ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ И МЕМБРАННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОК КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕМБРАНОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ

Белкина Анна

ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ И МЕМБРАННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОК КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕМБРАНОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ

Цель исследования изучение взаимосвязи состава липидов в корнях проростков пшеницы Triticum aestivum L. с проницаемостью клеточных мембран и их фазового состояния при действии мембранотропных веществ. 1) определили проницаемость мембран клеток корней, выращенных на мембранотропных веществах, для электролитов методом кондуктометрии; 2) исследовали липидный профиль в корнях, выращенных на мембранотропных веществах, методом инструментальной тонкослойной хроматографии; 3) оценили величину генерализованной поляризации возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах микросомальной фракции клеток корней пшеницы, выращенных на мембранотропных веществах.

Биология

Дипломы

Вуз: Казанский национальный исследовательский технологический университет (КНИТУ)

ID: 5b326bca7966e12f6e0aaec5

UUID: 24bce6c0-5b8d-0136-b35d-525400005860

Язык: Русский

Опубликовано: почти 6 лет назад

Просмотры: 41

10.82

Белкина Анна

Казанский национальный исследовательский технологический университет (КНИТУ)

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 5,3 МБ

Поделиться работой

МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет» (ФГБОУ ВО «КНИТУ») Кафедра Пищевой биотехнологии Направление 19.04.01 Биотехнология Программа Бионанотехнология Группа 626-М1 ВЫПУСКНАЯ КВАЛИКАЦИОННАЯ РАБОТА Уровень образования магистр Вид ВКР исследовательский Тема «Липидный состав и мембранные характеристики клеток корней пшеницы при действии мембранотропных веществ» Рецензент ______________________________ (Н.С.Карамова) Зав. кафедрой ___________________________ (М.А. Сысоева) Нормоконтролер ________________________ (В.Р. Хабибрахманова) Руководитель___________________________ (В.Р. Хабибрахманова) Руководитель___________________________ (Ю.Н. Валитова) Студент_______________________________ (А.В. Белкина) 2018 г

Кафедра Пищевой биотехнологии «УТВЕРЖДАЮ» Направление 19.04.01 Зав.кафедрой Сысоевой М.А. Программа Бионанотехнология Группа «___»_________________20___г. 626-М1 ЗАДАНИЕ на выпускную квалификационную работу магистра Белкиной А.В. Тема: Липидный состав и мембранные характеристики клеток корней пшеницы при действии мембранотропных веществ Срок представления работы к защите « » Цель, задачи и исходные данные работы: 20 г. Цель – изучение взаимосвязи состава липидов в корнях проростков пшеницы Triticum aestivum L. с проницаемостью клеточных мембран и их фазового состояния при действии мембранотропных веществ. Материал, полученный в ходе выполнения научно-исследовательской работы и прохождения практик в процессе обучения по магистерской программе; Публикации в научных журналах, специализированная научная литература. Задание по разделам работы: В литературном обзоре описать общую характеристику биологических мембран, проанализировать методы исследования физико-химического состояния биологических мембран. В экспериментальной части собрать, систематизировать и обработать весь объем полученных экспериментальных данных. В обсуждении результатов провести анализ полученных результатов, сделать обоснованные выводы. Содержание графической части (иллюстративного материала): Результаты магистерской диссертации, выносимые на защиту, оформить в виде электронной презентации с использованием программы Microsoft Power Point. Дата выдачи задания: « Руководитель _______________ (В.Р. Хабибрахманова) Руководитель _______________ (Ю.Н. Валитова) Задание принял к исполнению » ____________________ 20___ г. _______________ (А.В. Белкина) 2

ЛИСТ НОРМОКОНТРОЛЯ 1. Лист является обязательным приложением к пояснительной записке дипломного (курсового) проекта. 2. Нормоконтролер имеет право возвращать документацию без рассмотрения в случаях: - нарушения установленной комплектности; - отсутствия обязательных подписей; - нечеткого выполнения текстового и графического материала. 3. Устранение ошибок, указанных нормоконтролером, обязательно. ПЕРЕЧЕНЬ замечаний и предложений нормоконтролера по дипломному (курсовому) проекту, студента гр. 626 – М1 Белкиной А.В. (группа, инициалы, фамилия) Лист (страница) Условное обозначение (код ошибок) Содержание замечаний и предложений со ссылкой на нормативный документ, стандарт или типовую документацию Дата «____»___________________ Нормоконтролер ________ В.Р. Хабибрахманова (подпись) 3 (фамилия, инициалы)

Реферат Выпускная квалификационная работа содержит: страниц 90 , таблиц 16 , рисунков 21 , литературных источников 57 , в том числе зарубежных 39 Ключевые слова: липиды, стерины, фосфолипиды, мембрана, мембранотропные вещества, проницаемость, текучесть, флуоресцентный зонд Лаурдан. Цель работы – изучение взаимосвязи состава липидов в корнях проростков пшеницы Triticum aestivum L. с проницаемостью клеточных мембран и их фазового состояния при действии мембранотропных веществ. 4

Список сокращений и условных обозначений АНС – 1-анилинонафталин-8-сульфонат-анион ГлЦер 1– гликоцерамид, содержит в своем составе α-гидроксикислоту ГлЦер 2– гликоцерамид, содержит в своем составе не гидроксильные кислоты ГП – генерализованная поляризация ДАГ (DAG) – диацилглицерид ДГДГ – дигалактозилдиацилглицерид ДФГ – дифосфатидилглицерин ЖК – жирная кислота МГДГ – моногалактозилдиацилглицерид Ст – стерин сыр.в. – сырой вес ТАГ – триацилглицерид Т – терпеноид ТСХ – тонкослойная хроматография УвС – углеводороды, включая сквален ФГ – фосфатидилглицерин ФК – фосфатидная кислота ФЛ – фосфолипид ФИ – фосфотидилинозитол ФС – фосфотидилсерин ФХ – фосфотидихолин ФЭ – фосфотидилэтаноамин ЭПР – электронный парамагнитный резонанс ЯМР – ядерный магнитный резонанс ϕ – флуоресценция ADP – аденозиндифосфат ATP – аденозинтрифосфат GDP – гуанозиндифосфат 5

GTP – гуанозинтрифосфат IP3 – инозитрифосфат PIP2 – фосфатидилинозит – 4,5 – дифосфат 6

Содержани ВВЕДЕНИЕ 9 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12 1.1 Биологическая мембрана: химический состав, функции и структурная организация.........................................................................................................12 1.2 Методы исследования физико-химического состояния биологических мембран...............................................................................................................16 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 29 2.1 Характеристика материалов и реактивов...................................................29 2.2 Выращивание проростков пшеницы..........................................................29 2.3 Экстрагирование липидов из корней пшеницы.........................................30 2.4 Определение состава и содержания липидов в экстрактах из корней пшеницы с применением инструментальной тонкослойной хроматографии ..............................................................................................................................31 2.5 Определение проницаемости и фазового состояния мембран клеток корней пшеницы.................................................................................................40 2.6 Общие методы исследования......................................................................40 2.6.1 Инструментальная тонкослойная хроматография..............................40 2.6.2 Определение выхода электролитов и индекса мембранной стабильности...................................................................................................41 2.6.3 Определение величины генерализационной поляризации возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах микросомальной фракции растительных клеток.........................................41 2.7 Статистическая обработка результатов......................................................42 3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 43 3.1 Обоснование исследования.........................................................................43 3.2 Исследование влияния мембранотропных веществ на проницаемость мембран клеток корней пшеницы.....................................................................44 3.3 Исследование липидного профиля в экстрактах из клеток корней пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ..............46 7

3.4 Исследование влияния мембранотропных веществ на характеристики мембран клеток корней пшеницы.....................................................................56 ВЫВОДЫ 58 Список использованной литературы Приложение 59 66 8

ВВЕДЕНИЕ Актуальность. Различные неблагоприятные факторы окружающей среды воздействуют на растения вызывают в них стресс, что приводят к нарушениям жизнедеятельности растений. Липиды – это один из важных классов биологических соединений, который претерпевает существенные изменения в ответе растения на стрессовые воздействия [1]. Известно, что результатом стрессового воздействия на растение являются изменения метаболических процессов, идущих в клетке: активация ферментной системы, изменение текучести мембран, фотосинтетической способности [2]. Изучение этих изменений имеет важное фундаментальное значение, в первую очередь для культур, имеющих важное сельскохозяйственное значение. К важнейшим сельскохозяйственным культурам относится пшеница. Несмотря на широкую изученность пшеницы как основной продовольственной культуры, данные о ее липидном профиле, в том числе изменении его состава, при воздействии различных стрессоров до сих пор ограничены. Целью настоящего исследования явилось изучение взаимосвязи состава липидов в корнях проростков пшеницы Triticum aestivum L. с проницаемостью клеточных мембран и их фазового состояния при действии мембранотропных веществ. В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи: 1) определить проницаемость мембран клеток корней проростков, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ, для электролитов путем оценки их выхода методом кондуктометрии; 2) исследовать липидный профиль в корнях проростков, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ, методом инструментальной тонкослойной хроматографии на лабораторном комплексе «CAMAG» (Швейцария); 3) оценить величину генерализованной поляризации возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах микросомальной 9

фракции клеток корней проростков пшеницы, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ. Научная новизна. Впервые исследован качественный состав липидных соединений и определенно их количество в корнях проростков пшеницы, выращенных при воздействии CaCl2 (10-3 М) и β-ситостерин (5∙10-4 М), уплотняющих мембрану, а также нистатина (10-4 М) и детергента тритон Х-100 (1,6∙10-5 М), которые увеличивают ее проницаемость. Показано, что при выращивании пшеницы на среде с добавлением βситостерина происходит существенное изменение состава липидов в клетках корней. Происходит увеличением стеринов и моногалактозилдиацилгрицерида (в 3,4 и 2 раза, соответственно) и снижение фосфатидилхолина и гликоцерамидов (1,4 и 2, соответственно) При этом обнаруженные изменения в липидном профиле влияют на мембранные характеристики клеток корней пшеницы – увеличение мембранной стабильности на 4,7 % и уплотнение мембран в 1,3 раза. Установлено, что при выращивании растений в течение 4 суток на среде с добавлением нистатина в концентрации 10 -4 М, происходит адаптация растений к данному мембранотропу, которая заключается в восстановлении мембранных характеристик – текучести и проницаемости. Одним из факторов в этом механизме адаптации является снижение (в 3,3 раза) количества в мембранах доли стеринов. Практическая значимость. Методические разработки и данные представленные в диссертации Белкиной А. В. имеют научно-прикладную значимость и могут быть использованы в исследовательских и образовательных учреждений. По результатам исследования опубликованы 1 статья и 3 тезиса доклада: в материалах: II международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Уфа, 2017), IV российского симпозиума с международным участием «Фитоиммунитет и клеточная 10

сигнализация у растений» (Казань, 2016), годичного собрания общества физиологов растений России «Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Судак, 2017). Часть результатов работы получена в лаборатории Окислительно – восстановительного метаболизма КИББ ФИЦ КазНЦ РАН. Автор выражает благодарность соавторам за помощь в проведении экспериментов и обсуждении полученных результатов. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ (№ 16 – 04 – 00676 А). 11

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Биологическая мембрана: химический состав, функции и структурная организация Мембраны – это барьер, отделяющий цитоплазму всех клеток от окружающей среды. Некоторые внутриклеточные органеллы окружены мембранами — митохондрии, хлоропласты, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы и ядро. Эти барьеры отделяют функциональные единицы органелл от других клеточных компонентов [3]. Проницаемость мембран имеет большое значение для осморегуляции и поддержания ионного гомеостаза клетки, играет важную роль в энергообеспечении клетки, сенсорных механизмах и других процессах жизнедеятельности. Изменение текучести мембран оказывает влияние на активность мембранных ферментных комплексов, регулирует в клетках концентрацию ионов, сахаров, аминокислот и других продуктов обмена веществ. Известно [4], что проницаемость мембран для ионов может изменяться при действии многих факторов, например, антибиотиков. Мембраны представляют собой сложные структуры толщиной 6-10 нм [3]. Двойной липидный слой составляет основу мембраны, в формировании которого участвуют фосфолипиды и гликолипиды. К фосфолипидам можно отнести – глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды. Глицерофосфолипиды относятся к производным фофсфатидной кислоты. Находящийся в составе фосфатидной кислоты остаток фосфорной кислоты может образовывать сложноэфирную связь с различными полярными группировками. Наличие в молекуле глицерофосфолипидов остатков жирных кислот и полярной ионизированной головы придает им свойства амфифилов [5]. К основным фосфолипидам растений относятся фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилинозитол 12

(ФИ), фосфатидилглицерин (ФГ). Структурные формулы этих липидов представлены в приложении 1. Сфинголипиды – структурно разнообразные молекулы с неполярной церамидной основой. Церамиды содержат жирную кислоту, связанную с амидом через длинноцепочечное основание, которое является уникальным компонентом сфинголипидов. У комплекса сфинголипидов есть полярная группа, которая прикрепляется к гидроксильному остатку C1 церамида. Главными сфинголипидами растений являются гликоцерамиды (ГлЦер), которые имеют в своем составе глюкозосодержащую группу [6]. Стерины важны для всех эукариотов. В отличие от животных и грибных клеток, растительные которые клетки содержат обладают только сложным один главный стериновым стерин, составом. Преобладающими стеринами растений являются β-ситостерин, стигмастерин и кампестерин (приложение 1). β-cитостерин и кампестерин регулируют мембранную текучесть. Стерины растений также могут модулировать деятельность мембранных ферментов. Стигмастерин требуется для быстрого увеличения клеток. Уменьшая пространство между молекулами липидов, холестерин способствует более плотной упаковке жидкостно-организованных областей искусственных мембран [3]. Липидный бислой образован двумя рядами липидов, гидрофобные радикалы которых спрятаны внутрь, а гидрофильные группы обращены наружу и контактируют с водной средой [7] (рисунок 1.1). Согласно [8] определенные участки бислоя мембраны обогащены сфинголипидами и стеринами, которые организованы в особые липидные домены – рафты. Липидные рафты представляют собой гетерогенные и нестабильные структуры размером от 50 до 200 нм [9, 10] (рисунок 1.2). Они [11, 12] регулируют передачу различных сигналов внутри клетки, включая те, которые инициируют деление клеток, дифференцировку и различные реакции стресса. Физические и химические свойства липидных рафтов определяются качественным составом содержащихся в них стеринов, истощение которых 13

может привести к разрушению этих доменов и высвобождению их содержимого из мембран [13]. Добавление стеринов в модельные мембраны, состоящие из смеси фосфо- и сфинголипидов, приводит к упорядочению их насыщенных ацильных цепей, но сохраняет боковую подвижность липидов [14]. Рисунок 1.1 – Поперечный срез плазматической мембраны [7] Рисунок 1.2 – Схема организации липидного микродомена (рафта) [9] 14

На сегодняшний день исследования химического состава и структурой организации мембран различных природных объектов посвящено значительное количество работ [15, 16, 17, 18]. Наиболее актуальным является исследования влияния на состав и свойства мембраны при воздействии различных физических и химических факторов. В качестве тест объектов используются – Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Zea mays, а также Triticum aestivum и ряд других растительных объектов. Пшеница – является основной сельскохозяйственной культурой, и поэтому изучение изменений состава и структурой организации мембран клеток ее тканей (зеленная масса, корни, зерно) при воздействии различных неблагоприятных факторов имеет важное фундаментальное значение. В исследованиях, проводимых Валитовой Ю.Н. с коллегами [19, 20, 21], было установлено, что в зависимости от различного стрессового воздействия на пшеницу происходит существенные изменения липидного состава мембран. Например, под действием стерин-связывающего агента нистатина наблюдается значительное снижение содержания стеринов в клетках корней пшеницы, что сопровождается двукратным увеличением общего содержания ГлЦер [19; 20]. Кроме того, связывание стеринов с нистатином в корнях пшеницы приводит к уменьшению концентрации молекулярных видов ГлЦер, содержащих длинноцепочечные жирные кислоты (ЖК), например, d18:1Δ8/h22:0 [20] , Авторы предположили, что изменение стеринового компонента может влиять на функционирование мембран, изменяя сфинголипидную композицию липидных плотов [21]. В работе [22] показано, что в условиях кратковременного (1 ч) холодового (+4оС) стресса в корнях проростков пшеницы значительно возрастает общее содержание стеринов по сравнению с контролем. Увеличение стеринов в корнях проростков пшеницы, происходило в основном за счет увеличения содержания β-ситостерина и капместерина. В таблице 1.1 приведено содержание основных липидов в корнях пшеницы при раневом стрессе [19, 20, 21]. 15

Таблица 1.1 – Содержание основных липидов в корнях пшеницы при раневом стрессе [19, 20, 21] Объект исследования Отсеченные корни пшеницы Содержание липидов, мкг/г ФИ ФС стерины ФХ ФЭ 140-3200 110-2500 25-900 10-100 11-1200 ГлЦер 55-1500 Как видно, из данных таблицы 1.1, содержание различных липидов в отсеченных корнях пшеницы сильно варьируется. Предположительно, это может быть обусловлено, тем, что для анализа были использованы различные партии зерна пшеницы и эксперименты проводились в разные время года. Таким образом, проведенный обзор литературы показал, что данные о составе липидов в пшенице ограничены, в частности отсутствуют сведения о липидном профиле в интактных растениях пшеницы. 1.2 Методы исследования физико-химического состояния биологических мембран Методы исследования физико-химического состояния биологических мембран включают: фазово-контрастную микроскопию; электронную микроскопию; лазернаю микроскопию; рентгеноструктурный анализ; ядерномагнитный резонанс (ЯМР); электронно-парамагнитный резонанс (ЭПР) и использование спиновых меток; флуоресцентную спектроскопию (и использование флуоресцентных зондов). Фазово-контрастная микроскопия основана на том факте, что структурные элементы с различными показателями преломления имеют разную яркость. Таким образом, можно различать различные элементы клеток, но мембраны не видны, поскольку световой микроскоп позволяет видеть объекты по меньшей мере 20 нм, а толщина биомембран, как уже упоминалось, не превышает 10 нм. Разрешение электронных микроскопов значительно выше. На длине волны, используемой в электронной микроскопии, можно различать объекты 16

0,5-1,0 нм, т. е. даже большие молекулы. Электронная микроскопия позволяет связать данные о структуре объекта с результатами химического анализа [23]. В работе [24] представлены исследования растительных мембран с использованием электронного микроскопа (рисунок 1.3). Рисунок 1.3 – Мембранные структуры растительных клеток [24] Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков, которые необходимо учитывать при работе с биологическим материалом. Изучаемый объект обезвоживается, фиксируется, а затем контрастируется с солями тяжелых металлов, что может привести к его искажению. Недавно в биофизике была введена динамическая лазерная микроскопия, которая используется для изучения изменений формы живых объектов в трехмерных изображениях [23]. В своих исследованиях [25] изучил эндоплазматический ретикулум Arabidopsis thaliana при низких температурах с использованием конфокальной микроскопии (рисунок 1.4). 17

Рисунок 1.4 – Конфокальное микроскопическое изображение эндоплазматического ретикулума мембран в живых клетках во время замораживания [25] Одним из наиболее точных методов изучения структуры молекул, составляющих клеточную мембрану, является метод рентгеноструктурного анализа на основе рентгеновских лучей. Как правило, это явление наблюдается в тех случаях, когда на пути лучей существуют препятствия, сравнимые по размеру с длиной волны пучка. Если параллельный луч рентгеновских лучей направлен на исследуемый объект, а за объектом помещается фотопленка, то на нем фиксируется дифракционная картина. В результате интерференции лучей на рентгеновском изображении наблюдается образование многих пятен. Рентгенологический анализ предоставляет информацию о структуре объекта на молекулярном уровне. Значение метода заключается в том, что становится возможным, во-первых, точно измерить расстояние между молекулами, изучить их пространственное местоположение, оценить их внутримолекулярную структуру, а во-вторых, определить структуру молекулярных компонентов мембраны в нефиксированных клеточных препаратах [23]. В работе [26] метод рентгеноструктурного анализа использовался для изучения мембранной структуры (рисунок 1.5). 18

Рисунок 1.5 – Изображение липидного бислоя мембраны путем одновременного анализа рентгеновского и нейтронового рассеивания [26] Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) является следующим традиционным методом изучения состояния мембран. ЯМР-спектроскопия основана на физическом явлении поглощения электромагнитных волн атомными ядрами с магнитным моментом. В биологических исследованиях часто используют 13C, 1H, 31P. Структура спектров ЯМР зависит от величины диполь-дипольных взаимодействий между ядром и соседними ядрами, неоднородностью магнитного поля и т. д. Процессы релаксации, связанные с диполь-дипольными взаимодействиями, и служат мерой, характеризующей подвижность отдельных атомов и молекул. Метод ЯМР позволяет с высокой точностью получать информацию о селективном поведении отдельных частей белковых молекул и липидов, которые составляют биологическую мембрану. В настоящее время существуют спектры ЯМР многих белков, что позволяет изучать состояние воды в биологических мембранах, а также наблюдать структурные изменения, сопровождающие их функционирование. ЯМР на ядрах 31 С используется для изучения структуры и поведения фосфолипидов в модели и природных мембранах. Преимущество метода заключается в том, что в этом случае информация получается непосредственно от молекулы конкретного фосфолипида, а не от посредника, 19

как, например, при работе со спиновыми зондами. Недостатки метода включают в себя тот факт, что он имеет относительно низкую чувствительность, кроме того, спектры ЯМР сложны и часто плохо разрешимы. Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) широко используется для исследований в области молекулярной и клеточной биофизики. ЭПР успешно используется при изучении структуры молекул, содержащих парамагнитные частицы, а также кинетики изменений положения частицы при изменении конформации молекулы или ее соседей. В биологических объектах наиболее распространенными парамагнитными частицами являются ионы и свободные радикалы. Парамагнитными ионами являются переходные металлы – Fe, Co, Ni, Cu, Mg. Метод ЭПР позволяет судить об изменении конформации входящих в них комплексов и наблюдать их окислительно-восстановительные превращения. С помощью ЭПР исследуются также триплетные состояния, возникающие, например, во время фотобиологических реакций. Очень важным для мембранологии является использование спиновых меток и зондов, когда в исследуемую систему вводятся стабильные свободные радикалы, изменение характеристик спектров ЭПР оценивается по структурному и динамическому состоянию мембранных молекул. Результаты, полученные методом ЭПР и ЯМР, позволяют выяснить структурную организацию мембран и их изменения в функционировании. Кроме того, они дополняют электронные микроскопические данные об ультраструктурной организации мембран. Методы колебательной спектроскопии, такие как рассеянная спектроскопия и инфракрасная спектроскопия, представляют большой интерес для изучения отдельных компонентов мембраны [21]. Флуоресцентную спектроскопию можно использовать при изучении структурной организации мембран. Известно, что флуоресценция в клетках сопровождается появлением электронно-возбужденных состояний, когда 20

электрон переходит из основного состояния в возбужденное. Энергия, полученная молекулой, может потребляться в виде тепла или излучаться как свет. Светоизлучение проводится в течение более длительного времени, чем поглощение. При работе с биологическими объектами, в частности с клеточными мембранами, регистрируется либо собственная флуоресценция отдельных молекул плазматической мембраны, либо флуоресценция зондов или меток, специально связанных с макромолекулой и вводимых в клетку. Существуют флуоресцентные метки, образующие химическую связь с молекулами мембраны и флуоресцентные зонды, которые нековалентно связываются с молекулами мембраны. Когда зонд или метка включены в мембрану, их флуоресцентные свойства изменяются, что дает информацию о структурных особенностях исследуемой системы. Например, для измерения текучести мембраны наблюдается перемещение спиновых или флуоресцентных зондов, включенных в мембрану. Мембранная текучесть является одним из основных макроскопических биофизических свойств, характеризующих клеточные мембраны. Если в месте связывания флуорохрома изменяется заряд, микровязкость, состояние гидрофильности – гидрофобности или другие условия, то он меняет характер излучения. Поэтому его поведение может служить хорошим тестом при исследовании полярных (неполярных) участков белка, трансмембранных потенциалов, изучение структурных и функциональных изменений в мембранах, состояния воды в биологических мембранах. В нескольких исследованиях указывалось, что текучесть важна во время клеточных событий, таких как эндоцитоз, слияние мембран и, что важно, во время развития [27]. Эффекты, которые уменьшают площадь одной липидной молекулы, такие как повышенное гидростатическое давление, более низкая температура или добавление холестерина к фосфолипидам в жидкокристаллическом состоянии, вызывают снижение текучести. Это согласуется с теорией свободного объема, согласно которой плотность и текучесть обратно пропорциональны. Чем более плотная упаковка характерна 21

для мембраны, тем более ограниченным будет движение зонда. Результаты исследований зависят от текучести мембраны как индекса или маркера, который отражает потенциал клеточной пластичности [28]. Следует отметить, что существует разница между двумя типами таких флуоресцентных веществ - флуоресцентными зондами и флуоресцентными метками. Флуоресцентная метка, связанна с субстратом химической связью, тогда как флуоресцентные зонды ассоциированы нековалентно. Применимость метода ограничивается несколькими требованиями к флуоресцирующему хромофору. Он должен достаточно прочно связываться с определенными участками макромолекул, мембран и т.д. Зонд должен быть чувствителен к условиям окружения и не должен сам оказывать влияния на свойства мембран, макромолекул и пр. к таким зондам относятся 1,8-АНС (1анилинонафталин-8-сульфонат-анион), поглощение 360 нм, флуоресценция 530 нм; дансихлорид, поглощение 310 нм, флуоресценция 470 нм; лаурдан поглощение 360 нм; флуоресценция 490 нм. Так, для АНС (1-анилинонафталин-8-сульфонат-анион) характерно, что в водных растворах их флуоресценция слаба, но в неполярном окружении квантовый выход флуоресценции (ϕ) резко возрастает (в десятки раз). Возможно, определить зависимость ϕ от степени полярности (неполярности) окружения зонда. Так, имея максимум флуоресценции в воде при 515 нм, АНС в суспензии митохондрий флуоресцирует при 480 нм, а с белками при 460 нм. Отмечено также, что выход флуоресценции АНС в гидрофобном окружении возрастает в присутствии Ca2+ и Mg2+. Эти катионы, по-видимому, меняют сродство АНС к мембранам и т.п. При связывании зонда с мембраной заметно изменяется поляризация флуоресценции и ее анизотропия. Возможно также изменение спектра поглощения зонда и его спектра флуоресценции, что следует учитывать для флуоресценции зонда и корректировки возбуждения с целью повышения чувствительности метода. 22

Зависимость между равновесным количеством свободного и связанного зонда и концентрацией мест связывания зонда на мембране описывается уравнением: kc = r/C(N-r), где kc – константа связывания; r – концентрация связанного зонда; C – концентрация свободного зонда; N – концентрация мест связывания зонда на мембране. При этом предполагается, что все центры связывания одинаковы и не влияют друг на друга. Тогда в соответствующих координатах можно получить прямую зависимость. Для определения kc и N необходимо знать концентрацию связанного зонда r, которую в известных случаях можно увязать со всей измеряемой флуоресценцией Iфл. Модифицируя уравнения для конкретных ситуаций – титрование зондами определенной концентрации зонда – можно найти величины Iфлмоль – величину «молярной флуоресценции», зависящую от зонда, параметров установки и квантового выхода флуоресценции и величину nуд – число молей центров связывания на единицу мембранного материала. При наличии в зондах заряженных групп изменения поверхностного заряда мембраны должны влиять на связывание зондов, при чем связывание выше у противоположного заряженных участников. Установлена определенная зависимость между поверхностным зарядом мембраны и интенсивностью флуоресценции зонда [29]. Лаурдан (рисунок 1.6) представляет собой флуоресцентный мембранный маркер, используемый для исследования мембранной текучести [30]. Отличительной особенностью лаурдана является его способность ощущать полярность его окружения. В случае липидных бислоев, лаурдан обнаруживает присутствие воды в мембране, что дает нам информацию о проникновении воды, свойство имеющее отношение к мембранной текучеcти (рисунок 1.7). Лаурдан представляет собой молекулу, чьи спектроскопические 23

свойства влияют на состав и динамику его локального изменения. Другими словами, флуоресценция лаурдана зависит от двух основных факторов: полярность среды (основное состояние флуорофора) и скорости дипольной релаксации молекул переориентироваться или молекулярных вокруг фрагмента остатков, которые флуоресцентного могут лаурдана в возбужденном состоянии [31]. Рисунок 1.6 – Химическая структура лаурдана [32] Рисунок 1.7 – Схематическое изображение взаимодействия структуре, флуоресцентный фосфолипидов и лаурдана [31] Благодаря своей молекулярной нафталиновый фрагмент лаурдана представляет собой дипольный момент между 2-диметиламино- и 6-карбонильными остатками. При возбуждении дипольный момент возрастает; считается, что это увеличение вызывает переориентацию окружающих диполей растворителя. Энергия, необходимая 24

для переориентации окружающих растворителей, уменьшает выходящую энергию лаурдана, а спектр излучения зонда непрерывно смещается в красную область света, тогда соседние молекулы воды вокруг реорганизуются [33]. Соответственно, смещения в красную область спектра излучения наблюдаются в полярных растворителях, тогда как в неполярных растворителях, например, в плотно упакованных Lo-фазах с уменьшенным содержанием воды, эмиссия смещается в более синюю область света. Для количественной оценки конкретных сдвигов в спектральном поведении лаурдана были рассчитаны значения обобщенной поляризации (ГП-). ГП = (I430-I490)/(I430+I490), где I430 и I490 являются интенсивностью излучения при 430 и 490 нм. Значение ГП безразмерное и отражает преобладающее состояние липидов в липидных бислоях. В искусственно созданных тройных липидных смесях жидкие упорядоченные домены характеризовались высокими значениями ГП [34]. Значение ГП можно использовать в качестве индикатора для содержания воды в липидных фазах и, соответственно, в качестве степени для преобладающего состояния липидного порядка. Значение ГП «-1» означает водную фазу, тогда как значение ГП «+1» означает полностью упорядоченную фазу. Экспериментально эти значения зависят от состава липидов и от температуры. В жидкой неупорядоченной фазе модельных мембран ГП -значения варьировались от «-0,3» до «+0,3», а в жидких упорядоченных фазах эти значения обычно находятся в диапазоне от «+0,5» до «+0,6» [33]. Нестеркина с соавт. [35] в своих экспериментах с помощью многофотонного конфокального люминесцентного сканирующего лазерного микроскопа MicroTime 200 с пикосекундным временем разрешением (фирмы PicoQuant Gmbh, Германия) получили серию изображений вакуолей, проинкубированных с лаурданом, и фракции изолированных белоклипидных микродоменов, выделенных из опалесцирующей зоны градиента 25

сахарозы и также проинкубированных с лаурданом. На основе полученных изображений проводили расчет значений ГП. Значение ГП для вакуолей мембраны варьировало и составляло приблизительно «+0,06», что говорит о ее жидкости. Значение ГП фракции выделенных рафтов оказалось в пределах «+0,7», что свидетельствует, о том, что в этой фракции находятся упорядоченные (плотные) домены. Таким образом, полученные значения ГП для фракции тонопластов и рафтов однозначно характеризуют изолированную опалесцирующую зону градиента сахарозы как зону, содержащую высокоупорядоченные липиды, и подтверждают наличие белково-липидных микродоменов на вакуолярной мембране. В работе [36] обсуждаются результаты исследования особенностей строения вакуолярных мембран растительных клеток, исследованных с использованием конфокальной микроскопии (рисунок 1.8). Были полученны распределения значений ГП флуоресценции лаурдана для различных участков вакуолярной мембраны. В – везикулы, М – мембрана, Н – «трансвакуолярные нити», об. 60˟, масштабные отрезки – 10 мкм Рисонок 1.8 – Конфокальное изображение изолированных вакуолей, меченных флуоресцентными зондами – АНС (а) и лаурданом (б) [36] 26

Среднее значение ГП флуоресценции областей, характеризующихся повышенной интенсивностью флуоресценции, и всей мембраны существенно различаются («-0,22» и «-0,04» соответственно, Р < 0,05, критерий Манна– Уитни). Однако характер распределения значений ГП в случаях ярких областей был различным по сравнению с распределением значений ГП для всей мембраны (рисунок 1.9). По меньшей мере, три отдельных пика могут быть обнаружены в гистограмме распределения значений флуоресценции лаурдана в областях с повышенной интенсивностью. Среди упомянутых выше трех пиков имеются области спектра значений ГП, соответствующие более жидкой, средней плотности и более плотным состояниям вещества (максимумы значений ГП «-0,5», «-0,2», и «+0,35» соответственно). Как видно из гистограммы на рисунке 1.9, значения ГП флуоресценции лаурдана в вакуолярной мембране в норме имеют близкое к нормальному распределению и варьируют в диапазоне от «-0,6» до «+0,4» с максимумом «0,1», что соответствует жидкокристаллическому состоянию липидов мембраны. Рисунок 1.9 – Распределение значений ГП флуоресценции лаурдана, связанного с липидной составляющей вакуолярной мембраны [36] Таким образом, изучение особенностей морфологии, фазового состояния и микровязкости элементов мембран изолированных вакуолей 27

растительных клеток с помощью конфокальной микроскопии при сканировании верхней области изолированных вакуолей выявило части флуоресценции высокой интенсивности. Такими областями могут быть кластеры липидно-белковых образований с преобладанием их белкового состава. Характер распределения значений флуоресценции ГП лаургана в этих областях интенсивности флуоресценции отличался от распределения значений ГП для всей мембраны. Полученные данные свидетельствуют о существенной разнице между микровязкой интенсивно флуоресцирующих областей и остальной частью мембраны. В экспериментах Белугина [37] по изучению свойств упаковки и гидратации липидного бислоя двух популяций везикул с помощью лаурдана выявлено преобладание доли твердофазных доменов в липидном бислое во фракции мембран с высоким содержание стеринов. Фракции плазмалеммы низкой плотности обогащены стеринами и имеют более упорядоченную структуру липидного матрикса по сравнению с мембранами с высокой плотностью. Заключение В настоящем обзоре обобщены данные современной литературы о роли биологической мембраны и отдельных ее структур, в частности мембранных липидов в жизнедеятельности исследования Выявлено, растений. физико-химического что эффективным Проведен состояния инструментом анализ биологических исследования методов мембран. изменений состояния мембраны является метод флуоресцентных зондов. Флуориметрия и многофотомная флуоресценции микроскопия зондов. Лаурдан стандартные остается методы одним универсальных и основным флуоресцентным зондом. 28 для из измерения популярных,

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Характеристика материалов и реактивов В работе для проращивания использовали яровую пшеницу (Triticum aestivum L.) сорта «Казанская юбилейная». В работе использовали следующие химические реактивы: хлорид кальция (CaCl2, «Fluka Chemie AG», №2110), нистатин (С47Н75NO17, «SIGMAALDRICH», CAS 1400-61-9), тритон Х-100 (C14H22O(C2H4O)n(n=9-10), Scintran, № 14630), β-ситостерин (C29H50O, «SIGMA-ALDRICH», CAS 83-46-5), триолеин (C17H33COO)3C3H5, «SIGMA-ALDRICH», CAS 122-32-7), олеиновая кислота (СН3(СН2)7СН=СН(СН2)7СООН, «SIGMA-ALDRICH», CAS 112-801), сквален (С30Н50, «SIGMA-ALDRICH», CAS 111-02-4), фосфатидилхолин («SIGMA-ALDRICH», CAS 8002-43-5,), смесь гликоцерамидов («SIGMAALDRICH», CAS 85305-88-0), сахароза (С12Н22О11, «ТатХимПродукт», чда), HEPES, (C8H18N2O4S, «SIGMA-ALDRICH», CAS 7365-45-9), ЭДТА (C10H16N2O8, «SIGMA-ALDRICH», CAS 60-00-4), поливинилпирролидон ((C6H9NO)n, «SIGMA-ALDRICH», (HSCH2CH(OH)CH(OH)CH2SH, CAS 9003-39-8), «SIGMA-ALDRICH», CAS дитиотрийтол 3483-12-3), фенилметан сульфонил флуорид (C7H7FO2S, «SIGMA-ALDRICH», CAS 32998-6), лаурдан (C24H35NO, «SIGMA-ALDRICH», CAS 74515-25-6). 2.2 Выращивание проростков пшеницы Семена пшеницы предварительно замачивали в дистиллированнной воде в течение суток в специальной кювете. Далее наклюнувшиеся семена помещали на различные среды для проращивания: - 2,5∙10-4 М раствор CaCl2 – контроль; - 10-3 М раствор CaCl2 – модель 1; - раствор β-ситостерина с концентрацией 5∙10-4 М – модель 2; 29

- раствор нистатина с концентрацией 10-4 М – модель 3; - 1,6∙10-5 М раствор тритона Х-100 – модель 4. Кюветы с проростками помещали в растильную камеру на четыре дня при температуре плюс 22 °С и освещенности 100 Вт/м2 с 12-часовом фотопериодом. 2.3 Экстрагирование липидов из корней пшеницы Сумму липидов экстрагировали смесью изопропанола и хлороформа по методу [38] с модификациями [39]: 1) навеску корней (1 г) измельчали, гомогенизировали с 3 мл изопропилового спирта и помещали в термостат на 30 мин предварительно его нагрев до 70 °С; 2) на фильтр Шотта переносили гомогенат и отфильтровывали в круглодонную колбу с помощью водоструйного насоса; 3) материал, который остался на фильтре переносили в пробирку со шлифом, добавляли 5 мл смеси хлороформ – изопропиловый спирт (1:1) и помещали в термостат на 30 мин; 4) гомогенат переносили на фильтр Шотта, экстракт отфильтровывали с помощью водоструйного насоса в ту же круглодонную колбу с первой частью экстракта; 5) объединенный экстракт выпаривали (роторный испаритель) при температуре 40 °С; 6) к сухому остатку добавляли 2 мл смеси хлороформ: метанол (1:1), количественно переносили в колбу (конечный объем 3 мл), добавляли 4 мл воды, встряхивали и оставляли до разделения хлороформной и водно-метанольной фаз; 7) отбирали хлороформную фазу в пробирки со шлифом и выпаривали на роторном испарителе; 8) добавляли 100 мкл хлороформа и количественно переносили в виалы, выпаривали (роторный испаритель); 30

9) определили выход липидных веществ гравиметрическим методом, взвешивая виалки без и с сухим остатком экстрактом. Полученные результаты приведены в таблице 2.1. Таблица 2.1 – Определение выхода липидных веществ из выращенных корней пшеницы* (n=2) Выход липидных веществ, г % 0,0015 0,15 0,0012 0,12 0,0015 0,16 0,0017 0,17 0,0015 0,15 0,0017 0,17 0,0016 0,16 0,0015 0,15 0,0046 0,46 0,0042 0,42 Объект исследования Экстракт корней контроль Экстракт корней модель 1 Экстракт корней модель 2 Экстракт корней модель 3 Экстракт корней модель 4 * - для экстракции брали 1 г корней 2.4 Определение состава и содержания липидов в экстрактах из корней пшеницы с применением инструментальной тонкослойной хроматографии В полученных экстрактах из корней пшеницы определяли состав нейтральных и полярных липидов с применением инструментальной тонкослойной хроматографии (ТСХ) по методике п. 2.7.1. Для исследования нейтральных липидов на пластину наряду с экстрактами наносили растворы веществ – стандартов с шириной трека 8 мм (таблица 2.2, 2.3). Каждый объект анализировали в трех аналитических проворностях. Хроматографию дериватизацию проводили проводили в системе опрыскиванием пластины Полученные хроматограммы приведены на рисунке 2.1. 31 растворителей реактивом №1, №1.

Таблица 2.2 – Условия нанесения объектов исследования на хроматограмму при исследовании состава нейтральных липидов Объект исследования Экстракт корней контроль Экстракт корней модель 1 Экстракт корней модель 2 Экстракт корней модель 3 Экстракт корней модель 4 Ситостерол Условное обозначение Rc1,2,3 RСa1,2,3 Rs1,2,3 Rn1,2,3 Rt1,2,3 St1,2,3 Условия растворения/ концентрация Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа 1 мкг/мкл Объем нанесения, мкл Номер трека 5 1,7,13 5 2,8,14 5 4,10,16 5 3,9,15 5 5,11,17 8,12,16 6,12,18 Таблица 2.3 – Условия нанесения объектов исследования на хроматограмму при исследовании состава нейтральных липидов Объект исследования Экстракт корней контроль Ситостерол Циклоартенол Олеиновая кислота Триолеин Сквален Условное обозначение Rc1,2,3 St1 St2 St3 St4 St5 Условия растворения/ концентрация Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа 1 мкг/мкл 1 мкг/мкл 1 мкг/мкл 1 мкг/мкл 1 мкг/мкл Объем нанесения, мкл Номер трека 5 2,4,6 6 6 6 6 6 1 3 5 7 8 Рисунок 2.1 – Хроматограммы нейтральных липидов в экстрактах корней пшеницы Для исследования полярных липидов на пластину наряду с экстрактами наносили растворы веществ – стандартов с шириной трека 8 мм (таблица 2.4). Каждый объект анализировали в трех аналитических проворностях. 32

Таблица 2.4 – Условия нанесения объектов исследования на хроматограмму при исследовании состава полярных липидов Объект исследования Экстракт корней контроль Экстракт корней модель 1 Экстракт корней модель 2 Экстракт корней модель 3 Экстракт корней модель 4 ФХ ГлЦер1 и ГлЦер2 Условное обозначение Rc1,2,3 Rca1,2,3 Rs1,2,3 Rn1,2,3 Rt1,2 St1,2,3 Gl Хроматографию дериватизацию Условия растворения/ концентрация Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа Сухой остаток растворяли в 50 мкл хлороформа 1 мкг/мл 1 мкг/мл проводили проводили в системе опрыскиванием Объем нанесения, мкл Номер трека 5 1,7,13 5 2,8,14 5 4,10,16 5 3,9,15 5 5,17 4,6,8 12 6,12,18 11 растворителей пластины реактивом №2, №1. Полученные хроматограммы приведены на рисунке 2.2. Далее пластины помещали в денситометр «TLS Scanner 4» и сканировали в режиме абсорбции при длине волны 490 нм с щелью 8,00×0,40 мм со скоростью 20 мм/с и разрешением 100 мкм/шаг. Результаты сканирования обрабатываются автоматически с помощью специализированной программы «winCATS», версия 1.4.9 с использованием фильтра Savitsky – Golay 7 (цифровой фильтр, который может быть применен к ряду цифровых точек данных в целях сглаживания данных, то есть, чтобы увеличить отношение сигнал – шум, значительно не искажая сигнал). Полученные денситограммы и результаты их обработки приведены в приложении 2,3,4,5. В таблицах 2.6 и 2.7 приведены данные о количественном содержании обнаруженных липидных веществ в исследуемых экстрактах. Для количественного анализа стеринов, терпеноидов, жирных кислот, триглицеридов, углеводородов, ФХ и ГлЦер1 и ГлЦер2 в анализируемых экстрактах на пластины наносили растворы соответствующих веществ – стандартов. По площади (S) полученных пиков соответствующих веществ – стандартов на хроматограмме построены калибровочные графики (таблица 2.5). По 33

ним определили содержание отдельных групп липидов в анализируемых экстрактах из корней пшеницы. Полученные результаты приведены в таблице 2.8-2.13. А Б Рисунок 2.2 – Хроматограммы полярных липидов в экстрактах корней пшеницы после нагревания пластины при 150 °С 5 минут (А) и 20 минут (Б) Таблица 2.5 – Калибровочные графики зависимости площади пика от количества вещества, построенные по веществам – стандартам Вещества стандарты Количество вещества β-ситостерол фосфатидилхолин терпеноиды жирные кислоты углеводороды (сквален) гликоцерамид 1 гликоцерамид 2 2; 4; 6; 8; 10 4; 6; 8 0,2; 0,3; 0,4 4; 6; 8 4; 6; 8 2,4; 3,6; 4,8 1,6; 2,4; 3,2 Полученное калибровочное уравнение (по площади пиков) у=4812,461+668,782х у=1629+864,6х у=1344+5,852х у=2512+519,2х у=4081+651х у= 4703+2020х у= 2336+2365х 34 Единица измерени я мкг мкг мкг мкг мкг мкг мкг r; sdv 0,96; 6,88 0,97; 9,47 0,99; 2,57 0,99; 0,97 0,99; 3,07 0,99; 1,44 0,99; 0,53

Таблица 2.6 – Состав и содержание полярных липидов в экстрактах из корней пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ, (n=3) Rf 0,1 5 0,1 7 0,3 1 0,3 8 0,4 5 0,4 9 0,5 7 0,6 6 0,7 2 0,7 4 0,8 0 0,8 3 0,8 7 0,9 3 0,9 9 Контроль 1,06±0,03 Содержание полярных липидов в экстракте корней пшеницы, % *** СaCl2 (10-3 М) β-ситостерин (5∙10-4 М) Нистатин (10-4 М) Тритон Х-100 (1,6∙10-5 М) 0,95±0,25 1,42±1,05 1,03±0,69 1,50±0,36 0,62±0,48 1,79±0,53 1,06±0,52 1,20±0,85 1,55±0,80 3,18±0,22 3,37±0,39 2,72±0,52 3,17±0,45 3,96±0,86 19,34±1,4 9 7,62±0,98 18,13±2,54 15,07±1,73 18,65±1,27 15,87±1,08 10,57±0,31 7,15±0,32 8,41±1,04 9,37±1,55 2,75±0,24 2,65±0,25 2,21±0,37 2,57±0,15 1,98±0,46 1,88±0,44 2,03±0,13 1,43±0,09 1,82±0,16 2,05±0,70 13,37±1,0 2 6,00±0,51 12,71±0,11 11,74±0,38 13,58±0,27 13,19±0,02 6,25±0,52 5,73±0,19 6,54±0,44 6,39±0,12 6,57±1,07 6,39±0,91 4,74±0,18 5,53±0,71 5,38±0,33 3,45±0,51 3,23±0,51 3,99±0,45 3,24±0,66 5,21±0,47 4,79±0,76 4,66±1,02 6,17±1,04 4,13±0,58 6,19±0,28 3,17±0,61 3,84±0,77 3,65±0,82 3,46±0,67 2,62±0,13 12,03±1,1 4 14,95±2,2 5 9,78±0,90 19,89±2,82 11,83±1,20 35 9,91±1,07 13,64±0,69 13,06±1,23 14,35±1,53 14,88±2,95 Отнесение ФС ФИ ФХ* ФГ дифосфатидилглицерин ДГДГ ФЭ ГлЦер 1* ГлЦер 2* МГДГ сумма сопутствующих соединений

*- отнесение в сопоставлении с литературными данными [40] **- отнесение путем сопоставления Rf пятна с Rf вещества-стандарта ***- распределение липидов по площади пиков Таблица 2.7 – Состав и содержание нейтральных липидов в экстрактах из корней пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ, (n=3) Rf 0,04 Контроль 42,22±2,47 Содержание нейтральных липидов в экстракте корней пшеницы, % *** СaCl2 (10-3 М) β-ситостерин (5∙10-4 М) нистатин (10-4 М) Тритон Х-100 (1,6∙10-5 М) 41,77±1,05 40,86±2,12 39,81±2,38 39,21±2,29 0,14 3,66±0,54 3,95±0,17 4,71±0,62 3,48±0,63 0,18 13,98±1,08 12,47±0,43 21,41±1,92 11,48±0,28 0,21 2,42±0,45 4,27±0,19 3,09±0,86 7,42±1,14 0,25 3,32±0,92 3,66±0,63 2,96±0,22 3,42±0,85 0,33 0,91±0,14 1,20±0,19 1,20±0,06 1,18±0,11 0,41 0,77±0,13 1,02±0,03 0,62±0,10 0,84±0,08 0,51 10,31±0,55 7,47±0,43 6,35±0,46 9,67±1,36 0,65 0,88±0,07 0,86±0,11 0,80±0,16 0,74±0,12 0,92 3,33±1,25 3,21±0,45 2,46±0,42 2,44±0,55 0,98 4,66±0,66 6,04±0,45 3,92±0,72 5,19±0,74 1,00 13,56±1,94 14,08±0,71 11,63±1,15 14,34±1,02 *- отнесение в сопоставлении с литературными данными [40] **- отнесение путем сопоставления Rf пятна с Rf вещества-стандарта ***- распределение липидов по площади пиков 7,46±0,46 12,68±0,38 4,23±0,60 4,96±0,29 1,00±0,18 0,89±0,08 8,71±0,36 0,56±0,14 3,50±0,99 4,69±0,62 12,10±1,12 36 Отнесение сумма сопутствующих соединений 1,2-диглицериды* стерины** высшие спирты* терпеноиды* жирные кислоты** триглицериды** эфиры стеринов* углеводороды, сквален**

Таблица 2.8 – Содержание ФХ в экстрактах из корней пшеницы, выращенной при различном стрессовом воздействии, n=3 Содержание ФХ* Объект исследования в экстракте, мкг мкг/г сыр.в. корней 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Экстракт корней контроль 18178,0 16277,0 19,14 16,94 191,41 169,42 Экстракт корней модель 1 18185,0 18070,1 18271,3 19,15 19,02 19,25 191,49 190,16 192,49 Экстракт корней модель 2 13565,0 13285,3 12176,9 13,81 13,48 12,20 138,05 134,82 122,00 Экстракт корней модель 3 14270,0 14984,2 16195,8 14,62 15,45 16,85 146,21 154,47 168,48 Экстракт корней модель 4 14923,0 16488,6 15,38 17,19 153,76 171,87 * данные рассчитаны с использованием калибровочного графика зависимости площади пика от количества вещества Площадь пика, AU Таблица 2.9 – Содержание стеринов в экстрактах из корней пшеницы, выращенной при различном стрессовом воздействии, n=3 Площадь пика, AU Объект исследования Экстракт корней контроль Экстракт корней модель 1 Экстракт корней модель 2 Экстракт корней модель 3 Экстракт корней модель 4 1 7022,0 6820,2 5544,0 7099,7 2 7439,0 7177,0 13466,9 5607,0 7184,4 3 7360,7 6898,5 12934,8 5515,8 7305,0 1 3,30 3,00 1,09 3,42 37 Содержание стеринов* в экстракте, мкг мкг/г сыр.в. корней 2 3 1 2 3 3,93 3,81 33,04 39,27 38,10 3,54 3,12 30,02 35,36 31,19 12,94 12,14 129,41 121,45 1,19 1,05 10,94 11,88 10,52 3,55 3,73 34,20 35,47 37,27

* данные рассчитаны с использованием калибровочного графика зависимости площади пика от количества вещества Таблица 2.10 – Содержание ГлЦер 1 в экстрактах из корней пшеницы, выращенной при различном стрессовом воздействии, n=3 Содержание ГлЦер 1* в экстракте, мкг мкг/г сыр.в. корней 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Экстракт корней контроль 3514,9 6248,7 6055,6 0,77 0,67 7,65 6,70 Экстракт корней модель 1 4642,1 7206,5 7485,3 1,24 1,38 12,39 13,77 Экстракт корней модель 2 4411,9 5369,2 5148 0,33 0,22 3,30 2,20 Экстракт корней модель 3 4287,9 5791,9 5571,5 0,54 0,43 5,39 4,30 Экстракт корней модель 4 5653,8 7064,5 0,47 1,17 4,71 11,69 * данные рассчитаны с использованием калибровочного графика зависимости площади пика от количества вещества Объект исследования Площадь пика, AU Таблица 2.11 – Содержание ГлЦер 2 в экстрактах из корней пшеницы, выращенной при различном стрессовом воздействии, n=3 Объект исследования Экстракт корней контроль Экстракт корней модель 1 Площадь пика, AU 1 3484,6 4294,2 2 6964,8 7298,8 3 7052,2 8341,1 38 Содержание ГлЦер 2* в экстракте, мкг мкг/г сыр.в. корней 1 2 3 1 2 3 0,49 1,96 1,99 4,86 19,57 19,94 0,83 2,10 2,54 8,28 20,98 25,39

Экстракт корней модель 2 3656,4 4404,1 4282 0,56 0,87 0,82 5,58 Экстракт корней модель 3 3346,3 5049,4 4880,3 0,43 1,15 1,08 4,27 Экстракт корней модель 4 4613,7 6130,8 0,96 1,60 9,63 * данные рассчитаны с использованием калибровочного графика зависимости площади пика от количества вещества 8,74 11,47 16,05 8,23 10,76 Таблица 2.12 – Содержание терпеноидов в экстрактах из корней пшеницы, выращенной при различном стрессовом воздействии, n=3 Содержание терпеноидов* Объект исследования в экстракте, мкг мг/г сыр.в. корней 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Экстракт корней контроль 1118,6 1823,1 2414,4 81,87 182,91 0,82 1,83 Экстракт корней модель 1 1625,1 1951,9 2584,6 48,03 103,88 212,00 0,48 1,04 2,12 Экстракт корней модель 2 1452,6 1634,2 1840,8 18,56 49,59 84,89 0,19 0,50 0,85 Экстракт корней модель 3 1374,7 2086 1492,4 5,25 126,79 25,36 0,05 1,27 0,25 Экстракт корней модель 4 2655,8 2656,3 3159,9 224,16 224,25 310,30 2,24 2,24 3,10 * данные рассчитаны с использованием калибровочного графика зависимости площади пика от количества вещества Площадь пика, AU Таблица 2.13 – Содержание углеводородов в экстрактах из корней пшеницы, выращенной при различном стрессовом воздействии, n=3 Площадь пика, AU Объект исследования Экстракт корней контроль 1 5330,5 2 8453,6 3 7675 39 Содержание углеводородов * в экстракте, мкг мкг/г сыр.в. корней 1 2 3 1 2 3 1,92 6,72 5,52 67,17 55,21

Экстракт корней модель 1 7352,8 8788,8 7510,1 5,03 7,23 5,27 50,26 Экстракт корней модель 2 6613,2 6917,8 6039,1 3,89 4,36 3,01 38,90 43,58 Экстракт корней модель 3 7416 7030 6383,6 5,12 4,53 3,54 51,23 45,30 Экстракт корней модель 4 7088,9 7024,4 6453,7 4,62 4,52 3,64 46,20 45,21 * данные рассчитаны с использованием калибровочного графика зависимости площади пика от количества вещества 40 52,67 30,08 35,37 36,45

2.5 Определение проницаемости и фазового состояния мембран клеток корней пшеницы У проростков, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ, анализировали выход электролитов и индекс мембранной стабильности по методике, описанной в п. 2.6.2. Полученные данные приведены в таблице 3.1. Из проростков пшеницы, выращенных на средах с добавлением различных мембранотропных веществ, выделяли микросомальную фракцию и исследовали фазовое состояние мембран по методике, описанной в разделе 2.6.3. Полученные результаты приведены в таблице 3.2. 2.6 Общие методы исследования 2.6.1 Инструментальная тонкослойная хроматография Инструментальная ТСХ проводилась на лабораторном комплексе «CAMAG» (Швейцария). В состав комплекса входят приборы: «Linomat 5» – для автоматического нанесения экстрактов на хроматограмму, «ADS 2» – для элюирования хроматограммы в системе растворителей, «TLS Scanner 4» – для денситометрической осуществляется обработки через хроматограммы. компьютер с помощью Работа комплекса специализированной компьютерной программы «winCATS», версия 1.4.9. Для хроматографии использовали классические ТСХ пластины на стекле, силикагель 60, размером 10*20 см, «Е. MERCK KgaA» (1.00384.0001), которые перед анализом элюировали в этаноле, и активировали нагреванием 120°С 20 мин. Для разделения использовали системы растворителей: №1 – петролейный эфир – этиловый эфир – уксусная кислота (80:20:1); № 2 – хлороформ – метанол – вода (65:25:4). Для дериватизации использовали реагент – 5 % раствором H2SO4 в этаноле. Пластину опрыскивали реагентом с помощью 41

ручного пульверизатора (Ленхром), высушивали, переносили в сушильный шкаф и нагревали 20 мин при температуре 150°С. 2.6.2 Определение выхода электролитов и индекса мембранной стабильности Навеску корней (100 мг) промывали в бидистиллированной воде 2 – 3 раза, затем помещали в бюксы с бидистиллированной водой (10 мл) и инкубировали 30 мин в термостате при температуре 50°С. С помощью кондуктометра Cond 7310 (WTW, Германия) в растворе инкубации измеряли электропроводность. Затем пробу кипятили в течение 30 и определяли полный выход электролитов. Выход электролитов рассчитывали по формуле Выход электролитов = (С1/С2) × 100%, где С1 – электропроводность после инкубации в течении 30 мин при температуре 40°С; С2 – электропроводность после инкубации в течение 30 мин при кипячении. Индекс мембранной стабильности рассчитывали по формуле Индекс мембранной стабильности = (1–С1/С2) × 100%. 2.6.3 Определение величины генерализационной поляризации возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах микросомальной фракции растительных клеток Корни (10 г) разрезали на фрагменты, затем размельчили в блендере с 20 мл буфера А и защитными реагентами (1г поливинилпирролидона и 0,0015г дитиотрийтола) + фенилметан сульфонил флуорид 1 мМ (2 мл из 100 мМ стока). Полученный гомогенат отфильтровали через нейлоновую сетку в стакан. Далее фильтрат центрифугировали 10 мин при 3 200 об/мин при 4 оС 42

(в заранее охлажденной центрифуге). Полученный супернатант повторно центрифугировали 20 мин при 11 500 об/мин при 4оС. Осадок из центрифужной пробирки ресуспендировали в 6 мл буфера С и использовали для исследования. Его разделили на 3 части по 2 мл, добавили 20 мкл 1мМ раствора лаурдана и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. Измерение проводили на спектрофлуориметре ФЛЮОРАТ – 02 – ПАНОРАМА (Россия) при длине волны 360 нм. Обобщенная поляризация возбуждения была получена из уравнения ГП = (I430 - I490)/(I430 + I490), где I430 и I490 являются интенсивностей излучения при 430 и 490 нм. 2.7 Статистическая обработка результатов Опыты проводили в трех биологических повторностях для каждой из которых эксперименты выполняли трижды (3 аналитические повторности). Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась путем расчета стандартного отклонения с программы Microsoft Excel. 43 использованием компьютерной

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 3.1 Обоснование исследования Растения играют важную роль в жизни человека. Наряду с тем, что флора является неотъемлемой частью биосферы и осуществляет уникальную фотосинтетическую функцию, растения имеют существенное прикладное значение в жизнедеятельности человека. Они дают человеку пищу, а также строительный материал, сырье для промышленности (смолу, масло, каучук, дубильные вещества, спирт и др.). Кроме того, растения обладают уникальными вторичными метаболитами, на основе которых производят разнообразные лекарственные средства. Продуктивность сельскохозяйственных растений во многом зависит от климата и значительно снижается при неблагоприятных условиях. Большинство сельскохозяйственных культур испытывают серьезные угрозы от воздействия абиотических стрессоров, таких как засуха, засоление, экстремальные температуры, химическая токсичность, УФ-излучение и окислительный стресс. Например, при охлаждении (замораживании) мембраны растений выступают в роли своеобразной мишени, которые принимают удар на себя, и часто это приводит к их повреждению и разрушению растительной клетки в целом [41, 42]. На мембраны растительных клеток могут действовать не только физические факторы окружающей среды, но и различные химические соединения, которые относят к мембранотропным веществам. Анализ литературных данных показал, что действие мембранотропных веществ на клетки растений мало изучено, в связи с чем проведение исследований в этой области перспективно определить является влияние актуальным. мембранотропных В частности, веществ на компонентный состав мембран и их характеристики, такие как текучесть и проницаемость. Полученные результаты будут иметь фундаментальное и 44

прикладное значение и на их основе могут быть разработаны рекомендации для растениеводства. В настоящей работе в качестве объекта исследования была взята пшеница Triticum aestivum L. сорта Казанская юбилейная, которая является основной зерновой культурой, возделываемой в Республике Татарстан. В качестве мембранотропных веществ были выбраны соединения, уплотняющие мембрану, такие как CaCl2 (10-3 М) и β-ситостерин (5∙10-4 М), а также вещества, которые проявляют противоположное воздействие на мембрану и значительно увеличивают ее проницаемость, – нистатин (10-4 М) и тритон Х-100 (1,6∙10-5 М). В работе проростки пшеницы выращивали на питательных средах с добавлением различных мембранотропных веществ в течение 4 суток. При исследовании влияния на клеточные мембраны детергента – тритон Х-100, для обработки уже брались выращенные корни пшеницы. К ним добавляли раствор детергента, тщательно перемешивали и оставляли на 3 часа для воздействия, после чего их отмывали и брали для анализа. 3.2 Исследование влияния мембранотропных веществ на проницаемость мембран клеток корней пшеницы Важной характеристикой состояния мембран является индекс мембранной стабильности, который рассчитывается по выходу из тканей проростков электролитов. В таблице 3.1 приведены полученные результаты анализа этих показателей для клеток корней пшеницы при воздействии на них мембранотропных веществ в сравнении с контролем. Известно, что хлорид кальция – классический мембранный стабилизатор. Ион Ca2+ связывается с мембранами и образует мостики между отрицательно заряженными группами двух соседних белковых молекул (а также липидов) мембран [43]. Кроме того, ион Ca 2+, связанный с отрицательно заряженной группой, способен отбирать воду, поэтому он 45

вызывает частичную дегидратацию мембран. Эти свойства ионов Са 2+, согласно [44], являются факторами, стабилизирующими структуру мембраны. Полученные в работе результаты согласуются с литературными данными. Из клеток корней проростков пшеницы, выращенных на среде с хлоридом кальция в концентрации 10-3 М, выход электролитов по сравнению с контролем в 1,3 раза ниже, а индекс мембранной стабильности клеток корней пшеницы увеличился почти на 7,0 % (таблица 3.1). Таблица 3.1 – Выход электролитов и индекс мембранной стабильности в корнях проростков пшеницы при действии различных мембранотропных веществ (n=3) Объект исследования Корни пшеницы Мембранотропное вещество контроль хлорид кальция (10-3 М) β-ситостерин (5∙10-4 М) нистатин (10-4 М) тритон Х-100 (1,6∙10-5 М) Выход электролитов, % 26,4±0,3 19,5±5,1 22,3±1,3 24,8±2,1 54,5±10,7 Индекс мембранной стабильности, % 73,6 80,5 77,7 75,2 45,5 Увеличение индекса мембранной стабильности на 4,7 % по сравнению с контролем наблюдается также для клеток корней пшеницы, выращенных на среде с β-ситостерином в концентрации 5∙10-4 М. Известно, что β-ситостерин является одним из основных стеринов, содержащихся в плазматической мембране растительных клеток, и обладает способностью к их упорядочиванию, регулированию проницаемости и текучести [45]. Нистатин – мембраннотропное вещество, которое нарушает структурную организацию мембран путем связывания со стеринами, входящих в их состав, и образования пор. В результате этого взаимодействия увеличивается ионная проницаемость мембран, происходит потеря клеткой воды, аминокислот и других компонентов [46; 47]. В работе [47] показано, что уже с первых минут действия нистатина на корни проростков пшеницы происходит резкое увеличение проницаемости мембран для электролитов и деполяризация плазматической мембраны. В нашем исследовании использована даже более высокая концентрация нистатина по сравнению с 46

[46], однако показано, что индекс мембранной стабильности в корнях пшеницы, выращенных на среде с нистатином, практически не отличается от контроля. В предыдущих работах [47, 48] исследование с нистатином проводились на отсеченных корнях пшеницы в течение 1-6 ч, т е. на фоне раневого стресса. В наших экспериментах действию нистатина подвергались интактные проростки пшеницы, которые выращивались на растворе нистатина в течение 4 суток. В связи с этим, можно предположить, что у интактных растений, адаптационный ресурс которых значительно выше, чем у отсеченного органа, происходит адаптация к действию нистатина. Возможно, происходит «залечивание» образовывавшихся в первоначальный период нистатиновых пор [49] и восстановление исходной проницаемости клеточных мембран и индекса мембранной стабильности корней пшеницы. Тритон Х-100 (октилфенилполиэтиленгликольный эфир) – это неионный детергент, используемый для разрушения мембран. Механизм его действия основан на извлечении мембранных фосфолипидов и разрушении их комплексов с белками [50]. Показано, что из клеток корней проростков пшеницы вследствие их обработки тритоном Х–100 выход электролитов увеличивается в 2 раза по сравнению с контролем, и почти на 28 % снижается индекс мембранной стабильности (таблица 3.1). Из всех примененных мембраннотропных веществ тритон Х–100 оказал самое сильное воздействие на мембраны растительных клеток корней пшеницы. 3.3 Исследование липидного профиля в экстрактах из клеток корней пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ Из проростков корней, полученных, как и в контрольном, так и в опытных вариантах, извлекали сумму липидов по методу [38] с модификациями [39] и определяли их выход гравиметрическим методом (рисунок 3.1). 47

Установлено, что выход липидных веществ из контрольного образца – корней пшеницы, выращенных без воздействия мембранотропных веществ, составляет около 0,14 %. Из клеток корней пшеницы, выращенных в присутствии хлорида кальция, β-ситостерина и нистатина, выход липидов по сравнению с контролем незначительно возрастает, в среднем на 0,02 %. Наибольшее количество липидов было получено при экстракции клеток корней пшеницы, обработанных после выращивания детергентом – тритоном Х–100 – около 0,6 %. Это почти в 4,5 раза выше, чем в контроле и других опытных образцах. Учитывая сильное повреждающее действие тритона Х – 100 на мембраны, можно предположить, что в клетках начинается усиленный синтез липидов, необходимых для их восстановления, и поэтому содержание липидов в опытном образце выше, чем в других и в контроле. Другим возможным объяснением более высокого выхода липидов из клеток корней пшеницы, обработанных тритоном Х – 100, является то, что детергент увеличивает доступность липидов к извлечению за счет их высвобождения из мембранных клеточных структур. Оба высказанных предположения требуют проверки и проведения новых экспериментов. Контроль CaCl2 (10-3 М) β-ситостерин (5∙10-4 М) нистатин (10-4 М) тритон Х – 100 (1,6∙10-5 М) Рисунок 3.1 – Выход липидных веществ из корней пшеницы, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ 48

Для понимания тех изменений, которые происходят в клетках при воздействии мембранотропных веществ представляется целесообразным исследовать их липидный профиль. С этой целью в работе была применена тонкослойная хроматография, осуществляемая на оборудовании фирмы «CAMAG». В суммарных экстрактах липидов из контрольного и опытных образцов корней пшеницы анализировали состав нейтральных и полярных липидов с применением различных систем растворителей (п. 2.6.1). Для обнаружения разделенных на ТСХ пластинах липидов их обрабатывали неспецифическим проявителем – 5 % раствором серной кислоты в этаноле. На рисунке 2.1 и 2.2 приведен вид полученных ТСХ пластин анализа состава полярных и нейтральных липидов в исследуемых экстрактах в видимом свете после дериватизации. Отнесение обнаруженных липидных веществ в экстрактах осуществляли путем сопоставления их Rf с Rf веществ – стандартов ФХ, ГлЦер 1 и ГлЦер 2, стеринов (Ст), терпеноидов (Т), жирных кислот, триглицеридов (ТАГ), углеводородов, включая сквален (Ув,С) и с литературными данными [21]. Количественное содержание обнаруженных липидов в экстрактах определяли денситометрией на приборе «TLS Scanner 4». Для расчета точного содержания отдельных липидов в исследуемых экстрактах из корней проростков пшеницы были использованы калибровочные графики, построенные по чистым веществам – стандартам (таблица 2.5). На рисунках 3.2 и 3.3 представлены результаты количественного содержания нейтральных липидов, обнаруженных в исследуемых экстрактах. Показано что, они имеют разнообразный качественный состав и включают, как омыляемые (ацилглицериды, эфиры стеринов), так и неомыляемые липиды (стерины, терпеноиды, ЖК и др.). Во всех исследуемых экстрактах основными липидами являются стерины и углеводороды, включая сквален, занимающие около 12 % от суммы липидных веществ. Содержание ацилглицеридов (ТАГ и ДАГ), являющихся основными запасными липидами, составляет в среднем 10-16 %, тогда как на долю ЖК 49

приходится не более 1 %. Содержание остальных обнаруженных нейтральных липидов в исследуемых экстрактах значительно ниже (рисунок 3.2). контроль CaCl2 (10-3 M) β-ситостерин (5∙10-4 М) нистатин (10-4 М) тритон Х – 100 (1,6 ∙10 -5 М) Рисунок 3.2 – Содержание нейтральных липидов в экстрактах из корней проростков пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ контроль CaCl2 (10-3 M) β-ситостерин (5∙10-4 М) нистатин (10-4 М) тритон Х – 100 (1,6 ∙10 -5 М Рисунок 3.3 – Количество отдельных групп нейтральных липидов в экстрактах из корней проростков пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ Анализируя действие мембранотропных веществ на липидный профиль клеток корней пшеницы стоит отметить, что при их выращивании на среде с β-ситостерином, по сравнению с контролем в 3,4 раза увеличивается содержание стеринов (рисунок 3.3). Это указывает на то, что растительные 50

клетки способны использовать β-ситостерин из питательной среды, для образования клеточных мембран, и за счет этого повышается их стабильность по сравнению с контролем (таблица 3.1). В экстракте из корней пшеницы, выращенных на среде с нистатином, наоборот наблюдается резкое снижение количества стеринов, в 3,3 раза по сравнению с контролем и другими опытными объектами. Учитывая, что нистатин специфически связывается со стеринами, входящими в состав клеточных мембран, вследствие чего нарушается их структурная организация, за счет чего происходит сокращение доли стеринов в составе клеточных мембран. При воздействии на клетки корней другим мембранотропом – тритоном Х–100, который показал самое сильное повреждающее действие на клеточные мембраны (таблица 3.1), в липидном профиле также наблюдаются изменения по сравнению с контролем. Установлено, что в их составе увеличивается в 2 раза количество терпеноидов. Это подтверждает высказанное ранее предположение о том, что в клетках, обработанных тритоном Х – 100, начинается усиленный синтез липидов для восстановления поврежденных мембран и сохранения жизнеспособности растения. Известно, что терпеноиды являются предшественниками в биосинтезе стеринов, выполняющих как структурную, так и регуляторные функции в клетках [51] (рисунок 3.4). 51

Брассиностероиды – растительные гормоны: регуляция роста и развития растений Структурная функция Рисунок 3.4 – Схема биосинтеза стеринов у растений, их биологическая роль [51] На рисунках 3.5 и 3.8 представлены результаты количественного определения, полярных липидов обнаруженных в исследуемых экстрактах. Установлено, что состав фосфолипидов, обнаруженных во всех исследуемых экстрактах, представлен различными соединениями. Среди них наибольшее количество (около 19 и 13 %, соответственно) приходится на ФХ и ФЭ. 52

Б А контроль CaCl2 (10-3 M) β-ситостерин (5∙10-4 М) нистатин (10-4 М) тритон Х – 100 (1,6 ∙10 -5 М Рисунок 3.5 – Содержание фосфолипидов в экстрактах из корней проростков пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ: А –содержание по денситограмме (по площади пиков); Б – количество ФХ , рассчитанное по калибровочному графику Эти соединения являются главными липидными компонентами в клетках высших растений и метаболически связаны друг с другом (рисунок 3.6) [52]. Предшественником их синтеза является фосфатидилсерин, содержание которого в исследуемых экстрактах почти в 13-16 раза ниже, по сравнению с ФХ и ФЭ. Рисунок 3.6 – Пути биосинтеза важнейших фосфолипидов [52] 53

Как видно на рисунке 3.5 А, в корнях пшеницы при воздействии мембранных веществ, за исключением хлорида кальция, по сравнению с контролем снижается содержание ФХ. Наименьшее его содержание 131,62 ± 8,5 мкг/г сыр. веса отмечено в экстракте из корней пшеницы, выращенных при действии β-ситостерина (рисунок 3.5 Б). Именно в этом экстракте в отличие от остальных опытных образцов увеличивается почти в 3,4 раза доля стеринов в липидном профиле. Очевидно, что выявленные изменения в липидном составе корней пшеницы взаимосвязаны между собой. По – видимому, дополнительное встраивание стеринов в клетки мембраны происходит путем замещения структур фосфолипида – ФХ в пропорции 2,4 : 1,0. Определение количества ФИ, являющегося основным компонентом митохондриальных мембран, позволило установить в исследуемых экстрактах, что в корнях пшеницы при воздействии всех применяемых мембранотропных веществ, его содержание увеличивается в 1,7 – 2,9 раза. Это свидетельствует о том, что в растительных клетках в ответе на стресс при воздействии мембраннотропных веществ значительную роль берут на себя митохондрии. Об этом также свидетельствуют изменения содержания в экстрактах из опытных образцов другого фосфолипида – дифосфатидилглицерин (ДФГ), входящего в митохондриальные мембраны и играющего важную роль фофсфорилировании в фосфатидилинозитидном в переносе электронов митохондриях [52]. каскаде при и окислительном Известно, что в фосфорилировании фосфотидилинозита в мембране образуется фосфатидилинозит – 4,5 – дифосфат. Далее это соединение расщепляется мембрано-связанным ферментом фосфолипазой С на инозиттрифосфат и диацилглицерин (ДАГ) (рисунок 3.7). ДАГ является физиологическим активатором особой протеинкиназы С (связана с молекулой ФС расположенной на цитозольной стороне клеточной мембраны), которая участвует в регуляции многочисленных клеточных процессов, фосфорилируя различные белки – 54

мишени и некоторые факторы роста, следовательно, обеспечивает клеточные ответы [53]. Рисунок 3.7 – Фосфатидилинозитидный каскад: взаимосвязь ДАГ, инозиттрифосфата и Са2+ в качестве вторичных посредников: ADP – аденозиндифосфат, ATP – аденозинтрифосфат, GDP – гуанозиндифосфат, GTP – гуанозинтрифосфат, PIP2 – фосфатидилинозит – 4,5 – дифосфат, DAG – диацилглицерид, IP3 – инозитрифосфат [53] А контроль CaCl2 (10-3 M) Б β-ситостерин (5∙10-4 М) нистатин (10-4 М) тритон Х – 100 (1,6 ∙10 -5 М Рисунок 3.8 – Содержание гликолипидов в экстрактах из корней проростков пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ: А – содержание по денситограмме (по площади пиков); Б – количество ГлЦер 1 и 2, рассчитанное по калибровочному графику 55

Среди гликолипидов, идентифицированных в исследуемых экстрактах, обнаружены гликоцерамиды моногалактозилдиацилгрицерид двух (МГДГ) типов и (рисунок 3.9), дигалактозилдиацилгрицерид (ДГДГ) (рисунок 3.8 А). Известно, что эти соединения являются важными мембранными липидными компонентами в растениях. Хотя они не считаются основными компонентами непластидных мембран, изменения в их содержании часто наблюдаются в условиях стресса, что свидетельствует об их важной роли в приобретении толерантности к стрессам у растений [54]. Рисунок 3.9 – Путь синтеза сложных гликолипидов [55] Анализ гликолипидов в исследуемых экстрактах из опытных образцов корней по сравнению с контролем показал, что например, при воздействии βситостерина на корни пшеницы в липидном профиле их содержание существенно изменяется – почти в 2,0 раза увеличивается содержание МГДГ и одновременно с этим в 2,0 раза снижается доля ГлЦер 1 и ГлЦер 2 (рисунок 3.9 Б) по сравнению с контролем. Стоит отметить, что все выявленные изменения в липидном профиле этого опытного образца не влияют на стабильность мембран клеток (таблица 3.1). Также снижение доли ГлЦер 1 и ГлЦер 2 наблюдается в экстракте из корней пшеницы, выращенных при воздействии нистатина, и можно предположить, что это связано с протекающим процессом адаптации растения к этому мембранотропу. 56

3.4 Исследование влияния мембранотропных веществ на характеристики мембран клеток корней пшеницы В работе было микросомальной исследовано фракции клеток фазовое корней состояние пшеницы. мембран Выделяли миркоросомальную фракцию по методике, описанной в пункте 2.6.3, и проводили оценку текучести мембран. Текучесть отражает уровень организации липидов в бислое [56]. На сегодняшний день существуют различные современные методы исследования мембранной текучести. Флуоресцентный метод позволяет с помощью спиновых меток и флуоресцентных зондов оценить упаковку липидов в мембране. В нашей работе использовался флуоресцентный липофильный зонд лаурдан. Его флуоресценция в разных частях спектра позволяет выявить изменения в упорядоченности фосфолипидов в мембране, которая зависит от физического состояния липидного бислоя [57]. По изменению интенсивности излучения флуоресценции лаурдана проводят расчет важного показателя – генерализованная поляризация, по которому оценивают текучесть мембран. По данным литературы следует, что значение генерализованнной поляризации колеблется в пределе от «-1» до «+1». «-1» означает, водную фазу, тогда как значение ГП «+1» означает полностью упорядоченную фазу. Экспериментально эти значения зависят от липидного состава мембран, температуры окружающей среды и прочих факторов [33]. В результате проведенных нами исследований в таблице 3.2 показано, что действие хлорида кальция и β-ситостерина приводит к повышению значения ГП в 1,2 – 1,3 раза. Это может свидетельствовать об упорядочивании мембран. При действии тритона Х-100, на клетки корней проростков пшеницы наблюдался обратный эффект, значения ГП снижалось. Это говорит о том, что мембрана становится менее упорядоченной. Значение ГП при воздействии нистатина практически не изменяется по сравнению с контролем. Данные результаты согласуются с нашими 57 результатами

экспериментов по анализу выхода электролитов из клеток и индекса мембранной стабильности (таблица 3.1). Таблица 3.2 – Изменение фазового состояния клеток корней пшеницы, выращенных при воздействии различных мембранотропных веществ, (n=3) Воздействие на корни ГП контроль 0,16±0,01 хлорид кальция (10-3 М) 0,19±0,01 β-ситостерин (5∙10-4 М) 0,21±0,03 нистатин (10-4 М) 0,14±0,05 тритон Х-100 (1,6∙10-5 М) 0,11±0,01 58

ВЫВОДЫ 1) Установлено, что при воздействии хлорида кальция в липидном составе клеток корней пшеницы изменений не происходит, при этом увеличивается индекс мембранной стабильности на 7 %, по величине генерализованнной поляризации, полученной спектральным методом с флуоресцентным зондом, мембраны (в 1,2 раза) становятся более упорядоченными; 2) Показано, что при действии β-ситостерина в клетках корней пшеницы происходит увеличение мембранной стабильности на 4,7 % и упорядоченности липидного бислоя, что очевидно связано с обнаруженными изменениями в их липидном составе содержания следующих соединений – увеличением стеринов и моногалактозилдиацилгрицерида ( в 3,4 и 2 раза соответственно) и снижением фосфатидилхолина и гликоцерамидов (1,4 и 2 соответственно); 3) Выявлено, что в клетках корней пшеницы при выращивании на растворе нистатина в течении 4 суток не происходит снижения мембранной стабильности и упорядоченности мембран, что свидетельствует о более высоком адаптационном ресурсе растений к дестабилизирующему действию примененного мембранотропного соединения, в частности за счет уменьшения в липидном профиле количества стеринов (в 3,3 раза); 4) При обработке корней пшеницы тритоном Х – 100 наблюдается сильное повреждение клеточных мембран – увеличивается выход электролитов в 2 раза, и почти на 28 % снижается индекс мембранной стабильности. Это воздействие вызывает у растений стрессовый ответ. Показано, что происходит увеличение доли терпеноидов в сумме липидов, которые являются предшественниками биосинтеза стеринов, выполняющих в растениях регуляторную и структурную функции. 59

Список использованной литературы 1. Mazur, P. Freezing injury in plants / P. Mazur // Ann. Rev. Plant Physiol. -1969. - V. 20. - P. 419-448. 2. Dubey, R.S. Photosynthesis in plants under stressful conditions / R.S. Dubey // Ed. M. Pessarakli. - New York: Marcel Dekker Inc., 1997. - P. 859 – 875. 3. Рис, Э. Введение в молекулярную биологию. От клеток к атомам : [пер. с англ] / Э. Рис, М. Стернберг. – М.: Мир, 2002. – 142с. – Перевод изд: From cells to atoms an illustrated introduction to molecular biology / Anthony R. Rees, Michael J. E. Sternberg. – London : by Blackwell Scientific Publications, 1984. 4. Banfalvi, G. Permeability of biological membranes / G. Banfalvi. – Springer, 2016. – 263 p. 5. Holthuis, J.C.M. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis / J.C.M. Holthuis, A.K. Menon // Nature. – 2014. – V.510. – pp 48–57. 6. Lynch, D.V. An introduction to plant sphingolipids and a review of recent advances in understanding their metabolism and function / D.V. Lynch, T.M. Dunn // New Phytol. - 2004. - V.161. - P. 677–702. 7. Sena, F. Spectral phasor analysis reveals altered membrane order and function of root hair cells in Arabidopsis dry2/sqe1-5 drought hypersensitive mutant / F. Sena , M. Sotelo-Silveira , S. Astrada , M.A. Botella , L. Malacrida , O. Borsani // Plant Physiol Biochem. – 2017. – V. 119. – pp 224–231. 8. Martin, S. W. Lipid microdomains - plant membranes get organized / S. W. Martin, B. J. Glover, J. M. Davies, // Trends Plant Sci. – 2005. – V.10. – P. 263– 265. 9. Bhat, R.A. Lipid rafts in plants / R.A. Bhat, R. Panstruga // Planta – 2005. – V. 223. – P. 5–19. 10. Jacobson, K. Lipid rafts: at a crossroad between cell biology and physics / K. Jacobson, O.G. Mouritsen, R.G. Anderson // Nat. Cell Biol. – 2007. – V. 9. – P. 7–14. 11. Fielding, C.J. Membrane cholesterol and the regulation of signal transduction / C. J. Fielding, P. E. Fielding // Biochem. Soc. Trans. – 2004. –V.32. – P.65–69. 12. Grosjean, K. Differential effect of plant lipids on membrane organization: Specificities of phytosphingolipids and phytosterols / K. Grosjean, S. Mongrand, 60

L. Beney, F. Simon-Plas, P. Gerbeau-Pissot // J. Biol. Chem. – 2015. – V. 290. – pp 5810–5825. 13. Ando, J. Sphingomyelin distribution in lipid rafts of artificial monolayer membranes visualized by raman microscopy / J. Ando, M. Kinoshita, J. Cui, H. Yamakoshi, K. Dodo, K. Fujita, M. Murata, M. Sodeoka // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2015. – V. 112. – pp 4558–4563. 14. Pike, L.J. Cholesterol depletion delocalizes phosphatidylinositol bisphosphate and inhibits hormone-stimulated phosphatidylinositol turnover / L. J. Pike and J. M. Miller // J. Biol. Chem. - 1998. - V. 273. – P. 22298–22304. 15. Burkart, R. Dynamic complexity: plant receptor complexes at the plasma membrane / R. Burkart, Y. Stahl // Current Opinion in Plant Biology. – 2017. – V. 40. – .pp 15–21. 16. Schapire, A. Plasma membrane repair in plants / A. Schapire, V. Valpuesta, M. Botella // Plant Science. – 2009. – V.14. – pp 645–652. 17. Volkov, A. Cold plasma interactions with plants: Morphing and movements of Venus flytrap and Mimosa pudica induced by argon plasma jet / A. Volkov, K. Xu, V. Kolobovc // Bioelectrochemistry. – 2017. – V. 118. – pp 100–105. 18. Baloyi, N. Proteomic analysis of Arabidopsis plasma membranes reveals lipopolysaccharide-responsive changes /N. Baloyi, A. Dubery, A. Piater // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2017. – V. 486. – pp 1137–1142. 19. Валитова, Ю.Н. Связывание стеринов влияет на функционирование мембран и состав сфинголипидов в корнях пшеницы / Ю.Н. Валитова, Е.Р. Котлова, А.В. Новиков, А.Л. Шаварда, К.А. Артеменко, Р.А. Зубарев, Ф.В. Минибаева // Биохимия. – 2010. – Т. 75(5). – С. 644 – 653. 20. Valitova, J.N. Effects of sterol-binding agent nystatin on wheat roots: The changes in membrane permeability, sterols and glycoceramides / J.N. Valitova, F.V. Minibayeva, E.R. Kotlova, A.V. Novikov, A.L. Shavarda, L.I. Murtazina, I.S. Ryzhkina // Phytochemistry. – 2011. – V. 72(14-15). – P. 1751–1759. 21. Valitova, J. Sterol binding by methyl-b-cyclodextrin and nystatin comparative analysis of biochemical and physiological consequences for plants / J. Valitova, A. Sulkarnayeva, E. Kotlova, A. Ponomareva, F. Mukhitova, L. 61

Murtazina, I. Ryzhkina, R. Beckett , F. Minibayeva // FEBS J. – 2014. – V. 281(8). – P. 2051–2060. 22. Сулкарнаева, А.Г. Cтрессиндуцированные изменения мембранныхстеринов в корнях пшеницы / А. Г. Сулкарнаева, Ю. Н. Валитова, Ф. К. Мухитова, Ф. В. Минибаева // Доклады академии наук. – 2014. – Т. 455, № 2. – С. 229–231. 23. http://old.pskgu.ru/ebooks/revinbio/revinbio_2_21.pdf 24. Carde, J. Electron Microscopyof Plant Cell Membrans / J. Carde // Methods in Enzymology. – 1987. – V. 148. – pp 599–622. 25. Kobayashi, S. Confocal cryomicroscopic analysis and cryodynamics of endoplasmic reticulum in herbaceous plant cells / S. Kobayashi, N. Kutsuna, K.Tanino, Y. Kawamura // Environmental and Experimental Botany. – 2014. – V. 106. – pp 44– 51. 26. Pabst, G. Applications of neutron and X-ray scattering to the study of biologically relevant model membranes / G. Pabst, N. Kucerka, M.-P. Nieh, M.C. Rheinstädter, J. Katsaras // Chemistry and Physics of Lipids. – 2010. – V. 163. – pp 460–479. 27. Bonaventura, G. Laurdan monitors different lipids content in eukaryotic membrane during embryonic neural development. C/ G. Bonaventura, M.L. Barcellona, O. Golfetto, J.L. Nourse, L.A. Flanagan, E. Gratton. //ell biochemistry and biophysics. – 2014. – V. 70(2). – pp 785–94. 28. Golfetto, O. Laurdan fluorescence lifetime discriminates cholesterol content from changes in fluidity in living cell membranes // O. Golfetto, E. Hinde, E. Gratton // Biophysical journal. – 2013. – V. 104(6). – pp 1238–47. 29. Литвин, Ф.Ф. Молекулярная спектроскопия: основы теории и практика. Учеб. пособие / Ф.Ф. Литвин, В.Т. Дубровский, Р.А. Хатыпов, К.В. Неверов, Т.Н. Калабухов, Г.В. Микулинская, Л.Я. Сатина. – М.: ИНФРА – М, 2016. – 263 с. – ISBN 978 – 5 – 16 – 005727 – 9. 30. Sanchez, S.A. Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo / S. A. Sanchez, M. A. Tricerri, E. Gratton // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2012. – V. 109. – pp 7314–7319. 62

31. Jay, A. Disorder Amidst Membrane Order: Standardizing Laurdan Generalized Polarization and Membrane Fluidity Terms / A. Jay, J. Hamilton // J Fluoresc. – 2017. – V. 27. – pp 243–249. 32. Jurkiewicz , P. Lipid hydration and mobility: an interplay between fluorescence solvent relaxation experiments and molecular dynamics simulations / P. Jurkiewicz, L. Cwiklik, P. Jungwirth, M. Hof // Biochimie. – 2012. – V. 94. – pp 26–32 33. Sanchez, S.A. Laurdan Generalized Polarization: from cuvette to microscope / S. A. Sanchez, M.A.Tricerri, G. Gunther, E.Gratton // FORMATEX. – 2007. – pp. 1007 – 1014. 34. Dietrich, C. Lipid rafts reconstituted in model membranes / C. Dietrich, L. Bagatolli, Z. Volovyk, N. Thompson, M. Levi, K. Jacobson, E. Gratton // Biophys J. – 2001. – V. 80. – pp 1417–1428. 35. Нестеркина, И.С. Выявление липид-белковых микродоменов (рафтов) на вакуолярной мембране : автореферат диссертации ... кандидата биологических наук : 03.01.05 / Нестеркина Ирина Сергеевна. – Иркутск., 2011. – 104 с. 36. Нурминского, В.Н. Особенности структуры вакуоли растительной клетки, выявленные с помощью конфокальной микроскопии / В.Н. Нурминский, А.Л. Ракевич, Е.Ф. Мартынович, Н.В. Озолина, И.С. Нестеркина, Е.В. Колесникова, А.А. Пилипченко, Р.К. Саляев, М.Ю. Чернышов // Цитология. – 2015. – Т. 57(6). – С. 443–451. 37. Белугин, Б.В. Значение латеральной гетерогенности PIP-аквапоринов для транспорта воды через плазмалемму растительных клеток : автореферат диссертации ... кандидата биологических наук : 03.01.05 / Белугин Борис Владимирович. – Москва., 2011. – 111 с. 38. Nichols, B.W. Separation of the lipids of photosynthetic tissues: improvements in analysis by thin-layer chromatography / B.W. Nichols // Biochem. Biophys. Acta. – 1963. – V. 70. – P. 417–422. 39. Kotlova, E.R. Alterations in the composition of membrane glycero- and sphingolipids in the course of Flammulina velutipes surface culture development / E.R. Kotlova, S.V. Senik // Microbiology. – 2009. – V. 78. – P. 193–201. 63

40. Кейтс, М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. – М.: Изд-во Мир, 1975. – 322 с. 41. Shi, H. Comparative physiological, metabolomic, and transcriptomic analyses revealmechanisms of improved abiotic stress resistance in bermudagrass [Cynodondactylon (L). Pers.] by exogenous melatonin/ H. Shi, C. Jiang, T. Ye, D.X. Tan, R.J. Reiter, H. Zhang, R. Liu, Z. Chen //J. Exp. Bot. – 2015. – V. 66. – pp 681–694. 42. Минибаева, Ф.В. Электрогенез и дыхательный газообмен корней пшеницы при различном кальциевом и стериновом статусе : автореферат диссертации ... кандидата биологических наук : 03.00.12 / Минибаева Фарида Вилевна. – Казань., 1990. – 23 с. 43. Forstner, J. Calcium – binding sites in human erythrocyte ghosts / J. Forstner, J. Manery // Feb. Proc. – 1970. – V. 29. – p. 664. 44. Левин, С.В. Структурные изменения клеточных мембран / С.В. Левин. – Л.: Наука ЛО, 1976. – 224 с. 45. Marsan, M. Ability of clionasterol and poriferasterol (24-epimers of sitosterol and stigmasterol) to regulate membrane lipid dynamics / M. Marsan, I. Muller , A. Milon // Chemistry and -Physics of Lipids. – 1996. – V. 84. – pp 117 – 121. 46. Coutinho, A. Cholesterol and ergosterol influence nystatin surface aggregation: relation to pore formation / A. Coutinho, L. Silva, A. Fedorov, M. Prieto // Biophys J. – 2004. – V. 87. – pp. 3264–3276. 47. Гордон, Л.Х. Энергетический обмен клеток корней пшеницы при модификации ионной проницаемости плазмалеммы каналоформером нистатином / Л.X. Гордон, Ю.Н. Валитова, Т.И. Огородникова, Д.Ф. Рахматуллина, А.Ю. Алябьев, Н.Л. Лосева, А.Н. Ценцевицкий, Н.Ф. Рубан // Цитология. – 2005. – Т. 7(12). – С. 1088–1094. 48. Сулкарнаева, А. Г. Состав стеринов и активность генов C24-стерин метилтрансферазы Triticum aestivum при стрессе : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.01.05 / Сулкарнаева Альбина Гарифулловна. – Казань., 2016. – 24 с. 49. Васильев, Ю.М. Клеточная поверхность и реакция клеток / Ю.М. Васильев, А.Г. Маленков – Л. : Медицина, 1968. – 291 с. 64

50. https://genetics_dictionary.academic.ru/5005/%D0%A2%D1%80%D0%B8 %D1%82%D0%BE%D0%BD 51. Валитова, Ю. Н. Растительные стерины: многообразие, биосинтез, физиологические функции / Ю. Н. Валитова, А. Г. Сулкарнаева, Ф. В. Минибаева // Биохимия. – 2016. – Т. 81. – С. 1050 – 1068. 52. Ленинджер, А. Биохимия / А. Ленинджер. – М.: Изд-во Мир, 1974. – 957 с. 53. Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот. – М. : МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002. – 446 с. – ISBN 5 – 7846 – 0036 – 2. 54. Zhang, M. Regulation of galactolipid biosynthesis by over expression of the rice mgd gene contributes to enhanced aluminum tolerance in tobacco / M. Zhang, X. Deng, L. Yin, L. Qi, X. Wang, S. Wang, H. Li // Front Plant Sci. – 2016. – V. 7. – P. 337. 55. Baretto – Bergter, E. Structure and biological functions of fungal cerebrosides / E. Baretto – Bergter, M. R. Pinto, M. L. Rodrigues // Annals of the Brazilian Academy of Sciences. – 2004. – V. 76, № 1. – P. 67 – 84. 56. Gerbeau-Pissot, P. Modification of Plasma Membrane Organization in Tobacco Cells Elicited by Cryptogein / P. Gerbeau-Pissot, C. Der, T. Dominique, I. Anca, K. Grosjean, Y. Roche, J. Perrier-Cornet, S. Mongrand, F. Plas // Plant Physiology. – 2014. – V. 164. – P. 273 – 286. 57. Bagatolli, L. Water dynamics in glycosphingolipid aggregates studied by LAURDAN fluorescence / L. Bagatolli, , E. Gratton, , G. Fidelio // Biophys. J. 1998. - V. 75. - P. 331-341. 65

Приложение 1 Химическая структура основных липидов, найденных в корнях пшеницы Фосфолипиды Гликолипиды Стерины Сфинголипиды 66

Трек 1. Rc1 Приложение 2 ПРОТОКОЛ АНАЛИЗА ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДОВ ОТ 1.12.17 (20171201_KIBB_PL.cna) Трек 7. Rc2 Трек 13. Rc3 67

Трек 2. Rca1 Трек 8. Rca2 Трек 14. Rca3 68

Трек 3. Rn1 Трек 9. Rn2 Трек 15. Rn3 69

Трек 4. Rs1 Трек 10. Rs2 Трек 16. Rs3 70

Трек 5. Rt1 Трек 17. Rt2 Трек 6. Фосфатидилхолин , St1 Трек 12. Фосфатидилх 71

Трек 18. Фосфатидилхолин, St3 Калибровочные графи для фосфатидилхолин Y=1629+864,6*X r=0,96687 sdv=9,47 AU AU AU мкг Калибровочные графики, построенные по площади пика Калибровочные график для гликоцерамида1 в количестве2,4; 3,6; 4,8 мкг для гликоцерамида2 в ко Y=4703+2020*X Y=2336+2365*X r=0,99874 sdv=1,44 r=0,99988 sdv=0,53 мкг 72 мкг

Трек 1. Rc1 Приложение 3 ПРОТОКОЛ АНАЛИЗА ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДОВ ОТ 29.09.17 (20172909_KIBB_ NL_ Sterin.cna) Трек 7. Rc2 73

Трек 13. Rc3 Трек 2. Rca1 74

Трек 8. Rca2 Трек 14. Rca3 75

Трек 3. Rn1 Трек 9. Rn2 76

Трек 15. Rn3 Трек 4. Rs1 77

Трек 10. Rs2 Трек 16. Rs2 78

Трек 5. Rt1 Трек 11. Rt2 79

Трек 17. Rt3 80

Трек 1. Ситостерин 2мкл , St1 Трек 11. Ситостерин 2мкл , St3 Приложение 4 Трек 2. Ситостерин 4мкл , St1 ПРОТОКОЛ АНАЛИЗА ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДОВ ОТ 29.09.17 (20172909_KIBB_ NL_4 Приложение Sterin.cna) Трек 12. Ситостерин 4мкл , St3 81

Трек 3. Ситостерин 6мкл , St1 Трек 13. Ситостерин 6мкл , St3 Трек 4. Ситостерин 8мкл , St1 Трек 14. Ситостерин 8мкл , St3 82

Трек 5. Ситостерин 10мкл , St1 Трек 10. Ситостерин 10мкл , St2 AU Трек 15. Ситостерин 10мкл , St3 Калибровочные графики построенные по площади пика для β - ситостерина в количестве 2,4,6,8,10 мкг Y=4812+668,8*X r=0,95812 sdv=6,88 мкг 83

Трек 2. Rс1 Приложение 5 ПРОТОКОЛ АНАЛИЗА НЕЙТРАЛЬНЫХ ЛИПИДОВ ОТ 2.12.17 (20171202_KIBB_NL.cna) Трек 4. Rс2 84

Трек 6. Rс3 Трек 1. Ситостерин , St1 Трек 3. Циклоартенол , St2 85

Трек 5. Олеиновая кислота , St3 Трек 7. Триолеин , St4 Трек 7. Сквален , St5 Калибровочный график построенные по площади пика для терпеноидов в количестве 0,2;0,3;0,4 нг Y=1344+5,852*X r=0,99539 sdv=2,57 AU мкг 86

Калибровочный график построенные по площади пика для Калибровочный график построенные по площади пика жирной кислоты в количестве 4,6,8 мкг для углеводорода (сквален) в количестве 4,6,8 мкг Y=2512+519,2*X Y=4081+651*X r=0,99931 sdv=0,97 r=0,99128 sdv=3,07 AU AU мкг мкг 87

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв