ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТОЦИТОВ И ТРОМБОЦИТОВ КРОВИ КРЫС БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЭНДОМЕТРИТОМ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КВЧ -ИЗЛУЧЕНИЯ В ОПЫТАХ IN VITRO

Крайишник

ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТОЦИТОВ И ТРОМБОЦИТОВ КРОВИ КРЫС БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЭНДОМЕТРИТОМ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КВЧ -ИЗЛУЧЕНИЯ В ОПЫТАХ IN VITRO

Целью работы являлось изучение функциональной активности эритроцитов и тромбоцитов крови крыс больных острым эндометритом, при воздействии КВЧ -излучения в опытах in vitro. Исследования проводились на 15 белых лабораторных крыс, самок массой 250-300 г. Кровь забиралась из подъязычной вены на 5-е, 10-е и 15-е сутки эксперимента. Для моделирования воспалительного процесса эндометрия крыс использовали раствор аутокаловых масс по методике Никонова. Полученную свежеприготовленную эмульсию вводили крысам ректально.

Биология

Дипломы

Вуз: Нижегородский государственный университет имени Н. И. Лобачевского (ФГБОУ ВПО ННГУ им. Н. И. Лобачевского)

ID: 60e3fb05e4dde5000173ce4a

UUID: 12516fa0-c053-0139-3a33-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 4

10.08

Крайишник

Нижегородский государственный университет имени Н. И. Лобачевского (ФГБОУ ВПО ННГУ им. Н. И. Лобачевского)

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 762,4 КБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ.Н.И.ЛОБАЧЕВСКОГО» ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ И БИОМЕДИЦИНЫ Кафедра физиологии и анатомии Профиль_Физиология ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТОЦИТОВ И ТРОМБОЦИТОВ КРОВИ КРЫС БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЭНДОМЕТРИТОМ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КВЧ ИЗЛУЧЕНИЯ В ОПЫТАХ IN VITRO Научный руководитель: д.б.н., доцент кафедры физиологии и анатомии Копылова Светлана Вячеславовна Выпускная квалификационная работа (бакалаврская работа) студента 4 курса очной формы обучения, обучающегося по программе подготовки бакалавра по направлению Биология, Крайишник Милицы

Нижний Новгород 2021 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..................................................................................4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................7 1.1 Строение и функции эритроцитов.....................................7 1.1.1 Состав и морфология....................................................7 1.1.2 Строение мембраны эритроцитов................................7 1.1.3 Функции эритроцитов.................................................10 1.2 Исследования физиологии эритроцитов in vitro............11 1.2.1 Потребление глюкозы эритроцитами........................11 1.2.2 Осмотическая резистентность эритроцитов.............12 1.2.3 Исследование агрегации эритроцитов......................14 1.2.4 Электрокинетические свойства эритроцитов..........15 1.2.5 Влияние КВЧ –излучении на эритроциты in vitro.....15 1.3 Строение и функции тромбоцитов...................................17 1.4 Исследования физиологии тромбоцитов in vitro............19 1.4.1 Методы исследования спонтанной агрегации тромбоцитов.........................................................................19 1.4.2 Метод исследования ретракции сгустка крови.........20 1.4.3 Методы исследования системы гемостаза................21 1.4.4 Влияние КВЧ –излучении на тромбоциты in vitro.....21 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........23 2.1 Характеристика объекта и материалы исследования....23

2.2 Определение резистентности эритроцитов методом кислотных эритрограмм (Смирнова, 1995)...........................25 2.3 Осмотическая резистентность эритроцитов (Смирнова, 1995)........................................................................................ 26 2.4 Потребление глюкозы эритроцитами (Чиркин, 2002)....28 2.5 Определение ретенции (адгезивности) тромбоцитов (Баркаган, 1980).....................................................................29 2.6 Определение ретракции кровяного сгустка (Макферлейн, 1970)...............................................................30 2.7 Гемолизат- агрегационный тест (Баркаган, 1980).........30 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................32 3.1 Влияние КВЧ-излучения на морфо-функциональное состояние мембран эритроцитов (кислотную резистентность, осмотическую резистентность, на потребление глюкозы ) крови крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro..............................................32 3.2 Влияние КВЧ-излучения на морфо-функциональное состояние тромбоцитов (адгезивность, ретракцию кровяного сгустка, агрегацию) крови крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro..............................................43 ВЫВОДЫ.................................................................................... 47 ПРИЛОЖЕНИЯ:........................................................................48 ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА:.............................................50

4 ВВЕДЕНИЕ Одним из новых направлений клинической медицины является использование электромагнитных волн низкоинтенсивных крайне высокой частоты (КВЧ терапия). Известно, что в основе механизмов индивидуальной резистентности к внешним воздействиям лежат процессы, развивающиеся на клеточном уровне, в этом случае доступными и информативными объектами при исследовании изучений резистентности организма могут служить клетки крови (Choi, 2001). Электромагнитные колебания крайне высокой частоты (КВЧ-диапазона) медицинской уже более практике. К 30 лет применяются колебаниям в КВЧ-диапазона принято относить электромагнитные волны частотой 30-300 ГГц. Такой диапазон электромагнитных волн обладает рядом уникальных биологических свойств (Бецкий, 2002). В ряде экспериментальных работ было показано, что в процессе жизнедеятельности клетка вырабатывает электромагнитные колебания весьма широкого диапазона. При различных нарушениях функционирования клеток их электрическая симметрия нарушается. Клетки начинают генерировать когерентные электромагнитные волны КВЧ. Целью этих электромагнитных волн является нормализация нарушенных функций клеток. Предполагают, что внешнее КВЧ-облучение по сути имитирует указанные клеточные регулирующие воздействия, способствует нормализации нарушенных

5 функций клеток. Основной точкой приложения волн КВЧ является мембранно-информационная система они обладают выраженным воздействием на мембраны клеток, стимулируют перемешивание ее липидных слоев и белковых компонентов, изменяя функциональную активность клетки (Киричук, 2003). Предполагается, интенсивностей что КВЧ-излучение способно нетепловых индуцировать структурные перестройки в мембранах, что сопровождается быстрым закрыванием пробойных интерпретация каналов полученных ионных данных утечек. Такая согласуется с результатами по влиянию ЭМИ сантиметрового диапазона на температурные эритроцитов зависимости проницаемости мембран и подвижности жирных кислот в мембранах липосом (Капустина, 2002). Исследования эритроцитов в могут области решить физиологии многие задачи и патологии в медицине: например, повышение устойчивости эритроцитов к гемолизу при хранении препаратов консервированной крови, лечение эритроцитозов гипопластических опухолевого и генеза, дефицитных гемолитических, анемий, которые сопровождаются ускоренной гибелью эритроцитов. Согласно данным изучение многочисленных состояния исследовании эритроцитов при показано что критических, терминальных и постреанимационных состояниях позволяет выявить, как реагируют клетки, ответственные за газообмен

6 в организме, на сильные изменения обмена веществ, которые происходят при критических состояниях, и как при этом изменяются их функциональные, структурные и биохимические свойства. Расстройство микроциркуляции играет ключевую роль в патогенезе воспалительных заболеваний. В настоящее время показано, что повышение агрегации тромбоцитов является важным элементом патогенеза как развития, прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний, так и возникновения осложнений. Целью работы являлось изучение функциональной активности эритроцитов и тромбоцитов крови крыс больных острым эндометритом, при воздействии КВЧ -излучения в опытах in vitro. Задачи: 1.Изучить влияние КВЧ-излучения на морфо- функциональное состояние мембран эритроцитов (кислотную резистентность, потребление осмотическую глюкозы ) крови резистентность, крыс больных на острым эндометритом в опытах in vitro. 2.Изучить функциональное ретракцию влияние состояние кровяного КВЧ-излучения тромбоцитов сгустка, агрегацию) больных острым эндометритом в опытах in vitro на морфо- (адгезивность, крови крыс

7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Строение и функции эритроцитов 1.1.1 Состав и морфология Эритроцит состоит из воды (70%), гемоглобина (25%), а также липидов, сахаров, солей, ферментных белков на долю которых приходится 5%. (Мчедлишвили, 2002). Нормальный зрелый эритроцит (нормоцит) оксифилен, не содержит ядра и клеточных органелл. При физиологических условиях 85- 97% эритроцитов человека имеют форму двояковогнутого диска с

8 утолщениями по краям и центральной впадиной, на которую приходиться 35-55% его поверхности. Молекула гемоглобина находится близко максимальную эритроцитов поверхности, скорость в эхиноцитарную, изменения к норме газообмена. имеют клетки), обеспечивает Примерно неправильную стоматоцитарную, объема что форму: сфероцитарную куполообразную и 3% (без другие варианты, что обусловлено нарушением внутриклеточного обмена или наличием физико¬химических воздействий на эритроцит. (Блохина, Назаров, 2005). Зрелый эритроцит человека имеет диаметр 7 — 8 мкм и толщину 2,2 мкм по краям и в центре 1 мкм, объем эритроцитов составляет 85— 90 мкм3, площадь поверхности 145 мкм2. Особенности клеточного скелета и структуры мембраны позволяют ему претерпевать значительную деформацию и проходить через капилляры с просветом в 2-3 мкм. (Кленова, Кленов , 2009). 1.1.2 Строение мембраны эритроцитов Мембрана эритроцитов составляет всего 1% от веса эритроцита , но именно она определяет гомеостаз и функциональное состояние эритроцита (Трошкина, 2007). Структура клеточной мембраны типичного дискоцита одинакова на всей поверхности эритроцита. Известно, что мембрана эритроцита выглядит следующим образом: на внешней поверхности расположены липиды, сиаловая кислота, адсорбированные белки; антигенные внутренняя олигосахариды, поверхность

9 представлена кальцием, гликолитическими АТФ-азой, ферментами, гликопротеинами и натрием, гемоглобином (Погорелов, 2004). Распределение липидов в эритроцитарной мембране ассиметрично: на ее внешней стороне концентрируются сфингомиелин (26% от всех липидов) и фосфатидилхолин (28%), на внутренней фосфатидилэтаноламин - фосфатидилсерин (27%) и (13%), аминофосфолипиды (Воробьев, 2005). Белки мембраны условно разделяют на интегральные (встроены в липидный (цитоплазматические). слой) Интегральные и периферические белки в основном представлены белком полосы 3, гликофоринами А, В, С. (рис 1.) Рис 1. Схема расположения белковых структур и спектринового матрикса в бислое мембраны эритроцита (по Лиему Р., 2005).

10 По функциональному значению белки эритроцитарной мембраны делят на формирующие мембранный скелет (спектрины, анкирин, белки полосы 4.1, 4.2,4.9, актин и др.) и на белки, которые обеспечивают метаболизм и ионный гомеостаз клетки ,белок полосы 3, или анионный канал, гликофорины, аддуцин, ацетилхолинэстераза, белок полосы 4,5 и фракции 6, Nа+, К+-АТФ-аза, Са2т-АТФ- аза, карбоангидраза. Белок спектрин состоит из двух фракций (аи b- спектрины), является основным белком, который составляет структуру цитоскелета, он регулирует подвижность белков и удерживает в равновесии двойной слой липидов (Воробьев, 2005). Белок анкирин является крупным белком, молекула его состоит из 1881 аминокислоты, участвует в укреплении нескольких интегральных белков на определенном месте (Воробьев, 2005). Гликофорин А является основным сиалогликопротеидом мембраны эритроцита (75% от всех сиалогликопротеидов), содержит большинство сиаловых кислот, обладает МК- антигенной активностью, несет рецепторы к вирусу гриппа и фигогемагглютинину (Мушкамбаров, 2003). Белок полосы 3 (band 3, гликопротеин) функционирует как ионный канал, обменивая в легких HCO3- на Cl- по механизму пассивного транспорта. (Заварзин, 2000). Белок 3 полосы формирует основу (кор) для макромолекулярного

11 комплекса интегральных и периферических белков мембраны эритроцитов ( Perrotta, 2008). Основу фибриллярной сети субмембранной системы поверхностного аппарата эритроцита составляют связанные между собой спектрина, тетрамерные формирующие комплексы молекул гексагональные белка структуры на внутренней стороне мембраны (Tanner, 2002). В мембранах эритроцитов обнаружено присутствие аквапорина 1. Он принимает участие в транспорте двуокиси углерода через мембрану эритроцита. Через аквопорин 1 переносится до 60 % углекислого газа, что позволяет рассматривать аквопорин как основной путь поступления CO2 в эритроцит ( Трошкина, 2007). Одним из основных биофизических показателей крови являются ее реологические свойства. Реология крови — текучесть, которая функционального определяется состояния совокупностью форменных элементов (подвижность, деформируемость, агрегационная активность эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов), вязкости (концентрация белков и липидов) и осмолярности крови. Ключевая роль в формировании реологических параметров крови принадлежит форменным элементам, прежде всего эритроцитам, которые составляют 98% от общего объема клеточной популяции (Фирсов, Климанова и др. , 2010). 1.1.3 Функции эритроцитов

12 1)Эритроциты осуществляют газотранспортную функцию. Перенос кислорода от альвеол легких к тканям и углекислого газа от тканей к легким реализуется с участием гемоглобина и карбоангидразы. 2)Эритроциты участвуют в гомеостазировании рН, т.е. выполняют буферную функцию (Оловникова, Николаева, осуществляют питательную функцию 2001). 3)Эритроциты - переносят на своей поверхности аминокислоты, холестерин, глюкозу, витамины (В1, В2, В6, С) от органов пищеварения к клеткам организма . 4)Эритроциты выполняют защитную функцию. Она реализуется за счет адсорбции на поверхности эритроцитов токсических веществ, ряда вирусов и микробов ,разрушения медиаторов типа ацетилхолина холинэстеразой эритроцитов (Оловникова, Николаева, 2001). 6)Эритроциты несут в себе групповые признаки крови и детерминанты Rh (Горев, Смагулова и др., 2005). 7)Эритроциты являются регуляторами сосудистого тонуса. Многие из указанных функций реализуются за счет того, что на инсулина, мембране эритроцита соматотропного содержатся гормона, рецепторы ацетилхолина, катехоламинов, простагландинов, иммуноглобулинов (Martin, Bernard, 2001). 1.2 Исследования физиологии эритроцитов in vitro

13 1.2.1 Потребление глюкозы эритроцитами Значительное увеличение концентрации глюкозы внутри клетки цитоскелета, приводит гемоглобина к , изменением липид-белковых нарушаться взаимодействие гликозилированию что может сопровождаться взаимодействий, белков белков может цитоскелета и целостность мембран эритроцитов( Чеснокова, Понукалина и др., 2015). Шпаков Н.М.,проводил исследование о влиянии глюкозы на устойчивость эритроцитов млекопитающих к механическому стрессу, и показал как содержание глюкозы влияет на механические свойства эритроцитов (Шпаков, 2015). Шпаков наблюдал что повышенное содержание глюкозы в крови приводит к изменению механических свойств эритроцитов, в результате чего снижается их способность проходить по капиллярам, уменьшается площадь контакта клетки с поверхностью сосудов и снижается транспортная Снижение функция. свидетельствует о снижении потребления скорости кислородглюкозы гликолитических процессов (Шпаков, 2015). 1.2.2 Осмотическая резистентность эритроцитов Эритроциты человека в плазме крови или свежевыделенные растворе эритроциты представляют дискоциты. Объем в собой дискоцита изотоническом двояковогнутые можно солевом диски увеличить – до

14 сферической формы без изменения площади поверхности мембраны. При увеличивается увеличении площадь обьема поверхности эритроцита мембраны (Козак, эритроцитов (ОРЭ) 2010). Осмотическая резистентность отражает функциональное состояние клеточных мембран. В настоящее время гипотонической ОРЭ принято среды, определять выраженной в по степени процентном содержании NaCl, при которой происходит частичный или полный гемолиз эритроцитов . Наиболее вероятно, что этот метод преимущественно отражает способность эритроцитов к деформируемости: чем она выше, тем выше ОРЭ, т.е. тем требуется больший объем воды, входящей в эритроцит, для его разрушения. Обычно помещая осмотическую эритроциты резистентность в раствор определяют поваренной соли .Изотононическим является 0,9% раствор NaCl, в нем эритроциты Минимальное приводить не набухают значение и остаются концентрации осмотическому гемолизу, NaCl, дискоцитами. которое является не мерой осмотической хрупкости. Эритроциты в крови по критерию осмотической хрупкости распределены по нормальному закону(закону Гаусса)( Камилов, Шакиров и др., 2007). Осмотическая резистентность эритроцитов может зависеть от многих факторов: отношения объема клетки к площади поверхности цитоплазматической мембраны (V/S);

15 эластичности мембраны; концентрации осмотически активного материала в клетке и от изменения количества этого материала; изменения свойств мембраны под действием физических факторов и экзогенных химических соединений. (рис. 4) Рис 4. Кривая осмотической резистентности эритроцитов ( по Камилову Р.Ф., 2007) В возникновении периферическогo изменения гемодинамических звена кровотока механических свойств нарушений важным являются эритроцитов, их деформационной и агрегационной способности. Если эритроциты поместить в солевой физиологический раствор, создается то осмотическое ионами гемоглобином, а которые снаружи давление находятся только внутри в эритроцита клетке ионами, так и поэтому

16 концентрация ионов внутри эритроцита оказывается ниже, чем в окружающем растворе. За счет увеличения ионной проницаемости мембран концентрации снаружи начинают выравниваться. гемоглобин при этом создает ионов внутри и Внутриклеточный избыточное осмотическое давление, поэтому вместе с ионами в клетку входит вода и вызывает увеличение объема эритроцитов. Этот процесс называется коллоидно-осмотическим набуханием (рис. 5). Рис5. Набухание и лизис эритроцитов в гипотоническом солевом растворе (по Потаненко А.Я., 2006) Он приводит к осмотическому гемолизу даже в изотоническом солевом растворе( Потапенко, Кягова и др., 2006). Изучение осмотической резистентности дает возможность, помимо определения деформируемости эритроцитов, косвенно оценивать содержание в них аквапоринов и влияние различных биологически активных веществ на экспрессию и транслокацию аквапоринов (Крысова, Куншин и др., 2011).

17 1.2.3 Исследование агрегации эритроцитов Агрегация различается по видам : в регулярном сдвиговом потоке, при остаточном движении в микроскопической кювете, при оседании эритроцитов, при ультразвуковых колебаниях( Исследование кинетики Шрамм, Куличихин, образования 2003). эритроцитарных агрегатов у человека в норме и патологии происходит при помощи вискозиметрических приборов. Различают несколько видов вискозиметров: 1) ротационные. 2) капиллярные (Ройтман, 2001). Агрегация эритроцитов в эксперименте зависит от условий кровотока, геометрии камеры, содержащей кровь, времени которое пошло с начала процедуры, и от исходного состояния крови. (Камышников, 2002). Так же используют абсорбционные фотометрические методы, которые основаны на интенсивности поглощения света (Домушина, Дворянский и др., 2008) 1.2.4 Электрокинетические свойства эритроцитов Биологическое состояние мембраны клетки связано с поверхностным зарядом, о наличии заряда можно судить по электрофоретической подвижности клеток. Регистрация перемещения клеток крови в электрическом поле позволяет оценить не только их электрокинетический потенциал и, следовательно, морфофункциональное состояние мембран, но

18 и состояние гомеостаза организма в целом ( Матюшичев, Шамратова, 2008). 1.2.5 Влияние КВЧ –излучении на эритроциты in vitro Многочисленными исследованиями показано, что электромагнитные излучения крайне высоких частот (ЭМИ КВЧ) (30300 ГГц) или миллиметрового (мм) диапазона (λ=110 мм) низкой интенсивности (меньше 10 мВт/см) обладают выраженной биологической КВЧ-излучение обладает эффективностью. неспецифическим действием, механизмы которого к настоящему моменту до конца не изучены. Тем не менее на основе КВЧ-излучения созданы и создаются устройства для коррекции состояния организма при развитии патологических состояний. Известно, большинство заболеваний, на лечение которых действие КВЧтерапии, сопровождается что направлено нарушениями в микроциркуляторном русле. На микроциркуляторном уровне кровь проявляет себя как сложная гетерогенная система корпускулярной природы, имеющая реологические свойства, существенно отличающие ее от условия других гемодинамики жидкостей. Следовательно, на в системе микроциркуляции оказывает влияние агрегатное состояние крови. Вязкость крови в значительной степени определяется способностью эритроцитов к агрегации. Вместе с тем, результаты исследований свидетельствуют и о высокой чувствительности эритроцитов к ЭМИ мм диапазона (Киричук, 2003).

19 Так, ЭМИ КВЧ достоверно увеличивает скорость оседания эритроцитов in vitro, что может быть связано с увеличением агрегации красных клеток крови. . Получены убедительные доказательства влияния ЭМИ КВЧ на кислород-транспортную функцию и антиоксидантный потенциал эритроцитов. Выявлено, что облучение эритроцитов сопровождается интенсификацией процессов регенерации, что связано с характерными количественными и качественными изменениями липидов и эритроцитарных мембранах. После экспериментального КВЧвоздействия крови животных in vitro на образцы цельной параллельно со снижением количестваи эритроцитов выявлено увеличение их среднего диаметра, периметра, мембран объема и снижение жесткости (Авдеенко, Показано что ЭМИ 2003). КВЧ . корригирует стресс индуцированные морфологические изменения эритроцитов in деформации vitro. КВЧ воздействие препятствует эритроцитов, вызываемой стрессом, способствует сохранению нормальной формы видимости, КВЧ Таким и объема клеток. Этот факт, по всей объясняется эритроциты тем, что под воздействием ЭМИ приобретают образом, ЭМИ КВЧ повышенную прочность. препятствует нарушению функциональной целостности эритроцитов, т.е. развитию деформационного стресса (Чуян, 2006). 1.3 Строение и функции тромбоцитов

20 Тромбоциты представляют собой маленькие, 2–4 микрометра диаметром, безъядерные клеточные фрагменты, циркулирующие в кровотоке в концентрации 200–400 тыс. на микролитр и отвечающие за ключевые этапы процесса остановки кровотечения – гемостаза (Пантелеев, 2014). В исходном, неактивированном виде тромбоциты напоминают двояковыпуклые «тарелочки». Благодаря своему маленькому размеру (2–4 микрона в диаметре) они свободно проходят через капилляры. Его внутренняя среда на самом деле представляет мембранных источником каналов, собой сплошную которая мембранной служит поверхности способствует «губку», сеть дополнительным при активации секреции и гранул. Способность к активации – быстрому и в большинстве случаев необратимому переходу в некое новое состояние – является главным качеством тромбоцита. Стимулом активации может служить практически любое значительное возмущение окружающей механического среды, напряжения. вплоть Однако до простого основными физиологическими активаторами тромбоцитов считаются: 1) коллаген – главный белок внеклеточного матрикса; 2) тромбин – сериновая протеиназа, центральный фермент плазменной системы свертывания; 3) АДФ – адениновый нуклеотид, который выделяется из разрушенных клеток сосуда или секретируется плотными гранулами самих

21 тромбоцитов; 4) тромбоксан А2 – липид из класса эйкозаноидов, синтезируемый и выделяемый тромбоцитами. Действие каждого из тромбоцитарных активаторов опосредуется мембране через специализированные тромбоцита. Активация рецепторы тромбоцитов в внешне проявляется многочисленными внутренними перестройками и изменениями свойств, основными среди которых считаются: 1) изменение формы на амебовидную, для части тромбоцитов – сферическую ; 2) усиление способности к адгезии – прикреплению к месту повреждения; 3) появление способности к тромбоцитам агрегации с – целью пробки( прикреплению формирования к другим полноценной Мазуров, 2011). Часть этих свойств служит для реализации главной функции тромбоцитов – формирования гемостатической пробки, другая – для ускорения реакций свертывания крови. Так, экспонирование прокоагулянтной мембраны и секреция альфа-гранул необходимы для осуществления именно второй функции тромбоцитов. Свертывание крови представляет собой каскад реакций в плазме крови, который заканчивается формированием сети волокон фибрина и переводом крови из жидкого состояния в желеобразное. В нормальном поддерживает заряженные состоянии реакций мембрана тромбоцитов свертывания. фосфолипиды, в не Отрицательно первую очередь

22 фосфатидилсерин, сосредоточены на внутреннем слое мембраны, а фосфатидилхолин внешнего слоя связывает факторы свертывания гораздо хуже. Активация тромбоцита, предположительно, приводит к активации фермента скрамблазы, который начинает быстро, специфично, двусторонне и АДФ независимо перебрасывать отрицательно заряженные фосфолипиды из одного слоя в другой. В результате происходит ускоренное установление равновесия, при котором концентрация фосфатидилсерина в обоих слоях становится одинаковой ( Пантелеев, 2014 ). 1.4 Исследования физиологии тромбоцитов in vitro Существующие на сегодняшний день методы исследования позволяют изучить практически каждый этап участия тромбоцитов в процессе образования тромба. В диагностике нарушений тромбоцитарного звена гемостаза существенную помощь может оказать анализ состояния тромбоцитарных рецепторов, осуществляемый с помощью проточной цитометрии и электронной микроскопии ( Филиппова, 2012 ). 1.4.1 Методы исследования спонтанной агрегации тромбоцитов Большинство методов исследования САТ можно разделить по принципу из выполнения на две основные группы:1)оптические (измерение оптической плотности

23 суспензии тромбоцитов),2) визуальные (непосредственная морфологическая оценка агрегированных тромбоцитов или изменение их количества).Оценивают как наличие агрегатов тромбоцитов в исследуемой плазме или цельной крови, так и агрегационную активность тромбоцитов стимулы (длительное неспецифические в ответ вращение на в центрифуге, встряхивание). Иногда наличие САТ оценивают по степени их дезагрегации. Методы оценки агрегационной активности тромбоцитов в образце цельной крови позволяют учитывать клеточное и плазменное окружение приближенных к тромбоцитов, физиологическим; центрифугировать кровь и, т.е. нет в условиях, необходимости следовательно, подвергать дополнительному механическому воздействию тромбоциты; выраженная гиперлипидемия не влияет на точность результатов исследования в отличие от оптических методов (Козловский, 2013 ). Среди многочисленных методов определения адгезивности получил тромбоцитов метод наибольшее определения ретенции распространение на стеклянных шариках. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в венозной крови до и после ее пропускания с определенной скоростью через стандартную колонку со стеклянными шариками. Разница отражает степень адгезивности клеток. Для анализа берут свежую цитратную кровь. Исследование проводится в закрытой системе, так как соприкосновение

24 крови с воздухом, особенно в условиях перемешивания, существенно искажает результаты ( Филиппова, 2012). 1.4.2 Метод исследования ретракции сгустка крови Контракция (ретракция) кровяного сгустка – это его самопроизвольное сжатие под действием сократительных белков тромбоцитов. Несмотря на важность этого процесса для гемостаза и тромбоза, его систематическое изучение затрудняется Контракция отсутствием ссгустка сокращения количественных осуществляется активированных прилипают к нитям вязкоэластический фибрина, каркас, и за методов. счет активного тромбоцитов, образующим натягивают которые трехмерный их. Основным сократительным белком тромбоцитов является немышечный миозин IIA. Прикрепление осуществляется через тромбоцитов интегриновый к фибрину рецептор αIIbβ3 (прежнее название GPIIb/IIIa), который, в свою очередь, прочно связан с подвижными белками цитоскелета (Ложкин, 2014). Контракцию можно визуально наблюдать in vitro по уменьшению объема сгустка свежесвернувшейся крови. Поскольку движущей силой контракции сгустка являются тромбоциты, этот процесс можно использовать как тест для характеристики их количества и функционального состояния. Снижение или отсутствие контракции сгустка описано при болезни Верльгофа, тромбастении Гланцмана тромбоцитопении, и других эритремии, тромбоцитопатиях.

25 Несмотря на научную важность и потенциальную диагностическую ценность этого явления, систематическое изучение контракции широкого кровяного распространения, несовершенства сгустка не прежде существуюших получило всего методов из-за регистрации и оценки этого процесса. Степень контракции в подавляющем большинстве исследований, многочисленных, сравнительно рассчитывается очень не примерно по отношению объема выделившейся сыворотки к объему взятой крови ( Ложкин, 2014 ). 1.4.3 Методы исследования системы гемостаза Точность методов исследования системы гемостаза зависят в первую очеред от малотравматического набора крови и использования в качестве стабилизатора цитрата. В настоящей монографии дается систематизированный анализ параметров гемостаза на основе системы микротестов, большинство из этих тестов выполняется на образцах цельной крови. Вместе количественное проводятся на с тем гемолизат-агрегационный определение фактора микроколичествах агрегационный тест плазмы. тест, Виллебранда Гемолизат – отражает способность тромбоцитов к агрегации. Коагуляционный гемостаз представляет собой серию последовательных двенадцати белков, реакций, ионов идущих кальция и при участии фосфолипидов (Баркаган, 2008). 1.4.4 Влияние КВЧ –излучении на тромбоциты in vitro

26 Рассмотрение литературных данных о действии ЭМИ КВЧ на клеточном и конкретизировать субклеточном уровне представления о может возможных помочь путях восприятия организмами этого вида излучения. Имеются данные о способности КВЧ волн вызывать изменения гидратации белковых структур мембранных рецепторов. В работах показано умеренное ингибирующее влияние КВЧ облучения на функциональную активность (активацию и агрегацию) тромбоцитов в условиях in vitro. Наблюдаемый эффект ингибирования функциональной активности тромбоцитов опосредован рецепторо и мембранотропным действием КВЧ излучения на частотах молекулярного спектра поглощения и излучения (МСПИ) оксида азота. Основываясь на известных в настоящее время эффектах ЭМИ КВЧ на клетку, предполагается наличие мембранотропного действия излучения, биополимеров за а счет также влияния изменения их гидратного окружения (Подоляко, 2000). на активность конформации и

27 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Характеристика объекта и материалы исследования Исследования проводились in vitro, для чего использовалась кровь 30 белых лабораторных крыс, самок массой 250-300 г. Животных содержали в виварии, оборудованном согласно требованиям Санитарных оборудованию и правил содержанию по устройству, экспериментально- биологических клиник (вивариев) №1045-73. Исследования осуществляли в соответствии с правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к Приказу МЗ СССР №775 от 12.08.77), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях от 18 марта 1986 г. и обращения" ФЗ от РФ "О защите 01.01.1997. животных Животные от жестокого находились в

28 одинаковых пластиковых клетках с поилками, имели свободный доступ к достаточному количеству воды в поилках и полноценному экструдированному комбикорму. Световой режим вивария 12:12 (Каркищенко, Грачёв, 2010). Работа выполнялась согласно инструкциям: 1. Инструкция по охране труда при использовании вытяжных шкафов. Рег. №2. 2. Инструкция по охране труда при работе на персональном компьютере для сотрудников и студентов. Рег. №21. 3. Инструкция по охране труда для студентов при выполнении работ с использованием электроприборов Рег. №123. 4. Инструкция по охране труда для сотрудников и студентов при работе с едкими веществами (кислоты, щелочи). Рег. №120. 5. Инструкция по охране труда при работе с легковоспламеняющимися (ЛВЖ) и горючими жидкостями (ГЖ) Рег. №30. 6. Инструкция по охране труда при работе с лабораторной химической посудой и ампулами. Рег. №4. 7. Инструкция о мерах пожарной безопасности от 26.10.2017. 8. Инструкция по охране труда лабораторными животными Рег. №190. при работе с

29 9. По охране труда для работников и аспирантов при выполнении работ с использованием электроприборов Рег. №121 (Каркищенко, Грачёв, 2010). Первая группа исследований проводилась на пробах крови интактных крыс, которые не подвергались какому-либо воздействию на протяжении эксперимента. Вторая группа исследований проводилась на пробах крови больных животных, которым воспроизводился острый эндометрит, путем введения аутокаловых масс. Третья группа исследовании проводилась на пробах крови крыс опытной группы: Опыт 1 заключался в том, что кровь подвергалась КВЧ – излучению in vitro на 5 сутки после начала эксперимента. Опыт 2 заключался в том, что кровь подвергалась КВЧ – излучению in vitro на 10 сутки после начала эксперимента. Опыт 3 заключался в том, что кровь подвергалась КВЧ – излучению in vitro на 15 сутки после начала эксперимента. Для исследования тромбоцитов кровь забиралась и подвергалась КВЧ-излучению in vitro на 5, 10, 15-е сутки после начала эксперимента. Кровь забиралась из подъязычной вены на 5-е, 10-е и 15-е сутки эксперимента. Для моделирования воспалительного процесса эндометрия крыс использовали раствор аутокаловых масс (Хейфец, 1999).

30 Аутокаловую взвесь готовили непосредственно перед экспериментом. Собирали кал половозрелых самок крыс. Кал смешивали с физиологическим раствором в пропорции 1:10 (Никонов, 1988), раствор дважды фильтровали сквозь марлевый стерильный материал. Полученную свежеприготовленную эмульсию вводили крысам ректально на глубину 25 мм в объеме 1 мл с помощью устройства для обеспечивающего ректальных отсутствие вливаний травматичности (дозатора), процедуры (Никонов В. М., 1988). 2.2 Определение резистентности эритроцитов методом кислотных эритрограмм (Смирнова, 1995) Определение кислотных эритрограмм проводится на фотоэлектроколориметре ФЭК-М. Принцип метода: Фотометрическая регистрация кинетики гемолиза эритроцитов в 0,002 Н соляной кислоты. Ход определения: Одну каплю крови помещают в пробирку с 4 мл физиологического раствора. Содержимое перемешивают, 2 мл взвеси отмеряют в кювету. Заметив время, смешивают взвесь эритроцитов в кювете с 2 мл 0,002 Н раствора соляной кислоты и точно через 30 с. делают первое определение экстинкции Е 0,30 . Затем каждые 30 с делают новое определение экстинции ЕI, CO, ЕI , 30 и т.д., пока величина экстинции не перестанет уменьшаться (ЕН) . Постепенное

31 уменьшение экстинкции, наблюдаемое через интервалы 30 с, следствие постепенного разрушения эритроцитов, причем сначала разрушаются те формы, резистентность которых к соляной кислоте слабее. Процент уменьшения экстинции вычисляют по простому тройному правилу, принимая разность ЕН – Е0,30 за 100%. Процент распределения изображают графически эритроцитов от эритроцитов кривой зависимости времени эритрограммой.Нормальная по стойкости процента гемолиза эритрограмма с – 0,002 Н раствором соляной кислоты у взрослых характеризуется слабым понижением ко второй минуте, быстрым повышением и максимумом к 3,5 мин с последующим медленным снижением и достижением нулевой линии к 7 минуте. Кривую можно разделить на 3 основных участка : участок от 7,5 до 5 минут соответствует среднеустойчивым эритроцитам и участок от 3,5 до 1,5 минут соответствует эритроцитам с пониженной устойчивостью старых форм в возрасте свыше 90 дней. Расширение эритрограммы вправо указывает на увеличение числа молодых эритроцитов, т. е. на наличие регенеративного процесса. Сдвиг эритрограммы и ее имаксимума влево указывает на появление в периферической крови эритроцитов встречается интоксикациях пчелиным). при с повышенной инфекционных гемолитическими резистентностью и заболеваниях и ядами (например

32 2.3 Осмотическая резистентность эритроцитов (Смирнова, 1995) Под резистентностью эритроцитов понимают их свойство противостоять разрушительным воздействиям : осмотическим , химическим ,механическим и пр. При этом пониженная хрупкости,а резистентность повышенная соответствует резистентность повышенной – пониженной хрупкости . Резистентность эритроцитов можно исследовать по отношению к различным воздействиям. Принцип метода: определение осмотической резистентности эритроцитов основано на фотоэлектрическом измерении степени гемолиза в ряду растворов хлорида натрия. Реактивы: 0,9 раствор NaCI Ход определения: Перед исследованием приготавливают в пробирках растворы хлорида натрия различной концентрации от 0,9 до 0,2 с интервалом 0,1. В каждую пробирку с 0,5 мл раствора добавляют по две капли свежей крови. Кровь лучше набирать пипеткой от гемометра Сали и вводить по 20 мкл. Осторожным встряхиванием пробирки достигают равномерности взвеси и затем пробирки оставляют в штативе на 30 мин при комнатной температуре. После этого все растворы ряда промеряют на ФЕКе, определяя экстинцию для каждой концентрации при красном светофильтре. При красном светофильтре экстинция зависит только от

33 концентрации взвешанных в растворе частиц и практически не зависит от цвета гемоглобина. Процент парциального гемолиза вычисляют, принимая за 100% разность между максимальной экстинцией и 0,1 % NaCI. Результаты опыта выражают графиком, на котором по оси абсцисс откладывают концентрации гемолизирующих растворов, а по оси ординат – соответствующие им величины процентов парциального гемолиза. Полученный график – эритрограмма эритроцитов выражает по количественное группам стойкости. распределение Он имеет вид одновершинной кривой с острым пиком и пологими краями. От 0,85% до 0,65% имеется небольшой максимум, затем идет крутой подъем к вершине основного максимума, который располагается в пределах от 0,50% до 0,44% раствора NaCI. Подъем в области 0,85% раствора соли связан с массовым подъемом эритроцитов в сфероциты, что предшествует гемолизу эритроцитов. 2.4 Потребление глюкозы эритроцитами (Чиркин, 2002) Принцип метода: Основным источником энергии для эритроцитов является глюкоза. В мембране эритроцита находятся переносчики глюкозы (гликофорин, GLUT- 1 cKm= 1-2 ммоль/л. Для оценки трансмембранного переноса определяют убыль глюкозы из среды инкубации, содержащей эритроциты. Реактивы, исследуемый материал:

34 1)изоонический раствор NaCI 0,85 %; 2) фосфатный буфер – 0,1 М, pH 7,4 (7,16 гNa2HPO4 ∙ 12 H2O растворить в 100 мл H2O ; 2,72 гKH2PO4 растворить в 100 мл H2 O; к 81 мл раствора Na2HPO4 добавить примерно 19 мл раствора KH2PO4 (pH 7,4) и довести объем дистиллированной водой до 200 мл); 3) инкубационная смесь , состоящая из 1объема изотонического раствора NaCI и 1 объема 0,1 М фосфатного буфера , рH 7,4 . В инкубационную смесь добавляют глюкозу из расчета 12 мг на 10 мл смеси; 4) свежие эритроциты, изотоническим раствором отмытые NaCI 3 и раза холодным упакованные центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин. Ход работы: смешивают 2 объема инкубационной смеси и 1 объем упакованных эритроцитов. Инкубируют 2 ч при 37◦C , периодически встряхивая пробирку. До и после инкубации отбирают по 0,1 мл инкубационной смеси и определяют содержание глюкозы. Делают заключение об убыли глюкозы в процессе инкубации. Концентрацию глюкозы рассчитали по формуле: С=Eо/Eк×10 С - концентрация глюкозы в опытной пробе, моль/л Е0 - оптическая плотность опытной пробы,ед.опт.плотн. Ек- оптическая пробы,ед.опт.плотн. плотность калибровочной

35 10- концентрация глюкозы в калибровочном растворе, моль/л Статистическая обработка проводилась с использованием программы Excel и Т-критерия Стьюдента для парных сравнений. Результаты оценивались как статистически значимые при р ≤ 0,05. 2.5 Определение ретенции (адгезивности) тромбоцитов (Баркаган, 1980) Принцип метода: Среди многочисленных методов определения адгезивности распространение получил тромбоцитов метод наибольшее определения ретенции. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в венозной крови до и после ее пропускания с определенной скоростью через стандартную колонку. свежевзятую Для исследования цитратную берут кровь. В полиэтиленовый или силиконированный стеклянный шприц набирают 2 мл крови, присоединяют к нему полихлорвиниловую трубку (колонку). Качают трубку 60 сек. Количество тромбоцитов определяют дважды: до и после пропускания крови через колонку. Индекс ретенции (адгезивности) тромбоцитов рассчитывают по следующей формуле: ИР = (А-В/А) ´ 100 (%), где ИР — индекс ретенции (адгезивности); А — количество тромбоцитов в крови до пропускания;

36 В — количество тромбоцитов в крови после пропускания через колонку. 2.6 Определение ретракции кровяного сгустка (Макферлейн, 1970) В градуированную центрифужную пробирку помещают 5 мл венозной крови. В нее погружают стеклянную палочку с шероховатой поверхностью, укрепленную вертикально при помощи пробки, закрывающей пробирку. Пробирку устанавливают на водяную баню при 37 градусах Цельсия. Через час после свертывания стеклянную палочку удаляют вместе со сгустком. Определяют объем оставшейся сыворотки и выражают его в процентах. Ретракция кровяного сгустка недостаточна или отсутствует при тромбоцитопениях и тромбоцитопатиях. 2.7 Гемолизат- агрегационный тест (Баркаган, 1980) Принцип метода : Гемолизат эритроцитов является специфическим естественным индуктором агрегации тромбоцитов. В тесте определяют время появления видимых глазом агрегатов тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме после добавления к ней гемолизата в различных концентрациях. Ход определения: кровь набирают в силиконированную пробирку, стабилизируют цитратом и отделяют богатую тромбоцитами дважды плазму, изотоническим а осадок эритроцитов раствором хлорида отмывают натрия в соотношении 1:1, центрифугируя каждый раз по 10 мин при 1500 об/ мин. После удаления изотонического раствора

37 хлорида натрия 0.1 мл отмытых эритроцитов гемолизируют в 1 мл дистиллированной воды. Это разведение является маточным и обозначается как 10−1. последовательными разведениями гемолизата до от 10−2 10−6, для Затем готовят чего 0.1 из него разведения мл каждого предыдущего раствора вносят в заранее приготовленные пробирки с 1.0 мл явяются растворы 10−6 ( дистиллированной воды. Рабочими 10−2 ( максимальная доза гемолизата ) и минимальная доза). Исследуемую богатую тромбоцитами плазму разливают по 0.2 мл в две пробирки. После прогревания температуре добавляют 37 0.05 Немедленно покачивании проходящем образцов градусов мл в из 1 растворов секундометр определяют свете течение микротермостате каждого включают в появление первых и в при плазму гемолизата. при постоянном видимых агрегатов мин глазом в тромбоцитов. Определяют время появления этих агрегатов. Чтение результатов: Показания визуального теста выражают в секундах. Показатель агрегационной активности одного К тромбоцита (ААТ) определяют по формуле: ААТ,%= ∗100 , Б где К- нормальное количество тромбоцитов, соответствующее полученному времени агрегации ; Б- истинное количество тромбоцитов в исследуемой плазме. Степень активности тромбоцитов в ГАТ оценивают по индексу активации (ИАТ) по формуле: ИАТ= Кс Км , где Кс- нормальное количество

38 тромбоцитов, использовании соответствующее минимальной времени дозы агрегации гемолизата, при Км- аналогичный показатель для теста с максимальной дозой гемолизата. Причины ошибок: 1) проведение теста при тромбоцитопении (менее 150∗109/л) ; 2) проведение исследования через 20 мин и более после извлечения крови ; 3) проведение теста с плазмой, в которой уже образовались спонтанные агрегаты тромбоцитов или микросгустки фибрина Нормативные показатели : время агрегации при исследовании максимальной дозы гемолизата – 13,8±0,5 с (пределы нормальных показателей 11-17 с); для субпороговой дозы гемолизата – 46,8±3,4 с (пределы нормы 40-54 с). Норма ААТм и ААТс – 100,0±2,4% (пределы нормы 80-120%); ИАТ0,99±0,03 (пределы нормы 0,82±1,17). ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Влияние КВЧ-излучения на морфо-функциональное состояние мембран эритроцитов (кислотную резистентность, осмотическую резистентность, на потребление глюкозы ) крови крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro. В данной серии экспериментов было изучено влияние КВЧ-излучения in vitro на кислотную резистентность

39 эритроцитов здоровых крыс и крыс больных острым эндометритом. Цифровые данные оптической плотности крови вынесены которых в приложение, представляется при матемаческой возможным учесть крыс обработке стойкость эритроцитов и вывести эритрограмму. Рис. 7. Эритрограмма крови интактных крыс Из анализа эритрограммы (рис. 7) видно, что начало гемолиза находится Продолжительность в первом гемолиза 30-секундном составляет 4,5 интервале. минуты с резким максимумом на 3,5 минуте. По форме эритрограмма асимметрична. Ее левое плечо характеризует наличие в крови исследуемого животного клеток, которые обладают пониженной стойкостью. Правое плечо указывает на то что клетки обладают повышенной стойкостью.

40 Если весь период гемолиза разделить на три части по времени (от 30 секунд до 2 минут, от 2 минут до 3,5 минуты и от 3,5 минуты до 5 минут), то это позволит выделить в исследуемой крови эритроциты трех различных групп стойкости: первая группа (продолжительность гемолиза от 30 секунд до 2 минут) — пониженностойкие эритроциты, вторая группа (продолжительность гемолиза от 2 до 3,5 минуты) — среднестойкие и третья группа (гемолиз продолжался от 3,5 до 5 минут) — повышенностойкие. Нормальная эритрограмма с 0,002 Н раствором соляной кислоты характеризуется слабым понижением ко второй минуте, быстрым повышением и максимумом к 3,5 мин с последующим медленным снижением и достижением нулевой линии к 5 минуте. Рис. 8. Влияние острого эндометрита на изменение эритрограммы крови крыс

41 Из анализа эритрограммы (рис. 8) видно, что у крыс контрольной группы продолжительность гемолиза составляет 3 минут с резким максимумом на 1 минуте. Она характеризуется максимумом к 1 мин и с последующим медленным снижением и достижением нулевой линии к 3 минуте, чем она отличестся от эритрограммы интактной группы крыс, которая характеризуется максимумом к 3,5 минуте. Это говорит о наличии клеток которые обладают пониженной стойкостью. Рис. 9. Влияние КВЧ-излучения на кислотную резистентность эритроцитов крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro на 5-е сутки эксперимента Из анализа эритрограммы (рис. 9) видно, что продолжительность эндометритом минуты с на резким эритрограммы гемолиза 5-е сутки у крыс эксперимента максимумом видно, что больных на в 2 и крови острым составляет 3,5 мин. 4 Из преобладают

42 среднестойкие и повышенностойкие эритроциты, чем она отличается от эритрограммы интактной группы крыс. При КВЧ-излучении на 5-е сутки эксперимента число неустойчивых клеток уменьшилось. Рис. 10. Влияние КВЧ-излучения на кислотную резистентность эритроцитов крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro на 10-е сутки эксперимента Из анализа эритрограммы (рис. 10) видно, что продолжительность гемолиза у крыс болных острым эндометритом в опытах in vitro на 10-е сутки эксперимента составляет 4 минуты с резким повышением на 1 мин и последующим повышением снижением на эксперимента 3,5 мин. до 2,5 Видно, мин что в крови преобладают эритроциты по сравнению с проводился на 5-е где сутки, и на медленным 10-е пониженностойкие экспериментом, в сутки крови который преобладают

43 среднестойкие и повышенностойкие эритроциты, возможно, это связано с тем, что на 5-е сутки в пробирках остались клетки, которые благодаря собственной энергии способны поддерживать повышенную стойкость. На 10-е сутки в пробах остались только неустойчивые клетки. Рис. 11 Влияние КВЧ-излучения на кислотную резистентность эритроцитов крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro на 15-е сутки эксперимента Из анализа эритрограммы (рис. 11) видно, что продолжительность гемолиза у крыс больных эндометритом на 15-е сутки эксперимента острым составляет 3,5 минут с резким повышением на 3 мин и последующим снижением до 3,5 мин . Из эритрограммы видно, что в крови крыс интактной группы и крови крыс в опытах на 15-е сутки

44 эксперимента преобладают повышенностойкие эритроциты мембранах . На следующем этапе эксперимента была исследована кровь лабораторных курсового лечения вынесены в которых животных in vitro КВЧ-излучением. приложение, представляется при до и Цифровые матемаческой возможным после учесть их данные обработке стойкость эритроцитов и вывести эритрограмму. Рис 12. Эритрограмма крови интактных крыс Полученный график – эритрограмма - выражает количественное распределение эритроцитов по группам стойкости. От 0,85 до 0,6% имеется небольшой максимум, затем идет подъем к вершине основного максимума, который располагается в пределах от 0,5% до 0,4% раствора NaCI. Подъем в области 0,8% раствора соли связан с массовым

45 подъемом эритроцитов в сфероциты, что предшествует гемолизу эритроцитов. Рис 13. Влияние острого эндометрита на изменение эритрограммы крови крыс Полученный график – эритрограмма выражает количественное распределение эритроцитов по группам стойкости. Количество разрушенных эритроцитов у крыс контрольной группы при действии 0,5 и 0,6 конц NaCl составляет 82-90% , а у крыс интактной группы при 0,4 конц NaCl идет подъем к вершине основного максимума.

46 Рис 14. Влияние КВЧ-излучения на осмотическую резистентность эритроцитов крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro на 5-е сутки эксперимента Из графика видно что на 5-е сутки эксперимента в крови крыс в пределах от 0,5% до 0,6% растворов NaCl имеется максимум разрушения эритроцитов как и в крови контрольной группы крыс при такой концентрации растворов.

47 Рис 15. Влияние КВЧ-излучения на осмотическую резистентность эритроцитов крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro на 10-е сутки эксперимента Из эритрограммы видно что количество разрушенных эритроцитов в опытах на 10-е сутки эксперимента при действий 0,8 раствора NaCl составляет >100% по сравнению с крови крыс на 5-е сутки эксперимента где при такой же концентрации процент гемолиза менее 20% и именно такой результат говорит о наличии в эритроцитах наиболее существенных колебании количества АТФ (Камилов, 2007).

48 Рис 15.Влияние КВЧ-излучения на осмотическую резистентность эритроцитов крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro на 15-е сутки эксперимента На 15 день облучения процент разрушения эритроцитов возрастает при действии 0,2% и 0,3 % растворов NaCl. Из выше изложенного видно, что гемолиз в контроле начинался в растворе NaCl 0,5% и 0,6% концентрации. У интактной группе животных разрушение эритроцитов происходило при 0,3 % NaCl. В опыте гемолиз наступал при 0,5% NaCl на 5-е сутки КВЧ-лечении, при 0,8% NaCl на 10-е сутки КВЧ- лечении и 0,3%NaCl на 15-е сутки КВЧ-лечении что говорить о разной устойчивости опытных , контрольных и интактных эритроцитов к гемолизу. У крыс больных острым эндометритом содержание глюкозы в крови в процессе инкубации повышается.

49 После КВЧ-излучения у опытной группы крыс на 5-е сутки содержание глюкозы в крови примерно как и у интактной группы. На 10-е и 15-е сутки эксперимента содержание глюкозы в крови ещё больше снижается. Рис 19. Концентрация глюкозы в крови крыс интактной, контрольной группах и на 5-е, 10-е и 15-е сутки после воздействия КВЧ-излучении опытах in vitro Примечение * - p ≤ 0,05 достоверно по отношению к интактной группе **- p ≤ 0,05 достоверно по отношению к контрольной группе Результаты излучение экспериментов оказывает осмотическую действие резистентность показывают, как на что КВЧ- кислотную эритроцитов так и и на потребление глюкозы эритроцитами таким образом, что действует на структурные перестройки в организации

50 мембран эритроцитов, действует на процесс регенерации, что связано с характерными количественными и качественными изменениями липидов в эритроцитарных мембранах. Ряд проведенных исследовании показали, что облучение крови миллиметровыми волнами оказывает существенное влияние на осмотическую резистентность эритроцитов. После экспериментального КВЧ-воздействия на кровь in vitro параллельно со снижением количества эритроцитов выявлено увеличение их среднего диаметра, периметра, объема и снижение жесткости мембран (Капустина , 2002). Можно предположить, что острое воспаление приводит к повышению уровня холестерина в мембране эритроцита и изменению основным фосфолипидного состава. фактором изменения Установлено, фосфолипидного что спектра клеточных мембран является перекисное окисление липидов мембран клеток. При изучении мембран эритроцитов было обнаружено и нарушение белок-липидных взаимодействий, изменение активности Са2+–АТФазы и снижение активности антиоксидантной системы эритроцитов. (Рязанцева, 2004). Значительное приводит к увеличение концентрации гликозилированию белков глюкозы цитоскелета, гемоглобина и аминофосфолипидов внутреннего монослоя мембраны, что может сопровождаться целостности мембран эритроцитов. нарушением

51 3.2 Влияние КВЧ-излучения на морфо-функциональное состояние тромбоцитов (адгезивность, ретракцию кровяного сгустка, агрегацию) крови крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro Из результатов эксперимента видно что в крови крыс интактной группы индекс адгезивности составлял 42%, что соответствует эндометритом норме. В крови наблюдали крыс больных значительное острым увеличение количества тромбоцитов по сравнению с интактной группой. В опытах которые проводились на 15-е сутки после начала эксперимента доказали что КВЧ-излучение оказывает существенного влияния на процесс адгезии тромбоцитов, при этом индекс адгезивности достоверно снизился на 22%. Рис 16. Индекс адгезивности в крови крыс интактной, контрольной группах и на 15-е сутки после воздействия КВЧизлучении в опытах in vitro

52 Примечение * - p ≤ 0,05 достоверно по отношению к интактной группе **- p ≤ 0,05 достоверно по отношению к контрольной группе Увеличение объёма кровяного сгустка у крыс больных острым эндометритом было сопряжено со снижением его ретракции до 25%, по сравнению с интактной группой (45%). Под влиянием КВЧ-излучении наблюдали повышение ретракции до 35%, что говорит о эффективности воздействия КВЧ-волн на тромбоциты. Рис 17. Ретракция кровяного сгустка в крови крыс интактной, контрольной группах и на 15-е сутки после воздействия КВЧ-излучении в опытах in vitro Примечение *- p ≤ 0,05 достоверно по отношению к интактной группе

53 **- p ≤ 0,05 достоверно по отношению к контрольной группе В крови крыс больных острым эндометритом в пробирках за короткое время появились видимые глазом агрегаты тромбоцитов. Время агрегации при максимальной и минимальной дозах крыс контрольной группы(16с и исследовании гемолизата в крови 66с) уменьшилось по сравнению с интактной группой(40с и 80с) что говорит о повышении агрегационной способности тромбоцитов. Действием КВЧ-излучении на тромбоциты крови крыс в опытах in vitro наблюдали замедление скорости агрегации. Время агрегации при исследовании максимальной минимальной дозах гемолизата составляло 35с и 70с. и

54 Рис 18. Время агрегации в ГАТ при добавлении максимальной и минимальной дозах гемолизата в крови крыс интактной, контрольной и опытной групах. Примечение *- p ≤ 0,05 достоверно по отношению к интактной группе **- p ≤ 0,05 достоверно по отношению к контрольной группе Представленные данные свидетельствуют о возможности коррекции агрегационной способности тромбоцитов животных с помощью КВЧ-излучении. Показано что КВЧизлучение изменяет функциональную активность тромбоцитов и тем самым снижает адгезию тромбоцитов. Конформационные изменения кальциевых каналов может привести к уменьшению поступающих в клетку ионов Са2+, что также привело бы к уменьшению ответной реакции тромбоцитов. Данный рассмотрении режимов механизм ингибирующего КВЧ-воздействия наиболее вероятен влияния на процесс при классических активации тромбоцитов (Киричук, 2006). 1. При создании ВЫВОДЫ альтерации «острый эндометрит» эритроциты крыс становились менее резистентны к солевым и кислотным растворам, а также увеличилось потребление глюкозы этими клетками. Адгезия и

55 агрегация тромбоцитов увеличились, а также увеличился и объем кровяного сгустка. 2. При действии КВЧ-излучении на 5-е и на 15-е сутки после моделирования альтерации выявили преобладание в крови повышенностойких эритроцитов. На 10-е сутки в крови преобладали пониженностйкие эритроциты. На 5-е, 10-е и 15-е сутки, при воздействии КВЧ-излучения in vitro потребление глюкозы снижалось. 3. При действии КВЧ-излучении на 15-е сутки после моделирования альтерации выявили замедление скорости агрегации, повышение ретракции кровяного сгустка, а также снижение адгезивности тромбоцитов. ПРИЛОЖЕНИЯ: Приложение 1.

56 Влияние КВЧ-излучения на кислотную резистентность эритроцитов крови крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro Оптическая плотность, ед.опт. плотности Время Интактн Контрол КВЧ-(5- экспозиц ые . Группа е сутки) КВЧ- КВЧ-(15-е (10-е сутки) ии животн сутки) ,мин 0,5 ые 0,11±0,0 0,12±0, 1,2±0.0 1,44±0. 0,12±0.00 1 1 01 0,10±0,0 0,11±0, 5 04 1±0.013 1,3±0.0 6 0,12±0.01 1,5 2 03 0,09±0,0 0,01±0, 0,96±0. 7 0,86±0. 9 0,11±0.03 2 2 112 0,09±0,0 0,04±0, 014 0,9±0.0 014 0,56±0. 0,11±0.02 2,5 4 02 0,08±0,0 0,03±0, 15 0,59±0. 06 0,47±0. 0,01±0.02 3 15 021 0,07±0,0 0,02±0, 015 0,57±0. 19 0,44±0. 3 0,06±0.01 3,5 2 01 0,07±0,0 0,02±0, 01 0,46±0. 03 0,4±0.0 1 0,02±0.01 4 6 03 0,02±0,0 0,02±0, 02 0,21±0. 4 0,23±0. 0,02±0.01 4,5 12 03 0,01±0,0 01 0,21±0. 02 0,17±0. 01 5 3 0,01±0,0 03 0,17±0. 5,5 3 0,01±0,0 03

57 3 Приложение 2. Влияние КВЧ-излучения на осмотическую резистентность в эритроцитах крови крыс больных острым эндометритом в опытах in vitro Концентра Интактн Контро КВЧ(5-е КВЧ(10-е КВЧ(15-е ция NaCl, ые л. сутки) сутки) % животн Группа 0,2 ые 0,02±0,0 0,01±0, 0,02±0,03 0,06±0.0 0.05±0.0 0,3 1 12 0,01±0,0 0,01±0, 4 0,01±0,02 0,07±0.0 1 0.07±0.0 0,4 15 2 0,03±0,0 0,02±0, 2 0,02±0,01 0,063±0. 03 0.04±0.0 0,5 2 11 0,07±0,0 0,08±0, 047 0,04±0,01 0,083±0. 23 0.03±0.0 0,6 4 3 0,04±0,0 0,09±0, 15 056 0,06±0,01 0,089±0. 03 0.03±0.0 0,7 14 1 0,05±0,0 0,01±0, 45 071 0,02±0,00 0,09±0.0 17 0.02±0.0 0,8 3 17 0,05±0,0 0,01±0, 9 8 0,03±0,01 0,137±0. 0 0.04±0.0 1 15 2 1 113 сутки)

58 0,9 0,02±0,0 0,01±0, 0,03±0,01 0,108±0. 0.04±0.0 2 7 27 13 097 ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА: 1. Авдеенко В.С., Калюжный И.И., Креницкий А.П., Майбородин А.В., Тупикин В.Д. Изменение метаболических процессов в крови животных (in vitro) под воздействием ЭМИ КВЧ МСПИ О2 //Миллиметровые волны в биологии медицине. № 3 . 2003. С. 2128. 2. Бецкий ОВ., Яременко Ю.Г. Миллиметровые волны и перспективные области их применения // Зарубежная радиоэлектроника. № 5, 2002. С. 19-28. 3. Блохина Т.А, Назаров С.Б. Воздействие некоторых плазменных факторов на реологические характеристики эритроцитов человека // Вестник Ивановской медицинской академии. Т. 13. №3-4. 2008. С.18-20. и

59 4. Васильева Е.М. Биохимические особенности эритроцитов. Влияние патологии // Биомедицинская химия. Т. 51. №1. 2005. С.12-13. 5. Вдовин В.А., Муравьёв А.В.,Певзнер А.А. Способ определения агрегации клеток крови // Ярославский педагогический вестник. Т. 3 . №3. 2012. С.151-153. 6. Волкова С.А., Боровков Н.Н. Основы клинической гематологии. Н. Новгород: изд-во НижГМА , 2013. 400 с. 7. Воробьев А.И. Руководство по гематологии. М.: изд-во Ньюдиамед, Т. 3. 2005. 361 с. 8. Гапеев А.Б., Чемерис Н.К. Действие непрерывного и модулированного ЭМИ КВЧ на клетки животных. Обзор. Часть I. Особенности и основные гипотезы о механизмах биологического действия ЭМИ КВЧ // Вестник новых медицинских технологий.Т.1.2000. С.15-22. 9. Гармаза Ю.М., Тамашевский А.В. Механизмы развития окислительного стресса при моделировании состояния дефицита ионов цинка в эритроцитах человека in vitro // Актуальные вопросы биологической физики и химии. С.: издво Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Севастопольский государственный университет", Т. 3. №1. 2018. С.115-122. 10. Горев Р.А., Смагулова З.Ш., Макарушко С.Г. Адсорбция белка, глюкозы и холестерина на эритроцитах при действий гормонов // Вятский медицинский вестник. Т. 2. №2-3. 2005. С. 32-37.

60 11. Домушина Н.А.,Дворянский С.А., Циркин В.И. Методы изучения агрегационной способности эритроцитов // Вятский медицинский вестник. №3-4. 2008. С.59-67. 12. Елемесов Р. Е., Акоев В. Р., Ким Ю. А. Влияние электромагнитного излучения на гемолиз эритроцитов , истощенных по АТФ // II съезд биофизиков России. Тезисы. М., 1999. 13. Заварзин А.А.Сравнительная гистология. СПб.: изд-во С. -Петерб. ун-та, 2000. 520 с . 14. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов.М.: изд-во Литтерра, 2011. 480 с. 15. Мороз В.В., Голубев А.М., Афанасьев А.В., Кузовлев А.Н. ,Сергунова В.А., Гудкова О.Е., Черныш А.М. Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях // Общая реаниматология . Т. 8. №6. 2012. С.5. 16. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Эритроцит при патологии: размышления у электронного микроскопа // Архив патологии. № 3.2004. С. 53–61. 17. Капустина Н.Б. Влияние низкоинтенсивного ЭМИ КВЧдиапазона с шумовым спектром на некоторые показатели гомеостаза человека и животных// диссертация канд.биол.наук. 2002.С.22.

61 18. Камилов Р.Ф., Шакиров Д.Ф., Кудрявцев В.П. Кислотная и осмотическая резистентность эритроцитов // Вятский медицинский весник. №4. 2007. С.106-108. 19. Каркищенко Н.Н.,Грачева С.В.Руководство пр лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях //Альтернативы биомедицины. М.: изд-во Профиль-2С. 2010. 358 с. 20. Киричук В.Ф., Малинова Л.И.,Креницкий А.П. Гемореология и электромагнитное излучение КВЧдиапазона , С: изд-во Сарат. мед. ун-та,2003. 21. Киричук В.Ф., Креницкий А.П., Майбородин А.В., Тупикин В.Д. Микроциркуляция и электромагнитное излучение ТГЧдиапазона /Саратов: Изд-во СарГМУ. 2006. 391 с. 22. Козак М.В.-Возрастные изменения осмотической резистентности эритроцитов // Физиология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. №2. 2010. С.648-652. 23. Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия, М.: изд-во Мир, 2009. 473с. 24. Коношенко С. В., Мартоян М. М., Елкина Н. М., Мирмуминова З. М. Окислительная модификация протеинов и метгемоглобинобразование в эритроцитах в условиях моделирования окислительного стресса in vitro // Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского Биология. Химия. Т. 4. №1. 2018. С.35-42.

62 25. Крылов, И. А., Клеменова, Н. Г. Медко // Белорусский мед 2002 : тез. докл 1-ой Междунар. конф. Минск, 2002.С. 47-48. 26. Кленова Н.А., Кленов Р.О.Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии // Гос. образовательное учреждение высш. проф. образования "Самарский гос. ун-т". 2009. 112 с. 27. Кривенцев Ю. А., Бисалиева Р. А., Носков И. А. Гемоглобины человека // Вестник АГТУ. №11-6. 2016. С.10811085. 28. Лилунова Е.А. Система красной крови . Белгор.: изд-во Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет", 2004. 216 с. 29. Лысов В.Ф., Максимов В.И. Основы физиологии и этологии животных . М.: изд-во КолосС, 2004. 248 с. 30. Машковский М.Д. Лекарственные средства . М.: изд-во ООО «Издательство Новая волна», 2002. 540 с. 31. Мороз В.В.,Голубев А.М.,Афанасьев А.В., Кузовлев А.Н., Сергунова В.А., Гудкова О.Е., Черныш А.М., Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях // Общая реаниматология. Т. 8. №1. 2012. С.52-58. 32. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология . М.: изд-во Медицинское информационное агенство, 2003. 534 c.

63 33. Оловникова Н.И., Николаева Т.Л. Антигены эритроцитов человека,Гематология и трансфузиология. М.: изд-во Библиогр, 2001. С.95-100. 34. Орёл, Н. М.Функциональная биохимия крови, печени, почек, мышц. МНС.: изд-во БГУ, Т. 2. 2015. 150 с. 35. Погорелов В.М, Козинец Г.И. Лабораторно-клиническая диагностика анемий. М.: изд-во Медицинское информационное агентство ,2004. 152 с. 36. Подоляко В.Л., Макарчик А.В., Янкелевич Ю.Д. КВЧ- модуляция in vitro реологических свойств крови больных в остром периоде ишемического инсульта // Миллиметровые волны в биологии и медицине.№ 4 (20).2000. С. 53–55. 37. Потапенко А.Я., Кягова А.А., Тихомиров А.М. Осмотическая устойчивость эритроцитов // Медицинские науки. №3. 2010. С.9-14. 38. Ройтман Е.В. Биореология.Клиническая гемореология. Основные понятия, показатели, оборудование // Клиническая лабораторная диагностика. №5. 2001. С.25-32. 39. Рязанцева Н.В.,Новицкий В.В. Типовые нарушения молекулярной организации мембраны эритроцита при соматической и психической патологии // Успехи физиологических наук. Т. 3. №1. 2001. С.53-65. 40. Соколова И.А., Рыкова С.Ю. Агрегация эритроцитов:некоторые вопросы и гипотезы // Росийский журнал биомеханики. Т. 15. №1. 2011. С.7-22.

64 41. Фирсов Н.Н., Климанова Н.В. , Коротаева Т.В. Степень зависимости периферического кровотока от изменения микрореологических свойств крови. Региональное кровообращение и микроциркуляция. Т. 9. №4. 2010. С.4-62. 42. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Метаболические особенности эритроцитов // Успехи современного естествознания. №1-2. 2015. С.192-194. 43. Чуян Е.Н. антиноцицептивного , Джелдубаева действия Э.Р. Механизмы низкоинтенсивного миллиметрового излучения. Симферополь: изд-во Диайпи, 2006. 326 с. 44. Шифман Фред Дж. Патофизиология крови . М.: изд-во Бином, 2009. 446 с. 45. Шпакова Н.М., Нипот Е.Е., Шапкина О.А., Семионова Е.А., Орлова Н.В.- Влияние глюкозы на устойчивость эритроцитов млекопитающих к механическому стрессу // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. №3. 2015. С.142-147. 46. Шрамм Г. , Куличихин В.Г. Основы практической реологии и реометрии. М.: изд-во КолосС, 2003. 311 с. 47. Albert A. and Vera G. List Professor of Medicine, Tisch Cancer Institute, Hematology-Oncology Section, Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai // Haematologica, 2014. P.345-349. 48. Choi В., Welch A.J. // Lasers Surg. Med. – 2001. – V. 29. – P. 351–359.

65 49. Saladin KS. Anatomy and physiology – the unity of form and function. 3rd ed. New York: McGraw-Hill, 2004. P.52-62. 50. Sherwood L. Human physiology – from cells to systems. 5th ed. Belmont, Calif: Brooks/Cole, 2004. P.225-229. 51. Martin H. Steinberg, Bernard G. Forget, Douglas R. Higgs, Ronald L. Nagel, Disorders of Hemoglobin, 2001. P.63-66. 52. Perrotta S., Gallagher PG., Mohandas N.: Hereditary spherocytosis. Lancet , 2008. P.23-30. 53. Tanner M.J. Band 3 anion exchanger and its involment in erythrocyte and kidney disorses, 2002. 252 p. 54. https://cyberleninka.ru/article/n/osobennosti-molekulyarnoystruktury-membran-eritrotsitov/viewer? fbclid=IwAR2XTwEwYpDcGGsKAUQ8IfQgion3f57PKhYwPExPuR tb52MNGQ7MWlXRvPw. 55. https://cyberleninka.ru/article/n/osobennosti-obmena- glyukozy-po-pentozofosfatnomu-puti-v-eritrotsitah-materey-inovorozhdennyh-s-gerpesnoy-patologiey 56. https://jeb.biologists.org/content/jexbio/193/1/183.full.pdf 57. https://www.nature.com/articles/ncomms14750#abstract

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв