Изучение антистоксовой флуоресценции цианобактериальных фикобилипротеинов

Тема работы посвящена изучению особенностей антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов и возможности применения метода спектрального анализа антистоксовой флуоресценции для изучения белок-белковых взаимодействий в цианобактериальных фикобилисомных комплексах. Фикобилисомы – светособирающие комплексы цианобактерий и красных водорослей, содержащие сотни билиновых хромофоров и десятки линкерных белков, связывающих фикобилипротеины таким образом, чтобы обеспечить эффективную миграцию энергии возбуждения на хлорофиллы фотосистем. Основными частями этих комплексов являются фикоцианиновые стержневые и аллофикоцианиновые ядерные структуры. Для защиты фотосинтетического аппарата от избыточного освещения цианобактерии имеют систему нефотохимического тушения на основе оранжевого каротиноидного белка (ОСР). Предполагается, что ОСР взаимодействует с ядрами фикобилисом, хромофоры которых способны поглощать более красный свет, чем стержневые фикобилины. Тем не менее, точный механизм ОСР-зависимого нефотохимического тушения энергии возбуждения неизвестен, как неизвестен и сайт взаимодействия ОСР с фикобилисомой. Стандартные методы флуоресцентной спектроскопии в значительной степени помогли продвинуться в изучении этого вопроса, однако имеются значительные ограничения этих методов, связанные с перераспределением энергии возбуждения в системе и двусмысленностью получаемых результатов. В этой работе был разработан принципиально новый подход к применению флуоресцентной спектроскопии для изучения белок-белковых взаимодействий в цианобактериальных светособирающих комплексах на основе возбуждения антистоксовой флуоресценции. Впервые было предложено использовать ИК-излучение 770 нм для наиболее селективного возбуждения ядер фикобилисом и изучения особенностей взаимодействия фикобилисомы с ОСР, а также белок-белковых взаимодействий в фикобилисомных комплексах. Возможность возбуждения антистоксовой флуоресценции была показана еще в 30х годах прошлого века научной группой Каутского. Сейчас известно о нескольких механизмах такого возбуждения, в том числе однофотонном возбуждении по механизму «горячей полосы поглощения». В работе подробно изучены механизмы возбуждения антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов и фикобилисом ИК-светом. Впервые была показана возможность возбуждения антистоксовой флуоресценции цианобактериальных фикобилисомных комплексов и отдельных фикобилипротеинов инфракрасным светом в однофотонном режиме по механизму «горячей полосы поглощения». В работе подробно изучены свойства антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов с точки зрения как эффективности такого возбуждения, так и т.н. эффектов возбуждения на красном краю поглощения, а также эффектов фотоселективности по основному электронному состоянию вследствие конформационной подвижности билиновых хромофоров. На примере гексамеров фикоцианина мы показали возможность избирательного возбуждения различных состояний хромофоров в гетерогенном растворе цианобактериальных фикобилипротеинов, ранее определяемых только методами спектроскопии единичных молекул. Было проведено сравнительное исследование свойств антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов и их комплексов для исследования характера белок-белковых взаимодействий, в частности между отдельными фикобилипротеинами, фикобилипротеинами и линкерными белками, а также их комплесов с оранжевым каротиноидным белком. На основании анализа фикобилипротеинов разной степени олигомеризации были выдвинуты предположения о (1) влиянии степени олигомеризации и целостности фикобилипротеинов на диэлектрическое окружение фикобилиновых хромофоров, и, соответственно, на спектральные свойства антистоксовой флуоресценции, в частности на батохромные сдвиги спектров антистоксовой флуоресценции, а также о (2) возможности селективного возбуждения ИК-излучением низкоэнергетических хромофоров, в частности ядерных хромофоров фикобилисом. Были проведены исследования фикобилисомных комплексов с ОСР при селективном возбуждении ядерных хромофоров. Полученные данные свидетельствуют о значительном изменении диэлектрического окружения части фикобилинов в составе фикобилисомы при взаимодействии с ОСР, а также о расположении сайта тушения в области между стержнями и ядром фикобилисомы. Результаты данной работы открывают новые возможности для исследования фотофизики флуоресцентных белковых комплексов, в частности, цианобактериальных фикобилисом и фикобилипротеинов, а также особенностей белок-белковых и белок-хромофорных взаимодействий.