МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ   ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОГО ШТАММА ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПИВА

Ксения

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОГО ШТАММА ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПИВА

Магистерская диссертация на тему «Выделение нового штамма дрожжей для производства пива», является актуальной, так как в настоящее время на производствах, на территории Российской Федерации, в качестве посевного материала, используют сублимированные дрожжи, которые производят в Германии, Франции, Бельгии, Италии и ряде других стран. Необходимо выделение новых штаммов дрожжей, которые обладают всеми необходимыми производственно-ценными свойствами для бродильной промышленности, новые штаммы позволят сократить производственные затраты, расширить диапазон выпускаемых напитков брожения. Выделены новые штаммы дрожжей из растительных субстратов: персика, сливы, груши, винограда и ячменя. Проведены исследования культуральных и морфологических признаков изолятов дрожжей, исследованы физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов, проведена оценка кинетики роста изолятов, определена бродильная активность изолятов. В ходе исследования определен штамм, отличающийся высокой физиологической активностью, в перспективе которого – изучение, селекция и применение в пищевой промышленности.

Биология

Диссертации

Вуз: Астраханский государственный технический университет (АГТУ)

ID: 604206edccefde00012bc16b

UUID: ee33af40-5fca-0139-2be0-0242ac180002

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 123

12.46

Ксения

Астраханский государственный технический университет (АГТУ)

Комментировать 1

Рецензировать 0

Скачать - 2,0 МБ

Поделиться работой

Федеральное агентство по рыболовству Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Астраханский государственный технический университет» Система менеджмента качества в области образования, воспитания, науки и инноваций сертифицирована DQS по международному стандарту ISO 9001:2015 Институт рыбного хозяйства, биологии и природопользования Направление подготовки 06.04.01 «Биология» Направленность «Микробиология и вирусология» Кафедра «Прикладная биология и микробиология» МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОГО ШТАММА ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПИВА Работа выполнена студентом группы ДББММ-21 Боевой Ксенией Эльбертовной Руководитель ВКР к.б.н., доцент Гальперина Алина Равильевна Консультант по _____________________________________________________________ Консультант по _____________________________________________________________ Нормоконтролер к.б.н., доцент Пархоменко А. Н.________________________________ Допущена к защите «18» июня 2019 г. Заведующий кафедрой ______________ д.б.н. профессор Сопрунова О. Б. Астрахань 2019 г

АННОТАЦИЯ Магистерская диссертация на тему «Выделение нового штамма дрожжей для производства пива», является актуальной, так как в настоящее время на производствах, на территории Российской Федерации, в качестве посевного материала, используют сублимированные дрожжи, которые производят в Германии, Франции, Бельгии, Италии и ряде других стран. Необходимо выделение новых штаммов дрожжей, которые обладают всеми необходимыми бродильной производственно-ценными промышленности, новые штаммы свойствами позволят для сократить производственные затраты, расширить диапазон выпускаемых напитков брожения. Выделены новые штаммы дрожжей из растительных субстратов: персика, сливы, груши, винограда и ячменя. Проведены исследования культуральных и морфологических признаков изолятов дрожжей, исследованы физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов, проведена оценка кинетики роста изолятов, определена бродильная активность изолятов. В ходе исследования определен штамм, отличающийся высокой физиологической активностью, в перспективе которого – изучение, селекция и применение в пищевой промышленности. Магистерская диссертация состоит из введения, четырех основных глав, заключения, выводов, списка литературы и 3 приложений. Изложена на 80 страницах. Включает 5 таблиц и 5 рисунков. Список литературы состоит из 73 источников, из них 48 – иностранных авторов. По материалам исследования подготовлено и опубликовано 2 статьи (Приложение 1) и методические указания на тему: «Микробиологические методыпизученияднового1штамма1дрожжей».(Приложение.2).

ANNOTATION The master's thesis on «Allocating a New Yeast Strain for Beer Production» is relevant, since at present, freeze-dried yeast, which is produced in Germany, France, Belgium, and Italy, is used as seed in the Russian Federation. some other countries. It is necessary to isolate new yeast strains, which have all the necessary production-valuable properties for the fermentation industry, new strains will reduce production costs and expand the range of fermented beverages produced. New yeast strains have been isolated from plant substrates: peach, plum, pear, grape and barley. Studies of the cultural and morphological features of yeast isolates were carried out, the physiological and biochemical properties of the isolated strains were investigated, the kinetics of isolate growth was evaluated, the fermentation activity of the isolates was determined. In the course of the study, a strain was identified that is distinguished by high physiological activity, in perspective of which - the study, selection and application in the food industry. The master thesis consists of introduction, four main chapters, conclusion, conclusions, bibliography and 3 applications. Set out on 80 pages. Includes 5 tables and 5 figures. The bibliography consists of 73 sources, 48 of them are foreign authors. Based on the research materials, 2 articles (Appendix 1) and guidelines on the topic: «Microbiological methods for studying a new yeast strain»1(Appendix.2)1have1been1prepared1and1published.

2 СОДЕРЖАНИЕ Введение 4 Глава 1. Применение дрожжей в пищевой промышленности 6 1.1 Дрожжи. Особенности морфологии, физиологии и экологии 6 1.2 Применение дрожжей. Традиционные процессы дрожжевого брожения. Биотехнология дрожжей 18 1.2.1 Применение дрожжей в виноделии 20 1.2.2 Применение дрожжей в пивоварении. Основные пороки пива 21 1.2.3 Дистиллированный алкоголь 23 1.2.4 Дрожжи в технологии приготовления хлеба 24 1.3 Дрожжи в промышленной биотехнологии 26 Глава 2. Объекты и методы исследований 29 2.1 Схема исследований 29 2.2 Методы изучения культурально-морфологических свойств 30 2.2.1 Методы изучения морфологических признаков 30 2.2.2 Методы изучения культуральных признаков. Рост гигантской колонии дрожжей на сусло-агаре 2.2.3 Определение роста 30 изолятов дрожжей при различных температурах 32 2.2.4 Определение образования баллистоспор 33 2.3 Методы изучения физиолого-биохимических свойств изолятов 34 2.3.1 Методы изучения протеолитической активности 34 2.3.2 Определение кинетики роста дрожжей 34 2.3.3 Определение биомассы взвешиванием 34 2.3.4 Определение бродильной активности пикнометрическим методом 35 2.3.5 Определение содержания спирта погружным рефрактометром 36 2.3.6 Определение гемолитической активности 37

3 2.3.7 Учет степени чувствительности к антибиотикам 38 Глава 3. Перспективные штаммы дрожжей для использования в пищевой промышленности 39 3.1 Изучение культурально-морфологических свойств выделенных изолятов 39 3.2 Морфологические признаки изолятов 40 3.3 Культуральные признаки изолятов 42 3.4 Рост дрожжей при различных температурах 45 3.5 Образование баллистоспор 46 Глава 4. Физиолого-биохимические свойства изолятов 47 4.1 Протеолитическая активность изолятов 47 4.2 Кинетика роста изолятов 48 4.3 Бродильная активность изолятов 50 4.4 Гемолитическая активность выделенных изолятов 52 4.5 Показатели степени чувствительности к антибиотикам 52 Заключение 56 Выводы 57 Список литературы 58 Приложение 1. Список работ, опубликованных по теме диссертации 68 Приложение 2. Методические указания «Микробиологические методы изучения нового штамма дрожжей» 69 Приложение 3. Презентация магистерской диссертации 71

4 ВВЕДЕНИЕ Развитие предпринимательства в России, а именно производство небольших масштабов – специализирующиеся на выпуске популярных напитков – пива, вина и других напитков брожения, получили широкое распространение. В настоящее время на производствах в качестве посевного материала, как правило, используют сублимированные дрожжи, которые производят в Германии, Франции, Бельгии, Италии и ряде других стран. На сегодняшний день – новые штаммы дрожжей являются первой необходимостью, как в пищевой промышленности, так и для биотехнологии, и решение задачи по поиску нового перспективного штамма остается актуальным. Использование новых перспективных штаммов дрожжей позволило бы существенно расширить ассортимент напитков брожения. Биотехнология, основанная на таких штаммах, должна обеспечить максимально быстрое и эффективное накопление биомассы дрожжей, отличающихся высокой физиологической активностью и не содержащих посторонних микроорганизмов. Что в свою очередь позволит сократить производственные затраты, расширить диапазон выпускаемых напитков брожения, а также повысить их качественные характеристики. Цель работы: изучение новых штаммов дрожжей, перспективных для использования в бродильной промышленности. В соответствии с целью, были поставлены задачи: 1. Выделить штаммы дрожжей из растительных субстратов. 2. Изучить культуральные и морфологические признаки изолятов. 3. Изучить физиолого-биохимические свойства изолятов. 4. Определить кинетику роста изолятов. 5. Определить бродильную активность изолятов. 6. Определить наиболее перспективный штамм дрожжей для пивоварения.

5 Научная новизна. Выделены новые изоляты дрожжей, оптимально подходящие по алкогольной и температурной толерантности, изучено влияние величины засева дрожжей на физиологическую активность характеризующую кинетику размножения клеток. Практическая значимость. На основании полученных данных возможно применение перспективных изолятов в пищевой промышленности. Дальнейшее изучение и селекция изолятов дрожжей, позволит сократить производственные затраты, на посевной материал приобретаемый заграницей и расширить диапазон выпускаемых напитков брожения. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на VI международной научно-практической конференции в Барнауле (2018), 69-й международной студенческой конференции АГТУ (2019). Публикации. По результатам исследований опубликовано 2 статьи и подготовлены методические указания к лабораторным и самостоятельным работам на тему «Микробиологические методы изучения нового штамма дрожжей».

6 ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 1.1 Дрожжи. Особенности морфологии, физиологии и экологии Дрожжи относятся к сумчатым, базидиомицетам и несовершенным грибам – Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. Чтобы определить дрожжи в пищевом сырье используют следующий видовой определитель. Отдел: Ascomycotina Семейство: Saccharomycetaceae (аскоспоры и артроспоры; способ размножения – вегетативное, почкование и деление) Подсемейство: Nadsonioideae Род: Hanseniaspora Подсемейство: Saccharomycotoideae Род: Debaryomyces Issatchenkia Kluyveromyces Pichia Saccharomyces Torulaspora Zygosaccharomyces Подсемейство: Schizosaccharomycetoideae Род: Schizosaccharomyces Отдел: Deuteromycotina Семейство: Cryptococcaceae (размножение почкованием) Род: Brettanomyces Candida Cryptococcus Rhodotorula Trichosporon

7 В класс входит Ascomycetes порядок Endomycetales – дрожжеподобные сумчатые грибы, способные образовывать эндоспоры. К этому порядку относится семейство Saccharomycetaceae, представители которого имеют скудный мицелий или совсем лишены его. Это одноклеточные организмы овальной формы. Размножение у представителей семейства Saccharomycetaceae,, происходит почкованием или делением (Нетрусов, 2005). Семейство Saccharomycetaceae включает род Saccharomyces, большинство которого, например, Saccharomyces cerevisiae играют большую роль в пищевой промышленности. Saccharomyces cerevisiae размножаются почкованием. Род Schizosaccharomyces, относящийся к семейству Saccharomycetaceae, включает в себя дрожжи, размножение, которых, происходит делением. Как правило, местом обитания дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae принято считать поверхность плодов винограда, фруктов и ягод, зерен ячменя пшеницы и других злаковых культур (Alexopoulos, 2007). Среди семейства Saccharomycetaceae, в большинстве, встречаются представители спиртового брожения и дрожжи, вызывающие порчу и болезни пищевых продуктов, например Nadsonia, и продуктов бродильной промышленности (Грачева, 1992). Типичные почвенные дрожжи рода Lipomyces, также принадлежат к классу Ascomycetes. Basidiomycetes это класс дрожжей образующих базидиоспоры – половые структуры базидиального типа. Базидиомицеты подкласс Ustilaginomycetidae, включает в себя рода Rhodosporidium и рода Sporobolomyces, средой обитания которых является поверхность различных растений и листьев. К роду Sporobolomyces относятся дрожжи, размножающиеся баллистоспорами в бесполой стадии (Alexopoulos, 2007). Дрожжеподобные грибы, не образующие эндоспор, относят к классу Deuteromycetes. Размножение Deuteromycetes происходит почкованием.

8 Представители рода Torula являются бродильщиками – производят спиртовое брожение. Причиной порчи пищевых продуктов, как правило, бывает представитель класса Rhodotorula – Candida (Пат. РФ 2058992). Дрожжей представителей активных бродильщиков – конфидентов спиртового брожения, помимо поверхности плодов и растений, можно встретить и в почве виноградников. Но основная масса почвенных дрожжей, не являются представителями спиртового брожения (Agate, 1966). В зависимости от среды распространения и условий обитания – все представители дрожжеподобных грибов, могут менять форму и размер клеток. Некоторые дрожжи могут быть представителями нескольких форм – для них, характерен деморфизм (Голубев, 2009). Для Saccharomyces cerevisiae стандартной вегетативной клетки – свойственна овальная, округлая или эллипсоидная формы. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae можно встретить в виде нитей и палочек – такая форма характерна для старых культур, как правило, локализующаяся на пленках жидких сред. Для дрожжей родa Torulopsis – S. рasterianum свойственны формы встречаются среди идеальной сферы. представителей Циллиндрические рода формы Shizosaccharomyces. Лимоноподобные клетки характерны для дрожжей: Kloeckera, Nadsonia, Saccharomycodes и Hanseniaspora. Trigonopsis – характерна форма треугольника, бутылкообразные клетки встречаются среди представителей рода Pityrosporum. Вытянутыми формами представлены представители родов: Eremascus, Candida, Eremothecium, Ashbya. Также Eremothecium, Ashbya и Eremascus не принадлежат к истинными дрожжами (Becze, 1964). Вода является важным компонентом дрожжевой клетки и составляет примерно 75 %. Сухие вещества имеют следующий состав: белковые вещества от 40 до 60 %, углеводы от 25 до 35 %, жиры (липиды) от 4 до 7 %, минеральные вещества от 6 до 9 %. В состав минеральных веществ

9 входят: фосфаты, калий, натрий, кальций, магний, цинк, железо, марганец и медь (Кисленко, 2012). Клетки дрожжей содержат ряд витаминов, среди которых: никотиновая кислота 29-90 мг; тиамин (B1) 7-16 мг на 100 г СВ дрожжей; рибофлавин 3-7 мг; пантотеновая кислота 3-25 мг; фолиевая кислота 4-15 мг; пиридоксин 4-10 мг; биотип 0,1-1 мг (Akinrele, 1970). Все дрожжевые клетки состоят из цитоплазмы – цитозола, цитоплазма окружена клеточной мембраной, содержащей ряд органелл, столь необходимых в обмене веществ. Нуклеус (клеточное ядро) – важная органелла – выполняющая роль регулирования центра клетки, она окружена пористой, замкнутой двойной мембраной (Бабьева, 2004). Плазму – основное вещество, матрицу и хромосомы, содержит ядро. Информация хранится форме генов. В состав гена входят – дезоксирибонуклеиновая кислота и полимерная молекула. За процессы развития, роста и обмена веществ отвечает ДНК. В состав ядра входит ядрышко – nucleolus, оно – представлено соединениями рибонуклеиновой кислоты (Азаров, 2010). По объему митохондрии – занимают большое место в дрожжевой клетке. Образующийся пируват в цитоплазме, митохондрии разлагают его в процессе дыхания на СО2 и воду путем последовательных, сложных реакций (Manger, 2001). Синтезирует протеин – шероховатая эндоплазматическая сеть, за метаболизм токсичных веществ и синтез жиров (липидов), отвечает гладкая эндоплазматическая сеть. Блокирующийся протеин, транспортируется в везикулы, оснащенных оболочкой (Еремина, 1999). Комплекс Гольджи, представляет собой «сортировочный центр». Секреторная везикула транспортируется (Германов, 1969). к с токсичным клеточной веществом мембране и (со выводится спиртом) наружу

10 Переработку отходов в клетке осуществляют лизосомы, обеспечивая переработку, разлагают высокомолекулярные структуры в низкомолекулярные (Голубев, 2009). Клеточные мембраны, чрезвычайно важны – они окружают не только клетку, но и все ее органеллы. Структурными элементами клеточных мембран, важными по своей сути, являются фосфолипиды. 1/1000 составляет толщина клеточной мембраны, разделяя отделы клетки, образует мембраны вокруг клеточных органелл. Площадь поверхности клетки дрожжей составляет порядка 150 мкм2 (Berwal, 1995). Интенсивный синтез жирных кислот важен при размножении. Следует отметить, что высоким синтезом жирных кислот, клетка обеспечивает себя, для построения новой субстанции, по объему превышающий ее собственный в 4-5 раз (Кунце, 2009). Комплекс поверхности, включающий в себя клеточную мембрану и гликолизированные остатки (гликокаликс) называется клеточной стенкой (Нарцисс, 2007). В благоприятных условиях среды, переизбытке питательных веществ, например, во время начального брожения, клетки дрожжей активно начинают запасаться резервными питательными вещества. Содержание резервного углевода – гликогена, увеличивается на 30 %, откладывается трегалоза – углевод из группы невосстанавливающихся дисахаридов (Rainbow, 1975). Вакуоли, наполненные кислым соком в окружении клеточных мембран, можно обнаружить в дрожжевой клетке, здесь же, откладываются соли и высокомолекулярные органические вещества – белки. При помощи обратной реакции солей регулируется клеточный тургор, например повышенное содержание спирта увеличивает осмотическое давление снаружи клетки (Andersen, 1995). Строение дрожжевой клетки напрямую связано со способом ее размножения, например – вегетативный способ размножения. Существуют

11 два принципиально разных способов размножения по вегетативному типу это – талломный (артрический) и бластический. Распад мицелия у дрожжеподобных грибов при артрическом способе, происходит параллельно, в связке, с распадом на артроспоры, артороспоры это – одноклеточные элементы. У расчлененной гифы по поперечным септам, после разрушения первичной стенки на месте ее срастания – образуется артроспора. Galactomyces, Trichosporon, Endomyces, Arxula – дрожжеподобные грибы, являются типичными представителями, для которых характерен именно такой способ вегетативного размножения (Чернов, 2013). Бластическому типу вегетативного размножения характерны – образования почек. На материнской дрожжевой клетке образуется вырост, который по мере своего роста открепляется от материнской, оставляя после себя на материнской клетке рубец, а на вновь образованной клетке – родовой шрам. Рубцы на материнской клетке сохраняются весь период ее жизни, а родовые рубцы отпочковавшейся клетки – со временем малозаметны. Механизм ультраструктурного образования разделяют на голобластический и энтеробластический тип почкования (Меледина, 2013). Для аскомицетовых характерен первый тип размножения, второй – для базидиомицетовых дрожжей, способ размножения несет высокую таксономическую ценность. При голобластическом способе образовании почки, принимает участие вся материнская клетка, при таком типе размножения почке свойственно, выдуваться из материнской клетки (Arihara, 1998). Энтеробластический тип почкования характеризует себя разрывом материнской клетки, при этом материнская стенка клетки формируется заново, этот процесс имеет некое сходство с репродуктивной фазой мицелиальных грибов (Barrette, 2001).

12 Почкование дрожжевых клеток различают по нескольким признакам, а именно – от места образования клетки и способа ее отделения от материнской клетки. В зависимости от места образования почек различают полярное или биполярное и многостороннее почкование, которое наиболее распространено среди родов Saccharomyces, Candida, Debaryomyces, Pichia (Viljoen, 1989). Образование почек в строгом расположении по полюсам и поочередном их воспроизведении на месте предыдущей почки, является свидетельством полярного почкования. Такое почкование с нарастанием материнских шрамов на клетке – шрамы нарастают друг на друге, придавая клетке груше подобную форму, характерно для дрожжей рода Schizoblastosporion, а родам Nadsonia. Дрожжам рода Saccharomycodes, Hanseniaspora – свойственна лимоноподобная форма. В случае когда перешеек между материнской клеткой и почкой довольно широкий с хорошо визуализирующийся септой, принято считать признаком почкующегося деления (Camargo, 1963). Базидиомицетовые дрожжи, чаще всего представлены нефиксированным почкованием, из локуса вырастает сразу несколько почек. Например, для дрожжей рода Cryptococcus neoformans характерно симподиальное почкование, когда из одного локуса вырастают сразу несколько почек, в поочередной последовательности. В случае энтеробластического почкования у почки формируется хорошо заметный родовой рубец. Рода Kurtzmanomyces, Sterigmatomyces, Fellomyces образуют конидии или стеригмы (Collard, 1959). В процессе завершения почкования, дочерняя дрожжевая клетка не всегда отделяется от материнской и образовывает не одну, а несколько почек, которых принято называть сростками почек (Pearson, 2004). Дрожжи рода Trigonopsis представлены специфической угловатой формой, а Metschnikowia lunata обладают серповидной формой. Очень

13 часто, клетки дрожжей, почки которых образуются на стеригмах, обретают форму схожую с простекобактериями (Etchells, 1975). Клетки дрожжей очень разнообразны по своей форме, как правило, форма клетки неотъемлемо связана со способом вегетативного размножения. Сферическую, овальную или округлую формы имеют дрожжи размножение почек, у которых происходит многосторонним способом. Апикулятная биполярном или почковании, грушевидная для делящихся форма характерна дрожжей при свойственна цилиндрическая форма (Cummings, 2002). Процесс дыхания дрожжевой клетки является процессом добывания и обеспечения энергией клетки. Во время дыхания приобретенные питательные вещества, к примеру сахара, полностью расщепляются на СО2 и Н2О: С6Н12О6 + 6О2 → 6Н2О + 6СО2 (Deibel, 1957). В отсутствии кислорода дрожжи (единственный живой организм), с процесса дыхания, переходят на процесс спиртового брожения. Образуя из глюкозы спирт – этанол: С2Н5ОН и СО2: С6Н12О6 → 12C5H5OH + 2СО2 Во время брожения дрожжевой клетки получение энергии значительно сокращается, нежели во время дыхания (Alexopoulos, 2007). Спирт, образованный в процессе расщепления глюкозы (С6Н12О6), или во время дыхания до углекислого газа – СО2и воды Н2О, происходит чередой последовательных реакций. Клеточные структуры дрожжевой клетки напрямую связаны с ферментами. Клеточная цитоплазма содержит все, так необходимые ферменты для спиртового брожения, а процесс дыхания осуществляется при помощи митохондриальных ферментов (Collins, 1993). Обмен веществ, который происходит в клетке, а конкретно: жировой, белковый, углеводный и обмен минеральных веществ, носит комплексный характер (Бабьева, 2004).

14 Тригалоза и гликоген откладываются только в виде резерва, а основной углеводный обмен во время брожения служит для обеспечения энергией клетки (Everson, 2007). Как в большинстве случаев в живом мире, белковый, жировой обмены и обмен минеральных веществ, служат для формирования новых клеточных субстанций (Faparusi, 1971). В присутствии кислорода клетки дрожжей способны к потреблению широкого ряда веществ, в том числе – жировых, спиртовых углеводородных соединений. Нитраты аммония – являются источником азота для дрожжей, а вот сложные соединения углеводов – лигнины и целлюлозы для них не доступны. Использование углеводов как гексоза и синтезированные из нее олигосахариды, полисахариды – инулин, крахмал, моносахарид – пентоза, приоритетны в бескислородных условиях (Garcia-Garcia, 2000). В отличие от бактерий – дрожжи обладают большим размером и характерной, свойственной, только для них формой клеток: овальной, эллипсоидной или сферической. Размеры клеток варьируются в диапазоне от 5 до 8 мкм в диаметре, но возможны увеличения в размерах у некоторых клеток. Дрожжи, процесс размножения которых проходит почкованием или делением, имеют больший интерес и потенциал применения в пищевой промышленности (Giolitti, 1971). Также широк диапазон роста дрожжей в кислых значениях pH и при 18 %-м содержании этанола. Для многих дрожжей возможен рост в присутствии сахарозы с концентрацией 55-60 %. Цветной колорит дрожжей многообразен: от розового до красного цветов, от сливочного до коричневого (Kreger-van, 1984). Для таксономии и более детальной идентификации дрожжей были использованы новые методы нуклеотидных последовательностей 5S-pPHK, состава гетероциклических оснований ДНК и профилей кофермента Q. Из-за большего размера генома дрожжей, анализ

15 последовательности 5S-pPHK используется чаще, чем анализ больших фракций РНК. Много изменений произошло в систематике дрожжей частично благодаря использованию более новых методов, но также и тому, что пересмотр был направлен на группировку, а не на дробление таксонов (Semanchek, 1996) На сегодняшний день род дрожжей Torulopsis отнесен в род Candida, а Tomlaspora включает в себя дрожжи, ранее относимые к видам Saccharomyces и Zygosaccharomyces. Эти рода дрожжей обладают телеоморфной и половой стадиями. Как правило, аспорогенные дрожжи представлены клетками овальной формы, по своим биохимическим свойствам образуют уксусную кислоту в условиях полного отсутствия кислорода. Растут при самых низких показателях рН, начиная от 1,8. Все представители дрожжей рода Candida, являются возбудителями болезней вина, пива и слабоалкогольных напитков (Kreger-van, 1984). Род Candida оформлен в 1923 г. И в течение всего двадцатого столетия подвергался различным изменения. Изначально род имел вид гетерогенного таксона, который включал в себя три основные группы состоящих из сорока сегментов. Яркая белая окраска легла в основу названия рода, потому как в клетках дрожжей рода Candida содержится пигмент каротиноидной природы. Аскомицетные несовершенные виды, также отнесены к роду Candida: Candida famata (Torulopsis, Candida, T. famata) Candida kefyr (Candida pseudotropicalis, T. kefyr, Torulacremoris) Candida stellata (Torulopsis stellata) Candida holmii (Torulopsis holmii) Большинство анаморфных форм дрожжей рода Candida сегодня относят к родам Candida lipolytica .– анаморфа Saccharomycopsis lipolytica, Kluyveromyces и Pichia (Greenwalt, 2000).

16 Самым распространенным видом дрожжей встречаемых на пищевых продуктах, является С. tropicalis, часто встречается на мясе птицы и говядине (Harris, 1957). Анаморфы Filobasidiella и Basidiomycetes, являются представителями вида Cryptococcus. Это аспарогенные дрожжи, процесс размножения у которых представлен многосторонним почкованием. В клетках содержится пигмент красного и оранжевого цветов, клетки формируют артроспоры, не участвуют в процессе ферментации сахаров. Ареалом обитания дрожжей вида Cryptococcus как правило является почва, растения, но также они были обнаружены на продуктах морского промысла (Satomi, 1997). Аспорогенные дрожжи вида Debaryomyces образующие псевдомицелий, схожи с дрожжами вида Cryptococcus по способу размножения, процесс размножения представлен многосторонним почкованием. Дрожжи вида Debaryomyces встречаются в молочных продуктах чаще всех остальных видов дрожжей. Растут в присутствии 24 % NaCl и aw 0,65 активности воды. Дрожжи вида Debaryomyces вызывают порчу молочной продукции, концентрированных соков, на мясных полуфабрикатах образуют слизь (Viljoen, 1989). Апикулятные дрожжи Hanseniaspora представлены анаморфой – Kloeckera spp. Характерной чертой которых является, размножение биполярным почкованием, споры содержатся в асках. Дрожжи Hanseniaspora можно встретить на различных пищевых продуктах, особенно фруктах. Hanseniaspora ферментируют сахара (Schwan, 2008). Образующие псевдомицелий и размножающиеся многосторонним почкованием дрожжи рода Issatchenki ранее относились к роду Pichia. Дрожжи рода Issatchenkia имеют телеоморфу Candida krusei – I. orientalis. Отличительной чертой, которых является, образование пленок на поверхности жидких сред, дрожжи встречаются на различных продуктах питания (Schleifer, 1990).

17 Аскоспорообразующие дрожжи Kluyveromyces, размножающиеся многосторонним почкованием, имеют споры сферической формы. Дрожжи Kluyveromyces spp., являются продуцентами лактазы и участвуют в процессе ферментации глюкозы. Поэтому дрожжи, К. lactis, К. bulgaricus, К. fragilis и К. marxianus – чаще всего можно встретить в молочных продуктах. Штамм К. marxianus участвует в процессе производства фермента лактазы, но также является возбудителем порчи молочных продуктов (Shieh, 1982). Pichia род дрожжей процесс размножения, у которых представлен многосторонним почкованием, четыре споры содержатся в асках. Формируют как артроспоры, так и псевдомицелий. Анаморфа P. membranaefaciens – Candida valida. Патологические изменения в продукте представлены наличием пленок на поверхности жидких сред (Gobbetti, 1997). Анаморфа Basidiomycetes – это дрожжи Rhodotorula. Дрожжи Rhodotorula выделены способностью, формировать телиоспоры. Отнесены к отдельному роду – Rhodosporidium. Процесс размножения представлен многосторонним размножением. Обладают отличительной особенностью, образовывать каратиноидные пигменты (Buckle, 1990). Аскоспорогенные дрожжи Saccharomyces, размножаются многосторонним почкованием. Обладают отличительной чертой, не сбраживают лактозу. Дрожжи применяемы в пищевых целях, являются представителями рода Saccharomyces cerevisiae. Областью применения дрожжей рода Saccharomyces cerevisia, принято считать – производство вина, пива и хлеба (Dicks, 1975). Аскоспорогенные дрожжи представители рода Schizosaccharomyces – дрожжи процесс размножения, у которых происходит боковым делением, клетки формируют гифы. В асках содержатся от 4 до 8 спор (Deak, 1987).

18 Дрожжи рода Torulaspora, размножение у которых представлено многосторонним почкованием, в асках, находятся споры шаровидной формы. Представители рода Torulaspora сбраживают глюкозу (Deak, 1987). Trichosporon. Размножение у дрожжей рода Trichosporon происходит почкованием, образуют истинный мицелий, полное отсутствие ферментации сахаров. Trichosporon pullulans вид дрожжей синтезирующих липазу (Smith, 1973). Дрожжи рода принадлежащие Yarrowia, ранее к роду Saccharomycopsis, сейчас относят к порядку Endomycetale. Дрожжи Yarrowia можно встретить на поверхности фруктов и растений (Pitt, 1985). Zygosaccharomyces. В большинстве дрожжи Zygosaccharomyces являются гаплоидными, размножение у них происходит многосторонним почкованием, имеют круглые аскоспоры. Zygosaccharomyces свойственна ферментация сахаров (Schwan, 2008). 1.2 Применение дрожжей. Традиционные процессы дрожжевого брожения. Биотехнология дрожжей Традиционные процессы применения дрожжей в виноделии, пивоварении и хлебопечении зародились на заре эры человечества. По прошествии немалого количества времени, дрожжи приобрели массовую популярность, благодаря своей многолетней селекции, появилась технологическая градация штаммов направленная на определенный род применения: дистиллированный алкоголь, пивоварение, виноделие и хлебопечение. Только девятнадцатое столетие приоткрыло завесу тайны происхождения спиртового брожения. В 1837 году Мейер впервые описал их, и дал им название Saccharomyces. А немного позже, 1866 году, Пастер окончательно доказал роль дрожжей в процессе сбраживания глюкозы. Также конец девятнадцатого столетия ознаменован детальной расшифровкой дрожжей по физиологическим свойствам (Чернов, 2013).

19 Благодаря, методам молекулярной и генетической таксономии позволившим, человеку определить что, в большинстве своем, все виды Saccharomyces, различны по физиологическим свойствам, но близки по биологическому виду Saccharomyces cerevisiae. Представителями таких видов являются, например, S. oviformis, S. cheresiensis, S. ellipsoides, Saccharomyces vini, S. chevalieri. Как правило, такие дрожжи в природе не встречаются, так как являются продуктом человеческой селекции, такой же, как сорта культурных растений (Голубев, 2009). Такие популярные в мире напитки как пиво и вино, не единственные, напитки, в процессе приготовления которых применяют дрожжи. Так на Востоке дрожжи применяют в процессе приготовления саке (рисовая водка), текила и пульке в Южной Америке, напиток помбе в Африке (Bokanga, 1995). Главное различие технологии заключается в сырье, способе осахаривания и ферментами, применяемыми в процессе приготовления напитков. В некоторых случаях для сбраживания используются виды дрожжей, отличные от Saccharomyces cerevisiae. При производстве рома, например, применяются дрожжи из рода Schizosaccharomyces (Hartman, 2001). Двадцатый век с его безудержным развитием промышленности резко расширил области применения дрожжей. Они стали применятся не только в пищевых целях, но и выращиваться большими масштабами в качестве источника белка и витаминов для сельскохозяйственных животных (Маринченко, 1975). Дрожжи – основной источник технического этанола. С помощью дрожжей сейчас получают большой спектр соединений, использующихся в разных областях человеческой деятельности. К ним относятся витамины, различные полисахариды, липиды, которые могут служить заменителями растительных масел, разнообразные ферменты, используемые в пищевой промышленности. Развитие генетической инженерии позволило

20 использовать легко культивируемые дрожжи для получения многих полезных веществ животной и растительной природы, например, инсулина (Римарева, 2013). 1.2.1 Применение дрожжей в виноделии Вино продукт брожения винограда. На поверхности ягод винограда, фруктов присутствует микрофлора способствующая процессам брожения. В состав ягод винограда и фруктов входят сахара и поэтому использование дополнительного фермента амилазы не требуется. Первым этапом по созданию вина, считается выбор подходящего сорта винограда, который впоследствии обрабатывается метабисульфитом калия, от попутной контаминирующей сусло флоры. В отжатое виноградное сусло вносят культуру дрожжей Saccharomyces ellipsoideus – селекционный вид винных дрожжей, процесс брожения занимает от трех до пяти дней, в диапазоне температур 21-32 °С. Характерной особенностью винных штаммов дрожжей является толерантность к алкоголю, которая варьируется в пределах 14-18 % (Berwal, 1995). Как правило, основным контаминантом столовых вин, является Candida valida, она наносит наибольший урон производству, в сравнении с контаминацией бактериальной флорой. Для инфицирования дрожжами рода Candida valida в процессе брожения, характерно образование пленки на поверхности сусла. Патологический процесс порчи сусла – называют цветением вина, Candida valida утилизирует спирт. Основной представитель инфекционной бактериальной флоры это – Acetobacter, он выделяется характерной способностью окислять спирт до уксусной кислоты. Одно из наиболее серьезных видов порчи вина болезнь турн. Данное заболевание продукта вызвано дрожжами рода Pichiaceae которые обладают способностью утилизировать этанол (С2Н5ОН) и способствуют увеличению летучих кислот в сусле (Пат. РФ 2164941).

21 Oenococcus oeni – бактерия также является контаминантом виноградного сусла, растет при значениях pH 3,5-3,8, рост Oenococcus oeni стимулируется в момент декарбонизации L-яблочной кислоты, бактерия расщепляет яблочную кислоту до молочной кислоты и CO2 (Kunkee, 1975). Leuconostoс, Pediococcus и Lactobacillus – являются также возбудителями яблочно-молочнокислого брожения – состояния, очень важного в винах, так как пировиноградная и яблочная кислоты преобладают в вине, содержание кислоты необратимо влияет на органолептику продукта. Грамположительные факультативно анаэробные представители рода L. kunkeei и L. nagelii характеризуют патологический процесс сусла вялотекущим спиртовым брожением (Heinonen, 1998). 1.2.2 Применение дрожжей в пивоварении. Основные пороки пива Охмеленный солодовый напиток – называется пивом. Очень важным процессом в пивоварении считается распад углеводов. В зерне содержится большое количество углеводов в виде крахмала, поэтому для пивоварения первоочередной задачей является разложение крахмала до сахаров. Процесс гидролиза крахмала до сахаров, осуществляется активизацией ферментов, таких как – α-амилазы и β-амилазы. Подготовленный предварительно ячмень – проращивают (процесс соложения), данный этап необходим для репликации амилаз. Отсюда следует что пиво – это напиток брожения охмеленного сусла, получаемый в процессе смешивания воды, хмеля, солода и дрожжей (Горбунов, 2014). В некоторых технологиях приготовления пива указывается наличие лактобацилл в рецептурных картах, это необходимо для снижения кислотности сусла, для этих целей L. delbrueckii subsp. delbrueckii (Горбунов, 2014). принято использовать

22 Для сбраживания осахаренного затора вносят культуру дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae. В результате применения дрожжей верхового брожения, а именно S. cerevisiae, получается пиво сорта эль с кислотностью 3,8. Дрожжи рода Saccharomyces carlsbergensis производят (Кунце, 2009). Присутствие молочнокислых бактерий наблюдается, как правило, в любом виде пива, но лактобациллы чаще обнаруживаются в пиве элевых сортов, тогда как в лагерных напитках встречаются чаще педиококки (Kleyn, 1971). Вся виды порчи пива начинаются, как правило, с инфицирования микроорганизмами такими как: Zymomonas, Lactobacillus, Gluconobacter oxydans, Acetobacter, Pediococcus cerevisiae. Патологическая органолептика продукта характеризует следующие признаки: тягучесть, мутность, кислый вкус, посторонний запах – медовый аромат. Бактериальный рост возможен в пиве в силу благоприятных условий среды и pH, с ее оптимальным диапазоном, находящемся в пределах 4-5 (Rainbow, 1975). Также из испорченного пива были выделены микроорганизмы, относящиеся к родам: Megasphaera cerevisiae, Pectinatus cerevisiiphilus, Pectinatus frisingensis, Selenomona slacticifex, Zymophilus paucivorans, Zymophilus raffinosivorans. Их отличительной особенностью был облигатно-анаэробный, грамотрицательный статус. Все микроорганизмы являются продуцентами уксусной, изовалериановой и пропионовой кислот (Нарцисс, 2007). Необходимо также указать основного контаминанта упакованного пива – Saccharosemyces diastaticus, штамм обладает способностью утилизировать декстрины, что культурные штаммы дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis делать не могут. Flavobacterium proteus и Brettanomyces также встречаются в испорченном пиве (Kleyn, 1971).

23 1.2.3 Дистиллированный алкоголь Дистиллированный алкоголь это продукт, который получили путем дистилляции браги. Брага по своему составу может быть представлена следующими видами сусла: из зерновых культур, фруктовыми, а так же в виде растворенной патоки. Виски, ром, коньяк, арманьяк, джин – характерные представители дистиллированного алкоголя. А так же водка, как представитель ректифицированного алкоголя. Все процессы производства дистиллированного алкоголя, в большинстве своем сходны в этапах их проведения, но отличаются по технологическим рецептурам. Так, например ржаной бурбон содержит в составе рожь и ржаной солод или рожь и ячменный солод, данные компоненты использовались в разных пропорциях, но согласно закону, требуется не менее 51 % ржи в составе засыпи. Также бурбон (Bourbon, Kentucky straight whiskey), производят из кукурузы, ячменного солода, пшеничного солода или других, но по аналогичному закону. Основного компонента – кукурузы в засыпи не должно быть менее 51 %. Неотъемлемым показателем затора, являются низкие значения pH, это необходимо для подавления роста нежелательной микрофлоры, низкие параметры кислотности достигаются путем добавления кислоты в затор. Также возможно применение гомоферментативных микроорганизмов для молочно-кислого брожения, например L. delbrueckii subsp. delbruechii. И для образования этанола вносят дрожжи рода S. cerevisiae. После процесса брожения брагу подвергают дистилляции (Collins, 1993). Алкогольный напиток – сакэ, очень популярный в Японии. Производят из субстрата – крахмала, гидролиз крахмала до сахара, получают благодаря ферментам гриба Aspergillus oryzae. Главное брожение осуществляют дрожжи рода Saccharomyces sake. Период брожения занимает 30-40 суток. Максимальная толерантность к алкоголю у дрожжей рода Saccharomyces sake достигается на уровне 12-15 %,

24 молочная кислота составляет 0,3 %, образованная путем внесения в затор молочнокислых бактерий L. delbrueckii subsp. (Pitt, 1985). Нигерийское пальмовое вино – алкогольный напиток, получаемый в результате брожения пальмового сока. Пальмовый сок содержит сахара в пределах 10-12 %, сахароза является главным компонентом. Период брожения у пальмового вина, очень короткий, занимает от 36 до 48 ч, в процессе завершения брожения наблюдается резкое падение pH от 7,0 до 4,5. Нигерийское пальмовое вино уникальный продукт, в готовом виде вина, разрешенном к употреблению, содержатся живые микроорганизмы. В вине преобладающими микроорганизмами являются дрожжи родов Saccharomyces и Candida spp., а также наблюдается наличие таких микроорганизмов как: Micrococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactobacillus и Acetobacter. (Okafor, 1975). 1.2.4 Дрожжи в технологии приготовления хлеба Кислое тесто, является закваской или заквасочным дополнительным компонентом для производства хлеба. При приготовлении хлеба используются культуры хлебопекарских дрожжей. В состав закваски для приготовления хлеба входят: дрожжи и молочнокислые бактерии. Как правило, в закваске определяются дрожжи рода Saccharomyces exiguus, а бактерии представлены родами Lactobacillus sanfranciscensis, L. fermentum, L. fructivorans, некоторыми штаммами L. brevis и L. pontis. Главную роль в сквашивании компонентов для приготовления хлеба играет бактерия L. sanfranciscensis, бактерия отличается активной ферментацией в отношении мальтозы, для нормального развития которой необходимо присутствие насыщенных жирных кислот и дрожжевых экстрактов. За подкисание теста несет ответственность L. sanfranciscensis, а за подъемную силу теста – за счет выделения углекислого газа, отвечают дрожжи

25 Saccharomyces exiguus, также вырабатывается незначительное количество уксусной и молочной кислот (Cai, 1999). Закваски, используемые в технологии приготовления хлеба, делятся на три группы. Тип I заквасок ферментирует при 20-30 °С, в эту группу входят два основных организма – L. sanfranciscensis и L. pontis. Тип II употребляют хлебопекарные дрожжи как подъемную силу и подавляющее большинство молочнокислых бактерий L. Pontis. Тип III – высушенные продукты традиционного брожения. Все закваски из пшеничных продуктов принадлежат к I типу, ферментативный тип в пшеничном продукте состоит из Weissella cibaria, L. sanfranciscensis, L. paralimentarius L. brevis, также присутствуют микроорганизмы родов Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Dekkera bruxellensis, Candida humilis (DeVuyst, 2002). Страна, расположившаяся на полуострове индостан, подарила миру не только уникальную глубокую философию, но и культуру приготовления продуктов питания, а в частности приготовление ферментированных лепешек идли. Идли – аналог хлеба, распространенный в южной Индии. В состав, которого входят: рисовая мука, черная фасоль мунга, урд-бобы индийской фасоли. Основной состав микроорганизмов представлен грамположительными кокками и палочками, подавляющее большинство было за L. mesenteroides, а второй по численности вид занимал E. faecalis. За подъемную силу в лепешках идли отвечает L. mesenteroides. Это – пожалуй, единственный известный случай, когда молочнокислые бактерии играют эту роль в естественно ферментированном хлебе (Rose, 1982).

26 1.3 Дрожжи в промышленной биотехнологии Для производства спирта из мелассы, необходимы дрожжи с высокими показателями бродильной активности, они должны быть устойчивыми к высокой концентрации солей, обладать анаэробным типом дыхания, должны быть устойчивыми к продуктам обмена посторонних микроорганизмов (Маринченко, 1975). Saccharomyces cerevisiae один из основных штаммов, применяемых для производства спирта из мелассы. Но такой генеративной активностью обладают не все представители семейства Saccharomyces cerevisiae (Микелов, 1995). Для дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae, как правило, основной средой для производства спирта, является питательная мелассная среда. Современной России необходимы прогрессивные технологии производства спирта употребляемого в пищевых целях. Прогресс задает установку, целью которой является получение физиологически активных штаммов дрожжей, обладающих высокой способностью сбраживать мелассное сусло. Достоверно известно о пользе минеральных и органических веществах в геотермальной воде нефенольного класса. И для дрожжей как дополнительный источник питательных веществ, возможно, ее применение. С применением геотермальной воды установлен подъем выработки этанола на 25 % и характерное снижение посторонних примесей, а именно, жирных кислот и эфирно-альдегидной массы, данные результаты обусловлены изменением процесса метаболизма во время брожения на основе возможного влияния веществ геотермальной воды. Геотермальная вода нефенольного класса с общей минерализацией 5,2 – 5,4 г/л, является максимально подходящим дополнительным источником для получения эффективной выработки физиологической активности штамма получаемого на мелассной питательной среде.

27 Для дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae, наличие таких минеральных веществ как: K, Na, Mg, Ca, Fe, Mn, а также борная и кремниевая кислоты крайне важны. Минеральные вещества являются стимуляторами мембранных перестроек в живой клетке, создают благоприятные условия для культивирования дрожжей (Пат. РФ 2492229). Дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные, расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза, интенсивно изучаются. Применение таких дрожжей позволит упростить и сократить стадию высоко затратного гидролиза полисахарид содержащих отходов. Обладая, отличительной способностью хорошо расти на инулине, и продуцировать ферменты амилазы и глюкоамилазы, расти на крахмале и его сбраживать, могут представители родов: Saccharomycopsis fibuliger, Schwanniomyces occidentalis. Также оба вида, являются перспективными продуцентами белка и амилолитических ферментов (Пат. РФ 2195846) Trichosporon pullulans является продуцентом целлюлазы, однако активность этих ферментов низкая и о промышленном использовании таких дрожжей говорить пока рано (Пат. РФ 2378366). Дрожжи рода Kluyveromyces хорошо растут на инулине, и вовлечение их в процесс получения белка, является перспективным направлением (Пат. РФ 2058992). Известен способ производства спирта, основанный на сбраживании молочной сыворотки дрожжами Candida psevdotropicalis. Наиболее близким по технологическим характеристикам к предлагаемому способу является известный способ получения спирта, предусматривающий разваривание крахмалосодержащего сырья, осахаривание его, разделение на два потока, один из которых направляют на дрожжегенерацию, а другой на сбраживание дрожжами Saccharomyces cerevisiae. Данный штамм выделен из сбродившей молочной сыворотки, штамм сбраживает большое количество сахаров, хорошо ассимилирует мочевину,

28 дрожжевой автолизат, азотнокислый аммоний, азотнокислый кальций. Штамм термотолерантен, температурный оптимум культивации варьируется в диапазоне 34-36 °С. Штамм неприхотлив в культивировании и хранении, возможно применение в пищевых целях требующих смешанного брожения. Отличительная способность штамма – способен образовывать этанол на подсырной молочной сыворотке с толерантнтностью к алкоголю до 7,2 % от объема используемой молочной сыворотки (Пат. РФ 2449012). Дрожжи – это огромная группа микроорганизмов, многообразие которых, дает возможность человеку применять их в различных целях. Перспектива использования дрожжей состоит не только от поиска новых штаммов дрожжей, но и от дальнейшей их селекции.

29 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Схема исследований Схема исследований представлена на рисунке 1. Плоды сливы Плоды груши Плоды персика Зерна ячменя Ягоды винограда Постановка накопительных культур Выделение чистых культур С2 Я1 С3 П4 В5 Г6 Изучение свойств чистых культур Культуральные свойства рост изолятов при различных температурах посев гигантских колоний Морфологические свойства Физиологобиохимические свойства размеры и форма клеток протеолитическая активность определение баллистоспор определение кинетики роста определение бродильной активности гемолитическая активность учет степени чувствительности к антибиотикам Отбор наиболее перспективных штаммов Рис.1. Схема исследований

30 2.2 Методы изучения культурально-морфологических свойств 2.2.1 Методы изучения морфологических признаков Для определения морфологических признаков клеток дрожжевых колоний готовят фиксированные и окрашенные простым способом препараты. При описании дрожжевых клеток обращают внимание, на их форму, размер, положение в пространстве, образование слизей, наличие оболочек (Жарикова, 2008). 2.2.2 Методы изучения культуральных признаков. Рост гигантской колонии дрожжей на сусло-агаре Для приготовления сусла, солод крупно размалывают и смешивают с водой, 250 г солода на 1 л воды (гидромодуль 1:4). Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10-20 % сахара. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8 % и стерилизуют 30 минут при температуре 115 °С. Для приготовления сусло-агара, к пивному суслу добавляют 2,5-3 % агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при температуре 115 °С (Максимова, 2006). Производят посев уколом в чашки Петри, после обматывают чашки пищевой пленкой. Это необходимое условие для пресечения проникновения сторонней микрофлоры. Инкубируют 20 суток при комнатной температуре. При описании дрожжевой колонии учитывают следующие признаки, определяемые на плотных и жидких средах: 1. Форму неправильная. колонии – округлая, амебовидная, ризоидная,

31 2. Размер (диаметр) колонии – очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре). 3. Поверхность колонии – гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная. 4. Профиль колонии – плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный. 5. Прозрачность – тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая. 6. Цвет колонии (пигмент) – бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием. 7. Край колонии – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый. 8. Структуру колонии – однородная, мелко – или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз. 9. Консистенцию колонии; определяют, прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой – тянется за петлей, хрупкой – легко ломается при соприкосновении с петлей (Максимова, 2006). Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают: помутнение, образование осадка, наличие пленки, изменение цвета среды, появление кольца на поверхности среды. Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают: помутнение, образование осадка, наличие пленки, изменение цвета среды, появление кольца на поверхности среды. Используя четырех – семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях. При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное

32 помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду (Максимова, 2006). 2.2.3 Определение роста изолятов дрожжей при различных температурах Для большинства видов дрожжей оптимальные температуры роста находятся в пределах 20-28 °С, но имеются также организмы, лучше развивающиеся при более низких или более высоких температурах. В качестве дифференцирующего признака у дрожжей выступает способность к росту в определенных условиях, в частности максимальных для роста. Учитывают различия в способности к росту в температурном диапазоне 20-25, 28-34, 37-39 и 40-45 °С (Егоров, 1989). При установлении к способности к росту дрожжи культивируют при различных температурах на сусло-агаре, морфологическом агаре, жидкой азотной основе с 0,5 % глюкозы или в жидкой глюкозопептонной среде с дрожжевым экстрактом. Инокулят готовят таким же образом, как для тестов на ассимиляцию источников углерода. На плотную среду посев выполняют штрихом, жидкие засевают 0,1 мл инокулята. При повышенных температурах на плотной среде дрожжи инкубируют 2-4 суток. При слабом росте делают пересев на ту же среду и вновь инкубируют при этой же температуре. Определяющими являются результаты второго пассажа. При тестировании на жидких средах инкубацию ведут на качалке. Учет результатов 1 и 3 недели производят так же, как в тестах на ассимиляцию источников углерода. При определении максимальной температуры роста дрожжи культивируют в жидкой глюкозопептонной среде с дрожжевым экстрактом. Засеянные пробирки инкубируют в водяных термостатах при температурах, различающихся между собой на градус. Учет производят через неделю (Егоров, 1989).

33 2.2.4 Определение образования баллистоспор Баллистоспоры можно наблюдать по появлению зеркального отражения штриха или колонии на крышках чашек Петри, инкубируемых в перевернутом положении. Так как образованию и отстреливанию баллистоспор способствуют относительная влажность пониженные температуры, температуры то в и опытах высокая используют следующие приемы. Посев штрихом любой формы производят на пластинку с картофельным или кукурузным агаром на предметном стекле, которое помещают в чашку Петри штрихом вниз над вторым стеклом без агарной пленки. Между стеклами располагают не большую U – образную стеклянную прокладку (Бабьева, 2004). Для поддержания влажной атмосферы в чашку кладут смоченную стерильной водой вату. Посевы инкубируют при 18-20 °С. Следят за появлением повторенного на нижнем штриха, стекле который визуально образуется заметного за счет зеркально отстреленных баллистоспор. При скудном спорообразовании баллистоспор можно не получить зеркального изображения. В этом случае необходимо добиться прорастания спор и появления визуально видимых колоний. Для этой цели применяют посев двумя параллельными или перпендикулярными штрихами на кукурузный агар, а в крышку чашки Петри заливают сусло-агар, на поверхность которого кладут стерильное стекло таким образом, чтобы оно располагалось над одним из штрихов. Чашки при инкубировании ставят в перевернутом положении при температуре не выше 25 °С (18-20 °С). Для поддержания влажности в чашки кладут смоченные водой комочки ваты. При появлении роста дрожжей снимают с сусло-агара стекло и наблюдают под микроскопом отстрелявшиеся баллистоспоры (Нетрусов, 2005).

34 2.3 Методы изучения физиолого-биохимических свойств изолятов 2.3.1Методы изучения протеолитической активности Гидролиз казеина выявляют на молочном агаре. Для этого готовят равные объемы обезжиренного молока и 3 % водного агара. Молоко стерилизуют при 0,5 атм, 3 % водный агар – при 1 атм. После стерилизации водный агар расплавляют и добавляют к нему при постоянном перемешивая подогретое стерильное молоко. Полученный молочный агар разливают в чашки Петри. Микроорганизмы сеют штрихом или уколом. Продолжительность культивирования 2-10 суток. Гидролиз казеина выявляют по просветлению среды вокруг штриха. Для большей четкости зоны просветления, среды обрабатывают 10 % НCI (Теппер, 2004). 2.3.2 Определение кинетики роста дрожжей Параметры периодического роста дрожжей изучают, пересевая чистые культуры в жидкую питательную среду. Культуру дрожжей предварительно выращивают на поверхности плотной среды. В динамике периодического роста определяют биомассу, подсчетом клеток в счетной камере Горяева-Тома. По полученным данным, строят кинетические кривые роста в полулогарифмических координатах. Параметры периодического роста жидких культур – фазы роста, μ – удельная скорость роста, g – время генерации (Шлегель, 1987). 2.3.3 Определение биомассы взвешиванием Чтобы определить массу сухих клеток, бюкс, центрифужную пробирку или фильтр с осадком клеток микроорганизмов помещают в сушильный шкаф, высушивают и взвешивают. Режим высушивания и

35 взвешивания тот же, что использовали и при определении массы бюкс, пробирок или фильтров. Сухую биомассу определяют по формуле 1: M= (𝑀−𝐴)1000 𝑉 , (1) где: М – сухая биомасса г/л; А – масса бюксы (центрифужной пробирки, фильтра) с осадком, г; В – масса бюксы (центрифужной пробирки, фильтра) без осадка, г; V – объем культуральной жидкости взятый для центрифугирования, мл (Егоров, 1989). 2.3.4 Определение бродильной активности пикнометрическим методом Для получения дистиллята, спирт из сусла отгоняют в приборе дистилляторе. Прибор состоит из перегонной плоскодонной или круглодонной колбы объемом 500 мл, закрывающейся пробкой, в отверстие которой вставлен каплеуловитель Кьельдаля, соединенный с кожухотрубным – противоточным холодильником к нижнему концу которого присоединена стеклянная трубка с узким концом так, чтобы конец трубки доходил почти до дна, но не касался его, и мерной колбы объемом 200 мл, которая служит приемником (Рухляева, 1979). Прибор для перегонки устанавливают на лабораторном столе и проверяют его герметичность, для чего 200 мл водно-спиртового раствора перегоняют 3 раза подряд. Крепость последнего дистиллята не должна быть ниже крепости исходного водно-спиртового раствора более чем на 0,1 % об. Фильтрат сусла наливают в мерную колбу вместимостью 200 мл при температуре 20 °С. Затем раствор переносят из мерной колбы в перегонную. Мерную колбу ополаскивают 2-3 раза дистиллированной водой (по 10-12 мл) и промывную воду сливают в перегонную колбу. Туда

36 же опускают полоску индикаторной бумаги и для нейтрализации кислот к раствору сусла приливают 1 н раствор гидроксида натрия. Приемной колбой служит та же мерная колба, которой отмеривали фильтрат сусла. Мерную колбу ополаскивают водой, наливают в нее 15-20 мл дистиллированной воды и погружают в нее узкий конец стеклянной трубки холодильника для получения водяного затвора, затем колбу помещают в холодную воду (6-8 °С) и начинают перегонку. Во время перегонки дистиллят перемешивают вращением колбы. Когда приемная колба наполнится примерно наполовину, ее опускают так, чтобы конец трубки холодильника не погружался в дистиллят. Конец трубки ополаскивают 5 мл дистиллированной воды и продолжают перегонку без водяного затвора. Когда приемная колба полнится на 4/5 своего объема, перегонку прекращают. Дистиллят энергично перемешивают, закрывают пробкой и выдерживают в водяной бане при температуре 20 °С в течение 30 мин. Затем объем содержимого колбы доводят до метки дистиллированной водой той же температуры и смесь перемешивают. Далее измерения содержания спирта в дистилляте определяют погружным рефрактометром. 2.3.5 Определение содержания спирта погружным рефрактометром Спирт наливают в два стакана и помещают их на 10-15 мин в термостат с температурой 20 °С. Погружной рефрактометр проверяют перед каждым определением. Во время анализа необходимо следить за тем, чтобы температура не изменилась. Отсчет начинают делать через 2-3 мин после погружения рефрактометра. Измерив показания в одном стакане, рефрактометр вынимают, вытирают призму и опускают его во второй стаканчик. За конечный результат принимают среднее значение из двух полученных величин и по таблице содержания спирта в водно-

37 спиртовом растворе по показаниям рефрактометра находят содержание спирта в сусле (Рухляева, 1979). 2.3.6 Определение гемолитической активности Посев исследуемой культуры, проводится следующим способом: инкубирование посевов при температуре 36 °С в течение 24-48 часов и измерение ширины зоны гемолиза, заключающимся в том, что посев исследуемой культуры осуществляют на поверхность питательной среды, в качестве питательной среды используют двухслойный кровяной агар со следующим содержанием компонентов, мл на чашку Петри: подложечный агар (1 % агар «Дифко», приготовленный на физиологическом растворе) – 15-20; покрывной агар (на 100 мл: 50 мл мясо-пептонного бульона, 0,7 г агара «Дифко», NaCl с учетом его содержания в МПБ до 0,85 г, дистиллированная вода до 100 мл, 3-4 мл эритроцитов барана) – и после инкубирования по характеру изменения окраски колонии и зоны гемолиза визуально определяют тип гемолитической активности, а по соотношению радиуса колонии и ширины зоны гемолиза – ее уровень (Нетрусов, 2005). При посеве материала на чашку Петри на поверхности агара вырастают отдельные колонии микроорганизма. Через 24-48 часов вокруг колоний образуется четко ограниченная прозрачная зона гемолиза (β-гемолиз) или прозрачная зона с зеленящим эффектом (α-гемолиз). Об уровне гемолитической активности судят по соотношению радиуса колонии и ширины зоны гемолиза через 48 часов (Нетрусов, 2005).

38 2.3.7 Учет степени чувствительности к антибиотикам Определение чувствительности дрожжей к антибиотикам проводят методом дисков. Исследуемую культуру микроорганизмов, засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри. Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией. На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры судят о ее чувствительности к антибиотикам. Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, определять чувствительность микроорганизмов нужно методом серийных разведений (Жарикова, 2008).

39 ГЛАВА 3. ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ШТАММЫ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 3.1 Изучение культурально-морфологических свойств выделенных изолятов Исследования микроорганизмов включают следующий алгоритм действий, а именно: определение микроорганизмов до вида, до рода, исследование культуральных, морфологических, физиолого- биохимических признаков, характер взаимодействия с другими видами микроорганизмов, адаптации и особенностей изменчивости, исследование продуктов их жизни деятельности, например, токсины, ферменты. В ходе работы были выделены изоляты дрожжей из природных субстратов: зерен ячменя, плодов сливы, плодов персика, ягод винограда, плодов груши. Объектами исследования являются изоляты дрожжей именуемые далее, как дрожжи: Я1; С2; С3; П4; В5; Г6. Результаты исследования представлены в таблице 1. Таблица 1 Объекты исследования Объект Изолят Зерна ячменя Я1 Плоды сливы С2 Плоды сливы С3 Плоды персика П4 Ягоды винограда В5 Плоды груши Г6

40 3.2 Морфологические признаки изолятов Морфология дрожжей включает признаки, характеризующие отдельные клетки (форма, размеры), а также способы вегетативного и бесполого размножения и образуемые при этом структуры. Для определения морфологических признаков клеток в колониях дрожжей, готовили фиксированные и окрашенные фуксином или генцианвиалетом препараты. При описании дрожжевых клеток обращали внимание, на их форму, размер, подвижность. Результаты исследования микроморфологических изолятов дрожжей, представлены на рисунке 2. а б в г признаков

41 д е Рис. 2. Морфологические признаки изолятов дрожжей: а –Я1; б – С2; в – С3; г – П4; д – В5; е – Г6 Результаты исследования микроморфологических признаков изолятов дрожжей представлены в таблице 2. Таблица 2 Морфологические признаки изолятов Название изолята Я1 С2 С3 П4 В5 Г6 Длина мкм 3 ± 0,05 2,5 ± 0,02 2 ± 0,02 2 ± 0,04 3 ± 0,03 2 ± 0,01 Ширина мкм 3 ± 0,01 5 ± 0,01 5 ± 0,01 2,5 ± 0,02 4 ± 0,01 2,5 ± 0,02 В результате исследования морфологических признаков выделенных изолятов, были определены следующие признаки: размеры клеток изолятов крупные, варьируются в диапазоне 1,5-5 мкм в диаметре, имеют характерные округлую и овальную форму клеток, не образуют оболочек и псевдомицелия, не подвижны. Таким образом, все клетки выделенных изолятов, являются представителями несовершенных грибов.

42 3.3 Культуральные признаки изолятов Дрожжевые культуры, растущие на плотных средах, по консистенции бывают чаще всего пастообразными, слизистыми, вязкими, клейкими, кожистыми или крошащимися. Слизистый рост характерен для многих анаморфных базидиомицетовых дрожжей родов Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces, образующих большое количество внеклеточных полисахаридов, а также для аскомицетовых почвенных дрожжей рода Lipomyces. Большей частью у аскомицетовых дрожжей колонии пастообразные или сухие, культуры при росте на скошенном агаре не стекают на дно пробирки. У большинства дрожжей колонии белые часто приобретающие при старении кремовый или слегка коричневатый оттенок. У некоторых аскоспоровых дрожжей, например из родов Nadsonia или Lipomyces, старые колонии при обильном спорообразовании темнеют и становятся бурыми или шоколадными. Многие дрожжи образуют пигменты, окрашивающие их колонии в различные цвета. При росте в жидких средах дрожжи вызывают помутнение, образуют осадок, кольцо на стенках пробирки, разного характера пленки. Как правило, рост в виде пленки характеризует способность дрожжей объединяться в мицелиальные структуры, это свидетельствует об окислительном типе энергетического метаболизма. В ходе исследования были выращены гигантские колонии изолятов дрожжей на питательной среде сусло-агар. Гигантские колонии дрожжей представлены на рисунке 3.

43 а б в г д е Рис. 3. Гигантская колония дрожжевых изолятов: а – Я1; б – С2; в – С3; г – П4; д – В5; е – Г6 Результаты исследования культуральных признаков, исследуемых изолятов представлены в таблице 3.

44 Таблица 3 Культуральные признаки изолятов Признаки Форма Я1 округлая С2 округлая Изоляты С3 П4 В5 округлая округлая округлая Г6 округлая Размер, мм Поверхность 50 40 30 30 30 30 бугристая складчатая складчатая гладкая гладкая гладкая Профиль плоский плоский плоский плоский плоский плоский матовая матовая матовая матовая матовая матовая белый белый кремовый белый волнистый волнистый волнистый однородная однородная однородная волнистый не однородная мягкая кремовый волнистый однородная мягкая кремовый волнистый однородная мягкая Оптические свойства Цвет Край колонии Структура Консистенция плотная плотная плотная При изучении культуральных признаков изолятов: Я1, С2, С3, П4, В5, Г6 – выявлены такие признаки дрожжей, как: способность образовывать гигантские колонии. У колоний определена поверхность, структура, консистенция и цвет. Колони выращены в течение десяти дней на питательной среде сусло-агар, при температуре 18-20 оС. Отсутствие красного, розового, оранжевого и желтого пигментов, говорит о том что данные изоляты не относятся к базидиомицетовым дрожжам рода Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium, отсутствие бурого и черного пигментов – свидетельствует об отсутствии накопления меланинноподобных пигментов. Колонии имеют сухую и пастообразную консистенцию, как у большинтва аскомицетовых дрожжей. Наличие у всех гигантских колоний волнистых неворсинчатых свидетельствовать об отсутствии образования мицелия. краев, может

45 3.4 Рост дрожжей при различных температурах Температура – важнейший фактор для развития микроорганизмов. Для каждого из микроорганизмов существует минимум, оптимум и максимум температурного режима для роста. По этому свойству микроорганизмы подразделяются на три группы: Психрофилы – микроорганизмы, хорошо растущие при низких температурах с минимумом при 10-0 °С, оптимумом при 10-15 °С; Мезофилы – микроорганизмы, для которых оптимум роста наблюдается при таких температурах как: 25-35 °С, минимум – при 5-10 °С, максимум – при 50-60 °С; Термофилы – микроорганизмы, хорошо растущие при относительно высоких температурах с оптимумом роста при 50-65 °С, максимумом – при температуре более 70 °С. Изучали влияние температуры на рост изолятов методом посева штрихом на плотной питательной среде сусло-агар, с последующей инкубацией в диапазоне температур (5 °С; 25 °С; 30 °С; 37 °С и 40 °С). В ходе исследования было обнаружено отсутствие роста изолятов в диапазоне температур: 40 °С. Результаты исследования представлены в таблице 4. Таблица 4 Рост при различных температурах Изолята Я1 5 °С 25 °С 30 °С 37 °С 40 °С × + + + - С2 × + + + - С3 × + + + - П4 × + + + - В5 × + + + - Г6 × + + + - Примечания – «+» – есть рост, «–» – нет роста, «×» – слабый рост

46 В ходе изучения влияния температур на рост изолятов на плотных питательных средах, был выявлен рост изолятов при показателях температуры: 5 °С, 25 °С, 30 °С и 37 °С, абсолютное отсутствие роста обнаружено при температуре: 40 °С. Температурный оптимум роста у всех изотятов дрожжей находящийся в диапазоне 25-37 °С характеризует их как микроорганизмов относящихся к мезофильной группе, также был выявлен слабый рост при температуре 5 °С, данное исследование показало температура 5 °С является оптимальной для хранения культур. 3.5 Образование баллистоспор Образование баллистоспор, активно отстреливающихся бесполых спор характерный признак многих видов базидиомицетовых дрожжей (Бабьева, 2004). Баллистоспоры – это экзогенные споры (конидии), которые формируются на заостренных кончиках особых выростов – стеригм, и при созревании с силой отстреливаются за счет капельно-экскреторного механизма. Таким же образом у базидиомицетов отстреливаются созревшие базидиоспоры за счет резкого увеличения тургорного давления в стеригме и выталкивания капельки жидкости, которая и несет на себе спору. Способность к образованию баллистоспор, обладают дрожжи родов Sporidiobolus, Sporobolomyces, Bullera. Большинство баллистоспоровых дрожжей образуют каратиноидные пигменты (Чернов, 2013). В результате исследования было обнаружено, что исследуемые изоляты не образуют баллистоспор, наблюдалось отсутствие каратиноидного пигмента. Для выявления данного признака посевы производились на картофельноглюкозном агаре с дальнейшим микроскопированием. Отсутствие баллистоспор свидетельствует о том, что все выделенные Basidiomycetes. изоляты не относятся к дрожжам класса

47 ГЛАВА 4. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТОВ 4.1 Протеолитическая активность изолятов Пиво это продукт спиртового брожения, преимущественно рода Saccharomyces, и ячменного солода. По составу ячмень богат углеводами, витаминами и белками, которые в свою очередь также являются благоприятной средой для развития поточной контаминации продукта. Известно, что микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты – протеазы, катализирующие расщепление белков. В ходе исследования культуру засевали на молочном агаре. Для этого готовили равные объемы обезжиренного молока и 3 % водного агара. Молоко стерилизовали при 0,5 атм, 3 % водный агар – при 1 атм. После стерилизации водный агар расплавляли и добавляли к нему при постоянном перемешивании подогретое стерильное молоко. Полученный молочный агар разливали в чашки Петри. Микроорганизмы сеяли штрихом. Продолжительность культивирования 2-10 суток. При выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется – пептонизируется, в результате чего молоко просветляется и приобретает легкий кремовый оттенок. В ходе исследования, изолятов дрожжей – протеолитической активности по отношению к казеину молока не выявлено. Протеолитическая активность дрожжей может привести искажению органолептических показателей продукта, и как следствие, порче пива. Отсутствие протеолитической активности, говорит о дальнейшей перспективе исследования, и применения изолятов в бродильной промышленности.

48 4.2 Кинетика роста изолятов Кинетика роста микроорганизмов составляет основу количественного анализа микробиологических процессов. Кинетика роста популяций микроорганизмов динамики микробиологических позволяет выделить процессов. различные Типичная кривая типы роста позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу отмирания. Результаты кинетических исследований, представлены на рисунке 4. а в б г

49 д е Рис. 4. Кинетика роста изолятов дрожжей: а – Я1; б – С2; в – С3; г – П4; д – В5; е – Г6 Динамику прироста клеток оценивали путем отбора проб с момента засева через каждые 4 часа в течение 48 часов, клетки подсчитывали в счетной камере Горяева. Результаты кинетических исследований показывают, что каждая из шести культур дрожжей обладает специфической кривой роста. Кинетические кривые изолятов: Я1, С2, С3, П4, В5, обладают некоторым сходством. Все культуры растут в два этапа, причем на каждом этапе их скорость существенно не различается. Стационарная фаза не выражена: сразу после максимального значения биомассы наблюдается ее снижение. Также наблюдается характерное отличие кинетической кривой у изолята В5, а именно: самая короткая лаг-фаза, данное исследование, отмечает способность изолята максимально быстро осуществлять прирост биомассы, таким образом, предположительно сохраняя среду от возможной контаминации. Кинетическая кривая изолята Г6 обладает специфической кривой, растет в три этапа с характерным снижением и подъемом биомассы, стационарная фаза не выражена, после повторного набора биомассы наблюдалось резкое снижение роста клеток. Кинетическая кривая носит колебательный характер, что возможно объяснить частичным автолизом

50 клеток в популяции, который предоставляет дополнительный питательный субстрат для дрожжей. Автолиз дрожжей наблюдается при выработке игристых вин, что способствует обогащению букета вина. Результатом автолиза являются характерные (так называемые «лизатные») тона в вине – нюансы аромата, напоминающие корочку свежевыпеченного хлеба, крекеров, иногда сушеных грибов, вплоть до небольших нефтяных оттенков. 4.3 Бродильная активность изолятов Бродильная активность дрожжей – важный технологический признак дрожжей, так как определяет длительность главного брожения, физикохимические свойства пива, его биологическую стойкость. Она оценивается по таким показателям, как скорость потребления сахаров, количество выделившегося при этом диоксида углерода, и величина конечной степени сбраживания сусла. По степени сбраживания все штаммы дрожжей делят на 3 группы: низкосбраживающие, среднесбраживающие и высокосбраживающие. Скорость и степень сбраживания сусла связаны с активностью мальтозопермеазы, мальтотриозопермеазы, α-глюкозидазы, β-фруктофуранозидазы, участвующих взаимосвязь в алкогольдегидрогеназы сбраживании между сахаров бродильной сусла. активностью – ферментов, Существует и тесная флокуляционной способностью дрожжей: чем выше степень флокуляции, тем позже достигается конечная степень сбраживания пива. Для оценки бродильной активности штаммов все показатели, характеризующие их свойства, определяли в одинаковых условиях, температура воздуха в помещении составляла 22 о С. Во всех экспериментах использовали изоляты дрожжей: Я1, С2, С3, П4, В5, Г6. Начальная концентрация клеток составляла: Я1 = 1,7×103 клеток/мл;

51 2 2 С2 = 1,2×10 клеток/мл; С3 = 5,8×10 клеток/мл; П4 = 5,2×103 клеток/мл; В5 = 2,3×104 клеток/мл; Г6 = 0,9×103 клеток/мл. В качестве питательной среды использовали солодовое сусло с начальной плотностью 12 %, 16 %, 20 %. Пропорция сухой навески дрожжей составляла: 1г/50мл сусла. Сусло, лабораторная посуда и используемые в работе материалы повергались стерилизации в автоклаве. Для определения бродильной активности применяли пикнометрический метод и определяли содержание спирт погружным рефрактометром. Результаты эксперимента представлены в таблице 5. Таблица 5 Толерантность к алкоголю НПС Я1 С2 С3 П4 В5 Г6 12 % 0,757 % 1,39 % 1,29 % 1,29 % 2,604 % 1,85 % 16 % - 0,393 % - 0,833 % 4,136 % - 20 % - - - - 0,57 % - Исходя из данного эксперимента, можно сделать вывод, о том что по степени сбраживания штаммы дрожжей Я1, С2, С3, П4 и Г6 – являются низкосбраживающими. Органолептика НПС 12-16 % при брожении, содержала букет груши сорта «Дюшес» у изолятов С2, С3, П4. Изоляты Я1 и Г6 обладают слабо выраженным винно-кислым букетом. Кроме того в связи с увеличением начальной плотности сусла, менялась бродильная активность, наблюдалось характерное снижение активности, впоследствии влияющее на органолептические свойства продукта. В НПС 20 % у таких изолятов как: Я1, С2, С3, П4, Г6 произошло скисание. Изолят дрожжей В5 показал самые высокие результаты при брожении с НПС 12 %, 16 %, 20 %, органолептика сусла после брожения имела выраженный виноградный аромат. Таким образом, результат исследования изолята дрожжей В5 говорит о нем, как об активносбраживающем изоляте и возможном его применения в пищевых целях, а именно, в бродильных процессах.

52 4.4 Гемолитическая активность выделенных изолятов Гемолитическая активность у микроорганизмов проявляется как способность к разрушению форменных элементов крови, в данном случае эритроцитов. Гемолитические свойства выявляются в виде зоны гемолиза (просветления) вокруг колонии, при выращивании культуры на МПА с 5/0 дефибринированной крови. Для определения типа гемолиза изолята, клетки отбирали стеклянной палочкой (иглой) и однократным касанием наносили на поверхность агара. Посевы инкубировали при температуре 36 оС. Учет результатов провели через 24, 48 ч, визуально оценили тип гемолиза. Через 24-48 часов вокруг колоний образуется четко ограниченная прозрачная зона гемолиза – β-гемолиз. В том случае, если колония и формирующаяся вокруг нее зона гемолиза окрашиваются в зеленоватокоричневый цвет, тип гемолиза оценивали как α-гемолиз. Входе исследования была выявлена гемолитическая активность изолята дрожжей С3 – радиус колонии 5мм, ширина зоны гемолиза 6 мм без зеленящего оттенка, тип β-гемолиза. Что свидетельствует о потреблении веществ эритроцитов в процессе метоболизма изолята. Наличие гемолитической активности у изолята С3, говорит о невозможности его применения в пищевых целях, а имеено, в бродильных процессах, потому как, ниличие гемолиза у микроорганизмов свидетельствует о возможных патогенных свойствах. 4.5 Показатели степени чувствительности к антибиотикам По степени микроорганизмы чувствительности подразделяются на: к основным антибиотикам чувствительные, умеренно

53 чувствительные и устойчивые. В группу чувствительных входит большинство штаммов микроорганизмов, рост которых на питательных средах прекращается при использовании концентраций, соответствующих средним терапевтическим дозам антибиотиков. Если он угнетается при применении только микроорганизмы максимальных умеренно доз препаратов, чувствительны к то антибиотику. такие Если подавление роста достигается опытным путем в лаборатории при очень высокой концентрации препарата которую нельзя создать в организме, такие микроорганизмы относятся к устойчивым к антибиотику. Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антибиотическая активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. При ее изучении наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности антибиотика задерживать рост тест-микроорганизма. При выборе антибиотика должны использоваться сведения о минимальных подавляющих концентрациях для отдельных микроорганизмов, которые могут быть разными как по отношению к виду микроорганизма, так и к различным тканям (средам). На практике терапевтическая активность достигается при назначении антибактериальных препаратов в дозах, обеспечивающих более высокий их уровень в средах преимущественного обитания возбудителей. Исследования антибиотикорезистентности проводили на изолятах дрожжей с применение таких антибиотиков как: 1. Левофлоксацин – синтетическое химиотерапевтическое средство, фторированный карбоксихинолон, свободный от примесей S-энантиомер рацемического соединения – офлоксацина. Препарат относящийся к группе антибиотиков широкого спектра действия, фармакологической группе – хинолонов-фторхинолонов.

54 2. Ципрофлоксацин – препарат характеризуется достаточно широким спектром положительного лечебного действия. Он принадлежит к фармакологической группе фторхинолонов. 3. Кетоконазол – относится к фармакологической группе – противогрибковые средства, тормозит синтез эргостерола, триглицеридов и фосфолипидов, необходимых для синтеза клеточной стенки грибков (грибки теряют способность к образованию нитей и колоний), нарушает проницаемость клеточной стенки. Активен в отношении дерматофитов, дрожжеподобных грибков рода Candida и плесневых грибков, возбудителей системных микозов. 4. Цефтриаксон – антибиотик III поколения, относящийся к фармакологической группе цефалоспоринов, антибиотик широкого спектра действия. Бактерицидная активность обусловлена подавлением синтеза клеточной стенки бактерий. Отличается устойчивостью к действию большинства бета-лактамаз грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. 5. Ванкомицин – фармакологическая группа триглициридов. Антибиотик, выделенный из Amycolatopsis orientalis (Nocardia orientalis). Активно действует только на микроорганизмы, находящиеся в стадии размножения. 6. Бацитроцин – антибиотик белковой природы, синтезируемый Bacillus licheniformis – подавляет синтез клеточной стенки многих грамположительных бактерий. Результаты исследования представлены на рисунке 5.

55 15 Я1 С2 10 Г6 В5 П4 С3 С2 5 0 Я1 Изоляты Зона угнетения, мм 20 С3 П4 В5 Г6 Антибиотики Рис. 5. Степень чувствительности к антибиотикам В ходе исследования было выявлено, полное отсутствие чувствительности антибиотическим веществам таких групп как: хинолоны, фторхинолоны, цефалоспорины, триглицериды. Наблюдалась высокая чувствительность к антигрибковому препарату кетоконазол, активные вещества которого, тормозят синтез эргостерола, триглицеридов и фосфолипидов, грибы теряют способность образовывать колонии. Данный результат подтверждает природу изолятов, как одноклеточных грибов.

56 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате исследований получены данные о дрожжах, выделенных с поверхности субстратов: сливы; персика; груши; винограда; ячменя. Изучены культуральные и морфологические признаки изолятов, физиолого-биохимические свойства, развитие дрожжей в широком диапазоне температур – 5-37 о С. Определена бродильная активность дрожжей как важный технологический признак. Изучение кинетики роста изолятов, выявило характерные особенности, участвующие в компоновке букета конечного продукта, органолептику продукта и динамику роста клеток. Выбор субстратов проводился в пользу произрастающих на территории Астраханской области, с ее характерной климатической зоной – континентальной, сухой. По итогам исследования изоляты выделенные с поверхности субстратов обладают термотолерантным свойством, важным качеством технологического процесса – брожения, позволяющего снизить затраты на охлаждение бродильного помещения. Изоляты дрожжей В5 и Г6, по своим характеристикам, являются наиболее перспективными для дальнейшего их изучения, селекции и возможного применения в бродильной промышленности.

57 ВЫВОДЫ 1. Выделены изоляты дрожжей из растительных субстратов: плодов персика, сливы, груши; ягод винограда; зерен ячменя. Выбор субстратов был сделан в пользу произрастающих на территории Астраханской области, с учетом климатической зоны. 2. В ходе изучения культуральных признаков определены: размер и форма, отсутствие образования баллистоспор. Морфологические признаки выявили: что все изоляты представлены овальными вытянутыми клетками, размер которых варьируется в диапазоне 1,5-5 мкм, не образуют псевдомицелия. 3. По данным физиолого-биохимического исследования выявлена гемолитическая активность изолята дрожжей С3, тип β-гемолиза. По степени чувствительности к антибиотикам – высокая чувствительность к препарату «Кетоконазол». Отсутствие протеолитической активности. 4. В результате экспериментальных исследований кинетики роста дрожжей определены следующие показатели: специфический рост изолятов, фазы кинетики роста. 5. В ходе изучения бродильной активности определены длительность брожения, объемы спирта отбродившего сусла при различных показателях начальной плотности сусла, максимальные и минимальные показатели содержания спирта, после дистилляции (мин. 0,57 %; макс. 4,136 %), органолептика продукта. 6. Определены наиболее перспективные штаммы дрожжей В5 и Г6 исследование и потенциал которых, предполагают применение в пищевой промышленности и исключение необходимости приобретения посевного материала за рубежом.

58 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Азаров, В. Н. Основы микробиологии и санитарии [Текст] : учебник для техникумов по спец. «Товароведение и орг. торговли прод. товарами» / В. Н. Азаров. – 2-е изд., перераб. – М. : Экономика, 2010. – 206 с. : ил. : 20 см. – Библиогр.: с. 157-160. – 2200 экз. 2. Бабьева, И. П. Биология дрожжей [Текст] : спецкурс для студентов биол.-почв. фак. и фак. почвоведения ун-тов / И. П. Бабьева, И. Ю. Чернов; МГУ им. М. В. Ломоносова. – М. : Изд-во МГУ, 2004. [2] с. : ил.; 22 см. – Библиогр.: с. 208-222. – 700 экз. – ISBN 5-211-02878-3. 3. Германов, Н. И. Микробиология [Текст] : пособие для преподавателей / Н. И. Германов ; под. общ. ред. П. А. Генкеля. – М. Просвещение, 1969. – 227, [2] с. : ил. ; 22 см. – Библиогр.: с. 227- 229. – ISBN 5-09-001428-0. 4. Голубев, В. И. Методы выделения и идентификации дрожжей [Текст] : учебник / В. И. Голубев, И. П. Бабьева. – М. : Пищевая промышленность, 2009. – 120 с. : ил. ; 20 см. – Библиогр.: с. 110-113. – 700 экз. – ISBN 5-09-361288-0. 5. Горбунов, Л. В. Биометрия [Текст] : учебное пособие для студентов биотехнологического направления (в том числе иностранных) / Л. В. Горбунов, Н. Ф. Клещев. – Х. : НТУ ХПИ, 2014. – 160, [2] с. : ил. ; 20 см. – Библиогр.: с. 121-123. – ISBN 978-617-05-0107-3. 6. Грачева, И. М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия [Текст] : учеб. для вузов по спец. Биотехнология / И. М. Грачева, Л. А. Иванова, В. М. Кантере. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : Колос, 1992. – 382, [1] с. : ил. ; 21 см. Библиогр.: с. 243-245. – 2500 экз. – ISBN 5-10-002054-7. 7. Егоров, Н. С. Промышленная микробиология [Текст] : учебное пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» / Н. С. Егоров, З. А. Аркадьева, А. М. Безбородов, И. Н. Блохина [и др.] ; Под ред. Н. С.

59 Егорова. – М. : Высшая школа, 1989. – 686, [2] с. : ил. ; 22 см. – Библиогр.: с. 308-313. 4000 экз. – ISBN 5-06-001482-7. 8. Еремина, И. А. Микробиология [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И. А. Еремина. – М. : Академия, 1999. – 114, [1] с. : ил. ; 20 см. – Библиогр.: с. 100-102. – ISBN 5-9532-0166-4. 9. Жарикова, Г. Г. Основы микробиологии : практикум / Г. Г. Жарикова, И. Б. Леонова. – М. : Академия, 2008. – 136, [1] с. : ил. ; 22 см. – Библиогр.: с. 132-133. – 2000 экз. – ISBN 978-5-7695-3472-0. 10. Кисленко, В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст] : учебник / В. Н. Кисленко, Н. Н. Колычев, Р. Г. Гостанов. – 4-е, перераб. и доп. – М. : ГЭОТАР – Медия, 2012. – 764, [17] с. : ил. ; 22 см. – Библиогр.: с. 729-746. – 1000 экз. – ISBN 5-9704-2298-4. 11. Кунце, В. Технология солода и пива [Текст] / В. Кунце, Г. Мит. ; пер. с нем. А. А. Куреленкова. – СПб. : Профессия, 2009. – 912 с. : ил. ; 21 см. – Библиогр.: с. 80-87. – 700 экз. 12. Максимова, Е. Н. Практикум по микробиологии [Текст] : (дневник наблюдений) / Е. Н. Максимова, Т. П. Денисова, Е. В. Симонова ; Восточно-Сибирская гос. акад. образования, каф. общей биологии и экологии. – Иркутск : НЦ РВХ СО РАМН, 2006. – 28 с. : ил. ; 21 см. – Библиогр.: с. 13-15. – 150 экз. – ISBN 978-5-98277-137-7. 13. Маринченко, В. А. Технология спирта из мелассы [Текст] : учебное пособие / В. А. Маринченко, Б. Д. Метюгиев, В. Н. Щвец. – Киев. : Вища школа, 1975. – 283, [1] с. : ил. ; 22 см. – Библиогр.: с. 281-283. – 2000 экз. 14. Микелов, А. Н. Бродильная активность различных рас дрожжей [Текст] / А. Н. Микелов, Э. М. Соболев, В. М. Боярский // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. – 1995. – №5. С. 14-16. – Библиогр.: с. 16. 15. Меледина, Т. В. Физиологическое состояние дрожжей [Текст] : учебное пособие / Т. В. Меледина, С. Г. Давыденко, Л. М. Васильева. –

60 СПб. : НИУ ИТМО, 2013. – 48 с. : ил. ; 20 см. – Библиогр.: с. 17-19. – 700 экз. 16. Нарцисс, Л. Краткий курс пивоварения [Текст] / Л. Нарцисс, В. Бак. ; пер. с нем. А. А. Куреленкова. – СПб. : Профессия, – 2007. – 640 с. : ил. ; 20 см. – Библиогр.: с. 229-235. – 2000 экз. – ISBN 978-5-93913-149-0 17. Нетрусов, А. И. Практикум по микробиологии [Текст] : учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. И. Нетрусов, М. А. Егорова, Л. М. Захарчук. ; под ред. А. И. Нетрусова. – М. : Издательский центр академия, 2005. – 608 с. – Библиогр.: с. 157-161. – ISBN 5-7695-1809-Х. 18. Пат. 2164941 Российская Федерация, кл. С 12 N 1/18, С 12 N 6, С 12 Р 7/06. Штамм Saccharomyces cerevisiae для получения спирта и биомассы хлебопекарных дрожжей [Текст] : / Зацепин С. С., Козлов Д. Г., Неволенский С. В. ; заявитель и патентообладатель Государственный уч.ислед. ин-т генетики и селекции. – № 99123777/13; заявл. 01.11.99; опубл. 10.04.2001. 19. Пат. 2195846 Российская Федерация, кл. А 23 L 1/30, А 23 J 8. Штамм Saccharomyces carlsbergensis, способ получения пищевого алогически активного продукта переработке дрожжей [Текст] : Акопян В. Б., Вольфович Д. И., Вольфович Л. Д. ; заявитель и патентообладатель Акопян Валентин Бабкенович, Вольфович Давид Исаакович, Вольфович Лев Давидович, №2000119882/13; заявл. 26.07.00; опубл. 10.01.2003. 20. Пат. 2058992 Российская Федерация, кл. С 12 N 1/16, С 12 Р 00, С 12 М 1/00, А 23 К 1/00. Штамм Candida utilis, способ получения белка и устройство для его осуществления [Текст] : Антипин Г. Захаров В. В., Салятов Ю. П., Сычев А. Е., Соколов А. А., Виноградов А.; заявитель и патентообладатель Антипин Георгий Васильевич. – № 136312/13; заявл. 14.07.1993; опубл. 27.04.1996. 21. Пат. 2378366 Российская Федерация, кл. C12N 1/16, C12P 7/06, C12R 1/865. Штамм Saccharomyces cerevisiae 1039, ВКПМ Y-3327, обладающий осмофильными свойствами, для получения этилового спирта

61 [Текст] : Римарева Любовь Вячеславовна, Оверченко Марина Борисовна, Игнатова Надежда Иосифовна, Останина Елена Владимировна, Поляков Виктор Антонович.; "Всероссийский биотехнологии Патентообладатель(и): научно-исследовательский Российской академии Гос. науч. институт учре-е пищевой сельскохозяйственных наук". 2008126477/13, заявл. 02.07.2008, опубл. 10.01.2010 Бюл. № 1. 22. Пат. 2449012 Российская федерация, кл. C12N 1/20, C12R 1/225 A23C 9/12. Штамм Saccharomyces unisporus ВКПМ Y-3416 [Текст] : Цугкиев Борис Георгиевич, Козырева Индира Индирбекова, Рамонова Элла Викторовна, Хаев Давид Ладеевич.; Патентообладатель(и): Фед. гос. образ. уч. высш. проф. образ. «Горский государственный аграрный университет». – 2010119744/10, заявл. 17.05.2010, опубл. 27.04.2012 Бюл. № 12. 23. Пат. 2492229 Российская Федерация, кл. C12N 1/16, C12P 7/06, C12R 1/865. Штамм Saccharomyces cerevisiae №8 Спиртовой (8-С) [Текст] : Котенко Светлана Цалистиновна, Халилова Эсланда Абдурахмановна, Исламмагомедова Эльвира Ахмедовна, Аливердиева Динара Алиевна.; Патентообладатель(и): Фед. гос. бюд. учреж-е науки Прикас-ий институт био-х рес-в Дагестанского науч. центра РАН. – 2012119355/10; заявл. 11.05.2012, опубл. 10.09.2013 Бюл. № 25. 24. Римарева, Л. В. Влияние ферментативных систем на биохимический состав зернового сусла и культуральные свойства осмофильной расы спиртовых дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae [Текст] : Л. В. Римарева, М. Б. Оверченко, Е. М. Серба, Н. И. Игнатова // Научно-технический и производственный журнал. – М. : Пищпромиздат. 2013. – №1. С. 8-11. – Библиогр.: с. 11. 25. Рухляева, А. П. Справочник для работников спиртовых лабораторий заводов [Текст] : учебное пособие / А. П. Рухляева, Т. Г. Филатова, В. С. Чередниченко. – М. : Пищевая промышленность, 1979. – 232 с. : ил. ; 21 см. – Библиогр.: с. 201-208. – 5000 экз.

62 26. Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии [Текст] : учебное пособие для вузов / Е. З. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева ; под ред. В. К. Шильниковой. – 5-е изд., перераб. и доп. – М. : Дрофа, 2004. – 256 с. : ил. ; 26 см. – Библиогр.: с. 119-124. – 3000 экз. – ISBN 5-71077437-5. 27. Шлегель, Г. Общая микробиология [Текст] / Г. Шлегель. ; пер. с нем. Л. В. Алексеевой. ; под ред. Е. Н. Кондратьевой. – М. : Мир, 1987. – 567с. : ил. ; 22 см. – Библиогр.: с. 157-159. – 2000 экз. 28. Чернов, И. Ю. Дрожжи в природе [Текст] : учебник / И. Ю. Чернов. – М. : Товарищество научных изданий КМК, 2013. – 336 с. : ил. ; 24 см. – Библиогр.: с. 85-93. – ISBN 978-5-87317-927-5. 29. Agate, A. D. Role of pectinolytic yeasts in the degradation of mucilage layer of Cojfez robusta cherries Appl [Text] / A. D. Agate, J. V. Bhat // Microbiology. – 1966. – V. 27. – P. 256-260 p. 30. Akinrele, I. A. Fermentation studies on maize during the preparation of a traditional African starch-cake food [Text] / I. A. Akinrele // Food Agriculture. – 1970. – V. 129. – P. 619-625 p. 31. Andersen, S. J. Compositional changes in surface mycoflora during ripening of naturally fermentec sausages [Text] / S. J. Andersen // Food Protect. – 1995. – V. 17. – P. 126-129 p. 32. Arihara, К. H. Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria applied to meat fermentation [Text] / К. H. Arihara // Journal Food Science. – 1998. – V. 103. – P. 544-547 p. 33. Alexopoulos, С. J. Introductory Mycology [Text] / С. J. Alexopoulos, C. W. Mims, M. Blackwell // Nature. – 2007. – V. 307. – P. – 363-365. 34. Barrette, J. Sciences des Alinentset de Nutrition [Text] / J. Barrette J. Chem // Technology and Biotechnology. – 2001. – V. 88. – Р. – 297-304. 35. Becze, J. Wiener tierärztliche [Text] / J. Becze // Nature. – 1964. – V. 19. – P. 204-220.

63 36. Berwal, J. S. Molds as protective cultures for raw dry sausages [Text] / J. S. Berwal, D. Dincho. // Critical reviews in food science and nutrition. – 1995. – V. 39. – P. 817-819. 37. Bokanga, M. Biotechnology and cassava processing in Africa [Text] / M. Bokanga // International Wound Journal. – 1995. – V. 2. – P. 86-90. 38. Buckle, K. A. Inhibition of bongkrek acid and toxoflavin production in tempe bongkrek containing Pseudomonas cocovenenans [Text] / K. A. J. Buckle // Journal of Microbiology, Immunology and Infection. – 1990. – V. 27. – P. 338-349. 39. Cai, Y. Lactobacillus paralimentarius sp., isolated from sough-dough [Text] / Y. Cai // Archives of Medical Research. – 1999. – V. 36. – P. 151-155. 40. Camargo, R. General observations on the microflora of fermenting cocoa beans (Theobroma cacao) in Bahia (Brazil) [Text] / R. Camargo, J. Leme // Food Technology. – 1963. – V. 893. – P. 1328-1330. 41. Collard, P. A two-stage fermentation of cassava [Text] / P. Collard, S. Levi // Nature. – 1959. – V. – P. 620-621. 42. Collins, M. D. Taxonomic studies on some leuconostoc like organisms from fermented sausages: description of a new genus weissella for the leuconostoc paramesenteroides group of species [Text] / M. D. Collins, J. Samelis, J. Metaxopoulos, S. Wallbanks // Critical reviews in food science and nutrition. – 1993. – V. – P. 595-603. 43. Cummings, A. A survey of apple cider production practices and microbial loads in cider in the state of Iowa [Text] / A. Cummings, C. Reitmeier, L. Wilson, B. Glatz // New York: Academic Press. – 2002. – V. – P. 745-751. 44. Deak, T. Identification of food bome yeasts [Text] / T. Deak, L. R. Beuchat // International Wound Journal. – 1987. – V. – P. 243-264. 45. Deibel, R.H. Pediococcus cerevisiae: a starter culture for summer sausage [Text] / R. H. Deibel, C. F. Niven // Bacteriology Protect. – 1957. – V. – P. 145-151.

64 46. De Vuyst, L.V. The biodiversity of lactic acid bacteria in greek traditional wheat sourdoughs is reflected in both composition and metabolite formation [Text] / L.V. De Vuyst, S. Paramithiotis, B. Hoste, M. Vancanneyt, J. Swings, G. Kalantzopoulos, E. Tsakalidou, W. Messens // New York: Academic Press. – 2002. – V. – P. 659-669. 47. Dicks, L. M. Proposal to reclassify Leuconostoc oenos to Oenococcus oeni [Text] / L. M. Dicks, T. F. Dellaglio, M. D. Collins // Journal Systems Bacterial. – 1975. – V. – P. 395-397. 48. Etchells, J. L. Factors influencing the growth of lactic acid bacteria during the fermentation of brined cucumbers. In Lactic Acid Bacteria in Beverages and Food [Text] / J. L. Etchells, H. P. Fleming, T. A. Bell, J. G. Carr, C. V. Cutting, G. C. Whiting // New York: Academic Press. – 1975. – V. – P. 281-305. 49. Everson, C. Wimproved starter culture for semidry sausage [Text] / C. Everson, W. E. Danner, P. A. Hammes // Food Technology. – 2007. – V. – P. 244-247. 50. Faparusi, S. I. Microflora of fermenting palm-wine [Text] / S. I. Faparusi, O. Bassir // Food Science Technology. – 1971. – V. – P. 206-210. 51. Garcia-Garcia, P. Content of biogenic amines in table olives [Text] / P. Garcia-Garcia, M. Brenes-Balbuena, D. Homero-Mandez, A. Garcia-Borrego, A. Garrido-Femandez // Journal Food Protect. – 2000. – V. – P. 111-116. 52. Giolitti, G. Microbiology and chemical changes in raw hams of Italian type [Text] / G. Giolitti, C. A. Cantoni, M. A. Bianchi, P. Renon // International Wound Journal. – 1971. – V. – P. 51-61. 53. Gobbetti, M. Lactobacillus sanfrancisco a key sourdough lactic acid bacterium [Text] / M. Gobbetti, A. Corsetti // Food Microbiology. – 1997. – V. – P. 175-187. 54. Greenwalt, C. J. Kombucha, the fermented tea: mcrobiology, composition, and claimed health effects [Text] / C. J. Greenwalt, K. H. Steinkraus, R. A. Ledford // Journal Food Protect. – 2000. – V. – P. 976-981.

65 55. Harris, D. A. The development of commercial starter culture for summer sausages [Text] / D. A. Harris, L. Chaiet, R. P. Dudley, P. Ebert // Critical reviews in food science and nutrition. – 1957. – V. – P. 235-492. 56. Hartman, P. A. The evolution of food microbiology, in food microbiology – fundamentals and frontiers [Text] / P. A. Hartman, M. P. Doyle, L. R. Beuchat, T. J. Montviil // ASM Press. – 2001. – V. – P. 365-371. 57. Heinonen, I. M. Antioxidant activity in berry and fruit wines [Text] / I. M. Heinonen, P. J. Lehtonen // Journal of agricultural and food mistry. – 1998. – V. – P. 299-310. 58. Kleyn, J. The microbiology of brewing [Text] / J. Kleyn, J. Hough // Microbiology. – 1971. – V. – P. 583-608. 59. Kreger-van R. The yeasts, a taxonomic study [Text] / R. Kreger-van // Amsterdam Elsevier. – 1984. – V. – P. 241-259. 60. Kunkee, R. E. A second enzymatic activity for decomposition of malic acid by lactic bacteria, in lactic acid bacteria in beverages and food [Text] / R. E. Kunkee, J. G. Carr, C. V. Cutting, G. C. Whiting // New-York Academic Press. – 1975. – V. – P. 29-42. 61. Manger, H. J. Speed of yeast propagation in breweries. Basis for sizing a yeast propagation plant [Text] / H. J. Manger // Systems Application Microbiology. – 2001. – V. – P. 117-123. 62. Okafor, N. Microbiology of Nigerian palm wine with particular reference to bacteria [Text] / N. Okafor // Journal Application Bacteriology. – 1975. – V. – P. 181-188. 63. Pearson, А.М. Processed meats [Text] / A. M. Pearson, F. W. Tauber // New-York Kluwer Academic Publishers. – 2004. – V. – P. 279-282. 64. Pitt, J. I. Fungi and Food Spoilage [Text] / J. I. Pitt, A. D. Hocking // New-York: Academic Press. – 1985. – V. – P. 365-370. 65. Rainbow, C. Beer spoilage lactic acid bacteria. In lactic acid bacteria in beverages and food [Text] / C. Rainbow, J. G. Carr, C. V. Cutting, G. C. Whiting // New-York: Academic Press. – 1975. – V. – P. 149-158.

66 66. Rose, A. H. Fermented foods. Economic microbiology series [Text] / A. H. Rose // New-York: Academic Press. – 1982. – V. – P. 239-245. 67. Satomi, M. B. Tetragenococcus muriaticus sp., a new moderately halophilic lactic acid bacterium isolated from fermented squid liver sauce [Text] / M. B. Satomi, M. Kimura, T. Sato, T. Fujii // International Journal Systems Bacteriology. – 1997. – V. – P. 732-836. 68. Schleifer, K. H. Taxonomic study of anaerobic Gram-negative, rodshaped bacteria from breweries. Emended description of Pectinatus cerevisiiphilus and description at Pectinatus frisingensis sp., Selenomonas lacticifex sp., Zymophilus paucivorans sp. [Text] / K. H. Schleifer, M. Leuteritz, N. Weiss, W. Ludwig, G. Kirchhof, H. Seidel-Rufer // International Journal Systems Bacteriology. – 1990. – V. – P. 156-271. 69. Schwan, R.F. Cocoa fermentations conducted with a defined microbial cocktail inoculum [Text] / R. F. Schwan // Systems Application Microbiology. – 2008. – V. – P. 1477-1483. 70. Semanchek, J.J. Survival of Escherichia coli 0157:H7 during fermentation of apple cider [Text] / J. J. Semanchek, D. A. Golden // Food Protect. – 1996. – V. – P. 956-1259. 71. Shieh, Y. G. Microbial changes in fermented peanut and soybean pastes containing kojis prepared using Aspergillus oryzae and Rhizopus oligosporus [Text] / Y. G. Shieh, L. R. Beuchat // Journal Food Science. - 1982. – V. – P. 518-522. 72. Smith, J. L. Microbiology of Lebanon bologna [Text] / J. L. Smith, S. A. Palumbo // The Journal of Microbiology. – 1973. – V. – P. 489-496. 73. Viljoen, B. C. The genus Candida, a historical account of its delimitation [Text] / B. C. Viljoen, J. L. Kock // Systems Application Microbiology. – 1989. – V. – P. 183-190.

67 ПРИЛОЖЕНИЯ

68 Приложение 1 Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Боева, К. Э. Выделение новых штаммов дрожжей, перспективы для использования в пищевой промышленности [Текст] / К. Э. Боева // Инновации в науке и практике : Сборник статей по материалам VI международной научно-практической конференции. В 5 ч. Ч.1 / – Уфа : Дендра, 2018. – 42-46 с. 2. Боева, К. Э. Перспективные штаммы дрожжей для использования в пищевой промышленности [Электронный ресурс] / К. Э. Боева // Материалы 69-й Международной студенческой научно-технической конференции. – Астрахань : Изд-во АГТУ, 2018. – Режим доступа : 1 электрон. опт. диск (CD-ROM). 3. Методические указания к лабораторным и самостоятельным работам «Микробиологические методы изучения нового штамма дрожжей» для студентов направлений подготовки бакалавров 06.03.01 «Биология» и магистров 06.04.01 «Биология» / АГТУ; сост. К. Э. Боева. – Астрахань, 2019. – 14 с.

69 Приложение 2 Методические указания «Микробиологические методы изучения нового штамма дрожжей» Федеральное агентство по рыболовству Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Астраханский государственный технический университет» Институт рыбного хозяйства, биологии и природопользования Кафедра прикладной биологии и микробиологии Микробиологические методы изучения нового штамма дрожжей Методические указания к лабораторным и самостоятельным работам для студентов направлений подготовки бакалавров 06.03.01 «Биология» и магистров 06.04.01 «Биология» Астрахань – 2019

70 Продолжение приложения 2 Составители: Боева К.Э. – магистрант II курса направления подготовки 06.04.01 «Биология», направленность «Микробиология и вирусология» Рецензент: Сопрунова О.Б. микробиология». д.б.н., проф. каф. «Прикладная биология и Методические указания «Микробиологические методы изучения нового штамма дрожжей» для студентов направлений подготовки бакалавров 06.03.01 «Биология» и магистров 06.04.01 «Биология» / АГТУ; сост. К.Э. Боева. – Астрахань, 2019. – 14 с. Методические указания к лабораторным и самостоятельным работам предназначены студентам для освоения основных методов и приемов, применяемых для изучения штамма дрожжей в лабораторных условиях. Освещаются цель и методы выполнения задач, структура и содержание их частей, а также особенности написания отчета. Методические указания введены в учебный процесс решением кафедры ПБМ (протокол № ___ от «___» ___________ _______ г.). Методические указания утверждены учебно-методическим (протокол № ___ от «___»________________ _______ г.). советом

71 Приложение 3 Презентация магистерской диссертации

72 Продолжение приложения 3

73 Продолжение приложения 3

74 Продолжение приложения 3

75 Продолжение приложения 3

76 Продолжение приложения 3

77 Продолжение приложения 3

78 Продолжение приложения 3

79 Продолжение приложения 3

80 Продолжение приложения 3

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

16.92

Суд

Исследование не только актуальное, но и имеет проктическую пользу, что подчёркивает значимость дисертации. Она написана научным языком, но довольно проста для чтения потому что автор даёт довольно подробные и не за умные пояснения.