САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
КАФЕДРА ЦИТОЛОГИИ И ГИСТОЛОГИИ
Колесников Дмитрий Олегович
Магистерская диссертация
Изучение взаимодействия каналов TRPC с белками ORAI в клетках линии НЕК293
Научные руководители:
д.б.н., профессор, Корнилова Е. С.,
к.б.н, Шалыгин А. В.
Санкт-Петербург
2017
Оглавление
Список используемых сокращений:...........................................................................................4
Введение.........................................................................................................................................7
Цель и задачи работы.................................................................................................................8
Обзор литературы.......................................................................................................................9
Депо-управляемый вход кальция.........................................................................................................9
Молекулярная структура кальциевых сенсоров STIM......................................................................10
Перемещение кальциевых сенсоров STIM к плазматической мембране в область пункт.............11
Морфология и молекулярный состав пункт......................................................................................13
Функции кальциевых сенсоров STIM1, STIM2 и их изоформ.........................................................15
Депо-управляемые каналы ORAI.......................................................................................................18
Взаимодействие белков ORAI и STIM...............................................................................................19
Молекулярная структура каналов TRPC............................................................................................23
Физиологическая роль каналов TRPC...............................................................................................24
Взаимодействие белков TRPC, ORAI и STIM...................................................................................25
Депо-управляемые каналы в клетках линии HEK293.......................................................................29
Каналы Imin.......................................................................................................................................31
Каналы Ins........................................................................................................................................32
Каналы Imax......................................................................................................................................32
Постановка задачи...............................................................................................................................33
Методы и материалы...............................................................................................................33
1. Работа с клеточными культурами...................................................................................................33
1.1 Ведение клеточной линии HEK293 (клетки почки эмбриона человека).................................33
1.2 Липосомальная трансфекция клеток линии HEK293.............................................................34
1.3 Подавление экспрессии белков (РНК-интерференция):..........................................................35
1.4 Получение клеточных лизатов.................................................................................................35
2. Белковый электрофорез в ПААГ и иммуноанализ экспрессии белков........................................35
3. Метод локальной фиксации потенциала........................................................................................36
2
4. Используемое программное обеспечение......................................................................................38
Результаты и обсуждение.......................................................................................................39
Сверхэкспрессия доминантно-негативных мутантов ORAI не ингибирует активность каналов
Imax.........................................................................................................................................................39
Селективность каналов Imax не зависит от уровня экспрессии белка STIM.....................................41
Развитие активности каналов Imax, индуцированное белком STIM2 происходит медленнее, чем
активация каналов белком STIM1......................................................................................................44
Зависимость активности каналов Imax от потенциала на плазматической мембране различается в
растворах кальция и бария..................................................................................................................45
Обсуждение..........................................................................................................................................47
Выводы.........................................................................................................................................50
Список используемой литературы.............................................................................................51
3
Список используемых сокращений:
APS — Amonium peroxisulfate (Пероксисульфат аммония).
ARC — Arachidonic acid regulated channels (Каналы, регулируемые арахидоновой
кислотой).
BAPTA — (1,2-bis (o-aminophenoxy) ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (1,2 бис (оаминофенокси) этан-N, N, N ', N'-тетрауксусной кислоты).
BHQ — 2,5-Di-t-butyl-1,4-benzohydroquinone (2,5 ди-т-бутил-1,4- бензогидрохинон).
Cav1.2 — Calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1C subunit (Субъединица
альфа 1С потенциал управляемого кальциевого канала типа L).
CC — Coiled coiled (Суперскрученный).
CRAC — Calcium release activated channels (Каналы, активируемые выходом
кальция).
CRACR2 — CRAC regulator 2 (Регулятор каналов CRAC 2).
CFP — Cyan fluorescent protein (Синий флуресцентный белок).
DAG — Diacil glicerol (Диацилглицерол).
DMEM — Dulbecco's modified Eagle's medium (Модифицированная Дульбекко
среда Игла).
DMSO — Dimethyl sulfoxide (Диметилсульфоксид).
EB1 — End binding 1 protein (Белок, связывающийся с концами микротрубочек 1).
EDTA — Ethylenediaminetetraacetic acid (Этилендиаминтриуксусная кислота).
HEPES — 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (4 - (2-гидроксиэтил)
-1-пиперазинэтансульфоновая кислота).
EGTA — Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid (Этиленбис
(оксиэтиленнитрило) тетрауксусная кислота).
FBS — Fetal bovine serum (Эмбриональная сыворотка быка).
FRET — Fluorescent resonance energy transfer (Передача энергии посредством
флюоресцентного резонанса).
GFP — Green fluorescent protein (Зеленый флуоресцентный белок).
HEK293 — Human Embryonic Kidney 293 cells (Клетки почки эмбриона человека).
ICRAC — Ion flux of calcium release activated channel (Токи, развиваемые каналами,
активируемыми выходом кальция).
IP3 — Inositol 1,4,5-TrisPhosphate (Инозитол 1,4,5 трифосфат).
Mfn2 — Mitofusin 2 (Митофузин 2).
4
PIP2 — Phosphatidylinositol 4,5-diphosphate (Фосфатидилинозитол 4,5 дифосфат).
PLC — Phospholipase C (Фосфолипаза С).
PMSF — Phenylmethane sulfonyl fluoride (Фенилметан сульфонилфлуорид).
RBL2-H3 — Ratus basophilic leucemia 2 cell line (Клеточная линия базофилов,
выделенных из крысы).
ROC — Receptor operated channels (Каналы, регулируемые рецепторами).
SAM — Sterile Alpha Motif (Альфа домен белков).
SARAF — Store-operated calcium entry-associated regulatory factor (фактор,
регулирующий депо-управляемый вход кальция).
SC-SMD — Single ion Channel Single Molecule Detection technique (Детекция
одиночных каналов одновременно с детекцией флюоресценции одиночных молекул).
SDS — Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (Додецил сульфат натрия).
SERCA — Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (Кальциевая АТФаза
сарко/эндоплазматического ретикулума).
ShRNA(мшРНК) — Small hairpin RNA (Малая шпильковая РНК).
SiRNA(миРНК) — Small interfering RNA (Малая интерферирующая РНК).
SOAR — STIM - ORAI activation region (Домен активации ORAI каналов).
STIM — Stromal interaction molecule (Молекула, взаимодействующая со стромой).
TAC — Microtubule tip attachment complex (Комплекс прикрепления кончиков
микротрубочек).
TBST — Mixture of trisbufered soline and Tween 20 (Смесь солевого раствора Tris и
tween 20).
TEMED — Tetramethylethylenediamine (Тетраметилэтилендиамин).
Tg — Thapsigargin (Тапсигаргин).
TMEM110 — Transmembrane Protein 110 (Трансмембранный белок 110).
Tris — Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Трис(гидроксиметил)аминометан).
TRP — Transient receptor potential (Временный рецепторный потенциал).
TRPC — Transient receptor potential canonical (Канонический временный
рецепторный потенциал).
YFP — Yellow fluorescent protein (Желтый флуоресцентный белок).
UTP — Uridine 5 triphospate (5 уридин три фосфорная кислота).
А.к.о — Аминокислотный остаток.
АТФ — Аденозинтрифосфат.
АТФаза — Аденозинтрифосфатаза.
5
ПААГ — Полиакриламидный гель.
ПМ — Плазматическая мембрана.
ТМ — Трансмембранный.
ЭР — Эндоплазматический ретикулум.
6
Введение.
Кальций участвует в проведении внутриклеточных сигналов во всех живых
организмах. Кальциевым сигналом называют локальное повышение концентрации
кальция в цитоплазме, которое приводит к активации или ингибированию различных
внутриклеточных белков.
Через систему кальциевой сигнализации осуществляется регуляция множества
внутриклеточных процессов, таких как пролиферация и дифференцировка клетки, запуск
сигнальных каскадов, проведение нервного импульса и других функций, необходимых для
нормальной работы живой клетки.
Концентрации свободного кальция внутри клетки очень мала — приблизительно
100 нМ. Во внеклеточной среде кальций содержится в милимолярных концентрациях.
Постоянство
внутриклеточной
концентрации
кальция
поддерживает
множество
механизмов. Во-первых, внутриклеточный кальций постоянно выводится из цитоплазмы
АТФазами и обменниками либо во внеклеточное пространство, либо во внутриклеточные
кальциевые депо — эндоплазматический ретикулум (ЭР) и митохондрии. Во-вторых, в
цитоплазме кальций может быть связан кальций-связывающими белками. И напротив
существует два способа поступления кальция в цитоплазму: из внеклеточного
пространства, откуда кальций переносится за счет работы потенциал-управляемых
каналов и из кальциевых депо, а именно из эндоплазматического ретикулума. В
электроневозбудимых клетках эти пути тесно связаны.
Когда кальций по градиенту концентрации вышел из депо, начинают работать
кальциевые сенсоры STIM, расположенные на мембране ЭР. Они активируют депоуправляемые каналы, которые находятся на плазматической мембране клетки. Через них
кальций поступает в цитоплазму, откуда закачивается в депо.
Нарушения
в
системе
поддержания
кальциевого
гомеостаза
приводят
к
возникновению болезней различной природы: нейродегенеративных, онкологических,
аутоиммунных заболеваний, миопатий и других серьезных патологий ([Feske, 2011], [Ohhora, Rao, 2008]; [Zui, JianJie, 2016]; [Ryazantseva и др, 2013]).
Известно, что пору депо-управляемых каналов могут образовывать белки семейств
ORAI и TRPC. Каналы ORAI высокоселективны по отношению к двухвалентным ионам и
характеризуются чрезвычайно низкой проводимостью. Считается, что именно эти каналы
играют ключевую роль в поддержании депо-управляемого входа кальция в клетку. Нокаут
по белкам ORAI практически полностью элиминирует депо-управляемый вход [Lee и др.,
2011].
7
Каналы TRPC менее селективны по отношению к двухвалентным ионам и их
проводимость выше на два-три порядка [Cheng и др., 2013]. Кроме того, есть данные об
активации каналов TRPC производными каскада фосфолипазы С (PLC) (возможно
диацилглицеролом (DAG)) независимо от опустошения депо [Cheng и др., 2013]; [Asanov
и др., 2015].
Показано, что активность каналов ORAI и TRPC взаимосвязана [Shin и др., 2016].
В литературе описаны противоречивые данные о взаимодействии каналов ORAI и
TRPC:
1) Каналы TRPC работают независимо от каналов ORAI [Dehaven и др., 2009],
2) Каналы TRPC и ORAI формируют гетеромеры [Liao и др., 2008],
3) Активация каналов TRPC происходит вслед за входом кальция через каналы
ORAI ([Cheng и др., 2011]; [Ong, Ambudkar, 2015]),
4) Кальциевый сенсор STIM напрямую активирует каналы TRPC ([Weizhong Zeng,и
др 2009]; [Asanov и др., 2015]).
Поскольку данные противоречивы, то целью работы было изучить входит ли белок
ORAI1 в состав проводящей поры эндогенных каналов TRPC1 и участвует ли он в
регуляции этих каналов.
В качестве модельного объекта для изучения депо-управляемых каналов TRPC1 мы
использовали эндогенные канал Imax клеток линии НЕК293. Показано, что канал Imax
активируется в ответ на опустошение кальциевого депо и что в состав поры канала входят
белки TRPC1 [Skopin и др., 2013]. Известно, что в клетках линии HEK293 работают и
канал Imax и эндогенные каналы ORAI1 [Shalygin и др., 2015].
Цель и задачи работы.
Изучить входит ли белок ORAI в состав проводящей поры каналов TRPC1 и
участвует ли он в регуляции этих каналов в клетках линии НЕК293.
Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать изменение активности кальциевых каналов Imax (включающих в
свой состав белки TRPC1) при сверхэкспрессии доминантно-негативного мутанта белка
ORAI1 E106Q.
2. Выяснить, как зависит селективность каналов Imax от уровня экспрессии
основных активаторов депо-управляемых каналов ORAI, белков STIM1 и STIM2.
3. Сравнить активацию каналов Imax, вызванную белками STIM1 и STIM2.
8
4. Сравнить активность каналов Imax в случае, когда носителем тока являются ионы
кальция и ионы бария.
Обзор литературы
Кальций — это универсальный внутриклеточный посредник, контролирующий
множество функций в живой клетке. Кальций может поступать в цитоплазму из
межклеточного пространства, по градиенту концентрации, через каналы плазматической
мембраны или из внутриклеточных депо — митохондрий и эндоплазматического
ретикулума (ЭР).
Депо-управляемый вход кальция
Кальций закачивается в депо за счет работы кальциевых помп, обменников и
унипортеров [Hoppe, 2010]. Ключевую роль в механизме депо-управляемого входа играет
эндоплазматический ретикулум, в отличие от митохондрий способный быстро повышать
концентрацию кальция в цитоплазме.
Рис.1 Общая схема депо-управляемого входа кальция (По материалам обзора
[Harraz, Altier, 2014]).
Выход кальция из ЭР осуществляется через рецепторы рианодина и/или инозитол
трис фосфата, расположенные на мембране депо, которые являются кальциевыми
каналами (см. рис.1). В результате в цитоплазме запускается кальциевый сигнал —
локальное повышение концентрации кальция, что приводит к регуляции различных
внутриклеточных процессов.
В процессе восполнения содержания кальция в депо участвуют кальциевые
сенсоры STIM, пронизывающие мембрану эндоплазматического ретикулума. У них есть
кальций-связывающий домен, расположенный в люмене ретикулума. Благодаря ему они
чувствительны к изменениям содержания кальция в депо. По мере понижения
9
концентрации кальция сенсоры STIM активируются, димеризуются и перемещаются в так
называемые пункты — участки сближения мембраны ретикулума и плазматической
мембраны. Там они напрямую активируют депо-управляемые каналы. Через них кальций
поступает в цитоплазму, откуда АТФазами эндоплазматического ретикулума закачивается
в депо. Когда депо заполняется, кальциевые сенсоры релаксируют.
Молекулярная структура кальциевых сенсоров STIM
Основным регулятором работы депо-управляемых каналов являются кальциевые
сенсоры STIM. Семейство белков STIM было открыто параллельно сразу в двух
лабораториях в 2005-2006 годах в клетках мухи дрозофилы и человека. [Roos и др., 2005];
[Liou и др., 2005] с тех пор множество исследований подтвердили ключевую роль
кальциевых сенсоров в активации депо-управляемых каналов.
У млекопитающих существует два гомолога кальциевого сенсора STIM: STIM1 и
STIM2.
Рис. 2 Строение кальциевых сенсоров STIM (по материалам обзора [Stathopulos,
Ikura, 2013]).
Белок STIM1 пронизывает мембрану эндоплазматического ретикулума. Существует
несколько форм белка, образующихся в результате альтернативного сплайсинга.
Изначально была открыта сплайс изоформа названная STIM1S. Этот белок
повсеместно экспрессируется во всех клетках млекопитающих. Его молекулярная масса
равна 77,5 кДа. С-конец белка направлен в цитозоль, N-конец направлен в люмен
ретикулума.
В люмене расположены SAM домен, канонический домен EF hand, способный
связывать кальций, и неканонический домен EF hand, который не связывает кальций, но
стабилизирует структуру молекулы.
Цитозольный домен, состоит из трех суперскрученных сегментов (СС1-СС3) и
лизин богатого региона (PolyK). В нем выделяют три функционально различных участка.
Первый фрагмент непосредственно отвечает за взаимодействие с депо-управляемыми
каналами, расположенными на мембране клетки и за их активацию — домен SOAR.
10
Второй фрагмент — в покое взаимодействует с доменом, активирующим ORAI, тем самым
не позволяя тому взаимодействовать с белками ORAI или TRPC [Soboloff и др., 2012].
Третий фрагмент, отвечает за кальций зависимую инактивацию каналов ORAI. Служит для
предотвращения непрерывного тока кальция в клетку [Stathopulos, Ikura, 2013].
Второй тип кальциевого сенсора — STIM2 содержит больше аминокислотных
остатков, чем STIM1. Также существует несколько форм альтернативного сплайсинга
белка STIM2.
Белок STIM2 отличается от белка STIM1 строением цитоплазматического сегмента,
в частности ORAI-активирующего домена (SOAR). Содержит более длинную сигнальную
последовательность, также отличается строением доменов, выходящих в люмен
ретикулума и обладает еще рядом структурных отличий. В большинстве клеток
млекопитающих экспрессируются оба белка [Stathopolus,Ikura 2013].
При уменьшении концентрации кальция в депо кальциевые сенсоры STIM теряют
связь с кальцием, меняют свою конформацию и перемещаются в области сближения
плазматической мембраны и мембраны эндоплазматического ретикулума. Такие области
называют пунктами.
Перемещение кальциевых сенсоров STIM к плазматической мембране в область
пункт.
Считается, что перемещение кальциевых сенсоров к плазматической мембране
может сопровождаться изменением структуры эндоплазматического ретикулума [Shen,
Frieden, Demaurex, 2011a].
По мере опустошения депо STIM1 активируется, меняет свою конформацию
связывается с белком EB1, контактирующим с плюс концом микротрубочек. В результате
STIM1 индуцирует образование на плюс конце микротрубочек цистерн ЭР, заякоренных
через TAC комплекс, позволяющий ЭР расти и сужаться.
По
ходу
перестройки
ЭР
увеличивается
количество
цистерн
рядом
с
плазматической мембраной, длина участков ЭР, прилегающих к ПМ и число контактов
между ЭР и ПМ. В результате образуется производная из ЭР структура — кортикальный
ЭР.
Показано, что STIM1 способен формировать три типа производных ЭР:
прекортикальный ЭР, кортикальный ЭР и тонкий кортикальный ЭР.
Прекортикальный ЭР еще не имеет контактов с плазматической мембраной
(расположен на расстоянии в 500 нм от нее), однако уже лишен трансмембранных белков
11
резидентов ЭР (несущих KDEL мотив) и содержит много димеров STIM1. На
прекортикальном ЭР заякориваются тубулиновые микротрубочки.
Из прекортикального ЭР формируется кортикальный ЭР, представляющий собой
плоские листы, образованные из эндоплазматического ретикулума. На стороне,
обращенной к ПМ, отсутствуют рибосомы. Находится на расстоянии в 10-15 нм от
плазматической мембраны.
Он переходит в тонкий кортикальный ЭР, находящийся на расстоянии 1,3-14,7 нм от
плазматической мембраны. Здесь происходит взаимодействие между белками STIM и
ORAI [Shen, Frieden, Demaurex, 2011a].
Тем не менее, показано, что хотя нокаут по белку EB1 или обработка клеток
нокадозолом и препятствовали перестройке ЭР, перемещение STIM1 на плазматическую
мембрану все равно происходило [Grigoriev и др., 2008].
В ряде работ было показано, что перемещение кальциевых сенсоров STIM1 и
STIM2 в область пункт и релаксация сенсоров из области пункт происходит с разной
динамикой.
Brandman
и
соавторы
изучали
эндоплазматической
мембраны
в
перемещение
область
пункт.
кальциевых
В
клетках
сенсоров
HELA,
с
были
сверхэкспрессированы белки STIM1 и STIM2, слитые с флуоресцентными зондами. Были
созданы условия медленного опустошения кальциевого депо — клетки инкубировались в
растворе, где весь свободный кальций был связан мягким кальциевым хелатором EGTA.
STIM2 первым перемещался на плазматическую мембрану, время формирования на
мембране половины от максимального количества пункт равнялось 10 минутам, когда же
половина пункт, сформированных белком STIM1 наблюдалась после 30 минут
выдерживания в растворе EGTA.
Согласно расчетам авторов, концентрация кальция в депо при которой половина
всех кальциевых сенсоров перемещается на плазматическую мембрану равна 406 мкM для
STIM2 и 210 мкM для STIM1. Таким образом, STIM2 важен для поддержания базальной
концентрации кальция в депо (равной 300-500 мкM исходя из разных источников), а
STIM1 активируется при более резких опустошениях депо.
Интересно отметить, что при сверхэкспрессии STIM2 активность STIM1
подавляется (при сверхэкспрессии дольше 24 часов, либо больше 2 мкг кДНК на лунку)
[Brandman и др., 2009].
Shen и соавторы изучали на клетках HELA процессы олигомеризацию (при
перемещении в область пункт) и деолигомеризацию (при релаксации) белка STIM1.
12
Использовали STIM1, слитый с флуоресцентными белками YFP и CFP и смотрели FRET
взаимодействие между белками. Индуцировали опустошение депо, добавлением раствора
15 мкM BHQ, после этого отмывали ингибитор раствором 2 мМ Ca2+. Обнаружили, что
константа диссоциации STIM1 (165 ± 3,2 мкM) значительно ниже константы
олигомеризации (281 ± 2,6 мкM). Таким образом, STIM1 уходит с мембраны раньше, чем
депо успевает полностью снова заполнится. При добавлении двух молярного раствора Ca2+
STIM1 деолигомеризовался на мембране примерно за 125 секунд.
Кроме того выяснили, что для деолигомеризации STIM1 необходимо наличие
кальция в цитоплазме. Ставили эксперименты, где кальций поступал в депо напрямую,
минуя цитоплазму. Для этого депо заполняли кальцием при помощи особой формы
кальциевого хелатора BAPTA-AM, способного проникать внутрь ЭР и отдавать там
кальций. В этом случае кластеры STIM1 не диссоциировали, несмотря на повышение
концентрации кальция в ЭР. Использование лантаноидов — ингибиторов депоуправляемого входа также подавляет деолигомеризацию STIM1 [Shen, Frieden, Demaurex,
2011b]).
Морфология и молекулярный состав пункт
Исследования последних лет показали, что пункты — являются сложной
структурой, включающей в себя ряд белков и липидов, вовлеченных в регуляцию депоуправляемого входа
Для клеток линии Jurkat были получены данные, что протяженность отдельной
пункты может занимать от 200 до 300 нм, [Hogan, 2015].
Кластеры белков ORAI, образующиеся в клетках HEK293 после опустошения депо
по одним данным занимают диаметр около 700 нм, по другим около 1,4 мкм. Белки STIM
в клетках HEK293, после перемещения в область пункты занимают площадь диаметром
порядка 1,1 мкм. В случае контрольных клеток, пункты занимают около 4% площади всей
плазматической мембраной, в то время как, в случае сверхэкспрессии белков ORAI и STIM
пункты занимают площадь до 30% от всей ПМ.
В разных клеточных линиях расстояние, на котором может осуществляться
взаимодействие между белками STIM и ORAI варьирует от 8 до 17 нм.
Согласно расчетным данным в клетках HEK293 со сверхэкспрессией белков STIM и
ORAI число пункт может достигать до 300 на клетку.
13
Для контрольных клеток линии Jurkat показано, что на одну клетку приходится
порядка 2200 активных каналов ORAI, причем 1700 каналов могут работать
одновременно.
В случае сверхэкспрессии белков ORAI и STIM их расчетная плотность в пунктах
была по 1000 белков STIM1 и ORAI1 на 1 мкм2 .
Интересно отметить, что пункты всегда формируются в одних и тех же местах, что
говорит о том, что их положение заранее предопределено [Shen и др, 2011].
В лаборатории Zhou были получены данные об участии трансмембранного белка
TMEM110 в ремоделировании эндоплазматического ретикулума и образования контактов
между ЭР и ПМ. Наличие в клетке TMEM110 было необходимо для перемещения сенсора
STIM1 в пункты, была обнаружена его колокализация в пунктах вместе с сенсорами STIM.
В клетках, с нокаутом по TMEM110 количество контактов между ПМ и ЭР было
значительно снижено [Quintana и др., 2015].
Группа Liou [Chang и др., 2013] использовала маркер пункт “MAPPER” — белок,
представляющий собой слитые между собой сигнальную последовательность STIM1,
трансмембранный домен STIM1, домен, связывающий рапамицин и мотив, содержащий,
положительно заряженные аминокислотные остатки (а.к.о), который обеспечивает
конститутивную локализацию маркера в пунктах.
Исследователи доказали, что существует зависимость между числом образованных
пункт и концентрацией кальция в цитоплазме. Кроме того при повышении концентрации
кальция в цитоплазме, число пункт возрастало.
Цитоплазматическим
кальциевым
сенсором
оказались
белки
из
группы
синаптотагминов. Ранее в работе Giordano и др. 2013 [Giordano F. и др. 2013] было
доказано, что Е-синаптотагмины (Extended synaptotagmines) — белки, способные
связывать кальций и фосфолипиды, участвуют в связи мембраны ЭР и ПМ. Также, есть
данные других исследований, что синаптотагмины участвуют в кальциевой инактивации
депо-управляемых каналов [Hogan, 2015].
Авторы обнаружили, что после опустошения депо количество пункт возрастает,
однако, размеры пункт, образованных до опустошения депо, не изменяются после
добавления к клеткам тапсигаргина [Chang и др. 2013].
Считается, что транспорт через микротрубочки служит для накопления димеров
STIM1 на прилежащем к плазматической мембране участке ЭР. Олигомеры более
высокого порядка перемещаются к ПМ другим способом [Shen, Frieden, Demaurex, 2011a].
14
Вероятно, перемещение STIM1 к плазматической мембране осуществляется
пассивным транспортом, так как происходит даже в клетках, обедненных по АТФ [Shen,
Frieden, Demaurex, 2011a].
Кроме того, известно, что деполяризация мембраны митохондрии ингибирует
перемещение STIM1. В этом процессе играет роль белок mfn2 (mitofusin2), участвующий в
формировании контактов между ЭР и митохондриями, однако детальные механизмы
ингибирования пока не известны [Shen, Frieden, Demaurex, 2011a].
Функции кальциевых сенсоров STIM1, STIM2 и их изоформ.
Кальциевые сенсоры STIM1 и STIM2 отличаются по своей чувствительности к
концентрации кальция в депо.
STIM1 начинает олигомеризоваться при уменьшении концентрации кальция в депо
с базального уровня — 400-600 мкM до 210 мкM. Таким образом, он реагирует на сильное
уменьшение концентрации кальция.
Помимо депо-управляемых каналов STIM1 регулирует активность других каналов.
Так, показано, что STIM1 в возбудимых клетках взаимодействует доменом SOAR с Сконцом альфа 1 субъединицы потенциал управляемых каналов Cav1.2 L типа, ингибируя
их активность [Wang и др, 2010].
Кроме того есть сведения, что изоформа, образующиеся в ходе альтернативного
сплайсинга, STIM1L, регулирует активность каналов ORAI, не изменяя структуру
эндоплазматического ретикулума. При этом амплитуда кальциевого входа, вызванного
STIM1L выше, чем активированного повсеместно экспрессирующейся классической
изоформы STIM1S [Saüc и др., 2015].
Согласно модели авторов, этот факт объясняется следующим образом.
В случае с классической формой STIM1S в результате изменения структуры ЭР в
цитоплазме, в участках между мембраной ЭР и ПМ образуются кальциевые микродомены,
в которых поддерживается высокая концентрация кальция. Что приводит, к кальциевой
инактивации каналов ORAI, в результате меньше кальция попадает в депо.
Напротив, форма STIM1L собирается в уже предсуществующие участки ЭР,
прилегающие к плазматической мембране. В таком случае кальциевые микродомены с
высокой концентрацией кальция не образуются, следовательно, каналы ORAI будут
меньше подвержены кальциевой инактивации и больше кальция попадет в цитоплазму.
15
Рис.3. Модель активации депо-управляемых каналов изоформой STIM1L (по
материалам [Saüc и др., 2015]).
Хотя большая часть STIM1 локализована на мембране ЭР, около 10% от общего
пула белка расположена на плазматической мембране. Плазматический STIM1 не
участвует в активации депо-управляемого входа, однако, предполагается, что он способен
взаимодействовать с белками семейства STIM, расположенными в ретикулуме STIM1 и
регулировать активность депо-управляемых каналов [Soboloff и др. 2012].
STIM2 активируется при снижении концентрации кальция в депо с 400-600 мкM до
уровня в 400 мкM или ниже, таким образом, STIM2 восполняет депо после умеренного
опустошения. Часть пула STIM2 конститутивно активна и поддерживает базальную
концентрацию кальция в депо [Brandman и др., 2009].
Кроме того в ряде работ было показано, что при частичном опустошении
кальциевого депо, вызванного применением ингибиторов кальциевой помпы SERCA или
агонистов PLC в малой концентрации активируется исключительно кальциевый сенсор
STIM2.
Thiel, Lis и Penner показали на тучных клетках крысы RBL-2H3, что различные
концентрации ортованадата — ингибитора помп эндоплазматического ретикулума поразному регулируют депо-управляемый вход. Ортованадат в высоких концентрациях (от
50 мкM до 5 мМ) активировал депо-управляемые каналы через 30-60 секунд после
добавления, однако при добавлении ингибитора в малых концентрациях (5 мкM) входящие
токи кальция развивались лишь через 110 секунд. Использование антибиотика G418 —
селективного ингибитора кальциевого сенсора STIM2 позволило доказать, что ответ на
использование ортованадата в низких концентрациях обусловлен работой сенсора STIM2,
16
а в высоких концентрациях — STIM1.
Любопытно, что в клетках с подавлением экспрессии STIM2 в течение первых
суток после подавления не развивался ответ на добавление ингибитора в малой
концентрации. Однако на вторые сутки после нокдауна добавление ортованадата в той же
концентрации приводило к активации сенсора STIM1. Это связано с тем, что при
длительном подавлении экспрессии STIM2 базальная концентрация кальция в депо
постепенно падает, достигая уровня достаточного для активации STIM1.
Также соавторы показали, что STIM2 поддерживает длительные ответы на
опустошения депо — селективный ингибитор STIM2 частично подавлял вход кальция
после 400 секунды от начала развития депо-управляемых токов [Thiel, Lis, Penner, 2013].
Экспрессия STIM2 в большинстве клеток ниже, чем STIM1, за исключением
некоторых типов нервных клеток, где STIM2 является основным кальциевым сенсором
[Berna-Erro и др., 2009].
Помимо классической формы альтернативного сплайсинга STIM2 существует
форма STIM2.1, участвующая в подавлении депо-управляемого входа. Она обладает
модифицированным доменом SOAR, имеющим низкую аффинность к белкам ORAI, но
высоко аффинным к STIM1. Переместившись в пункту STIM2.1 не позволяет STIM1
активировать каналы ORAI, подавляя тем самым депо-управляемый вход кальция [Shin и
др., 2016].
Физиологическая значимость сенсора STIM1 была показана в опытах на мышах с
нокаутом по гену STIM1. Подопытные животные умирали в ходе внутриутробного
развития.
Часть мышей с нокаутом по STIM2 выживали, однако у них находили различные
патологии в работе иммунной, нервной, опорно-двигательной и других систем.
Нарушение работы STIM2 приводит к различным патологиям: нейрогенеративным
заболевания, например к болезни Альцгеймера [Ryazantseva, Skobeleva, Kaznacheyeva,
2013] и хореи Хантингтона [Vigont и др., 2014], формированию злокачественных
опухолей[Oh-hora, Rao, 2008], заболеваниям иммунной системы [Feske, 2011] и к другим
патологиям.
Переместившись в область пункт кальциевые сенсоры STIM активируют депоуправляемые каналы, расположенные на плазматической мембране клетки. Через депо
управляемые каналы кальций поступает в цитоплазму клетки, откуда закачивается
кальциевыми АТФазами обратно в депо. Известно, что депо-управляемые каналы могут
быть образованы белками из семейств ORAI и TRPC.
17
Депо-управляемые каналы ORAI
Депо-управляемые каналы ORAI играют ключевую роль в формировании депоуправляемого входа кальция в клетку. Это высокоселективные по отношению к кальцию
каналы, обладающие малой проводимостью. В настоящий момент полностью изучен
только молекулярный состав канала Icrac, состоящего из белков ORAI1.
В пору каналов ORAI входят белки достаточно консервативного семейства ORAI.
Белки ORAI находят у различных групп животных, начиная от насекомых, заканчивая
млекопитающими.
У насекомых существует только одна изоформа белка ORAI — dORAI. У рыб,
амфибий и птиц — две (ORAI1 и ORAI2). У млекопитающих обнаружено три вида белков
ORAI: ORAI1, ORAI2, ORAI3 [Shuttleworth, 2012].
При этом считается, что белки ORAI, в особенности изоформа ORAI1 играют
ключевую роль в поддержании депо-управляемого входа. Подавление экспрессии белков
ORAI в большинстве типах клеток практически полностью элиминирует депоуправляемый вход в клетку [Lee и др. 2010].
В лимфоцитах больных тяжелым иммунодефицитом нарушен кальциевый
гомеостаз. Как оказалось, там экспрессируется мутантная форма белка ORAI1 R91W.
Экспрессия нормальной формы белка ORAI1 полностью восстанавливала депоуправляемый кальциевый вход в таких лимфоцитах [Feske и др., 2006].
Большая часть мышей с нокаутом по гену
ORAI1 умирали во время
внутриутробного развития. У немногих выживших наблюдали патологии в развитии Т и В
лимфоцитов, тучных клеток, сильное облысение, маленький вес и карликовость ([Vig и
др., 2006]; [Gwack и др., 2008]).
Из данных рентгено-структурного анализа выделенного кристалла канала dIcrac
мухи дрозофилы [Hou и др., 2012], стало известно, что каналы dIcrac состоят из 6
субъединиц белка dORAI. Каждая из субъединиц образована четырьмя трансмембранными
доменами (ТМ 1-4). На каждом белке ORAI1 есть два домена, связывающих STIM (рис.4).
18
Рис.4 Строение белка ORAI1 (по материалам [Prakriya, 2013]).
Тем не менее, в более ранних работах, проведенных на клетках млекопитающих,
было показано, что каналы ICRAC образованы четырьмя субъединицами ORAI ([Mignen,
Thompson, Shuttleworth, 2008]; [Penna и др., 2008]). Thompson и Shuttleworth показали в
2013 году, что в клетках HEK293 сверхэкспрессия конструкции, состоящей из шести
связанных белков ORAI1, приводит к формированию неселективных депо-управляемых
каналов, пропускающих не только Cа2+, но и одновалентные ионы [Thompson, Shuttleworth,
2013]. Сверхэкспрессия тетрамерных каналов в клетках
HEK293 приводило к
формированию селективных по отношению к кальцию депо-управляемых каналов. Исходя
из этих данных, авторы сделали вывод, что электрофизиологические характеристики
тетрамера ближе к характеристикам каналов ICRAC, экспрессирующихся в клетках
млекопитающих.
Каналы, сформированные белками ORAI, обладают низкой проводимостью и
высокой селективностью по отношению к кальцию [Parekh, Putney, 2005].
Основными регуляторами активности депо-управляемых каналов ORAI служат
кальциевые сенсоры STIM.
Селективность каналов и их активация кальциевыми сенсорами STIM связаны. Чем
больше STIM, тем сильнее они активированы, и тем больше повышается селективность
ORAI к Ca2+ [Hoover, Lewis, 2011].
Взаимодействие белков ORAI и STIM
Взаимодействие между депо-управляемыми каналами ORAI и кальциевыми
сенсорами STIM является ключевым событием в активации депо-управляемого входа
кальция в клетку.
В настоящий момент, общепринятая модель взаимодействия белков ORAI и STIM
выглядит следующим образом (рис.5).
В отсутствии стимула димеры белков STIM свободно распределены на мембране
19
ЭР. В покое домен активации белков ORAI (домен SOAR) связан с ингибирующим
доменом, домен EF hand связан с кальцием и взаимодействует с доменом SAM.
При снижении концентрации кальция в депо домен EF hand отпускает кальций и
домен SAM. В результате STIM меняет конформацию и начинает олигомеризоваться, что
приводит к освобождению домена активации ORAI от ингибиторного домена (рис.5).
Рис. 5. Модель взаимодействия белков ORAI и STIM (по материалам работы [Yang
и др., 2012]).
Также есть данные, что во взаимодействии белков STIM и ORAI принимает участие
цитоплазматический белок SARAF (Store-operated calcium entry associated factor). Пока
STIM не активирован, SARAF связан с доменом активации белков ORAI (SOAR). За связь
SOAR и SARAF отвечает ингибиторный домен белка. В ходе опустошения депо
ингибиторный домен освобождает домен SOAR от SARAF [Ong, Ambudkar, 2015].
Параллельно с олигомеризацией STIM начинает перемещаться в область контакта
ПМ и мембраны ЭР. Там домен активации ORAI напрямую связывается с двумя участками
на канале ORAI, расположенных на N и на C концах белка. Полилизиновый домен на Сконце белков STIM взаимодействует с фосфоинозитидами ПМ и стабилизирует комплекс
STIM-ORAI [Yang и др., 2012]).
В стабилизации комплекса STIM1-ORAI1 участвует цитоплазматический белок
CRACR2, связывающийся с комплексом после опустошении депо, и диссоциирующий при
восполнении депо [Srikanth и др., 2010].
20
По-видимому, сборка пункт и взаимодействие между кальциевыми сенсорами и
депо-управляемыми каналами ORAI — это чрезвычайно сложный процесс, в который по
современным данным, вовлечены более 70 различных белков и ряд липидов [Jing и др.,
2015].
Взаимодействие между кальциевыми сенсорами STIM и ORAI влияет не только на
селективность каналов ORAI [McNally и др.2012], но и на характеристики депоуправляемого входа в клетку.
Scrimgeor и соавторы показали, что различное соотношение уровней экспрессии
белков STIM1 и ORAI1 приводит к возникновению депо-управляемых токов с различными
характеристиками.
В клетках линий HEK293 экспрессировали белки ORAI1 и STIM1 в соотношениях
1:4 или 2:1.
Рис. 6. Суммарный депо-управляемый вход кальция, полученный на клетках с
разным уровнем экспрессии белков STIM и ORAI (по материалам [Scrimgeour и др.,
2009]).
В
каждом
случае
получились
токи
с
уникальными
физиологическими
характеристиками (рис.6).
Характеристики депо-управляемых каналов Icrac, образованных при экспрессии
белков ORAI1 и STIM1 в соотношении 1:4:
В случае избытка белка STIM1 формировались токи, амплитуда которых
уменьшалась при отрицательных потенциалах в 10 мМ растворе Са 2+. Такие токи были
подвержены сильной быстрой кальциевой инактивации — при повышении концентрации
кальция в наружном растворе до 100 мМ сначала происходило резкое кратковременное
повышение амплитуды токов, после которого отмечали экспоненциальное уменьшение
амплитуды до уровня ниже, чем при 10 мМ кальция.
21
Быстрая
кальциевая
инактивация
зависела
от
концентрации
кальция
во
внеклеточном растворе — чем выше была концентрация кальция, тем быстрее
происходила инактивация токов (примерно за 100 мс для 2 мМ раствора кальция и за 30 мс
для 100 мМ раствора кальция).
Вследствие сильной кальциевой инактивации на -100 мВ бариевый ток был лишь
на 10% меньше кальциевого, а стронциевый ток был на 40% больше кальциевого. При
этом вероятность открытого состояния каналов для кальция повышалась при более
положительных потенциалах и уменьшалась на отрицательных.
График открытого состояния каналов имел форму колокола. Вероятность открытого
состояния достигала максимума при 0 мВ и выше, половина от максимально возможной
вероятности достигалась при -72 мВ. Минимальная вероятность открытого состояния
наблюдалась на потенциалах ниже -140 мВ. График вероятности открытого состояния для
бария имел обратную зависимость (рис.7).
Рис.7. Кривые вероятности открытого состояния каналов ORAI для внеклеточных
растворов кальция и бария, в случае сверхэкспрессии белка STIM (по материалам
[Scrimgeour и др., 2009]).
Характеристики депо-управляемых каналов Icrac при соотношении уровней
экспрессии ORAI1:STIM1=2:1.
При избытке ORAI1 в смеси для трансфекции формировались каналы со
следующими характеристиками. Максимальная амплитуда каналов была зарегистрирована
при
отрицательных
потенциалах.
Такие
каналы
слабо
подвержены
кальциевой
инактивации.
Замена кальция на барий или стронций во внеклеточном растворе приводила к
уменьшению амплитуды тока на потенциале -100 мВ на 70% или 35% соответственно. В
связи с меньшей подверженностью каналов медленной кальциевой инактивации
вероятность открытого состояния для кальция варьировала от -120 до +80 мВ, с максимум
22
при -30 мВ и график имел форму колокола. График открытого состояния для бария был
смещен на 70 мВ в сторону положительных потенциалов.
Рис.8 Кривые вероятности открытого состояния каналов для бария и кальция в
случае сверхэкспрессии белков ORAI (по материалам работы [Scrimgeour и др., 2009]).
Вероятно, что такие отличия в свойствах каналов объясняются изменением
стехиометрии взаимодействия белков STIM и ORAI.
Hoover и Lewis в 2011 году показали, что наибольшие токи каналов ICRAC
достигаются связыванием двух молекул STIM1 с одной молекулой ORAI1 [Hoover, Lewis,
2011]. Скорее всего, в физиологических условиях мы наблюдаем именно такое
соотношение экспрессии белков STIM и ORAI.
Молекулярная структура каналов TRPC
Помимо описанных выше депо-управляемых каналов ORAI, в формирование депоуправляемого
входа
кальция
вносит
вклад
семейство
каналов
TRPC.
Это
слабоселективные по отношению к кальцию каналы, обладающие сравнительно высокой
проводимостью.
Семейство белков TRPC (canonical TRP proteins) является подгруппой более
крупного белкового семейства TRP. Название семейства Transient receptor potential
channels — связано с объектом, на котором впервые были открыты эти белки:
неселективные каналы TRP участвуют в проведении сигнала от фоторецептора мухи
дрозофилы.
В состав семейства TRPC входят 7 генов, каждый из которых экспрессируется у
млекопитающих. Белок TRPC 2 является псевдогеном для человека, но синтезируется у
некоторых других видов млекопитающих.
Белки TRPC состоят из шести трансмембранных доменов, с порой и селективным
фильтром между 5 и 6 ТМ (трансмембранными) доменами [Dietrich, Fahlbusch, Gudermann,
23
2014]. Как правило, это неселективные катионные каналы, с большей проводимостью в
сравнении с каналами ORAI.
Рис.9 Структура белка TRPC (по материалам обзора [Dietrich, Fahlbusch,
Gudermann, 2014]).
Выделяют две подгруппы белков TRPC схожих по своей структуре: в первую
группу входят белки TRPC 1,4,5. Во вторую TRPC 3,6,7. Структурные отличия определяют
их способность взаимодействовать с кальциевыми сенсорами STIM. Каналы из первой
группы способны связываться с сенсорами STIM, таким образом, работают в качестве
депо-управляемых, в то время как каналы из второй группы сами по себе не могут
взаимодействовать с сенсорами STIM и могут работать независимо от них. В таком случае
активатором каналов будут являться разные вторичные мессенджеры, такие как
диацилглицерол (DAG) [Ong, Ambudkar, 2015]; [Asanov и др., 2015]).
Известно, что помимо депо-управляемых каналов, TRPC могут образовывать
каналы рецептор опосредованного кальциевого входа (ROC) [Liao и др., 2008]. Причем
депо-управляемые каналы TRPC локализованы ближе к центру липидных рафтов, в то
время, как ROC каналы TRPC локализованы ближе к границам липидных рафтов.
В качестве белка скэффолда каналов TRPC на плазматической мембране выступает
белок кавеолин 1. Мутация по сайту связывания с кавеолином у белка TRPC1 привела к
уменьшению депо-управляемого входа и не способности к перемещению в область пункт
[Sun и др., 2017][Ong, Ambudkar, 2015].
Физиологическая роль каналов TRPC
Физиологические функции каналов TRPC отличаются от функций каналов ORAI.
Ключевую роль в поддержании TRPC опосредованного депо-управляемого входа
для большинства типов клеток отводят каналу TRPC1.
TRPC1 и 3 участвуют в активации кальмодулином транскрипционного фактора
NfkB, регулирующего синтез провоспалительных цитокинов. TRCPC 1 участвует в
24
активации
фактора
иммунной
системы
NFAT.
[Nilius,
Flockerzi,
2014].
Также
гиперактивность каналов TRPC1 может вести к гипертрофии сердца млекопитающих.
TRPC1 играет роль в развитии атеросклероза [Takahashi и др., 2007], диабета типа II
[Cheng и др., 2013], регулирует секрецию слюнных желез млекопитающих. Патологии
работы TRPC1 может вызывать коарктацию аорты (сужение аорты).
TRPC1 участвует в регуляции дифференцировки, миграции и регенерации
эмбриональных мышечных клеток [Antigny и др., 2013], развитии остеокластов [Ong и др.,
2013], развитии болезни Паркинсона [Sun и др., 2017]. Гетеромерный комплекс, состоящий
из белков TRPC1 и 4 участвует в развитии судорожных болезней [Phelan и др., 2013].
TRPC3 участвует в регуляции работы цитокина TNF альфа в моноцитах. TRPC3
участвует в регуляции вазоконстрикции сосудов [Nilius, Flockerzi, 2014].
Мыши с нокаутом по гену TRPC1 выживают и сохраняют фертильность однако у
них обнаруживается ряд патологий поперечно-полосатых и гладких мышц, слюнных
желез, работы нейронов гиппокампа. Со стороны иммунной системы у них снижено
количество Т хелперов второго типа, снижен уровень экспрессии IL-2, и повышена
экспрессия
TNF
альфа.
Также
такие
мыши
дольше
восстанавливались
после
анафилактического шока [Nilius, Flockerzi, 2014].
Взаимодействие белков TRPC, ORAI и STIM.
Как уже было упомянуто, депо-управляемые каналы могут быть сформированы при
участии нескольких белковых семейств (на настоящий момент известна роль семейств
ORAI и TRPC), однако механизм взаимодействия между белками пока не полностью ясен.
В настоящий момент существует четыре теории взаимодействия белков TRPC и
ORAI:
1) Каналы TRPC работают независимо от каналов ORAI [Dehaven и др., 2009].
Эта теория базируется на результатах исследования группы Putney. Данные были
получены на клетках HEK293. Основанием теории являлись следующие факты:
Сверхэкспрессия белков TRPC1, 3, 7 и белка STIM1, не усиливает депоуправляемый вход в клетку.
Нокдаун по белкам STIM1 и ORAI не меняет свойства депо-управляемого входа,
опосредованного белком TRPC7. По данным авторов активность канала TRPC7
регулируется АТФазой эндоплазматического ретикулума (SERCA).
Нокаут белков STIM1 и ORAI также не меняет свойства депо-независимых каналов
TRPC 6-7 (гетеромерных аргинин-вазопрессин активируемых неселективных катионных
каналов гладкомышечной мускулатуры).
25
Кроме того исследователи доказали, что белки TRPC и белки групп ORAI и STIM
локализуются в разных участках плазматической мембраны. Если белки TRPC
локализуются преимущественно в липидных рафтах, то STIM и ORAI в других участках
плазматической мембраны. Используя ганглиозид GM1 — специфичный маркер липидных
рафтов авторы показали после опустошения депо колокализацию каналов TRPC и рафтов
и отсутствие колокализации между STIM и липидными рафтами Кроме того по данным
авторов разрушение липидных рафтов ингибировало активность каналов TRPC, однако не
влияло на формирование депо-управляемого входа кальция. Из этого авторы сделали
вывод, что белки STIM и TRPC находятся в разных мембранных доменах.
Исходя из вышеизложенных данных исследователи предположили, что STIM и
TRPC не могут взаимодействовать между собой.
Тем не менее, данные о взаимодействии сенсоров STIM, белков TRPC и ORAI с
липидными рафтами неоднозначны.
Ряд исследований подтверждают факт, того что белки TRPC входят в состав
липидных рафтов. Есть данные, что белки TRPC могут, как входить, так и покидать состав
липидных рафтов, причем, в составе рафтов они работают в качестве депо-управляемых
каналов и напрямую регулируются кальциевыми сенсорами STIM, выйдя из рафтов — в
качестве депо не зависимых каналов, которые не регулируются STIM1 [Alicia и др., 2008].
По данным одних работ разрушение холестериновых микродоменов влечет к
снижению взаимодействия между белками ORAI и STIM. Считается, что в таком случае
нарушается связь между полилизинным доменом STIM и PIP2-богатым участком
липидного рафта.
Однако, если разрушить липидные рафты уже после момента образования комплека
STIM и депо-управляемых каналов, то депо-управляемый вход не будет нарушен. Таким
образом, скорее всего, липидные рафты требуются только для сборки депо-управляемых
комплексов на мембране, а STIM1 участвует в направлении депо-управляемых комплексов
в рафты.
Недавно опубликованная работа Pachelo и соавторов [Pacheco и др., 2016б]
представила новые сведения о взаимодействии между белками STIM, ORAI и липидными
рафтами. Согласно исследованию, холестерин, входящий в состав липидных рафтов
является негативным регулятором взаимодействия ORAI и STIM. Холестерин связывается
с определенной аминокислотной последовательностью внутри домена SOAR сенсора
STIM1, ингибируя взаимодействие STIM и ORAI.
26
Исходя из этих данных доказательства, представленные в работе DeHaven, не
являются однозначными. Возможно, что исследователи не зарегистрировали белки STIM в
липидных рафтах, т. к. сенсоры STIM к этому моменту уже вышли из рафтов.
То, что сверхэкспрессия STIM1 не меняла свойства депо независимых каналов
TRPC может объясняться фактом, что STIM регулирует исключительно активность депоуправляемых каналов TRPC.
2) Каналы TRPC и ORAI работают в форме гетеромера [Liao и др., 2008].
Работа была выполнена на клетках линии HEK293. Использовали 4 линии клеток
HEK293, каждая из которых конститутивно экспрессировала TRPC1, 3, 6, 7 (HEKT 1-7).
Затем в каждой из линий клеток проводилась временная сверхэкспрессия на низком
уровне нормально работающих белков ORAI или их мутантных форм.
В клетках со сверхэкспрессией нормально работающих форм белков ORAI
исследователи зарегистрировали рост депо-управляемого входа на 50-150% по сравнению
с кальциевым входом в контрольных клетках. В клетках с мутантными белками ORAI1
R91W исследователи наблюдали подавление не только депо-управляемого входа,
опосредованного каналами TRPC, но и рецептор-активируемого кальциевого входа,
который обусловлен активностью каналов ROC — разновидностью депо не зависимых
каналов TRPC.
Также интересно отметить, что сверхэкспрессия белков STIM и ORAI значительно
повышала депо-управляемый вход в клетку, в то время как сверхэкспрессия одного лишь
белка STIM не оказывала влияния на депо-управляемый вход кальция.
Исследователи показали, что ORAI регулируют не только активность депоуправляемых каналов TRPC, но и рецептор активируемых кальциевых каналов TRPC
(ROC). Сверхэкспрессия STIM и ORAI частично снимала блок гадолинием не только с
депо-управляемых каналов, но и с ROC каналов TRPC.
Исходя из всех вышеизложенных данных исследователи предложили следующую
модель работы гетеромерных каналов TRPC-ORAI.
27
Рис. 10. Модель работы гетеромерных каналов ORAI-TRPC (по материалам работы
[Liao и др., 2008].
Согласно представлениям авторов, каналы ORAI и депо-управляемые каналы TRPC
лежат в липидных мембранных рафтах и образуют гетеромерные комплексы, в то время
как рецептор активируемые каналы TRPC (ROC) лежат за пределами липидных рафтов.
Взаимодействие STIM с ORAI ведет к активации гетеромерных ORAI-TRPC каналов.
3) Каналы TRPC могут быть напрямую активированы кальциевыми сенсорами
STIM ([Huang и др., 2006]; [Asanov и др., 2015]).
Рис. 10. Модель взаимодействия белков STIM и TRPC (по материалам обзора [Shin
и др., 2016]).
Изучением молекулярных аспектов взаимодействия между белками STIM и TRPC
во многом занималась лаборатория Muallem. Согласно модели исследователей TRPC 1, 4 и
5 могут напрямую взаимодействовать с белком STIM1 в отличие от TRPC 3, 6, 7. Причем,
STIM1 может активировать гетеродимерные каналы, образованные из субъединиц TRPC1
и 3 и TRPC4 и 6.
По данным группы Muallem у белков TRPC 3, 6 и 7 внутри С-концевого
суперспирального домена есть участок, взаимодействующий с белком STIM. Однако у
мономерных белков или гомодимеров этот участок скрыт N-концевым суперспиральным
доменом и не может взаимодействовать с белком STIM. Образование гетеродимера с
группой TRPC, взаимодействующих
со STIM белком, освобождает С-концевой
суперспиральный домен и для связи с доменом SOAR белка STIM.
В активации каналов TRPC ключевую роль играет домен SOAR белка STIM. .
Также для активации необходим полилизиновый домен, взаимодействующий с остатками
28
аспартата белков TRPC. Белок STIM с мутацией в этом домене был способен к активации
каналов ORAI, однако не мог активировать каналы TRPC [Shin и др., 2016].
В недавнем исследование Asanov и соавторы изучили субъединичный состав
каналов TRPC, активируемых кальциевым сенсором STIM. Исследователи использовали
метод, объединяющий измерение электрофизиологических характеристик каналов
методом
локальной
фиксации
потенциала,
объединенным
с
флюоресцентным
детектированием одиночных молекул (метод SC-SMD:Single ion Channel Single Molecule
Detection technique). Данный метод позволяет определять субъединичный состав активных
ионных каналов.
Согласно представлениям авторов, каждый из исследуемых каналов (TRPC1-6)
образует тетрамер. Каналы TRPC 1,4,5 могут работать в качестве депо-управляемых в
отличии от TRPC 3 и 6, для активации которых необходим DAG.
Известно, что в процессе кальциевой инактивации депо-управляемых каналов
участвует кальмодулин. В данном исследовании было показано, что один тетрамерный
канал TRPC связывают 4 молекулы кальмодулина. Связь с кальмодулином ингибирует
каналы TRPC, в случае их активации в ответ на опустошение кальциевого депо, однако не
влияет на активность каналов, регулируемых диацилглицеролом.
Однако, исследователи изучали исключительно свойства гомомерных каналов
TRPC, поэтому, возможно эти данные нельзя переносить на эндогенные гетеромерные
каналы.
4) Для активации каналов TRPC необходимы работающие белки ORAI:
Показано, что для активации каналов TRPC необходимо наличие в клетке активного
белка ORAI1. Считается, что депо-управляемый вход вызванный белком ORAI1 приводит
к привлечению белков TRPC в область пункт на ПМ, где происходит взаимодействие
TRPC со STIM [Ong, Ambudkar, 2015].
Депо-управляемые каналы в клетках линии HEK293
Для изучения ионных каналов используют метод локальной фиксации потенциала.
Ионные каналы принято характеризовать следующими свойствами: проводимостью
— способностью канала проводить поток ионов; средним временем открытого состояния
канала; вероятностью открытого состояния, которое высчитывается, как отношение
времени, в котором канал был открыт, ко времени записи всего эксперимента;
селективностью по отношению к данному иону. Последнее понятие характеризуется
потенциалом реверсии — потенциалом мембраны, при котором ток начинает течь в
29
обратном направлении. Чем выше по модулю потенциал реверсии, тем более селективным
окажется канал. Запись активности каналов на разных потенциалах дает возможность
построения вольт-амперных кривых каналов.
Каналы Icrac
Рис. 11. Вольт-амперная кривая канала Icrac (по материалам обзора [Parekh, Putney,
2005]).
Наиболее хорошо изученные депо-управляемые каналы CRAC сформированы
белками ORAI. Эти каналы характеризуются уникальными биофизическими свойствами:
крайне высокая селективность по отношению к кальцию, в сравнении с натрием
(селективность к кальцию против натрия — 1:1000). У каналов ORAI положительный
потенциал реверсии, равный примерно 50 мВ в кальций содержащих растворах. Вольтамперная кривая канала характеризуется внутренним выпрямлением. Расчетная
проводимость каналов для одиночных каналов составляет 9 фСм в физиологических
условиях [Parekh, Putney, 2005]. Диаметр поры канала необычно мал (3,8 А). Причем
активация и селективность каналов связаны. Чем больше уровень экспрессии STIM, тем
сильнее ORAI активированы, и тем больше повышается селективность ORAI к Ca2+ [Li и
др., 2011];[McNally и др., 2012].
В растворах без дивалентных ионов каналы ORAI способны проводить
моновалентные ионы (например Na+, Cs+), при этом даже микромолярная концентрация
кальция во внешнем растворе блокирует моновалентный ток.
Несмотря на то, что каналы Icrac, состоящие из белков ORAI остаются наиболее
хорошо изученными депо-управляемыми каналами, показано, что лишь в некоторых типах
клеток (в основном в иммунной системе) депо-управляемый вход определяется
активностью исключительно каналов Icrac. В большинстве других клеточных линий, таких
как HEK293 [Zagranichnaya, Wu, Villereal, 2005], клетки эндотелия сосудов [Sundivakkam и
30
др., 2012], мышечных клетках [Antigny и др., 2013] , лимфоцитах [Saul и др., 2014], каналы
Icrac не являлись единственными депо-управляемыми каналами, а в нейронах блуждающего
нерва депо-управляемый вход вообще не зависел от активности белков ORAI [Hooper и др
2013].
Поэтому изучение других типов депо-управляемых каналов представляется не
менее важной задачей.
Каналы Imin
Каналы Imin были исходно обнаружены в клетках карциномы A431.
Они схожи с каналами Icrac по своей малой проводимости:1-1,5pS для
двухвалентных ионов и чувствительностью к блокатору каналов Icrac SKF95365. Для
моновалентных ионов в отсутствии дивалентных ионов проводимость равна 10 пСм.
Среднее время открытого состояния канала — 9 мс.
Активируются в ответ на добавление во внеклеточный раствор агонистов PLC (UTP
или брадикинина), при добавлении во внутриклеточный раствор IP3 [Kiselyov и др.,
1997] или в ответ на опустошение депо. Также они могут быть напрямую активированы Nконцевым лиганд связывающим доменом рецептора IP3 в присутствии IP3. Кроме того
активация каналов инозитол три фосфатом в конфигурации inside out облегчалось в
присутствии антител к PIP2, что привело к предположению, о существовании комплекса
IP3R-PIP2-Imin [Kaznacheyeva и др., 2001].
Каналы обладают высокой избирательностью по отношению к кальцию, о чем
свидетельствует высокий экстраполированный потенциал реверсии каналов — +50 мВ
[Bugaj и др., 2005].
Вероятность открытия этих каналов повышалась при гиперполяризации выше -40
мВ во внешнем растворе бария [Kaznacheyeva и др., 2001]. В работе 2007 года было
показано, что нокдаун белка TRPC3 с помощью миРНК (малых интерферирующих РНК)
не приводит к исчезновению каналов Imin [Kaznacheyeva и др., 2007]. Нокдаун белка TRPC1
также не влиял на активность каналов Imin [Skopin и др., 2013].
Недавнее исследование показало, что эти каналы регулируются белком STIM2. В
пользу этого предположения говорят следующие факты. Во-первых каналы Imin работают в
качестве депо-управляемых каналов даже в клетках с подавлением экспрессии STIM1. Вовторых, активность каналов Imin увеличена в клетках со сверхэкспрессией STIM2. Втретьих, известно, что частичное опустошение кальциевого депо активирует
исключительно сенсор STIM2. Частичное опустошение кальциевого депо активирует Imin
31
каналы в клетках HEK293. Таким образом, число открытых каналов Imin коррелирует с
числом активных белков STIM2 [Shalygin и др., 2015].
Каналы Ins
Помимо описанных выше депо-управляемых каналов, в клетках HEK293
экспрессируются катионные каналы низкой селективности, активирующиеся в ответ на
опустошение депо. Эти каналы были названы INS. Они характеризуются следующими
характеристиками. Проводимость канала равна 5 пСм. Среднее время открытого
состояния — 6,6 мс. Потенциал реверсии равен -10 мВ [Bugaj и др., 2005] (Рис.14).
Известно, что белок TRPC3 регулирует активность каналов INS [Kaznacheyeva и др., 2007]).
Кроме того, в работе 2013 года Skopin с соавторами показали, что белок TRPC1 не входит
в состав каналов INS [Skopin и др., 2013].
Показано, что активность каналов Ins регулируется исключительно кальциевым
сенсором STIM1 [Shalygin и др. 2015].
Рис. 14. Вольт-амперная характеристика каналов INS
Каналы Imax
Каналы экспрессируются в клетках A431 (клетки карциномы человека). В клетках
HEK293 также зарегистрирована их активность [Bugaj и др., 2005].
Каналы обладают следующими характеристиками: экстраполированный потенциал
реверсии равен +30 мВ, проводимость для двухвалентных ионов 17 пСм. Проводимость
для моновалентных ионов — 33 пСм [Bugaj и др., 2005] (Рис.15). Наблюдалось два
времени открытого состояния каналов: 2,1 мс и 32 мс. В 2013 году Skopin с соавторами
показали, что в состав этих каналов входит белок TRPC1 [Skopin и др., 2013].
Белок TRPC3 не участвует в регуляции этих каналов [Kaznacheyeva и др., 2007].
Показано, что каналы Imax регулируются белками STIM1 и STIM2.
32
Рис. 15 Вольт-амперная характеристика каналов Imax в клетках HEK293:(по
материалам работы [Bugaj и др., 2005].
Постановка задачи
В живых системах сосуществуют разные типы депо-управляемых каналов, которые
отличаются по своим электрофизиологическим характеристикам от каналов Icrac. Регуляция
и молекулярный состав таких каналов малоизучены. Целью работы было изучить входят
ли белки ORAI1 в состав эндогенных каналов TRPC1 и осуществляют ли они регуляцию
эндогенных каналов TRPC1.
В качестве модельного объекта для изучения каналов, образованных белками TRPC
мы выбрали канал Imax клеток линии НЕК293, в состав поры которого входят белки TRPC1.
Для
решения
поставленных
задач
в
работе
проводилось
сравнение
электрофизиологических характеристик и механизмов регуляции каналов ORAI1 и
эндогенных каналов Imax, состоящих из белков TRPC1.
Методы и материалы
1. Работа с клеточными культурами
1.1 Ведение клеточной линии HEK293 (клетки почки эмбриона человека).
Клетки линии HEK293 из коллекции клеточных культур института Цитологии РАН
культивировали в жидкой среде DMEM (Среда Дульбекко, модифицированная Иглом) с
добавлением 10% эмбриональной сыворотки быка (FBS).
Для проведения экспериментов клетки выращивали на прямоугольных фрагментах
покровных стекол, размером приблизительно от 3 до 7 мм. Для удаления возможного
следов жира фрагменты стекол предварительно сутки выдерживались в одномолярном
растворе соляной кислоты и 96% этанола в соотношении 1:1. Затем были промыты три
раза в дистилированной воде, и два раза в растворе спирта. После этого стекла обжигались
в пламени спиртовки, опущены в чашки Петри диаметром 3 см и выдержаны в течении 1033
15 минут в 0,001% растворе L-полилизина (Sigma) — реагента, повышающего адгезию
клеток к поверхности стекол. Затем стекла были троекратно промыты дистилированной
водой и оставлены сушится на ночь.
Исходно клетки
были
заморожены
и
хранились
в
морозильной
камере
холодильника на -80C, в 80% растворе среды DMEM, 15% FBS и 5% растворе
криоконсерванта — DMSO.
Разморозку клеток проводили следующим образом: эппендорф с клетками быстро
размораживали в водяной бани нагретой до 37oC. Затем эппендорф центрифугировали 2
минуты при оборотах в 500g, сливали супернатант (криоконсервант), наливали в
эппендорф среду DMEM с добавлением 10% сыворотки тщательно пипетировали и
переносили на 6см чашку Петри. Первые 7-10 пассажей клетки не использовали в
экспериментах, просто пересевая их на чашки диаметром 6 см. Плотность клеток при
пересеве составляла 60-90%.
Пересев клеток проводился следующим образом. Из чашек Петри сливали среду.
Затем клетки инкубировались в 1 мл раствора трипсина и версена в соотношении 2:1 в
течении 1-2 минуты при комнатной температуре. После этого раствор трипсин-версена
сливали, в чашку Петри добавляли 1 мл жидкой среды DMEM (Среды Дульбекко,
модифицированной Иглом) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки быка (FBS).
Клетки тщательно пипетировали. Затем переливали часть среды, с клетками в чашку
Петри, в которую была заранее налита стерильная среда, с добавлением FBS (2,5 мл на
чашку диаметром 3 см и 5 мл на чашку диаметром 6 см). Пересевали 1/5 часть от всех
клеток. Клетки росли в инкубаторе с 5 % содержанием CO2 и при 37oС.
Для контрольных экспериментов patch clamp, где не требовалась трансфекция,
клетки можно было использовать через 9-18 часов после пересева на чашки со стеклами.
1.2 Липосомальная трансфекция клеток линии HEK293
Для проведения липосомальной трансфекции клетки рассевали на стекла за 9-16
часов до проведения трансфекции. Плотность клеток на чашке составляла от 30 до 50%.
Трансфекцию проводили при помощи липосомального трансфицирующего агента
lipofectamin (Sigma).
В одной микропробирке растворяли плазмиды в 100 мкл раствора DMEM без
добавления сыворотки в нужной концентрации (суммарный вес плазмиды не превышал
2мкг на чашку Петри диаметром 3 см). В другой микропробирке растворяли 5 мкл
унифектина в 100 мкл среды DMEM. Содержимое микропробирок встряхивали на
34
вортексе, после чего аккуратным пипетированием смешивали растворы в микропробирках
между собой. Полученную смесь выдерживали в течении 10 минут для образований
липосом с заключенной в них плазмидой. После этого раствор медленно по каплям
добавляли в чашку Петри с клетками
Клетки использовали в экспериментах через 9-15 часов после проведения
трансфекции.
1.3 Подавление экспрессии белков (РНК-интерференция):
В исследование мы использовали клеточную линию с постоянной трансфекцией
плазмиды, кодирующей малые РНК, образующие шпильки (small hairpin RNA – shRNA мшРНК).
Последовательность
STIM1
мшРНК
—
CTGAGCAGAGTCTGCA
TGACCTTCAGGAA (Origen).
Клеточная линия с подавлением экспрессии STIM1 была получена Глушанковой
Любовью Николаевной (ИНЦ РАН).
1.4 Получение клеточных лизатов
Клетки выращивались на чашках Петри диаметром 6 см. Для получения клеточных
лизатов клетки помещались на 10 минут на +4 oC. Затем клетки дважды отмывали натрийфосфатным буфером (PBS) при 4oC, затем клетки помещали на 10 минут в лизирующий
раствор, содержащий 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA,
1% тритон X-100 (Sigma, США), 0.5% NP40, 10% глицерин, 0,5 мМ PMSF, с добавлением
коктейля ингибиторов протеаз PIC. После этого клетки отбирали в эппендорф и
центрифугировали 30 минут при 4oC, 15000rpm. Затем отбирали супернатант и добавляли
к нему голубой загрузочный буфер 400mM β-MeEtOH, 4% SDS, 0.1% Bromphenol blue,
40% Glycerol, 200мM Трис-HCl pH 6,8.), в конечном объемном соотношении
25%.Полученный
раствор
инкубировали
5
минут
при
100 oC,
охлаждали,
центрифугировали 5 минут при 15000 rpm и хранили в холодильнике на +4oC.
2. Белковый электрофорез в ПААГ и иммуноанализ экспрессии белков
Белки, разделяли в 10% полиакриламидном геле (PAAG) в денатурирующих
условиях. Сначала между стекол камеры заливали разделяющий гель (10% раствор
бисакриламида и акриламида (1:29), 0.1% SDS, 0.1% APS, 375 мМ Tris-HCl (pH=6.8),
0.01%
TEMED).
После
полимеризации
35
сверху
разделяющего
геля
наливали
концентрирующий гель (5% раствора акриламида и бис-акриламида (1:29), 0.1% SDS,
0.1% APS, 0.01% TEMED, 133 мM Трис-HCl, рН 6.8).
Пробы наносили в лунки концентрирующего геля. Белки разделялись в
концентрирующем геле при силе тока равной 25 мА, в разделяющий геле при 50 мА.
После электрофоретического разделения проводили полусухой перенос белка из
геля на нитроцеллюлозную мембрану. Для этого нитроцеллюлозную мембрану смачивали
буфером для переноса (47.9 мM Трис, 38.6 мM глицина, 0.0385% SDS, 20% метанол),
опускали под гель. С обеих сторон от геля и мембраны прокладовали листы
хроматографической бумаги (BioRad, США). Перенос осуществлялся 50 минут при силе
2
тока 0.8 мА/см .
Вслед за переносом мембрану 4-6 раз по 5 минут отмывали буфером TBST (0.1%
Tween, 10 мМ Tрис, 150 мМ NaCl, pH=7.6). Затем мембрану инкубировали в течении 1
часа при комнатной температуре в 5% обезжиренном молоке для исключения возможности
неспецифического связывания антител. После этого мембрану промывали в TBST 6 раз по
5 минут, и наносили моноклональные первичные антитела против белка STIM1 (BD
Bioscience 1:250) или моноклональные антитела против альфа тубулина (Sigma 1:5000).
Инкубировали мембрану в растворе антител 1 часа. После этого проводили шестикратную
отмывку мембрану по 5 мин в TBST. Затем на один час добавляли соответствующие
вторичные антитела (Sigma), разведенные в растворе 5% обезжиренного молока.
Для проявке антител белков использовали реагент усиления люминиесценции ECL
— SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate. Выдержав мембрану в
реагенте в течении 1 минуты, к мембране прикладывали фотопленку. Проявляли бенды
белков в растворе проявителя, после чего отмывали пленку в дистилляте и опускали в
раствор фиксажа, для закрепления изображения.
3. Метод локальной фиксации потенциала
Для регистрации активности ионных каналов мы использовали метод локальной
фиксации потенциала — регистрацию изменений потенциала и токов на мембране клетки
через контакт между микроэлектродом и мембраной клетки, имеющим высокое
сопротивление. Метод позволяет контролировать разницу потенциала на мембране клетки
[Hille 1992].
36
Получение стеклянных микроэлектродов осуществлялось при помощью микро
кузницы Sutter P97. Использовали тонкие трубочки из боросиликатного стекла
(внутренний d = 0,86 мм, внешний: 1,5 мм) со стеклянным филаментом внутри. Трубочки
плавились металлической спиралью, нагретой электрическим током, и растягивались в
разные стороны. Вытягивание осуществляется в несколько этапов, что позволяет получить
требуемую форму кончика пипетка и диаметр ее отверстия. На одном из этапов трубочка
утоньшалась и рвалась. Сопротивление у полученных электродов могло варьировать в
диапазоне от 6 до 10 мОм.
После получения стеклянных микроэлектродов кончик электрода покрывали
силгардом (Dow Corning, США) — силиконовой резиной, застывающей при нагреве.
Служит для повышения изоляции микроэлектрода и уменьшения паразитных шумов.
Для получения плотных контактов использовали установка, состоящую из:
Микроскопа. Для выбора клетки и подведения микропипетки используется
инвертированный
микроскоп
проходящего
света
Axiovert.
Микроскоп
оснащен
осветительной лампой. Расположен на антивибрационной подушке.
Усилителя. Токи регистрировались с помощью усилителя Axopatch 200B,
который состоит из предварительного
усилителя,
усилителя
и преобразователя
ток/потенциал.
Персонального компьютера для регистрации сигналов и устройством ЦАП-
Камеры для клеток. Стеклянная камера. Дно состояла из покровного стекла.
АЦП.
Камера заполнена внеклеточным раствором (который подробнее описан ниже по тексту). В
нее опускается стекло с клетками.
Отсасывающего устройства, представляющего собой бутыль, соединенную с
одной стороны с насосом, отводящим жидкость, а с другой — с камерой. Она отсасывает
лишнюю жидкость из камеры. Если требуется сменить раствор — в камеру подается
другой раствор объемом в пять и более раз превышающий объем камеры. Таким образом,
старый раствор полностью замещается на новый.
Держателя стеклянной микропипетки. С помощью него пипетка с
электродом подсоединяется к предварительному усилителю, закрепленному на
микроманипуляторе.
Микроманипулятора, позволяющего двигать микроэлектрод в 3ех
плоскостях (x,y,z).
37
Тройника из трубок с выходом на U образный манометр, микроэлектрод и
исследователя. Тройник позволяет менять давление в микропипетке.
Двух электродов: сравнения (относительно которого снимаются показания
(находится в 140 мМ растворе KCl) и внутриклеточного хлорированного серебряного
микроэлектрода из AgCl. Камеру для клеток и емкость, в которой находится электрод
сравнения, соединяет агарозный мостик с раствором 140 мМ КCl.
Получение плотного контакта осуществлялось согласно следующей методике:
На электрод подавалось небольшое положительное давление (А). При касании
стеклянной пипеткой (микроэлектродом) мембраны клетки следовал резкий сброс
давления и изменение его на отрицательное. При этом мембрана клетки могла схлопнуться
с отверстием микропипетки — наблюдался быстрый рост сопротивления контакта между
клеткой и электродом (Рис.16). Если сопротивление вырастало выше 20 ГОм мы
проводили запись эксперимента в конфигурации cell attached.
В случае применения конфигурации inside out, после формирования гигаомного
контакта мы резко отводили микроэлектрод от клетки. В результате вместе с
микроэлектродом
отрывался
участок
плазматической
мембраны,
на
котором
производилась регистрация активности одиночных каналов. Особенностью данной
конфигурации является возможность контроля содержимого внутриклеточного раствора.
Конфигурация сell attached
Конфигурация inside out
Рис. 16 Схема получения конфигураций cell attached и inside out (По материалам
методического пособия Дембицкая и др. 2012).
4. Используемое программное обеспечение
Анализ данных полученных методом локальной фиксации потенциала проводился
при помощи программного обеспечения pClamp10. Все графики были построены в
программном обеспечении Origin. Обработка данных полученных Western blot анализа
проводилась в программном обеспечении ImageJ.
38
Результаты и обсуждение.
Существуют разные гипотезы объясняющие взаимодействие каналов ORAI и
TRPC. В одних работах показано, что каналы ORAI и TRPC работают независимо друг от
друга [DeHaven и др. 2009], в других, что каналы TRPC являются гетеромером белков
ORAI и TRPC [Liao и др 2008], в третьих, что активация каналов TRPC происходит через
белки ORAI, в четвертых, что каналы TRPC напрямую активируются сенсором STIM
[Asanov и др. 2015].
Целью нашей работы было выяснить работают ли эндогенные каналы TRPC в
форме гетеромера белков ORAI/TRPC и регулируется ли эндогенные каналы TRPC
белками ORAI?
В качестве модельного объекта изучения депо-управляемых каналов TRPC мы
использовали каналы Imax. Известно, что каналы Imax активируются в ответ на опустошение
кальциевого депо, и что в состав поры канала входит белок TRPC1 [Skopin и др. 2013].
Для изучения вопроса входит ли белок ORAI в пору канала TRPC Imax мы
использовали клетки HEK293, со сверхэкспрессией доминантно-негативных мутантов
ORAI. Это белки, несущие аминокислотную замену в поре канала: глутамат заменен на
глутамин. В результате кальций не может связаться с каналом. Встраиваясь в пору
эндогенных каналов такие белки ингибируют их активность.
Сверхэкспрессия доминантно-негативных мутантов ORAI не ингибирует
активность каналов Imax.
Регистрировали активность депо-управляемых каналов в клетках линии HEK293
при помощи метода локальной фиксации потенциала в конфигурации cell attached.
Клетки для опыта трансфицировали плазмидой, кодирующей последовательности
доминантно-негативных мутантов ORAI1 E106Q. Плазмиды были любезно предоставлены
лабораторией Trevor Shuttleworth. Для контроля эффективности трансфекции клетки,
экспрессирующие доминантно негативных мутантов ORAI1 E106Q, котрансфицировали
плазмидой, кодирующей белок GFP, в соотношении 1:3.
Контрольные клетки трансфицировались плазмидой, кодирующей белок GFP.
Через 9-16 часов после трансфекции приступали к электрофизиологическим измерениям
активности каналов.
В качестве внутриклеточного раствора использовали 105 мМ водный раствор
хлорида бария с добавлением 10 мМ буфера TrisCl. До получения гигаомного контакта
клетки находились в растворе натрия, изотоничном внутреклеточной среде. Его состав:
39
140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2 и 10 мМ буфер TrisCl. После получения
гигаомного контакта с сопротивлением 20-40 гОм, наружный раствор замещался на
деполяризующий раствор с высокой концентрацией калия, содержащий 135 мМ KCl, 5 мМ
NaCl, 1 мМ Mg Cl2, 2 мМ CaCl2 и 10 мМ TrisCl. Данный раствор обнуляет потенциал на
мембране клетки.
Растворы титровали водным раствором соляной кислоты до значения pH = 7.2-7.3.
Осмолярность растворов, в которые были погружены клетки, была равна 280-290 мОсм/кг.
Осмолярность раствора, которым заполняли электрод, была равна 300-310 мОсм/кг.
После получения гигаомного контакта производилась запись базальной активности
каналов в течении двух-трех минут. Затем в камеру добавляли 1 мкМ раствора
тапсигаргина,
разведенного
в
DMSO.
После
чего
регистрировали
активность
индуцированных ионных каналов на разных потенциалах в диапазоне от -100 до +100 мв.
Спустя 2-3 минуты регистрации активности ионных каналов в камеру добавляли
100 мкМ водного раствора UTP — активатора каскада PLC, и также записывали
активность депо-управляемых каналов на потенциалах от -100 до +100 мв.
В контрольных клетках в ответ на добавление тапсигаргина мы наблюдали
активность каналов Imax в 23% случаев (n = 7/30). После добавления раствора UTP
активность каналов была зарегистрирована в 57% экспериментов (n = 17/30).
Рис. 17 Фрагменты записи экспериментов в конфигурации cell attached,
проведенные на контрольных клетках и на клетках, экспрессирующих доминантнонегативных мутантов ORAI.
40
В клетках со сверхэкспрессией доминантно-негативных белков мы не наблюдали
активность каналов Imax, развиваемую в ответ на добавление тапсигаргина, однако, в 20%
экспериментов мы зарегистрировали спонтанную активность каналов Imax, вызванную в
ответ на UTP (n = 5/25) (Рис.16).
Тапсигаргин — это ингибитор кальциевой помпы эндоплазматического ретикулума.
В результате действия тапсигаргина кальций пассивным транспортом по градиенту
концентрации вытекает из депо. Тот факт, что мы не видели активацию каналов Imax в ответ
на применение тапсигаргина в клетках с неактивными белками ORAI означает, что каналы
Imax могут работать, в качестве депо-управляемых каналов, только в клетках с активными
белками ORAI. Причем белки ORAI не входят в пору канала. В противном случае мы не
увидели бы активности каналов Imax в ответ на добавление UTP.
Селективность каналов Imax не зависит от уровня экспрессии белка STIM.
Кальциевый сенсор STIM является основным активатором депо-управляемых
каналов. У млекопитающих экспрессируются два белка семейства STIM, отличающиеся
своей чувствительностью к кальцию. STIM1 реагирует на большое изменение
концентрации кальция в депо, STIM2 – на малое.
Также, известно, что каналы ORAI обладают необычным свойством: при
повышении уровня экспрессии сенсора STIM, возрастает селективность канала.
Селективность можно оценить зная потенциал реверсии, это такой потенциал, при
котором ток через канал не течет. Грубо говоря, чем выше по модулю значение потенциала
реверсии, тем более селективен данный канал.
Для каналов ORAI показано, что повышение уровня экспрессии белка STIM в два
раза ведет почти к двукратному увеличению потенциала реверсии (McNally и др. 2012).
Для того, чтобы исследовать влияние STIM на активность каналов Imax были
поставлены эксперименты, которые позволили сравнить характеристики каналов I max в
клетках с разным количеством активных белков STIM. Так в клетках дикого типа
добавление тапсигаргина в концентрации 1 мкМ приводит к сильной активации в
основном белков STIM1. Эти результаты сравнивали с данными, полученными на клетках,
в которых была подавленна экспрессия белков STIM1. Для белков STIM2 сравнивали
клетки с оверэкспрессией STIM2 и клетки, где частичным опустошением депо селективно
активировали эндогенные белки STIM2.
Для экспериментов с подавлением экспрессии гена STIM1, использовалась
клеточная линия со стабильной трансфекцией миРНК, направленной против гена STIM1.
41
Для экспериментов
в
сверхэкспрессией
STIM2 использовалась
временная
котрансфекция клеток плазмидами, кодирующими STIM2 и зеленый флуоресцентный
белок.
Для проверки успеха подавления экспрессии белка STIM1 мы разделили в
полиакриламидном геле лизаты клеток с нокдауном по белку STIM1. Лизаты были
собраны с чашки Петри диаметром 6см. Средняя плотность клеток на чашку составляла
70-80%. С одной чашки были получены 40 мкл клеточных лизатов.
На первую дорожку нанесли лизаты клеток HEK293, с подавлением STIM1,
объемом 10 мкл. На вторую дорожку мы нанесли контрольные лизаты клеток HEK293,
также объемом 10 мкл. Выравнивание белковых бендов проводили по тубулину.
В контрольных пробах концентрация белка STIM1 значительно выше, чем в опыте
(рис. 18).
Рис.18 Иммуноанализ подавления
экспрессии белка STIM1 и сверхэкпрессии белка STIM2.
Затем мы записывали эксперименты в конфигурации cell attached на контрольных
клетках линии HEK293, клетках с подавлением экспрессии STIM1 и со сверхэкспрессией
STIM2. В экспериментах, проведенных на контрольных клетках и клетках с подавлением
экспрессии STIM1, мы заполняли электрод раствором 50 мМ BaCl2 и 10 мМ TrisCl. В
экспериментах со сверхэкспрессией STIM2 мы заполняли электрод раствором 105 мМ
BaCl2 и 10 мМ TrisCl.
В экспериментах на контрольных клетках, клетках с подавлением STIM1 и
сверхэкспрессией STIM2 мы активировали депо-управляемые каналы добавлением 1 мкМ
Tg.
Кроме того мы провели серию экспериментов на контрольных клетках, где
активировали депо-управляемые каналы 10 нМ раствором Tg. Показано, что подача Tg в
данной концентрации ведет лишь к частичному опустошению кальциевого депо, в
результате активируется исключительно сенсор STIM2, а не STIM1 [Shalygin и др. 2015].
42
В каждой из серий было набрано порядка 15-20 экспериментов, в которых мы
измеряли активность каналов на потенциалах от -80 мВ до +30 мВ — для клеток с
подавлением экспрессии STIM1 и контрольных подавления экспрессии STIM1 клеток и от
-130 до +50 — для клеток с подавлением экспрессии STIM2 и контрольных для
сверхэкспрессии STIM2 клеток. На основании полученных данных в программе Origin 6.0
мы построили вольтамперные графики каналов Imax.
Каждая точка на графике является усредненным значением из трех экспериментов
амплитуды тока на определенном потенциале
Зная значение потенциала реверсии, рассчитали проницаемость каналов Imax в каждом из
четырех случаях для бария по отношению к калию.
Рис.19 Вольт-амперные характеристики каналов Imax, полученные на контрольных
клетках после добавления в раствор омывающий клетку 1мкМ Tg.
Рис.20 Вольт-амперные характеристики каналов Imax, полученные на клетках с
подавлением экспрессии STIM1. Активация 1мкМ Tg (черная кривая) или 100 мкМ UTP
(серая кривая).
43
Рис.21 Вольт-амперные характеристики каналов Imax, полученные на контрольных
клетках, активация 10нМ Tg (слева), на клетках со сверхэкспрессией STIM2. Активация
1мкМ Tg (справа).
Проницаемость каналов Imax для бария по отношению к калию рассчитывалась по
уравнению Ходжкина-Хаксли:
P[Ba/K] = [Kin]/4[Baout]exp(ErevF/RT)[exp(ErevF/RT + 1],
где [Kin] — внутриклеточная концентрация калия (140 мМоль); [Baout] —
концентрация бария внутриэлектрода (105 мМ или 50 мМ),
Erev — потенциал реверсии канала Imax.
RT/F = 25мВ для экспериментов, выполненных при комнатной температуре.
Полученные данные служат дополнительным доказательством того, что белки
ORAI не входят в пору эндогенного канала Imax , содержащего белки TRPC1.
Развитие активности каналов Imax, индуцированное белком STIM2 происходит
медленнее, чем активация каналов белком STIM1.
Регистрировали активность каналов методом локальной фиксации потенциала в
конфигурации cell attached в клетках с подавлением экспрессии STIM1 и в контрольных
клетках. Электрод был заполнен раствором 105 мМ BaCl2 и 10 мМ TrisCl. До получения
гигаомного контакта между электродом и клеткой в камере находился изотоничный
раствор натрия (пропись смотри выше). После получения гигаомного контакта раствор
заменяли на деполяризующий раствор калия (пропись смотри выше).
Депо-управляемые
каналы
активировали
добавлением
к
клеткам
1мкМ
тапсигаргина. В экспериментах, проведенных на клетках с подавлением экспрессии белка
STIM1, активация каналов Imax наступала через 2-3 минуты, то есть с большей задержкой,
44
чем в случае активации в контрольных клетках (рис.22) что согласуется с данными
полученными на каналах ORAI, для которых активация STIM2 также происходит с
задержкой [Zhou и др. 2009]. В наших опытах аналогичные результаты были получены
при активации каналов Imax эндогенными белками STIM2 при частичном опустошении
депо.
Эти данные служат подтверждением гипотезы о том, что каналы TRPC
активируются вслед за каналами ORAI.
Рис.22
Фрагмент
записей
экспериментов
в
конфигурации
cell
attached,
выполненные на контрольных клетках и клетках с подавлением экспрессии STIM1.
Зависимость активности каналов Imax от потенциала на плазматической
мембране различается в растворах кальция и бария.
Вероятность открытого состояния каналов ORAI в разных проводящих растворах
зависит от потенциала. В барии каналы открываются с наибольшей частотой при
гиперполяризации мембраны (при отрицательных потенциалах), в кальции — при
положительных потенциалах.
Мы решили сравнить активность каналов Imax, содержащих белки TRPC1, в
растворах кальция и бария.
Для изучения активности каналов Imax в растворе бария мы работали в
конфигурации cell attached. Внутри микропипетки (электрода) был раствор бария: 105 мМ
BaCl2, 10 мМ Tris Cl (pH = 7.2 – 7.3), осмолярность 280-290 мОсм/кг. Клетки находились в
изотоническом растворе 140 NaCl2. После получения плотного гигаомного контакта
раствор замещали на деполяризующий мембрану раствор калия, 1-2 минуты записывали
45
базальную активность ионных каналов, после чего подавали активатор депо-управляемого
входа 1 мкM Tg и регистрировали активность каналов на потенциалах в диапазоне от -90
до +70 мВ.
Максимальная частота встречаемости каналов Imax достигалась при потенциалах
ниже -40 мВ. В то время, как на положительных потенциалах, выше 0 мВ, активность
каналов Imax практически отсутствовала (см. рис. 23).
Для изучения активности каналов Imax мы заполняли электрод раствором кальция:
105 мМ CaCl2, 10 мМ Tris Cl (pH = 7.2 – 7.3), осмолярность 280-290 мОсм/кг. Изначально
мы работали в конфигурации cell attached. Однако, ни в одном из записанных
экспериментов мы не видели активности каналов Imax в ответ на добавление 1 мкм Tg. Мы
предположили, что это связано с быстрой кальциевой инактивацией каналов.
Для того, чтобы точнее контролировать внутриклеточную концентрацию кальция
мы стали записывать эксперименты в конфигурации Inside-out: после получения плотного
контакта исследователь отрывает от клетки участок мембраны, в области плотного
контакта между электродом и клеткой, что позволяет контролировать раствор, омывающий
внутриклеточную поверхность плазматической мембраны.
До получения гигаомного контакта клетки находились в растворе 140 натрия: 140
мМ NaCl; 4 мМ CsCl; 10 мМ CaCl 2; 2мМ MgCl2; 10 мМ Hepes. Раствор был титрован едким
натром до pH = 7.3 Внутри электрода находился кальциевый: 105 мМ CaCl2; 10 Tris Cl.
После получения гигаомного контакта с сопротивлением 20-40 гОм, резко отводили
микроэлектрод от мембраны клетки. В результате участок мембраны клетки отрывался,
внутреняя сторона мембраны оказывался в растворе 140 натрия, наружная поверхность
мембраны — в растворе 105 мМ кальция.
Затем раствор в камере заменялся на раствор pCa2+ 7 (130 Cs: 130 мМ Cs- глутамат;
5 мМ CaCl2; 5мМ MgCl2; 1мМ MgATP; 10 мМ EGTA; 10 мМ Hepes). Значение pH было
доведено при помощи NaOH до 7.2. Расчетное содержание свободного кальция в растворе
было порядка 100 нм (расчеты производились в программе Max Chelator). Регистрировали
базальную активность депо-управляемых каналов в течении одной-двух минут, после чего
добавляли в камеру 2,5 мкМ водного раствора IP3. И регистрировали активность депоуправляемых каналов, развиваемую в ответ на IP3, на потенциалах от -100 мВ до +100 мВ.
Как оказалось, максимальная вероятность открытого состояния каналов Imax в
кальциевом растворе наблюдалась при положительных потенциалах.
46
Рис. 23 Фрагменты записей экспериментов в конфигурации inside-out. Сверху
представлены фрагменты записей экспериментов в конфигурации cell attached в растворе
бария. Снизу представлены фрагменты записей экспериментов в конфигурации inside out в
растворе кальция. Для наглядности выбраны участки экспериментов с максимальной
частотой открытия каналов Imax.
Таким образом, активность каналов Imax в кальциевом растворе возрастает при
деполяризации мембраны и положительных потенциалах, тогда как в бариевом растворе
активность каналов увеличивается, наоборот, при отрицательных потенциалах.
Обсуждение
Отличительной
взаимодействия
чертой
каналов
данной
ORAI
и
работы
TRPC
является,
использовались
то,
что
для
методы,
изучения
позволяющие
регистрировать одиночные каналы, поскольку за исключением одной-двух публикаций
исследователи используют только методики, отражающие суммарный вход кальция в
клетку, что не позволяет различать разные типы депо-управляемых каналов.
Полученные нами данные позволяют сделать выводы о молекулярном составе
эндогенных каналов Imax , состоящих из белков TRPC1, и о механизме регуляции данных
каналов.
В проведенных нами экспериментах мы не наблюдали активацию каналов Imax в
клетках со сверхэкспрессией доминантно-негативных мутантов ORAI1E106Q, в ответ на
тапсигаргин, в то время, как в ряде экспериментов мы регистрировали активность каналов
47
Imax в ответ на добавление UTP (рис.17). Данные результаты можно объяснить со
следующей точки зрения. Известно, что каналы TRPC могут работать независимо от
состояния депо. В таком случае они могут быть активированы некоторыми малыми
молекулами напрямую (Asanov и др. 2015). Можно предположить, что активация каналов
Imax в клетках, экспрессирующих доминантно-негативных мутантов ORAI, в ответ на UTP
не была связана с выходом кальция из депо, а происходила в ответ на индукцию каскада
PLC.
Таким образом, исходя из этих данных мы предположили, что, во-первых, белок
ORAI1 не входит в пору эндогенных каналов TRPC1 - Imax этот же вывод получается из
опытов по влиянию количества белков STIM на селективность каналов Imax, во-вторых
белки ORAI необходимы для поддержания чувствительности каналов TRPC к
опустошению депо. После опустошения кальциевого депо активация каналов TRPC
происходит вслед за активацией каналов ORAI, что согласуется с результатами группы
Ambudkar.
Тот факт, что селективность каналов TRPC не менялась при изменении уровня
экспрессии сенсора STIM (рис. 19-21) еще не означает, что активность каналов TRPC не
регулируется напрямую сенсором STIM. Тем не менее, в недавней работе было показано,
что у каналов TRPC селективность и активация также связаны [Lichtenegger и др. 2013]. К
тому же принимая во внимание, тот факт, что сверхэкспрессия доминантно-негативных
мутантов ORAI отменяла активацию каналов TRPC, можно с большей долей уверенности
считать, что каналы Imax активируются сенсорами STIM не напрямую, а посредством
каналов ORAI.
В большинстве экспериментов активация каналов Imax кальциевым сенсором STIM2
происходила с задержкой на 3 и более минуты (рис.22), что согласуется с данными
полученными на каналах ORAI [Zhou и др. 2009], для которых активация STIM2 также
происходит с задержкой. Эти данные служат подтверждением гипотезы о том, что каналы
TRPC активируются вслед за каналами ORAI.
Поскольку зависимость вероятности открытого состояния от потенциала в
растворах кальция и бария похожи для каналов TRPC и ORAI (рис.23), то можно
предположить, что активация каналов TRPC и каналами ORAI сопряжены.
Учитывая схожесть регуляции каналов ORAI и ТRPC1, и то, что доминантно
негативный мутант ORAI отменял активацию при опустошении депо, отсутствие
корреляции между селективностью каналов TRPC и уровнем экспрессии сенсора
48
STIM(рис.19-21) можно предположить, что каналы Imax активируются вслед за включением
каналов ORAI и не могут быть напрямую активированы кальциевыми сенсорами STIM.
Тем самым, наше исследование подтверждает описанные выше исследования
группы Ambudkar и противоречат другим теориям, объясняющим взаимодействия между
белками ORAI и TRPC.
Наши данные однозначно показывают, что белки ORAI не входят в пору
эндогенного канала Imax. Результаты работы Laou et.al, о том, что белки ORAI и TRPC
образуют гетеромерные каналы можно трактовать по разному.
Тот факт, что для активации каналов TRPC необходимо присутствие в клетке не
только кальциевого сенсора STIM, но и ORAI, может означать, что каналы TRPC только
регулируются каналами ORAI, а не являются гетеромером ORAI-TRPC.
Можно предположить, что некоторые депо-управляемые каналы TRPC могут
регулироваться напрямую кальциевыми сенсорами STIM, а некоторые только через белки
ORAI.
Как уже было описано выше, трактовка работы DeHaven, о том, что белки ORAI и
TRPC не могут взаимодействовать осложняется чрезвычайной сложностью процессов
происходящих при сборке депо-управляемых комплексов. Отсутствие колокализации в
липидных рафтах STIM и TRPC может объясняться способностью каналов TRPC покидать
и входить в липидные рафты [Alicia и др., 2008], выход STIM1 из липидных рафтов после
образования депо-управляемых комплексов [Pacheco, Ramírez-jarquín, Vaca, 2016].
То, что сверхэкспрессия STIM1 не меняла свойства депо независимых каналов
TRPC может объясняться фактом, что STIM регулирует исключительно активность депоуправляемых каналов TRPC.
Кроме того, нельзя исключать вероятность, что в разных клетках экспрессируются
различные изоформы альтернативного сплайсинга белков TRPC. Возможно лишь
некоторые изоформы белков TRPC могут быть активированы кальциевыми сенсорами
STIM
Результаты наших исследований показывают сходства в регуляции и отличия в
структуре поры между каналами TRPC и ORAI.
Суммируя все вышесказанное, наши данные указывают, на то что белок ORAI не
входит в пору эндогенного канала Imax, состоящего из белков TRPC, но необходим для
поддержания чувствительности каналов к состоянию депо. Эндогенные каналы,
состоящие из белков TRPC1, активируются вслед за каналами ORAI при опустошении
депо.
49
Выводы
1) В клетках линии HEK293 с сверхэкспрессией мутантного белка ORAI1
E106Q депо-управляемые каналы Imax, включающие в свой состав белки TRPC1, не
активируются при опустошении депо тапсигаргином, однако проводящая пора
каналов Imax не менялась, поскольку каналы можно было активировать агонистом.
2) Селективность каналов Imax не зависит от уровня экспрессии белка STIM, в
отличие от каналов ORAI.
3) Развитие активности каналов Imax, индуцированное белком STIM2
происходит медленнее, чем активация каналов белком STIM1, что сходно с
регуляцией каналов ORAI белками STIM.
4) Зависимость вероятности открытого состояния каналов Imax от
потенциала противоположна для растворов, где носителем является барий или
кальций, что аналогично характеристикам каналов ORAI в идентичных условиях.
5) Таким образом, белок ORAI не входит в пору эндогенного канала Imax. Можно
предположить, что активация каналов ORAI необходима для чувствительности
каналов Imax к опустошению депо.
50
Список используемой литературы
1. Alicia S., Angelica Z., Carlos S., Alfonso S., Vaca L,. STIM1 converts TRPC1 from a
receptor-operated to a store-operated channel: Moving TRPC1 in and out of lipid rafts // Cell
Calcium. 2008. Т. 44. № 5. С. 479–491.
2. Antigny F., .Koenig S., Bernheim L., Freiden M., During post-natal human
myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca2+ entry // J. Cell
Sci. 2013. Т. 126. № 11. С. 2525–2533.
3. Asanov A., Alicia S., Moreno C., Pacheco J., Salgado A., Sherry R., Vaca L.,
Combined single channel and single molecule detection identifies subunit cofile:// Cell Calcium.
2015. Т. 57. № 1. С. 1–13.
4. Berna-Erro A., Braun A., Kraft R., Kleinschnitz C., Schuhmann M.K., Stegner, D.,
Wultsch, Eilers, J., Eilers, J., Meuth, S. G., Stoll, G., Nieswandt, B.// STIM2 Regulates
Capacitive Ca2+ Entry in Neurons and Plays a Key Role in Hypoxic Neuronal Cell Death // Sci.
Signal. 2009. Т. 2. № 93. С. ra67-ra67.
5. Brandman O., Liou, J., Park, W.S., Meyer T// STIM2 is a feedback regulator that
stabilize basal cytosolic and endoplasmic reticulum Ca2+ levels // Cell. 2009. Т. 131. № 7. С.
1327–1339.
6. Bugaj V. и Bugaj, V., Alexeenko V., Zubov, A, Glushankova, L, Nikolaev
A., Wang, Z., Kaznacheyeva, E.V.., Bezprozvanny, I., Mozkayeva, G. N.// Functional properties
of endogenous receptor- and store-operated calcium influx channels in HEK293 cells // J. Biol.
Chem. 2005. Т. 280. № 17. С. 16790–16797.
7. Chang C.L., Hsieh T.S., Yang T., Rothberg K.G., Karen G., Liou G// Feedback
regulation of receptor-induced ca2+ signaling mediated by e-syt1 and nir2 at endoplasmic
reticulum-plasma membrane junctions // Cell Rep. 2013. Т. 5. № 3. С. 813–825.
8. Cheng K.T., Liu, X., Ong, H.L., Swaim, W., Ambudkar, Indu S.// Local Ca2+ entry via
Orai1 regulates plasma membrane recruitment of TRPC1 and controls cytosolic Ca2+ signals
required for specific cell functions // PLoS Biol. 2011. Т. 9. № 3. С. 26–34.
9. Cheng K.T. Ling Ong, H, Liu, X., Ambudkar, Indu S. Contribution and Regulation of
TRPC Channels in Store- Operated Ca2+ Entry // Curr. Top. Membr. 2013. Т. 71. С. 149–179.
10. Darbellay B. Arnaudeau, S., Bader, C. R. Konig, S.,Bernheim, L. STIM1L is a new
actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca 2+ release // J. Cell Biol. 2011. Т. 194.
№ 2. С. 335–346.
51
11. Dehaven W.I.Jones, B. F Petranka, J. G.,Smyth, J. T., Tomita, T., Bird, G. S., Putney, J
W. TRPC channels function independently of STIM1 and Orai1 // J Physiol. 2009. Т. 58710. С.
2275–2298.
12. Dietrich A., Fahlbusch M., Gudermann T. Classical transient receptor potential 1
(TRPC1): Channel or Channel regulator? // Cells. 2014. № 3. С. 940–962.
13. Feske S. Gwack, Y., Prakriya, M., Srikanth, S., Puppel, S. H., Tanasa, B., Hogan, P.
G., Lewis, R. S., Daly, M., Rao, A., A mutation in Orai1 causes immune deficiency by
abrogating CRAC channel function. // Nature. 2006. Т. 441. № 7090. С. 179–185.
14. Feske S. Immunodeficiency due to defects in store-operated calcium entry // Ann. N.
Y. Acad. Sci. 2011. Т. 1238. № 1. С. 74–90.
15. Giordano F., Saheki Y., Idevall-Hagren O., Colombo S., Pirrucello M., Milosevic I.,
Gracheva E., Bagriantsev S., Borgese N. C.P. NIH Public Access // Cell. 2013. Т. 153. № 7. С.
1494–1509.
16. Grigoriev I. Gouveia, S., Vaart, B., Demmers, J., Smyth, J.T., Honnappa, S., Splinter,
D., Steinmetz, M. O., James, W., Jr, Putney., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A., STIM1 is a
microtubule plus end tracking protein involved in remodeling of the endoplasmic reticulum //
Curr. Biol. 2008. Т. 18. № 3. С. 177–182.
17. Gwack Y. и др. Hair Loss and Defective T- and B-Cell Function in Mice Lacking
ORAI1 ᰔ † // 2008. Т. 28. № 17. С. 5209–5222.
18. Hogan P.G. The STIM1-ORAI1 microdomain // Cell Calcium. 2015. Т. 58. № 4. С.
357–367.
19. Hooper, J. S., Hadley, S. H., Mathews, A., and Taylor-Clark, T. E. (2013) Store-operated
calcium entry in vagal sensory nerves is independent of Orai channels. // Brain Res. 1503, 7–15.
20. Hoover P.J., Lewis R.S. Stoichiometric requirements for trapping and gating of Ca2+
release-activated Ca2+ (CRAC) channels by stromal interaction molecule 1 (STIM1) // Proc.
Natl. Acad. Sci. 2011. Т. 108. № 32. С. 13299–13304.
21. Hoppe U.C. Mitochondrial calcium channels // FEBS Lett. 2010. Т. 584. № 10. С.
1975–1981.
22. Hou X., Pedi, L., Diver, M. M., Long, S. B.// Crystal structure of the calcium releaseactivated calcium channel Orai // Science (80-. ). 2012. Т. 29. № 6. С. 997–1003.
23. Huang G.N., Zeng, W., Kim, J.Y., Yuan, J P., Han, L., Muallem, S., Worley, P F.,
STIM1 carboxyl-terminus activates native SOC, Icrac and TRPC1 channels // Nat. Cell Biol.
2006. Т. 8. № 9. С. 1003–1010.
52
24. Jing J. Huang, G. N., Zeng, W., Kim, J.Y., Yuan, J. P., Han, L., Muallem, S., Worley, P
F., Proteomic mapping of ER-PM junctions identifies STIMATE as regulator of Ca2+ influx //
Nat Cell Biol. 2015. Т. 23. № 10. С. 1780–1789.
25. Kaznacheyeva E., Zubov, A., Gusev, K., Bezprozvanny, I., Mozhayeva, G N,
Activation of calcium entry in human carcinoma A431 cells by store depletion and
phospholipase C- dependent mechanisms converge on ICRAC-like calcium channels. // Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. Т. 98. № 1. С. 148–153.
26. Kaznacheyeva E., Glushankova, L., Bugaj, V., Zimina, O., Skopin, A., Alexeenko, V.,
Tsiokas, L., Bezprozvanny, I., Mozhayeva, G. N. Suppression of TRPC3 leads to disappearance
of store-operated channels and formation of a new type of store-independent channels in A431
cells // J. Biol. Chem. 2007. Т. 282. № 32. С. 23655–23662.
27. Kiselyov K.I., Mamin, A G., Semyonova, S. B., Mozhayeva, G. N. Low-conductance
high selective inositol(1,4,5)-trisphosphate activated Ca2+ channels in plasma membrane of
A431 carcinoma cells // FEBS Lett. 1997. Т. 407. № 3. С. 309–312.
28. Lee K. Yuan, J. P., Hong, J. H., Worley, P. F An Endoplasmic Reticulum/Plasma
Membrane Junction: STIM1/ Orai1/TRPCs // FEBS Lett. 2011. Т. 584. № 10. С. 2022–2027.
29. Li Z. Liu, L., Deng, Y., Ji, W., Du, W., Xu, P., Chen, L., Xu, T., Graded activation of
CRAC channel by binding of different numbers of STIM1 to Orai1 subunits // Cell Res. 2011. Т.
21. № 2. С. 305–315.
30. Liao Y. Erxleben, C., Abramowitz, J., Flockerzi, V., Zhu, M X., Armstrong, D. L.,
Birnbaumer, L., Functional interactions among Orai1, TRPCs, and STIM1 suggest a STIMregulated heteromeric Orai/TRPC model for 1. Liao Y, Erxleben C, Abramowitz J, et al.
Functional interactions among Orai1, TRPCs, and STIM1 suggest a STIM-regulated heteromeric
Orai/TRPC // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Т. 105. № 8. С. 2895–2900.
31. Liou J., Kim, M.,Heo, W.,Jones, J.T., Myers, J.W., James, E., Jr, Ferrell., Meyer, T.,
STIM Is a Ca2+ Sensor Essential for Ca2+-Store-DepletionTriggered Ca2+ Influx // Curr. Biol.
2005. Т. 15. № 13. С. 1235–1241.
32. McNally B., Somasundaram, A., Yamashita, M., Prakriya, M., Gated Regulation of
CRAC Channel Ion Selectivity by STIM1 // Biophys. J. 2012. Т. 102. № 3. С. 314a.
33. Mignen O., Thompson J.L., Shuttleworth T.J. Orai1 subunit stoichiometry of the
mammalian CRAC channel pore. // J. Physiol. 2008. Т. 586. № 2. С. 419–425.
34. Nilius B., Flockerzi V. Mammalian Transient Receptor Potential (TRP) Cation
Channels. Volume II // Handb. Exp. Pharmacol. 223. 2014. Т. 223. С. 1035–1054.
53
35. Oh-hora M., Rao A. Calcium signaling in lymphocytes Masatsugu // Curr Opin
Immunol. 2008. Т. 20. № 3. С. 250–258.
36. Ong E.C.,Nesin, V., Long, C., Bai, C., Guz, J., Ivanov, I., Abramowitz, J.,
Birnbaumer, L., Humphrey, M.B., Tsiokas, L., A TRPC1 protein-dependent pathway regulates
osteoclast formation and function // J. Biol. Chem. 2013. Т. 288. № 31. С. 22219–22232.
37. Ong H.L., Ambudkar I.S. Molecular determinants of TRPC1 regulation within ERPM junctions // Cell Calcium. 2015. Т. 58. № 4. С. 376–386.
38. Pacheco J., Ramírez-jarquín J.O., Vaca L. Calcium Entry Pathways in Non-excitable
Cells // 2016 а. Т. 898. С. 353–378.
39. Pacheco J. и др. OPEN A cholesterol-binding domain in STIM1 modulates STIM1Orai1 physical and functional interactions // 2016 б. № June. С. 1–16.
40. Parekh A.B., Putney J.W. Store-operated calcium channels. // Physiol. Rev. 2005. Т.
85. № 2. С. 757–810.
41. Penna A., Demuro, A., Yeromin, A. V..,Zhang, S. L.,Safrina, O., Parker, I., Cahalan,
M D., The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai
dimers // Nature. 2008. Т. 456. № 7218. С. 116–120.
42. Phelan K.D., Shwe, U.T., Abramowitz, J., Wu, H., Rhee, S. W., Howell, M D.,
Gottschall, P. E., Freichel, M., Flockerzi, V., Birnbaumer, L., Zheng, F, Canonical transient
receptor channel 5 (TRPC5) and TRPC1/4 contribute to seizure and excitotoxicity by distinct
cellular mechanisms. // Mol. Pharmacol. 2013. Т. 83. № 2. С. 429–38.
43. Prakriya M., Feske, S., Gwack, Y., Srikanth, S., Rao, A., Hogan, P. G., Orai1 is an
essential pore subunit of the CRAC channel // Nature. 2006. Т. 443. № 7108. С. 230–233.
44. Prakriya M. Store-Operated Orai Channels: Structure and Function // Curr. Top.
Membr. 2013. Т. 71. С. 1–32.
45. Quintana A., Rajanikanth, V., Farber-Katz, S., Gudlur, A., Zhang, C.,Jing, J., Zhou, Y.,
Rao, A.,
Hogan, P. TMEM110 regulates the maintenance and remodeling of mammalian ER–plasma
membrane junctions competent for STIM–ORAI signaling // Proc. Natl. Acad. Sci. 2015. С.
201521924.
46. Roos J. DiGregorio, P., Yeromin, A. V., Ohlsen, K.,Lioudyno, M., Zhang, S., Safrina,
O. Kozak, J. A., Wagner, S. L., Cahalan, M. D., Veliçelebi, G., Stauderman, K., STIM1, an
essential and conserved component of store-operated Ca 2+ channel function // J. Cell Biol.
2005. Т. 169. № 3. С. 435–445.
54
47. Ryazantseva M., Skobeleva K., Kaznacheyeva E. Familial Alzheimer’s disease-linked
presenilin-1 mutation M146V affects store-operated calcium entry: Does gain look like loss? //
Biochimie. 2013. Т. 95. № 7. С. 1506–1509.
48. Saüc S. Bulla, M., Nunes, P., Orci, L., Marchetti, A., Antigny, F., Bernheim, L.,
Cosson, P., Frieden, M., Demaurex, N., STIM1L traps and gates Orai1 channels without
remodeling the cortical ER. // J. Cell Sci. 2015. Т. 128. № 8. С. 1568–79.
49. Saul S. Stanisz, Hedwig B, C., Schwarz, E., Hoth, M., How ORAI and TRP channels
interfere with each other: Interaction models and examples from the immune system and the skin
// Eur. J. Pharmacol. 2014. Т. 739. № C. С. 49–59.
50. Scrimgeour N., Litjens, T., Ma, L., Barritt, G J., Rychkov, G Y, . Properties of Orai1
mediated store-operated current depend on the expression levels of STIM1 and Orai1 proteins. //
J. Physiol. 2009. Т. 587. № Pt 12. С. 2903–18.
51. Shalygin A. Skopin, Anton, Kalinina, Vera, Zimina, Olga, Glushankova, Lyuba,
Mozhayeva, Galina N., Kaznacheyeva, Elena, STIM1 and STIM2 Proteins Differently Regulate
Endogenous Store-operated Channels in HEK293 Cells // J. Biol. Chem. 2015. Т. 290. № 8. С.
4717–4727.
52. Shen W.-W., Frieden M., Demaurex N. Remodelling of the endoplasmic reticulum
during store-operated calcium entry. // Biol. Cell. 2011a. Т. 103. № 8. С. 365–380.
53. Shen W.W., Frieden M., Demaurex N. Local cytosolic Ca 2+ elevations are required
for stromal interaction molecule 1 (STIM1) de-oligomerization and termination of store-operated
Ca 2+ entry // J. Biol. Chem. 2011b. Т. 286. № 42. С. 36448–36459.
54. Shin D.M., Son, A., Park, S., Kim, M.S., Ahuja, M., Muallem, S., Calcium Entry
Pathways in Non-excitable Cells // 2016. Т. 898. С. 47–66.
55. Shuttleworth T.J. Orai3 - the ‘exceptional’ Orai? // J. Physiol. 2012. Т. 590. № 2. С.
241–257.
56. Skopin A., Shalygin, A., Vigont, V., Zimina, O., Glushankova, L., Mozhayeva, G. N.,
Kaznacheyeva, E., TRPC1 protein forms only one type of native store-operated channels in
HEK293 cells // Biochimie. 2013. Т. 95. № 2. С. 347–353.
57. Soboloff J., Rothberg, B. S., Madesh, M. Gill, D. L., STIM proteins: dynamic calcium
signal transducers // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012. Т. 13. № 9. С. 549–565.
58. Srikanth S., Jung, H., Kim, K., Souda, P., Whitelegge, J., Gwack, Y.,, A novel EFhand protein, CRACR2A, is a cytosolic Ca2+ sensor that stabilizes CRAC channels in T cells //
Nat. Cell Biol. 2010. Т. 12. № 5. С. 436–446.
55
59. Stathopulos P.B., Ikura M. Structural aspects of calcium-release activated calcium
channel function // Channels. 2013. Т. 7. № 5. С. 344–353.
60. Sun Y., Zhang, H., Selvaraj, S., Sukumaran, P., Lei, S., Birnbaumer, L., Singh, B B.,
. Inhibition of L-type Ca 2+ channels by TRPC1-STIM1 complex is essential for the
protection of dopaminergic neurons // J. Neurosci. 2017. С. 3010–16.
61. Sundivakkam P.C. Freichel M., Singh V., Yuan J P., Vogel S M., Flockerzi, V., Malik
A. B, Tiruppathi,C// The Ca(2+) sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) is necessary and
sufficient for the store-operated Ca(2+) entry function of transient receptor potential canonical
(TRPC) 1 and 4 channels in endothelial cells. // Mol. Pharmacol. 2012. Т. 81. № 4. С. 510–26.
62. Takahashi Y. Hiroyuki W, Murakami, M., Ohba, T., Radovanovic, M. Ono, K
Involvement of transient receptor potential canonical 1 (TRPC1) in angiotensin II-induced
vascular smooth muscle cell hypertrophy // Atherosclerosis. 2007. Т. 195. № 2. С. 287–296.
63. Thiel M., Lis A., Penner R. STIM2 drives Ca2+ oscillations through store-operated
Ca2+ entry caused by mild store depletion. // J. Physiol. 2013. Т. 591. № Pt 6. С. 1433–45.
64. Thompson J.L., Shuttleworth T.J. How many Orai’s does it take to make a CRAC
channel? // Sci. Rep. 2013. Т. 3. С. 1961.
65. Vig M. и др. CRACM1 Multimers Form the Ion-Selective Pore of the CRAC
Channel // Curr. Biol. 2006. Т. 16. № 20. С. 2073–2079.
66. Vigont V.A., Zimina O.A., Glushankova L.N., Kolobkova V.A., Ryazantzeva M.A.,
Mozhayeva G.N., Kaznacheeva E.V., STIM1 Protein Activates Store-Operated Calcium
Channels in Cellular Model of Huntington ’ s Disease // Acta Naturae. 2014. Т. 6. № 23. С. 40–
47.
67. Wang Y. The Calcium Store Sensor , STIM1 , Reciprocally Controls Orai and CaV1 .
2 Channels // 2010. № October.
68. Weizhong Zeng, Joseph P. Yuan, Min Seuk Kim, Young Jin Choi, Guo N. Huang,
Paul F. Worley and S.M. STIM1 gates TRPC channels but not Orai1 by electrostatic
interaction // Mol Cell. 2009. Т. 32. № 3. С. 439–448.
69. Yang X., Jin H., Cai X., Li S., Shen Y., Structural and mechanistic insights into the
activation of Stromal interaction molecule 1 (STIM1) // Proc. Natl. Acad. Sci. 2012. Т. 109. №
15. С. 5657–5662.
70. Zagranichnaya T.K., Wu X., Villereal M.L. Endogenous TRPC1, TRPC3, and TRPC7
proteins combine to form native store-operated channels in HEK-293 cells // J. Biol. Chem.
2005. Т. 280. № 33. С. 29559–29569.
56
71. Zui P., JianJie M. Open Sesama: treasure in store-operated calcium entry pathway for
cancer therapy // Sci China Life sci. 2016. Т. 58. № 1. С. 48–53.
57
Отзывы:
Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв