МОДИФИКАЦИЯ СВОЙСТВ ПЕКТИНОВЫХ ГЕЛЕЙ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ СРЕДСТВ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ

Марина Волкова

МОДИФИКАЦИЯ СВОЙСТВ ПЕКТИНОВЫХ ГЕЛЕЙ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ СРЕДСТВ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ

Цель работы: получить пектиновые гели для адресной доставки месалазина в толстый кишечник. Выделены и охарактеризованы пектиновые полисахариды борщевика Сосновского, бодяка полевого, рябины обыкновенной и люпина узколистого, полученные из каллусных культур. Разработаны методики количественного определения месалазина в инкубационных средах и биологических образцах методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Биоаналитические методики валидированы. Проведено сравнение спектрофотометрического и хромато-масс-спектрометрического определения 5АСК. Помимо разработанных методик ВЭЖХ-МС/МС и исследования распределения в организме, научная новизна работы также заключается в исследовании устойчивости к деструкции и цитотоксичности гелей из пектинов, полученных биотехнологическим путем. Установлено влияние условий желирования на устойчивость гелей к деструкции в искусственной гастральной среде. Изучено влияние пектиновых гелей на метаболическую активность трех клеточных линий. Изучено влияние пектиновых гелей на распределение месалазина в организме крыс. Гели обеспечивают пролонгированный эффект и способствуют умеренному увеличению концентрации лекарственного средства в плазме и тканях организма. В условиях in vivo пектиновые гели продемонстрировали значительные преимущества по сравнению с введением лекарственного средства без носителя. Но разрушение пектиновых гранул и высвобождение месалазина подвержено широкой вариабельности, которая незначительно коррелирует с результатами исследований in vitro. По результатам работы опубликована статья: Волкова М. В. и др. Гелевые гранулы из пектина каллуса Lupinus angustifolius предотвращают преждевременное высвобождение месалазина //Биотехнология. – 2020. – Т. 36. – №. 1. – С. 53-60.

Биотехнология

Дипломы

Вуз: Вятский государственный университет (ВятГУ)

ID: 5ebc48cfcd3d3e000189482c

UUID: ec0c34b0-777c-0138-07d4-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: почти 4 года назад

Просмотры: 258

-4.64

Марина Волкова

Московский физико-технический институт (государственный университет) (МФТИ)

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 3,1 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Вятский государственный университет» Институт биологии и биотехнологии Кафедра биотехнологии Выпускная квалификационная работа магистерская диссертация по направлению подготовки 19.04.01 Биотехнология на тему: «МОДИФИКАЦИЯ СВОЙСТВ ПЕКТИНОВЫХ ГЕЛЕЙ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ СРЕДСТВ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ» Выполнил студент гр. БТм-2101-01-00 _______________ Волкова М.В. Научный руководитель, к.б.н., ст.н.с ЦП «Фармацевтическая БТ» _______________ Марков П.А. Допущено к защите в ГЭК _________ Заведующий кафедрой биотехнологии, директор института биологии и биотехнологии ________________________ к.т.н., доцент Мартинсон Е.А. Руководитель магистерской программы «Молекулярная и клеточная биотехнология» ________________________ д.м.н., профессор Бывалов А.А. Киров 2019

Реферат Волкова М.В. Модификация свойств пектиновых гелей с целью создания средств адресной доставки лекарств: Выпускная квалификационная работа / ФГБОУ ВО «ВятГУ», каф. Биотехнологии; рук. Марков П.А. – Киров, 2019. –131 с., 51 рис., 34 табл., 115 источников, 4 прил. ПЕКТИНОВЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ФАРМАКОКИНЕТИКА ПОЛИСАХАРИДЫ, ГРАНУЛЫ, ДЕСТРУКЦИЯ, МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ, Объект разработки – система адресной доставки в толстый кишечник на основе пектиновых полисахаридов. Цель работы: получить пектиновые гели для адресной доставки месалазина в толстый кишечник. Проведена оценка влияния условий желирования на устойчивость гелей к деструкции в искусственной гастроэнтеральной среде. Разработаны методики количественного определения месалазина методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Изучено влияние пектиновых гелей на распределение месалазина в организме крыс. Исследовано влияние пектиновых гелей на метаболическую активность клеток эпителия кишечника в условиях in vitro. Основные результаты исследований были представлены на III Всероссийской молодежной научной конференциии «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2018), XXII Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2018), IV Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Киров, 2018). Доклад «Оценка системы адресной доставки лекарств на основе пектина смолевки обыкновенной in vitro» отмечен сертификатом III степени на IX Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов «Молодая фармация – потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2019). По результатам работы опубликована статья: Волкова М. В. и др. Гелевые гранулы из пектина каллуса Lupinus angustifolius предотвращают преждевременное высвобождение месалазина //Биотехнология. – 2020. – Т. 36. – №. 1. – С. 53-60.

Содержание Введение ........................................................................................................................................ 7 Литературный обзор................................................................................................................... 9 1. Воспалительные заболевания кишечника .............................................................................. 9 1.1. Физиология желудочно-кишечного тракта...................................................................... 9 1.2. Патология и терапия воспалительных заболеваний кишечника ................................. 11 2. Адресная доставка лекарственных средств в толстый кишечник...................................... 13 3. Пектиновые полисахариды .................................................................................................... 16 3.1. Строение и роль пектинов в природе ............................................................................. 16 3.2. Свойства и применение пектинов................................................................................... 18 3.3. Культура клеток растений как источник пектинов ....................................................... 21 4. Пектиновые гели ..................................................................................................................... 23 4.1. Применение пектиновых гелей ....................................................................................... 23 4.2. Получение пектиновых гелей ......................................................................................... 25 4.3. Исследование пектиновых гелей .................................................................................... 28 4.3.1. Оценка высвобождения лекарства из гелей in vitro ............................................... 28 4.3.2. Оценка влияния гелей на метаболическую активность клеток in vitro ................ 29 4.3.3. Оценка распределения лекарства in vivo ................................................................. 30 5. Аналитические методы исследования .................................................................................. 31 5.1. Сканирующая электронная микроскопия ...................................................................... 31 5.2. Спектрофотометрия ......................................................................................................... 32 5.3. Высокоэффективная жидкостная хромато-масс-спектрометрия................................. 33 Материалы и методы ............................................................................................................... 36 1. Характеристика пектиновых полисахаридов ....................................................................... 36 2. Модельное лекарственное средство (МЛС) ......................................................................... 40 3. Желирование и инкубация гелей ........................................................................................... 42 3.1. Получение пектиновых гелей ......................................................................................... 42 3.2. Инкубация и исследование пектиновых гелей .............................................................. 42 4. Элементный состав гелей ....................................................................................................... 43 5. Качественное определение МЛС методом ВЭЖХ-МС/МС ............................................... 43 4

6. Разработка методов пробоподготовки .................................................................................. 48 6.1. Разработка метода пробоподготовки тканей ................................................................. 49 6.2. Разработка метода пробоподготовки плазмы крови ..................................................... 51 6.3. Разработка метода пробоподготовки инкубационных сред и образцов гранул......... 52 7. Определение МЛС методом спектрофотометрии................................................................ 53 8. Использование культур клеток для исследований in vitro.................................................. 55 9. Проведение экспериментов на лабораторных крысах ........................................................ 57 10. Статистическая обработка ................................................................................................... 57 Результаты ................................................................................................................................. 58 1. Исследование деструкции гелей в условиях in vitro ........................................................... 58 1.1. Деструкция пектиновых гелей ........................................................................................ 58 1.2. Оценка высвобождения лекарственного средства из гелей ......................................... 62 1.3. Модификация гелей силикатом натрия.......................................................................... 65 2. Исследование цитотоксичности гелей in vitro ..................................................................... 67 2.1. Влияние на метаболическую активность клеток HEK293 ........................................... 67 2.2. Влияние на метаболическую активность клеток Caco-2 .............................................. 69 2.3. Влияние на метаболическую активность клеток NCTC 929 ........................................ 71 3. Исследование распределения лекарства в условиях in vivo................................................ 73 3.1. Валидация разработанных биоаналитических методик ............................................... 73 3.1.1. Селективность ............................................................................................................ 73 3.1.2. Линейность, прецизионность и точность ................................................................ 73 3.1.3. Матричный эффект и восстановление ..................................................................... 76 3.1.4. Перенос и полнота разбавления ............................................................................... 76 3.1.5. Стабильность.............................................................................................................. 77 3.2. Оценка распределения лекарственного средства в организме .................................... 78 Обсуждения ................................................................................................................................ 84 1. Физико-химические особенности лекарственного средства .............................................. 84 2. Использование пектиновых гелей для адресной доставки ................................................. 86 3. Влияние на метаболическую активность клеток ................................................................. 88 4. Закономерности распределения в организме ....................................................................... 89 5

Заключение................................................................................................................................. 92 Приложение А (обязательное) Авторская справка ...................................................................... Приложение Б (справочное) Библиографический список ...................................................... 94 Приложение В (справочное) Список сокращений ................................................................. 102 Приложение Г (справочное) Список терминов...................................................................... 104 6

Введение Одной из медицинских проблем являются воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – группа тяжелых хронических болезней, характеризующихся продолжительным текущим воспалением пищеварительного тракта. Они занимают второе место среди заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), от них страдают люди разного возраста и пола. Распространенность заболеваний растет со временем и в разных регионах мира, что придает социальное значение проблеме лечения ВЗК. Терапия данных воспалительных заболеваний включает использование пероральных и парентеральных лекарственных форм. Парентеральное введение не соответствует местной доставке лекарств в кишечник и сопровождается соответствующими системными эффектами. Поэтому пероральные лекарственные формы являются наиболее желательным маршрутом доставки, но традиционные лекарственные препараты абсорбируются преимущественно в тонком кишечнике и не доставляются к пораженному участку ЖКТ [13]. В связи с этим, особой задачей в фармацевтической области является разработка специфичных для конкретного участка дозированных форм, которые способны контролировать время доставки и высвобождение активных ингредиентов в нижней части тонкого кишечника или в толстой кишке. В частности, такой препарат можно использовать в качестве носителя для противовоспалительных лекарств, используемых для лечения ВЗК, и для системной абсорбции перорально вводимых полипептидов, восприимчивых к ферментативному перевариванию в верхнем отделе ЖКТ. Доставка препарата в толстый кишечник (colon drug delivery system, CDDS) также может быть использована для системного введения лекарств, которые неблагоприятно влияют на верхние отделы пищеварительного тракта. В данной работе в качестве носителя для CDDS исследовались гелевые гранулы из пектината кальция. Пектины являются естественными, биосовместимыми, биоразлагаемыми и возобновляемыми полимерами, имеющими низкую стоимость, широкое разнообразие структур и гибкость в использовании, которая обусловлена возможностью целенаправленной модификации структуры с целью достижения желаемой функциональности пектинового полисахарида [8, 12, 40, 43]. Это делает их потенциальным биоматериалом для медицины и фармацевтики. Пектиновые полисахариды обладают широким спектром физиологической активности, в том числе иммуномодулирующим действием. Они устойчивы к протеазам и амилазе, которые активны в верхних отделах ЖКТ, и деградируется большим количеством микроорганизмов, присутствующих в толстом кишечнике [45]. Пектины обладают гелеобразующими свойствами и в присутствии двухвалентных ионов металлов могут образовывать трехмерные надмолекулярные структуры, или гели, в которые с помощью простых процедур может быть загружено лекарственное средство. При этом пектиновые гидрогели имеют ряд существенных недостатков, таких как чувствительность к воде и нестабильность в физиологических условиях, а именно высокое набухание в физиологических средах [23, 56]. Поэтому одним из актуальных направлений исследований применения пектиновых полисахаридов в качестве CDDS является поиск пектинов. Цель исследования – получить пектиновые гели для адресной доставки месалазина в толстый кишечник. Были поставлены следующие задачи: 1. Выделить и охарактеризовать пектиновые полисахариды борщевика Сосновского (Heracleum Sosnowskyi, HSc, гераклиуман), бодяка полевого (Cirsium arvense, CAc, 7

цирсиуман), рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia, SAc, сорбан) и люпина узколистого (Lupinus angustifolius, LAc, люпинан), полученные из каллусных культур коллекции Лаборатории биологически активных веществ и биополимеров ФГБОУ ВО «Вятского Государственного университета». 2. Получить гели на основе пектиновых полисахаридов и оценить влияние условий желирования на устойчивость гелей к деструкции в искусственной гастроэнтеральной среде (концентрация пектина и кальция, продолжительность желирования). 3. В условиях искусственной гастроэнтеральной среды оценить способность пектиновых гелей предотвращать преждевременное высвобождение месалазина. 4. Оценить влияние пектиновых гелей на метаболическую активность клеток эпителия кишечника в условиях in vitro. 5. Изучить влияние пектиновых гелей на распределение месалазина в организме крыс. 8

Литературный обзор 1. Воспалительные заболевания кишечника 1.1. Физиология желудочно-кишечного тракта Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) представляет собой мышечную трубку длиной около 6 м с разным диаметром. Он состоит из четырех основных областей: пищевода, желудка, тонкого и толстого кишечника. Основные отделы желудочно-кишечного тракта представлены на Рисунке 1 [92]. Поверхность просвета трубки не гладкая, а шероховатая, что увеличивает площадь поверхности для поглощения. Большая часть желудочнокишечного эпителия покрыта слоями вязкоупругого полупрозрачного водного геля (слизи). Слизь секретируется по всему желудочно-кишечному тракту и действует как защитный слой и механический барьер. Это постоянно меняющаяся смесь многих секретов и отшелушенных эпителиальных клеток, которая имеет большую водную составляющую (около 95 %). Основными компонентами слизи являются муцины - гликозилированные белки, которые отвечают за ее физические и функциональные свойства. Рисунок 1 – Схема желудочно-кишечного тракта (слева) и толстого кишечника (справа) Функция желудка заключается в хранении и частичном переваривании пищи [115]. Желудок является наиболее расширенной частью ЖКТ и имеет емкость около 1,5 л. К желудочной секреции относится соляная кислота, выделяемая париетальными клетками (поддерживает рН желудка), гормон гастрин – стимулятор продуцирования желудочной кислоты, пепсины, разлагающие белки на пептиды при низком рН, и слизь. Желудок имеет небольшую площадь поверхности, поэтому поглощение веществ происходит меньше по сравнению с тонкой кишкой. При этом скорость опорожнения желудка может быть контролирующим фактором вначале абсорбции различных компонентов пищи. Тонкий кишечник является самой длинной (4-5 м) частью желудочно-кишечного тракта. Это область, в которой поглощается большинство питательных веществ. Основные функции тонкой кишки это: процесс ферментативного переваривания и абсорбция. Тонкий кишечник разделен на двенадцатиперстную кишку длиной 200-300 мм, тощую кишку длиной 2 м и подвздошную кишку длиной около 3 м [92]. Стенка кишечника имеет богатую сеть как кровеносных, так и лимфатических сосудов. 9

Толстый кишечник является последней основной частью ЖКТ и состоит из: слепой кишки (85 мм в длину), восходящей ободочной кишки (200 мм), печеночного изгиба, поперечной толстой кишки (больше 450 мм), селезеночного изгиба, нисходящей ободочной кишки (300 мм), сигмовидной (400 мм) и прямой кишки. В толстом кишечнике происходит всасывание основной массы воды и всасывание электролитов [115]. Он постоянно колонизируется множеством бактерий, которые способны к различным метаболическим реакциям. В частности, бактерии деградируют полисахариды для получения короткоцепочечных жирных кислот (уксусной, пропионовой и масляной) [92]. Физиологические особенности ЖКТ необходимо учитывать при разработке соответствующих лекарственных форм. Пероральный путь введения лекарственных средств подразумевает исследование их поведения во время прохождения через желудочнокишечный тракт. Если разрабатываются системы доставки лекарств с замедленным или контролируемым высвобождением, то важно учитывать факторы, которые будут влиять на их поведение и время их прохождения через определенные районы желудочно-кишечного тракта. Время пребывания фармацевтического препарата в желудке варьируется и зависит от дозированной формы и состояния желудка (сытости/голода). Нормальное время пребывания обычно колеблется от 5 минут до 2 часов. Малый кишечный транзит обычно проходит в течение 3-4 часов. В отличие от желудка, на условия переноса лекарства через тонкий кишечник не влияет лекарственная форма или сытое/голодное состояния. Транзит фармацевтических препаратов через толстый кишечник длительный и переменный. Он зависит от типа лекарственной формы, диеты, схемы питания, состояния болезни. Транзит толстой кишки характеризуется короткими всплесками активности, за которыми следуют длительные периоды стаза. Время прохождения может составлять от 2 до 48 часов, возможно варьирование до нескольких дней [92]. Большую роль в биодоступности лекарственного средства играет его водорастворимость – скорость, с которой лекарство растворяется в желудочно-кишечных жидкостях. Другими потенциальными ограничениями являются: скорость высвобождения из лекарственной формы, скорость метаболизма ферментами в клетках слизистой оболочки кишечника и скорость метаболизма лекарства во время его первого прохода через печень. В ЖКТ существует ряд барьеров для абсорбции лекарственного средства после высвобождения из лекарственной формы и растворения в желудочно-кишечных жидкостях. В частности, желудочно-кишечный рН. В желудке рН в пределах 1-3,5 в голодном состоянии, после еды он находится в диапазоне 3-7. В зависимости от размеров еды он возвращается к исходным значениям состояния натощак в течение 2-3 часов. Таким образом, лекарственный препарат, полученный с или вскоре после еды, столкнется с более высокими значениями рН. За счет нейтрализации желудочной кислоты бикарбонатными ионами, выделяемыми поджелудочной железой в тонкую кишку, происходит повышение рН в тонком кишечнике от двенадцатиперстной до подвздошной кишки. Затем рН снова снижается примерно до 6,5 в толстом кишечнике. Это связано с тем, что бактериальные ферменты разрушают непереваренные углеводы в короткоцепочечные жирные кислоты. Другим препятствием являются ферменты: пепсин в желудочном соке; амилазы и протеазы, секретируемые из поджелудочной железы в тонкий кишечник в ответ на прием пищи. Присутствие пищи в ЖКТ может влиять на скорость и степень поглощения, прямо или косвенно. Например, если препараты связываются с компонентами в рационе. Это 10

становится проблемой в отношении биодоступности, когда образуется необратимый или неразрушаемый комплекс. Также на абсорбцию и биодоступность перорально вводимых лекарств оказывает состояние заболевания и физиологического расстройства ЖКТ. Местные заболевания могут вызвать изменения рН желудка, которые повлияют на стабильность, растворение и/или абсорбцию лекарственного средства. Другим препятствием для лекарств является слизь. Слой слизи, чья толщина и текучесть варьируются в зависимости от длины ЖКТ, могут препятствовать распространению лекарственного вещества. Некоторые препараты способны образовывать комплексы слизи, что уменьшает их доступность для абсорбции. 1.2. Патология и терапия воспалительных заболеваний кишечника К неспецифическим воспалительным заболеваниям кишечника относятся язвенный колит и болезнь Крона. Локализация воспаления при данных заболеваниях представлена на Рисунке 2, а патологические особенности на Рисунке 3. Этиология воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК, IBD) характеризуется постоянными эпизодами диффузного воспаления слизистой кишечника, эпителиальными ранами или эрозией, изъявлениями и фиброзом стенки кишечника. Тяжелое повреждение ткани требует эффективного заживления раны слизистой оболочки для эффективной терапии IBD [37]. Рисунок 2 – Схема локализации воспаления при ВЗК Рисунок 3 – Патология болезни Крона и язвенного колита 11

Активные стадии IBD характеризуются прерывистым раневым поражением и воспалением. Ключевыми факторами заболеваний являются потеря кишечного иммунного гомеостаза, дефектный слизистый барьер кишечника, бактериальная транслокация и выделение эндотоксинов. В слизистой кишечника происходит множество местных иммунных реакций. К ним относятся повышение концентрации B-лимфоцитов, вырабатывающих IgG, и изменения в соотношении субпопуляций Т-лимфоцитов. Активированные лимфоциты слизистой выделяют ряд цитокинов, которые также участвуют в развитии воспаления. Помимо этого повышается продукция других медиаторов воспаления [115]. Повышенное выделение активных форм кислорода, металлопротеиназ способствует индукции разрушения тканей и некроза. Фактор некроза опухоли (THP-α), интерлейкин-1β (IL-1β) и интерферон-γ (IFN-γ) являются другим важным фактором, способствующим ранению слизистой оболочки, некрозу и повышенной проницаемости на месте раны. Уменьшение уровня интегральных трансмембранных белков плотного соединения и молекул адгезии приводит к снижению барьерной функции и увеличению проницаемости кишечника к микробным эндотоксинам. Это приводит к системному воспалительному ответу [37]. Язвенный колит (ЯК) – хронический воспалительный процесс слизистой оболочки толстого кишечника, сопровождающийся появлением язв, участков некроза и кровотечений. ЯК никогда не поражает тонкий кишечник. При данном заболевании происходит изъявление поверхности слизистой оболочки, которое постепенно распространяется от прямой кишки к проксимальным отделам кишечника. Изъявление приводит к упрощению эпителия слизистой между зонами повреждения и к гибели бокаловидных клеток [106]. По клиническому течению выделяют острую типичную форму и острую фульминантную (молниеносную) форму, как правило, с летальным исходом. Перфорация толстой кишки является наиболее частой причиной смерти при молниеносной форме ЯК. Вследствие обширного язвенно-некротического процесса стенка толстой кишки истончается, теряет свои барьерные функции и становится проницаемой для разнообразных токсических продуктов, находящихся в просвете кишки [101]. Наиболее опасными осложнениями заболевания являются токсический мегаколон и колоректальный рак. Риск развития рака толстой кишки при ЯК резко возрастает при длительности заболевания свыше 10 лет, а также, если колит начался в возрасте моложе 18 лет. Болезнь Крона (БК) – хроническое рецидивирующее заболевание ЖКТ неясной этиологии, характеризующееся трансмуральным, сегментарным, гранулематозным воспалением с развитием местных и системных осложнений. Клинические симптомы при БК широко варьируют в зависимости от локализации и протяженности поражения, стадии заболевания, наличия или отсутствия осложнений. При БК могут поражаться любые участки ЖКТ. Однако в подавляющем большинстве случаев БК вначале возникает в подвздошной кишке и затем распространяется на другие отделы [101]. Воспалительный процесс охватывает все слои стенки кишки, но ограничивается разрозненными участками кишечника, способствует возникновению свищей, абсцесса и перфорации [106]. Абсцесс и образование свищей при БК в прилежащих органах (мочевой пузырь или кожа) способствуют развитию множественных опухолей. В результате наиболее распространенными осложнениями болезни являются стеноз и непроходимость кишечника, образование свищей, повышается вероятность колоректальных опухолей и амилоидоза [106]. 12

Системные осложнения при IBD иначе называют внекишечными проявлениями. У больных могут встречаться поражениями печени, слизистой оболочки полости рта, кожи, суставов. Такие внекишечные проявления обычно свидетельствуют о тяжести основного заболевания и, как правило, исчезают после тотальной колпроктэктомии или наступления ремиссии процесса. Поддерживающее лечение является важнейшим фактором уменьшения числа рецидивов [101]. До сих пор не выяснены механизмы воспалительных реакций, лежащих в основе IBD. Среди возможны патогенетических факторов выделяют неблагоприятный состав кишечной флоры, нарушение эпителиального барьера, гиперреактивность иммунной системы. Различий между БК и ЯК так много, что общая природа этих заболеваний маловероятна [110]. Однако методы лечения весьма сходны. Целью терапии является стимулирование и поддержание ремиссии, предотвращение прогрессирования заболевания с помощью аминосалицилатов, кортикостероидов и биологических препаратов, которые вводят перорально, парентерально или ректально. Восстановление барьерной функции эпителия кишечника после повреждения, вызванного воспалением, может стать ключевой целью лечения в IBD [37]. Заживление ран и лечение воспаления кишечника включает в себя первую терапию аминосалицилатами (сульфасалазин, месалазин). Терапевтические агенты второй линии (кортикостероиды) являются сильными ингибиторами цитокинов [37]. Глюкокортикоиды (будесонид) достигают высокой концентрации в слизистой после приема внутрь или введения ректально, но обладают низкой системной активностью в результате пресистемной элиминации в печени. Таким образом, их можно считать препаратами для местного лечения. В тяжелых случаях назначают антибактериальные средства (метронидазол), эффективные против анаэробов [110]. Терапевтическая догма переключилась на биологические препараты с точной противовоспалительной активностью. Фактор некроза опухоли TNF-α играет ключевую роль в стимуляции воспаления кишечника. Поэтому для лечения слизистой оболочки и поддержания IBD средней тяжести одобрены несколько TNF-α связывающих антител (infliximab, adalimumab, golimumab, certolizumab). Лечение толстой кишки биологическими препаратами направлено на блокирование или ингибирование воспалительных каскадных путей на участке заболевания. Побочные эффекты лекарств, связанные с их парентеральным введением, являются проблемой в текущих стратегиях доставки лекарственных средств. Широко предполагается, что адресная доставка лекарств в область раны / язвы повысит эффективность и уменьшит побочные эффекты, обеспечивая локальные концентрации лекарственного средства на месте заболевания и вызывая меньшее системное воздействие [37]. Хирургическое вмешательство с применением наименее инвазивных методов показано только в тех случаях, когда оно необходимо для устранения осложнений или при безрезультативности медикаментозной терапии [106]. 2. Адресная доставка лекарственных средств в толстый кишечник Одной из приоритетных задач фармацевтической индустрии является разработка и внедрение инновационных лекарственных форм. Традиционные лекарственный формы (ЛФ) имеют ряд недостатков: повышенный расход лекарственного вещества (ЛВ), ненаправленное действие ЛВ, нежелательные физиологические эффекты в области введения лекарственных 13

средств (ЛС) [78]. Использование лекарственных форм, обеспечивающих адресную доставку ЛС, имеет ряд существенных преимуществ [63]:  направленный транспорт к очагу патологического процесса,  увеличение биодоступности препарата,  обеспечение пролонгированного действия и поддержание оптимальной терапевтической концентрации,  снижение возможных побочных эффектов ЛВ и их метаболитов,  снижение раздражения желудка,  обход метаболизма в печени во время первого прохода. Парентеральное введение не всегда доставляет лекарство точно в цель без системных побочных эффектов. Поэтому пероральные лекарственные формы являются наиболее желательным маршрутом доставки лекарств для лечения ЖКТ. Они более удобны и обеспечивают большую степень гибкости в дизайне состава, улучшают соблюдение пациентом безопасного применения [37]. Толстый кишечник представляет собой подходящие условия для доставки лекарств, поскольку он имеет более низкую интенсивность ферментативной активности и почти нейтральный рН. Абсорбционная способность толстой кишки ниже, чем у тонкой, но время пребывания препаратов составляет 2-3 дня. Доставка препарата в толстый кишечник предназначена для местного лечения язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника. Потенциально может быть использована для лечения рака толстой кишки или системного введения лекарств, которые неблагоприятно влияют на верхний желудочно-кишечный тракт. Толстый кишечник считается предпочтительным местом абсорбции для перорального введения белков и пептидных лекарств из-за относительно низкой активности протеолитических ферментов в толстой кишке по сравнению с верхними отделами ЖКТ [41]. Толстая кишка исследуется как потенциальное место для доставки белков, пептидов, вакцин и других лекарств, таких как нифедипин, теофиллин и изосорбид [65]. Основными препятствиями при пероральном введении пептидных лекарств являются кислотная и ферментативная деградация. Системы адресной доставки лекарственных средств в толстый кишечник включают использование пролекарств, полимерных покрытий и/или капсул, контролируемых давлением в кишечнике [18]. Полимерные композиты действуют как защитные матрицы, подавляют неспецифические взаимодействия с биологическими молекулами, способствуют контролируемому и устойчивому высвобождению и повышают биодоступность и стабильность загруженного лекарственного средства [2]. Принцип системы, контролируемой давлением, основывается на том, что в результате перистальтики более высокие давления встречаются в толстой кишке, чем в тонком кишечнике [63]. Большинство имеющихся систем адресной доставки сосредоточено на одном из трех следующих подходов: рН-зависимое, время-зависимое высвобождение или бактериальная деградация. Время и рН могут варьироваться от одного человека к другому, от патологических и диетических условий конкретного человека. Например, пациенты с синдромом раздраженного кишечника и язвенным колитом проявляли ускоренный транзит через разные области толстой кишки [36]. Помимо этого, между тонким и толстым кишечником происходит незначительное изменение рН, поэтому системы, зависящие от рН, с точки зрения целевого выделения, становятся менее конкретными. Следовательно, в случае использования время-зависимого и рН-зависимого высвобождения может происходить преждевременная и неспецифическая доставка лекарств. 14

Точная доставка лекарств для толстого кишечника требует, чтобы механизм запуска в системе отвечал только физиологическим условиях, характерным для толстой кишки [8]. Резкое увеличение бактериальной популяции и связанной с ней ферментативной активности в толстой кишке представляет собой непрерывное событие, не зависящее от времени переноса в ЖКТ и рН. Поэтому системы бактериальной деградации выглядят более перспективными [61]. Возможно использование систем, имеющих комбинированный принцип высвобождения лекарства. Например, подход, основанный на рН и микробиологическом эффекте. Первое покрытие представляет собой кислый растворимый полимер, которое защищает таблетку, когда она находится в желудке, а затем быстро растворяется после опорожнения желудка. Второе покрытие защищает препарат, когда он проходит через щелочную рН тонкого кишечника. Как только таблетка поступает в толстый кишечник, бактерии ферментативно деградируют второе покрытие/матрицу, к примеру, полисахарид [63]. В перспективе рассматривается для контролируемого высвобождения использование патофизиологических параметров, которые непосредственно связаны с местом заболевания [37]. Основным критерием выбора биополимера для проектирования системы доставки является наличие функциональных групп в структуре биополимеров. Функциональные группы могут быть конъюгированы с биоактивным компонентом, или агрегированы для образования сшитой плотной сети с целью инкапсуляции биологически активного компонента [3]. В настоящее время используются различные известные природные полисахариды в силу их деградации кишечной микрофлорой [12]. Система доставки в толстую кишку может быть получена либо комбинацией различных полисахаридов, либо сочетанием натурального полисахарида с синтетическими полимерами [56], также рассматриваются варианты адресной доставки, основанной на покрытии пектином и галактоманнаном [36]. Большой интерес вызывает создание гибридных лекарственных форм из природных биополимеров и неорганических соединений. Например, при использовании силикагеля возможно образование защитной оболочки на пектиновых гранулах, придающей стабильность в имитируемых пищеварительных жидкостях. При этом материалы на основе диоксида кремния не токсичны и биологически совместимы [22]. Эффективным методом защиты наиболее активных агентов является метод микрокапсулирования. Микрокапсулы могут препятствовать разложению активных веществ под действием внешних факторов окружающей среды, таких как воздух, влажность или УФсвет [50]. Системы адресной доставки в толстый кишечник (CDDS) полезны не только для местного лечения заболеваний толстой кишки, но и для системной терапии как обычными, так и лабильными молекулами. Из них возможно создание следующих лекарственных форм: таблетки, капсулы, гранулы, шарики, микросферы, микро- и наночастицы [11]. Но существует разрыв с данными передовыми технологиями в связи с многочисленными проблемами, среди которых: нанотоксичность, иммуногенность, структурная стабильность при транспортировке, проблемы расширения на промышленном уровне, ограниченная стабильность срока хранения продукта, сложный дизайн системы доставки, высокая стоимость производства и трудности с воспроизводимостью [37]. 15

3. Пектиновые полисахариды 3.1. Строение и роль пектинов в природе Пектины представляют собой сложную смесь полисахаридов, которая составляет около 1/3 сухого вещества клеточной стенки высших растений, и являются одним из основных компонентов первичной клеточной стенки большинства растений. Самые высокие концентрации пектина обнаруживаются в средней пластинке клеточной стенки, с постепенным уменьшением при прохождении через первичную стенку к плазматической мембране [8, 65]. На Рисунке 4 представлена структура клеточной стенки. Рисунок 4 - Структура клеточной стенки [8] Пектиновые полисахариды в тканях растений связаны с другими компонентами клеточных стенок, такими как целлюлозы или гемицеллюлозы [8]. В наиболее распространенном представлении первичной растительной клеточной стенки растущих растений пектин изображается как независимая сеть, встроенная в несущую целлюлозугемицеллюлозу, с некоторыми структурными белками [41]. Пектиновые полисахариды играют роль в росте растений и их развитии, морфогенезе, сигнализации, пористости стенки [41]. Они могут способствовать клеточной адгезии и смягчению клеточных стенок для удлинения клеток. Эти полисахариды прочны и оказывают поддержку растениям, поддерживая консистенцию клеток и механическую устойчивость. Кроме того, пектин влияет на различные свойства клеточной стенки, такие как пористость, поверхностный заряд, рН и ионный баланс, путем образования сетей и улавливания растворенных молекул, которые обеспечивают перенос ионов. Пектин также активирует защиту растений, стимулируя накопление фитоалексинов. Они обладают широким спектром антимикробной активности. Помимо этого, олигосахариды пектина индуцируют накопление ингибиторов протеазы в тканях растений в ответ на рану [8]. В плане практического применения для человека, они могут функционировать как детоксиканты, регуляторы и защитные средства ЖКТ и стимуляторы иммунной системы [77]. Хотя пектин обычно встречается в большинстве растительных тканей, количество источников для коммерческого производства ограничено. Как и большинство других полисахаридов растений, пектин является полидисперсным [41]. Он имеет специфические биологические функции в зависимости от его местоположения и молекулярной структуры. На структуру молекул влияют реакции ферментативной и химической модификации во время роста растений и созревания плодов, а также при хранении и переработке фруктов и овощей. 16

Пектиновые вещества включают протопектин, представляющий собой нерастворимый высокомолекулярный пектиновый комплекс и образующий каркас клеточной стенки, пектиновые полисахариды и сопутствующие арабинаны, галактаны и арабиногалактаны [74]. Химическая структура пектинов десятилетиями была предметом научных исследования. Пектиновые полисахариды состоят из остатков D-галактуроновой кислоты. Они имеют линейные области галактуронана и рамногалактуронана и разветвленные области представленные рамногалактуронаном I и рамногалактуронаном II с боковыми цепями галактана, арабинана, арабиногалактана и других более сложных фрагментов [23]. Гомогалактуронан состоит из остатков 1,4-связанной α-D-галактопиранозилуроновой кислоты, в которой от 8 до 74 % карбоксильных групп могут быть этерифицированы метиловым спиртом. Друг с другом гомогалактуронаны соединяются остатками α-L-рамнопиранозы, включенными в основную цепь 1,2-связью. Пектины могут быть водорастворимыми (или свободными) и водонерастворимыми в зависимости от молекулярной массы и степени метоксилирования. На растворение влияют рН раствора, температура, природа и концентрация растворенных веществ [78]. Арабинаны представляют собой разветвленные полисахариды с основой (1→5) связанных α-L-арабинофуранозильных остатков; другие α-L-арабинофуранозильных звенья присоединены к различным количествам остатков в положении О2 и/или О3 [111]. Пектины также содержат некарбоновые заместители, в основном метанол, уксусную кислоту и фенольные кислоты; амидные группы присутствуют в некоторых коммерческих образцах. Одной из характеристик пектиновых полисахаридов является степень этерификации (DE), выраженная в процентах от общего количества карбоксильных групп, существующих обычно через полимерную основу. Пектин с DE менее 50% этерификацией классифицируется как низкий метоксипектин и более 50% как высокий метоксипектин [53]. Распределение метилового эфира влияет на физическое поведение молекул пектина. Гомогалактуронаны синтезируются полностью метилэтерифицированными, а распределения, обнаруженные в конкретных пектинах, будут зависеть от действия эндогенных ферментов (пектиновые метилэстеразы) или условий, при которых обрабатывается сырье или экстрагируется пектин [97]. В дополнение к метилэтерификации и в зависимости от происхождения пектина фрагменты галактуроновой кислоты могут быть замещены ацетильными группами в О2- или О3-положении; пектины из многих источников могут быть ацетилированы до некоторого уровня. Степень этерификации (DE) и степень амидирования (DA), которая также выражается в процентах амидированных групп от общего числа карбоксильных групп, являются важным средством классификации пектинов [18]. Общая схема фрагментов структуры пектина представлена на Рисунке 6. 17

Рисунок 6 – Схема строения пектинов, где GalA – -D-галактопиранозил-уроновая кислота; Rha – -L-рамнопираноза, Ara – арабиноза, Gal – галактоза, Xyl - ксилоза, Fer – феруловая кислота, RG-I - рамногалактуронан I Предлагаются три модели: 1) каркас пектина состоит из чередующихся областей HGA и RGI; 2) каркас пектина включает домен RGI с HG, который связан как его боковая цепь; 3) каркас пектина состоит из чередующихся перпендикулярно связанных линий HGA и домена RGI [8]. Химическая структура пектина варьирует между растениями, тканями и даже внутри клеточной стенки. Многое предстоит сделать, чтобы соотнести функциональность и взаимодействие каждого деления пектина с его уникальными биохимическими свойствами [8]. 3.2. Свойства и применение пектинов Пектин растворим в чистой воде, но нерастворим в спирте и большинстве других растворителей. Он образует нерастворимые соли с ионами двухвалентного металла. Пектиновые полисахариды также образуют нерастворимые комплексы с положительно заряженными полимерами. При смешении с отрицательно заряженными полимерами, такими как белки, которые выше их изоэлектрической точки, может происходить сегрегационное разделение: смесь развивается в две сосуществующие водные фазы, одна фаза обогащенная пектином, а другая – обогащенная белком [97]. Реология препарата, содержащего растворенный пектин, зависит от свойств пектина, а также от свойств системы. Значительными свойствами пектина являются молекулярная масса, количество и схема распределения заместителей, таких как С6-метиловые группы, С6амидные группы и О-ацильные группы, рН, наличие растворенных твердых веществ или растворителей, ионную силу, присутствие определенных ионов металлов, концентрацию пектина и температуру [97]. Разбавленные растворы пектина содержат гомогенно диспергированные молекулы, которые слишком далеки друг от друга для взаимодействия. В этом случае наблюдается 18

лишь небольшое увеличение вязкости. Вязкость растворов пектиновых полисахаридов возрастает с увеличением концентрации. Расстояния между молекулами пектина уменьшаются, что облегчает межмолекулярные взаимодействия (водородные связи). Наблюдается линейная зависимость между сдвиговым напряжением и скоростью сдвига растворов пектина. Это указывает на ньютоновское поведение, но только до определенной концентрации. Фактическая концентрация пектина, при которой раствор переходит от ньютоновского поведения к поведению сдвига, зависит от молекулярной массы используемого пектина [8]. Как и в случае растворимости, вязкость раствора пектиновых полисахаридов связана с молекулярной массой, концентрацией препарата, рН и наличием противоионов в растворе. Помимо этого, вязкость, растворимость и гелеобразование связаны между собой. Например, факторы, повышающие прочность геля и склонность к гелеобразованию, уменьшают растворимость и повышают вязкость, и наоборот. Таким образом, одновалентные катионные соли пектинов высоко ионизированы в растворе. Распределение ионных зарядов вдоль молекулы имеет тенденцию удерживать ее в расширенной форме из-за кулоновского отталкивания. Растворы одновалентных солей пектинов обладают устойчивой вязкостью, поскольку каждая полимерная цепь гидратирована, вытянута и независима [65]. Пектин является естественным, биосовместимым, биоразлагаемым и возобновляемым полимером, имеющим низкую стоимость, широкое разнообразие типов и гибкость в использовании, которая обусловлена возможностью целенаправленной модификации структуры с целью достижения желаемой функциональности пектинового полисахарида [8, 12, 40, 43]. Большинство синтетических полимеров имеют ряд недостатков, например, таких как высокая цитотоксичность и низкая биосовместимость. Поэтому пектины являются потенциальным биоматериалом для медицины и фармацевтики. Разнообразие пектинов, с одной стороны, создает проблемы для создания универсальной стратегии сшивания, но, с другой стороны, имеет преимущество в плане модифицирования свойств. Перестраиваемые свойства материала могут быть использованы для различных биомедицинских применений, в том числе при подготовке и разработке новых систем адресной доставки (DDS) [9, 15]. Пектин выделяется как модификатор реологии. Реология – это исследование деформации и потока вещества. Модификатором реологии является материал, изменяющий реологию жидкой композиции, к которой она добавляется. Большинство продуктов в пищевой, фармацевтической, личной или бытовой областях содержат модификаторы реологии для достижения соответствующих характеристик материалов. Пектины, например, повышают вязкость многих пищевых матриц [8]. Пектиновые полисахариды обладают широким спектром физиологической активности, в том числе иммуномодулирующим действием. Также известно гастропротективное и антиканцерогенное и/или антиметастатическое действие пектинов, выявленное на примере яблочного пектина в экспериментальных моделях канцерогенеза кишечника и метастазов печени [74]. Установлено, что пектины оказывают бактерицидное действие на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. При этом в аналогичных условиях представители эндогенной микрофлоры ЖКТ (молочнокислые бактерии) сохраняли свою жизнеспособность [77]. Пектин устойчив к протеазам и амилазе, которые активны в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта, и деградируется большим количеством микроорганизмов, присутствующих в толстой кишке [45]. В результате ферментации диетической клетчатки 19

микроорганизмами толстого кишечника образуется короткоцепочечная жирная кислота, обладающая широким спектром иммуномодулирующих функций, включая подавление активации макрофагов и дендритных клеток, стимулирование развития регуляторных Тклеток и поддержание функций эпителиального барьера [30]. Благодаря чему, потребление диетических волокон способствует снижению риска воспалительных заболеваний. Также показано, что пектины связываются с муцином, основным компонентом слизи ЖКТ, образуя гелевую сетку. Таким путем пектиновые полисахариды, усиливая защитные барьерные свойства слизи, могут быть использованы для лечения повреждений ЖКТ и инфекционных заболеваний [73]. В зависимости от структуры некоторые пектиновые полисахариды способны защищать систему кишечника от повреждений и ингибировать воспаление. Различия в характере действия на воспаление связаны с тонкими элементами строения пектинов, такими как структура боковых углеводных цепей и взаимное расположение разветвленных областей пектиновой макромолекулы. Пектиновые полисахариды из нетрадиционных источников обладают широким спектром физиологической активности и обладают индивидуальным фармацевтическими свойствам. Например, комаруман (пектин сабельника), в частности, его галактуронановый фрагмент, ингибирует развитие кишечного воспаления. Стоит также отметить, что ряд пектинов оказывает действие только на отдельные параметры повреждений кишечника [73, 75]. Также противовоспалительная активность пектина связывается, как указано в нескольких исследованиях, с непосредственным влиянием пектина на иммунные клетки. В частности, инкубация клеточных культур в среде с пектином ингибирует действие липополисахарида. Противовоспалительные эффекты пектина in vitro и in vivo коррелируют со степенью метилэтерификации. Подразумевается, что химическая структура пектина обладает фармакологической активностью и распознается иммунными клетками. Обширные исследования взаимосвязи между химическим строением пектина и противовоспалительной активностью показали, что степень метилэтерификации основной цепи важна для подавления воспалительных цитокинов [30]. Помимо противовоспалительной активности, многие типы пектина были связаны с противораковой активностью, как в исследованиях in vitro, так и in vivo. Они снижали пролиферацию, миграцию и адгезию клеток, а также индуцировали апоптоз. Например, в исследовании [16], были изучены противоопухолевые свойства пектина папайи. Пектиновые полисахариды папайи с разных стадий созревания вызывают гибель раковых клеток на разных уровнях. Пектин ингибирует агрегацию и миграцию раковых клеток, влияет на взаимодействия между раковыми клетками и белками внеклеточного матрикса, а также индуцирует поздний апоптоз / некроптоз раковых клеток. Пектины широко используются в качестве эмульгаторов, гелеобразующих агентов, остекляющих агентов, стабилизаторов и/или загустителей в пищевой, фармацевтической, личной гигиене и полимерных продуктах [8]. Его высокая гидрофильность и гелеобразующие свойства в водных средах сделали его подходящим полимером для различных биомедицинских и фармацевтических применений [53]. Обращает на себя внимание использование пектина в качестве матрицы-носителя биологически активных компонентов или лекарственных препаратов. Пектиновые композиции легко сшиваются в гели: 3D-матрицы, пленки, микро- или наночастицы, которые представляют собой кросс-связанный пектин, менее растворимый и менее 20

подверженный деградации в организме [67, 74]. При этом различные препараты могут быть включены в данные композиции с высокой эффективностью загрузки [23]. Стоит отметить, что в настоящее время существует потребность в разработке биоматериалов с новыми свойствами для биомедицинских применений [43]. Поэтому возрастает интерес к технике тканевой инженерии, где биосовместимые и биоразлагаемые материалы могут использоваться в качестве опорных матриц или субстрата для доставки биологически активных веществ и культивируемых клеток в целевые ткани для содействия трехмерной тканевой реконструкции [45]. Несмотря на огромное количество преимуществ, пектиновые полисахариды имеют ряд существенных недостатков, которые зависят и от потенциальной области применения. В частности, при использовании в целенаправленной доставке пектин не способен эффективно защищать свою лекарственную нагрузку во время прохождения через желудок и тонкую кишку [36, 45, 51]. Чтобы преодолеть это, пектиновые составы могут быть сшиты ионами кальция или гидрофобными полимерами [45]. Полученные пектиновые гели не разрушаются желудочными или кишечными ферментами, а деградируются пентолитическими ферментами микробиоты толстого кишечника [18]. Другим препятствием является большое разнообразие молекулярных характеристик пектина, что может быть обусловлено и условиями экстракции данных полисахаридов. Для пектина характерна невоспроизводимость и неоднородность его структуры. Это усложняет контроль и обеспечение качества пектиновых полисахаридов и биоматериалов на их основе [24]. Например, ультразвук может использоваться для увеличения выхода пектина, но, как показали исследования, реологические свойства пектина ухудшаются. Это связано с уменьшением молекулярной массы пектиновых полисахаридов путем деградации под действием разрушающей кавитации [8]. Эти проблемы можно частично решить разработкой новых технологий выделения, очистки и характеристики пектина [23]. Но изучение роли отдельных биополимеров является сложным из-за неоднородности растительных тканей / органов и способности растений адаптироваться в ответ на экологические стимулы [41]. В любом образце пектина такие параметры, как молекулярный вес или содержание конкретных субъединиц, будут отличаться от молекулы к молекуле. Структура пектина очень трудно определить, потому что пектин может меняться во время выделения из растений, хранения и переработки растительного материала. Между образцами и между молекулами внутри образца могут существовать большие различия, и результаты различных методов измерения будут отличатся друг от друга [65]. 3.3. Культура клеток растений как источник пектинов Химический состав и биологическая активность веществ, выделенных из нативных растений, подвержены широкой вариабельности. Она отражает различия в месте произрастания, погодных условиях, особенностях почв и т.д. Физико-химические свойства пектинов существенно зависят от стадии онтогенеза и условий роста растений. Для решения проблемы стандартизации и стабильности растительного сырья широко используются каллусные культуры, которые представляют собой относительно однородные системы клеток. Среди достоинств каллусных культур можно отметить отсутствие контроля над организмом, безразличие к климатическим условиям и возможность оптимизации культивирования и накопления пектина в клетках [72, 76]. 21

Клеточные культуры представляют собой стабильную гомогенную систему, которая в стандартных условиях продуцирует пектиновые вещества с определенной структурой. Это позволяет использовать их в качестве модельных соединений для изучения элементов тонкого строения, метаболизма и биосинтеза, а также для исследования взаимосвязи структуры и физиологической активности. Данные свойства клеточных культур привели к получению с их помощью пектиновых полисахаридов с заранее заданной структурой и свойствами. Структурное изучение пектинов, выделенных из каллусных культур, и сравнение их с пектинами нативных растений показало, что некоторые типы пектинов из разных источников имеют близкие свойства и строение. Другие типы пектиновых полисахаридов могут различаться, например, по характеру строения боковых цепей. Пектиновые вещества из каллуса, как и из нативного растения, обладают выраженной иммуномодулирующей активностью. Принимая во внимание высокую продуктивность каллусных культур по биомассе и синтезируемым пектиновым веществам, можно с уверенностью сказать, что клеточные культуры могут рассматриваться как альтернативные источники получения стандартизованных физиологически активных пектинов [75]. Для культуры растительных тканей доступны несколько методов производства, представленных на Рисунке 7. Во время каллусогенеза происходит размножение аморфной массы клеток в ответ на воздействие различных регуляторов роста (гормонов) на экспланты. Затем каллус можно использовать для регенерации целых растений или культивировать для производства важных метаболитов в культурах клеточной суспензии [19]. Тканевая культура растений, способная производить важные биомолекулы, имеет ряд преимуществ перед традиционной культурой. Это независимость от географических, сезонных и экологических изменений; непрерывное производство с равномерным качеством и выходом; отсутствие в необходимости применения пестицидов и гербицидов; сравнительно короткие циклы роста. Но одним из основных недостатков культуры ткани in vitro является высокая стоимость, связанная с этой технологией. В частности расходы на культуральные среды, электричество и рабочую силу. Несмотря на то, что растения способны адаптироваться к широкому спектру условий, как только адаптация происходит, повторная адаптация к новым условиям идет медленно и затруднительно [19]. 22

Рисунок 7 - Схема современных методов, используемых для крупномасштабного производства биоактивных соединений с использованием культуры растений in vitro Другая проблема, обнаруженная в культуре растительных тканей, связана с генетической стабильностью растений. Условия культивирования in vitro, особенно некоторые регуляторы роста, действуют как факторы стресса. Они вызывают изменения в чувствительных областях генома растений и приводят к нестабильности в культивируемых клетках. Это представляет собой препятствие в практическом использовании методов культивирования тканей растений для производства активных метаболитов. Также в культурах клеток растений, особенно каллусных культурах, редко присутствуют однородные физиологические характеристики. Их гетерогенный характер приводит к необходимости выбора высокопроизводительных клеточных линий для создания прочных производственных платформ для натуральных продуктов. Но, несмотря на вышеперечисленные недостатки, культура тканей in vitro является важным инструментом, который можно использовать для производства важных метаболитов [19]. 4. Пектиновые гели 4.1. Применение пектиновых гелей Гелеобразование представляет собой создание трехмерной сети полимерных цепей с растворителем и растворенными в нем веществами. Трехмерные сшитые полимерные материалы, или гидрогели, обладают способностью поглощать и удерживать большое количество воды. Данные материалы можно использовать в качестве матриц для контролируемой доставки лекарств и инкапсуляции клеток [45]. Природные полисахариды в настоящее время широко используются для разработки твердых лекарственных форм в целях адресной доставки ЛС в толстый кишечник. В качестве материала для конструирования системы адресной доставки рассматриваются пектиновые гели. Предположительно, ысвобождение лекарственного препарата из гелей происходит в 23

толстом кишечнике за счет ферментативной деградации полимерной основы пектолитическими ферментами микробиоты. Одним из важнейших свойств выбранных материалов является их биосовместимость. Гелеобразование по типу “egg-box” характеризуется тем, что пектин образовывает твердый гидрогель в водном растворе без использования вредных веществ [50]. Использование природных полимеров, таких как пектин, хитозан и альгинат, возможно и в разработке системы доставки лекарственных средств для лечения рака. Наночастицы на основе полисахаридов могут быть дополнены лигандами для специфического нацеливания на раковые клетки. Они подходят для таргетирования рецепторов на клеточном уровне [70]. Потенциальные применения пектиновых гидрогелей интенсивно изучаются и в области биоматериалов для заживления ран, тканевой инженерии и стоматологии [56]. Пектиновые гидрогели могут также использоваться в качестве барьерного материала для профилактики послеоперационных спаек в хирургии или в качестве внеклеточной матрицы для восстановления мягких тканей [43]. При этом пектиновые гидрогели имеют ряд существенных недостатков, таких как механическая слабость, чувствительность к воде и нестабильность в физиологических условиях (высокое набухание в физиологических средах), непредсказуемое поведение в долгосрочных применениях [23, 56]. Мягкая и эластичная природа является одновременно достоинством и недостатком данных материалов. Механическая прочность природного полимера меньше по сравнению с синтетическими материалами, что делает их уязвимыми для различных биомедицинских применений [45]. Изменить свойства гелеобразования пектинов и снизить растворимость может структурная модификация [8]. С этой целью возможно использование комбинаций пектинов с производными полиакрилата или хитозаном [24]. Нативные углеводные биополимеры рассматриваются как безопасные для энтерального введения, но их свойства могут полностью измениться после химической модификации. Токсичность данных соединений должна быть оценена индивидуально [78]. Имеется информация о том, что гидрогели из пектина обладают низкой цитотоксичностью, подобно гидрогелям других природных полисахаридов [43]. Также необходим подбор условий гелеобразования с учетом природы и строения молекул лекарственного средства. В частности, большие молекулы белковых лекарств не могут диффундировать через поры матричного шарика, но они могут быть высвобождены из-за ферментативной деградации матрицы. В то время как лекарства с меньшим размером молекул, например, 5-аминосалициловая кислота, могут легко проходить через поры матрицы. Это характерно для кислой среды, где в присутствии ионов водорода образуются растворимые и более проницаемые области пектиновой кислоты [18]. В целом, пектиновый матрикс пригоден для изготовления дозированных лекарственных форм, таких как таблетки, гранулы, пеллеты и микрочастицы [78]. Многочастичные лекарственные формы более перспективные. При попадании в толстый кишечник они быстро распространяются и подвергаются высвобождению лекарственного средства из-за повышенной площади поверхности, подвергаемой воздействию ферментов [12]. 24

4.2. Получение пектиновых гелей Гель формируется в результате образования непрерывной трехмерной сети полимерных молекул, поперечно связанных друг с другом в жидкой среде. В образовании пектиновых гидрогелей частично или полностью задействованы функциональные группы [43]. Процесс гелеобразования зависит как от внутренних, так и от внешних параметров. К внутренним факторам относится число и схема распределения свободных карбоксильных групп, молекулярная масса и тип пектина, а к внешним – концентрации пектина и кальция, рН, ионная сила и температура [8]. Например, из яблочного пектина получают более эластично-вязкий гель, а пектин цитрусовых образует более эластично-хрупкий гель. Прочность геля зависит от показателей полимеризации, метоксилирования и ацетилирования и от наличия боковых цепей из нейтральных сахаров. В частности, жесткость геля определяется количеством эффективных соединений, образованных на цепь [8, 78]. Тем самым, чем ниже молекулярный вес, тем меньше может быть образовано соединений на молекулу, что приводит к уменьшению степени сшивания и ослаблению геля. В зависимости от метилэтерифицированности пектиновые гели имеют принципиально разные механизмы образования. Образование геля в высокометоксилированных пектинах (HM, DE50%) обеспечивают водородные связи и гидрофобные взаимодействия между галактуроновыми цепями [78]. Образование гелей НМ требует высокого содержания солевого раствора и кислоты, поэтому их получают при низком значении рН (около 3) в присутствии высокой концентрации (около 65%) сахарозы или подобного сопутствующего вещества. Высокая концентрация сахарозы уменьшает активность воды, которая необходима для стимулирования взаимодействия цепей. Низкое рН способствует протонированию карбоксилатных остатков, сводя к минимуму электростатическое отталкивание. Водородное связывание является основным взаимодействием, которое поддерживает гелевую структуру НМ [8, 97]. Низкометоксилированные (LM, DE50%) пектины содержат больше свободных карбоксильных групп, чем высокие метоксипектины. Поэтому гелеобразование данных пектинов может происходить в отсутствие совместного растворения, при наличии достаточного количества подходящих ионов двухвалентного металла и в более широком диапазоне значений рН [8, 11, 97]. Желирование LM пектинов происходит в результате образования ионных связей в зоне контакта пектиновых молекул, то есть при воздействии катионов, которые сшивают цепи галактуроновой кислоты. Степень гидратации, тип и степень сшивания полисахаридной матрицы существенно влияют на эффективный размер ячейки геля и, как следствие, на молекулярную диффузию в гель [23, 78]. Более того, из-за пониженной гидрофильности пектинов в присутствии амидных групп, амидированные LMпектины имеют улучшенные гелеобразующие свойства. Такие пектины нуждаются в меньшем количестве кальция в геле и менее подвержены осаждению при высоком уровне кальция [65]. Помимо этого, водородная связь между амидными группами также увеличивает прочность геля в амидированных пектинов, что приводит к образованию более компактной сети кальций-пектината [11]. Для получения пектиновых гелей преимущественно используется ионное сшивание молекулярных цепей. Модель гелеобразования пектина («egg box») рассмотрена на примере ионной сшивки с ионами кальция и представлена на Рисунке 8. 25

Рисунок 8 – Схема процесса гелеобразования на молекулярном уровне (модель «egg box») Ионы кальция могут взаимодействовать со свободными карбоксильными группами LM-пектина по всей цепи для создания водонерастворимого сшитого полимера. Эти приводит к образованию высокоупорядоченной трехмерной сети из цепочек пектина и индуцированию так называемых «зон ячеек» в модели «egg box» [53]. Присутствие метиловых групп предотвращает образование зон контакта, а боковые цепи в молекулах пектина препятствуют их агрегации. Поэтому, чем больше свободных карбоксильных групп и чем меньше боковых цепей, тем наиболее вероятно формирование кальциевых мостиков [78]. Подобную гелевую структуру можно получить в водной среде, данная процедура известна как ионотропное гелеобразование пектина [53]. Но есть предположение [65], что гелеобразование амидированных пектинов не может быть объяснено только моделью «egg box», так как амидные группы вдоль цепи способствуют ассоциации через водородную связь. В целом, скорость образования геля и его прочность зависят от степени метоксилирования пектина, концентрации кальция в растворе и рН раствора [78]. В качестве сшивающих агентов могут быть рассмотрены ионы двухвалентных металлов, например, кальций Ca, цинк Zn, магний Mg или железо Fe. Тип катиона влияет на взаимодействие «пектин-катион». Ионы кальция (Ca2+) связываются в основном через карбоксильные группы. Ионы цинка (Zn2+) и ионы железа (Fe2+) связываются аналогично Ca2+. Однако они обладают высокой аффинностью для других групп, включая гидроксильные. Следовательно, во взаимодействии «пектин-катион» образуется больше связей в случае использования ионов Zn2+ или Fe2+, чем Ca2+. Несмотря на свое сходство с ионами кальция, ионы магния (Mg2+) оказывают гораздо меньшее влияние на реологию пектина. Они являются плохим агентом, сшивающим пектин, что не позволяет создавать пектиновые системы LM [97]. Предполагая фиксированный размер модели «egg box», Mg2+ не вписываются в эту модель, учитывая их больший эффективный гидратированный диаметр по сравнению с диаметром других катионов. Чем больше электроотрицательный элемент, тем легче для этого элемента тянуть к себе электроны. Это приводит к более сильному связыванию и, как следствие, к менее свободным ионам. Таким образом, более электроотрицательные ионы Zn2+ и Fe2+ связываются с пектином сильнее по сравнению с менее электроотрицательными катионами Ca2+ и Mg2+[40]. Использование ионов цинка в качестве сшивающих агентов приводит к усилению пектина в верхнем отделе ЖКТ, чем при использовании ионов кальция. Эти свойства приводят к уменьшению набухания в среде растворения и снижению высвобождения 26

лекарственного средства. При этом в результатах [18] указано, что эффективность загрузки в микрочастицы с Ca2+ и Zn2+, полученных при одной и той же концентрации сшивающего агента, почти одинакова. Как следствие, можно предположить, что различия в скорости высвобождения могут быть объяснены различием в степени сшивания двух типов геля [2, 13, 18]. Другим фактором гелеобразования, влияющим на прочность пектиновых гелей, является рН сшивающего раствора. Предположительно, удерживание лекарственного средства уменьшается с увеличением рН, но данный эффект наиболее выражен для Znпектинатных гелей. Сообщается, что более сильные гели, в частности, для амидированного пектина образуются при рН ниже 3 (ниже, чем значение рКа пектина). Подкисление сшивающего раствора увеличивает прочность геля благодаря двум механизмам: межмолекулярному сшиванию по модели «egg box» и водородных связей или гидрофобных взаимодействий [2]. Низкий рН снижает растворимость пектиновой цепи и подавляет межмолекулярное электростатическое отталкивание карбоксильных групп путем их протонирования. В этом случае, карбоксильные группы выступают как доноры водородной связи. Таким образом, снижение рН способствует конформационному переходу сети от двухкратной к более компактной трехкратной спиральной конформации полигалактуронатных цепей пектина [12, 34, 65]. В то же время снижение рН ниже 3 ослабляет гель, образованный ионами кальция и неамидированным пектином. Предположительно, в этом случае гелеобразование LM пектина благоприятствует высокому рН, потому что для образования Са-мостиков необходимо достаточное количество диссоциированных карбоксилатных групп [30]. Также подкисление среды гелеобразования увеличивает размеры пор геля [74]. Влияние на удерживающую способность геля оказывает количество лекарственного средства и условия сушки гидрогелей. Отмечено увеличение экстракции загруженного вещества для гранул с высокой инкапсуляцией лекарственного средства. Также более быстрое высвобождение демонстрируют гели, высушенные при комнатной температуре или при 37оС, в отличие от плотных гранул, полученных путем высушивания при высокой температуре (50оС) [12]. Рассмотрены разные способы модификации пектинов и пектиновых гелей. Например, контролируемая деструкция геля может быть достигнута путем изменения сахарного состава пектиновых полисахаридов. Возможно получение пектинов с модифицированной структурой и, следовательно, пектиновых гелей с определенными характеристиками и функциональными свойствами. Это осуществляется с помощью влияния на биосинтез пектинов благодаря изменению различных компонентов питательной среды [23]. Другим направлением может выступать покрытие пектиновых микросфер полимером, например, Eudragit S100 [13]. Еще одним способом для конструирования системы адресной доставки является создание гибридных материалов, состоящих из биополимера и неорганического комплексообразователя, например, силиката натрия [22, 67]. Характеристики готового геля и его функциональные свойства зависят от многих факторов, в особенности от тонкой химической структуры пектина и состава системы [24]. Остается актуальным и поиск пектинов, гель из которого будет устойчив к действию сред желудочно-кишечного тракта. 27

4.3. Исследование пектиновых гелей 4.3.1. Оценка высвобождения лекарства из гелей in vitro Любая система адресной доставки требует оценки высвобождения лекарственного средства в условиях in vitro и in vivo. Термин «высвобождение» охватывает несколько процессов, которые способствуют переносу лекарственного средства из лекарственной формы. Необходима разработка системы, предназначенной для доставки лекарства со скоростью, которая больше регулируется лекарственной формой и меньше свойствами лекарственного средства и условиями, преобладающими в окружающей среде. Основным механизмом высвобождения является диффузия, которая происходит как в химических системах, так и в системах с контролируемым набуханием. В первом случае скорость высвобождения лекарственного средства контролируется деградацией и растворением, а также скоростью гидролитического или ферментативного расщепления. Во втором случае, проникновение жидкости в матрицу индуцирует диффузию лекарственного средства в сторону раствора [96]. Ключевыми элементами, регулирующими высвобождение лекарственного средства из биополимерных матриц, является набухание, диффузия растворенного вещества и деградация матрицы [56]. Успешное развитие лекарственных форм с контролируемым высвобождением требует понимания взаимодействия между лекарственной формой и физиологическими факторами ЖКТ, включая: транзит, рН, трансэпителиальные механизмы и метаболизм [99]. Для исследования процесса высвобождения в условиях in vitro разработаны составы искусственных гастроэнтеральных сред (simulated gastrial fluid – SGF, simulated intestinal fluid – SIF, simulated colon fluid – SCF), представленных в различных Фармакопеях мира и рекомендуемых для оценки растворимости и диффузии лекарственных средств [96]. Среда, имитирующая желудок (SGF), имеет рН 1,5 и ниже, а рН сред, имитирующих кишечник (SIF и SCF), составляет 6,8-7,4. Пектин представляет собой анионный полиэлектролит, и изменение рН влияет на конформацию цепей. В кислых средах преобладают ионы H+, что приводит к протонированию карбоксильных групп (-СООН) и уменьшению электростатического отталкивания. В этих условиях полимерные цепи и гранулы в целом сохраняют относительно нерастворимую и плотно упакованную сферическую структуру, которая затрудняет проникновение жидкости в систему. Однако при этом происходит частичное замещение ионов Ca2+ на Н+ или Na+ во внешних слоях гелей. При последующем воздействии более высокими значениями рН, карбоксильные группы переходят в ионизированную форму. Это увеличивает гидрофильность и способствует расширению сети за счет электростатического отталкивания, являющегося фактором, способствующим проникновению жидкости в систему [11, 54]. Также, ионы Na+ и К+, присутствующие в средах SIF и SCF могут вытеснять ионы кальция из гелеобразной структуры. Частично формируются области растворимых пектинов, которые являются более проницаемыми [18, 24]. Кроме того, поведение набухания может быть связано с присутствием в средах ионов фосфата, которые способствуют высвобождению ионов Ca2+ [24, 54]. Таким образом, исследование пектиновых гелей начинается с изучения их поведения в искусственных гастроэнтеральных средах. Необходимо провести поиск подходящего материала в качестве носителя лекарственного средства и формирование из него сильной 28

матрицы и жесткого поверхностного слоя, которые будет замедлять высвобождение инкапсулированного препарата [11]. 4.3.2. Оценка влияния гелей на метаболическую активность клеток in vitro В процессе создания лекарственно препарата необходимо также изучение токсикологических свойств биоматериалов. Многочисленные токсикологические исследования проводятся на экспериментальных моделях in vitro, с целью уменьшения экспериментов на животных, согласно одному из принципов концепции «3R» и Этического кодекса. Для оценки антипролиферативного свойства соединений на культивируемые клетки широко используются анализы высокой пропускной способности на основе метаболизма [55]. Анализы на основе метаболической жизнеспособности с использованием солей тетразолия, таких как МТТ измеряют скорость метаболизм митохондрий и косвенно отражают число жизнеспособных клеток. Реакция протекает за счет митохондриальных дегидрогеназ (преимущественно сукцинатдегидрогеназы) и редуктаз, активность которых зависит от концентрации внутриклеточного NADH и NADPH. Только живые клетки, имеющие интактные митохондрии и клеточные мембраны, могут катализировать реакцию. Однако изменения, как митохондрий, так и метаболизма могут влиять на метаболическую жизнеспособность клеток. Также любое вещество, которое препятствует гликолизу или ферментам, участвующим в восстановлении соли тетразолия до формазана, изменяет скорость реакции дегидрирования МТТ. Как следствие, изменяются результаты подсчета клеток [55, 93, 98]. В некоторых случаях МТТ может быть заменен другими более чувствительными и менее цитотоксичными форматами анализа (МТС, ХТТ, WST-1), которые требуют меньше экспериментальных шагов. Но с другой стороны на них влияют несколько факторов, к которым МТТ-анализ не чувствителен. Кроме этого, МТТ метаболически снижается всеми жизнеспособными клетками иммортализованной клеточной линии или первичной культуры, экстрагированной из ткани. В этом анализе возможно использование как адгезивных, так и суспензионных клеток, в отличие от других форматов исследования цитотоксичности [98]. МТТ, благодаря своей простоте и эффективности, является широко используемым методом оценки жизнеспособности клеток и цитотоксичности для скрининга биоматериалов на предварительных уровнях. При подобранных оптимальных условиях проведения анализа метод МТТ является очень надежным и может быть автоматизирован для применения на большом количестве выборок. Тестирование на токсичность обычно требует, по крайне мере, 2-3 дня воздействия испытуемого вещества на клетки [5, 98]. Выбор клеточных линий для МТТ-анализа также зависит от исследуемого вещества, которое необходимо подвергнуть тестированию in vitro. Мышиные и человеческие клеточные линии являются важными инструментами для изучения клеточных функций, механизмов и ответов, а также сигнальных путей и транспорта питательных веществ и лекарств [98]. В течение десятилетий модели кишечника in vitro использовались для изучения фармакологического и токсикологического воздействия [31]. Поверхность слизистой оболочки ЖКТ выстилается монослоем эпителиальных клеток кишечника, соединенных друг с другом своими апикальными полюсами. Образуется слой, который отделяет просветное содержимое от иммунных клеток под ним. Таким образом, модели клеток кишечника обычно 29

используются для изучения абсорбции, метаболизма, биодоступности и токсичности лекарств [64]. Наиболее известная клеточная линия аденокарциномы толстой кишки человека Caco-2 демонстрирует многие морфологические, биохимические и функциональные свойства эпителия кишечника in vivo, которые делают ее подходящей модельной системой in vitro [20, 26, 93]. Клетки растут в монослое, показывают цилиндрическую поляризованную морфологию, имеют микроворсинки на апикальной стороне и плотные соединения между соседними клетками, а также выражают небольшие ферментативные активности кишечных гидролаз на апикальной мембране [58]. В качестве второй клеточной линий как модели тестирования токсичности in vitro может быть рассмотрена культура клеток НЕК293. Они являются чувствительными человеческими эмбриональными клетками, восприимчивыми к факторам окружающей среды [27]. Среди культур клеток мыши для тестирования могут быть рассмотрены клеточная линия эмбриональных фибробластов мыши NIH 3T3 и фибробласты подкожной соединительной ткани мыши NCTC клон 929 (L929). 4.3.3. Оценка распределения лекарства in vivo Методы in vitro – скрининговая или объемная оценка эффективности и безопасности фармакологических веществ в модельных системах с использованием реакционных сред, ферментов, клеточных линий и др. – на сегодняшний день очень популярны как с точки зрения высокой инновационности, так и с позиции гуманного обращения с животными. Но, несмотря на широкое использование клеточных культур и наличие различных методов и оборудования для исследований, полученные данные не всегда удается экстраполировать на живой полноценный организм. Поэтому полностью исключить использование лабораторных животных в исследованиях путем замены на альтернативные биологические тест-системы невозможно. Кинетические закономерности химических и биологических процессов, происходящих с лекарством в организме животного или человека, являются одним из важных критериев, которые необходимо учитывать при разработке новых лекарственных форм. Данные закономерности изучает раздел фармакологии под названием фармакокинетика. Фармакокинетика содействует решению проблемы эффективности и безопасности фармакотерапии путем исследования зависимости терапевтических и побочных эффектов лекарств от их концентрации в месте действия и расчету подходящих режимов введения препаратов для создания и поддержания оптимальных концентрации лекарственных веществ [94]. Одним из параметров, устанавливаемых в рамках исследования фармакокинетики, является изучение распределения лекарственного средства в организме. Оно носит индивидуальных характер и, как следствие, вариацию фармакокинетических параметров и развитие терапевтического эффекта. В связи с этим, исследование распределения лекарства из новой лекарственной формы в условиях in vivo является одной из ключевых задач при разработке препарата. Исследования проводятся с учетом технических возможностей и в большинстве случаев требуют разработки или адаптации аналитических методик. Крысы используются во множестве физиологических, фармакологических, биохимических исследований и при оценке безопасности, установлению токсичности лекарственных веществ и ядов, а также для воспроизведения экспериментальных опухолей и инфекционных заболеваний. Для экспериментальных исследований используют белых крыс, 30

которые являются альбиносами черной и серой пород. Важное преимущество белых крыс как лабораторных животных заключается в том, что они довольно устойчивы к инфекционным заболеваниям и дают большой приплод. Небольшая масса тела, относительно простое содержание и успешное разведение их в лабораторных условиях позволяют проводить массовые опыты [104]. Известно, что поглощение и распределение лекарственного средства в организме крысы после перорального введения схоже с человеческим. Крыса также обладает некоторым прогнозирующим потенциалом для определения адгезии слизистой оболочки желудка [99]. Но из-за размера ЖКТ крысы необходимо вносить корректировки. В Таблице 1 представлено сравнение кислотности и времени пребывания пищи в отделах желудочнокишечного тракта крысы и человека [94]. Таблица 1 – Сравнение показателей отделов ЖКТ крысы и человека Показатель рН Время пребывания пищи, мин Организм Крыса Человек Крыса Человек Желудок 1.93 – 4.15 1.10 – 1.70 15 15 - 78 5.89 – 7.10 6.00 – 7.50 88 - 109 198 - 238 6.23 – 6.70 5.00 – 6.80 451 - 844 1293 - 2350 Тонкий кишечник Толстый кишечник 5. Аналитические методы исследования В области фармацевтических исследований очень важно аналитическое исследование лекарственных материалов, биологических образцов, содержащих препараты и их метаболиты. От этапов разработки препарата до маркетинга большую роль играют аналитические методы, будь то понимание физической и химической стабильности препарата, влияние на выбор и конструкцию лекарственной формы и т.д. [62]. 5.1. Сканирующая электронная микроскопия Микроскопы используются в научных исследованиях для получения информации об объекте исследования в форме изображения. Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) – прибор, предназначенный для получения увеличенного изображения объекта путем сканирования по нему сфокусированным пучком электронов и регистрации детектором сигнала, возникающего в результате взаимодействия электронов с веществом [88]. В биологических исследованиях основным преимуществом сканирующего электронного микроскопа является изучение морфологии и деталей поверхности объемных образцов при очень высоком разрешении. С помощью СЭМ обычно исследуют внешние особенности образца, в отличие от исследований с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Линзы в СЭМ не формируют изображения, а действуют как набор из трех конденсаторных линз в серии размагничивания, чтобы сфокусировать чрезвычайно твердое пятно или зонд электронов на твердом образце. Но биологические системы состоят из более легких элементов и дают плохой сигнал в обычной сканирующей электронной микроскопии. Чтобы преодолеть это препятствие, биологические образцы предварительно покрывают тонким слоем элемента с высоким атомным номером (золото, палладий, платина или осмий) для сохранения структурных деталей [95]. 31

Принципиальная схема СЭМ представлена на Рисунке 9 и включает в себя камеру с образцом, источник электронов, оптическую систему для фокусировки и сканирования (электронную колонну), детекторы для регистрации сигнала и систему для создания вакуума в микроскопе. Рисунок 9 – Схема сканирующего электронного микроскопа [109]: 1 – катод, 2 – анод, 3 – электронный луч, 4,5,6 – конденсорные линзы, 7 – отклоняющие катушки, 8 – блок регулировки увеличения, 9 – фотоумножитель, 10 – апертурная диафрагма, 11 – образец, 12 – сцинтиллятор, 13 – световод, 14 – отклоняющие устройства, 15 – устройство для наблюдения, 16 – съемка, 17 – усилитель сигнала, 18 – вакуумная система Принцип действия СЭМ заключается в том, что происходит выбивание из материала образца вторичных и отраженных электронов при попадании электронного луча в какуюлибо точку объекта. Электронный луч в виде тонкого пучка электронов сканирует образец точку за точкой и передает сигнал на монитор. Метод сканирующей электронной микроскопии применяется как в научных исследованиях, так и в промышленности, в частности, в биологических науках, материаловедении и нанотехнологиях. 5.2. Спектрофотометрия Спектроскопические методы анализа основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом. Они служат для исследования строения, идентификации и количественного определения светопоглощающих соединений [89]. Из всех фотометрических методов спектрофотометрия имеет максимально широкое применения при анализе различных объектов неорганической и органической природы. Данный метод используется в медицине, сельском хозяйстве, промышленной и научной областях, например в исследованиях биохимии, иммунохимии, бактериологии и др. Спектрофотометры для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра состоят из оптической системы и устройства для измерения оптической плотности. Оптическая система создает монохроматическое излучение в области от 190 до 800 нм и 32

обеспечивает его прохождение через образец [89]. Принципиальная схема спектрофотометра представлена на Рисунке 10. Рисунок 10 – Схема спектрофотометра Принцип работы прибора заключается в разложении света в спектр с помощью монохроматора. Монохроматизованный световой поток проходит через кюветное отделение и попадает на фотоэлементы приемника излучения, в котором энергия светового потока преобразуется в фототок. Усиленный электрический сигнал регистрируется в виде спектральной кривой или по показанию отсчитывающего устройства. Различают спектрофотометры, работающие по однолучевой и двулучевой схеме. В первом случае в световой поток в кюветном отделении попеременно вносят кювету с раствором сравнения и кювету с анализируемым раствором. При работе с двулучевыми спектрофотометрами устанавливают обе кюветы одновременно: в канал сравнения кювету с нулевым раствором, а в измерительный канал – с исследуемым раствором. 5.3. Высокоэффективная жидкостная хромато-масс-спектрометрия Одним из эффективных методов разделения сложных смесей веществ является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси с помощью различия в распределении между двумя несмешивающимися фазами, подвижной и неподвижной. Отличительной особенностью ВЭЖХ является полное и быстрое разделение сложных смесей веществ благодаря использованию высокого давления и мелкозернистых сорбентов. Данный метод применяется в химии, биотехнологии, медицине, охране окружающей среды, производстве лекарственных препаратов и др. Принцип работы жидкостного хроматографа заключается в распределении пробы между двумя фазами в хроматографической колонке. Проба вводится в петлю и переносится из петли на колонку с помощью подвижной фазы, которая подается насосами. Разделяемые компоненты с различной скоростью перемещаются вдоль колонки. Компоненты, которые слабее взаимодействуют с сорбентом, преимущественно остаются в подвижной фазе. Они перемещаются вдоль колонки быстрее компонентов, чья адсорбция на неподвижной фазе выше. Принципиальная схема жидкостного хроматографа с градиентным элюированием представлена на Рисунке 11. 33

Рисунок 11 – Принципиальная схема жидкостного хроматографа В жидкостной хроматографии не только выбор подвижной и неподвижной фаз, но и метод обнаружения имеет решающее значение, чтобы гарантировать, что все компоненты будут обнаружены. Одним из широко используемых детекторов в ВЭЖХ является УФдетектор, он обеспечивает обнаружение всех УФ-поглощающих компонентов. Детектор с фотодиодной матрицей – линейной матрицей дискретных фотодиодов на интегральной микросхеме для спектроскопии, которая позволяет измерять одновременно диапазон длин волн – также может анализировать чистоту пика путем сопоставления спектров. Другим детектором является детектор показателя преломления для обнаружения аналитов с ограниченным или отсутствующим поглощением ультрафиолета, например, спиртов, сахаров, углеводов, жирных кислот и полимеров. Данный детектор имеет низкий уровень шума, но и низкую чувствительность среди всех детекторов. Одним из наиболее чувствительных детекторов является детектор флуоресценции [62]. Жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией считается одним из важнейших методов последнего десятилетия XX века. Масс-спектрометр в качестве детектора для жидкостной хроматографии обеспечивает высокую чувствительность среди всех методов детектирования. Масс-спектрометрия – метод исследования вещества путем определения масс ионов этого вещества (m/z) и их количеств. Масс-спектрометрия заключается во введении пробы в источник ионов и переводе молекул образца в ионизированную форму с последующим разделением и регистрацией образующихся при этом положительных и отрицательных ионов. Принципиальные схемы представлены на Рисунке 12 и 13. Для решения некоторых задач схема процесса может быть значительно сложнее (тандемная масс-спектрометрия). В этом случае смесь ионизируется с помощью мягкого метода (ESI, MALDI). Образовавшиеся молекулярные ионы проходят через первый анализатор и в бесполевом пространстве их внутреннюю энергию повышают с целью фрагментации. Второй анализатор позволяет получить масс-спектр индивидуального соединения [105]. 34

Рисунок 12 – Принципиальная схема масс-спектрометрического анализа [114] Рисунок 13 – Принципиальная схема тандемной масс-спектрометрии на примере молекулы пептида [114] Метод жидкостной хромато-масс-спектрометрии имеет две составляющие: жидкостную хроматографию, обеспечивающую разделение компонентов смеси при анализе биологических объектов, и масс-спектрометрию – один из наиболее информативных методов определения структуры органических соединений. В связи с этим, высокоэффективная жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС, HPLC-MS) широко используется для анализа таких сложных образцов, как биологические пробы (плазма, сыворотка и др.), которые содержат широкий спектр матричных компонентов, таких как белки, липиды и соли. При этом выделяют два критических момента при использовании ВЭЖХ-МС. Во-первых, во время этапов пробоподготовки могут возникать переменные потери аналитов, а во время анализа ВЭЖХ-МС могут наблюдаться вариации, например, при ионизации. Для уменьшения влияния потерь аналита и инструментальных изменений при пробоподготовке используется внутренний стандарт, который обладает теми же или сходными физическими и химическими свойствами, что и аналит, и добавляется в равном количестве как известная концентрация до обработки образца [100]. Во-вторых, при разработке HPLC-MS метода серьезной проблемой являются матричные эффекты, которые появляются из матрицы за счет соэлюирующих соединений, которые могут приводить к усилению или подавлению сигнала. Матричные эффекты могут возникать от неизвестных и непредсказуемых соединений и не могут быть компенсированы внесением внутреннего стандарта в пробу. Поэтому, необходима оптимизация хроматографического разделения и пробоподготовки, а также построение градуировочных графиков с использованием соответствующих матриц. 35

Материалы и методы 1. Характеристика пектиновых полисахаридов Для исследования использовались пектиновые полисахариды гераклиуман (HSc, Heracleum Sosnowskyi, пектин борщевика Сосновского), цирсиуман (CAc, Cirsium arvense, пектин бодяка полевого), сорбан (SAc, Sorbus aucuparia, рябина обыкновенная) и люпинан (LAc, Lupinus angustifolius, пектин люпина узколистого), полученные из каллусных культур коллекции ФГБОУ ВО «Вятского Государственного университета». Культивирование каллусной ткани проводили на твердой питательной среде с минеральной основой Мурасиге-Скуга (MS) с добавлением витаминов по прописи Стаба, мио-инозита (100 мг/л), глицина (2 мг/л), агара 7 г/л, фитогормонов – 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,0 мг/мл) и 6-бензиламинопурина (1,0 мг/мл). В качестве источника углевода добавляли сахарозу (30 г/л). Культивирование проводили при температуре 26±1оС в темноте в течение 21 суток. Разработаны различные процедуры экстракции и фракционирования с целью внесения изменений в пектины во время роста, созревания, хранения или переработки растительных материалов. Процедуры начинаются с этапа очистки исходного материал. Это проводится для инактивации эндогенных ферментов и удаления мешающих соединений, таких как сахара, органические кислоты, полифенолы и др. Затем материал клеточной стенки последовательно экстрагируют в условиях, которые соответствуют высвобождению определенных групп полисахаридов [97]. Для выделения пектина использовался следующий метод. Биомассу каллусной ткани разрушали однократным замораживанием и оттаиванием, затем обрабатывали в течение 1 часа при 50оС 0,4%-ным формалином для ингибирования ферментов и связывания полифенолов. Фракцию водорастворимых полисахаридов экстрагировали о бидистиллированной водой при 68 С в течение 1 часа. Остаток материала обрабатывали бидистиллированной водой, подкисляли разбавленным раствором соляной кислоты до рН 3,8-4,0 и выдерживали в течение 1 часа при 50оС. Пектиновые полисахариды, входящие в состав протопектинового комплекса, экстрагировали 0,7%-ным раствором оксалата аммония в течение 1 часа при 68оС [82]. Экстрагирование проводили до отрицательной качественной реакции на углеводы по Смиту [17]. Полученные экстракты концентрировали, диализовали. Полисахариды осаждали 96% этиловым спиртом в соотношении экстракт:спирт 1:4. Осадок растворяли в минимальном объеме бидистиллированной воды и высушивали лиофильно. Все полученные пектиновые полисахариды были охарактеризованы. Количественное содержание остатков уроновых кислот в полисахаридах определяли реакцией с 3,5диметилфенолом [66], белка – по методу Лоури [42], содержание метоксильных групп – по методу [68]. Способность к набуханию пектиновых полисахаридов определяли гравиметрически [57]. Для определения плотности раствора пектина навеску (20 мг) растворяли в PBS pH 7.2. Готовили растворы пектинов в концентрациях 0,2-0,025 дм/дл. Плотность растворов пектина определяли согласно ГФ XIII ОФС.1.2.1.0014.15. Определение проводили при температуре 28±1оС. Идентификацию и количественное определение моносахаридных остатков проводили с помощью хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) после гидролиза полисахаридов 2М раствором трифторуксусной кислоты (TFA), содержащей в качестве внутреннего стандарта 36

мио-инозит (0,1 мг/мл), при 100 °С в течение 4-5 ч, с последующим переводом их в триметилсилильные (ТМС) эфиры [103] или ацетаты полиолов [69]. Молекулярные массы полисахаридов оценивали с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Образец полисахарида (3 мг) растворяли в 0,15М NaCl (1 мл), полученном с использованием бидистиллированной воды, и раствор фильтровали и подвергали анализу [24]. Спектрофотометрическое определение проводили на спектрофотометре UV-mini1240 (Shimadzu, Япония). Моносахаридный анализ проводили на газовом хроматографе G2589A (Agilent Technologies, США) с масс-селективным детектором 5973 INERT (Agilent Technologies, США) и капиллярной колонкой HP-5MS (0,25 мм u 30 м, США). Определение молекулярных масс проводили с использованием жидкостного хроматографа (Shimadzu, Япония) с колонкой OHpak SB-804 HQ (8,00 мм х 30 см, Япония) и рефрактометрическим детектором RID-10A (Shimadzu, Япония). Результаты исследования полученных пектиновых полисахаридов представлены в Таблице 2. Для определения реологических свойств растворов пектинов навеску (20 мг) растворяли в PBS pH 7.2. Готовили растворы пектинов в диапазоне концентраций 0,2-0,025 мг/дл. Вязкость растворов определяли с помощью стеклянного капиллярного вискозиметра ВПЖ согласно ГФ XIII ОФС.1.2.1.0015.15. Постоянная вискозиметра равно 0,3004. Определение проводили при температуре 28±1оС. Формулы для определения относительной, удельной, приведенной, характеристической, кинематической и динамической вязкости представлены в Таблице 3. Зависимости удельной, приведенной и динамической вязкости от концентрации растворов пектинов представлены на Рисунках 14-16. Характеристическая вязкость пектинов представлена в Таблице 4. Таблица 2 - Характеристика пектиновых полисахаридов Содержание, % Пектин Выход, %* MeO, % DМ, % UA Ara Gal Man Glc Rha Xyl Белок Mw, kDa Mn, kDa Mw/Mn Степень набухания HSc 2,98 3,10 32,5 57,80 7,94 5,18 0,35 0,97 2,11 Н.о. 13,25 115,84 14,69 7,88 1,69 CAc 3,5 1,56 21,32 44,33 1,45 1,16 Сл. 0,38 0,41 Н.о. 10,61 86,91 14,20 6,12 12,88 SAc 2,33 2,16 21,42 61,10 4,89 6,64 0,33 2,11 0,47 0,46 4,80 109,47 6,94 15,78 28,71 LAc 2,00 1,50 28,00 53,60 1,8 1,30 0,1 0,54 0,73 0,14 5,80 416,68 11,02 37,81 42,82 * - от массы сухого материала; Mn – среднечисленная молекулярная масса; Mw – среднемассовая молекулярная масса; UA – уроновые кислоты; Ara – арабиноза; Gal – галактоза; Rha – рамноза; Xyl – ксилоза; Man – манноза; Glc – глюкоза; Сл. – следовые количества; Н.о. – не определено. 37

Таблица 3 – Определение реологических свойств растворов пектинов Вязкость Формула Относительная Удельная уд Приведенная отн = = отн прив Характеристическая Динамическая −1 уд с – концентрация раствора пектина с Получают экстраполяцией прямой приведенной вязкости до пересечения с осью ординат , графически кин Кинематическая = Пояснение – время течения раствора; – время течения растворителя ∙ ∙ ∙ 8∙ ∙ = ∙ = кин ∙ = ∙ ∙ = дин дин = – плотность испытуемой жидкости 0,3 удельная вязкость 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0,025 0,05 0,1 0,15 0,2 Концентрации растворов пектинов, мг/дл HSc CAc SAc LAc Рисунок 14 – Зависимость удельной вязкости от концентрации раствора пектина 38

1,6 Приведенная вязкость, дл/мг 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 Концентрации растворов пектинов, мг/дл HSc CAc SAc LAc Рисунок 15 – Зависимость приведенной вязкости от концентрации раствора пектина Таблица 4 – Характеристическая вязкость растворов пектинов Вязкость [ƞ], дл/мг HSc 0,38 CAc 0,77 SAc 0,44 LAc 1,05 Динамическая вязкость, мПа*с 1,7 1,65 1,6 1,55 1,5 1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 0,025 0,05 0,1 0,15 0,2 Концентрации растворов пектинов, мг/дл HSc CAc SAc LAc Рисунок 16 – Зависимость динамической вязкости от концентрации раствора пектина В качестве пектинов сравнения использовались яблочный пектин Classic AU 701 (Herbstreith&Fox, Germany). Также использовались полисахариды, предоставленные 39

Институтом физиологии Коми НЦ УрО РАН: силенан (SVc, Silene vulgaris, пектин каллуса смолевки обыкновенной), танацетан (TVc, Tanacetum vulgare, пектин каллуса пижмы обыкновенной), комаруман (CP, Comarum palustre, пектин сабельника болотного), гераклеуман (HS, Heracleum sibiricum, пектин борщевика сибирского) и бергенан (BC, Bergenia crassifolia, пектин бадана толстолистного). Характеристика пектиновых полисахаридов представлена в Таблице 5 [79, 80, 81]. Таблица 5 – Характеристика пектиновых полисахаридов Пектин Содержание, % Rha Glc Xyl DM, % Mw, kDa Н.о. 36 401 0,5 14,1 - 416 0,4 0,2 8,8 - 521 2,0 0,2 1,1 - - - 12,0 - - - - - - 1,9 - - - - - - UA Gal Ara Man Белок AU701 86,5 2,3 0,3 1,3 1,5 2,8 Н.о. SVc 81,9 1,6 1,7 1,2 0,4 0,3 TVc 77,0 2,3 4,1 1,0 0,8 BC 84,0 3,1 2,8 1,3 CP 64,0 13,0 6,0 HS 84,0 2,8 2,6 2. Модельное лекарственное средство (МЛС) Для лечения воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) используют различные лекарственные средства, среди которых наибольшее распространение получил месалазин (mesalamine, mesalazine, 5-аминосалициловая кислота, 5АСК). Месалазин является противовоспалительным компонентом сульфасалазина, показанного на Рисунке 17, в составе которого он связан с сульфаниламидом сульфопиридина. Последний предупреждает преждевременное всасывание 5АСК в верхних сегментах тонкой кишки, так как расщепление сульфасалазина происходит под действием бактерий толстого кишечника. Но в то же время сульфаниламид сульфопиридина является причиной многих побочных эффектов. В связи с этим разработан ряд новых составов для доставки 5-аминосалициловой кислоты в толстую кишку без токсичного сульфапиридинового носителя [29]. Рисунок 17 – Структура молекул сульфасалазина (слева) и месалазина (справа) [112] 40

Показано, что 5АСК ингибирует 5-липооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты, который приводит к образованию лейкотриенов в слизистой оболочке кишечника и полиморфоядерных лейкоцитов, и синтез кишечного простагландина, катализирующего циклооксигеназу [1, 49, 60]. Также 5-аминосалициловая кислота является очень мощным акцептором свободных радикалов, например 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила и кислорода, а именно супероксида и гидроксила [1]. Данные радикалы чрезвычайно токсичны для живых клеток, они участвуют в тканеразрушающих процессах, характерных для хронического воспаления. 5АСК легко передает свои электроны активным формам кислорода, тем самым подавляя их токсичность [32, 49, 52]. Стоит отметить, что исследования in vitro показывают, что многие действия месалазина зависят от дозы. Таким образом, концентрация лекарственного средства в ткани может быть определяющим фактором терапевтической эффективности [29]. 5АСК (5-амино-2-гидроксибензойная кислота, C7H7NO3) является полярным компонентом. Соединение проявляет амфотерные свойства из-за присутствия первичной ароматической аминогруппы, карбоксильной группы и фенольной группы в молекуле. Это усложняет анализ методами спектрофотометрии и ВЭЖХ. Следовательно, разумно подавление амфотерных свойств месалазина с помощью реакции дериватизации [49]. Стоит учитывать, что в организме 5АСК широко и быстро метаболизируется в печени и стенке слизистой оболочки кишечника, главным образом, ферментом N-ацетилтрансферазой I до Nацетил-5-аминосалициловой кислоты [6, 32, 52]. Также в биоматрицах могут присутствовать другие достоверные метаболиты месалазина, такие как N-формил-, N-бутирил-5АСК и N-βD-глюкопиранозил-5АСК [49, 60]. Поэтому является приемлемым использование пропионового ангидрида в качестве агента для N-ацилирования. В результате реакции дериватизации, представленной на Рисунке 18, ионизирующая аминогруппа маскируется как неионизирующая N-пропиониламиногруппа. Рисунок 18 – Образование N-пропионил-5АСК (слева) и N-пропионил-4АСК (справа) в ходе реакции дериватизации [49] Пробоподготовка биологических образцов в виду своей многостадийности может сопровождаться потерями исследуемого компонента. Для снижения погрешности, связанной с пробоподготовкой и колебаниями приборных факторов, используется метод внутреннего 41

стандарта. Он подразумевает введение в анализируемую смесь определенного количества стандартного вещества. В качестве внутреннего стандарта следует выбирать вещество, которое способно полностью смешиваться с компонентами анализируемой смеси, а также быть из числа соединений, близких объекту анализа по структуре и летучести. При использовании метода жидкостной хромато-масс-спектрометрии отдается предпочтение использованию изотопа mesalamine-d3 [6, 7, 32, 60]. Данный изотоп является стабильным и отличается от 5АСК по молекулярной массе, что позволяет идентифицировать пики исследуемого компонента и внутреннего стандарта. Также в качестве внутреннего стандарта возможно использование изомера месалазина (Рисунок 18) – пара-аминосалициловую кислоту (ПАСК, 4АСК) [49, 52]. В виду одинаковых молекулярных масс веществ необходим тщательный подбор условий хроматографического разделения двух изомеров для более точной идентификации и количественного определения компонентов. 3. Желирование и инкубация гелей 3.1. Получение пектиновых гелей Гели получали путем ионотропного гелеобразования. Для этого навеску пектина растворяли в дистиллированной воде для получения 1-4% раствора пектина. Загрузку лекарственного средства проводили путем растворения навески месалазина (Acros Organics, Belgium) в растворе пектина из соотношения пектин:месалазин 1:1-3:1 (масс.). Для гелеобразования использовали 0.34, 1 и 2 М растворы хлорида кальция. Сшивку полисахаридных цепей проводили путем инкубации гранул в растворе хлорида кальция в течение 5-60 минут. После этого гидрогели извлекались и высушивались при двух режимах: при 37оС в течение 12 часов или при 60оС в условиях вакуума в течение 1 часа. Модифицирование гелей силикат-ионами осуществляли двумя способами. Первый метод включает в себя помещение сухих гранул в раствор силиката натрия (10 мг/мл). Гели оставляли на 5 минут, после чего извлекали и повторно высушивали. Второй способ заключался во внесении раствора силиката натрия в исходный раствор пектина (или пектина и месалазин) до конечной концентрации силиката 1, 10 или 22,2 мкг/мл. 3.2. Инкубация и исследование пектиновых гелей Для исследования деструкции пектиновых гелей использовали среды, рекомендованные [86]. Для приготовления 1л среды, имитирующей желудок (SGF), растворяли 2 г хлорида натрия и 1М соляной кислотой доводили рН до 1.2. Для приготовления 1л среды, имитирующей тонкий кишечник (SIF), 77 мл 0.2М раствора гидроксида натрия смешивали с 250 мл раствора, содержащего 6.8г дигидрофосфата калия, и доводили водой до необходимого объема. В качестве среды, имитирующей толстый кишечник (SCF), использовали SIF с добавлением пектиназы Aspergillius niger из расчета 1,7 мг/мл. Навеску гранул вносили в 4-5 мл SGF и инкубировали в течение 2 часов в термостате при температуре 37оС. После этого гранулы извлекали из раствора и переносили в SIF на 4 часа при 37оС. Затем неразрушенные образцы вновь извлекали и переносили в SCF на 12 часов при 37оС. Общая схема исследования гелей представлена на Рисунке 19. 42

Рисунок 19 – Схема исследования гелей Интенсивность деструкции оценивали по изменению массы и размеров гранул после каждой стадии инкубации. Тридцать отдельных исходных гранул и гелей после каждой стадии инкубации были охарактеризованы по общей площади и отношению сторон (длинный диаметр (длина) / короткий диаметр (ширина)) с помощью программы ImageJ 1.49. 4. Элементный состав гелей Отбирали десять образцов исходных гранул каждого типа, а также по десять образцов после каждой стадии инкубации. Образцы после инкубации в искусственных средах подвергались высушиванию при 37оС. Элементный состав исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (JEOL, JSM6510LV, USA) при 10 кВ. Пробоподготовка образцов включала покрытие зафиксированных гелей платиной с помощью ионного распыления в течение 30 секунд. Цифровые изображения были получены при увеличениях 10х (масштабная линейка 1 мм). Определялось содержание ионов углерода, кислорода, натрия, кремния, фосфора, серы, хлора, калия и кальция. 5. Качественное определение МЛС методом ВЭЖХ-МС/МС Знание фармакокинетики и метаболизма 5АСК из месалазинсодержащих препаратов является обязательным при разработке новых лекарственных препаратов для лечения ВЗК. Поэтому для исследований биоэквивалентности необходимы проверенные аналитические методы. Это связано с заметной изменчивостью в метаболизме и распределении 5АСК после перорального введения [29]. ВЭЖХ-МС (HPLC-MS/MS) с использованием электрораспылительной ионизации (ESI) теперь признана мощным инструментом для подтверждения и количественного анализа благодаря высокой чувствительности и селективности, и поэтому настоятельно рекомендуется для фармакокинетических исследований в сложных матрицах [52]. Аминосалициловые кислоты плохо растворяются в воде, особенно 4АСК, а также имеют короткий срок хранения в холодильнике, поэтому были рассмотрены другие способы приготовления стандартов: в воде с 1-2 каплями соляной кислоты [6], в метаноле [52], в 0,1% 43

муравьиной кислоте : ацетонитриле (v:v 50:50) [7] или в 5% растворе аммиака [60]. Стандартный растворы с концентрацией 100 мкг/мл, приготовленные с использованием метанола или ацетонитрила, стабильны в течение месяца при хранении в холодильнике (+4Со) [7, 52]. Согласно исследованиям различных подвижных фаз уксусной и муравьиной кислот, а также переменной кислотной концентрации, установлено, что подвижная фаза с ацетонитрилом и водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты, (v:v 60:40) наблюдается самая высокая чувствительность [6, 7]. Поэтому было решено использовать подвижные фазы 0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрила для хроматографического разделения. В связи с этим, стандартные растворы были приготовлены на растворе 0.1FA-A (0,1% муравьиная кислота : ацетонитрил, v:v 40:60). Стоковые растворы 5АСК (EP Reference Standard) и 4АСК (Sigma-Aldrich, USA) приготовлены с концентрацией 500 мг/мл, рабочие растворы для обнаружения ионов и оптимизации метода – 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 и 100 мкг/мл для каждого компонента соответственно. Согласно литературным данным [49], 4АСК, 5АСК, N-пропионил-4АСК и N-пропионил-5АСК имеют следующие ионные переходы, представленные в Таблице 6. Таблица 6 – Ионные переходы 4АСК, 5АСК, N-пропионил-4АСК и N-пропионил-5АСК Compound 4ASA 5ASA Mr* 153 153 N-Pr-4ASA 209 N-Pr-5ASA 209 Positive-ion ESI-MS/MS, m/z 154→136 [M+H-H2O]+ 154→136 [M+H-H2O]+ 210→192 [M+H-H2O]+ 210→136 [M+H-H2O-CH3CHCO]+ 210→192 [M+H-H2O]+ 210→166 [M+H-CO2]+ 210→136 [M+H-H2O-CH3CHCO]+ Negative-ion ESI-MS/MS, m/z 152 → 108 [M-H-CO2]152 → 108 [M-H-CO2]208→164 [M-H-CO2]208→108 [M-H-CO2-CH3CHCO]208→164 [M-H-CO2]- * - молекулярная масса. Для установления и подтверждения m/z Precursor ion N-Pr-4ASA и N-Pr-5ASA к 500 мкл каждого стандарта (5 мкг/мл) было добавлено по 20 мкл пропионового ангидрида. Затем стандарты проинкубированы на Vortex при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего были проанализированы в режиме полного сканирования Q3 Scan. Данный режим подразумевает сканирование по заданному диапазону масс, происходящее с определенным фиксированным интервалом (скоростью измерения). Были установлены диапазон m/z 100-300 и время сканирования 100 мсек. Сканирование стандартных растворов проводилось как при положительной, так и при отрицательной ионизации. При обработке полученных масс-хроматограмм, представленных на Рисунке 20, проводился поиск Precursor ion с m/z 210 и 208 для положительной и отрицательной ионизации соответственно. Для N-Pr-4ASA и N-Pr-5ASA получены аналогичные массхроматограммы и масс-спектры. Анализ проводился с использованием колонки «Dr.Maish Reprosil-Pur Basic C18» 100х2 мм с размером зерен неподвижной фазы 3 мкм. 44

Рисунок 20 – Фрагменты масс-хроматограмм (слева) и масс-спектров (справа) для N-Pr4ASA при отрицательной (сверху) и положительной (снизу) ионизации Таким образом, при сканировании по заданному диапазону масс были подтверждены m/z для Precursor ion N-Pr-4ASA и N-Pr-5ASA, указанные в статье [49]. Стоит отметить, что дериватизация имеет значение и при детектировании соединений методом массспектрометрии, так как при исследовании месалазина в положительном режиме прекурсорион был обнаружен, но продукт-ион был неустойчивым, поэтому многие интерферирующие ионы продуктов разрушались при приложении энергии столкновения [6]. Аминосалициловые кислоты могут быть обнаружены в режиме положительной и отрицательной ионизации. Чувствительность с протонированным ионом-предшественником в положительном режиме была меньше, чем депротонированный ион-предшественник в отрицательном режиме [60], что было подтверждено на практике. Также выбор режима отрицательной ионизации обеспечивает более широкий линейный диапазон. Кроме того, при работе в режиме положительной ионизации наблюдались аддукты с ионами натрия, влияющие на чувствительность. Образование заряженный капель в ESI достигается, главным образом, за счет ионного восстановления на капиллярной поверхности. Положительные 45

ионы, образующиеся при протонизации в кислой среде, увеличивают скорость процесса восстановления и позволяют распылителю легче переносить отрицательный избыток заряда, который затем переносится на аналит [52]. По установленным m/z Precursor ion проведено исследование в режиме сканирования по продукт-иону. Анализ подразумевает выбор необходимой m/z на первом квадруполе Q1 и после вынужденного соударительного распада проводить выборочный анализ на квадруполе Q3 по установленным ионам-прекурсорам. Полученные в данном режиме спектры продуктионов, позволяют определять структуру ионов, выбранных в первом квадруполе Q1. Обнаруженные продукт-ионы для N-Pr-4ASA и N-Pr-5ASA представлены на Рисунках 21 и 22, соответственно. Рисунок 21 – Фрагмент масс-хроматограммы (сверху) и масс-спектра (снизу) для Product ion N-Pr-4ASA Рисунок 22 – Фрагмент масс-хроматограммы (сверху) и масс-спектра (снизу) для Product ion N-Pr-5ASA 46

При отрицательной ионизации (CE = 25V) N-пропионил-производных образуются продукт-ионы с m/z 164 [M-H-CO2]- - для обоих соединений и m/z 108 [M-H-CO2-CH3CHCO]для N-Pr-4ASA и m/z 107 [M-H-CO2-CH3CHCO-H]- для N-Pr-5ASA. Вероятно, Nпропионильная группа в мета- и пара-положении по отношению к группе ОН является причиной появления различных энергетически выгодных продуктов [52]. Следующей стадией создания метода является оптимизация параметров массспектрометра, во время которой устанавливаются оптимальные значения напряжений на квадруполях при измерении событий мониторинга множественных реакций. Режим регистрации множественных переходов (MRM), представленный на Рисунке 23, подразумевает выборочный анализ ионов при выбранных m/z на квадруполях Q1 и Q3. В сравнении с измерениями по выбранному иону SIM, оба выбранный и представленный ионпрекурсор и продукт-ион могут быть исследованы в высоко избирательных количественных анализах. Режим эффективен для определения количества следовых составляющих, содержащихся в большой матрице образца. В данном режиме могут быть получены только масс-хроматограммы, так как сканирование не производится. Рисунок 23 – Схема осуществления режима регистрации множественных переходов В ходе оптимизации получены следующие данные для режима MRM при отрицательной ионизации, показанные в Таблице 7, которые включают в себя уточненные m/z для Precursor ion и Product ion и напряжения на квадруполях Q1 Pre Bias и Q3 Pre Bias, а также энергии в соударительной ячейке СЕ. Таблица 7 – Параметры масс-спектрометра для детектирования N-пропионил-АСК Precursor m/z 208,20 208,20 208,20 Product m/z 164,20 107,05 108,05 Q1 Pre Bias 23,0 15,0 15,0 CE 16,0 25,0 22,0 Q3 Pre Bias 29,0 19,0 29,0 Оптимизация проводилась при использовании проточно-инжекционного анализа. После присоединения колонки были установлены времена удерживания N-пропионил-5АСК и N-пропионил-4АСК на колонке с фазой С18. Для сравнения был проведен подобный анализ на колонке c фазой NH2 марки «Dr.Maish Equisil APS» 100х3 мм с размером зерен неподвижной фазы 3 мкм. В результате подтверждено, что N-пропионилпроизводные являются неполярными соединениями и не удерживаются полярной фазой NH2. Максимальное разделение компонентов возможно только на неполярной фазе, в частности С18. В ходе ряда экспериментов был установлен оптимальный режим градиентного элюирования, представленный на Рисунке 24. 47

Рисунок 24 – Режим градиентного элюирования для разделения N-Pr-4ASA и N-Pr-5ASA При анализе стандартного раствора, содержащего N-пропионил-5АСК и Nпропионил-4АСК в концентрации 500 нг/мл каждого компонента, с использованием оптимизированного метода, получена масс-хроматограмма следующего вида, показанная на Рисунке 25. Рисунок 25 – Масс-хроматограмма стандартных растворов N-Pr-4ASA и N-Pr-5ASA 6. Разработка методов пробоподготовки Существуют различные методики пробоподготовки биологических образцов, включающие в себя дериватизацию с помощью уксусного или пропионового ангидрида и депротеинизацию с использованием ацетонитрила, метанола или хлорной кислоты [49]. Для пробоподготовки образцов тканей проводятся следующие стадии [14, 29]: гомогенизация, экстракция месалазина с использованием фосфатного буфера, разрушение 48

клеток с помощью ультразвука, осаждение белков метанолом или ацетонитрилом, а также перерастворение в подвижной фазе. В данных методиках имеется ряд недостатков, связанных с тем, что данные методики разрабатывались не для хромато-масс-спектрометрии. Современные методики преимущественно разрабатываются для количественного определения месалазина в плазме крови человека [6, 7, 32, 49, 52, 60]. Отличием от пробоподготовки тканей является отсутствие таких стадий, как гомогенизация и ультразвук. Некоторые методики отличаются довольно многостадийной пробоподготовкой. Другой особенностью является использование не чистого пропионового ангидрида, а его 1% или 10% раствора в метаноле [6, 32, 49, 60]. Утверждается, что 25 мкл 10% пропионового ангидрида, добавленного к 500 мкл плазменной смеси, достаточно для дериватизации продукта в плазме и водных образцах [60]. 6.1. Разработка метода пробоподготовки тканей F.N.Hussain предложил следующую методику [29] пробоподготовки для высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором. После гомогенизации образца к взвешенной навеске добавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта (15 мкг/мл, 4ASA), 400 мкл 0.05М фосфатного буферного раствора (рН 7.4), 500 мкл метанола и 20 мкл пропионового ангидрида (Acros Organics, Belgium). Клетки тканей разрушали с помощью ультразвука, затем суспензию инкубировали при комнатной температуре на Vortex в течение 30 минут. По истечению времени, пробу центрифугировали (5000g, 15 минут), супернатант отбирали, фильтровали и 20 мкл образца закалывали для ВЭЖХ-анализа. На практике в жидкостной хроматографии метанол оказывается более полярным, чем ацетонитрил, что делает его ближе по свойствам к воде. Следовательно, для депротеинизации больше подходит ацетонитрил, на который был заменен метанол. После фильтрования добавлена стадия перерастворения: 500 мкл отфильтрованного образца полностью высушивается в выпарном испарителе (60оС, вакуум), сухой остаток растворяют в смеси 0.1% муравьиная кислота : ацетонитрил (v/v 40:60, раствор 0.1FA-A). Для разрушения клеток слизистой оболочки пробирки с пробами помещались в ультразвуковую ванну на 10 минут. При апробации предложенной методики [29] был установлен следующий недостаток: при использовании большого объема фосфатного буферного раствора по отношению к объему ацетонитрила не обеспечивается полноценное осаждение мешающих компонентов (в том числе белков). В результате при перерастворении невозможно полное высушивание пробы, а после добавления раствора 0.1FA-A вновь образуется осадок, который необходимо отделять центрифугированием. В связи с этим была рассмотрена вторая методика [14], предложенная M. De Vos для высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором. К навеске гомогенизированного образца добавляли 100 мкл внутреннего стандарта (57,6 мг/мл, Nпропионил-4АСК), 20 мкл пропионового ангидрида и 500 мкл фосфатного буфера. Затем интактные клетки слизистой оболочки разрушали ультразвуком, после перемешивали на Вортексе в течение 1 часа при 37оС. Интересующие вещества экстрагировали 6 мл ацетонитрила с 500 мкл 10% раствора хлорида натрия. После пробу центрифугировали при 1500g в течение 10 минут. Отбирали органический слой, полностью высушивали на воздухе, и сухой остаток растворяли в 500 мкл подвижной фазы. 49

При проверке данной методики использовался ацетонитрил без 10% раствора хлорида натрия, так как использование неорганических солей нежелательно для прибора. Соотношение ацетонитрила и буферного раствора обеспечивает полное осаждение всех мешающих компонентов пробы. Однако использование больших объемов реактивов приводит к сильному разведению образца и обязательному перерастворению пробы в меньшем объеме. В связи с чем, методика является достаточно длительной и трудоемкой, требует значительное количество времени на полное высушивание полученной пробы. Поэтому был проведен ряд экспериментов по созданию методики для пробоподготовки тканей, в основу которой был положен метод [29]. Установлено, что использование буферного раствора необходимо для непосредственной экстракции месалазина из тканей, так как при замене его на ацетонитрила отмечено заметное снижение интенсивности пика 5АСК. Подобрано соотношение объемов буферного раствора и ацетонитрила, обеспечивающее полную депротеинизацию образцов. Проведено сравнение использования раствора 0.1FA-A (0.1% муравьиная кислота : ацетонитрил) и чистого ацетонитрила для перерастворения пробы. Предложена следующая методика: к навеске гомогенизированного образца ткани массой около 200 мг (±1 мг) добавляли 400 мкл внутреннего стандарта (500 нг/мл, 4АСК) , 400 мкл раствора 0.1FA-A, 1600 мкл буферного раствора (pH 7.2) и гомогенизировали. Отбирали 300 мкл суспензии и добавляли к ней 20 мкл пропионового ангидрида и 1000 мкл ацетонитрила. Инкубировали при комнатной температуре на Vortex в течение 30 минут. По истечению времени пробу центрифугировали (12000 об/мин, 15 минут) и фильтровали (диаметр пор фильтра 0.2 мкм). 500 мкл образца высушивали в вакуумном испарителе при 60оС, сухой остаток перерастворяли в 100 мкл ацетонитрила. Выдерживали на Vortex в течение 5 минут, после чего центрифугировали (15000 об/мин, 5 минут) и 100 мкл отбирали в виалу для автодозатора. В результате исследования образца с добавлением вместо раствора 0.1FA-A стандарта месалазина получена масс-хроматограмма, представленная на Рисунке 26. Рисунок 26 – Масс-хроматограмма образца тканей с добавлением стандартов 5АСК и 4АСК 50

Время выхода N-пропионил-5АСК (6,40 min) и N-пропионил-4АСК (7,25 min), экстрагированных из биологической матрицы, соответствует временам выхода, полученным при анализе стандартных растворов. При сравнении масс-хроматограмм образца, содержащего N-пропионил-5АСК и N-пропионил-4АСК, (Рисунок 26) и образца чистой ткани (Рисунок 27), установлено, что пик (8,30 min) является примесью, предположительно внутреннего стандарта, а пик (5,10 min) является неустановленным соединением, присутствующим в тканях. Предположительно, неустановленное соединение имеет сходную природу с исследуемым веществом, в том числе обладает NH2-группой, которая вступает в реакцию дериватизации аналогично стандартам. Стоит отметить: данное соединение образует те же осколочные ионы в соударительной ячейке, что и N-пропионил-5АСК, но с вероятностью образования более близкой к N-пропионил-4АСК. Рисунок 27 - Масс-хроматограмма образца тканей без добавления стандартов 5АСК и 4АСК 6.2. Разработка метода пробоподготовки плазмы крови После рассмотрения всех имеющихся методик определения месалазина в плазме крови в основу метода был выбран способ пробоподготовки образцов [6], предложенный E.Balaraji. Согласно методике к 500 мкл плазмы добавляют 50 мкл внутреннего стандарта (500 нг/мл, Mesalamine-D3) и 1,5 мл ацетонитрила. Смесь перемешивают на Vortex в течение 5 минут, после центрифугируют (12000 об/мин, 5 минут). Отбирают 1 мл супернатанта и добавляют к нему 100 мкл дериватизирующего раствора (1% пропионовый ангидрид в метаноле). Инкубируют смесь на водяной бане в течение 10 минут при 40оС. Затем высушивают образец и перерастворяют в 500 мкл подвижной фазы. С учетом технических возможностей предложена следующая методика: к 300 мкл плазмы добавляли 50 мкл раствора 0.1FA-A, 50 мкл внутреннего стандарта (500 нг/мл, 4АСК) и 900 мкл ацетонитрила. Смесь перемешивали на Vortex в течение 5 минут и центрифугировали (15000 об/мин, 15 минут). Отбирали 1 мл супернатанта и к нему добавляли 20 мкл пропионового ангидрида. После чего смесь инкубировали при комнатной температуре на Vortex в течение 30 минут. Далее фильтровали пробы (диаметр пор фильтра 51

0.2 мкм), высушивали на вакуумном испарителе при 60оС, перерастворяли в 100 мкл ацетонитрила и переносили в виалу для автодозатора. При анализе пробы плазмы крови, полученной от крысы, которой вводили месалазин, получена масс-хроматограмма, представленная на Рисунке 28. Обнаружен пик (5,10 min) того же самого неустановленного соединения, который был обнаружен в образцах тканей. Рисунок 28 - Масс-хроматограмма образца плазмы крови 6.3. Разработка метода пробоподготовки инкубационных сред и образцов гранул Необходимость проведения пробоподготовки образцов инкубационных и экстракционных сред обусловлена наличием в пробах неорганических солей в больших количествах. Присутствие неорганических солей может сказаться на точности проведения анализа, так как их наличие в пробе сильно влияет на ионизацию. Помимо этого, они являются нелетучими соединениями, поэтому не испаряются и со временем оседают на стенках внутри прибора. Накапливаясь, неорганические соли вносят изменения во все процессы работы масс-спектрометра. Была предложена методика, заключающаяся в предварительном увеличении концентрации неорганических солей в пробе и последующей жидкостно-жидкостной экстракции с использованием ацетонитрила. После добавления ацетонитрила и последующего центрифугирования наблюдается граница раздела фаз «жидкость-жидкость» или «жидкость-твердое вещество». В первом случае нижний слой является неорганическим и представляет собой насыщенный раствор солей, а верхний – органический слой (ацетонитрил). Во втором случае наблюдается выпадение белого осадка неорганических солей. При проведении жидкостно-жидкостной экстракции месалазин или его N-пропионилпроизводное экстрагируется в верхний органический слой. Подбор методики осуществлялся с использованием часового стекла для обнаружения присутствующих неорганических солей в верхнем органическом слое (ацетонитриле). Капля пробы после центрифугирования наносилась на часовое стекло и высушивалась при комнатной температуре. После полного испарения ацетонитрила наличие неорганических солей можно оценить визуально. На Рисунке 29 представлены две пробы, при подготовке 52

которых использовались различные соотношения насыщенного раствора сульфата натрия и ацетонитрила. Соотношение сульфат натрия:ацетонитрил 1:4 обеспечивает минимальное содержание солей в органическом слое по сравнению с использованием соотношения 1:2. Рисунок 29 – Визуальное определение неорганических солей в ацетонитриле при подборе оптимального соотношения сульфата натрия и ацетонитрила для жидкостно-жидкостной экстракции: в сравнении 1:4 (слева) и 1:2 (справа) В результате предложена следующая методика: к 50 мкл инкубационной или экстракционной среды добавляли 50 мкл раствора 0.1FA-A и 50 мкл внутреннего стандарта (5 мкг/мл, 4АСК). Для насыщения пробы вносили 500 мкл насыщенного раствора сульфата натрия (20 г сульфата натрия на 80 мл дистиллированной воды с добавлением серной кислоты до рН = 2), а для получения N-пропионил-производных – 20 мкл пропионового ангидрида. Пробы выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут при периодическом перемешивании на Vortex. После вносили 1,8 мл ацетонитрила и, периодически перемешивая, выдерживали еще 10 минут. Затем центрифугировали (3500 об/мин, 5 минут) и фильтровали (диаметр пор фильтра 0.2 мкм) в виалу для автодозатора. Для определения количества месалазина в пектиновых гелях несколько гранул растирали в ступке и отбирали навеску массой 1 мг (±0.05 мг). В качестве раствора для экстракции использовали воду с добавлением серной кислоты (рН 2). К навеске растертых гранул добавляли 5 мл раствора для экстракции. Затем пробирку помещали в ультразвуковую баню на 15 минут, после выдерживали при комнатной температуре, периодически перемешивая на Vortex, в течение 2-3 часов до полного растворения гранул. Более длительное время экстракции приводит к разрушению высвободившегося месалазина. Пробоподготовку полученной экстракционной среды проводят по предложенной выше методике. 7. Определение МЛС методом спектрофотометрии Благодаря своему строению 5-аминосалициловая кислота может быть количественно определена с помощью спектрофотометрии без предварительной пробоподготовки. Стоит отметить, что применение данного аналитического метода затруднительно для биологических образцов. Поэтому спектрофотометрия будет рассмотрена для исследований in vitro, а именно количественное исследование месалазина в экстракционных и инкубационных средах. В виду амфотерных свойств 5-АСК, данный метод определения в кислых и нейтральных средах необходимо проверить на достоверность результатов, например, при сравнении с результатами хромато-масс-спектрометрии. Месалазин поглощает свет в ультрафиолетовой области спектра, но в литературных источниках указываются разные значения длин волн для определения 5-аминосалициловой 53

кислоты в пробе. В частности, Moharana при построении калибровочной кривой для 5-АСК с использованием 0.5М HCl использовала длину волны 303 нм [46]. Neufeld в своем исследовании использовал разные длины волн в зависимости от рН, а именно 302 и 350 нм (0.1 mM HCl и PBS pH 7.4 соответственно) [48]. В связи с этим необходимо практически установить длины волн, при которых наблюдается максимум поглощения ультрафиолетового света растворов месалазина с различными значениями рН. Для построения спектров поглощения месалазин растворяли в 0.5М соляной кислоте, PBS pH 7.4, средах SGF pH 1.2 и SIF pH 6.8 и сканировали в диапазоне длин волн 200-400 нм с помощью однолучевого (UVmini-1240, Shimadzu, Japan) и двулучевого спектрофотометров (UV-1800, Shimadzu, Japan). В ходе экспериментов была подтверждена оптимальная длина волны 303 нм для растворов 5-аминосалициловой кислоты в 0.5М HCl и SGF, а для растворов в SIF и PBS установлена длина волны 323 нм. В результате построены калибровочные кривые при 303 и 323 нм, представленные на Рисунке 30. Получены уравнения зависимости оптической плотности от концентрации месалазина, представленные в Таблице 8. Концентрация месалазина, мкг/мл 70 60 50 40 SGF 30 SIF 20 10 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Оптическая плотность Рисунок 30 – Калибровочные кривые для количественного определения месалазина в средах SGF и SIF на двулучевом спектрофотометре UV-1800 Таблица 8 – Уравнения и коэффициенты регрессии градуировочных графиков Среда HCl SGF PBS SIF Модель прибора 1240 1800 1240 1800 Длина волны, нм 303 323 Уравнение Y = 43,361*X – 0,5035 Y = 44,121*X – 0,2211 Y = 57,794*X – 0,3273 Y = 55,060*X + 12,367 Согласно коэффициенту регрессии данные, калибровочных кривых, можно считать достоверными. Коэффициент регрессии (R2) 0,9990 0,9990 0,9999 0,9999 полученные с использованием 54

8. Использование культур клеток для исследований in vitro В исследованиях использовались клеточная линия эпителиальной колоректальной аденокарциномы человека (Caco-2), линия клеток из эмбриональных почек человека (HEK293) и фибробластов подкожной соединительной ткани мыши (NCTC клон 929). Ниже представлены паспорта клеточных культур [113]. Паспорт линии фибробластов подкожной соединительной ткани мыши: Паспорт клеточной линии эпителиальной колоректальной аденокарциномы человека: 55

Паспорт линии клеток из эмбриональных почек человека: Культивирование клеток проводили в питательной среде Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM 1X, Gibco, USA) с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (FBS Research Grade, Sigma-Aldrich, USA), антибиотиков, пирувата (Piruvat 100mM, Gibco, USA), аминокислот (MEM NEAA 100X, Gibco, USA) и буферного раствора (HEPES 1M, Gibco, USA) согласно Таблице 9. Субкультивирование осуществляли с использованием 0.25% трипсина (TrypLE Express, Gibco, USA) или раствора 0.25% трипсин-ЭДТА (Trypsin-EDTA solution, Sigma-Aldrich, USA). Таблица 9 – Составы полных питательных сред на основе DMEM Культура FBS, % HEK293 10 CACO-2 20 NCTC 929 10 MEM NEAA Piruvat 10X 10mM HEPES Антибиотик 100 mM Гентамицин – 50 мкг/мл Гентамицин – 50 мкг/мл Пенициллин – 50 Ед/мл Стрептомицин – 50 мкг/мл Для оценки цитотоксичности использовали образцы пектиновых лекарственного средства, представленных в Таблице 10. гелей без Таблица 10 – Образцы пектиновых гелей для оценки цитотоксичности Образец HSc 1M CAc 1M SAc 1M LAc 1M LAc 0.34M LAc + Si AU 0.34M AU + Si CM (CaCl2) 1М 0.34 М Наличие силикат-ионов - + + 56

Цитотоксичность гранул оценивали с использованием МТТ-теста. Навеску гранул (15 ± 0.5 мг) помещали в питательную среду (1 мл) и инкубировали в течение 24 ч при 37оС с 5% СО2 для получения экстракционной среды. Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты (100 мкл, 8х104 клеток/мл) и инкубировали в течение 24 ч при 37оС в атмосфере, содержащей 5% СО2, в инкубаторе (Galaxy 170 S, Eppendorf, Germany). После завершения инкубации среду заменяли на 100 мкл свежей (контроль) или экстракционной среды. Оценка метаболической активности клеток проводилась через 48 и 144 часа. При длительном инкубировании проводилась периодическая замена экстракционных и питательных сред. Для определения цитотоксичности в каждую лунку добавляли 10 мкл МТТ (5мкг/мл) в PBS и инкубировали 37оС в СО2-инкубаторе в течение 2-4 часов в зависимости от культуры клеток. После питательную среду с МТТ отбирали и добавляли 100 мкл раствора солюбилизации (4мМ соляная кислота в изопропаноле). После полного растворения кристаллов формазана поглощение считывали при 530 нм с вычетом фонового поглощения при 620 нм (планшетный ридер CLARIOstar, BMG LabTech, Germany). Жизнеспособность клеток рассчитывалась по формуле: (ОПопытных лунок – ОПсреды) / (ОПконтроль – ОПсреды) х 100%, где ОП – оптическая плотность. Метаболическая активность менее 30% соответствует сильной цитотоксичности, от 30% до 60 % - умеренная цитотоксичность, 60-90% показывает незначительное снижение жизнеспособности, более 90% - цитотоксичность отсутствует. 9. Проведение экспериментов на лабораторных крысах Исследования проводили на самках и самцах половозрелых белых крысах массой тела 180-200 г. Животных содержали на диете с неограниченным доступом к воде и корму. Эксперименты на животных осуществляли в соответствии с рекомендациями по обращению с экспериментальными животными Комитета по биоэтике Коми НЦ УрО РАН. Крысы были разделены на 4 группы. В каждой группе было по 4-5 животных, 3 из которых получали лекарственное средство в форме пектиновых гелей. Для исследования распределения месалазина использовали гели из пектина смолевки (SVc), содержащие лекарственное средство и модифицированные силикатом натрия. Группа сравнения получила раствор лекарства в карбоксиметилцеллюлозе. Введение производили перорально (из расчета лекарственного средства 10 мг/кг) через пластиковый зонд однократно после применения эфирного наркоза. Крыс после эфирного наркоза умерщвляли по группам через 3, 6, 24 и 48 часов после введения гелей или раствора КМЦ с лекарством. Забирали кровь из сердца в пробирку с гепарином для последующего центрифугирования и отбора плазмы. Животных вскрывали и извлекали желудок, тонкий и толстый кишечник, печень и почки для исследования распределения месалазина с помощью ВЭЖХ-МС. 10. Статистическая обработка При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратичное отклонение с использованием программного обеспечения «Excel» (Microsoft Corporation). Достоверность различий оценивалась по t-критерию Стьюдента. 57

Результаты 1. Исследование деструкции гелей в условиях in vitro 1.1. Деструкция пектиновых гелей Для определения оптимальных условий гелеобразования использовали гранулы без загрузки лекарственного средства. Рассмотрено влияние исходной концентрации раствора пектина на морфологию гелей и устойчивость в инкубационных средах. Были приготовлены гранулы из яблочного пектина AU701 с исходной концентрацией 1%, 2% и 4%. Для гелеобразования использовались 0.34М, 1М и 2М растворы хлорида кальция. Характеристика полученных гелей представлена в Таблице 11. Таблица 11 – Влагоемкость и морфология сухих гелей из яблочного пектина Образец Спектина, CM % (CaCl2) 0.34 1 0.34 1 2 2 0.34 1 4 2 Морфология Влагоемкость, % Sсеч, мм2 ± SD L/D, мм2 ± SD Содержание Ca2+, % ± SD 90,1 95,8 89,5 79,0 95,3 88,2 78,4 7,36 ± 2,19 0,67 ± 0,20 0,85 ± 0,20 1,34 ± 0,31 0,60 ± 0,13 0,70 ± 0,14 1,15 ± 0,21 1,44 ± 0,22 1,22 ± 0,16 1,28 ± 0,23 1,35 ± 0,22 1,30 ± 0,25 1,20 ± 0,14 1,10 ± 0,08 -* 36,85 ± 1,89 33,73 ± 0,58 33,05 ± 0,74 37,74 ± 5,05 34,63 ± 0,16 33,41 ± 0,34 * не исследовалось Установлено, что увеличение молярности раствора хлорида кальция способствует снижению влагоемкости гранул. Концентрация пектина и концентрация CaCl2 влияют на форму гранул. Чем выше содержание пектина и ионов кальция, тем более правильную сферическую форму имеют гели. После инкубации в среде SGF гели полностью разрушились, поэтому было предложено исследовать прочность гранул от условий гелеобразования на пектинах: комаруман CP, бергенан BC, гераклиуман HS и танацетан TVc. Установлено, что тип пектина оказывает незначительное влияние на морфологию, влагоемкость и содержание ионов кальция в гелях. Однако гранулы из комарумана CP 2% разрушились при сушке. Подтверждено, что увеличение концентрации используемого CaCl2 способствует снижению влагоемкости гелей и увеличению их размеров. Характеристика пектиновых гелей представлена в Таблице 12. 58

Таблица 12 – Влагоемкость и морфология сухих гелей Образец Пектин и CM Спектина (CaCl2) 0.34 1 BC 2% 2 0.34 1 BC 4% 2 0.34 1 CP 2% 2 0.34 1 CP 4% 2 0.34 1 HS 2% 2 0.34 1 HS 4% 2 0.34 1 TVc 2% 2 0.34 1 TVc 4% 2 Морфология Влагоемкость, % Sсеч, мм2 ± SD L/D, мм2 ± SD 94,4 90,1 82,1 93,5 86,33 77,4 93,3 86,0 73,8 93,8 86,8 78,1 94,9 88,9 79,6 92,6 86,1 78,1 95,5 87,6 79,1 89,6 93,6 76,7 -* 0,90 ± 0,28 1,25 ± 0,32 0,53 ± 0,20 0,72 ± 0,14 1,11 ± 0,23 -* -* -* 0,95 ± 0,47 1,13 ± 0,37 1,69 ± 0,39 0,61 ± 0,16 0,99 ± 0,22 1,26 ± 0,24 0,73 ± 0,15 0,77 ± 0,18 1,20 ± 0,21 0,57 ± 0,16 0,96 ± 0,20 1,75 ± 0,30 0,71 ± 0,20 0,86 ± 0,15 1,39 ± 0,22 -* 1,28 ± 0,17 1,17 ± 0,15 1,29 ± 0,17 1,23 ± 0,17 1,16 ± 0,16 -* -* -* 1,25 ± 0,18 1,28 ± 0,27 1,21 ± 0,15 1,22 ± 0,15 1,25 ± 0,15 1,17 ± 0,15 1,27 ± 0,16 1,22 ± 0,14 1,13 ± 0,11 1,19 ± 0,13 1,26 ± 0,16 1,20 ± 0,17 1,30 ± 0,23 1,38 ± 0,22 1,22 ± 0,25 Содержание Ca2+, % ± SD -* 33,75 ± 0,48 32,41 ± 0,55 29,81 ± 10,43 34,60 ± 0,28 33,15 ± 0,47 -* -* -* 37,45 ± 2,05 34,96 ± 0,39 33,12 ± 0,26 38,14 ± 1,09 33,21 ±0,33 32,68 ± 0,15 38,37 ± 4,21 35,15 ± 0,23 33,70 ±0,45 37,13 ± 0,54 33,28 ± 0,40 33,07 ± 0,18 38,71 ± 0,73 34,23 ± 0,41 33,17 ± 1,37 * после сушки гранулы разрушились Гели инкубировались последовательно в SGF в течение 2 часов и SIF в течение 4 и 18 часов. Результаты представлены в Таблицах 13 и 14. Данные отсутствуют по гранулам, которые разрушились на первом этапе. Таблица 13 – Деструкция и морфология гелей в ходе инкубации Образец CM Спектина (CaCl2) 1 2 BC 2% BC 4% mисх, SGF, мг мг SGF, % 3 4 5 1 23 140 614 2 42 120 288 0.34 7 100 1458 1 20 160 817 2 41 130 318 Морфология 6 Sср = 3,42 мм2, L/Dср = 1,09 мм Sср = 3,27 мм2, L/Dср = 1,09 мм Sср = 3,02 мм2, L/Dср = 1,11 мм Sср = 3,70 мм2, L/Dср = 1,11 мм Sср = 4,63 мм2, L/Dср = 1,11 мм SIF, мг SIF* ,% 7 8 171 122 144 125 250 250 230 144 150 115 Морфология 9 Sср = 3,98 мм2, L/Dср = 1,11 мм Sср = 3,86 мм2, L/Dср = 1,11 мм Sср = 4,50 мм2, L/Dср = 1,14 мм Sср = 5,17 мм2, L/Dср = 1,07 мм 59

Продолжение Таблицы 13 1 CP 4% 2 0.34 1 2 3 11 24 50 4 50 100 220 5 463 411 442 0.34 13 120 917 1 22 140 641 2 46 200 439 0.34 8 40 481 1 26 60 234 2 57 100 174 0.34 12 40 333 1 21 40 194 2 38 80 210 HS 4% TVc 2% TVc 4% 6 Sср = 3,54 мм2, L/Dср = 1,14 мм Sср = 3,45 мм2, L/Dср = 1,12 мм Sср = 4,54 мм2, L/Dср = 1,07 мм Sср = 1,44 мм2, L/Dср = 1,21 мм Sср = 1,94 мм2, L/Dср = 1,19 мм Sср = 2,72 мм2, L/Dср = 1,14 мм Sср = 1,74 мм2, L/Dср = 1,25 мм Sср = 1,64 мм2, L/Dср = 1,18 мм Sср = 2,32 мм2, L/Dср = 1,17 мм 7 - 8 - 9 - - - - 265 189 234 117 - - - 180 300 - 133 133 - - - - - - - 220 275 Sср = 2,98 мм2, L/Dср = 1,17 мм Sср = 4,85 мм2, L/Dср = 1,10 мм Sср = 4,54 мм2, L/Dср = 1,09 мм * расчет увеличения массы произведен от массы навески после инкубации в SGF Таблица 14 – Содержание ионов кальция в гелях после каждой стадии инкубации Образец Спект CM BC 2% 1 2 0.34 1 2 0.34 1 2 0.34 1 2 0.34 1 2 0.34 1 2 BC 4% CP 4% HS 4% TVc 2% TVc 4% SGF 2 часа Содержание Потери, Ca2+, % ± SD %* 12,53 ± 5,43 62,9 11,83 ± 6,40 63,5 12,00 ± 5,89 59,7 10,72 ± 4,06 69,0 9,84 ± 6,41 70,3 26,86 ± 6,95 23,2 29,15 ± 9,60 12,0 14,96 ± 2,16 61,0 16,40 ± 6,96 53,3 27,58 ± 5,40 18,2 15,32 ± 1,26 58,7 32,55 ± 2,54 2,2 33,67 ± 7,37 0,0 18,70 ± 3,22 51,7 25,65 ± 3,23 25,1 32,97 ± 1,28 0,6 SIF 4 часа Содержание Потери, Ca2+, % ± SD %* 12,59 ± 6,70 62,7 13,95 ± 6,82 57,0 3,94 ± 3,17 86,8 11,18 ± 5,89 67,7 21,36 ± 3,10 35,6 9,78 ± 1,05 72,2 28,50 ± 5,24 15,4 6,13 ± 3,15 81,6 17,17 ± 4,64 48,1 9,92 ± 1,35 70,1 SIF 18 часов Содержание Потери, Ca2+, % ± SD %* 3,48 ± 2,13 89,7 4,75 ± 2,30 85,3 2,70 ± 1,43 92,2 3,21 ± 1,93 90,3 5,85 ± 2,34 83,4 8,10 ± 1,35 76,0 12,42 ± 2,28 62,5 - * потери относительно исходного содержания ионов кальция (Таблица 2) После инкубации установлено сильное влияние типа пектина на поведение гранул в гастроэнтеральных средах. Минимальное набухание выявлено для гелей из комарумана CP и 60

танацетана TVc. Однако почти все образцы разрушились на стадии инкубации в SIF. Установлено, что гели гераклиумана HS и бергенана BC, полученные с использованием 1 и 2 М растворов хлорида кальция наиболее устойчивы к условиях искусственной гастроэнтеральной среды. Установлено, что деструкция пектиновых гелей сопровождается снижением в них количества кальция. Интенсивность вымывания кальция зависит от типа пектинового геля. Так, например, гранулы из пектина бадана при потере 60% ионов кальция не разрушаются в средах SGF и SIF. Гранулы из пектинов пижмы и борщевика лучше удерживают ионы кальция, но при потере такого же количества на стадии «желудка» в среде SIF разрушаются. Гранулы из пектина сабельника, по сравнению с другими пектинами, даже при незначительных потерях ионов кальция на стадии SGF после «желудка» разрушаются. Также были исследованы гели из пектиновых полисахаридов каллусов: гераклиуман HSc, цирсиуман CAc, сорбан SAc и люпинан LAc. Характеристика гранул представлена в Таблице 15. Таблица 15 – Влагоемкость и морфология сухих гелей из пектинов каллусных культур Образец Пектин и CM Спектина (CaCl2) 1 HSc 4% 2 1 CAc 4% 2 1 SAc 4% 2 1 LAc 2% 2 Морфология Влагоемкость, 2 % Sсеч, мм ± SD L/D, мм2 ± SD 82,1 70,3 84,4 71,7 83,0 70,2 84,8 71,1 0,79 ± 0,22 1,10 ± 0,33 0,95 ± 0,22 1,16 ± 0,19 0,89 ± 0,28 1,57 ± 0,45 0,41 ± 0,15 0,52 ± 0,15 1,14 ± 0,11 1,13 ± 0,18 1,20 ± 0,13 1,16 ± 0,10 1,23 ± 0,18 1,24 ± 0,16 1,17 ± 0,16 1,15 ± 0,13 Содержание Ca2+, % ± SD 17,07 ± 1,16 17,76 ± 2,33 16,57 ± 1,85 17,67 ± 0,93 9,72 ± 0,79 9,37 ± 0,98 9,72 ± 0,79 9,65 ± 2,31 Выявлено, что поведение гелей в инкубационных средах похоже на деструкцию образцов из комарумана и танацетана. И те и другие набухают в среде SGF в 2-3 раза, а после – разрушаются в среде SIF. Установлено, что пектиновые гели содержат в 3 раза меньше ионов кальция, чем образцы, исследованные ранее (Таблица 12). В ходе инкубации в среде «желудка» из гелей экстрагируется более 70% ионов кальция. Это способствует преждевременной деструкции образцов в энтеральной среде. Результаты полученные в ходе инкубации указаны в Таблицах 16-17. Таблица 16 – Деструкция и морфология гелей из пектинов каллуса в ходе инкубации Образец Спектина CM (CaCl2) 1 HSc 4% 2 1 CAc 4% 2 1 SAc 4% 2 1 LAc 2% 2 mисх, мг 5 8 6 9 8 17 3 4 SGF, мг 12 16 10 11 10 18 6 5 SGF, % 263 194 167 117 125 106 200 125 Морфология Sср=1,07±0,34 мм2; L/Dср=1,10±0,06 мм Sср=1,33±0,45 мм2; L/Dср=1,08±0,09 мм Sср=1,03±0,27 мм2; L/Dср=1,19±0,12 мм Sср=1,16±0,20 мм2; L/Dср=1,11±0,07 мм Sср=0,72±0,30 мм2; L/Dср=1,22±0,24 мм Sср=1,84±0,58 мм2; L/Dср=1,17±0,12 мм Sср=0,21±0,16 мм2; L/Dср=1,36±0,38 мм Sср=0,39±0,13 мм2; L/Dср=1,18±0,14 мм Таблица 17 – Содержание ионов кальция в гелях из пектинов каллусных культур после каждой стадии инкубации 61

Образец Спект CM HSc 4% CAc 4% SAc 4% LAc 2% 1 2 1 2 1 2 1 2 SGF 2 часа Содержание Ca2+, Потери, %* % ± SD 3,27 ± 3,21 80,8 1,39 ± 0,19 92,2 6,34 ± 2,80 61,7 3,55 ± 0,89 79,9 0,80 ± 0,31 91,8 1,85 ± 1,31 80,3 0,11 ± 0,05 98,9 0,15 ± 0,01 98,5 SIF 4 часа Содержание Ca2+, Потери, %* % ± SD 2,84 ± 0,90 82,9 2,61 ± 0,60 85,2 0,53 ± 0,10 94,6 2,54 ± 0,54 80,3 - * потери относительно исходного содержания ионов кальция (Таблица 15) 1.2. Оценка высвобождения лекарственного средства из гелей Для установления оптимальных условий загрузки лекарственного средства были исследованы гранулы из яблочного пектина AU701 с исходной концентрацией пектина 2% и 4% и загрузкой месалазина 1, 2 или 4%. Характеристика гелей представлена в Таблице 18. Для гелеобразования использовался 1М раствор хлорида кальция. Таблица 18 - Морфология сухих гелей из яблочного пектина AU701 и загрузка месалазина Образец Спектина, Cмесалазина, % % 1 2 2 4 1 2 4 4 Морфология Влагоемкость, % Sсеч, мм2 ± SD L/D, мм2 ± SD 85,5 83,9 82,6 80,6 80,7 77,3 2,65 ± 0,32 2,42 ± 0,35 2,41 ± 0,37 2,61 ± 0,42 3,29 ± 0,34 2,99 ± 0,45 1,27 ± 0,22 1,44 ± 0,29 1,27 ± 0,14 1,23 ± 0,16 1,15 ± 0,10 1,29 ± 0,21 Содержание 5ASA, мкг/мг геля 3,1 7,9 25,7 6,5 9,7 18,8 Установлено, что загрузка лекарственного средства зависит от концентраций пектина и месалазина и их соотношения. Таким образом, среди гранул с загрузкой 1:1 (пектин:месалазин) в 2 раза больше лекарства содержит 4% гель. Однако максимальное содержание месалазина выявлено у пектин-гелевых гранул из 2% раствора пектина и 4% раствора месалазина. Высвобождение лекарственного средства из гелей в ходе инкубации представлено в Таблице 19. Установлено, что гели, содержащие менее 50% месалазина, высвобождают лекарство преимущественно в среде SGF. 5АСК экстрагируется из пектин-гелевых гранул с загрузкой лекарственного средства 1:1 или 1:2 преимущественно при инкубации в SIF. 62

Таблица 19 – Деструкция и высвобождение месалазина из гелей AU701 в ходе инкубации Образец Спект, % 2 4 1 C5ASA SGF mисх, m5ASA2, мг мкг mгеля SIF mгеля1 m5ASA m5ASA Морфология мг % мкг % Морфология мг % мкг % 1 32,0 99,2 95,4 298 84,9 86 Sср = 5,09 ± 0,84 мм2, L/Dср = 1,18 ± 0,13 мм 109,1 114 18,4 19 Sср = 5,31 ± 0,66 мм2, L/Dср = 1,16 ± 0,07 мм 2 31,7 252,6 87,9 277 119,0 47 Sср = 4,66 ± 0,70 мм2, L/Dср = 1,23 ± 0,12 мм 113,1 129 134,1 53 Sср = 5,40 ± 0,75 мм2, L/Dср = 1,23 ± 0,14 мм 71,7 135 451,5 82 Sср = 4,62 ± 0,45 мм2, L/Dср = 1,16 ± 0,09 мм 4 21,3 547,4 53,1 249 95,2 17 Sср = 3,42 ± 0,80 мм2, L/Dср = 1,30 ± 0,21 мм 1 35,7 229,4 123,1 345 217,5 95 Sср = 6,51 ± 0,79 мм2, L/Dср = 1,14 ± 0,09 мм 178,6 145 22,8 10 Sср = 8,05 ± 1,15 мм2, L/Dср = 1,14 ± 0,08 мм 2 32,0 310,4 114,0 356 255,8 82 Sср = 6,01 ± 0,71 мм2, L/Dср = 1,13 ± 0,09 мм 157,3 138 104,0 34 Sср = 8,08 ± 0,31 мм2, L/Dср = 1,12 ± 0,12 мм 4 34,3 644,8 110,9 323 278,5 43 Sср = 5,86 ± 0,62 мм2, L/Dср = 1,25 ± 0,15 мм 158,5 143 388,4 60 Sср = 7,35 ± 0,41 мм2, L/Dср = 1,26 ± 0,22 мм расчет увеличения массы произведен от массы навески после инкубации в SGF; 2 содержание месалазина в навеске гранул, рассчитанное умножением массы навески (mисх) на среднее содержание месалазина в гранулах из Таблицы 8 63

Проведена оценка влияния времени сшивания и рН раствора хлорида кальция на высвобождение месалазина из гелей AU701 в ходе инкубации. Результаты показаны в Таблице 20. Таблица 20 – Влияние рН CaCl2 и времени сшивания в хлориде кальция на высвобождение месалазина № рН CaCl2 1 2 3 4 1.5 Время сшивания, мин 5 10.3* 15 30 Содержание месалазина в геле, мкг/мг 92,5 147,2 153,5 104,6 Высвобождение в среду SGF, % 98,8 71,8 69,2 51,6 * рН раствора хлорида кальция без добавления соляной кислоты Выявлено, что при использовании сшивающего раствора с низким рН, высвобождение лекарственного средства из гелей протекает интенсивнее, по сравнению с контролем. Увеличение времени пребывания гранул в растворе хлорида кальция способствует формированию прочных ионных связей. Поэтому экстракция месалазина при дальнейшей инкубации снижается. С учетом полученных результатов были выбраны условия для гелеобразования и загрузки лекарственного средства в гели из пектинов, полученных из каллусных культур борщевика (HSc), бодяка (CAc), рябины (SAc) и люпина (LAc). Гранулы изготовлены с использованием 1М раствора хлорида кальция. Характеристика гранул представлена в Таблице 21, а деструкция образцов в ходе инкубации в Таблице 22. Таблица 21 – Морфология гелей из пектинов каллусных культур и загрузка месалазина Образец Спект, % HSc 4% CAc 4% SAc 4% LAc 2% Время Влагоемкость, C5ASA, сшивки, % мин % Морфология Sсеч, мм2 ± SD L/D, мм2 ± SD Содержание 5ASA, мкг/мг гранул 4 5 79,9 1,58 ± 0,27 1,29 ± 0,28 35,0 2 30 80,1 1,01 ± 0,25 1,14 ± 0,08 255,1 4 5 81,3 1,83 ± 0,27 1,32 ± 0,17 34,5 82,2 0,52 ± 0,11 1,15 ± 0,16 354,4 81,1 0,85 ± 0,23 1,20 ± 0,12 167,0 83,7 0,49 ± 0,14 1,30 ± 0,22 248,1 2 2 1 30 64

Таблица 22 – Деструкция и высвобождение месалазина из гелей в ходе инкубации Образец Спект, % HSc 4% CAc 4% SAc 4% LAc 2% C5ASA, % SGF mисх, мг mгеля m5ASA, мкг m5ASA Морфология мг % мкг % 4 17,9 627 51,0 286 427,4 68 2 7,4 1888 23,6 319 443,6 24 1 16,5 569 20,0 121 416,0 77 2 3,9 1382 6,7 172 226,2 16 2 5,1 852 5,5 108 115,1 14 1 3,8 943 3,8 100 59,8 6 Sср = 3,78 ± 0,60 мм2, L/Dср = 1,07 ± 0,06 мм Sср = 1,89 ± 0,56 мм2, L/Dср = 1,15 ±0,13 мм Sср = 2,20 ± 0,44 мм2, L/Dср = 1,26 ± 0,15 мм Sср = 0,78 ± 0,18 мм2, L/Dср = 1,16 ± 0,13 мм Sср = 0,86 ± 0,28 мм2, L/Dср = 1,27 ± 0,25 мм Sср = 0,55 ± 0,18 мм2, L/Dср = 1,21 ± 0,16 мм При увеличении времени пребывания гелей в растворе хлорида кальция и высушивании гранул при температуре 60оС и вакууме возможно получение гранул с площадью поперечного сечения менее 1мм2. Установлено, что увеличение времени сшивания в растворе хлорида кальция позволяет снизить экстракцию лекарства на стадии SGF в 3-4 раза. На гелях из пектинов каллусных культур проведено сравнение двух аналитических методов определения лекарственного средства в инкубационных средах: спектрофотометрии (СФ) и хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Результаты представлены в Таблице 23. Таблица 23 – Сравнение количественного определения месалазина Образец 4% HSc + 2% 5ASA 4% CAc + 2% 5ASA 4% SAc + 2% 5ASA 2% LAc + 1% 5ASA С5ASA в SGF (ВЭЖХ-МС), % 23,55 ± 3,85 16,15 ± 2,34 13,46 ± 4,60 5,99 ± 2,55 С5ASA в SGF (СФ), % 11,36 ± 0,70 11,35 ± 0,77 9,13 ± 0,63 4,76 ± 1,84 Выявлено, что два аналитических метода показали аналогичные результаты только для гелей из пектина люпина. Остальные данные спектрофотометрии значительно меньше результатов, полученных с помощью хромато-масс-спектрометрии. 1.3. Модификация гелей силикатом натрия Первоначально для модификации использовали способ погружения сухих гелей в раствор силиката натрия с последующим извлечением и высушиванием. Для исследования использовались гранулы, полученные из растворов пектинов (соотношение пектин:месалазин 1:1): 4% яблочного AU701 (1М CaCl2), 4% борщевика HS (1М и 2М CaCl2) и 2% пижмы TVc (2М CaCl2). Результаты по высвобождению лекарства представлены в Таблице 24. 65

Таблица 24 – Высвобождение месалазина из гранул, покрытых силикатом натрия, в сравнении с гелями без покрытия Образец Содержание 5ASA, мкг/мг гранул mисх, мг m5ASA, мкг AU AU + Si TVc TVc + Si HS(1M) HS(1M) + Si HS(2M) HS(2M) + Si 38,3 36,4 19,4 30,3 31,8 32,3 30,1 36,2 38,5 28,5 44,3 16,6 46,1 31,6 66,3 37,1 1476 1037 859 502 1464 1022 2037 1344 m5ASA в среде SGF мкг % 1049,6 71 618,0 60 589,0 69 459,6 92 942,7 64 797,2 78 1228,7 60 808,9 60 Не выявлена зависимость высвобождения месалазина из гранул от наличия или отсутствия силикат-ионов (Таблица 13). В связи с полученными результатами был предложен другой способ модификации гелей, который был применен к гелям из 2% раствора люпина (пектин:месалазин 2:1), полученных с использованием 0.34 и 0.5 М растворов хлорида кальция. Добавление силиката натрия в исходный раствор пектина с месалазин позволяет получить гели, которые лучше удерживают лекарственное средство. При использовании раствора силиката натрия в концентрации 10 мг/мл удалось снизить экстракцию месалазина из гранул до 3% вне зависимости от молярности раствора хлорида кальция. Результаты представлены в Таблицах 25 и 26. Таблица 25 – Характеристика модифицированных гелей из пектина люпина Образец СCaCl2, CNa2SiO3, М мг/мл 0 0.34 1 10 0 0.5 10 Морфология Влагоемкость, % Sсеч, мм2 ± SD L/D, мм2 ± SD 96,8 97,0 97,0 97,3 96,7 0,21 ± 0,07 0,17 ± 0,04 0,11 ± 0,03 0,15 ± 0,04 0,14 ± 0,05 1,16 ± 0,10 1,17 ± 0,10 1,20 ± 0,15 1,26 ± 0,25 1,25± 0,24 Содержание 5ASA, мкг/мг гранул 320 217 387 250 344 Таблица 26 – Высвобождение месалазина из модифицированных гелей в ходе инкубации Образец СCaCl2, М 0.34 SGF CNa2SiO3, mисх, мг мг/мл m5ASA m5ASA, мкг Морфология мкг % 0 1,1 352 96,9 27 1 1,2 260 67,0 26 10 1,0 387 10,2 3 0 1,5 375 68,4 17 10 1,0 344 9,4 3 0.5 Sср = 0,32 ± 0,12 мм2, L/Dср = 1,15 ± 0,12 мм Sср = 0,19 ± 0,06 мм2, L/Dср = 1,20 ± 0,22 мм Sср = 0,19 ± 0,07 мм2, L/Dср = 1,24 ± 0,18 мм Sср = 0,22 ± 0,06 мм2, L/Dср = 1,15 ± 0,12 мм Sср = 0,16 ± 0,05 мм2, L/Dср = 1,20 ± 0,14 мм 66

2. Исследование цитотоксичности гелей in vitro 2.1. Влияние на метаболическую активность клеток HEK293 При двухдневной инкубации экстрактов гелей с клетками HEK293 установлено незначительное снижение цитотоксического действия во всем диапазоне исследованных концентраций (Рисунок 31). Рисунок 31 – Метаболическая активность клеток HEK293 после инкубации с гелями из пектина борщевика HSc, бодяка CAc, рябины SAc и люпина LAc в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3 Исключением являются гранулы из яблочного пектина, для которых выявлена сильная цитотоксичность (Рисунок 32). Рисунок 32 - Метаболическая активность клеток HEK293 после инкубации с гелями из яблочного пектина AU и пектина люпина LAc в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно 67

При шестидневной инкубации клеток с концентрациями выше 1 мг/мл установлено умеренное токсическое действие гель-экстрактов, изготовленных с использованием 1M CaCl2 (Рисунок 33). Гели из яблочного пектина AU701 и пектина люпина, полученные при помощи 0.34М CaCl2, продемонстрировали слабую цитотоксичность (Рисунок 34). Экстракт из геля пектина рябины SAc в концентрации менее 0,3 мг/мл стимулирует метаболическую активность клеток на 50% (данные не представлены). Рисунок 33 – Метаболическая активность клеток HEK293 после инкубации с гелями из пектина борщевика HSc, бодяка CAc, рябины SAc и люпина LAc в течение 144 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** - различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно Рисунок 34 - Метаболическая активность клеток HEK293 после инкубации с гелями из яблочного пектина AU и пектина люпина LAc в течение 144 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно 68

2.2. Влияние на метаболическую активность клеток Caco-2 При двухдневной инкубации экстрактов гелей с клетками Caco-2 установлено отсутствие снижения метаболической активности для концентраций менее 2 мг/мл (Рисунок 35). Низкая цитотоксичность отмечена для всех гель-экстрактов высокой концентрации (более 2.5 мг/мл). Незначительное увеличение пролиферации клеток установлено для образцов гелей из пектина люпина, изготовленных как с помощью 1М, так и с 0.34М растворами хлорида кальция (Рисунок 36). Рисунок 35 – Метаболическая активность клеток Caco-2 после инкубации с гелями из пектина борщевика HSc, бодяка CAc, рябины SAc и люпина LAc в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. * - различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 Рисунок 36 - Метаболическая активность клеток Caco-2 после инкубации с гелями из яблочного пектина AU и пектина люпина LAc в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно 69

При шестидневной инкубации клеток с концентрациями выше 2 мг/мл выявлено умеренное токсическое действие гель-экстрактов (Рисунок 37). Сильный цитотоксический эффект характерен для всех образцов гель-экстрактов в концентрации 5 мг/мл. Концентрации менее 1 мг/мл не способствуют снижению метаболической активности. Степень токсичности зависит от используемого пектина. В случае гелей, полученных с использованием 0.34М раствора хлорида кальция, данная закономерность наблюдается только на высоких концентрациях гель-экстракта (Рисунок 38). Рисунок 37 – Метаболическая активность клеток Caco-2 после инкубации с гелями из пектина борщевика HSc, бодяка CAc, рябины SAc и люпина LAc в течение 144 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** - различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно Рисунок 38 - Метаболическая активность клеток Caco-2 после инкубации с гелями из яблочного пектина AU и пектина люпина LAc в течение 144 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно 70

2.3. Влияние на метаболическую активность клеток NCTC 929 При двухдневной инкубации клеток NCTC 929 с экстракционными средами установлен незначительный цитотоксический эффект для гранул, полученных с использованием 1М CaCl2 (Рисунок 39). Выявлено отсутствие снижения метаболической активности для гелей, изготовленных с использованием 0.34М раствора хлорида кальция (Рисунок 40). Рисунок 39 – Метаболическая активность клеток NCTC 929 после инкубации с гелями из пектина борщевика HSc, бодяка CAc, рябины SAc и люпина LAc в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** - различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно Рисунок 40 - Метаболическая активность клеток NCTC 929 после инкубации с гелями из яблочного пектина AU и пектина люпина LAc в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно 71

При шестидневной инкубации клеток с экстракционными средами отмечается низкая цитотоксичность для всех образцов гелей (Рисунок 41). Умеренная токсичность установлена только для образцов из яблочного пектина, модифицированных силикатионами (Рисунок 42). Рисунок 41 – Метаболическая активность клеток NCTC 929 после инкубации с гелями из пектина борщевика HSc, бодяка CAc, рябины SAc и люпина LAc в течение 144 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** - различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно Рисунок 42 - Метаболическая активность клеток NCTC 929 после инкубации с гелями из яблочного пектина AU и пектина люпина LAc в течение 144 часов. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. *, ** различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно 72

3. Исследование распределения лекарства в условиях in vivo 3.1. Валидация разработанных биоаналитических методик 3.1.1. Селективность Аналитический метод должен дифференцировать интересующий аналит и внутренний стандарт от посторонних компонентов. Обычно отсутствие мешающих компонентов принимается в случае ответа менее 20% и 5% нижнего предела количественной оценки аналита и внутреннего стандарта соответственно. Анализ селективности заключается в пробоподготовке пустого образца и исследовании в условиях хроматографического анализа. Метод отвечает требованиям селективности, если в установленное время удерживания аналита и внутреннего стандарта не происходит детектирования посторонних веществ. При исследовании пустого образца (Рисунок 27) установлено отсутствие сигнала во времени удерживания аналита и внутреннего стандарта. Постороннее вещество, имеющее 2 из 3 установленных ионных переходов, в образцах ткани и плазмы присутствует, но время удерживания составляет 5.1 минут. Селективность метода подтверждена. 3.1.2. Линейность, прецизионность и точность Реакция прибора на концентрацию анализируемого вещества должна быть известна и оцениваться в определенном диапазоне концентраций. Стандарты калибровки используют на основе матрицы, аналогичной предполагаемым образцам для исследования. Подготовка стандартных растворов заключается в добавлении известных концентраций аналита в пустой матрикс. В идеале, прежде чем проводить проверку аналитического метода, следует знать, какой диапазон концентраций ожидается. Этот диапазон должен охватываться диапазоном калибровочной кривой, также он должен быть установлен для обеспечения адекватного описания фармакокинетики аналита. Следует использовать как минимум шесть уровней концентраций. Критерий линейности соответствует построению калибровочных кривых. Готовили ряд стандартных растворов аналита (рекомендуется не менее 6 «точек») с добавлением раствора внутреннего стандарта с одной и той же концентрацией. Также одной из рекомендаций является построение калибровочной кривой для каждого типа матриц. Проводилась пробоподготовка и анализ всех проб в условиях, которые будут использоваться в дальнейшем. Результаты по оценке линейности графиков представлены в Таблицах 27 и 28. Таблица 27 – Коэффициент регрессии (R2) градуировочных графиков Плазма Желудок Тонкий кишечник Толстый кишечник Печень Почки 0,9997 0,9965 0,9971 0,9984 0,9995 0,9993 73

1 25 2 50 3 75 4 100 5 250 6 500 7 1000 Толстый Тонкий Желудок Плазма кишечник кишечник Срассчит, нг/мл 29,0 57,5 70,5 86,3 215,1 438,1 934 Отклон, % 16,0 15,0 6,0 13,7 14,1 12,4 6,6 Срассчит, нг/мл 29,8 54,8 82,4 115,5 217,3 427,0 851 Отклон, % 19,0 9,5 9,8 15,5 13,1 14,6 14,9 Срассчит, нг/мл 25,0 48,0 86,1 113,9 216,8 573,0 1089 Отклон, % 0,0 4,0 14,8 13,9 13,3 14,6 8,9 Срассчит, нг/мл 29,5 45,1 82,0 114,0 231,5 487,5 1009 Отклон, % 18,0 9,9 9,3 14,0 7,4 2,5 0,9 Почки Печень Таблица 28 – Обратный расчет концентраций Уровень Cфактическая, нг/мл Срассчит, нг/мл 20,5 44,0 75,5 110,0 248,0 427,5 976 Отклон, % 18,0 12,1 0,7 10,0 0,8 14,5 2,4 Срассчит, нг/мл 29,7 54,0 86,1 114,8 241,5 574,9 1064 Отклон, % 18,8 8,0 14,7 14,8 3,4 15,0 6,4 Норма, % менее 20 менее 15 Градуировочный график достоверно отражает зависимость отношения площади пика аналита к внутреннему стандарту от отношения концентрации аналита к внутреннему стандарту, если коэффициент регрессии составляет более 0,99. Требование выполняется для всех построенных калибровочных кривых. После построения калибровочной кривой осуществляли обратный расчет концентраций каждой точки калибровочной кривой. Отклонение рассчитанной концентрации не должно быть более 15% от фактической концентрации для всех точек. Для минимальной точки допускается отклонение не более 20%. Полученные значения соответствуют норме, что подтверждает линейность и достоверность построенных калибровочных кривых. После построения калибровочной кривой оценивали сигнал пробы с минимальной концентрацией. Если сигнал пробы превышает сигнал шума в 3 раза, то говорят об установлении нижнего предела качественного обнаружения. Если сигнал пробы превышает сигнал шума в 10 раз, то это нижний предел количественного обнаружения (как правило, это первый уровень калибровочной кривой). Нижний предел является самой низкой концентрацией калибровки, которую можно надежно оценить с достаточной точностью. Необходимо обязательно установить предел количественного обнаружения. 74

Предел качественного обнаружения приводится редко и служит лишь для подтверждения, что обнаружены «следовые количества» аналита. Прецизионность аналитического метода описывает близость повторяющихся индивидуальных показателей аналита и выражается как коэффициент вариации. Точность аналитического метода описывает близость определенного значения, полученного методом, к номинальной концентрации аналита, выраженная в процентах. Прецизионность и точность должны быть продемонстрированы для образцов LLOQ, низкого, среднего и высокого качества. Для оценки точности и прецизионности в условиях повторяемости анализировали образцы плазмы крови, содержащие аналит в 4 различных концентрациях, перекрывающих собой диапазон градуировочной кривой: нижний предел количественного обнаружения (LLOQ) , тройная величина LLOQ, 50% диапазона и 80% от верхнего диапазона градуировочной кривой, рассчитывая при этом количественное содержание по калибровочному графику. Результаты представлены в Таблице 29. 10 30 500 800 Плазма Срассчит.ср.знач, нг/мл 10,8 30,6 524 829 Отклон, % 8,0 2,0 4,8 3,6 Желудок Срассчит.ср.знач, нг/мл 9,6 29,6 474 724 Отклон, % 4,0 1,4 5,2 9,5 Тонкий кишечник Срассчит.ср.знач, нг/мл 9,5 27,8 489 794 Отклон, % 5,0 7,3 2,2 1,7 Толстый кишечник Срассчит.ср.знач, нг/мл 8,9 28,4 482 753 Отклон, % 11,0 5,4 3,6 5,9 Печень Срассчит.ср.знач, нг/мл 10,1 32,1 536 851 Отклон, % 1,0 7,0 7,2 6,4 Почки Таблица 29 – Расчет концентраций контрольных образцов Cфактическая, нг/мл Срассчит.ср.знач, нг/мл 10,3 31,6 542 837 Отклон, % 3,0 5,3 8,4 4,6 Отклонение рассчитанной концентрации не должно быть более 15% от фактической концентрации для всех точек. Для LLOQ допускается отклонение не более 20%. Полученные значения соответствуют норме, что подтверждает прецизионность и точность разработанных методов. 75

3.1.3. Матричный эффект и восстановление При использовании масс-спектрометрических методов следует исследовать матричные эффекты. Для каждого аналита и внутреннего стандарта матричный коэффициент рассчитывали путем вычисления отношения площади пика в присутствии матрицы к площади пика в чистом растворителе. Исследование матричного эффекта заключается в пробоподготовке пустых образцов с последующим добавлением стандартного раствора в матрицу. Анализировали стандарт в матрице и стандарт в чистом растворителе. Оценивали усиление / подавление сигнала. Матричные коэффициенты для биологических образцов приведены в Таблице 30. Таблица 30 - Результаты исследований матричного эффекта Аналит (5ASA) Плазма Желудок Тонкий кишечник Толстый кишечник Печень Почки 50 нг/мл 500 нг/мл 0,99 0,93 0,93 0,96 0,97 0,98 0,98 0,92 0,94 0,96 0,97 0,97 IS (4ASA) 0,99 0,94 0,96 0,98 0,98 0,97 При матричном коэффициенте равном 1.00 можно судить об отсутствии матричного эффекта. Менее 1.00 или более 1.00 происходит подавление или усиление ионизации аналита под действием экстрагированных компонентов матрицы соответственно. Исследование восстановления проводилось аналогично оценке матричного эффекта, только стандартный раствор вносится в пустой образец до пробоподготовки. Для сравнения использовали стандарт в чистом растворителе. Степень восстановления аналита и внутреннего стандарта из биологических образцов представлена в Таблице 31. Таблица 31 – Результаты исследований восстановления аналита и IS Аналит (5ASA) Плазма, % Желудок, % Тонкий кишечник, % Толстый кишечник, % Печень, % Почки, % 50 нг/мл 500 нг/мл 96,1 89,9 90,2 89,3 95,4 97,9 85,6 87,0 89,4 85,7 93,1 96,5 IS (4ASA) 89,2 90,5 92,8 91,7 95,2 95,9 3.1.4. Перенос и полнота разбавления При разработке метода необходимо учитывать и минимизировать перенос. Также разбавление образцов не должно влиять на прецизионность и точность. Если это применимо, целостность разбавления следует продемонстрировать, снижая концентрацию 76

аналита выше верхнего предела количественного обнаружения путем разбавления пустой матрицей. Прецизионность и точность в этом случае должны быть в пределах ±15%. Перенос оценивался введением пустого образца после анализа образца с концентрацией, соответствующей верхнему пределу градуировочной кривой. На полученной хроматограмме холостого образца пиков аналита и внутреннего стандарте не обнаружено. Следовательно, в ходе анализа образцов переноса сигнала не происходит. Значение концентрации аналита в исследуемых образцах не должно превышать значение максимальной точки калибровочной кривой. Если содержание аналита выше, необходимо осуществлять разбавление пробы. Для оценки полноты разбавления использовались пустые образцы и образец с аналитом (5ASA, 500 мкг/мл) и внутренним стандартом (4ASA, 500 нг/мл). После подготовки проб образец с высокой концентрацией разбавлялся пустой матрицей в 10, 20 и 50 раз и анализировался. Результаты представлены в Таблице 32. Таблица 32 – Оценка полноты разбавления Разведение Срассчит, мкг/мл Коэф.вар., % % номин. в 10 раз 541,04 8,2 108,2 в 20 раз 532,07 6,4 106,4 в 50 раз 469,05 6,2 93,8 Установленное отклонение рассчитанной концентрации от номинальной находится в допустимых пределах (менее 15%). 3.1.5. Стабильность Оценка стабильности должна проводиться для обеспечения того, чтобы условия пробоподготовки и хранения не влияли на концентрацию аналита. Стабильность должна обеспечиваться на каждом этапе аналитического метода. Условия, применяемые к испытаниям на стабильность, такие как матрица образцов, антикоагулянт, материалы для контейнеров, условия хранения и анализа, должны быть аналогичны условиям, применяемым для реальных исследуемых образцов. Ссылка на литературные данные считается недостаточной. Исследования стабильности проводят в течение периодов времени, которые равны или превосходят те, которые применяются к фактическим образцам исследования. Стабильность стандартных и рабочих растворов Исследуются стандартные и рабочие растворы 5-аминосалициловой кислоты и 4аминосалициловой кислоты в чистом растворителе (0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле, v/v 40:60). Рабочие растворы хранятся в холодильнике, стандартные – в морозильной камере. Рабочие растворы стабильны в течение 7 суток хранения при температуре 2–8 оС, стандартные растворы стабильны в течение одного месяца хранения в морозильной камере. Стабильность обработанных образцов Исследована стабильность готовых проб в автодозаторе (15оС, 3 часа) и в холодильнике (2-8оС, 12 часов). Анализ проводился сразу после пробоподготовки, а затем спустя указанное время. Коэффициент вариации в пределах допустимого отклонения. 77

Пробы стабильны при хранении в автодозаторе и в холодильнике в течение указанного времени. Стабильность исходных образцов В этом случае оценивается стабильность при замораживании-оттаивании, краткосрочная и долгосрочная стабильность. Исследование заключается в замораживании образцов в морозильной камере при заданной температуре, а затем оттаивании при комнатной температуре или температуре обработки. После полного оттаивания образцы вновь замораживают, применяя те же условия, в течение не менее 12 часов. Количество циклов при этом должно быть равно или превышать количество циклов замораживания/оттаивания исследуемых образцов. Краткосрочная стабильность – это стабильность в условиях пробоподготовки, а именно при комнатной температуре или температуре обработки в течение всего времени подготовки образцов. Исследование долгосрочной стабильности заключается в том, что контрольные образцы хранятся в морозильной камере при тех же условиях хранения и в течение той же продолжительности, что и образцы исследования. Для малых молекул считается приемлемым применения подхода брекетинга. В случае, если стабильность была доказана, например, при -70оС и -20оС, то нет необходимости исследовать стабильность при температурах между ними. Для больших молекул (пептиды и белки) стабильность следует изучать при каждой температуре, при которой будут храниться образцы исследования. Образцы стабильны при комнатной температуре в течение 4 часов, а также после трех циклов замораживания-оттаивания. Допускается хранение образцов в морозильной камере в течение одного месяца, хранение более трех месяцев недопустимо, так как установлено значительное снижение содержания аналита в образцах. Результаты валидации показывают, что используемые биоаналитические методики дают достоверные данные. 3.2. Оценка распределения лекарственного средства в организме Первоначально рассмотрено распределение месалазина в организме при введении лекарственного средства в водном растворе. Крыса №1К получила 100 мг 5аминосалициловой кислоты в виде водного раствора, а крыса №2К – 50 мг. Забой животных произведен через час с разницей в 15 минут. Установлено, что концентрация месалазина в плазме крови, желудке и двенадцатиперстной кишке примерно в 10 раз выше у крысы №1К по сравнению с крысой №2К. Содержание 5АСК в подвздошном отделе кишечника в 10 раз выше у крысы №2К. У крысы №1К концентрация лекарства в 2 и 3 раза выше в тканях печени и почек соответственно. Результаты исследования представлены в Таблице 33 и графически показаны на Рисунках 43 и 44. 78

Таблица 33 – Распределение месалазина через 1 час после введения Образец Крыса №1 Cмесалазин, нг/мг (мкл) ± SD Крыса №2 Cмесалазин, нг/мг (мкл) ± SD Плазма 2 120,44 ± 9,42 251,98 ± 10,08 Желудок 373,40 ± 28,39 47,53 ± 8,60 ДПК* 161,12 ± 24,92 1,44 ± 0,05 Подвздошная кишка 1,54 ± 0,02 11,70 ± 2,36 Печень 3,72 ± 0,11 1,57 ± 0,02 Почки 11,41 ± 0,14 4,08 ± 0,26 * двенадцатиперстная кишка Рисунок 43 – Содержание месалазина в плазме крови крыс через 1 час после введения. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 2. ** - различия достоверны по сравнению с контролем (№1К) при р < 0,01 79

Рисунок 44 – Распределение месалазина в организме крыс через 1 час после введения. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 2. ** - различия достоверны по сравнению с контролем (№1К) при р < 0,01 Основное исследование заключалось в распределении лекарственного средства, введенного крысам в форме пектиновых гранул. Результаты приведены в Таблице 34 и графически показаны на Рисунках 45-49. Таблица 34 – Распределение месалазина в организме крыс Образец Плазма Желудок ДПК* ТК* ПК* Толстая кишка Печень Почки 3 часа, нг/г (мл) SVc КМЦ 6 206 1 249 54 203 137 69 1 324 7 967 3 265 23 701 103 1 085 - - 6 часов, нг/г (мл) SVc КМЦ 50 2 222 32 23 14 0 56 62 213 191 3 52 14 34 12 24 часа, нг/г (мл) SVc КМЦ 0 0 74 25 25 0 32 28 77 0 11 23 15 9 0 82 48 часов, нг/г (мл) SVc КМЦ 0 0 247 0 5 24 14 26 17 123 38 18 0 8 7 3 * ДПК, ТК и ПК – двенадцатиперстный, тощий и подвздошный отделы тонкого кишечника 80

Рисунок 45 – Распределение месалазина в организме крыс через 3 часа после введения. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. ** - различия достоверны по сравнению с контролем (КМЦ) при р < 0,01 Выявлено, что через 3 часа у контрольных животных абсорбировано в 55 раз больше месалазина, чем у исследуемой группы. Через 6 часов концентрация лекарства у контролей в тканях снижается, а абсорбция месалазина происходит преимущественно в подвздошной кишке. Установлено, что пектиновые гели замедляют высвобождение лекарства в условиях организма. Через 24 часа определено снижение концентрации месалазина во всех тканях. 81

Рисунок 46 – Распределение месалазина в организме крыс через 6 часов после введения. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. ** - различия достоверны по сравнению с контролем (КМЦ) при р < 0,01 Рисунок 47 – Распределение месалазина в организме крыс через 24 часа после введения. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. ** - различия достоверны по сравнению с контролем (КМЦ) при р < 0,01 82

Рисунок 48 – Распределение месалазина в организме крыс через 48 часов после введения. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. ** - различия достоверны по сравнению с контролем (КМЦ) при р < 0,01 Рисунок 49 - Содержание месалазина в плазме крови крыс. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение, n = 3. ** - различия достоверны по сравнению с контролем (КМЦ) при р < 0,01 83

Обсуждения 1. Физико-химические особенности лекарственного средства При хранении гидрогелей в хлориде кальция было отмечено изменение окраски раствора на светло-коричневый в течение суток. Насыщенность окрашивания зависели от концентрации раствора хлорида кальция. Чем больше Ca2+, тем сильнее окрашивание. В связи с этим, было выдвинуто предположение о взаимодействии 5АСК с ионами кальция. В основу гипотезы была взята фармакопейная качественная реакция на фенольный гидроксил. Она используется для подтверждения подлинности противотуберкулезного средства - пара-аминосалициловой кислоты (ПАСК, 4ASA). В кислой среде натрия парааминосалицилат с раствором хлорида железа (III) образует комплексное соединение, придающее раствору фиолетово-красное окрашивание [89]. При этом отмечается особенность этой качественной реакции: она используется для подтверждения подлинности и обнаружения примеси – токсичного и фармакологически неактивного натрия мета-салицилата. Указано, что мета-салицилат образует комплекс того же цвета, что и соль ПАСК, но со временем выпадает осадок данной соли коричневого цвета. Можно предположить, что карбоксильная и/или гидроксильная группы месалазина могут вступать в реакцию с ионами металлов, в том числе и с двухвалентными ионами кальция. Возможная реакция, а также окрашивание растворов хлорида кальция во время хранения гелей представлены на Рисунке 50. Рисунок 50 – Вариант химической реакции 5АСК с ионами кальция (слева) и окрашивание растворов хлорида кальция с пектиновыми гелями, загруженными месалазином (справа): более светлое окрашивание в 1 и 3 пробе с 0.34М CaCl2, темно-коричневое окрашивание – 2, 4 пробы с 1М CaCl2 Получение гелей происходит за счет реакции сшивания полисахаридных цепей между собой с помощью ионов кальция. Поэтому было выдвинуто предположение о сшивке пектиновых молекул не только друг с другом, но и с лекарственным средством. Гели без лекарственного средства имеют преимущественно светло-желтое окрашивание. Раствор лекарственного средства имеет серый цвет. Высушенные гранулы приобретают насыщенный коричневый цвет. Окрашивание также отмечено и в случае использования силиката натрия для модифицирования гелей. При смешивании раствора силиката натрия с раствором пектина и месалазина изменение окраски происходит до процесса ионотропного образования. Предположительно, комплексы образуются между пектином, лекарством и силикат-ионами. Месалазин является амфотерным химическим [49] соединением благодаря наличию в своем составе NH2-группы основного характера и СООН-группы, придающей 84

кислые свойства. В связи с этим 5АСК зависима от значений рН среды. Она может быть в форме анионов, катионов, нейтральных биполярных ионов (цвиттер-ионов) или в виде смеси их форм, показанных на Рисунке 51. Рисунок 51 – Формы 5-АСК в зависимости от рН среды Так как месалазин абсорбирует свет в ультрафиолетовой области спектра [46], его количество можно определять с помощью простых спектрофотометрических методов, отличающихся простотой. Но, вследствие наличия у 5АСК амфотерных свойств, данные методы не всегда могут быть достоверными. Это было отмечено при определении месалазина в инкубационных средах (Таблица 23). Для гелей из пектинов рябины (SAc) и люпина (LAc) были получены сопоставимые результаты. Для гранул из пектинов бодяка (CAc) и борщевика (HSc) высвобождение месалазина по данным спектрофотометрического определения было в 1,5 и 2 раза меньше соответственно по сравнению с результатами хромато-масс-спектрометрии. Стоит отметить, что наибольшая степень деструкции гелей была установлена для гелей из пектина борщевика, в меньшей степени для образцов из пектинов бодяка и рябины. Гранулы из пектина люпина практически не набухали. Вследствие этого можно сделать следующее предположение: так как растворы пектинов имеют слабокислую среду, фрагменты молекул при деструкции гелей сдвигают рН инкубационной среды (в данном случае SGF) к нейтральным значениям. В результате чего, происходит перераспределение зарядов на функциональных группах части молекул с образованием смеси форм 5АСК в растворе. И в ходе спектрофотометрического определения при установленной длине волны детектируются не все молекулы месалазина, а только их часть. При повышении рН среды происходит увеличение длины волны максимума поглощения 5АСК. Для решения данной проблемы может быть предложено использование реакции дериватизации с помощью уксусного или пропионового (как для хромато-массспектрометрии) ангидрида [49, 60] для подавления амфотерных свойств месалазина с последующим определением характерной длины волны для производного 5АСК. В ходе разработки хромато-масс-спектрометрических методик были отмечены следующие особенности изомеров. Расположение функциональных групп бензольного кольца по отношению друг другу влияет на масс-спектрометрическое определение 5АСК по сравнению с его изомером – 4АСК. Согласно хроматограмме (Рисунок 25), Nпропионил-5АСК образует преимущественно два типа Product ion с m/z 164,20 и 107,05 (m/z 108,05 присутствует). В то же время, его изомер N-пропионил-4АСК в соударительной ячейке разрушается до ионов с m/z 108,05 и 164,20. Это можно объяснить, учитывая особенности взаимного расположения функциональных групп двух изомеров 85

[112]. Гидроксильная –OH и аминогруппа – NH2 относятся к электронодонорным заместителям. Неподеленная пара электронов в этих группах вступает в общее сопряжение с p-электронной системой бензольного кольца и увеличивает длину сопряженной системы. Наличие данных групп повышает электронную плотность в сопряженной системе, которая сосредотачивается в орто- и пара-положениях. Карбоксильная группа –COOH также образует общую сопряженную систему с бензольным кольцом, но общее электронное облако смещается в сторону этой группы от кольца, так как она относится к электроноакцепторным заместителям. Наличие данной группы снижает электронную плотность в сопряженной системе, но меньше всего она уменьшается в мета-положении. Переход m/z 208,20 → 164,20 [M-H-CO2]- характеризуется, главным образом, потерей карбоксильной группы, а m/z 208,20 → 108,05 [M-H-CO2-CH3CHCO]- и m/z 208,20 → 107,05 [M-H-CO2-CH3CHCO-H]- - дополнительным разрушением связи N-С с отщеплением «пропионильного» хвоста. N-пропиониламиногруппа относительно гидроксильной группы –ОН в 5АСК расположена в пара-положении, где сосредоточена электронная плотность сопряженной системы, а в 4АСК - в мета-положении. Это объясняет то, что при соударении связь N-C в месалазине разрушается в меньшей степени. В то время как пара-аминосалициловая кислота, преимущественно, разрушается до иона с m/z 108,05 с разрывом связи N-C. Переходы m/z 208,20 → 108,05 и 208,20 → 107,05 отличаются потерей одного иона + H . Предположительно, это ион, связанный с азотом группы NH2+. В молекуле Nпропионил-5АСК, как уже было сказано ранее, электронная плотность сосредоточена в положении N-пропионильной группы, что делает связь N-C прочнее. Но если «пропионовый» хвост отрывается, свободные электроны азота вступают в общее сопряжение с p-электронной системой бензольного кольца. Происходит перераспределение электронной плотности. Наличие гидроксильной группы в параположении способствует «оттягиванию» электронной плотности с иона водорода, связанного с азотом, и, следовательно, к отрыву H+. В случае N-пропионил-4АСК ионный переход 208,20 → 107,05 отсутствует. Это подтверждает предположение, связанное с взаимным влиянием функциональных групп, так как в этом случае они располагаются в мета-положении по отношению друг к другу. Для создания средств адресной доставки необходимо качественное исследование материала носителя для лекарственного препарата и лекарственного средства, его физикохимических особенностей, которые могут влиять на формирование и устойчивость разрабатываемой системы. В данном случае критическими моментами является взаимодействие 5АСК с пектиновыми молекулами и вспомогательными ионами в ходе ионотропного гелеобразования, а также качественное и количественное определение месалазина с помощью аналитических методов ввиду его амфотерных свойств. 2. Использование пектиновых гелей для адресной доставки Ключевыми моментами в разработке системы адресной доставки являются: характеристика используемых полисахаридов, условия гелеобразования (в частности, концентрация хлорида кальция), а также возможность химического взаимодействия пектиновых молекул с лекарственным средством, рассмотренная ранее. В виду 86

технического оснащения в работе изучались в первую очередь условия ионотропного гелеобразования для формирования гелей [53]. С увеличением концентрации пектина снижается деструкция гранул в инкубационных средах. Гели из 4% пектина в несколько раз прочнее и лучше удерживают лекарственное средство [8]. Также концентрация влияет на морфологию гелей, сферические гранулы можно получить, используя 2% и более раствор пектина. Эффективность загрузки месалазина преимущественно зависит от концентрации лекарственного средства и соотношения пектин : месалазин. Можно отметить, что при соотношении 1:1 количество загруженного лекарства будет выше для гранул из 4% раствора пектина по сравнению с 2% (Таблица 18). При увеличении соотношения в пользу месалазина загрузка лекарства будет увеличиваться для гранул с меньшей концентрацией полисахарида. Однако при этом высвобождение лекарственного средства при дальнейшей инкубации происходит интенсивнее. Поэтому оптимальным вариантом будет использование исходного раствора пектинового полисахарида с большей концентрацией и соотношением пектин : месалазин – 1:1 или 2:1. Значительное влияние на морфологию и устойчивость к деструкции оказывает концентрация ионов кальция в сшивающем растворе. При увеличении молярности раствора хлорида кальция снижается влагоемкость гелей, гранулы приобретают сферическую форму. Значительное влияние на деструкцию гелей в ходе инкубации оказывает остаточное содержание Ca2+ в гранулах, но для каждого пектина отмечается его индивидуальное предельное значение (Таблица 14). Влияние концентрации хлорида кальция на устойчивость к деструкции необходимо оценивать совместно со временем сшивания в данном растворе. Ионное гелеобразование необходимо проводить в течение 30 и более минут, так как образование ионных связей между молекулами пектина и Ca2+ происходит медленно. В результате длительной сшивки в растворе хлорида кальция образуются прочные связи. Степень удерживания лекарственного средства значительно увеличивается (Таблица 22). Время сшивания, концентрация хлорида кальция и условия сушки влажных гелей комплексно влияют на размеры гранул. При увеличении времени сшивания и концентрации хлорида кальция с последующим высушиванием под вакуумом при температуре 60оС позволяет получать гранулы размером около 200-300 мкм. В литературных источниках [11, 12] также указывается тот факт, что гранулы, высушенные при 50оС, лучше удерживают лекарство, чем гели, высушенные в условиях 37оС. Данный факт не был проверен в ходе этой работы. В статьях [11, 34] указывается на то, что 5АСК является слабой кислотой (рК около 3.5). Следовательно, использование кислых условий при ионотропном гелеобразовании позволяет снизить высвобождение лекарственного средства, так как в этом случае происходит загрузка в пектиновый гель месалазина в нерастворимой форме. В ходе экспериментов установлено, что пектиновые гранулы в ходе гелеобразования имеют темные вкрапления, при этом раствор хлорида кальция не приобретает коричневого оттенка. Согласно ранее приведенным предположениям о физико-химических особенностях месалазина, можно сделать вывод, что лекарство присутствует в гелях в нерастворимой форме. При инкубации данных образцов (Таблица 19) установлено, что высвобождение 5АСК происходит интенсивнее, чем в случае гранул, которые были 87

получены с использованием хлорида кальция без добавления соляной кислоты (рН 10.3). Это не подтвердило приведенные в литературном обзоре утверждения. Использование неорганических солей для создания дополнительной оболочки на поверхности гранул не снизило деструкцию гелей. Также была исследована возможность включения силикат-ионов непосредственно в структуру гранул путем добавления в исходный раствор пектина и месалазина. Таким образом, создание гибридного материала из биополимера и неорганического комплексообразователя позволило снизить экстракцию лекарства из гелей [22, 67]. Предположительно, за счет образования связей между участками молекул лекарства и пектина, которые не вступают в реакцию с ионами кальция. Благодаря тонкому подбору условий ионотропного гелеобразования возможно создание системы адресной доставки на основе пектиновых полисахаридов. Но такие характеристики, как эффективность загрузки и высвобождение лекарства, во многом зависят от строения используемых пектинов. Поэтому для прогнозируемого конструирования средств доставки необходимо глубокое изучение характеристик пектиновых полисахаридов и их возможных взаимодействий с конкретным лекарственным средством [24]. 3. Влияние на метаболическую активность клеток При инкубации клеток непосредственно с гелевыми гранулами возникает проблема удаления образцов перед добавлением МТТ и последующим спектрофотометрическим измерением. Поэтому был выбран способ предварительной инкубации гелей в питательной среде для получения гель-экстракта. Затем полученный экстракт вносят к адгезированным клеткам. Основными компонентами, экстрагирующимися из гранул являются ионы кальция, силикат-ионы и фрагменты полисахаридных молекул, характерных для каждого типа пектинов. Экстракция фрагментов пектиновых молекул зависит от источника полисахаридов, количества кальция, наличия силикат-ионов и прочности сшивания гранул в целом. В виду того, что невозможно установить качественный состав гель-экстрактов, была проведена комплексная оценка цитотоксического действия определенных образцов с целью выявления перспективных и не токсичных материалов. Преимущественно все образцы незначительно снижают метаболическую активность клеток. По результатам исследования цитотоксичности на культуре клеток эмбриональных почек человека HEK293 выбраны гели из сорбана (SAc 1M) и люпинана (LAc 0.34M и LAc+Si). При инкубации в течение двух суток данные образцы оказывают незначительный пролиферативный эффект. В течение шестидневной инкубации отмечена умеренная цитотоксичность по сравнению с другими образцами, которые оказывают сильное цитотоксическое действие. Менее пригодны образцы из пектина борщевика (HSc 1M) и люпина (LAc 1M). Данные гель-экстракты через 48 часов продемонстрировали низкий цитотоксический эффект, а через 144 часа – снижение метаболической активности до 50% (5 мг/мл). Установлено, что гели из люпинана (LAc 1M) меньше всего снижают метаболическую активность клеток аденокарциномы толстого кишечника человека Caco2. В то же время, образцы LAc 0.34M и LAc +Si способны снизить жизнеспособность клеток почти до 50%. Остальные гранулы продемонстрировали преимущественно 88

одинаковое влияние на метаболическую активность. Для них выявлена умеренная цитотоксичность при использовании концентраций гель-экстрактов более 1 мг/мл. Клеточная линия мышиных фибробластов NCTC клон 929 оказалась менее чувствительна к гель-экстрактам. Через двое суток отмечено незначительное снижение метаболической активности, а через шесть - цитотоксический эффект для большинства гранул не наблюдается. Это может быть связано с ускоренным метаболизмом и высокой скоростью роста мышиных фибробластов по сравнению с человеческими линиями. Вследствие этого происходит быстрая адаптация клеток к новым условиям и компонентам питательной среды. Установлено, что гели из яблочного пектина (AU 0.34 и AU +Si) значительно снижают метаболическую активность мышиных клеток по результатам инкубации в течение 144 часов по сравнению с другими образцами. Комплексно оценивая результаты исследований на трех клеточных культурах выявлено, что в качестве носителя могут быть использованы гранулы из люпинана (LAc 0.34M и LAc +Si). Другим перспективным материалом для модификации с целью создания системы адресной доставки лекарств может выступать сорбан (SAc). Стимулирующее действие пектиновых гелей SAc на жизнеспособность клеток может быть обусловлено повышенным содержанием глюкозы, по сравнению с другими исследуемыми пектинами. Глюкоза является преобладающим субстратом метаболизма клеток млекопитающих. Она способна окисляться в ходе гликолиза, обеспечивая клетку энергией. Полученная энергия используется пролиферирующей клеткой во время митоза. В виду различной метаболической активности разных культур клеток необходимо проведение исследований на нескольких клеточных линиях, желательно как человеческих, так и, например, мышиных. Для получения более точных данных по цитотоксичности пектиновых гелей целесообразно проведение полноценных исследований с полным разрушением образцов ферментативным способом. В случае использования пектиназы необходим подбор оптимальных условий проведения анализа, так как, например, отдельные компоненты полной питательной среды могут оказывать ингибирующие воздействие на фермент. 4. Закономерности распределения в организме При исследовании тканей и плазмы крови двух крыс, которые получили водный раствор 5АСК однократно, можно отметить следующее: - Концентрация месалазина в плазме крови, желудке и двенадцатиперстной кишке примерно в 10 раз выше у крысы №1К, получившей 100 мг лекарства, по сравнению с крысой №2К, которой ввели 50 мг лекарственного средства. Следовательно, абсорбция лекарственного средства в желудочно-кишечном тракте протекает одинаково независимо от дозировки 5АСК. - Содержание 5АСК в подвздошном отделе кишечника, наоборот, в 10 раз выше у крысы №2К, которую вскрыли через 75 минут после введения, в сравнении с крысой №1К, вскрытой через 60 минут. Возможно, это связано именно со временем умерщвления, так как по литературным данным пища в организме крысы проходит тонкий кишечник за 88-109 минут. Таким образом, разница в 15 минут (примерно 1/6 времени пребывания лекарства в тонком кишечнике) могла способствовать увеличению концентрации 89

месалазина в подвздошной кишке второй крысы по сравнению с первой, жизнедеятельность которой была прервана раньше. - Концентрация лекарства в тканях печени в два раза выше у крысы №1К, чем у крысы №2К. Данный факт коррелирует с введенной дозировкой обеим крысам и свидетельствует об одинаковой скорости метаболизма животных. - Содержание месалазина в почках примерно в 3 раза выше у крысы №1К по сравнению с крысой №2К. Несмотря на высокую начальную дозировку лекарства для первого животного, основное количество 5АСК, которое не метаболизируется и выводится из организма в неизменном виде, незначительно. При сравнении тканей печени и почек двух животных установлено, что доля лекарства, которое выводится из организма в неизменном виде, повышается с увеличением дозировки. Это также может быть объяснено и с точки зрения индивидуальных особенностей организма крыс. Фармакокинетика препарата при введении месалазина в форме пектиновых гелей заметно отличается от распределения лекарства в форме раствора с карбоксиметилцеллюлозой (контроль). Через 3 часа после приема 5АСК отмечается незначительное высвобождение лекарственного средства в случае использования гранул. Как показали результаты вскрытия пищеварительного тракта крыс, все SVc гранулы находятся в составе химуса в полости желудка. При сравнении содержания 5ASA в различных тканях, установлено максимальное содержание месалазина в подвздошном отделе тонкого кишечника через 3 часа после введения гелей. В случае контрольного животного наблюдается высокая концентрация препарата в желудке, меньше в подвздошной и тощей кишке. Ключевое отличие при приеме гелей с месалазином или раствора 5АСК с карбоксиметилцеллюлозой отмечено через 6 часов после введения лекарственных препаратов. Концентрация лекарства, введенного с КМЦ, в кишечнике снижается более чем в 1000 раз, а абсорбция месалазина происходит преимущественно в подвздошной кишке. Поэтому лекарственное средство не достигает толстого кишечника. В случае использования пектиновых гелей установлено значительное увеличение концентрации месалазина в ткани толстой кишки по сравнению с контролем. Следовые количества лекарства в почках могут свидетельствовать о том, что не весь месалазин метаболизируется и незначительные его концентрации выводятся в неизменном виде. В случае использования раствора КМЦ или пектиновых гелей происходит минимальная абсорбция в двенадцатиперстном отделе тонкого кишечника. Спустя 24 часа определено снижение лекарственного средства в тканях организма. Высокие концентрации месалазина в желудке и подвздошной кишке в случае использования гранул можно объяснить следующим предположением: в организме остается часть гранул, которая медленно переваривается. В результате долгого нахождения в физиологических жидкостях организма и, как следствие, набухания происходит значительное высвобождение лекарства не в толстом кишечнике, как через 6 часов после приема, а в подвздошном отделе кишечника. Значительная концентрация в почках и отсутствие лекарства в печени контрольного животного может быть объяснена с точки зрения здоровья крысы (медленный процесс ацетилирования месалазина в тканях печени). 90

Ситуацию через 48 часов можно объяснить только с точки зрения индивидуальных характеристик лабораторных животных. Спустя двое суток в организме остаются следовые количества лекарственного средства. В случае использования раствора КМЦ происходит быстрое высвобождение и абсорбция лекарства в течение первых трех часов, после чего концентрация в плазме значительно падает. При использовании пектиновых гелей более высокая концентрация в плазме отмечена через 6 часов, что свидетельствует о медленном высвобождении 5АСК. Суммарная концентрация месалазина за 48 ч в стенке тонкого кишечника составляет 85 и 21 нг/мл для крыс, получивших раствор месалазина с КМЦ и пектиновые гранулы соответственно. Суммарная концентрация в стенке толстой кишки за 48 ч составила 17 и 7 нг/мг ткани соответственно. Комплексно оценивая все полученные результаты можно сделать следующие выводы: - Значительная абсорбция месалазина отмечена для желудка и подвздошной кишки. При этом лекарство практически не абсорбируется в двенадцатиперстном отделе тонкого кишечника. Таким образом, при конструировании системы доставки необходимо учитывать условия и время нахождения в условиях желудка и подвздошного отдела тонкого кишечника. - Использование пектиновых гелей снижает высвобождение месалазина на стадиях желудка и подвздошного отдела в течение первых трех часов после приема лекарства. Гранулы обеспечивают преимущественное высвобождение и абсорбцию в толстом кишечнике через 6 часов по сравнению с использованием раствора КМЦ. - Пектиновые гели обеспечивают пролонгированный эффект. Спустя сутки в тканях лабораторных животных, которым вводили гранулы, установлены более высокие концентрации лекарства, чем в тканях контрольных животных. Общее количество месалазина, распределенного в стенке пищеварительного тракта, печени, почках и плазме крови у животных, получивших месалазин в виде раствора с КМЦ и в составе SVc гранул, составляет около 900 и 100 нг соответственно. Это может быть связано с наличием метасиликата натрия в гелях, который используется для увеличения устойчивости структуры. Возможно, пектин-гелевые гранулы чрезмерно устойчивы к среде пищеварительного тракта у крыс, в том числе к бактериальной ферментации. В целом, отсутствие резкого увеличения концентрации месалазина в плазме и более длительного (пролонгированного) эффекта позволяет рассматривать пектиновые гранулы в качестве перспективного носителя, так как:  умеренное увеличение концентрации лекарственного средства в тканях организма способствует снижению риска возникновения побочных эффектов;  пролонгированный эффект при длительном приеме лекарственного средства позволяет снизить дозировку лекарственного средства и быстрее достигнуть необходимой терапевтической концентрации в тканях. 91

Заключение Выделены и охарактеризованы пектиновые полисахариды борщевика Сосновского (Heracleum Sosnowskyi, гераклиуман), бодяка полевого (Cirsium arvense, цирсиуман), рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia, сорбан) и люпина узколистого (Lupinus angustifolius, люпинан), полученные из каллусных культур коллекции Лаборатории биологически активных веществ и биополимеров ФГБОУ ВО «Вятского Государственного университета». Разработаны методики количественного определения месалазина в инкубационных средах и биологических образцах методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Биоаналитические методики валидированы. Данные, полученные с использованием разработанных методов, являются достоверными. Проведено сравнение спектрофотометрического и хромато-масс-спектрометрического определения 5АСК. Разработанные методики качественного определения месалазина могут быть использованы для других исследований. Помимо разработанных методик ВЭЖХ-МС/МС и исследования распределения в организме, научная новизна работы также заключается в исследовании устойчивости к деструкции и цитотоксичности гелей из пектинов, полученных биотехнологическим путем. Проведенные исследования показали, что из пектиновых полисахаридов, полученных из коллекции каллусных культур ВятГУ, наиболее перспективным является пектин люпина узколистного. Установлено влияние условий желирования на устойчивость гелей к деструкции в искусственной гастральной среде. Подобраны оптимальные условия для получения гранул, устойчивых к деструкции. Гели, полученные из 2% раствора пектина люпина и месалазина (2:1) с добавлением силиката натрия (10 мг/мл) методом ионотропного желирования в 0,34 М растворе хлорида кальция, удерживают более 97% лекарства при инкубации в кислой среде. Дополнительно по результатам исследований выдвинуто предположение о химическом связывании месалазина с пектином посредством ионов кальция и силикатионов. Молекулы лекарственного средства меньше размера пор, которые образуются при сшивании полисахарида. Поэтому связывание 5АСК с пектином является перспективным способом для снижения высвобождения лекарства в верхних отделах ЖКТ. Модифицирование гелей силикат-ионами также позволяет увеличить устойчивость гранул и снизить концентрацию используемого сшивающего раствора хлорида кальция. Выявленные закономерности гелеобразования могут быть использованы для конструирования системы адресной доставки лекарств. Изучено влияние пектиновых гелей на метаболическую активность трех клеточных линий. Установлено незначительное снижение метаболической активности клеток, что свидетельствует об отсутствии цитотоксичности данных материалов. Результаты исследований показали, что в качестве носителя могут быть использованы гранулы из люпинана, полученные с использованием 0,34М раствора хлорида кальция. Другим перспективным материалом являются гели из сорбана. Изучено влияние пектиновых гелей на распределение месалазина в организме крыс. Гели обеспечивают пролонгированный эффект и способствуют умеренному увеличению концентрации лекарственного средства в плазме и тканях организма. 92

В условиях in vivo пектиновые гели продемонстрировали значительные преимущества по сравнению с введением лекарственного средства без носителя. Но разрушение пектиновых гранул и высвобождение месалазина подвержено широкой вариабельности, которая незначительно коррелирует с результатами исследований in vitro. Методики определения 5АСК в биологических образцах требует доработки, а именно дополнительной оценки концентраций метаболитов месалазина в плазме и тканях. Использование системы адресной доставки лекарств на основе пектинов целесообразно с точки зрения биосовместимости полимеров и их физиологической активности. Иммуномодулирующее и противовоспалительное действие носителя может выступать в качестве дополнительного лечебного фактора при терапии воспалительных заболеваний кишечника. Структурное разнообразие пектиновых полисахаридов и физикохимические свойства лекарственных средств требуют тщательного подбора носителя, условий гелеобразования и аналитических методик для исследования in vitro и in vivo. 93

Приложение Б (справочное) Библиографический список 1. Ahnfelt-Rønne I. et al. Clinical evidence supporting the radical scavenger mechanism of 5-aminosalicylic acid //Gastroenterology. – 1990. – Т. 98. – №. 5. – С. 1162-1169. 2. Almeida E. A. M. S. et al. Curcumin-loaded dual pH-and thermo-responsive magnetic microcarriers based on pectin maleate for drug delivery //Carbohydrate polymers. – 2017. – Т. 171. – С. 259-266. 3. Andishmand H. et al. Pectin-zinc-chitosan-polyethylene glycol colloidal nano-suspension as a food grade carrier for colon targeted delivery of resveratrol //International journal of biological macromolecules. – 2017. – Т. 97. – С. 16-22. 4. Awasthi R. et al. Dual crosslinked pectin–alginate network as sustained release hydrophilic matrix for repaglinide //International journal of biological macromolecules. – 2017. – Т. 97. – С. 721-732. 5. Bahuguna A. et al. MTT assay to evaluate the cytotoxic potential of a drug //Bangladesh Journal of Pharmacology. – 2017. – Т. 12. – №. 2. – С. 115-118. 6. Balaraji E. et al. Development and Validation of a LC-MS/MS Method for Mesalamine in Human Plasma by Derivatization Technique //European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. – 2015. – T. 2. – № 5. – C. 716-727. 7. Banda J. et al. Determination of mesalazine, a low bioavailability olsalazine metabolite in human plasma by UHPLC–MS/MS: Application to a pharmacokinetic study //Journal of Chromatography B. – 2016. – Т. 1008. – С. 1-10. 8. Chan S. Y. et al. Pectin as a rheology modifier: Origin, structure, commercial production and rheology //Carbohydrate polymers. – 2017. – Т. 161. – С. 118-139. 9. Cui S. et al. Effects of pectin structure and crosslinking method on the properties of crosslinked pectin nanofibers //Carbohydrate polymers. – 2017. – Т. 157. – С. 766-774. 10. Chambin O. et al. Colon-specific drug delivery: influence of solution reticulation properties upon pectin beads performance //International Journal of Pharmaceutics. – 2006. – Т. 321. – №. 1-2. – С. 86-93. 11. Das S., Ng K. Y. Colon-specific delivery of resveratrol: Optimization of multi-particulate calcium-pectinate carrier //International Journal of Pharmaceutics. – 2010. – Т. 385. – №. 1-2. – С. 20-28. 12. Das S., Ng K. Y. Resveratrol-loaded calcium-pectinate beads: effects of formulation parameters on drug release and bead characteristics //Journal of pharmaceutical sciences. – 2010. – Т. 99. – №. 2. – С. 840-860. 13. Dashora A., Jain C. P. Development and characterization of pectin-prednisolone microspheres for colon targeted delivery //Int J Chem Tech Res. – 2009. – Т. 1. – №. 3. – С. 751-757. 14. De Vos M. et al. High-performance liquid chromatographic assay for the determination of 5-aminosalicylic acid and acetyl-5-aminosalicylic acid concentrations in endoscopic intestinal 94

biopsy in humans //Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. – 1991. – Т. 564. – №. 1. – С. 296-302. 15. Dheer D. et al. Polysaccharides based nanomaterials for targeted anti-cancer drug delivery //Journal of drug targeting. – 2017. – Т. 25. – №. 1. – С. 1-16. 16. do Prado S. B. R. et al. Ripening-induced chemical modifications of papaya pectin inhibit cancer cell proliferation //Scientific reports. – 2017. – Т. 7. – №. 1. – С. 16564. 17. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. // Anal. Chem. 1956. V. 28. № 2. P. 350–356. 18. El-Gibaly I. Oral delayed-release system based on Zn-pectinate gel (ZPG) microparticles as an alternative carrier to calcium pectinate beads for colonic drug delivery //International Journal of Pharmaceutics. – 2002. – Т. 232. – №. 1-2. – С. 199-211. 19. Espinosa-Leal C. A., Puente-Garza C. A., García-Lara S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds //Planta. – 2018. – С. 1-18. 20. Ferraretto A. et al. Morpho-functional properties of a differentiated Caco2/HT-29 coculture as an in vitro model of human intestinal epithelium //Bioscience reports. – 2018. – С. BSR20171497. 21. Gentilini R. et al. Polysaccharide-based hydrogels with tunable composition as 3D cell culture systems //The International journal of artificial organs. – 2018. – Т. 41. – №. 4. – С. 213-222. 22. Günter E. A. et al. Preparation and release characteristics of mesalazine loaded calcium pectin-silica gel beads based on callus cultures pectins for colon-targeted drug delivery //International journal of biological macromolecules. – 2018. – Т. 120. – С. 2225-2233. 23. Günter E. A. et al. Swelling and morphology of calcium pectinate gel beads obtained from Silene vulgaris callus modified pectins //Carbohydrate polymers. – 2014. – Т. 103. – С. 550-557. 24. Günter E. A., Popeyko O. V. Calcium pectinate gel beads obtained from callus cultures pectins as promising systems for colon-targeted drug delivery //Carbohydrate polymers. – 2016. – Т. 147. – С. 490-499. 25. Günter Y. A., Ovodov Y. S. Pectin substances of the callus culture of Silene vulgaris (M.) G //Applied biochemistry and microbiology. – 2011. – Т. 47. – №. 1. – С. 82-86. 26. Hidalgo I. J., Raub T. J., Borchardt R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability //Gastroenterology. – 1989. – Т. 96. – №. 3. – С. 736-749. 27. Hu J. et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: A Vehicle for Biopharmaceutical Manufacturing, Structural Biology, and Electrophysiology //Cells Tissues Organs. – 2018. – Т. 205. – №. 1. – С. 1-8. 28. Hubatsch I., Ragnarsson E. G. E., Artursson P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers //Nature protocols. – 2007. – Т. 2. – №. 9. – С. 2111. 95

29. Hussain F. N., Ajjan R. A., Riley S. A. Dose loading with delayed‐release mesalazine: a study of tissue drug concentrations and standard pharmacokinetic parameters //British journal of clinical pharmacology. – 2000. – Т. 49. – №. 4. – С. 323-330. 30. Ishisono K., Yabe T., Kitaguchi K. Citrus pectin attenuates endotoxin shock via suppression of Toll-like receptor signaling in Peyer's patch myeloid cells //The Journal of nutritional biochemistry. – 2017. – Т. 50. – С. 38-45. 31. Kämpfer A. A. M. et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state //Toxicology in Vitro. – 2017. – Т. 45. – С. 31-43. 32. Kanala K. et al. Simultaneous quantification of mesalamine and its metabolite N-Acetyl mesalamine in human plasma by LC-MS/MS and its application to a bioequivalence study //British Journal of Pharmaceutical Research. – 2014. – Т. 4. – №. 13. – С. 1568. 33. Kandula M. et al. Discovery and preclinical development of a novel prodrug conjugate of mesalamine with eicosapentaenoic acid and caprylic acid for the treatment of inflammatory bowel diseases //International immunopharmacology. – 2016. – Т. 40. – С. 443-451. 34. Kawadkar J., Meenakshi K. C., Ram A. Evaluation of potential of Zn-pectinate gel (ZPG) microparticles containing mesalazine for colonic drug delivery //DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2010. – Т. 18. – №. 3. – С. 211. 35. Kim C. et al. Microfluidic synthesis of monodisperse pectin hydrogel microspheres based on in situ gelation and settling collection //Journal of Chemical Technology & Biotechnology. – 2017. – Т. 92. – №. 1. – С. 201-209. 36. Kosaraju S. L. Colon targeted delivery systems: review of polysaccharides for encapsulation and delivery //Critical reviews in food science and nutrition. – 2005. – Т. 45. – №. 4. – С. 251-258. 37. Kotla N. G. et al. Bioresponsive drug delivery systems in intestinal inflammation: Stateof-the-art and future perspectives //Advanced drug delivery reviews. – 2018. 38. Kruve A. et al. Tutorial review on validation of liquid chromatography–mass spectrometry methods: Part I //Analytica chimica acta. – 2015. – Т. 870. – С. 29-44. 39. Kruve A. et al. Tutorial review on validation of liquid chromatography–mass spectrometry methods: Part II //Analytica chimica acta. – 2015. – Т. 870. – С. 8-28. 40. Kyomugasho C. et al. Pectin nanostructure influences pectin-cation interactions and in vitro-bioaccessibility of Ca2+, Zn2+, Fe2+ and Mg2+-ions in model systems //Food Hydrocolloids. – 2017. – Т. 62. – С. 299-310. 41. Lopez-Sanchez P. et al. Cellulose-pectin composite hydrogels: Intermolecular interactions and material properties depend on order of assembly //Carbohydrate polymers. – 2017. – Т. 162. – С. 71-81. 42. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Pholin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. С. 265–275. 43. Markov P. A. et al. Mechanical properties, structure, bioadhesion, and biocompatibility of pectin hydrogels //Journal of Biomedical Materials Research Part A. – 2017. – Т. 105. – №. 9. – С. 2572-2581. 96

44. Mishra M., Chawla V., Chawla P. Pectin, beta-cyclodextrin, chitosan and albumin based gastroprotective systems for piroxicam maleate: Synthesis, characterization and biological evaluation //International journal of biological macromolecules. – 2019. – Т. 122. – С. 127-136. 45. Mishra R. K., Banthia A. K., Majeed A. B. A. Pectin based formulations for biomedical applications: a review //Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. – 2012. – Т. 5. – №. 4. – С. 1-7. 46. Moharana A. K. et al. Development and validation of UV spectrophotometric method for the determination of mesalamine in bulk and tablet formulation //Int J Pharm Pharm Sci. – 2011. – Т. 3. – №. 2. – С. 19-21. 47. Mongkolkitikul S., Paradee N., Sirivat A. Electrically controlled release of ibuprofen from conductive poly (3-methoxydiphenylamine)/crosslinked pectin hydrogel //European Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2018. – Т. 112. – С. 20-27. 48. Neufeld L., Bianco-Peled H. Pectin–chitosan physical hydrogels as potential drug delivery vehicles //International journal of biological macromolecules. – 2017. – Т. 101. – С. 852-861. 49. Nobilis M. et al. High-performance liquid-chromatographic determination of 5aminosalicylic acid and its metabolites in blood plasma //Journal of chromatography A. – 2006. – Т. 1119. – №. 1-2. – С. 299-308. 50. Noh J. et al. Microencapsulation by pectin for multi-components carriers bearing both hydrophobic and hydrophilic active agents //Carbohydrate polymers. – 2018. – Т. 182. – С. 172-179. 51. Paharia A. et al. Eudragit-coated pectin microspheres of 5-fluorouracil for colon targeting //AAPS pharmscitech. – 2007. – Т. 8. – №. 1. – С. E87-E93. 52. Pastorini E. et al. Development and validation of a HPLC-ESI-MS/MS method for the determination of 5-aminosalicylic acid and its major metabolite N-acetyl-5-aminosalicylic acid in human plasma //Journal of Chromatography B. – 2008. – Т. 872. – №. 1-2. – С. 99-106. 53. Penhasi A. Preparation and characterization of in-situ ionic cross-linked pectin films: II. Biodegradation and drug diffusion //Carbohydrate polymers. – 2017. – Т. 157. – С. 651-659. 54. Popov S. V. et al. In vitro gastrointestinal-resistant pectin hydrogel particles for βglucuronidase adsorption //Journal of Biomaterials science, Polymer edition. – 2017. – Т. 28. – №. 3. – С. 293-311. 55. Rai Y. et al. Mitochondrial biogenesis and metabolic hyperactivation limits the application of MTT assay in the estimation of radiation induced growth inhibition //Scientific reports. – 2018. – Т. 8. – №. 1. – С. 1531. 56. Rezvanian M. et al. Optimization, characterization, and in vitro assessment of alginatepectin ionic cross-linked hydrogel film for wound dressing applications //International journal of biological macromolecules. – 2017. – Т. 97. – С. 131-140. 57. Rodrigues S.C. et al. Preparation and characterization of collagennanohydroxyapatite biocomposite scaffolds by cryogelation method for bone tissue engineering applications // J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 2013. Vol. 101 A, № 4. P. 1080–1094. 97

58. Sambuy Y. et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics //Cell biology and toxicology. – 2005. – Т. 21. – №. 1. – С. 1-26. 59. Sawarkar S. P. et al. I n Vivo Evaluation of 5-ASA Colon-Specific Tablets Using Experimental-Induced Colitis Rat Animal Model //AAPS PharmSciTech. – 2015. – Т. 16. – №. 6. – С. 1445-1454. 60. Shah M. H., Reddy P. R. Y., Bhawanishankar M. AN IMPROVED STABLE ISOTOPE LIQUID CHROMATOGRAPHY TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE DETERMINATION OF N-ACETYL-5-AMINOSALICYLIC ACID AND ITS DERIVATIZED PARENT, 5-AMINOSALICYLIC ACID IN HUMAN PLASMA. – 2016. 61. Si L. et al. Calcium pectinate gel bead intended for oral protein delivery: preparation improvement and formulation development //Chemical and Pharmaceutical Bulletin. – 2009. – Т. 57. – №. 7. – С. 663-667. 62. Siddiqui M. R., AlOthman Z. A., Rahman N. Analytical techniques in pharmaceutical analysis: A review //Arabian Journal of chemistry. – 2017. – Т. 10. – С. S1409-S1421. 63. Singh C. K. et al. A review on novel approaches for colon targeted drug delivery systems //PharmaTutor. – 2018. – Т. 6. – №. 7. – С. 11-22. 64. Smith M. C. et al. In vitro co-culture models to evaluate acute cytotoxicity of individual and combined mycotoxin exposures on Caco-2, THP-1 and HepaRG human cell lines //Chemico-biological interactions. – 2018. – Т. 281. – С. 51-59. 65. Sriamornsak P. Chemistry of pectin and its pharmaceutical uses: A review //Silpakorn University International Journal. – 2003. – Т. 3. – №. 1-2. – С. 206-228. 66. Usov A. T., Bilan M. I., Klochkova N. G. Polysaccharides of Algae. Polysaccharide composition of several calcareous red algae: isolation of alginate from Corallina pilulifera P. et R. (Rhodophyta, Corallinaceae) // Bot. marina. 1995. V. 38. P. 43–51. 67. Vityazev F. V. et al. Pectin-silica gels as matrices for controlled drug release in gastrointestinal tract //Carbohydrate polymers. – 2017. – Т. 157. – С. 9-20. 68. Wood P. J., Siddiqui I. R. Determination of methanol and its application to measurement of pectin ester content and pectin methyl esterase activity // Analyt. Biochem. 1971. Vol. 39. P. 418– 428. 69. York W. S., Darvil A. G., McNeil M., Stevenson T. T. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components // Meth. Enzymol. 1986. V. 118. P. 3–40. 70. Zainudin B. H., Wong T. W., Hamdan H. Design of low molecular weight pectin and its nanoparticles through combination treatment of pectin by microwave and inorganic salts //Polymer Degradation and Stability. – 2018. – Т. 147. – С. 35-40. 71. Zhang Y., Sun T., Jiang C. Biomacromolecules as carriers in drug delivery and tissue engineering //Acta Pharmaceutica Sinica B. – 2018. – Т. 8. – №. 1. – С. 34-50. 72. Zlobin A. A. et al. Polysaccharides from the callus tissue of the rowan tree Sorbus aucuparia L. stem //Russian Journal of Bioorganic Chemistry. – 2014. – Т. 40. – №. 2. – С. 193-197. 98

73. Марков П. А. и др. Противовоспалительная активность пектинов и их галактуронанового кора //Химия растительного сырья. – 2010. – №. 1. 74. Оводов Ю. С. Современные представления о //Биоорганическая химия. – 2009. – Т. 35. – №. 3. – С. 293-310. пектиновых веществах 75. Оводова Р. Г. и др. Новейшие сведения о пектиновых полисахаридах //Известия Коми научного центра УРО РАН. – 2010. – №. 3 (3). 76. Попов С. В. и др. Химическая характеристика и противовоспалительное действие раувольфиана, пектинового полисахарида каллуса раувольфии змеиной //Биохимия. – 2007. – Т. 72. – №. 7. – С. 955-962. 77. Хотимченко Ю. С. и др. Фармакология некрахмальных полисахаридов //Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. – 2005. – №. 1. 78. Хотимченко Ю. С. Углеводные биополимеры для адресной доставки белковых препаратов, нуклеиновых кислот и полисахаридов //Тихоокеанский медицинский журнал. – 2014. – №. 2 (56). 79. Гюнтер Е.А. Пектиновые вещества клеточных культур растений [Текст]: автореф. дис. докт. биол. наук; Спец. 03.01.04 / ФГБУН Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН; Е.А.Гюнтер; науч.конс. Оводов Ю.С., Попов С.В. – Сыктывкар, 2012 – 41 с. 80. Коновалова М.В. Получение и исследование противоспаечных барьерных материалов на основе биополимеров пектина и хитозана [Текст]: дис. канд. биол. наук; Спец. 03.01.06 / ФГУ "ФИЦ "Фундаментальные основы биотехнологии" РАН" Институт биоинженерии; М.В.Коновалова; науч.рук. Курек Д.В. – Москва, 2017 – 118 с. 81. Попов С.В. Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов [Текст]: автореф. дис. докт. биол. наук; Спец. 03.01.04 / ФГБУН Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН; С.В.Попов; науч.конс. Оводов Ю.С. – Сыктывкар, 2010 – 39 с. 82. Оводова Р. Г., Бушнева О. А., Головченко В. В., Попов С. В., Оводов Ю. С. Способ получения из растительного сырья полисахаридов, обладающих иммуностимулирующим действием // Патент РФ №2149642 от 27.05. 00. (приоритет от 9.08.99.), БИ № 15. – 2000. 83. Bankowski Z., Howard-Jones N. International guiding principles for biomedical research involving animals //Geneva: WHO. – 1986. 84. DHHS U.S., FDA C. Guidance for industry: bioanalytical method validation. US Department of Health and Human Services //Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CV). – 2001. – Т. 2015. 85. European Medicines Agency. Guideline on bioanalytical method validation //Committee for Medicinal Products for Human Use (EMEA/CHMP/EWP/192217/2009). – 2011. 86. European Pharmacopoeia Commission et al. European Pharmacopoeia 8.0//Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines of European Council. – 2013. – Т.242 87. ГОСТ Р 33044-2014 «Принципы надлежащей практики». – 2015 – 08 – 01 – М.: Стандартинформ, 2015 – Т2. лабораторной 99

88. ГОСТ Р 56647-2015/ISO/TS 80004-6:2013. Нанотехнологии / Федер. агентство по техн. регулированию и метрологии. - Москва : Стандартинформ 89. Государственная фармакопея XIV [Текст]. – 2015. 90. Постановление главного государственного санитарного врача РФ от 29.08.2014 №51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарноэпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». – 2015 – 02 – 17. – Российская газета (специальный выпуск), № 24/1, 06.02.2015. 91. Приказ Минздравсоцразвития РФ №708н от 23.08.2010 г. «Обутверждении Правил лабораторной практики». – 2010 – 11 – 02. – Российская газета, №240, 22.10.2010. 92. Aulton M. E., Taylor K. M. G. (ed.). Aulton's Pharmaceutics E-Book: The Design and Manufacture of Medicines. – Elsevier Health Sciences, 2017. 93. Cree I. A. et al. (ed.). Cancer cell culture: methods and protocols. – Humana Press, 2011. 94. Khojasteh S. C., Wong H., Hop C. E. C. A. Drug metabolism and pharmacokinetics quick guide. – Springer Science & Business Media, 2011. 95. Kuo J. (ed.). Electron microscopy: methods and protocols. – Springer Science & Business Media, 2007. – Т. 369. 96. Macheras P., Iliadis A. Modeling in biopharmaceutics, pharmacokinetics, and pharmacodynamics, volume 30 of Interdisciplinary Applied Mathematics. – 2006. 97. Seymour G. B., Knox J. P. (ed.). Pectins and their manipulation. – Taylor & Francis, 2002. – Т. 15. 98. Stoddart M. J. (ed.). Mammalian cell viability: methods and protocols. – New York (NY): Humana Press, 2011. 99. Wilson C. G., Crowley P. J. (ed.). Controlled release in oral drug delivery. – Springer Science & Business Media, 2011. 100. Xu Q. A., Madden T. L. (ed.). LC-MS in drug bioanalysis. – Springer Science & Business Media, 2012. 101. Воробьев, Г. И. Неспецифические воспалительные заболевания кишечника / Г. И. Воробьев, И. Л. Халиф. - М. : Миклош, 2008. - 422 с. 102. Дергунова Е.А., Алиев Р.Т., Губкин И.Н., Коновалов П.В., Никуленков Е.В., Поликарпова М.В., Сергеев В.В. Лабораторный практикум по дисциплине «Материаловедение сверхпроводников». – М.: МИФИ, 2012. – 60 с. 103. Костенко В.Г. Хроматографический анализ сахаров, получаемых в процессе переработки растительного сырья. - М.: ОНТИТЭИмикробиопром, 1984. - 44 с. 104. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте: 3-е изд., перераб. и доп. / И.П. Западнюк, В.И. Западнюк, Е.А. Захария, Б.В. Западнюк – Киев: Высшая школа, 1983. – с.383. 105. Лебедев А. Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. - 493 с. 100

106. Наглядная иммунология / Г.-Р. Бурместер, А. Пецутто с участием Т. Улрихса и А. Айхер ; под ред. Л. В. Козлова ; пер. с англ. Т. П. Мосоловой. - Москва : Бином. Лаб. знаний, 2007. - 320 с. 107. Отто М. Современные методы аналитической химии. 3-е издание. - М.: Техносфера 2008. - 544 с. 108. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях: учебное пособие для системы медицинского и армацевтического послевузовского образования / под ред.: Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачев. – М.: Профиль, 2010. – с.358. 109. Схунмакерс П. Оптимизация селективности в хроматографии. – М.: Мир, 1989. – 399с. 110. Фармакология [Текст] : атлас : учебное пособие для студентов образовательных учреждений высшего профессионального образования, обучающихся по группе специальностей "Здравоохранение и медицинские науки" по дисциплине "Фармакология" / Х. Люлльман, К. Мор, Л. Хайн ; пер. с англ. под ред. А. А. Свистунова ; М-во образования и науки РФ. - Москва : Практическая медицина, 2016. - 373 с. 111. Pectin [Electronic Resource] / A Database of Polysaccharide 3D structure URL: http://polysac3db.cermav.cnrs.fr/discover_pectins.html 112. The PubChem Project [Electronic Resource] URL: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 113. Коллекция культур клеток позвоночных [Электронный ресурс] / Институт цитологии РАН URL: http://www.cytspb.rssi.ru/rkkk/katalog_ccc_v_incras_2018_rus.pdf 114. Мошковский С., Пташник О. 12 методов в картинках: протеомика [Электронный ресурс] / Биомолекула URL: https://biomolecula.ru/articles/12-metodov-v-kartinkakh-proteomika 115. База знаний о человеке [Электронный ресурс] URL: https:// humbio.ru 101

Приложение В (справочное) Список сокращений 4ASA, 4АСК 4-аминосалициловая кислота, ПАСК 5ASA, 5АСК 5-аминосалициловая кислота, месалазин BC Пектин бадана толстолистого CAc Пектин каллусной культуры бодяка полевого CDDS Система адресной доставки лекарств в толстый кишечник CP Пектин сабельника болотного DA Степень амидирования пектиновых полисахаридов DE Степень этерификации пектиновых полисахаридов ESI Электрораспылительный источник ионизации HPLC, ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография HPLC-MS, ВЭЖХ-МС Высокоэффективная жидкостная хромато-масс-спектрометрия HS Пектин борщевика сибирского HSc Пектин каллусной культуры борщевика Сосновского IBD, ВЗК Воспалительные заболевания кишечника LAc Пектин каллусной культуры люпина узколистого MRM Режим регистрации множественных переходов N-Pr-4ASA N-пропионил-4-аминосалициловая кислота N-Pr-5ASA N-пропионил-5-аминосалициловая кислота PBS Фосфатный буферный раствор SAc Пектин каллусной культуры рябины обыкновенной SCF Simulated colon fluid, Среда, имитирующая толстый кишечник SGF Simulated gastrial fluid, Среда, имитирующая желудок SIF Simulated intestinal fluid, Среда, имитирующая тонкий кишечник SVc Пектин каллусной культуры смолевки обыкновенной TVc Пектин каллусной культуры пижмы обыкновенной 102

БК Болезнь Крона ГФ Государственная фармакопея ЖКТ Желудочно-кишечный тракт КМЦ карбоксиметилцеллюлоза ЛС Лекарственное средство МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид СЭМ Сканирующая электронная микроскопия ЯК Язвенный колит 103

№ 1 Термин Абсорбция 2 Амфотерность 3 Аналит 4 Внутренний стандарт 5 Восстановление аналита Гастроэнтеральные среды 6 7 Гель (гранула) 8 Градиентное элюирование 9 Депротеинизация 10 Дериватизация 11 Деструкция 12 Инкубация Приложение Г (справочное) Список терминов Определение Химический или физический процесс впитывания одного вещества другим (лекарственного средства тканями организма). Способность некоторых соединений проявлять в зависимости от условий как кислотные, так и основные свойства. Определяемый компонент в пробе аналитического контроля. Компонент, имеющий сходное строение и физикохимические свойства с аналитом. В пробу вносится известное количество внутреннего стандарта. В ходе пробоподготовки происходят равные потери обоих компонентов. Концентрацию аналита определяют путем сравнения отношения сигналов определяемого вещества и стандарта на хроматограмме. Полнота экстракции (перехода) анализируемого компонента из исследуемого образца. Растворы неорганических солей с определенным значением рН, сходные по составу и имитирующие физиологические среды желудочно-кишечного тракта. Структурированные системы, состоящие из высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ. Наличие трехмерного полимерного каркаса придает механические свойства твердых тел: отсутствие текучести, способность сохранять форму, прочность и способность к деформации. Позволяет уменьшить продолжительность и повысить селективность анализа методом ВЭЖХ. В начале разделения используется слабая подвижная фаза (элюент) для смывания с колонки слабо сорбирующихся компонентов, затем сильный элюент для вымывания наиболее прочно удерживаемых веществ. Отделение белков и липидов, затрудняющих определение целевых компонентов, в ходе пробоподготовки биологических образцов для анализа методом ВЭЖХ. Один из методов химического анализа, который превращает анализируемое соединение в продукт (дериват, производное) с похожей химической структурой, но отличающейся реакционной способностью, растворимостью или др. Разрушение целостности структуры гранул путем их набухания и последующего растворения. Сопровождается вымыванием из гелей ионов кальция и лекарственного средства. Помещение образцов в экспериментальные (физиологические) условия на определенное время. 104

13 Ионизация 14 Ионное сшивание (ионные связи) 15 Ионный переход 16 Ионотропное гелеобразование 17 Каллусные культуры растений 18 Квадруполь 19 Клеточная линия млекопитающих 20 Контролируемое высвобождение лекарств 21 Масс-спектр 22 Масс-хроматограмма Эндотермический процесс образования ионов из нейтральных атомов или молекул. Положительно заряженный ион образуется, если электрон в молекуле получает достаточную энергию для преодоления потенциального барьера. Отрицательно заряженный ион образуется при захвате дополнительного электрона атомом с высвобождением энергии. Химические реакции, приводящие к росту молекулярной цепи за счет образования ионных связей. Ионная связь – сильная химическая связь между положительно и отрицательно заряженными ионами. Полученные во время ионизации молекулярные ионы подвергаются дополнительному разрушению в соударительной ячейке. Ионным переходом являются две массы, характерные для каждого соединения: m/z родительского иона, полученная после ионизации, и m/z дочернего иона, полученная после дополнительного разрушения. Реакция, которая сопровождается образованием пектинового геля с момента касания раствора пектина с раствором хлорида кальция. На поверхности капли образуется оболочка, которая удерживает сферическую форму и внутреннее жидкое содержимое. Гелеобразование происходит с учетом законов диффузии и массопереноса из внешней среды. Ионы кальция диффундируют в центр сферической формы, которая с течением времени превращается в сплошной гель. Неорганизованно пролиферирующая ткань, возникающая из дедифференцированных клеток. На месте ранения часть ткани утрачивает прежние связи с организмом, для их восстановления необходимо нарастание клеточной массы. Изолированные кусочки ткани поддерживают путем пассирования и выращивания в лабораторных условиях in vitro. Электрически нейтральная система заряженных частиц. Можно рассматривать как совокупность двух диполей с равными по величине, но противоположными по знаку дипольными моментами, расположенных на некотором расстоянии друг от друга. Культура однородных клеток, происходящих чаще всего от одной родительской пары клеток, и обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками. Группа лекарственных форм с измененным механизмом и характером высвобождения лекарственных веществ. Обеспечивают высвобождение в определенном участке организма. Зависимость интенсивности ионного тока (количества вещества) от отношения массы к заряду (природы вещества). Результат регистрирования зависимости сигнала 105

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 (концентрации компонентов) масс-спектрометрического детектора на выходе из колонки от времени. Матричный эффект Собирательное понятие, объединяющее ряд явлений, приводящих к изменению сигнала в зависимости от качественного и количественного состава анализируемой пробы, а также дрейф сигнала во времени. Метаболическая Скорость обмена веществ (метаболизма) – набора активность химических реакций, которые возникают в живом организме для поддержания жизни. Модификация гелей Направленное изменение характеристик геля с целью получения структуры, отвечающей определенным требованиям. Парентеральные Стерильные препараты, предназначенные для введения лекарственные формы путем инъекций, инфузий или имплантаций в организм человека или животного. Пероральные Препараты, которые принимаются через рот, путем лекарственные формы проглатывания лекарства. Полимеры Высокомолекулярные вещества, состоящие из мономерных звеньев, соединенных в длинные макромолекулы химическими или координационными связями. Прецизионность метода Степень близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных установленных условиях. Пролонгированное Группа лекарственных форм, из которых лекарственное высвобождение вещество высвобождается медленно и равномерно или лекарств порциями. Распределение в Переход лекарства из системного кровотока в органы и организме ткани организма. В работе под распределением также понимается переход лекарства из лекарственной формы в ткани желудочно-кишечного тракта, до попадания в системный кровоток. Селективность Возможность метода или методики определять или (избирательность) обнаруживать искомый компонент в присутствии других метода сопутствующих компонентов. Фармакокинетика Раздел фармакологии, изучающий кинетические закономерности химических и биологических процессов, происходящих с лекарственным средством в организме животного или человека. Хромато-массКомбинированный метод прямого качественного и спектрометрия количественного химического анализа сложных смесей, сочетающий хроматографическое разделение с массспектрометрическим анализом. Масс-спектрометрия – метод исследования вещества, основанный на определении отношения массы к заряду ионов. Цвиттер-ион Молекула, которая в целом электронейтральна, в своей структуре имеет части, несущие как отрицательный, так и положительный заряды. Электронная плотность Плотность вероятности обнаружения электрона в данной точке конфигурационного пространства (квантовой системе – атоме, молекуле, кристалле). 106

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв