МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра физиологии растений
Выпускная квалификационная работа бакалавра
студентки 4-го курса
Еремеевой Елизаветы Алексеевны
ИССЛЕДОВАНИЕ РОСТОВЫХ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК MANDRAGORA TURCOMANICA MIZG.
INVESTIGATION OF GROWTH AND BIOSYNTHETIC CHARACTERISTICS OF
CELL SUSPENSION CULTURE OF MANDRAGORA TURCOMANICA MIZG.
Научные руководители:
доц., к.б.н. Дмитрий Владимирович Кочкин
(МГУ имени М.В.Ломоносова)
с.н.с., к.б.н. Мария Владимировна Титова
(ИФР РАН)
Москва, 2021 г.
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................ 4
ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................... 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................................. 8
1. Традиционные источники получения биологически активных веществ
лекарственных и ароматических растений. ...................................................................... 8
2. Культура клеток как альтернативный возобновляемый источник растительного
сырья (биологически-активных веществ) редких и исчезающих видов
лекарственных растений.......................................................................................................... 10
2.1 Историческая справка .................................................................................................... 10
2.2 Получение культур клеток высших растений (каллусных и суспензионных)
................................................................................................................................................ 11
2.3 Условия культивирования культур клеток растений ................................................ 12
2.4. Методы характеристики культивируемых клеток растений ................................... 16
2.5. Вторичный метаболизм в культурах клеток .............................................................. 17
3. Культуры клеток редких и эндемичных видов растений – продуцентов алкалоидов
....................................................................................................................................................... 19
3.1. Алкалоиды как ценные вторичные метаболиты растений ........................................ 19
3.1.1 Общие сведения о структуре и функциях алкалоидов ........................................ 19
3.1.2. Представители редких и эндемичных видов растений как источник ценных
алкалоидов ........................................................................................................................ 20
3.1.3 Тропановые алкалоиды – биосинтез, распространение и значение .................. 21
3.2 Общая характеристика Mandragora spp. и M. turcomanica ........................................ 22
3.2.1 Описание и таксономия рода Mandragora и вида и M. turcomanica.................. 22
3.2.2 Особенности вторичного метаболизма Mandragora spp. и, в частности, M.
turcomanica ....................................................................................................................... 23
3.2.3
Физиологическая активность экстрактов Mandragora spp. и, в частности, M.
turcomanica ....................................................................................................................... 26
3.2.4
Примеры и особенности культур клеток и органов M. turcomanica, а также
таксонов, родственных Mandragora spp. ....................................................................... 27
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ...................................................................... 29
1. Описание объектов исследования ...................................................................................... 29
2
2. Условия выращивания, условия добавления метилжасмоната и сукцината ........... 29
3. Получение микрофотографий клеток ............................................................................... 30
4. Изучение ростовых характеристик культур клеток ...................................................... 30
5. Химический анализ экстрактов культур клеток ............................................................ 31
6. Анализ антимикробной активности экстрактов культур клеток ............................... 32
7. Статистическая обработка результатов ........................................................................... 34
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................................ 35
1. Морфология клеток линий Mt-20 и Mt-31 ........................................................................ 35
2. Сравнение ростовых характеристик линий Mt-20 и Mt-31 .......................................... 36
3. Химический анализ линий Mt-20 и Mt-31 ........................................................................ 45
4. Влияние добавления метилжасмоната и сукцината на ростовые и
биосинтетические характеристики линии Mt-20 ................................................................ 49
5. Анализ антимикробной активности линий Mt-20 и Mt-31 в сравнении с корнем
интактного растения по отношению к Staphylococcus aureus ........................................... 51
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................................................................... 55
ВЫВОДЫ .................................................................................................................................... 56
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................................... 57
ПРИЛОЖЕНИЕ ......................................................................................................................... 65
БЛАГОДАРНОСТИ .................................................................................................................. 68
3
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
БАВ – биологически активные вещества
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГХ/МС – газовая хроматография/масс-спектрометрия
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИМК – индолилмасляная кислота
ИУК – индолилуксусная кислота
ИФР РАН – Институт физиологии растений Российской академии наук
НУК – нафтилуксусная кислота
УЭЖХ-ИЭР-МС - ультраэффективная жидкостная хроматография массспектрометрия с ионизацией электрораспылением
ЦНС – центральная нервная система
HEPES – 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
M. – Mandragora
MES – 2-N-морфолиноэтансульфоновая кислота
S. – Staphylococcus
TRIS – трисгидроксиметиламинометан
4
ВВЕДЕНИЕ
Растения использовались в медицине ещё до новой эры, задолго до существования
современной науки. Почти половина лекарств в Государственной Фармакопее России
получены при переработке лекарственных растений [Салова, Громова, 2016], многие виды
растений также употребляются в пищу. Этим обусловлен интерес к изучению растений как
в фундаментальных, так и в прикладных отраслях науки.
Удобными
объектами
для
экспериментов
и
потенциальными
продуцентами
необходимых для человека биологических веществ являются культуры клеток и органов
растений – уникальные биологические системы, выращиваемые на искусственных средах в
контролируемых условиях. Преимущества этих объектов заключаются в быстром росте и
высокой продуктивности. Такие культуры удобно использовать для производства веществ,
которые сложно получить путём химического синтеза. Помимо этого, затраты ресурсов при
работе с культурами относительно невысоки, следовательно, эта технология экономически
выгодна.
Различные вторичные метаболиты растений широко используются в медицине. Одна
из важных групп, которую выделяют во всём многообразии вторичных соединений –
алкалоиды. Алкалоиды синтезируются растениями из разных семейств, например,
пасленовые (Solanaceae), бобовые (Fabaceae), лютиковые (Ranunculaceae) и пр.
[Aniszewski, 2007]. Они находят применение в различных областях медицины в качестве
спазмолитиков, успокоительных, антиоксидантов, противораковых средств и др. Их
получение за счет искусственного органического синтеза затруднено, т.к. связано со
сложностью и высокой стоимостью организации многостадийного процесса, достаточно
низким выходом продукта.
Основными источниками алкалоидов сейчас являются
растения-продуценты. Однако многие виды этих растений относятся к редким и
исчезающим,
при
этом
не
все
виды
одинаково
просто
культивировать
на
сельскохозяйственных угодьях, это требует затрат ресурсов. Кроме того, выделение
алкалоидов из растительного сырья может быть затруднено их низкой концентрацией.
Культуры клеток и органов растений-продуцентов могут быть альтернативным источником
алкалоидов, что позволит получать эти вторичные метаболиты в лабораторных, а затем и в
промышленных условиях.
Мандрагора – растение, в течение многих веков использовавшееся как лекарственное
в Европе и на Ближнем Востоке. Её упоминали в своих трудах Диоскорид и Авиценна.
Мандрагору использовали для облегчения боли, в качестве снотворного, а также в
ритуальных и мистических практиках. Ещё в XIX веке из растений рода Mandragora были
выделены различные алкалоиды тропанового ряда, такие как гиосцин и гиосциамин. Они
5
способны связываться с
ацетилхолиновыми
рецепторами, что
и
обуславливает
производимый ими эффект: обезболивающий, успокоительный. При дальнейших
исследованиях были обнаружены другие алкалоиды и прочие вторичные метаболиты
[Hanuš et al., 2005].
При этом мандрагора распространена достаточно локально – в некоторых областях
Средиземноморья, Передней и Средней Азии, в Гималаях. Вид Mandragora turcomanica или
мандрагора туркменская, описанный в 1942 году, является эндемичным для Туркменистана
и, по данным статьи 2003 года, Ирана [Akhani, Ghorbani, 2003]. В 1999 году в естественных
условиях произрастало не более 500 растений этого вида.
Таким образом, растения рода Mandragora являются эффективными продуцентами
алкалоидов, а сложность их культивирования в искусственных условиях делает
целесообразным получение культур клеток из растений данного рода. В частности, в
последние годы в лаборатории Института физиологии растений Российской Академии наук
(ИФР РАН) была получена культура клеток вида M. turcomanica, находящегося под угрозой
исчезновения.
Получение культур клеток и органов видов-продуцентов с последующим анализом
синтезируемых ими веществ является важной и непростой задачей. Как показывает анализ
доступных литературных источников, достаточно сложно получить растительные объекты
in vitrо, в которых сохраняется синтез алкалоидов. Спектр вторичных метаболитов,
производимых культурой, в большинстве случаев значительно отличается от веществ,
получаемых из целого растения. Поэтому важен не только комплексный анализ ростовых и
биосинтетических особенностей культур-продуцентов, но и исследование возможностей
повышения их продуктивности по целевым продуктам (биомассе и целевым метаболитам).
Также желательно исследовать биологическую активность веществ, синтезируемых
культурами клеток, для оценки потенциальных направлений их практического применения.
Таким образом, целью данной работы является исследовать ростовые характеристики,
спектр синтезируемых вторичных метаболитов и биологическую активность линий Mt-20
и Mt-31 суспензионной культуры клеток M. turcomanica.
6
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать динамику роста по сырой и сухой массе клеток для линий Mt-20 и Mt31 при разной плотности посадки и разной концентрации сахарозы в среде.
2) Исследовать спектр синтезируемых вторичных метаболитов для каждой линии в
сравнении с корнем интактного растения методом УЭЖХ-ИЭР-МС. Исследовать
влияние метилжасмоната на ростовые параметры и состав синтезируемых
метаболитов.
3) Исследовать антимикробную активность экстрактов линий Mt-20 и Mt-31 и корня
интактного растения.
7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Традиционные источники получения биологически активных веществ
лекарственных и ароматических растений.
До разработки культур клеток и органов для получения необходимых метаболитов
использовалось растительное сырьё, собранное в дикой природе или на полях. Этот метод
активно применяется и в современной промышленности.
Первые свидетельства об использовании трав для лечения заболеваний обнаружены на
шумерских глиняных табличках. Известно об использовании трав древними египтянами,
вавилонянами, греками, римлянами, персами. Первым учёным, научно пытавшимся
обосновать применение растений при различных заболеваниях, был Гиппократ в труде
Corpus Hippocraticum. Другой древнейший труд по медицине, включающий описание
использования трав, называется Аюр-Веда и создан в Индии.
На территории России травы использовались ещё со времён скифов, чему можно найти
подтверждения в археологических данных, а также в иностранных летописях того времени.
Фитотерапию широко использовали на протяжении всей истории. В 1714 году при
правлении Петра I был организован петербургский Аптекарский огород, что положило
начало систематическому изучению лекарственных растений [Пельтихина, Морозова,
Морозов, 2018].
По данным онлайн-списка «The plant list» [The Plant List] в мире описано более 350
тысяч видов растений, и для 10-15% из них проводились исследования на наличие БАВ
[Смирнова, Киселева, 2009]. Названия официальных лекарственных растений содержатся в
государственном реестре лекарственных средств, в народной медицине используется
значительно больше видов, однако эффективность применения многих из них не доказана.
Около 45% лекарств в Государственной Фармакопее России получены при промышленной
переработке лекарственных растений [Салова, Громова, 2016].
Как правило, для получения биологически активных веществ (БАВ) используется не
всё растение, а наиболее богатая необходимыми веществами часть. К подземным частям
растения относятся корни, корневища, клубни и луковицы. Они, как правило,
заготавливаются весной или осенью. Надземную часть травянистых растений часто
собирают полностью во время цветения, такое сырьё называется травой. Плоды и семена
собираются после полного созревания, листья, стебли и цветки – во время цветения. Если
необходимые бутоны или почки, их собирают до распускания. Кору заготавливают весной.
8
Собранное сырьё очищается от примесей, повреждённых частей, подземные части, как
правило, моются. Затем сырьё сушат в отсутствие прямых солнечных лучей в сухих,
затенённых помещениях при комнатной температуре и измельчают. В редких случаях
сырьё замораживают или используют в свежем виде.
Для
получения
различных
БАВ
используются
растительные
экстракты,
изготавливаемые, как правило, из высушенного сырья. Для сырья определяют такие
параметры, как степень измельчения, насыпную массу и коэффициент поглощения
экстрагента. Далее к сырью добавляют экстрагент. В различных случаях используются
этанол, метанол, ацетон, вода или их смеси. Экстракцию проводят в течение нескольких
часов, часто – несколько суток при температуре, которую подбирают отдельно для каждого
экстракта. По окончании экстракции экстракт при необходимости отстаивают, затем
фильтруют. В некоторых случаях одно и то же сырьё обрабатывают экстрагентом
несколько раз, в конце объединяя полученные фракции. Для получения вещества в сухом
виде экстракт выпаривают или же отстаивают при определённой температуре до выпадения
осадка, который фильтруют и высушивают – в нём содержится необходимое вещество
[Averyanova et al., 2017; Базарова, Иванченко, 2016].
Есть множество других, более современных способов экстракции. Экстракция под
давлением позволяет избежать повышенных температур, при которых разрушаются
некоторые молекулы. При экстракции с использованием ультразвука или микроволн
различной интенсивности и длительности сырьё в смеси с растворителем подвергают
воздействию соответствующих волн. При сверхкритической флюидной экстракции в
качестве растворителя используется сверхкритический флюид – во многих случаях это
углекислый газ. Вещество находится при температуре и давлении, которые лежат выше
критической точки, где нет традиционного жидкого или газообразного состояния вещества,
а существует новое по свойствам состояние – сверхкритический флюид. В случае метода
импульсного электрического поля сырьё обрабатывается короткими импульсами поля с
высокой напряжённостью, что приводит к разрушению растительных клеток. Также для
экстракции используются высоковольтные разряды [Khaw et al., 2017; Ligor et al., 2018; Xu
et al., ]. Методы могут как использоваться для полной экстракции, так и являться её первым
этапом, необходимым для более быстрого и полного извлечения БАВ [Roselló-Soto et al.,
2014].
Для качественного и количественного определения веществ в экстрактах используются
такие методы как титриметрия, спектрофотометрия, высокоэффективная жидкостная
хроматография (ВЭЖХ) [Базарова, Иванченко, 2016].
9
2.
Культура
клеток
как
альтернативный
возобновляемый
источник
растительного сырья (биологически-активных веществ) редких и исчезающих видов
лекарственных растений
2.1. Историческая справка
Основателем культур клеток растений признан немецкий учёный Габерландт.
В
документе 1902 года он писал о теоретической возможности получения культур одиночных
растительных клеток и о возможном применении этой системы. Габерландт проводил
эксперименты на дифференцированных клетках, таких как клетки зелёного листа, но не
добился успеха – система не воспроизводилась дальше нескольких первых клеточных
делений [Robbins, 1922; Sugiyama, 2015; Thorpe, 2007].
В дальнейшем были получены культуры меристематических тканей из кончиков
корней и побегов [Loo, 1945; Robbins, 1922; Sugiyama, 2015; Thorpe, 2007]. Удалось
получить культуру и из зародышей, в которых также преобладают меристемы [LaRue, 1936;
Thorpe, 2007].
Следующим
шагом было получение культур клеток из
более
дифференцированных тканей. Важным этапом здесь стали работы Готре, который работал
с камбием клёна, Нобекора, вместе с Готре работавшим над получением культуры клеток
из корня моркови при добавлении индолилуксусной кислоты (ИУК), и Уайта, получившего
культуру из клеток генетической опухоли гибрида двух видов табака.
В дальнейшем были получены каллусные культуры для многих видов растений,
включая голосеменные [Thorpe, 2007]. В 1950-х годах при выращивании культуры клеток
табака был выделен кинетин – первый цитокинин, образовавшийся в среде при распаде
ДНК. После этого различные сочетания разных ауксинов и цитокининов были опробованы
для стимуляции роста культур. Было показано, что высокое содержание кинетина
относительно ИУК вызывало рост побегов, а низкое – корней. Большие количества ИУК и
кинетина стимулировали рост клеточной массы без её дифференцировки. [Sugiyama, 2015;
Thorpe, 2007]. Открытие ауксинов и цитокининов позволило проводить опыты по
органогенезу растений in vitro и выделить 3 стадии органогенеза: на первой стадии
возникает компетентность клеток, которая может быть вызвана гормонами в различных
концентрациях и сочетаниях, на второй стадии под влиянием определённого соотношения
гормонов определяется направление органогенеза, т.е. какой орган будет сформирован, и
на третьей стадии происходят морфологические изменения, не зависящие от внешних
фитогормонов. Удалось получить и биполярный зародыш in vitro.
10
В начале 1940-х были получены культуры клеток из частей женского гаметофита и чуть
позднее – из мужского гаметофита. В 1962, была опубликована статья с информацией о
первом удачном опылении и оплодотворении in vitro [Thorpe, 2007].
Первые культуры, начало которым давали одиночные клетки, были получены в 1950-х
для Tagetes erecta (бархатцы прямостоячие) и Nicotiana sp. (табак) [Muir, Hildebrandt, Riker,
1958; Thorpe, 2007]. Вначале культуры пытались выращивать на фильтровальной бумаге,
помещённой поверх растущего каллуса, затем для этого стали использовать жидкие среды.
В это же время была разработана технология для получения колоний из клонов
единственной растительной клетки и получило широкое применение микроклональное
размножение [Thorpe, 2007].
Расширить спектр культивируемых видов позволила разработка новой среды – MS,
которая пришла на смену средам Кнопа и Успенского [Murashige, Skoog, 1962]. В наше
время среда MS является самой распространённой при выращивании культур клеток
[Thorpe, 2007].
В наши дни культуры клеток растений используются всё шире. Получены культуры
клеток различных травянистых и древесных растений, включая такие сельскохозяйственно
важные категории как злаки, корнеплоды, масличные и фруктовые культуры [Thorpe, 2007].
Культуры клеток продолжают изучать как отдельную систему: исследуются основные
физиологические параметры различных культур клеток и тканей, такие как дыхание и
потребность в различных веществах при росте [Smith, 1980], их структурные особенности,
в частности, агрегированность для суспензионных культур, способность к органогенезу и
эмбриогенезу [Fukuda, Komamine, 1980; Zimmerman, 1993]. В биотехнологии культуры
клеток используют для микроклонального размножения, получения межродовых и
межвидовых гибридов [Kaneko, Bang, 2014], гаплоидных растений [Steffenson et al., 1995],
для применения генной инженерии [Horsch et al., 1985] и слияния протопластов с
последующим получением целого растения [Johnson, 1998].
Другим важной областью для использования клеточных культур является получение
вторичных метаболитов. Известно, что многие культуры являются лучшими продуцентами
ценных метаболитов, чем интактные растения [Thorpe, 2007], например, Taxus spp.,
Duboisia spp [Kolewe, Gaurav, Roberts, 2008]. Таким образом, открытые в XX веке культуры
клеток и тканей растений сейчас обладают широкой применимостью.
2.2. Получение культур клеток высших растений (каллусных и суспензионных)
Для получения культуры клеток необходим эксплант из ткани растения – небольшой
участок, высеченный из живой ткани. Во многих случаях экспланты получают из растений,
11
оплодотворённых и пророщенных в лабораторных условиях [Kumar, Tata, 2010; Yemets et
al., 2003; Суханова, Соболькова, 2018]. Изначально успехи в получении культур были
достигнуты при использовании участков различных меристематических тканей в качестве
эксплантов [Thorpe, 2007], однако сейчас получают культуры и из постоянных тканей
растения, не обладающих меристематической активностью [Globa et al., 2009; Суханова,
Соболькова, 2018].
Итак, эксплант стерилизуют и помещают на питательную среду, содержащую
необходимые питательные вещества, витамины и гормоны. Для каллусообразования
используют твёрдые среды, приготовленные с добавлением агара или других желирующих
добавок. Для успешного развития клеток в культуре необходим источник углерода, в
качестве которого часто используется сахароза, различные макро- и микроэлементы и
гормоны, в частности, ауксины и цитокинины. Также необходимо поддержание pH,
температуры и концентрации кислорода [Stafford, Morris, Fowler, 1986].
Для получения суспензионной культуры клеток небольшой объём выросшего каллуса
помещают в жидкую среду и культивируют при постоянном перемешивании [Globa et al.,
2009; Khandy et al., 2017; Kolewe, Gaurav, Roberts, 2008]. Реже используется помещение в
жидкую среду первичного экспланта. При посадке необходимо соблюдать определённую
плотность инокулята: как для лучшего выживания культуры, так и для быстрого нарастания
биомассы. Для пересадки каллусных и суспензионных культур небольшой объём каллуса
или клеток из жидкой среды соответственно в стерильных условиях помещают на новую
среду и продолжают культивирование.
2.3. Условия культивирования культур клеток растений
Для роста клеточных культур необходимы определённые условия: питательные среды
определённого состава и pH, а также необходимые физические параметры: концентрация
кислорода, температура, в некоторых случаях свет, для суспензионных культур важно
постоянное перемешивание.
Питательные среды для культур можно разделить на твёрдые и жидкие. В твёрдые
среды добавляется желирующий агент. Как правило, им является агар, хотя есть
исследования, в которых говорится о возможности использования других веществ, таких
как камеди, и в частности, геллановая камедь [Babbar, Jain, Walia, 2005; Jain, Babbar, 2002],
изубгол [Babbar, Jain, 1998], крахмал или пектины [George, Hall, Klerk De, 2008]. В жидкие
среды желирующий агент не добавляется, по сути, они являются раствором необходимых
солей, витаминов и гормонов в дистиллированной воде.
12
Среди неорганических веществ, входящих в состав питательных сред, можно выделить
макро- и микроэлементы. К макроэлементам относят азот, фосфор, серу, калий, кальций и
магний. К микроэлементам – бор, хлор, марганец, цинк, никель, медь, железо и молибден
[George, Hall, Klerk De, 2008]. Все эти элементы добавляются в среду в виде катионов или
анионов. Азот может вноситься в среду как в виде катиона NH4+, так и в виде аниона NO3-,
и в некоторых средах, в частности в среде Мурасиге и Скуга (MS) используются обе этих
формы одновременно. Некоторые элементы, такие как натрий, иод, кобальт или кремний
необходимы для выращивания культур клеток определённых групп растений. Такие
химические элементы-органогены как водород, кислород и углерод также частично входят
в неорганические соли, помимо этого кислород может поступать при аэрации, а источником
углерода служат вносимые в среду углеводы, как правило, сахароза в концентрации 2-4%.
Из витаминов наиболее необходим тиамин, однако во многих средах также
присутствуют
пиридоксин,
никотиновая
кислота
и
мио-инозитол
(мезоинозит),
ускоряющие рост культур. Другие витамины, например, пантотеновая или L-аскорбиновая
кислота используются значительно реже. В целом, в разных случаях витамины могут быть
как абсолютно необходимы, так и нет, а в определённых экспериментах показывают даже
ингибирующий эффект [Gamborg et al., 1976; George, Hall, Klerk De, 2008]. В некоторых
экспериментах в среды добавляют также различные экстракты из дрожжей, растительных
или животных тканей [George, Hall, Klerk De, 2008].
Также для роста и, при необходимости, дифференцировки клеточных культур нужны
растительные гормоны. Почти во всех средах содержатся те или иные ауксины и
цитокинины. Из ауксинов чаще всего используют синтетический 2,4-D, хотя в некоторых
ситуациях вместо него используют НУК или ИУК [Gamborg et al., 1976; George, Hall, Klerk
De, 2008]. Ауксин применяют для поддержания пролиферации в культуре, для образования
каллуса из экспланта и для ризогенеза, причём для получения каллуса чаще используют 2,4D, а для органогенеза НУК или ИМК [George, Hall, Klerk De, 2008].
Из
цитокиинов
достаточно
часто
используют
как
природные,
например,
изопентиниладенин и транс-зеатин, так и искусственные, в частности, кинетин.
Цитокинины так же, как и ауксины, зачастую в комбинации с ними, используются для
поддержания пролиферации клеток и каллусогенеза. Также их применяют для
дифференцировки побегов из каллуса. Есть данные, что цитокинины
способствуют
агрегированности клеток в культуре, тогда как ауксины, наоборот, увеличивают число
отдельных клеток [George, Hall, Klerk De, 2008].
13
Другие гормоны используются значительно реже. Гибберелины, в частности, GA3
применяют при выращивании культур с низкой плотностью клеток, также используют для
предотвращения морфогенеза в культурах. Абсцизовая кислота, наоборот, способствует
дифференцировке каллусов. Этилен в различных экспериментах показывает как
стимулирующее, так и ингибирующее влияние на деление клеток и морфогенез [George,
Hall, Klerk De, 2008].
К наиболее распространённым средам для культивирования можно отнести МурасигеСкуга (MS), Гамборга-Эвелега (Б5), Шенка и Гиберландта (SH), Хеллера (HE), Чу (N6) и
другие [Gamborg et al., 1976; Назаренко и др., 2018]. Среду выбирают в зависимости от
объекта и экспериментальных задач.
Среда MS является наиболее универсальной и широко используется для различных
клеточных культур. Среда Уайта применяется для выращивания побегов при регенерации,
среда Б5 часто применяется для культур клеток бобовых. Более низкое содержание
аммония в этой среде может быть полезно при выращивании некоторых культур в
периодических биореакторах. Среда SH похожа по минеральному составу на Б5, хотя
содержание некоторых солей в ней выше. Среда N6 часто используется для культур клеток
злаков [Gamborg et al., 1976; Назаренко и др., 2018].
Для выращивания культур клеток необходим оптимальный pH. Для каждой культуры
он может быть установлен опытным путём, так, пролиферация в культуре побегов Camellia
sasanqua была наилучшей при pH равном 5-5,5 [Torres, Carlisi, 1986]. Однако в целом клетки
в культурах обычно способны выжить в пределах pH от 4,0 до 7,2. При выращивании
культур в начале цикла, как правило, стремятся установить pH около 5,6-6,0. pH влияет на
поглощение ионов клетками. Как правило, катионы легче поглощаются при более высоких
значениях pH, анионы – при более низких [George, Hall, Klerk De, 2008].
Для поддержания pH могут использоваться различные соединения, такие как
органические кислоты и другие органические соединения: TRIS, MES, HEPES. В частности,
использование MES помогает поддержанию жизнеспособности при получении культуры из
одиночных протопластов [Muller, Ionier, Caboche, 1983]. Также поддержанию pH
способствует наличие в среде культивирования как NH4+, так и NO3-. При более низком pH
легче поглощается нитрат как анион, однако, уменьшение его концентрации приводит к
повышению pH среды до значений, при которых поглощаются уже катионы аммония,
вследствие чего pH опять снижается.
14
При автоклавировании pH сред, в которые добавлены сахара, снижается, так, в среде
MS с 3-3,4% сахарозы pH после автоклавирования падает от 5,7 до 5,5-4,6 по данным разных
авторов. Длительное хранение среды также вызывает снижение pH, однако при хранении в
темноте этот эффект выражен несильно. Добавление агара, наоборот, вызывает рост pH в
среде [George, Hall, Klerk De, 2008].
При начале культивирования в средах одного состава с различным pH он, как правило,
приходит к определённому значению, не зависящему от начального, в течении нескольких
дней. Характерно небольшое снижение pH на начальных этапах роста и его повышение
ближе к концу цикла выращивания, это показано, в частности, на культуре Dioscorea
deltoides [Butenko et al., 1984].
Как правило, культуры клеток выращиваются при постоянной температуре, различной
в разных лабораториях, но близкой к 25˚C. Культуры клеток тропических видов в
некоторых случаях выращивают при более высоких температурах, чем видов умеренных
широт. Неоптимально низкие или высокие температуры негативно влияют на культуру, при
этом при температурах ниже оптимума скорость роста снижается, при чрезмерно высоких
– увеличивается [George, Hall, Klerk De, 2008].
Для определённых целей используют кратковременное выращивание при низких
температурах Например, этот метод применяется для индукции роста корней и побегов у
каллусов [Negrutiu, Jacobs, 1978].
Свет при выращивании культур не является обязательным фактором, т.к. многие
культуры переходят к полностью гетеротрофному образу жизни. На многие культуры
освещение оказывает ингибирующее воздействие [George, Hall, Klerk De, 2008; Michler,
Lineberger, 1987]. Однако, рост некоторых культур стимулируется светом, и для более
интенсивного роста некоторых каллусных культур важно правильно подобрать длину
волны и интенсивность освещения [Seibert, Wetherbee, Job, 1975].
Освещение может вызвать образование в клетках хлоропластов, хотя к автотрофному
существованию они всё же не переходят. Большую роль в образовании хлоропластов часто
играет именно свет из красной области спектра. Хлоропласты, образовавшиеся в культурах
клеток часто более разнообразны по форме, чем хлоропласты интактного растения [George,
Hall, Klerk De, 2008].
Интересно, что варьирование длины светового дня и температуры может
способствовать различным процессам в культуре. Так, при экспериментах с культурой
побегов Artocarpus heterophyllus максимальная сухая масса вырастала при 30 ˚C и
15
ежедневном 12-часовом освещении, а оптимальное число побегов развивалось при 25 ˚C и
освещении в течении 12 или 16 часов в сутки [Rahman, Blake, 1988].
Также освещение может увеличить активность определённых ферментов и привести к
синтезу вторичных метаболитов [George, Hall, Klerk De, 2008].
2.4. Методы характеристики культивируемых клеток растений
Для характеристики клеточных культур используется ряд параметров. Так, у
каллусных и суспензионных культур взвешиванием можно измерить сырую и сухую массу.
У суспензионных культур, помимо этого, оценивают осаждённый и упакованный объёмы:
первый
определяют
после
осаждения
клеток
в
цилиндре,
другой
–
после
центрифугирования. К определению плотности клеток подходят по-разному: нормируют
сухую массу клеток на объём среды культивирования, подсчитывают число клеток в камере
Фукса-Розенталя [Демидова, Решетняк, Носов, 2006] или аналогичных устройствах или
определяют оптическую плотность клеток. Быстрым и удобным способом характеристики
роста культуры также является измерение электрической проводимости клеток, связанное
с накоплением ими ионов в процессе роста. [Godoy-hernández, Vázquez-flota; Ryu, Lee,
Romani, 1990].
Одним из основных параметров, позволяющих описать рост, является S-образная
кривая роста, которую получают, определяя плотность культуры через определённые
промежутки времени в течение одного субкультивирования. По Р.Г. Бутенко в кривой роста
суспензионной культуры клеток выделяют 6 стадий: лаг-фаза, для которой характерно
сохранение первоначальной плотности посадки, фаза ускорения роста, экспоненциальная
фаза, во время которой клетки активно делятся, фаза замедления роста, фаза стационара, на
которой плотность поддерживается на одном уровне, но в некоторых случаях снижается
жизнеспособность, и фаза деградации, когда плотность и жизнеспособность культуры
снижается [Бутенко, 1999]. Подобное выделение фаз применяется и в зарубежной
литературе [George, Hall, Klerk De, 2008].
Кривая роста строится в прямых или в полулогарифмических координатах (плотность
от времени или логарифм плотности от времени культивирования соответственно).
Полулогарифмические координаты удобны для определения экспоненциальной и
стационарной фазы и расчёта остальных фаз по известным (Носов, 2011).
Зная максимальную и начальную плотности суспензионной культуры, можно
рассчитать индекс роста как отношение максимальной плотности или разности между
16
максимальной и начальной плотностью к начальной. Также, зная прирост биомассы за
определённое время, по формуле или по полулогарифмической кривой роста можно
определить удельную скорость роста и время удвоения биомассы (Носов, 2011). Для
каллусных культур также можно определить индекс роста [Godoy-hernández, Vázquez-flota;
Ryu, Lee, Romani, 1990]
Экономический
коэффициент
определяют
как
отношение
разности
между
максимальной и начальной плотностью к количеству добавленного источника углерода,
обычно это сахароза. Экономический коэффициент позволяет вычислить, какая часть
субстрата тратится культурой на увеличение биомассы (Носов, 2011).
Помимо ростовых параметров можно определить и цитогенетические, например,
количество ДНК, плоидность клеток, митотический индекс – для этих методов используют
фиксированные препараты клеток [Смирнова и др., 2010]. Для определения количества
ДНК используют проточную цитофлуориметрию, для подсчёта митотического индекса –
препарат смотрят на световом микроскопе [Смирнова и др., 2010; Смоленская и др., 2005].
Ещё одним параметром, часто измеряемым у суспензионных культур, является
агрегированность, её определяют как процент агрегатов, содержащих определённое число
клеток [Демидова, Решетняк, Носов, 2006; Смирнова и др., 2010]. Агрегированность может
изменяться при изменении условий культивирования.
2.5. Вторичный метаболизм в культурах клеток
Вторичный метаболизм культуры клеток анализируют, собирая и исследуя экстракт клеток
или среду культивирования [Lee et al., 2007; Савин и др., 2015], т.к. некоторые метаболиты
обнаруживаются в среде в большем количестве, чем в экстракте клеток [Савин и др., 2015].
Во многих случаях культуры изолированных органов оказываются лучшими продуцентами
вторичных метаболитов, совпадающих с метаболитами интактного растения, чем культуры
клеток [Kolewe, Gaurav, Roberts, 2008]. В клеточных культурах спектр вторичных метаболитов
часто отличается от такового у интактного растения, а целевые вещества отсутствуют или
содержатся в следовых количествах. Это характерно, например, для культуры клеток Artemisia
annua [Liu, Zhao, Wang, 2006] или Camptotheca acuminata [Pasqua et al., 2006].
Чтобы добиться синтеза целевых вторичных метаболитов в культурах клеток, применяют
различные подходы. Один из основных – добавление веществ, вызывающих усиление
транскрипции гена вторичного метаболита, такие вещества называют элиситорами (англ.
elicitor). Т.к. многие вторичные метаболиты синтезируются растением в ответ на изменения
17
окружающей среды или для защиты от паразитов, элиситорами могут являться растительные
гормоны или вещества, синтезируемые патогенами. Так, в различных культурах клеток для
повышения выхода вторичных метаболитов широко применяется метилжасмонат – эфир
жасмоновой кислоты, растительный гормон, осуществляющий сигнальную функцию при атаке
паразита. Экспериментально доказано, что метилжасмонат вызывает увеличение синтеза
вторичных метаболитов в целом ряде культур [Gundlach et al., 1996], в том числе в культуре
клеток тиса [Yukimune et al., 1996]. В некоторых экспериментах используется сам жасмонат, а
не его эфир [Elshorbagy et al., 2018].
В различных экспериментах для активации синтеза ценных вторичных метаболитов
использовались различные неорганические ионы (Catharanthus roseus) [Болдырева, Величко,
2003], вещества, повышающие осмолярность раствора (Catharanthus roseus) [Zhao et al., 2001],
а также вещества-предшественники для целевых метаболитов или вещества, присутствие
которых направляет путь биосинтеза в сторону синтеза метаболита [Elshorbagy et al., 2018; Lee
et al., 2007; Zhao et al., 2001]. При этом, в зависимости от культуры различные вещества могут
активировать или ингибировать биосинтез: так у Catharanthus roseus сукцинат стимулирует
биосинтез аймалицина и серпентина [Zhao et al., 2001], а на Atropa belladonna действует как
ингибитор [Elshorbagy et al., 2018].
Также для увеличения продуктивности используют различные абсорбенты, добавляемые к
культуре клеток во время роста. Связывание продукта препятствует его накоплению в среде и
ингибированию биосинтеза вследствие отрицательной обратной связи. Другим способом,
приводящим к повышению выхода продукта и снижению вариабельности в суспензионных
культурах, является иммобилизация клеток в желатине, агаре или других отвердителях
[Chiang, Abdullah, 2007; Wilson, Roberts, 2012].
По меньшей мере 14 веществ, производимых культурами клеток, используются как
промышленный источник ценных метаболитов [Frense, 2007]. Наиболее известный пример –
культуры клеток тиса (Taxus spp.), используемые для производства паклитаксела (таксола) –
вещества, применяемого для лечения различных видов рака. Выделение паклитаксела из
деревьев невыгодно, т.к. из одного столетнего дерева можно получить около 300 мг этого
вещества. К другим примерам можно отнести скополамин из культуры Duboisia spp.
и
шиконин из культуры Lithospermum erythrorhizon [Kolewe, Gaurav, Roberts, 2008]. Стоит
отметить, что первый случай применения культур клеток как источника ценных метаболитов
в промышленном производстве был описан в Советском Союзе. В конце 1970-х биомассу
культуры клеток Panax ginseng использовали в производстве лекарств и косметических
средств [Решетников, Спиридович, Носов, 2014].
18
В 1995 году в России была зарегистрирован препарат Витагмал®, созданный на основе
биомассы культуры клеток Polyscias filicifolia [Пинчук, 2017], а в 1996 году на препарат был
получен международный патент как на антитератогенное средство [Kotin, Bichevaya, 1996].
В последние годы для производства различных целевых продуктов используют трансгенные
культуры клеток растений. Так, трансгенную культуру клеток моркови использовали для
синтеза фермента глюкоцереброзидазы – его приём необходим для терапии наследственной
болезни Гоше, связанной с нарушениями функций лизосом и приводящей к нарушениям
многих органов. Использование растительных, а не бактериальных культур клеток
обуславливалось тем, что для получения функционального фермента необходимо его
гликозилирование, что не удалось получить в клетке трансформированной бактерии [Wilson,
Roberts, 2012].
3. Культуры клеток редких и эндемичных видов растений – продуцентов
алкалоидов
3.1. Алкалоиды как ценные вторичные метаболиты растений
3.1.1 Общие сведения о структуре и функциях алкалоидов
Алкалоиды – это азотсодержащие вторичные метаболиты растений, как правило, с
гетероциклом в составе молекулы. Название алкалоиды происходит от латинского слова
alcali – щёлочь, т.к. благодаря атому азота в составе эти вещества обладают основными
свойствами разной степени выраженности. Все алкалоиды по типу биосинтеза и структуры
можно разделить на 3 большие группы: протоалкалоиды, псевдоалкалоиды и истинные
алкалоиды. Истинные алкалоиды синтезируются на основе антраниловой и никотиновой
кислот или аминокислот: L-орнитина, L-лизина, L-триптофана, L-фенилаланина, Lтирозина и L-гистидина. Предшественниками протоалкалоидов являются L-тирозин, Lтриптофан и L-орнитин, и представители этой группы содержат азот вне гетероцикла. Для
биосинтеза псевдоалкалоидов характерно отсутствие азота на начальных этапах биосинтеза
и присоединение его в ходе реакций аминирования и трансаминирования, а соединениямипредшественниками являются такие вещества как пируват, ацетат, гераниол и др.
[Aniszewski, 2007].
По меньшей мере четверть всех высших растений содержит алкалоиды [Aniszewski,
2007], по другим данным – пятая часть всех сосудистых растений [Matsuura, Fett-Neto,
2017]. Алкалоиды содержатся в представителях таких семейств, как барбарисовые
(Berberidaceae), бобовые (Fabaceae), кутровые (Apocynaceae), лилейные (Liliaceae),
маковые (Papaveraceae), пасленовые (Solanaceae), рутовые (Rutaceae) и др. [Aniszewski,
2007].
19
Алкалоиды являются защитными метаболитами растений: они придают органам, в
которых содержатся, горький вкус, неприятный для большинства растительноядных
животных, а также оказывают на фитофагов отравляющее действие, нарушая метаболизм и
работу нервной системы при попадании через пищеварительный тракт. Люди используют
алкалоиды в промышленности и в пищевых продуктах (широко известны, например, такие
алкалоиды как хинин и кофеин), а также для лабораторных исследований, например, в
качестве селективных ингибиторов ионных каналов. Однако наиболее широкое
применение эти вещества находят в медицине. Различные алкалоиды входят в состав
противопаразитных
препаратов,
например,
для
лечения
малярии,
обладают
антимикробным и антивирусным действием, могут влиять на работу нервной системы,
применяются в качестве обезболивающих и для лечения рака. Таким образом, алкалоиды
являются чрезвычайно важными веществами для человека. Основной источник алкалоидов
– это растения, однако использование дикорастущих видов или культивирование их в
промышленных условиях может быть сопряжено с определёнными трудностями
[Aniszewski, 2007].
3.1.2. Представители редких и эндемичных видов растений как источник ценных
алкалоидов
Многие редкие или произрастающие в пределах небольшого ареала виды растений
содержат ценные алкалоиды. Например, вид Duboisia myoporoides, эндемик восточной
Австралии, используется как продуцент скополамина [Kohnen-Johannsen, Kayser, 2019; Tran
et al., 2020]. Различные виды рода Mandragora издревле использовались в медицине
благодаря наличию в них, в частности, атропина и гиосциамина [Kohnen-Johannsen, Kayser,
2019]. Catharanthus roseus – вид-эндемик острова Мадагаскар – широко используется для
получения противораковых средств, благодаря наличию в нём таких алкалоидов, как
винбластин и винкристин [Aniszewski, 2007; Chang et al., 2014].
Очевидно, что сбор дикорастущих растений-эндемиков угрожает их экологическому
благополучию и может привести к уничтожению вида. При этом культивирование
некоторых видов в промышленных условиях может быть затруднительным. Эту сложность
можно хорошо видеть на примере тиса (Taxus spp.) – хвойного растения, различные виды
которого используются как источник паклитаксела (дитерпеноид, ацилированный
азотсодержащим ацильным остатком) – вещества, применяющегося при химиотерапии
онкологических заболеваний. Паклитаксел получают преимущественно из коры взрослого
дерева, при этом выход вещества в среднем составляет 0,01% от сухой массы. Выход из
хвои в три раза меньше (данные указаны для Taxus baccata [Globa et al., 2009]). Учитывая,
20
что выращивание дерева занимает годы, а выход продукта незначительный, цена
полученного таким образом паклитаксела очень высока. Поэтому для тиса, также как и для
других сложных в культивировании видов-продуцентов, разумно искать альтернативы
интактным растениям.
3.1.3 Тропановые алкалоиды – биосинтез, распространение и значение.
Тропановые
алкалоиды
–
многочисленная
группа
истинных
алкалоидов,
синтезирующихся на основе L-орнитина. Схема начальных этапов биосинтеза тропановых
алкалоидов представлена на рис. 1 (по [Kohnen-Johannsen, Kayser, 2019]). На основе
тропанового скелета синтезируется множество самых разнообразных молекул.
Рис. 1. Начальные этапы биосинтеза тропановых алкалоидов. Цифрами обозначены
ферменты, кроме 4. 1 – орнитиндекарбоксилаза, 2 – путресцин-N-метилтрансфераза, 3 –
N-метилпутресциноксидаза, 4 – спонтанная циклизация, 5 – поликетидсинтаза, 6 –
цитохром P450, 7 – тропинонредуктаза II, 8 – тропинонредуктаза I.
К тропановым алкалоидам относятся такие вещества как уже упомянутые скополамин
и гиосциамин, характерные для семейства пасленовые, кокаин, выделенный впервые из
Erythroxylum
coca
(кока),
полигидроксилирование
Предшественником
и
и
различные
которые
типичных
калистегины,
найдены
алкалоидов
в
для
которых
характерно
разных
классах
растений.
пасленовых
является
тропин,
а
предшественником калистегинов – псевдотропин [Kohnen-Johannsen, Kayser, 2019].
Калистегнины, гиосциамин, скополамин, тиглоидины и другие тропановые алкалоиды
были обнаружены в различных частях растений рода Mandragora со сравнительно
небольшим ареалом распространения. Таким образом, растения этого рода, и в частности,
21
вид M. turcomanica можно рассматривать как потенциальный продуцент алкалоидов. В силу
указанных выше причин, а именно, сложности культивирования и небольшой численности
природных популяций, целесообразным может быть использование в виде продуцента не
интактного растения, а культур клеток M. turcomanica.
3.2 Общая характеристика Mandragora spp. и M. turcomanica
3.2.1 Описание и таксономия рода Mandragora и вида и M. turcomanica
Мандрагора (Mandragora) — род травянистого растения семейства пасленовых
(Solanaceae). Многолетние травы с толстым, как правило, ветвящимся корнем, стебель
короткий или отсутствует. Листья крупные, овальной или ланцетовидной формы, цельные,
собраны в прикорневую розетку. Цветки одиночные, зеленовато-белые, голубые или
фиолетовые. Для растения характерен период покоя, во время которого листья могут
высыхать, а в корне сохраняется запас питательных веществ [Fogel, 2012].
Корень часто напоминает формой фигурку человека, поэтому в древности растение
называли planta semihominis (трава-получеловек).
В некоторых статьях говорится о шести современных видах мандрагоры: M. acaulis,
M. autumnalis, M. caulescens, M. officinarum, M. turcomanica, и M. vernalis [Mou, Parvin,
Dash, 2019; Schultes, 1977]. Однако более поздние исследования с использованием ДНКанализа, а также анализа морфологических и физиологических параметров ставят под
сомнение такое деление. [Fogel, 2012; Tu et al., 2010; Volis et al., 2018]. В них говорится о
пяти таксономических группах, которые можно разделить на две ветви: СредиземноморскоТуранскую и Тибетского нагорья. К Средиземноморско-Туранской относятся виды
M. officinarum L. (встречается на западном побережье Средиземного моря), M. autumnalis
Bertol. (восточное побережье Средиземного моря) и M. turcomanica Mizg. (на границе Ирана
и Туркменистана). В ветви, распространённой на Тибетском нагорье, выделяются два вида:
M. caulescens C.B. Clarke, встречающийся в лесах на юго-востоке нагорья и M. chinghaensis
Kuang & A.M. Lu, который произрастает в степях в центральной части плато.
Вид M. turcomanica был описан в 1938 году Мизгирёвой О.Ф. вблизи Кара-Кала у
подножья горы Сюнт, на юго-западне района Копет-Дага, Туркменистан [Мизгирёва, 1942].
Многолетнее
травянистое
растение,
стебель
отсутствует,
корень
толстый,
веретеновидный, до 60 см. длиной, часто разветвлённый. Листья крупные, до 90 см. длиной
и до 60 см. шириной, цельные, эллиптические или яйцевидные, собраны в прикорневую
розетку. С обеих сторон листа присутствует опушение, в основном вдоль жилок. Цветки
22
фиолетовые или пурпурные, с тремя белыми полосами в основании. Околоцветник
двойной, состоит из пяти чашелистиков и пяти лепестков, длиной 20-25 см, чашелистики,
также как и лепестки, сросшиеся у основания. В цветке пять тычинок и пестик с
одногнёздной завязью. Плод – оранжевая или жёлтая ягода, 4-6 см в диаметре.
Цветение продолжается с октября по март, плоды образуются с марта по июнь, затем
наступает период покоя.
По последним данным, полученным в результате генетического анализа, мандрагору
туркменскую правильнее рассматривать не как отдельный вид, а как реликтовую
популяцию Mandragora officinarum [Fogel, 2012].
Мандрагора туркменская занесена в международную Красную книгу.
3.2.2 Особенности вторичного метаболизма Mandragora spp. и, в частности, M. turcomanica
Мандрагора богата различными вторичными соединениями. Виды этого рода содержат
различные
алкалоиды.
Атропин
(R,S-гиосциамин),
гиосцин,
гиосциамин
и
псевдогиосциамин были выделены из растений рода Mandragora ещё в конце XIX – начале
XX веков. В 1962 при проведении хроматографии в корне M. officinarum были выявлены
атропин, гиосцин, гиосциамин, скопин и кускгигрин. Перечисленные соединения также
удалось выделить в виде кристаллических солей-пикратов. Помимо этого, бумажная
хроматография позволила выявить апоатропин и белладонины, также было показано
начилие псевдогиосциамина [Hanuš et al., 2005].
Позднее из корня, стебля и листьев M. officinarum были также выделены 2 изомера Nоксида (-)гиосциамина. Также в растениях этого вида были выявлены калистегины А3, B1
и B2, причём в надземных частях растения содержание калистегинов выше.
При исследовании свежих и высушенных корней M. autumnalis and M. officinarum были
выделены следующие алкалоиды: гиосцин, гиосциамин, кускогигрин и апоатропин. В
высушенных корнях также были обнаружены белладонины. Помимо этого, были выявлены
два эфира тиглиновой кислоты [Hanuš et al., 2005; Jackson, Berry, 1973].
Необходимо пояснить, что изначально в вышеупомянутой статье вид был указан, как
M. vernalis, но позднее этот вид перестали выделять как отдельный, поэтому сейчас
справедливо называть его M. officinarum. Сами авторы также упоминают этот вид как
M. officinarum в 1979 году [Jackson, Berry, 1979].
Атропин и гиосциамин были также выделены из различных частей растения
M. autumnalis с использованием капиллярной газовой хроматографии. Помимо уже
перечисленных веществ, известно, что в корнях растений этого вида присутствует скопин.
Растение также содержит калистегины A3, B1, B2 и B3 [Hanuš et al., 2005].
23
В статье 2019 года также упоминается, что содержание гиосциамина в корнях M.
officinarum выше, чем в других частях растения. При этом в растениях видов M. officinarum
и M. turcomanica не найдены скополамин и анизодамин (7β-гидроксигиоциамин), в отличие
от M. autumnalis [Schlesinger et al., 2019].
При исследовании всех органов вида M. turcomanica были выделены гиосцин,
апогиосцин и гиосциамин. С помощью тонкослойной хроматографии и массспектрометрии были выявлены псевдогиосциамин, апоатропин, 3α-тиглоилокситропан-6βол, белладонины и тиглоидины, а также три алкалоида, определить которые не удалось
[Hanuš et al., 2005; Razzakov et al., 1998].
По литературным данным составлена таблица, в которой отмечено наличие
определённых алкалоидов у каждого из трёх видов (Таблица 1).
Вещества липидной природы исследованы в корнях, семенах и плодах растений вида
M. turcomanica. В корнях с помощью различных типов хроматографии, а также
инфракрасной и УФ-спектроскопии были описаны 20 классов липидов. Большая часть
липидов (12 классов, 64,7% по массе) относится к неполярным липидам, среди них больше
всего по массе триацилглицеридов. Обнаруженные полярные липиды делятся на 2 большие
группы: гликолипиды (4 класса) и представленные в меньшем количестве по массе
фосфолипиды (4 класса) [Asilbekova et al., 1994].
Структура жирных кислот, входящих в состав ацил-содержащих липидов, была
определена
с
помощью
хроматографии
с
газожидкостной
последующей
хроматографии
масс-спектрометрией.
и
Ag+-тонкослойной
Ненасыщенные
кислоты
преобладают в составе моно-, ди- и триацилглицеридов, а также фосфолипидов [Asilbekova
et al., 1994].
При
дальнейшем
более
пристальном
изучении
структуры
молекул
класса
триацилглицеридов было установлено, что чаще прочих в состав входит жирная кислота с
формулой 18:1 (олеиновая), причём чаще она присоединена по второму положению
молекулы глицерина, тогда как кислоты с формулами 18:2, 18:3, 17:1 чаще встречаются в
первом и третьем положениях [Gusakova, Asilbekova, 1997].
При исследовании липидов в семенах и плодах M. turcomanica хроматографическими
методами было описано 17 классов липидов, большая часть которых опять же относится к
неполярным
(8
классов).
Среди
неполярных
липидов
также
преобладают
триацилглицериды, причём их относительное количество больше в семенах, чем в плодах.
Что касается полярных липидов, в семенах фосфолипиды преобладают над гликолипидами,
24
в плодах – наоборот. Степень насыщенности свободных жирных кислот, а также жирных
кислот в составе триглицеридов и фосфолипидов больше в плодах, чем в семенах
M. turcomanica [Asilbekova, Glushenkova, 1998].
В триацилглицеридах плодов и семян M. turcomanica преобладают ненасыщенные
жирные кислоты, причём в семенах кислота с формулой 18:2 специфически образует эфир
с центральной OH-группой молекулы глицерина, тогда как в плодах в этой позиции
встречаются
18:2
и
18:1
кислоты.
Из
48
видов
триацилглицеридов
самый
распространённый, как в мякоти плода, так и в семенах, 1- или 3-олеоилдилинолеат
[Asilbekova, Giushenkova, 1999].
Вещества, содержащиеся в эфирном масле и определяющие запах мандрагоры, в
частности M. officinarum, впервые исследовали в 1992 году методом ГХ/МС. Среди 55
обнаруженных веществ основными были этилбутират, гексанол, бутилацетат и
гексилацетат [Fleisher, Fleisher, 1992; Hanuš et al., 2005].
При исследовании плодов M. autumnalis в 1998 году было выделено более 100 веществ.
В эфирном масле основными веществами были этилдеканоат, этилдодеканоат и
децилацетат. Этилгексаноат и этилбутират были основными компонентами, выделенными
из мякоти. Также большой вклад в характерный запах вносят различные вещества,
содержащие серу [Baser et al., 1998; Hanuš et al., 2005].
Пигментный состав был изучен на двух клеточных линиях M. turcomanica: M31-M и
M31-P. Обнаружены типичные для большинства растений хлорофилл и каротиноиды,
причём изменение относительного количества хлорофилла b и разных типов каротиноидов
влияло на ультраструктуру пластид [Hanuš et al., 2005].
В 2010 году появились данные о выделении из M. officinarum 7 витанолидов –
фитостероидов, в целом характерных для семейства Solanaceae. В том же исследовании был
обнаружен тропановый алкалоид – 3-сенециойлокситропан [Suleiman, Abu, Sabri, 2010].
Из других вторичных метаболитов мандрагоры были выявлены гернианин,
умбеллиферон, ангелицин, скополетин, скополин и хлорогеновая кислота в различных
частях растения M. officinarum, а также троповая кислота и скополетин в корнях
M. autumnalis [Hanuš et al., 2005]. В обоих видах были также найдены β-метилэскулетин и
ситостерин и четыре сахара, присутствовавшие в несвязанном виде: рамноза, глюкоза,
сахароза и фруктоза [Jackson, Berry, 1979].
25
Таблица 1. Наличие различных типов алкалоидов в растениях 3 видов рода Mandragora.
M. turcomanica M. officinarum
3α-тиглоилокситропан-6β-ол
+
анизодамин
скополамин
атропин
+
апогиосцин
+
гиосцин
+
+
псевдогиосциамин
+
+
гиосциамин
+
+
скопин
+
кускогигрин
+
апоатропин
+
+
белладонины
+
+
калистегнины
+
тиглоидины
+
3.2.3
M. autumnalis
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Физиологическая активность экстрактов Mandragora spp. и, в частности,
M. turcomanica
Мандрагору применяют на протяжении тысячелетий. Теофраст в книге Historia Plantarum
поместил её первой в списке, в книге говорилось о пользе мандрагоры при ранах и рожистом
воспалении, а также как о средстве от подагры [Chidiac, Kaddoum, Fuleihan, 2012].
Древнегреческий учёный Диоскорид писал о применении сока и спиртового экстракта
мандрагоры как обезболивающего, противовоспалительного, абортивного средства, а также
лекарства от бессонницы [Dioscorides, first century]. Плиний старший советовал использовать
мандрагору перед операциями «чтобы притупить разум», а в Риме во времена правления
Нерона мандрагору использовали в стоматологии. Сок мандрагоры также использовался
Авиценной (Ибн Синой) в составе снотворного [Chidiac, Kaddoum, Fuleihan, 2012]. Есть
сведения об использовании M. turcomanica в туркменской народной медицине [Акмурадов и
др., 2016].
Известно также о токсичности мандрагоры. Описано несколько случаев отравления. В
одном из них при обследовании семьи из 6 человек, отравившихся M. autumnalis. У пациентов
наблюдалась тошнота без рвоты, расширенный зрачок, сухость во рту, лёгкая тахикардия и
повышение рефлексов (гиперреактивность). У одной пациентки также была повышенная
температура, сухая гиперемичная кожа и нарушения мочеиспускания [Piccillo, Mondati, Moro,
2002].
26
В другом отчёте говорилось о 15 пациентах, членах двух разных семей, отравившихся также
M. autumnalis. У всех пациентов было нечёткое зрение, сухость во рту, расширенные зрачки,
тахикардия. У 14 также наблюдалась сухость кожи и слизистых, гиперреактивность или
галлюцинации, у части пациентов помутнение сознания (делирий), головная боль,
головокружение, рвота и затруднённое мочеиспускание [Jimenez-Mejias et al., 1990].
Все эти эффекты вызваны воздействием тропановых алкалоидов мандрагоры. Такие
алкалоиды, как атропин и скополамин являются холиноблокаторами, то есть блокируют
ацетихолиновые синапсы, нарушая проведение нервного импульса, что вызывает учащённое
сердцебиение, нарушает работу потовых желез, влияет на тонус сосудов и в целом нарушает
работу парасимпатической нервной системы и ЦНС.
Также зарегистрирован случай контактного дерматита после прикосновения к мандрагоре у
пациента [Baysak et al., 2015].
В 2016 году исследовались антиоксидантная и фермент-ингибирующая активность
экстрактов мандрагоры. Для этого использовали ацетоновые и метаноловые экстракты из
цветков и листьев M. autumnalis. Наибольший антиоксидантый эффект показал метаноловый
экстракт цветков растения. Также экстракты оказали ингибирующий эффект на ацетил- и
бутирилхолинэстеразу, амилазу, глюкозидазу и тирозиназу [Uysal, Zengİn, Aktumsek, 2016].
Данные ферменты связаны с различными заболеваниями: так, ингибирование тирозиназы
используют при лечении меланомы, ингибирование амилазы и глюкозидазы – для терапии при
диабете 2 типа, а ингибирование упомянутых холинэстераз используют при терапии болезни
Альцгеймера.
Также проводились исследования антимикробной активности экстрактов M. turcomanica.
Экстракты из различных частей растения, в частности, из плодов и корней, оказали
ингибирующий эффект на ряд видов бактерий, в частности, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus и Pseudomonas aeruginosa [Jodallah, saleem Ali-shtayeh, 2013; Obeidat, 2011].
3.2.4
Примеры и особенности культур клеток и органов M. turcomanica, а также
таксонов, родственных Mandragora spp.
Особенности биологии этого растения затрудняют интродукцию вида (например, в
условия ботанических садов) и/или плантационное выращивание [Hanuš et al., 2005; Akhani
H., Ghorbani A. B., 2003; Sinev I. E., 2016]. Эти обстоятельства предопределяют
актуальность работ по получению и подробному изучению культур клеток Mandragora spp.
и, в частности, M. turcomanica in vitro.
27
На данный момент для M. turcomanica получены различные объекты in vitro. Так, для неё
применяется метод микроклонального размножения с использованием апикальной
меристемы стебля [Полисенкова, 2016]. В московском ИФРе (Институт физиологии
растений) получена каллусная культура. Для её получения использовались экспланты из
корня восьмилетнего растения, а также семена [Суханова, Соболькова, 2018]. В этом же
институте получена суспензионная культура клеток M. turcomanica [Суханова, Куличенко,
Соболькова, 2018].
О получении культур изолированных корней M. turcomanica данных нет, однако
получены и широко используются культуры Datura sp. (дурман), относящегося к тому же
семейству, что и M. turcomanica [Harfi et al., 2016]. Также нет данных о криосохранении
Mandragora sp. в виде семян или объектов in vitro. Однако при проращивании зародышей,
выделенных из интактных очищенных от оболочки семян, были получены растения M.
autumnalis, успешно растущие в тепличных условиях после пересадки и показывающие
даже лучшие ростовые параметры по сравнению с контрольной группой [Al-Ahmad, 2020].
28
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Описание объектов исследования
В качестве объектов исследования использовали суспензионные культуры клеток M.
turcomanica, линии Mt-20 и Mt-31, депонированные во Всероссийской коллекции культур
клеток высших растений (ВККК ВР ИФР РАН):
- линия Mt-31 получена в 2015 году из фотосинтезирующей суспензионной культуры
клеток путем модификации состава питательной среды и перевода на темновой режим
культивирования.
- линия Mt-20, получена в 2017 году из каллуса.
2. Условия выращивания, условия добавления метилжасмоната и сукцината
Культуры клеток выращивали в конусовидных колбах объёмом 250 мл. Добавление
инокулята в среды производилось в асептических условиях, в ламинар-боксах. Для
выращивания использовались модифицированные питательные среды:
- для линии Mt-20 с минеральной основой по Шенку-Хильдебрандту (SH) [Schenk,
Hildebrandt, 1972] с добавлением 30 г сахарозы, 1 мг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты
и 0,1 мг кинетина на литр среды, плотность посадки при поддержании в коллекции 0,3 г/л
в 40 мл среды
- для линии Mt-31 с минеральной основой по MS [Murashige, Skoog, 1962] с
добавлением
30
г
сахарозы,
1
мг
α-нафтилуксусной
кислоты,
1
мг
2,4-
дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 мг 6-бензиламинопурина на литр среды, плотность
посадки при поддержании в коллекции 1 г/л в 50 мл среды.
Подробный состав сред состав сред указан в таблице 2, приложение. Культивирование
производили при постоянном перемешивании на качалке (90 об./мин), в темноте при
температуре 26˚С. Объем суспензии в колбах при поддержании в коллекции - 40 мл для
линии Mt-20 и в 50 мл для линии Mt-31.
Для исследования возможности стимуляции биосинтеза алкалоидов использовали
более молодую линию Mt-20. В экспериментальные колбы с линией Mt-20 на 10 день
выращивания в асептических условиях в ламинар-боксе добавляли стерильный раствор
метилжасмоната из расчета конечной концентрации в колбе 50, 100 или 200 мкМ/1 л среды,
а также стерильный раствор сукцината в концентрации из расчета 10мМ/1 среды (по 4
колбы на каждый вариант). Концентрации подбирали на основе данных литературных
источников [Zhao et al., 2001]. На 14 день колбы с метилжасмонатом, сукцинатом, а также
29
контрольные колбы использовали для определения жизнеспособности, сырой и сухой
массы (методика – см. 2.4), а также для проведения пробоподготовки для УЭЖХ-ИЭР-МС.
3. Получение микрофотографий клеток
Для получения микрофотографии каплю суспензии помещали на предметное стекло,
накрывали покровным и помещали на предметный столик светового микроскопа со
специальной камерой (Axio ImagerтZ2, “Zeiss”, Германия). Полученные изображения
обрабатывали в программе ZEN 2.3. Работа проводилась совместно с Фоменковым А.А. и
Носовым А.В.
4. Изучение ростовых характеристик культур клеток
При изучении ростовых характеристик определяли динамику роста исследуемых
культур клеток. Для этого в день посадки инокулята и далее каждые 1-2 дня брали по 3
колбы с культурой для каждой лини и определяли жизнеспособность, сырой и сухой вес
клеток в каждой колбе. По полученным данным строили кривые роста.
Жизнеспособность определяли следующим способом: на предметное стекло помещали
200 мкл суспензии, окрашивали каплей 0,1% феносафронина и рассматривали препарат в
световой микроскоп. Мёртвые клетки были окрашены в розовый феносафронином, живые
сохраняли обычный оттенок: серый или желтоватый. Агрегат клеток считался
нежизнеспособным, если более 50% клеток в нём были мертвы, и наоборот. Для оценки
жизнеспособности культуры считали 150-200 агрегатов и определяли отношение
жизнеспособных агрегатов ко всем посчитанным.
Для определения сырой массы мерным цилиндром измеряли общий объем суспензии,
затем её фильтровали через воронку Бюхнера с положенным поверх неё капроновым или
бумажным фильтром в колбу Бунзена под вакуумом, используя водоструйный насос.
Биомассу собирали с фильтра в пластиковую чашку Петри известной массы, взвешивали на
лабораторных весах и нормировали сырую массу на объём суспензии (г/л).
После взвешивания сырую массу сушили на воздухе при температуре не более 40-45оС
в сушильной камере. После полного высыхания (обычно через 2 суток) взвешивали чашки
Петри и определяли сухую массу, которую также нормировали на объём суспензии (г/л).
Для расчёта ростовых характеристик использовали следующие формулы [Носов, 2011]:
𝑥𝑚𝑎𝑥 −𝑥0
Индекс роста: 𝐼 =
, где xmax – максимальная масса, x0 – масса в день
𝑥0
добавления инокулята.
30
Удельная скорость роста:
𝜇=
ln(𝑥2 )−ln(𝑥1 )
𝑡2 −𝑡1
,
в программе Excel находится через
функцию «НАКЛОН». Для этого на кривой роста (зависимость логарифма сырой или сухой
массы ln(x) от времени (t)) определяется линейный участок и диапазоны соответствующих
ему значений по x и y записываются в функцию для расчёта.
𝑥𝑚𝑎𝑥 −𝑥0
Экономический коэффициент: 𝑌 =
где xmax – максимальная масса, x0 –
𝑆0
масса в день добавления инокулята, S0 – начальное содержание сахарозы в среде, г/л
𝑥𝑚𝑎𝑥 −𝑥0
Продуктивность: 𝑃 =
где xmax – максимальная масса, x0 – масса в день
𝑡
добавления инокулята, t – время культивирования на момент достижения xmax, сут.
Обводнённость определяли как отношение разности сырой и сухой масс к сырой массе,
выраженное в процентах.
5. Химический анализ экстрактов культур клеток
Пробы, выбранные для проведения химического анализа, указаны в таблице 3,
приложение. Сутки, на которые были собраны образцы биомассы, соответствовали точкам
с максимальным накоплением биомассы по сухой массе клеток. Также для сравнения
проводили анализ корня интактного растения M. turcomanica.
Для проведения химического анализа готовили очищенный экстракт культуры. Для
этого навеску высушенной и измельчённой в фарфоровой ступке биомассы 20-25 мг,
поместив в пробирку «Эппендорф» экстрагировали 70% (по объёму) этиловым спиртом в
ультразвуковой ванне (УЗВ-12, Сапфир, Россия; рабочая частота – 35 кГц) в течение 30 минут,
центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин (Микроцентрифуга МЦФ, Россия),
супернатант отбирали в грушевидную колбу на 50 мл. Такая экстракция проводилась 3 раза,
супернатанты объединяли. Затем супернатант упаривали под вакуумом на роторном
испарителе при 55˚С.
Упаренный осадок суспендировали в 1 мл дистиллированной воды при помощи
обработки ультразвукком в течение 1 минуты (УЗВ-12, Сапфир, Россия). Для конечного
этапа очистки использовали патрон для твердофазной экстракции Supelclean ENVI-18
(Supelco, США). Патрон предварительно кондиционировали: промывали 5 мл 70% (по
объёму) этилового спирта, затем 3 мл дистиллированной воды. После этого наносили на
патрон суспендированный экстракт, промывали патрон 3 мл дистиллированныой воды,
аналит смывали 3 мл 70% (по объёму) этилового спирта в грушевидную колбу на 25мл.
31
Очищенный раствор упаривали под вакуумом на роторном испарителе при 55˚С, хранили в
морозильной камере.
Анализ проб проводили методом УЭЖХ-ИЭР-МС (ультраэффективная жидкостная
хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией при ионизации электрораспылением).
Для нанесения на хроматографическую колонку упаренный экстракт растворяли в 2 мл
70% (по объему) водного метанола и фильтровали через нейлоновый фильтр с порами 0,2
мкм фирмы «Acrodisc» (Acrodisc, Pall Corporation, США).
Анализ проводили на хроматографе ACQUITY UPLC H-Class PLUS (Waters, США),
оснащенном гибридным времяпролетным масс-спектрометром Xevo G2-XS Tof (Waters,
США). Пробы в объеме 0,01-0,10 мкл наносили на колонку ACQUITY UPLC BEH C18
(50×2,1 мм, 1,7 мкм; Waters, США). Температура колонки составляла 40°С, объемная
скорость потока подвижной фазы – 0,4 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали
0,1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0,1% (по объему)
раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель Б). Для подготовки
растворителя «А» использовали деионизированную воду (получена на установке Simplicity
UV, Millipore, Франция). Ацетонитрил квалификации «LC-MS», фирмы Panreac (Испания).
Хроматографическое разделение проводили в режиме градиентного элюирования. В
процессе анализа состав подвижной фазы менялся следующим образом (Б, % по объему):
0-1 мин. – 5→15%, 1-5 мин. – 15→30%, 5-11 мин. – 30→38%, 11-15 мин. – 38→65%, 1515,5 мин. – 65→95.
Анализ осуществляли в режиме детектирования отрицательных и положительных
ионов (диапазон m/z 100-1900). Параметры источника ионизации: температура источника
ионизации – 150°С, температура десольвации – 650°С напряжение на капилляре – 3,0 кВ,
напряжение на конусе ввода пробы – 30 В, скорость подачи азота (десольвационный газ)
1101 л/час. Обработку полученных результатов производили с помощью программы
MassLynx (Waters, США).
6. Анализ антимикробной активности экстрактов культур клеток
Для анализа антимикробной активности были выбраны следующие культуры:
клеточная масса линии Mt-31 с плотностью посадки 1 г/л и добавлением 3% сахарозы в
32
среду и линия Mt-20 с плотностью посадки 0,3г/л и добавлением 3% сахарозы в среду.
Также для сравнения проводили анализ корня интактного растения M. turcomanica.
Для проведения анализа готовили комплексные экстракты проб биомассы. Навеску
400-600 мг измельчённой в ступке биомассы переносили в пробирку типа Фалькон,
экстрагировали однократно 7 мл 70% (по объёму) этилового спирта в ультразвуковой ванне
(УЗВ-12, Сапфир, Россия; рабочая частота – 35 кГц) в течение 30 минут. Затем
центрифугировали в течение 15 мин при 2700 об/мин на центрифуге (ПЭ-6926 ЭКРОС,
ООО «Экохим», Россия). Супернатант отбирали в грушевидную колбу, выпаривали при
45˚C на роторном испарителе под вакуумом. Упаренный экстракт хранили в морозильной
камере, растворяли в дистиллированной воде.
Для определения антимикробной активности экстракта использовали культуру
золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus АТСС 25923). Штамм выращивали на
скошенном Триптиказо-соевом агаре (TSA, Liofilchem) при 37°С в течение 24 часов,
смывали физиологическим раствором, доводя до концентрации 1*109 по стандарту
мутности МакФарланда. 100 мкл суспензии переносили в пробирки «Эппендорф» с 2 мл
Триптиказо-соевого бульона (TSB, Liofilchem). Для культивирования Staphylococcus aureus
в TSB бульон добавляли 0,1 % Tween 80 (Liofilchem). Пробирки с культурой инкубировали
на термошейкере TS-10 (BioSan, Латвия) при температуре 37°С в течение 4 часов.
Концентрацию выращенной биомассы в бульоне измеряли c помощью фотометра OD600
(Implen, Германия) и сравнивали с калибровочной кривой для определения концентрации
клеток в бульоне. В качестве положительного контроля использовали суспензию в
концентрации около 3*107 КОЕ/мл. Для получения отрицательного контроля полученную
суспензию прогревали при 100 °С в течение 10 мин. Для получения суспензии смешанных
клеток, состоящей из 50% живых и 50 % предположительно нежизнеспособных, смешивали
в одинаковых долях живые и мертвые клетки, соответственно.
Для определения антимикробной активности объектов исследования методом
проточной цитометрии по отношению к Staphylococcus aureus 10/20/30 мкл образца
смешивали с 90/80/70 мкл культуры с начальной концентрацией клеток 2,5*10^7 кл/мл,
тщательно
перемешивали
пипетированием.
Положительный
контроль
готовили
смешиванием 10/20/30 мкл Триптиказо-соевого бульона (TSB, Liofilchem) с 90/80/70 мкл
культуры. Образцы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 3,5 и 20
часов.
После инкубации образцы анализировали с использованием набора реагентов
"LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability and Counting Kit (Thermo, США). 987 мкл
33
раствора натрия хлорида (0,9%) смешивали с 1,5 мкл готового раствора SYTO 9 и 1,5 мкл
готового раствора PI, тщательно перемешивали, добавляли 10 мкл культуры в случае 3,5
часов инкубации или 5 мкл культуры в случае 20 часов инкубации, перемешивали,
инкубировали в темных светозащитных пробирках «Эппендорф» (Axigen, США) в течение
15 минут, измеряли популяции живых и мертвых клеток на проточном цитометре Guava
EasyCyte (MerkMillipore).
Определение
антимикробной
активности
проводилось
сотрудницей
экспериментальной клиники ВНИИМП им. Горбатова Котеневой Е.А.
7. Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку ростовых параметров проводили по стандартным
методикам. На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения и
стандартные отклонения из 3 биологических повторностей (по 3 чашки или по 3
фиксированных объема биологического материала на точку).
Для обработки данных по антимикробной активности использовали двусторонний
непараметрический U-критерий Манна-Уитни в программе GraphPad Prism 9.1.1.225.
34
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Морфология клеток линий Mt-20 и Mt-31
На рис. 2 представлены типичные микрофотографии клеток линий Mt-20 и Mt-31 в
середине экспоненциальной фазы роста. При микроскопическом исследовании было
показано, что клетки обеих линий отличались относительно крупными размерами – от 3060 мкм в первой половине цикла субкультивирования до 150 мкм в конце выращивания.
Форма клеток преимущественно округлая, для линии Mt-20 показано присутствие
некоторого количества удлинённых и S-образных клеток, в среднем не более 3% от
популяции. Для линии Mt-31 таких клеток не выявлено.
Форма агрегатов была также преимущественно округлой с неровными краями для всех
вариантов. Оба штамма относительно мелкоагрегированные, более 70 % агрегатов в
суспензии составляют кластеры, размером до 50 клеток, количество агрегатов с
количеством клеток более 50 не превышало 20%. Агрегаты с количеством клеток 11-20 и
20-50 составляют основную часть агрегатного состава. Тем не менее, для линии Mt-31 в
целом характерно преобладание более крупной фракции - агрегаты, состоящие из 20-50
клеток, составляют около 40% популяции. Количество жизнеспособных единичных клеток
и мелких агрегатов (до 5 клеток) было незначительно для всех вариантов (таблица 4).
А.
35
Б.
Рис.2 Клетки и клеточные агрегаты суспензионных культур клеток M. turcomanica
в экспоненциальной фазе роста при выращивании в колбах. А – линия Mt-31; Б –
линия Mt-20.
Таблица 4. Процентное содержание агрегатов в суспензионных культурах клеток
M. turcomanica (середина-конец экспоненциальной фазы роста; вариант выращивания
- 3% сахарозы; инокулят 1 г/л)
Штамм
Mt-20
(9 сутки)
Mt-31
(10 сутки)
1-5
Число клеток в агрегате, % от общей популяции
6-10
11-20
20-50
>50
6
22
29
26
17
3
17
21
39
20
2. Сравнение ростовых характеристик линий Mt-20 и Mt-31
Для характеристики ростовых параметров определяли жизнеспособность и плотность
клеток по сырой и сухой массе в течение одного цикла субкультивирования при
стандартном
выращивании
в
колбах
на
качалке.
Для
исследуемых
линий
продолжительность цикла при определении ростовых характеристик составляла 21-27
суток; начальная плотность посадки по сухой массе клеток – 0,3-0,4 и 1,0-1,5 г/л.
36
По полученным данным были построены кривые роста в нормальной и
полулогарифмической системах координат. На рис. 3-8 приведены графики зависимости
сырой
массы,
культивирования,
сухой
а
массы
также
жизнеспособности
зависимости
и
логарифма
обводнённости
от
времени
сухой
от
времени
массы
культивирования.
По графикам видно, что при 3% сахарозы в среде более низкий уровень накопления
сырой и сухой массы клеток был характерен для линии Mt-31, наименьшие значения были
получены при плотности посадки 0,3 г/л.
С целью оценки возможности повышения продуктивности по биомассе для этой линии
проводили культивирование на среде с 5% сахарозы, что привело к повышению уровня
накопления клеточной биомассы почти в 2 раза. (см.рис.3А и 4А).
При сравнении линий Mt-31 и Mt-20, заметно, что по сырой массе различия между
двумя линиями при одной плотности посадки выше, чем по сухой. Для линии Mt-31
характерна большая вариабельность по сухой массе, у линии Mt-20 обе кривые лежат
достаточно близко. Это может быть связано с большей гетерогенностью, характерной для
более старой линии Mt-31, в силу чего при выращивании в различных условиях в культуре
больше различных вариантов отбора клеток, лучше приспособленных к росту и
пролиферации в среде.
Жизнеспособность культур к концу цикла снижается. Если сравнивать графики
жизнеспособности на 20 сутки, заметно что жизнеспособность выше у культур с большей
плотностью посадки, а из двух линий – у линии Mt-31. Самое медленное снижение
жизнеспособности наблюдается у линии Mt-31 с плотностью посадки 1 г/л и 3% сахарозы
в среде.
Заметно, что у всех линий минимальные значения обводнённости совпадают с
экспоненицальной фазой роста. Для экспоненциальной фазы характерно активное деление
клеток, что сопровождается накоплением сухой биомассы без увеличения объёма каждой
отдельной клетки. После, в фазу замедления роста и стационара обводнённость начинает
расти, что обусловлено менее интенсивным делением, но большим увеличением объёма
клеток.
В целом при переходе к фазе деградации характерно снижение как сырой, так и сухой
массы, при этом в большинстве линий снижение сухой массы (в процентах от
максимальной) более значительно, чем сырой. Обратное соотношение характерно только
для линии Mt-20 с плотностью посадки 0,3 г/л и добавлением 3% сахарозы в среду.
A.
37
Линия Mt-31
600
m сыр, г/л
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
30
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
5% сахарозы, 1 г/л
Б.
Линия Mt-20
600
m сыр, г/л
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1 г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
Рис. 3. Динамика роста суспензионных культур клеток M. turcomanica
по сырой массе клеток при выращивании в колбах. А – линия Mt-31; Б – линия Mt20. Здесь и далее - ст.отклонение меньше 10% на графиках не указывали.
38
А.
Линия Mt-31
40
35
m сух, г/л
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1 г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
5% сахарозы, 1г/л
Б.
Линия Mt-20
40
35
m сух, г/л
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
Рис. 4. Динамика роста суспензионных культур клеток M. turcomanica по сухой массе
клеток при выращивании в колбах. А – линия Mt-31; Б – линия Mt-20.
39
А.
Линия Mt-31
100
жизнеспособность, %
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
5% сахарозы, 1 г/л
Б.
Линия Mt-20
100
жизнеспособность, %
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1 г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
Рис. 5. Изменение жизнеспособности суспензионных культур клеток M. turcomanica
в процессе выращивания. А – линия Mt-31; Б – линия Mt-20.
40
А.
Линия Mt-31
98
97
Обводнённость, %
96
95
94
93
92
91
90
89
88
0
5
10
15
20
25
30
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1 г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
5% сахарозы, 1 г/л
Б.
Линия Mt-20
98
97
Обводнённость, %
96
95
94
93
92
91
90
89
88
0
5
10
15
20
25
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1 г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
Рис. 6. Изменение обводненности суспензионных культур клеток M. turcomanica
в процессе выращивания. А – линия Mt-31; Б – линия Mt-20.
41
А.
Линия Mt-31
4
ln m сух, г/л
3
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
-1
-2
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1 г/л
3% сахарозы, 0,3 г/л
5% сахарозы, 1 г/л
Б.
Линия Mt-20
4
ln m сух, г/л
3
2
1
0
0
5
10
15
20
25
-1
-2
Время культивирования, сутки
3% сахарозы, 1 г/л
0,3% сахарозы, 1 г/л
Рис. 7. Динамика роста суспензионных культур клеток M. turcomanica
по сухой массе клеток в полулогарифмической системе координат. А – линия Mt-31;
Б – линия Mt-20.
42
На рис. 8 приведён пример расчёта ростовых фаз.
Линия
0, 0,3 г/л, 3% сахарозы
5
сух
3
1
0
0
5
10
15
0
5
1
Время культивирования, сутки
Рис. 8. Пример расчета границ фаз ростового цикла суспензионных культур клеток M.
turcomanica
Рассчитанные по полученным данным границы фаз ростового цикла и основные
ростовые параметры представлены в таблицах 5 и 6 соответственно.
Таблица 5. Фазы ростового цикла суспензионных культур клеток M. Turcomanica
Границы фаз ростового цикла, сут.
Линия
Mt-31,
5%
Mt-31,
3%
Mt-20,
3%
ЭкспоненФаза
Фаза
циальная
замедления стационара
фаза
Лагфаза
Фаза
ускорения
1,0 г/л
0–1
1–3
3 – 10
10 – 14
14-19
1,0 г/л
-
0–4
4 – 12
12 – 13
13 – 18
0,3 г/л
-
0–5
5 – 11
11-12
12 – 14
1,0 г/л
0–4
4–6
6–9
9 – 10
10 – 13
0,3 г/л
0–2
2–4
4–9
9 – 11
11 – 14
43
Фаза
деградации
С 19 суток
до конца
цикла
С 18 суток
до конца
цикла
С 14 суток
до конца
цикла
С 13 суток
до конца
цикла
С 14 суток
до конца
цикла
При 3% сахарозы в среде для каждой из линий отмечен сходный характер динамики
роста независимо от плотности посадки. Если говорить о различиях, видно, что линия Mt20 отличается более короткой экспоненциальной фазой, чем Mt-31. У линии Mt-31
практически отсутствует лаг-фаза, а значит, культура быстро переходит к активному
увеличению биомассы.
При сравнении линии Mt-31 с плотностью посадки 1 г/л при 3 и 5% сахарозы заметно,
что культура на 5% сахарозы немного быстрее проходит экспоненциальную фазу и фазу
замедления, а фазы стационара одинаковы по длительности при разной концентрации
сахарозы.
В целом, для всех вариантов длительность лаг-фазы варьирует в пределах 0-4 суток,
фазы ускорения – 2-5 суток, экспоненциальной фазы – 3-8 суток, фазы замедления 1-4
суток, фазы стационара 2-5 суток. Максимум по сухой массе для линии Mt-20 – 11-14 день
по снятым массам и 11-13 день по кривой роста, для линии Mt-31 – 17 день как по снятым
массам, так и по кривой.
По полученным данным для исследуемых суспензионных культур клеток были
рассчитаны ростовые параметры (см. таблицу 6).
Таблица 6. Ростовые параметры суспензионных культур клеток M. Turcomanica
Линия
С(сах), %
Начальная
плотность
посадки, г/л
Mmax,
г/л
v, %
µ,
сут-1
I
Y
P
Mt-31
5%
1 г/л
33,77±
0,71
90,80±
0,85
0,31
27,78
0,652
1,92
3%
1 г/л
16,12±
0,31
85,67±
0,58
0,20
13,23
0,5
0,88
0,4 г/л
4,05 ±
0,32
66,00±
1,73
0,23
10,46
0,123
0,22
1 г/л
17,74±
0,79
92,10±
1,11
0,43
10,54
0,540
1,47
0,3 г/л
14,60±
1,3
75,77±
13,27
0,49
45,02
0,476
1,02
Mt-20
3%
Mmax – максимальное значение сухой массы клеток; v – жизнеспособность клеток; µ удельная скорость роста; I – индекс роста; Y – экономический коэффициент; P –
продуктивность.
При большей плотности посадки сухая масса и другие ростовые характеристики в
целом выше. Однако удельная скорость роста и индекс роста у линии Mt-20 выше при
44
плотности посадки 0,3 г/л. При сравнении линии Mt-31 с плотностью посадки 1 г/л при 3 и
5% сахарозы заметно, что все ростовые характеристики выше при 5% сахарозы.
В целом линия Mt-20 отличается более высокой удельной скоростью роста и индексом
роста, то есть, быстрее достигает максимальных значений накопления сухой массы клеток.
При сравнении линий Mt-20 и Mt-31 с одинаковой плотностью более высокие значения
накопления биомассы по сухой массе клеток получены для линии Mt-20. При этом само
максимальное значение сухой массы, также как экономический коэффициент и
продуктивность, выше у линии Mt-31 при выращивании с добавлением 5% сахарозы и
плотностью посадки 1 г/л.
Если сравнивать кривые линии Mt-31 при 3 и 5% сахарозы заметно, что все ростовые
характеристики выше при большей концентрации сахарозы. Продуктивность культуры при
5% сахарозы в среде выше в 2 раза (2,18), а экономический коэффициент – в 1,3 раза по
сравнению с выращиванием при 3% сахарозы. Это говорит о том, что клетки в этих
условиях используют больший процент сахара для пластического обмена, т.е увеличения
биомассы.
Таким образом, проведена комплексная характеристика особенностей роста 2 линий
суспензионных культур клеток M. turcomanica. Показано, что линии Мt-20 и Mt-31
различаются по ростовым характеристикам. При 3% сахарозы в среде для линии Мt-20
наблюдали более высокие значения ростовых параметров при всех вариантах начальной
плотности посадки, чем для линии Mt-31. Для более низкопродуктивной линии Mt-31 при
увеличении содержания сахарозы в среде до 5% при одинаковой начальной плотности
посадки (1 г/л) продуктивность по клеточной биомассе, индекс роста и максимальный
уровень накопления клеточной биомассы возрастали почти в 2 раза, удельная скорость
роста – почти в 1.5 раза. В целом, большая плотность посадки и концентрация сахарозы в
среде положительно влияет на ростовые характеристики линии Mt-31, для которой
характерна большая вариабельность в накоплении сырой и сухой массы в зависимости от
условий, а также более быстрый переход к активному росту. При этом у линии Mt-20 выше
скорость роста и индекс роста, т.е. она быстрее достигает своих максимальных значений по
сухой массе.
3. Химический анализ линий Mt-20 и Mt-31
Был проведён химический анализ проб двух линий методом УЭЖХ-ИЭР-МС.
УЭЖХ ЭР МС проводили в режиме детектирования положительно-заряженных ионов,
поскольку в этом режиме при электрораспылительной ионизации для многих природных
45
соединений часто наблюдается фрагментация (с образованием характеристических
осколочных ионов) уже в источнике ионизации. Это позволяет проводить достаточно
быструю
структурную
идентификацию
метаболитов
при
ограниченном
числе
хроматографических разделений. Структурную идентификацию соединений проводили на
основании
расшифровки
протонированных
молекул
результатов
в
масс-спектрометрии
источнике
ионизации),
анализа
(фрагментации
относительного
хроматографического поведения соединений и сопоставления этих результатов с данными
литературы.
Выявленные с опорой на статью [Кочкин и др., 2021] метаболиты представлены в
таблице 7 и на рис 9. Видно, что метаболиты, обнаруженные в линии Mt-31, отсутствуют в
более молодой линии Mt-20, в том числе после добавления метилжасмоната и сукцината, и
в корне интактного растения M. turcomanica. Это является доказательством того, что линии
различны между собой. Отличия можно видеть и на хроматографических пиках (см рис.
10). Это позволяет сделать вывод, что клеточные линии, полученные из растения одного
вида, могут быть различны по биосинтетическим показателям. В корне интактного
растения обнаружен алкалоид гиосциамин (ион [M+H] с m/z 290; хроматограмма
положительных ионов). В линиях Mt-20 и Mt-31 данный алкалоид отсутствует,
следовательно, обе линии отличаются по биосинтезу от интактного растения.
Следует подчеркнуть, что в настоящей работе идентификация соединений
выполнена на основе исключительно данных масс-спектрометрии. Для более строгого
структурного
описания
обнаруженных
соединений
требуются
дополнительные
исследования. Также в настоящее время продолжается хромато-масс-спектрометрическая
идентификация соединений, обнаруженных в биомассе линии Mt-20.
46
Таблица 7. Вещества, обнаруженные в пробах биомассы культур клеток и корня M.
turcomanica
Время удержания (мин) в различных пробах (прочерк означает,
что пик не обнаружен)
вещество
корень Mt-31 Mt-20 Mt-20 + Mj, Mt-20 +
Mt-20
200 мкМ
Suc, 10 мМ контроль
кофеоилпутресцин
изокофеоилпутресцин
ферулоилпутресцин
изо-ферулоилпутресцин
феруолилоктопамин-Hex
изо-феруолилоктопамин-Hex
ферулоилтирамин-HexHex
N-ферулоилтирамин-Hex
Изо-Nферулоилтирамин-Hex
ферулоилметокситираминHex
ферулоилтирамин
Гиосциамин
-
Фенилпропаноиды
0,74
-
-
-
-
1,00
-
-
-
-
-
1,71
-
-
-
-
-
1,47
-
-
-
-
-
2,07
-
-
-
-
-
2,22
-
-
-
-
-
2,16
-
-
-
-
-
2,84
-
-
-
-
-
2,93
-
-
-
-
-
3,03
-
-
-
-
-
4,20
-
-
-
-
Алкалоиды
-
-
-
2,36
-
47
Рис. 9. УЭЖХ-ИЭР-МС хроматограмма (полный ионный ток) для линии Mt-31 (записана в
режиме регистрации положительных ионов). Цифрами обозначены пики,
соответствующие следующим веществам: 1,2 – изомеры кофеоил-путресцина, 3,4 –
изомеры ферулоил-путресцина, 5 – феруолил-октопамин-Hex, 6 - ферулоил-тирамин-HexHex, 7,8 – изомеры N-ферулоил-тирамин-Hex. Hex – остаток гексозы. Звёздочками (*)
обозначены пики веществ, идентифицировать которые на данном этапе работы не
удалось.
48
Рис.10. Хроматограмма двух линий M. turcomanica в сравнении с корнем интактного
растения. Стрелками указаны пики, отличающиеся в экстрактах корня и клеточных
культур.
4.
Влияние
добавления
метилжасмоната
и
сукцината
на
ростовые
и
биосинтетические характеристики линии Mt-20
Был проведён эксперимент по добавлению в колбы с культурой клеток линии Mt-20 на
10 день выращивания метилжасмоната в концентрациях 50, 100 и 200 мкМ и сукцината в
концентрации 100 мкМ. На рис. 11 приведены графики различных ростовых характеристик
для проб с метилжасмонатом и сукцинатом и для контрольных проб (все пробы сняты на
14 сутки).
На графиках заметны сильные различия по таким ростовым параметрам как сырая,
сухая масса и обводнённость между контрольными пробами и пробами с добавлением
100мкМ сукцината. Очевидно, сукцинат снижает скорость роста культуры клеток, при этом
не оказывая сильного влияния на её жизнеспособность.
Если говорить о других тенденциях, то заметно различие между контрольными
пробами и пробами с добавлением 200 мкМ жасмоната по сырой массе (p=0,057). Однако
сырая масса является менее стабильным параметром, чем сухая, и меньше подходит для
оценки роста культур. Также заметно снижение сырой массы и жизнеспособности в ряду
49
проб с увеличением концентрации метилжасмоната в среде. Метилжасмонат, таким
образом, негативно влияет на рост и жизнеспособность культур, однако его влияние на рост
меньше, чем у сукцината.
А.
В.
Б.
Г.
Рис. 11. Сравнение проб с добавлением различных модуляторов роста и контрольных
проб А – по сырой массе, Б – по сухой массе, В – по жизнеспособности, Г – по
обводнённости. Указано наименьшее p-значение.
На рис. 12 показаны хроматограммы проб с добавлением 200 мкМ жасмоната, 100 мкМ
сукцината, а также контроля к ним. Заметно, что пики в пробах, к которым были добавлены
метилжасмонат и сукцинат, слабо отличаются от пиков в контроле. Внешне отличий на
данных хроматограммах меньше, чем различий между хроматограммами разных линий на
50
Рис. 10. Однако внешний вид хроматограммы не позволяет полноценно описать сходства и
различия проб и для расшифровки соединений, присутствующих в них, нужна
дополнительная обработка полученных данных.
Рис. 12. Хроматограмма проб линии Mt-20 с добавлением 100мкМ сукцината и 200 мкМ
метилжасмоната в сравнении с контролем.
5. Анализ антимикробной активности линий Mt-20 и Mt-31 в сравнении с корнем
интактного растения по отношению к Staphylococcus aureus
На следующем этапе работ был проведен первичный скрининг антимикробной
активности комплексных экстрактов из клеточной биомассы линий Mt-20 и Mt-31, а также
корня интактного растения с использованием тест-систем культур клеток золотистого
стафилококка Staphylococcus aureus АТСС 25923.
S. aureus остается одним из важнейших возбудителей инфекций человека, вызывая
широкий спектр заболеваний: от легких и средней тяжести поражений кожи и мягких
тканей до угрожающих жизни пневмонии, сепсиса, септикопиемии и синдрома
токсического шока. Изоляты патогена часто используются как тест-системы для
определения антимикробной активности экстрактов лекарственных растений [Tong et al.,
2015].
51
В проведенных раннее работах было показано, что экстракты представителей
Mandragora spp. оказывают ингибирующее влияние на рост различных микроорганизмов,
в частности Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa [Jodallah,
saleem Ali-shtayeh, 2013; Obeidat, 2011].
Для проведения анализа на антимикробную активность комплексных экстрактов
биомассы культур клеток Mt-20 и Mt-31 использовали проточную цитометрию. К
культурам клеток патогенов Staphylococcus aureus АТСС 25923 добавляли экстракты M.
turcomanica и инкубировали 3.5 ч. После соответствующей обработки (см. выше описание
методики), измеряли популяции живых и мертвых клеток на проточном цитометре.
Результаты исследования антимикробной активности экстрактов линий Mt-31 и Mt20,
а также корня M. turcomanica приведены в таблице 8 и на рис. 13. Видно, что инкубирование
с экстрактом корня в течение 3,5 часов вызвало дозо-зависимое подавление роста: при
добавлении 10 мкл эффект незначительный, 20 мкл экстракта привели к уменьшению
живых клеток в пробах на 35%, 30 мкл экстракта снизили число живых клеток на 82%.
Однако при длительном инкубировании (20 часов) эффект не сохранился (таблица 9).
Инкубирование в течение 3,5 часов с добавлением экстрактов линий Mt-20 и Mt-31 в
объёмах 10 и 20 мкл вызвало не ингибирование, а активацию роста бактерий. Добавление
10 мкл вызвало увеличение роста в 1,5 раза для экстракта линии Mt-20 и в 1,7 раза для
экстракта линии Mt-31, добавление 20 мкл оказало меньший эффект.
Для линии Mt-31 при инкубировании с 30 мкл экстракта влияние на рост бактерий
незначительно, в то время как для линии Mt-20 характерно подавление роста на 10-15% при
добавлении 30 мкл экстракта. Инкубирование в течение 20 часов для проб с добавлением
экстрактов клеточных культур не проводилось.
Сравнение экспериментальных проб с контролем с использованием U-критерия
Манна-Уитни не показало значимых различий (p=0,01), что можно объяснить малой
выборкой (3 повторности для опыта и контроля).
Таким образом, антимикробная активность показана для корня M. turcomanica, и
частично для линии Mt-20. Добавление небольших количеств экстракта культур клеток
стимулирует рост Staphylococcus aureus.
52
Таблица 8. Результаты исследования антимикробной активности образцов экстрактов
по отношению к Staphylococcus aureus после 3.5 часов инкубирования. K+ ср – средние
значения положительного контроля.
№
Всего
Живые
Мертвые
кл*10^7/мл
Живые
клетки,
% к К+ (жив)
Мертвые клетки,
% от общего числа
клеток
10 мкл
k+ ср
11,5
11,19
0,31
----
2,65
Корень 10,73±0,60 10,60±0,60 0,12±0,03
94,74±5,38
1,18±0,32
Mt-20
17,57±0,15 17,36±0,13 0,21±0,03
155,17±1,18
1,20±0,15
Mt-31
20,70±0,32 19,74±0,48 0,96±0,20
176,44±4,32
4,66±1,01
20 мкл
k+ ср
12,45
Корень
8,22±0,82
12,38
0,07
----
0,61
8,04±0,85 0,18±0,05
64,90±0,691
2,25±0,80
Mt-20
15,45±1,41 15,34±1,42 0,10±0,01
123,92±11,47
0,69±0,13
Mt-31
21,73±0,87 21,05±0,99 0,68±0,18
170,06±7,98
3,14±0,91
30 мкл
k+ ср
16,40
Корень
4,60±0,46
15,52
0,89
----
5,40
2,72±0,11 1,89±0,38
17,88±0,72
40,68±4,2
Mt-20
13,45±0,39 13,31±0,42 0,15±0,04
87,51±2,72
1,09±0,29
Mt-31
16,16±0,67 15,85±0,69 0,31±0,21
104,22±4,52
1,91±1,26
Рис. 13. Процент живых клеток S. aureus после инкубации с экстрактами линий M.
turcomanica и корня интактного растения в течение 3,5 часов.
53
Таблица 9. Результаты исследования антимикробной активности образцов экстрактов
по отношению к Staphylococcus aureus после 20 часов инкубирования. K+ ср – средние
значения положительного контроля.
№
Всего
Живые
Мертвые
кл*10^7/мл
Живые
клетки,
% к К+ (жив)
Мертвые клетки,
% от общего числа
клеток
10 мкл
k+ ср
35,59
34,58
1
----
Корень 33,35±0,18 32,26±0,42 1,09±0,25
93,29±1,22
2,81
3,27±0,76
20 мкл
k+ ср
35,66
35,04
0,62
----
Корень 35,42±0,83 34,76±0,76 0,66±0,07
99,22±2,18
1,75
1,86±0,15
30 мкл
k+ ср
25,41
24,47
0,94
Корень 26,68±7,87 26,04±7,69 0,64±0,19
---107,28±31,70
54
3,7
2,43±0,29
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате проведенных экспериментов выявлены различия между
линиями Mt-20 и Mt-31 культуры клеток M. turcomanica.
Показано, что линии Мt-20 и Mt-31 различаются по ростовым характеристикам.
При 3% сахарозы в среде для линии Мt-20 наблюдали более высокие значения
большинства характеристик при всех вариантах начальной плотности посадки, чем для
линии Mt-31. У линии Mt-31 отсутствовала лаг-фаза, а для линии Mt-20 была характерна
короткая экспоненциальная фаза роста.
Для более низкопродуктивной линии Mt-31 при увеличении содержания сахарозы в
среде до 5% при одинаковой начальной плотности посадки (1 г/л) продуктивность по
клеточной биомассе, индекс роста и максимальный уровень накопления клеточной
биомассы возрастали почти в 2 раза, удельная скорость роста – почти в 1.5 раза. В целом,
большая плотность посадки и концентрация сахарозы в среде положительно влияет на
ростовые характеристики линии Mt-31, для которой характерна большая вариабельность в
накоплении сырой и сухой массы в зависимости от условий. При этом у линии Mt-20 выше
скорость роста и индекс роста, т.е. она быстрее достигает своих максимальных значений по
сухой массе.
Кроме того, при сравнении линий по морфологии для линии Mt-20 наблюдали
присутствие в клеточной популяции вытянутых S-образных клеток, для Mt-31 подобных
клеток не выявлено.
Биохимический анализ также позволил выявить различия между двумя исследуемыми
линиями и корнем интактного растения. Анализируя хроматограммы, можно отметить, что
для линий Mt-20, Mt-31 и корня характерно наличие разных пиков, а вещества,
определённые в линии Mt-31, не выявлены в других пробах.
В экстракте из корня интактного растения обнаружен алкалоид гиосциамин (ион
[M+H] с m/z 290; хроматограмма положительных ионов). В линиях Mt-20 и Mt-31 данный
алкалоид отсутствует. Для линии Mt-31 также показано присутствие различных моно- и
диаминов.
Отличия между двумя линиями и корнем наблюдаются и при анализе антимикробной
активности. Корень обладает выраженным дозо-зависимым ингибирующим эффектом, в то
время как для высоких концентраций экстракта линии Mt-20 характерен слабовыраженный
эффект, а для линии Mt-31 подавления роста S. aureus не показано.
55
ВЫВОДЫ
1. Проведенный комплексный анализ показал, что для суспензионных культур клеток M.
Turcomanica увеличение начальной плотности посадки приводит к повышению
значений таких ростовых параметров, как уровень максимального накопления
биомассы, жизнеспособность, экономический коэффициент. При этом более высокие
значения этих показателей наблюдали для более молодой линии Mt-20.
2. На примере линии Mt-31 показано, что повышение концентрации сахарозы в среде на
66% в два раза увеличивает продуктивность линии по клеточной биомассе.
3. Качественный фитохимический анализ выявил существенные различия в спектре
синтезируемых соединений между двумя исследуемыми линиями и корнем
интактного растения. В частности, в экстрактах из клеточной биомассы линий Mt-20 и
Mt-31 отсутствует алкалоид гиосциамин, характерный для корня.
4. Показано, что экстракты из корня интактного растения и клеточной биомассы
исследуемых линий отличаются по антимикробной активности. Корень обладает
выраженным дозо-зависимым ингибирующим эффектом в отношении S. aureus, в то
время как для высоких концентраций экстракта линии
Mt-20 характерен
слабовыраженный эффект, а для линии Mt-31 подавления роста S. aureus не показано.
5. При добавлении метилжасмоната и сукцината отмечено изменение ростовых
параметров, а также показан другой набор хроматографических пиков, что позволяет
предполагать отличия в биосинтезе от контрольной группы. Тем не менее для
расшифровки соединений нужна дополнительная обработка полученных данных.
56
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Акмурадов А. и др. Эндемичные лекарствннные растения юго-западного
Копетдага, применяемые в туркменской народной медицине // Сибирский
медицинский журнал (Иркутск). 2016. Т. 1. С. 56–61.
2. Базарова Ю. Г., Иванченко О. Б. Исследование состава биологически активных
веществ экстрактов дикорастущих растений // Вопросы питания. 2016. С. 100–107.
3. Болдырева Я. А., Величко Н. А. Влияние элементов минерального питания на рост
каллусной ткани и синтез алкалоидов в культуре ткани катарантуса розового //
Биотехнология. 2003. № 1. С. 53–62.
4. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitrо и биотехнологии на их
основе: Учебное пособие., 1999. 160 с.
5. Демидова Е. В., Решетняк О. В., Носов А. М. Влияние состава питательных сред на
ростовые характеристики и содержание тритерпеновых гликозидов суспензионной
культуры клеток женьшеня японского (Panax japonicus var repens) // Биотехнология.
2006. № 2. С. 32–39.
6. Кочкин Д. В. и др. Хромато-масс-спектрометрическая идентификация гликозидов
фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот в суспензионной культуре клеток
Mandragora turcomanica // Физиология Растений. 2021. Т. 68. № 5.
7. Мизгирёва, О.Ф. Новый вид рода мандрагора (сель-мелек) из Туркмении // Труды
Туркменского филиала Академии наук СССР / Академия наук СССР. 1942. Вып.№
2. С. 165-170.
8. Назаренко Л. В. и др. Биотехнология растений учебник и практикум для
бакалавриата и магистратуры 2-е издание, исправленное и дополненное., 2018. 161
с.
9. Носов А.М. (2011) Методы оценки и характеристики роста культур клеток высших
растений // Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной
биологии растений, под ред. Вл.В. Кузнецова, В.В. Кузнецова, Г.А. Романова. М.:
БИОНОМ, 2018. С. 386–403.
10. Пельтихина О. В., Морозова М. А., Морозов А. М. Об истории фитотерапии в
России и мире // Синергия наук. 2018. № S24. С. 35–50.
11. Пинчук С. А. Разработка и использование препарата «ВИТАГМАЛ ®» на основе
экстракта биомассы клеток субтропического лекарственного растения из семейства
аралиевых Polyscias filicifolia., 2017.
12. Полисенкова В. Д. Электронный учебно-методический комплекс по учебной
57
дисциплине лекарственные растения., 2016.
13. Решетников В. Н., Спиридович Е. В., Носов А. М. Биотехнология растений и
перспективы ее развития // Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 1. С. 3–
18.
14. Савин П. С. и др. Изучение зависимости роста суспензионной культуры Thalictrum
minus L. и синтеза ею алкалоида Берберина от фитогормонов // Фармацевтическая
химия. 2015. С. 17–21.
15. Салова Т. Ю., Громова Н. Ю. Теоретические аспекты получения биологически
активных веществ из растительного и животного сырья // Успехи современного
естествознания. 2016. Т. 3. С. 39–43.
16. Смирнова Ю. А., Киселева Т. Л. Новые Виды Лекарственных Растений Для
Отечественной Фармакопеи // Фармация. 2009. Т. 7. С. 6–8.
17. Смирнова Ю. Н. и др. Влияние регуляторов роста на синтез гинзенозидов в
культуре клеток двух видов женьшеня // Физиология Растений. 2010. Т. 57. № 3. С.
458–466.
18. Смоленская И. Н. и др. Суспензионная культура клеток Panax japonicus var. repens
.1. Параметры роста и цитогенетические характеристики // Биотехнология. 2005. №
5. С. 21–28.
19. Суханова Е. С., Куличенко И. Е., Соболькова Г. И. Всероссийская коллекция
культур клеток высших растений ИФР РАН (УНУ ВККК ВР) // 2018. Т. 58. № 082.
20. Суханова Е. С., Соболькова Г. И. Получение каллусных культур клеток ценных
лекарственных растений Ближнего Востока: Mandragora turcomanica и Alhagi
persarum // Биология клеток растений in vitro и биотехнология, 2018. С. 228–229.
21. Akhani H., Ghorbani A. B. Mandragora turcomanica (solanaceae) in Iran: A new
distribution record for an endangered species // Syst. Biodivers. 2003. V. 1. № 2. P. 177–
180.
22. Al-Ahmad H. In Vitro Decoated Seed Germination and Seedling Development for
Propagation of Wild Mandrake (Mandragora autumnalis Bertol.) // 2020.
23. Aniszewski T. Alkaloids - Secrets of Life, 2007.
24. Asilbekova D. T. et al. Lipids of the tuberous roots of Mandragora turcomanica // Chem.
Nat. Compd. 1994. V. 30. № 5. P. 566–572.
25. Asilbekova D. T., Giushenkova A. I. Triacylglycerols of the seeds and fruit flesh of
Mandragora turcomanica // Chem. Nat. Compd. 1999. V. 35. № 3. P. 291–294.
26. Asilbekova D. T., Glushenkova A. I. Lipids pf the seeds and flesh of the fruit of
Mandragora turcomanica // Chem. Nat. Compd. 1998. V. 34. № 6. P. 664–667.
58
27. Averyanova E. V. et al. Research of process of extraction of biologically active
substances (BAS) from plant raw materials in the conditions of ultrasonic extraction //
International Conference of Young Specialists on Micro/Nanotechnologies and Electron
Devices, EDM, 2017. P. 255–259.
28. Babbar S. B., Jain N. ‘Isubgol’ as an alternative gelling agent in plant tissue culture
media // Plant Cell Rep. 1998. V. 17. P. 318–322.
29. Babbar S. B., Jain R., Walia N. GUAR GUM AS A GELLING AGENT FOR PLANT
TISSUE CULTURE MEDIA // Vitr. Cell. Dev. Biol. - Plant. 2005. V. 41. P. 258–261.
30. Baser K. H. C. et al. Composition of the essential oil and the headspace sample of
mandragora autumnalis bertol. Fruits // J. Essent. Oil Res. 1998. V. 10. № 6. P. 632–634.
31. Baysak S. et al. Case Report A Case Report of Allergic Contact Dermatitis due to
Mandragora Radix // 2015.
32. Butenko R. G. et al. Changes in culture medium pH by cell suspension cultures of
Dioscorea deltoidea // Plant Sci. Lett. 1984. V. 35. P. 207–212.
33. Chang B. et al. The improved resistance to high salinity induced by trehalose is
associated with ionic regulation and osmotic adjustment in Catharanthus roseus // Plant
Physiol. Biochem. 2014. V. 77. P. 140–148.
34. Chiang L., Abdullah M. A. Enhanced anthraquinones production from adsorbent-treated
Morinda elliptica cell suspension cultures in production medium strategy // Process
Biochem. 2007. V. 42. № 5. P. 757–763.
35. Chidiac E. J., Kaddoum R. N., Fuleihan S. F. Mandragora: Anesthetic of the ancients //
Anesth. Analg. 2012. V. 115. № 6. P. 1437–1441.
36. Dioscorides, First century. In "The Greek Herbal of Dioscorides", the 1934, Edition (ed.
By Gunther, R. T.), p. 701, Hafner Publishing Co., London and New York.
37. Elshorbagy M. I. et al. Tropane Alkaloids Production From Callus Culture of Atropa
Belladonna L. As Affected By Elicitors and Precursor Feeding // Int. Res. J. Pharm.
2018. V. 9. № 7. P. 116–125.
38. Fleisher Z., Fleisher A. The odoriferous principles of mandrake, Mandragora officinarum
L. // J. Essent. Oil Res. 1992. V. 4. № 2. P. 187–188.
39. Fogel K. Mandragora: Phylogenetic and Domestication // Ph.D. thesis, Ben-Gurion Univ.
negev. 2012. № June.
40. Frense D. Taxanes: Perspectives for biotechnological production // Appl. Microbiol.
Biotechnol. 2007. V. 73. № 6. P. 1233–1240.
41. Fukuda H., Komamine A. Direct Evidence for Cytodifferentiation to Tracheary
Elements without Intervening Mitosis in a Culture of Single Cells Isolated from the
59
Mesophyll of Zinnia elegans // Plant Physiol. 1980. V. 65. № 1. P. 61–64.
42. Gamborg O. L. et al. Plant tissue culture media // Vitr. Cell. Dev. Biol. - Plant. 1976. V.
12. № 15. P. 473–478.
43. George E. F., Hall M. A., Klerk G.-J. De. Plant Propagation by Tissue Culture 3rd
Edition, 2008. 501 p.
44. Globa E. B. et al. Callusogenesis and Formation of Cell Suspension Cultures of Four
Taxus // 2009. № 3. P. 63–70.
45. Godoy-hernández G., Vázquez-flota F. Growth Measurements Estimation of cell division
and cell expansion // V. 318. P. 51–58.
46. Gundlach H. et al. Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell
cultures // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. V. 89. № 6. P. 2389–2393.
47. Gusakova S. D., Asilbekova D. T. Structure and composition of the triacylglycerols of
the tuberrous roots of Mandragora turcomanica // Chem. Nat. Compd. 1997. V. 33. № 4.
P. 441–444.
48. Hanuš L. O. et al. Substances isolated from Mandragora species // Phytochemistry. 2005.
V. 66. № 20. P. 2408–2417.
49. Harfi B. et al. Hyoscyamine production in hairy roots of three Datura species exposed to
high-salt medium // Vitr. Cell. Dev. Biol. - Plant. 2016. V. 52. № 1. P. 92–98.
50. Horsch R. B. et al. A Simple and General Method for hybridization revealed the expected
// Science. 1985. V. 227. P. 1229–1231.
51. Jackson B. P., Berry M. I. Hydroxytropane tiglates in the roots of Mandragora species //
Phytochemistry. 1973. V. 12. № 5. P. 1165–1166.
52. Jackson B. P., Berry M. I. Mandragora - taxonomy and chemistry of the Europian species
// The biology and taxonomy of the Solanaceae, 1979. P. 505–512.
53. Jain N., Babbar S. B. Gum katira-a cheap gelling agent for plant tissue culture media,
2002. p. 223–229.
54. Jimenez-Mejias M. E. et al. Atropine poisoning by Mandragora autumnalis. Report of 15
cases // Med. Clin. (Barc). 1990. V. 95. № 18. P. 689–692.
55. Jodallah N., saleem Ali-shtayeh M. Antioxidant and antimicrobial activity of Mandragora
autumnalis Bertol extracts // An-Najah Natl. Univ. 2013.
56. Johnson A. A. T. Protoplast Fusion for the Production of Intermonoploid Somatic
Hybrids // 1998. № Virginia Polytechnic Institute and State University.
57. Kaneko Y., Bang S. W. Interspecific and intergeneric hybridization and chromosomal
engineering of brassicaceae crops // Breed. Sci. 2014. V. 64. № 1. P. 14–22.
58. Khandy M. T. et al. Obtaining and Study of Callus and Suspension Plant Cell Cultures of
60
Tribulus terrestris L., a Producer of Steroidal Glycosides // Appl. Biochem. Microbiol.
2017. V. 53. № 8. P. 800–806.
59. Khaw K. Y. et al. Solvent supercritical fluid technologies to extract bioactive compounds
from natural sources: A review // Molecules. 2017. V. 22. № 7.
60. Kohnen-Johannsen K. L., Kayser O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology,
biosynthesis and production // Molecules. 2019. V. 24. № 4. P. 1–23.
61. Kolewe M. E., Gaurav V., Roberts S. C. Pharmaceutically active natural product
synthesis and supply via plant cell culture technology // Mol. Pharm. 2008. V. 5. № 2. P.
243–256.
62. Kotin A. M., Bichevaya N. K. ANTI-TERATOGENIC AGENT // 1996.
63. Kumar A., Tata S. of Current Research in Vitro Induction of Callusogenesis in Chili
Peppers (Capsicum Annuum L.) // 2010. № January 2010. P. 1–4.
64. LaRue C. D. The growth of plant embryos in culture // Bull. Torrey Bot. Club. 1936. V.
63. P. 365–382.
65. Lee M. H. et al. Precursor-feeding strategy for the production of solanine, solanidine and
solasodine by a cell culture of Solanum lyratum // Process Biochem. 2007. V. 42. № 5. P.
899–903.
66. Ligor M. et al. Extraction approaches used for the determination of biologically active
compounds (cyclitols, polyphenols and saponins) isolated from plant material //
Electrophoresis. 2018. V. 39. № 15. P. 1860–1874.
67. Liu C., Zhao Y., Wang Y. Artemisinin: Current state and perspectives for
biotechnological production of an antimalarial drug // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006.
V. 72. № 1. P. 11–20.
68. Loo S.-W. Cultivation of Excised Stem Tips of Asparagus in Vitro // Am. J. Bot. 1945.
V. 32. № 1. P. 13–17.
69. Matsuura H. N., Fett-Neto A. G. Plant Alkaloids: Main Features, Toxicity, and
Mechanisms of Action // Plant Toxins, 2017. P. 243–261.
70. Michler C. H., Lineberger R. D. Effects of light on somatic embryo development and
abscisic levels in carrot suspension cultures // Plant Cell. Tissue Organ Cult. 1987. V. 11.
P. 189–207.
71. Mou K. M., Parvin M. N., Dash P. R. Phytochemistry and medicinal properties of
Mandragora officinarum: A review // Int. J. Pharmacogn. Pharm. Res. 2019. P. 05–09.
72. Muir W. H., Hildebrandt A. C., Riker A. J. The preparation, isolation and growth in
culture of single cells from higher plants // 1958. V. 45. № 8. P. 589–597.
73. Muller J. F., Ionier C., Caboche M. Low density growth of cells derived from Nicotiana
61
and Petunia protoplasts: Influence of the source of protoplasts and comparison of the
growth‐promoting activity of various auxins // Physiol. Plant. 1983. V. 57. № 1. P. 35–
41.
74. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with
Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. № 3. P. 473–497.
75. Negrutiu I., Jacobs M. Factors which Enhance in vitro Morphogenesis of Arabidopsis
thaliana // Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 1978. V. 90. № 5. P. 423–430.
76. Obeidat M. Antimicrobial activity of some medicinal plants against multidrug resistant
skin pathogens // J. Med. Plants Res. 2011. V. 5. № 16. P. 3856–3860.
77. Pasqua G. et al. Triterpenoids and ellagic acid derivatives from in vitro cultures of
Camptotheca acuminata Decaisne // Plant Physiol. Biochem. 2006. V. 44. № 4. P. 220–
225.
78. Piccillo G. A., Mondati E. G. M., Moro P. A. Six clinical cases of Mandragora
autumnalis poisoning: Diagnosis and treatment // Eur. J. Emerg. Med. 2002. V. 9. № 4. P.
342–347.
79. Rahman M. A., Blake J. Factors affecting in vitro proliferation and rooting of shoots of
jackfruit (Artocarpus heterophyllus Lam.) // Plant Cell. Tissue Organ Cult. 1988. V. 13.
P. 179–187.
80. Razzakov N. A. et al. Alkaloids of Mandragora turcomanica // Chem. Nat. Compd. 1998.
V. 34. P. 741–742.
81. Robbins W. J. Cultivation of Excised Root Tips and Stem Tips Under Sterile Conditions
// Bot. Gaz. 1922. V. 73. № 5. P. 376–390.
82. Roselló-Soto E. et al. High Voltage Electrical Discharges, Pulsed Electric Field, and
Ultrasound Assisted Extraction of Protein and Phenolic Compounds from Olive Kernel //
Food Bioprocess Technol. 2014, V. 8. p. 885–894.
83. Ryu D. D., Lee S. O., Romani R. J. Determination of growth rate for plant cell cultures:
comparative studies // Biotechnol. Bioeng. 1990. V. 35. P. 305–311.
84. Schenk R. U., Hildebrandt A. C. Medium and techniques for induction and growth of
monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Can. J. Bot. 1972. V. 50. P.
199–204.
85. Schlesinger D. et al. Alkaloid chemodiversity in Mandragora spp. is associated with lossof-functionality of MoH6H, a hyoscyamine 6β-hydroxylase gene. // Plant Sci. 2019. P.
310.
86. Schultes R. E. The botanical and clinical distribution of hallucinogens // J. Psychoactive
Drugs. 1977. V. 9. № 3. P. 247–263.
62
87. Seibert M., Wetherbee P. J., Job D. D. The Effects of Light Intensity and Spectral Quality
on Growth and Shoot Initiation in Tobacco Callus // Plant Physiol. 1975. V. 56. P. 130–
139.
88. Sinev I. E. The history of Mandragora turkomanica (Solanaceae) // Israel Journal of Plant
Sciences. 2016 V. 63, № 3 P. 176-181.
89. Smith I. K. Regulation of sulfate assimilation in Tobacco cells // Plant Physiol. 1980. V.
66. P. 877–883.
90. Stafford A., Morris P., Fowler M. W. Plant cell biotechnology: A perspective // Enzyme
Microb. Technol. 1986. V. 8. № 10. P. 578–587.
91. Steffenson B. J. et al. Genetics of multiple disease resistance in a doubled‐haploid
population of barley // Plant Breed. 1995. V. 114. № 1. P. 50–54.
92. Sugiyama M. Historical review of research on plant cell dedifferentiation // J. Plant Res.
2015. V. 128. № 3. P. 349–359.
93. Suleiman R. K., Abu M., Sabri S. S. Fitoterapia New withanolides from Mandragora
officinarum: First report of withanolides from the Genus Mandragora // Fitoterapia. 2010.
V. 81. № 7. P. 864–868.
94. Thorpe T. A. History of plant tissue culture // Mol. Biotechnol. 2007. V. 37. № 2. P. 169–
180.
95. Tong S. Y. C. et al. Staphylococcus aureus infections: Epidemiology, pathophysiology,
clinical manifestations, and management // Clin. Microbiol. Rev. 2015. V. 28. № 3. P.
603–661.
96. Torres K. C., Carlisi J. A. Plant Cell Reports Shoot and root organogenesis of Camellia
sasanqua, 1986. p. 381–384.
97. Tran T. D. et al. Potent Antibacterial Prenylated Acetophenones from the Australian
Endemic Plant Acronychia crassipetala // Antibiotics. 2020. V. 9. № 8. P. 487.
98. Tu T. et al. Dispersals of Hyoscyameae and Mandragoreae (Solanaceae) from the New
World to Eurasia in the early Miocene and their biogeographic diversification within
Eurasia // Mol. Phylogenet. Evol. 2010. V. 57. № 3. P. 1226–1237.
99. Uysal S., Zengİn G., Aktumsek A. Antioxidant properties and enzyme inhibitory effects
of extracts from Mandragora autumnalis and its fatty acid composition // Marmara
Pharm. J. 2016. № 2. P. 144–151.
100.
Volis S. et al. Evolutionary history and biogeography of Mandragora L.
(Solanaceae) // Mol. Phylogenet. Evol. 2018. V. 129. № July 2017. P. 85–95.
101.
Wilson S. A., Roberts S. C. Recent advances towards development and
commercialization of plant cell culture processes for the synthesis of biomolecules //
63
Plant Biotechnol. 2012. V. 10. P. 249–268.
102.
Xu D.-P. et al. Natural Antioxidants in Foods and Medicinal Plants: Extraction,
Assessment and Resources // Int. J. Mol. Sci.
103.
Yemets A. I. et al. Efficient callus formation and plant regeneration of goosegrass
[Eleusine indica (L.) Gaertn.] // Plant Cell Rep. 2003. V. 21. № 6. P. 503–510.
104.
Yukimune Y. et al. Methyl jasmonate-induced overproduction of paclitaxel and
Baccatin III in Taxus cell suspension cultures // Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. № 9. P.
1129–1132.
105.
Zhao J. et al. Effects of stress factors, bioregulators, and synthetic precursors on
indole alkaloid production in compact callus clusters cultures of Catharanthus roseus //
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 55. № 6. P. 693–698.
106.
Zimmerman J. L. Somatic embryogenesis: A model for early development in
higher plants // Plant Cell. 1993. V. 5. № 10. P. 1411–1423.
107.
The Plant List [Электронный ресурс]. URL: http://www.theplantlist.org (дата
обращения: 23.03.2021).
64
ПРИЛОЖЕНИЕ
Таблица 2. Состав питательных сред, использовавшихся при культивировании. А - c
минеральной основой по Шенку и Хильдебрандту (SH), Б - ArSc (c минеральной основой
по Мурасиге-Скугу (MS)).
А.
Компонент питательной
Среда SH
Микросоли SH
Макросоли SH
среды
KNO3
2500 мг/л среды
MgSO4 x 7H2O
400 мг/л
NH4H2PO4
300 мг/л
CaCl2 20%
0.75 мл/л
MnSO4 x H2O
10 мг/л
H3BO4
5 мг/л
ZnSO4 x 7H2O
1 мг/л
KI
1 мг/л
CuSO4 x 5H2O
0.2 мг/л
Na2MoO4 x 2H2O
0.1 мг/л
CoCl2 x 6H2O
0.1 мг/л
Fe-хелат
5 мл/л
Инозит
100 мг/л
Тиамин HCl
5 мг/л
Пиридоксин HCl
0.5 мг/л
Никотиновая кислота
5 мг/л
2.4-Д
1 мг/л
Кинетин
0.1 мг/л
Сахароза
30 г/л
65
Б.
Компонент питательной
Среда ArSc
Микросоли MS
Макросоли MS
среды
NH4NO3
1,65 г/л
KNO3
1,9 г/л
MgSO4x7H2O
0,37 г/л
KH2PO4
0,17 г/л
CaCl2x2H2O
0,44 г/л
H3BO3
6,2 мг/л
MnSO4x4H2O
22,3 мг/л
ZnSO4x7H2O
8,6 мг/л
KI
0,83 мг/л
Na2MoO4x2H2O
0,25 мг/л
CuSO4x5H2O
0,025 мг/л
CoCl2x6H2O
0,025 мг/л
Фолиевая к-та
0,5 мг/л
Рибофлавин (В2)
0,5 мг/л
биотин
1,0 мг/л
Са-пантетонат
1,0 мг/л
Кобаламин (В12)
0,002 мг/л
Fe-ЭДТА
5 мл/л
Сахароза
30 г/л
Инозит
100 мг/л
2,4-Д
1 мл/л
ИУК
1 мл/л
БАП
0,2 мл/л
66
Таблица 3. Пробы, использованные для биохимического анализа.
Эксперимент Культура
Плотность Содержание сахарозы в
посадки
среде (по массе)
Mt-31
0,3 г/л
3%
1 г/л
3%
кривая роста
1 г/л
5%
Mt-20
0,3 г/л
3%
1 г/л
3%
Mt-20, Mj
200 мкМ
активация
Mt-20, Suc
вторичного
0,6 г/л
3%
10 мкМ
метаболизма
Mt-20,
контроль
67
Сутки
выращивания
17
17
17
14
11
14
БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаю глубокую благодарность кафедре физиологии растений МГУ, Институту
физиологии растений РАН и научным руководителям Титовой Марии Владимировне и
Кочкину Дмитрию Владимировичу за мудрое наставничество. Также хочется сказать
спасибо сотруднице экспериментальной клиники ВНИИМП им. Горбатова Елене
Александровне Котеневой за проведение и разъяснение методики антимикробной
активности, сотрудникам ИФР РАН Александру Владимировичу Носову и Артёму
Алексеевичу Фоменкову за прекрасные микрофотографии культур клеток и студенткам
кафедры физиологии растений Луньковой Марии и Тюриной Татьяне за помощь на
различных этапах работы.
68
Отзывы:
Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв