокой концентрацией полиаденилата (200 мкМ). Также в данном эксперименте была проведена количественная оценка эффективности обратной транскрипции с помощью контрольных растворов sgРНК известной концентрации. Кривые накопления ПЦР-продуктов представлены на рис. 24. 47

Рисунок 24. Специфическое и неспецифическое связывание sgРНК с частицами Dynabeads M-280 Streptavidin после блокирования 200 мкМ полиаденилата. Анализ реакционных смесей после ОТ методом ПЦР в реальном времени: 1) ОТ-ПЦР sgРНК, специфическое связывание; 2) ОТ-ПЦР sgРНК, неспецифическое связывание. ПЦР в реальном времени в присутствии 1х SYBRGreen I, RotorGene Q (Qiagen). Рассчитанные из полученных данных значения количества РНК в ОТ-смеси составили 40 фмоль для специфической пробы и 6 фмоль для неспецифической. В данном случае соотношение количества специфически и неспецифически связавшейся РНК составило около 10, при этом общее количество РНК в специфической пробе значительно ниже по сравнению с максимально возможным в данных условиях (34 пмоль). Возможно, блокирование полиаденилатом дополнительно осложняет взаимодействие комплекса sgРНК:Cas9 с ДНК-мишенью вблизи поверхности частиц. На основании полученных данных мы заключили, что магнитные частицы Dynabeads M-280 не обеспечивают необходимой степени специфического связывания комплекса Cas9:РНК с иммобилизованным ДНК-мишенью даже в оптимизированных условиях. 3.3.2. Выделение комплексов с использованием магнитных частиц NEB Streptavidin В качестве альтернативы мы протестировали стрептавидин-модифицированные гидрофильные магнитные частицы NEB Streptavidin (New England Biolabs). В данном случае после иммобилизации биотинилированной ДНК-мишени емкость магнитных частиц по ДНК составила 500 пмоль на 1 мг частиц. Неспецифическое связывание sgРНК с магнитными частицами и специфическое связывание комплекса sgРНК:Cas9 с биотинилированной ДНК-мишенью, 48

иммобилизованной на магнитные частицы, исследовали в присутствии 0.05% Tween 20 и 3 мкМ полиаденилата. РНК, полученную после обработки частиц реагентом Trizol с последующим осаждением, подвергали обратной транскрипции. Количество полученной кДНК оценивали с помощью ПЦР в реальном времени с ДНК-стандартами, а также проводили оценку эффективности обратной транскрипции с помощью контрольных растворов sgРНК известной концентрации. Рисунок 25. Специфическое и неспецифическое связывание sgРНК с гидрофильными частицами NEB Streptavidin (New England Biolabs) в присутствии 0.05% Tween 20 и 3 мкМ полиаденилата. Анализ реакционных смесей после ОТ методом ПЦР в реальном времени: 1) ОТ-ПЦР sgРНК, специфическое связывание; 2) ОТ-ПЦР sgРНК, неспецифическое связывание. ПЦР в реальном времени в присутствии 1х SYBRGreen I, Rotor-Gene Q (Qiagen). Соотношение количества кДНК в специфической и неспецифической пробах составило приблизительно 1000:1 (рис. 25). При этом количество специфической кДНК в ОТ-пробе составило 600 фмоль (соответствует 0.8–3 пмоль РНК, в зависимости от эффективности обратной транскрипции). Это можно рассматривать в качестве приемлемого значения с учетом того, что формирование комплекса с ДНК-мишенью вблизи поверхности магнитных частиц может быть затруднено. Таким образом, гидрофильные магнитные частицы New England Biolabs оказались более подходящими для in vitro селекции направляющих sgРНК в нашей системе, и были использованы для дальнейших экспериментов по in vitro селекции. 3.4. In vitro селекция направляющих sgРНК в оптимизированных условиях С использованием иммобилизованной биотинилированной дцДНК-мишени на гидрофильных магнитных частицах New England Biolabs было проведено шесть раундов 49

in vitro селекции с исходной комбинаторной библиотекой sgРНК. Для селекции наиболее аффинных молекул РНК давление отбора последовательно увеличивали, начиная с четвертого раунда. Для этого снижали избыток РНК-библиотеки по отношению к Cas9 (табл. 2). Таблица 2. Условия селекции и результаты ОТ-ПЦР для 1–6 раундов селекции sgРНК Количество Получено Количество РНК Получено РНК после связавшейся в дцДНК после Раунд для связывания с in vitro тройной комплекс ОТ-ПЦР, Cas9, пмоль транскрипции, пмоль РНК, пмоль пмоль 1 340 0.4 320 5000 2 340 0.2 340 3600 3 340 0.2 382 7000 4 113.3 0.6 400 4600 5 37.7 0.3 352 3700 6 37.7 0.6 258 5500 На каждом раунде отбора неспецифическую и специфическую фракции РНКбиблиотеки отделяли от частиц при помощи реагента Trizol, осаждали и подвергали обратной транскрипции с последующей ПЦР в течение 7–12 циклов. Аликвоты реакционных смесей после обратной транскрипции использовали для оценки количества кДНК с помощью ПЦР в реальном времени. Типичные примеры результатов анализа реакционных смесей после ОТ-ПЦР приведены на рис. 26. Рисунок 26. Соотношение фракций (контрселекция и положительная селекция) РНКбиблиотеки после пятого раунда селекции. А. Анализ реакционных смесей ОТ-ПЦР в 3.5%-ном агарозном геле, окрашивание бромидом этидия, 0.5 мкг/мл: 1) маркер длины дцДНК от 50 до 1000 п.н. (минимальный фрагмент – 50 п.н.); 2) контроль ПЦР без матрицы; 3) ОТ-ПЦР после контрселекции (неспецифическое связывание); 4) ОТ-ПЦР 50

после положительной селекции (специфическое связывание). Б. Анализ реакционных смесей после ОТ методом ПЦР в реальном времени: 1) ОТ-ПЦР sgРНК после положительной селекции (специфическое связывание); 2) ОТ-ПЦР sgРНК после контрселекции (неспецифическое связывание). ПЦР в реальном времени в присутствии 1 х SYBRGreen I, Rotor-Gene Q (QIAGEN). Реакционные смеси специфической фракции после обратной транскрипции амплифицировали с учетом данных, полученных с помощью ПЦР их аликвот в реальном времени. Аликвоты из амплифицированной фракции специфического связывания дополнительно реамплифицировали для наработки дцДНК-матрицы в количестве, достаточном для проведения in vitro транскрипции. После in vitro транскрипции с ДНКампликонов были получены обогащенные РНК-библиотеки для следующего раунда селекции. В ходе дальнейшего отбора мы исследовали возможность использования in vitro селекции для получения вариантов sgРНК, обладающих повышенной чувствительностью к несовершенным ДНК-мишеням. Мы предположили, что использование на стадии контрселекции иммобилизованных на частицах ДНК-мишеней с однонуклеотидными заменами позволит исключить из библиотеки пул молекул РНК, не различающих совершенный и несовершенный субстраты. За счет этого можно было ожидать обогащения библиотеки вариантами РНК, селективно узнающими только совершенную ДНК-мишень. В качестве несовершенных ДНК-мишеней мы использовали два 50нуклеотидных ДНК-дуплекса, каждый из которых содержал по одному точечному нуклеотидному несоответствию вне затравочной области (рис. 27) . Рисунок 27. Последовательность несовершенных ДНК-мишеней. Красным цветом выделены однонуклеотидные замены вне затравочной области. В экспериментах этого типа мы использовали по два раунда отбора для каждой из несовершенной ДНК-мишени. В каждом случае раунд начинался с контрселекции на 51

несовершенную мишень. При этом использовали следующий протокол: обогащенную РНК-библиотеку (37.7 пмоль), полученную после предыдущего раунда, инкубировали с Cas9 (34 пмоль), затем проводили контрселекцию – смешивали полученные комплексы с суспензией магнитных частиц, несущих несовершенную ДНК-мишень с однонуклеотидными заменами (34 пмоль). После магнитной сепарации комплексы sgРНК:Cas9, не связавшиеся с несовершенной ДНК-мишенью, инкубировали с суспензией частиц, несущих совершенную ДНК-мишень (34 пмоль). Суспензию сепарировали, обе порции магнитных частиц (после контрселекции и после селекции) промывали буферным раствором, затем выделяли РНК при помощи реагента Trizol, осаждали этанолом и подвергали ОТ-ПЦР (табл. 3). Таблица 3. Условия селекции и результаты ОТ-ПЦР для последующих раундов отбора sgРНК с дополнительной стадией контрселекции на несовершенные ДНК-мишени Количество Количество Получено Получено РНК связавшейся в Несовершенная РНК, для дцДНК после in vitro Раунд тройной ДНК-мишень связывания с после ОТтранскрипции, комплекс РНК, Cas9, пмоль ПЦР, пмоль пмоль пмоль 7 8 9 10 М1 (ДНК3:ДНК4) 37.7 0.06 250 3700 37.7 0.06 300 7200 М2 (ДНК5:ДНК6) 37.7 0.1 200 4400 37.7 0.01 240 7700 Всего в ходе выполнения in vitro селекции было получено 10 обогащенных РНКбиблиотек. На заключительном этапе работы была проведена оценка функциональной активности РНК-библиотек, а именно их способности индуцировать расщепление совершенной и несовершенной ДНК-мишеней нуклеазой Cas9. 3.4.1. Сравнительное исследование функциональной активности sgРНКбиблиотек Чтобы оценить, как изменяется функциональная активность РНК-библиотек в ходе селекции, мы исследовали их способность индуцировать расщепление ДНК-мишеней нуклеазой Cas9 при разных концентрациях комплекса Cas9:РНК. Для слежения за ходом расщепления на 3’-конец неадресуемой цепи ДНК-мишени была введена флуоресцентная метка – цианиновый краситель Cy5. Продукты расщепления анализировали электрофорезом в денатурирующем ПААГ и визуализировали при помощи сканера Typhoon. На рис. 28 приведены кривые расщепления флуоресцентно меченой 52

совершенной ДНК-мишени. В качестве сравнения была взята исходная sgРНК. Можно видеть, что стартовая комбинаторная библиотека РНК обеспечивает значительно более низкую эффективность расщепления по сравнению с sgРНК. Это говорит о том, что даже 15%-ное допирование всех нуклеотидных позиций в случайной области приводит к появлению в комбинаторной библиотеке довольно значительной фракции функционально неактивных вариантов направляющих РНК. Уже после первого раунда селекции эффективность расщепления РНК заметно выросла и затем последовательно увеличивалась в ходе отбора. После 10 цикла кривая расщепления практически совпадала с аналогичной кривой для исходной sgРНК. Это говорит о том, что мы выбрали адекватную стратегию селекции и отбор РНК идет в нужном направлении. Необходимо отметить, что полученные результаты расщепления ДНК с использованием обогащенных РНК-библиотек отражают усредненную функциональную активность сразу всего набора молекул РНК в каждой библиотеке. Можно предполагать, что в составе этого набора есть индивидуальные РНК, которые обеспечат повышенную эффективность расщепления по сравнению с исходной направляющей РНК. Cтепень расщепления, % M0 (совершенная ДНК-мишень) 100 sgРНК R0 R1 R4 R6 80 60 40 R8 R10 20 0 50 -20 100 150 200 Cas9:РНК, нM Рисунок 28. Кривые расщепления совершенной ДНК-мишени комплексами Cas9 c исходной sgРНК и с РНК-библиотеками. R0 – стартовая РНК-библиотека; R1, R4, R6, R8, R10 – РНК-библиотеки после соответствующих раундов селекции. Необходимо было также проверить, как повлияло на функциональную активность обогащенных РНК-библиотек введение после 6-го цикла отбора дополнительной стадии контрселекции на несовершенные ДНК-мишени. В случае исходной направляющей РНК наблюдается несколько меньшая эффективность расщепления ДНК-мишеней с однонуклеотидными заменами по сравнению с совершенной мишенью (рис. 29А). Эта же закономерность сохраняется и для стартовой РНК-библиотеки (рис. 29Б). 53

Рисунок 29. Кривые расщепления совершенной ДНК-мишени М0 и несовершенных ДНКмишеней М1, М2 комплексами Cas9 с исходной sgРНК (А) и со стартовой комбинаторной РНК-библиотекой (Б). В случае несовершенной ДНК-мишени М1 на первых циклах отбора эффективность еѐ расщепления возрастает и после 6 раунда приближается к уровню расщепления в присутствии исходной направляющей РНК (рис. 30А). Но при добавлении контрселекции на мишень М1 после 8 раунда отбора эффективность ее расщепления начинает снижаться, и эта тенденция сохраняется к 10 раунду. Для большей наглядности данные при концентрации комплекса РНК:белок 67 нМ представлены в виде отдельной диаграммы (рис. 30В). Полученные результаты дают основания считать, что наша стратегия в принципе работоспособна, и в обогащенной библиотеке после 10 раунда будут найдены РНК, обеспечивающие повышенную точность расщепления ДНК-мишени нуклеазой Cas9. Интересно, что в случае несовершенной ДНК-мишени М2 эффективность ее расщепления также увеличивалась в ходе отбора, достигая уровня исходной sgРНК (рис. 30 Б,В). Однако, при этом дополнительная контрселекция с использованием этой ДНК никак не снизила эффективности еѐ расщепления. 54

Рисунок 30. А. Кривые расщепления несовершенной ДНК-мишени М1 комплексами Cas9 c исходной sgРНК и с РНК-библиотеками. Б. Кривые расщепления несовершенной ДНКмишени М2 комплексами Cas9 c исходной sgРНК и с РНК-библиотеками. В. Степень расщепления совершенной ДНК-мишени М0 и несовершенных ДНК-мишеней М1, М2 комплексом РНК:Сas9 при концентрации 67 нМ. R0 – стартовая РНК-библиотека; R1, R6, R8, R10 – РНК-библиотеки после соответствующих раундов селекции. Возможно, для отбора вариантов sgРНК, обеспечивающих высокую селективность по отношению к широкому спектру точечных несоответствий в составе ДНК-мишени, необходимо проводить контрселекцию на большее количество различных вариантов несовершенных мишеней, а также дополнительно оптимизировать протокол селекции. 55

3.5. Заключение В данной работе впервые был использован метод in vitro селекции для отбора новых вариантов неадресующего фрагмента в направляющих РНК для системы геномного редактирования CRISPR/Cas9. Была показана возможность использования концевых фрагментов sgРНК в качестве константных участков при создании комбинаторной РНКбиблиотеки. Создана комбинаторная библиотека направляющих РНК с равномерным 15%-ным допированием всех позиций центрального фрагмента, соответствующего неадресующей части sgРНК, наиболее активно взаимодействующей с нуклеазой Cas9. Предложен протокол in vitro селекции с выделением тройного комплекса РНК:белок:ДНК через биотинилированную ДНК, иммобилизованную на стрептавидин-модифицированные магнитные частицы, и оптимизирована методика отбора. Проведена селекция с использованием совершенной ДНК-мишени и несовершенных ДНК-мишеней, содержащих однонуклеотидные замены. Показана адекватность и работоспособность разработанного способа селекции, и показано обогащение комбинаторных библиотек РНК целевыми молекулами. Работа выполнена в рамках проекта РФФИ № 19-04-01073 «Контролируемая эволюция направляющей РНК – новый подход к повышению эффективности системы геномного редактирования CRISPR/Cas9». Публикации по результатам работы: 1. Юшкова, А. Д., Воробьев, П. Е., Тимошенко, В. В., Вохтанцев, И.П., Жарков, Д.О., Веньяминова, А.Г., Воробьева, М.А. Разработка подхода к in vitro селекции новых вариантов направляющей РНК для нуклеазы Cas9. // Материалы международной научной конференции «Biotop 2020: актуальные вопросы современной биологии» (21-24 декабря 2020, Новосибирск, Россия), с. 72. Новосибирск, ИХБФМ СО РАН, 2020, ISBN 978-591556-879-1. 56

4. Выводы 1. Создана и протестирована модельная система для in vitro селекции новых вариантов sgРНК – адресуюшего компонента нуклеазы Cas9. Показана возможность использования sgРНК в качестве прототипа комбинаторной РНК-библиотеки в ферментативных реакциях, необходимых для селекции in vitro. 2. Получена новая комбинаторная библиотека sgРНК с центральным 61-нуклеотидным фрагментом, равномерно допированным на 15% случайными нуклеотидами. 3. Оптимизирован протокол in vitro селекции новых вариантов sgРНК в системе, включающей в себя нуклеазу Cas9, синтетический дцДНК-субстрат и комбинаторную библиотеку РНК. Показано, что использование гидрофильных стрептавидин- модифицированных магнитных частиц в присутствие полиаденилата обеспечивает высокую специфичность выделения РНК, связанной в целевой трехкомпонентный комплекс. 4. Получена серия обогащенных sgРНК-библиотек после 10 раундов in vitro селекции с использованием совершенных и несовершенных ДНК-субстратов, исследована их функциональная активность. Показано, что в ходе селекции эффективность расщепления ДНК в присутствии обогащенных библиотек последовательно возрастает и достигает уровня исходной sgРНК. Использование в цикле отбора стадии контрселекции на несовершенные ДНК-мишени снижает эффективность расщепления мишени М1 к 10 циклу отбора. 57

Список литературы 1. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond // Annual Review of Biochem. – 2016. – Vol. 85. – № 1. – P. 227–264. 2. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. – 2012. – Vol. 337. – P. 816–821. 3. Doench, J. G., Hartenian, E., Graham, D. B. et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation // Nature Biotechnology. – 2014. – Vol. 32. – № 12. – P. 1262–1267. 4. Zhang, Y., Lai, B., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications // Molecules. – 2019. – Vol. 24. – № 5. – P. 941. 5. Sun, H., Zu, Y. A. Highlight of recent advances in aptamer technology and its application // Molecules. – 2015. – Vol. 20. – № 7. – P. 11959–11980. 6. Lander, E. S. The heroes of CRISPR // Cell. – 2016. – Vol. 164. – № 1–2. – P. 18–28. 7. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J. et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements // Journal of Molecular Evolution. – 2005. – Vol. 60. – № 2. – P. 174–182. 8. Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines // Genome Biol. – 2015. – Vol. 16. – № 247. – P. 1–11. 9. Sontheimer, E. J., Barrangou, R. The bacterial origins of the CRISPR genome-editing revolution // Human Gene Therapy. – 2015. – Vol. 26. – № 7. – Р. 413–424. 10. Mojica, F. J. M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J. et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defense system // Microbiology. – 2009. – Vol. 155. – № 3. – P. 733–740. 11. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2012. – Vol. 109. – № 39. – P. 2579–2586. 12. Nishimasu, H., Ran, F. A., Hsu, P. D. et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA // Cell. – 2014. – Vol. 156. – № 5. – P. 935–949. 13. Zheng, T., Hou, Y., Zhang, P. et al. Profiling single-guide RNA specificity reveals a mismatch sensitive core sequence // Scientific Reports. – 2017. – Vol. 7. – № 1. – P. 1–8. 14. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. – 2013. – Vol. 339. – № 6121. – P. 819–823. 15. Hsu, P., Scott, D. A., Weinstein, J. A. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases // Nature Biotechnology. – 2013. – Vol. 31. – № 9. – P. 827–832. 58

16. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M. et al. DNA interrogation by the CRISPR RNAguided endonuclease Cas9 // Nature. – 2014. – Vol. 507. – № 7490. – P. 62–67. 17. Lin, Y., Cradick, T. J., Brown, M. T. et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences // Nucleic Acids Res. – 2014. – Vol. 42. – № 11. – P. 7473–7485. 18. Moreno-Mateos, M. A., Vejnar, C. E., Beaudoin, J. D. et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo // Nat Methods. – 2015. – Vol. 12. – № 10. – P. 982–988. 19. Doench, J. G., Fusi, N., Sullender, M. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9 // Nat Biotechnol. – 2016. – Vol. 34. – № 2. – P. 184–191. 20. Cho, S. W., Kim, S., Kim, Y. et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases // Genome Research. – 2013. – Vol. 24. – № 1. – P. 132–141. 21. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D. et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs // Nature Biotechnology. – 2014. – Vol. 32. – № 3. – P. 279–284. 22. Wyvekens, N., Tsai, S. Q., Joung, J. K. Genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases // Current Protocols in Molecular Biology. – 2015. – Vol. 31.3. – P. 1–18. 23. Zhang, J. P., Li, X. L., Neises, A. et al. Different effects of sgRNA length on CRISPRmediated gene knockout efficiency // Scientific Reports. – 2016. – Vol. 6.1. – P. 1–8. 24. Cui, Y., Xu, J., Cheng, M. et al. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools // Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences. – 2018. – Vol. 10. – № 2. – P. 455– 465. 25. Dahlman, J. E., Abudayyeh, O. O., Joung, J. et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease // Nature Biotechnology. – 2015. – Vol. 33. – № 11. – P. 1159–1161. 26. Kocak, D.D., Josephs, E.A., Bhandarkar, V. et al. Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures // Nature Biotechnology. – 2019. – Vol. 37. – P. 657–666. 27. Liu, X., Zhang, N., Cheng, C. et al. CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CART cells // Cell Res. – 2017. – Vol. 27. – № 1. – P. 41–49. 28. Filippova, J., Matveeva, A., Zhuravlev, E. et al. Guide RNA modification as a way to improve CRISPR/Cas9-based genome-editing systems // Biochimie. – 2019. – Vol. 167. – P. 49– 60. 59

29. Fonfara, I., Le Rhun, A., Chylinski, K. et al. Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems // Nucleic Acids Research. – 2013. – Vol. 42. – № 4. – P. 2577–2590. 30. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR–Cas9 structures and mechanisms // Annual Review of Biophysics. – 2017. – Vol. 46. – № 1. – P. 505–529. 31. Flamme, M., McKenzie, L. K., Sarac I. et al. Chemical methods for the modification of RNA // Methods. – 2019. – Vol. 161. – P. 64–82. 32. Yin, H., Song, C. Q., Suresh, S. et al. Structure-guided chemical modification of guide RNA enables potent non-viral in vivo genome editing // Nat. Biotechnol. – 2017. – Vol. 35. – P. 1179– 1187. 33. Hendel, A., Bak, R. O., Clark, J. T. et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells // Nature Biotechnology. – 2015. – Vol. 33. – № 9. – P. 985–989. 34. Yamano, T., Nishimasu, H., Zetsche, B. et al. Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA // Cell. – 2016. – Vol. 165. – № 4. – P. 949–962. 35. Zetsche, B., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system // Cell. – 2015. – Vol. 163. – № 3. – P. 759–771. 36. Safari, F., Zare, K., Negahdaripour, M. et al. CRISPR Cpf1 proteins: structure, function and implications for genome editing // Cell & Bioscience. – 2019. – Vol. 9. – № 1. – P. 1–21. 37. Park, H. M., Liu, H., Wu, J. et al. Extension of the crRNA enhances Cpf1 gene editing in vitro and in vivo // Nature Communications. – 2018. – Vol. 9. – № 1. – P. 1–12. 38. Gao, P., Yang, H., Rajashankar, R. K. et al. Type V CRISPR-Cas Cpf1 endonuclease employs a unique mechanism for crRNA-mediated target DNA recognition // Cell Res. – 2016. – Vol. 26. – P. 901–913. 39. Li, B., Zhao, W., Luo, X. et al. Engineering CRISPR-Cpf1 crRNAs and mRNAs to maximize genome editing efciency // Nat Biomed Eng. – 2017. – Vol. 1. – № 5. – P. 1–10. 40. Bin Moon, S., Lee, J. M., Kang, J. G. et al. Highly efficient genome editing by CRISPR-Cpf1 using CRISPR RNA with a uridinylate-rich 3’-overhang // Nature Communications. – 2018. – Vol. 9. – № 1. – P. 1–11. 41. Dong, D., Ren, K., Qiu, X. et al. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA // Nature. – 2016. – Vol. 532. – P. 522–538. 42. Gao, Z., Herrera-Carrillo, E., Berkhout, B. Improvement of the CRISPR-Cpf1 system with ribozyme-processed crRNA // RNA Biology. – 2018. – Vol. 15. – № 12. – P. 1458–1467. 60

43. McMahon, M. A. Chemically modified Cpf1-CRISPR RNAs mediate efficient genome editing in mammalian cells // Molecular Therapy. – 2018. – Vol. 26. – № 5. – P. 1228–1240. 44. Tan, S. Y., Acquah, C., Sidhu, A. et al. SELEX modifications and bioanalytical techniques for aptamer–target binding characterization // Critical Reviews in Analytical Chemistry. – 2016. – Vol. 46. – № 6. – Р. 521–537. 45. Vorobyeva, M., Davydova, A., Vorobjev, P. et al. Key aspects of nucleic acid library design for in vitro selection // Int. J. Mol. Sci. – 2018. – Vol. 19. – P. 470. 46. Knight, R., Yarus, M. Analyzing partially randomized nucleic acid pools: straight dope on doping // Nucleic Acids Res. – 2003. – Vol. 31. – № 6. – Р. 30. 61

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Юшкова Анастасия

Данная дипломная работа посвящена разработке метода селекции вариантов направляющей РНК для CRISPR-ассоциированной нуклеазы Cas9. На сегодняшний день система CRISPR/Cas9 рассматривается как один из важнейших инструментов, используемых для направленной модификации генома in vivo. Молекула единой направляющей РНК является одним из ключевых компонентов системы CRISPR/Cas9, поскольку обеспечивает с...

почти 3 года назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

32.34

Юшкова Анастасия

Дмитрий Ипатьев, здравствуйте! Да, такие работы планируются, так как в некоторых исследованиях было показано, что наличие химических модификаций в направляющей РНК тоже может влиять на эффективность и специфичность расщепления ДНК-мишени нуклеазой Cas9

Дмитрий Ипатьев

Здравствуйте! Планируете ли вы вводить химические модификации в направляющую РНК?