Молекулярная эпидемиология вируса бешенства на территории Российской Федерации и оптимизация лабораторной диагностики рабической инфекции на основе методов амплификации нуклеиновых кислот

Андрей Девяткин

Молекулярная эпидемиология вируса бешенства на территории Российской Федерации и оптимизация лабораторной диагностики рабической инфекции на основе методов амплификации нуклеиновых кислот

Арктический регион уникален с точки зрения экологии вирусов. Во-первых, низкая температура и вечная мерзлота могут обеспечивать длительное сохранение микроорганизмов. Во-вторых, низкая плотность животных и интенсивная миграция могут быть причиной высокой скорости распространения вирусов в пространстве. Бешенство, будучи вирусным заболеванием, передаётся преимущественно путём прямого физического контакта. Для эффективной устойчивой трансмиссии обычно необходима высокая плотность популяции животных-переносчиков. Этот параметр постоянно меняется вследствие изменяющихся условий окружающей среды, и циклов «хищник-жертва» что может приводить к естественному вымиранию геновариантов вируса бешенства. Тем не менее после сокращения популяции животных-переносчиков до критического уровня и элиминации вируса популяция, как правило, быстро восстанавливается и становится восприимчивой для распространения новых геновариантов вируса. Результаты представленного исследования поддерживают эту модель, подразумевающую регулярное расширение и исчезновение вирусных популяций. Так, все вирусы бешенства в умеренных климатических зонах России имели общего предка всего около 150 лет назад, а распространение вируса во все степные регионы от Черного Моря до Тихого Океана произошло после 1943 года. По причине относительной суровости природных условий биоразнообразие фауны арктических пустынь ниже, чем в более экваториальных регионах. Например, сухопутные млекопитающие представлены только двумя видами: белыми медведями и песцами, что свидетельствует о хрупкости экосистемы. В марте арктический ледовый покров достигает максимальных значений, и все приполярные территории (Аляска, северная Канада, Гренландия, север России) образуют связанный единый экологический регион. Это подтверждается результатами наших исследований. В 2016 году на архипелаге Земля Франца-Иосифа был обнаружен труп песца (Alopex lagopus), находившегося в неестественной позе. Из образца мозговой ткани выделили нуклеиновую кислоту вируса бешенства в высокой концентрации. Анализ полногеномной последовательности этого штамма выявил, что ближайший родственный вирус бешенства был обнаружен на Аляске (США) в 2008 году. Последний общий предок этих двух вирусов существовал ориентировочно в 2000 году. В то же время, вирусы, выделенные в арктических областях Азии, не были ближайшими родственниками вируса с Земли Франца-Иосифа. Это свидетельствует о регулярных дальних миграциях полярных лисиц в пределах всего арктического региона. Таким образом, инфекционная заболеваемость песцов является показателем связанности ареалов обитания на всей огромной территории полярной зоны.

Биология

Диссертации

Вуз: Независимое исследование (нет вуза)

ID: 5aa3b4dd7966e145c68a7978

UUID: a15f9040-067c-0136-82b5-525400005860

Язык: Русский

Опубликовано: около 6 лет назад

Просмотры: 53

20.16

Андрей Девяткин

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова)

Комментировать 2

Рецензировать 2

Скачать - 4,0 МБ

Поделиться работой

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН» На правах рукописи Девяткин Андрей Андреевич Молекулярная эпидемиология вируса бешенства на территории Российской Федерации и оптимизация лабораторной диагностики рабической инфекции на основе методов амплификации нуклеиновых кислот 03.02.02 – вирусология диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.м.н. Лукашев А.Н. Москва – 2017

2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 14 1.1. Общая характеристика вируса бешенства......................................................... 14 1.1.1. Развитие представлений о бешенстве ......................................................... 14 1.1.2. Таксономия вируса бешенства ..................................................................... 17 1.1.3. Структура вириона вируса бешенства ........................................................ 24 1.1.4. Организация генома вируса бешенства ...................................................... 26 1.1.5. Особенности транскрипции генов, репликации генома и синтеза белка вируса бешенства ....................................................................................................... 27 1.1.6. Жизненный цикл вируса бешенства ............................................................ 29 1.1.7. Патогенез вируса бешенства ........................................................................ 31 1.2. Молекулярная эпидемиология вируса бешенства............................................ 32 1.2.1. Популяция вируса бешенства – динамическая сеть взаимосвязанных мутантных форм ......................................................................................................... 32 1.2.2. Распространение вируса бешенства в мире ................................................ 36 1.2.3. Распространение вируса бешенства в Российской Федерации ................ 36 1.2.4. Молекулярная эпидемиология бешенства на территории Российской Федерации ................................................................................................................... 38 1.3. Меры профилактики ............................................................................................ 41 1.3.1 История вакцинопрофилактики бешенства ................................................... 41 1.3.2 Современные меры профилактики бешенства .............................................. 42 1.3.3 Пути искоренения бешенства .......................................................................... 42 1.3.4 Опыт применения оральной вакцинации диких животных ......................... 46 1.4. Лабораторная диагностика бешенства .............................................................. 49

3 1.4.1. Необходимость применения лабораторных методов для идентификации возбудителя бешенства .............................................................................................. 49 1.4.2. Посмертная диагностика бешенства ........................................................... 51 1.4.3. Современные методы диагностики бешенства .......................................... 51 1.5. Предпосылки для данного исследования .......................................................... 54 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................... 55 2.1. Биологический материал ..................................................................................... 55 2.2. Использованные олигонуклеотиды ................................................................... 60 2.3. Секвенирование фрагментов генома вируса бешенства.................................. 64 2.3.1 Выделение РНК и синтез кДНК ...................................................................... 64 2.3.2 Амплификация фрагментов ДНК.................................................................... 65 2.3.3 Определение первичной нуклеотидной последовательности ...................... 65 2.4. Разработка набора реагентов для определения РНК вируса бешенства (Rabies virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени ..................................................................... 66 2.4.1 Положительные контрольные образцы .......................................................... 66 2.4.2 Условия постановки ОТ-ПЦР в реальном времени ...................................... 67 2.4.3 Определение чувствительности и специфичности набора реагентов. ........ 68 2.5 Филогенетический анализ ................................................................................... 69 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ............................................................................................. 77 3.1 Разработка набора реагентов для диагностики бешенства методом ПЦР в реальном времени .......................................................................................................... 77 3.1.1 Выбор праймеров и зонда ................................................................................ 77 3.1.2 Основные характеристики диагностического набора реагентов ................. 79 3.1.3 Практическое применение набора реагентов ................................................ 83

4 3.2 Филогенетический анализ штаммов вируса бешенства на основании выравнивания N-генов .................................................................................................. 85 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................................... 92 4.1 Усовершенствование лабораторной диагностики рабической инфекции на территории Российской Федерации ............................................................................ 92 4.2 Вирус бешенства как возможный этиологический агент энцефалитов неясной этиологии......................................................................................................... 94 4.3 Филогенетическое разнообразие геновариантов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации.......................................... 97 4.4 Заключение ......................................................................................................... 107 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 109 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .............................. 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 111

5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Бешенство – вирусное заболевание зоонозной природы с контактным механизмом передачи возбудителя, протекающее по типу энцефаломиелита и заканчивающееся летально [25]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики заболеваемости бешенством, а также в области создания антирабических вакцин [47], ежегодно в мире от болезни умирает более 55000 человек [11], что делает бешенство самым смертоносным зоонозом [52]. Основное число смертей приходится на страны Азии и Африки [70], причѐм предполагается, что вследствие отсутствия должного эпидемиологического надзора и развитой инфраструктуры клинико-диагностических лабораторий значительная часть случаев заболеваемости бешенством остаѐтся не выявленной [51]. По причине нехватки достоверных статистических данных о заболеваемости бешенством в мире сложно подсчитать суммарный экономический ущерб от рабической инфекции, но по приблизительным оценкам бешенство приводит к ежегодной потере более чем 2 000 000 человеко-лет [52]. Современные методы анализа нуклеотидных последовательностей позволяют выяснить эволюционную историю разных штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации, выделить основные геноварианты патогена, определить время расхождения разных эволюционных ветвей вируса бешенства. Подобный подход способен усовершенствовать эпидемиологический надзор за рабической инфекцией, способствуя лучшему пониманию динамики распространения бешенства и давая чѐткое представление о генетическом разнообразии патогена на исследуемой территории. В Российской Федерации описаны 6 основных филогенетических групп вируса бешенства, различающихся географической локализацией [21, 75, 82]. Последняя

6 работа, описывающая разнообразие геновариантов вируса бешенства на основании первичных нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вируса бешенства, была опубликована в 2004 году [75]. В этой работе описывается молекулярная эпидемиология бешенства на территории стран бывшего СССР на основании анализа 39 последовательностей N-гена (1353 оснований) и 55 фрагментов G-гена (405 оснований) штаммов, выделенных преимущественно в конце 1980х и в начале 1990х гг. Сведения о современной эпидемической ситуации по бешенству в Российской Федерации экономическом значении свидетельствуют рабической о серьѐзном инфекции. Так, социальном и 2007-2011 гг. в зарегистрировано 22 264 случаев бешенства у животных (из них 10916 диких, 6669 домашних, 4431 сельскохозяйственных животных) и 67 случаев у людей. Ежегодно вследствие травмирования животными порядка 200-400 тысяч людей обращаются за антирабической помощью [20]. В настоящее время в Российской Федерации для посмертной лабораторной диагностики бешенства животных преимущественно применяют метод флуоресцирующих антител (МФА), биологическую пробу на белых мышах, иммуноферментный анализ (ИФА) [4]. Метод флуоресцирующих антител основан на детекции специфического взаимодействия антигеном, антирабического содержащимся в иммуноглобулина цитоплазме со инфицированных специфическим клеток при окрашивании отпечатков головного мозга. Недостатком подобного подхода является необходимость высокой квалификации проводящего анализ специалиста. Лабораторная диагностика бешенства требует как можно более скорого, ясного и недвусмысленного результата экспертизы и основана на обязательном использовании нескольких методов, регламентированных на международном уровне [113]. В случае отрицательного или сомнительного результата МФА проводят постановку биологической пробы на белых мышах. Вспомогательным методом диагностики бешенства является иммуноферментный анализ.

7 Всѐ большее применение в диагностике бешенства получают молекулярногенетические методы, рекомендуемые ВОЗ к использованию в качестве дополнительных. На территории Российской Федерации имели место случаи, когда молекулярно-генетические методы явились основными. В 2009 году в Приморском крае из головного мозга пациентки, умершей от менингоэнцефалита неясной этиологии, на мышах-сосунках выделили вирус, который идентифицировали только через год благодаря использованию молекулярнобиологических методов [13]. Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений молекулярнобиологической диагностики инфекций является метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Причина подобного приоритетного статуса методики заключается в ряде ее преимуществ: 1. Высокая чувствительность – наличия исследуемой нуклеотидной последовательности в количестве десяти копий в пробе достаточно для еѐ детекции. 2. Высокая специфичность методики обусловлена выбором специфичных праймеров и зонда. 3. Время выполнения анализа после выделения нуклеиновых кислот не превышает 2 часов. 4. Высокая производительность анализа. Например, прибор Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science) позволяет проводить одновременный анализ до 72 образцов, прибор ДТ-96 (ДНК-технология) – до 96 образцов. 5. При использовании нескольких комбинаций праймеров и зондов появляется возможность диагностики в одной пробирке одновременно нескольких мишеней. На момент начала выполнения представленной работы в литературе не было описано отечественных разработок, позволяющих детектировать РНК вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационнофлуоресцентной детекцией. Степень разработанности темы исследования

8 В настоящее время в Российской Федерации при лабораторной диагностике бешенства аутопсийный материал исследуют преимущественно методом флуоресцирующих антител (МФА). В случае отрицательного или сомнительного результата МФА используют вспомогательные способы диагностики заболевания: метод выделения вируса бешенства на животных (белые мыши) или в культуре клеток, иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию диффузионной преципитации [50]. Прижизненная диагностика бешенства не практикуется. В рамках рекомендаций ВОЗ молекулярные методы диагностики бешенства играют вспомогательную роль, однако успешное использование данных методов является многообещающей практикой [48], внедрѐнной в ряде стран [50, 57, 59, 86, 108, 109]. В литературе описаны случаи, когда молекулярно-генетические методы являлись основными в диагностике у людей летальных инфекций, вызванных лиссавирусами. Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области, погибших в 2003 г. от энцефалита неясной этиологии, проводимая в рамках работы по расшифровке случаев нейроинфекций, стала возможна в первую очередь благодаря применению молекулярнобиологических методов [9]. В настоящее время технология ПЦР в реальном времени получила широкое применение в молекулярной диагностике, что обусловлено высокими показателями специфичности и чувствительности метода, а также высокой скоростью проведения анализа. Существенный недостаток подхода в случае применения его с целью идентификации РНК-вирусов заключается в том, что в силу высокой изменчивости генома патогенов (например, к виду Rabies virus относят вирусы, геномы которых имеют не менее 80% идентичных рибонуклеотидов [68]) проведение анализа путѐм постановки ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени может привести к ложно-отрицательному результату в случае присутствия в исследуемом материале геноварианта вируса, отличного от того, к которому были выбраны специфические праймеры и зонды. Несмотря на то, что описан ряд разработок, успешно внедренных в практику диагностики бешенства [50, 57, 59, 86, 108, 109], ранее не было

9 опубликовано работ, проверяющих работоспособность имеющихся методов на выборке российских геновариантов вируса бешенства. Более того, информация о генетическом разнообразии вируса бешенства на территории РФ могла быть недостаточно полной. Первая работа, описывающая генетическое разнообразие вируса бешенства на основании анализа 39 последовательностей N-гена (1353 оснований) и 55 фрагментов G-гена (405 оснований) штаммов, выделенных на территории бывшего СССР, была опубликована в 2004 г [75]. Авторы определили 5 филогрупп вируса бешенства, циркулирующего на территории бывшего Советского Союза: А) подгруппа «собственно арктических» вирусов бешенства (северная часть Евразии и Северной Америки); B) подгруппа «арктически-подобных» вирусов бешенства (Восточная Сибирь и Дальний Восток); C) подгруппа «степных» вирусов бешенства (степная и лесостепная зона РФ от Европейской части до Алтая и Саян); D) подгруппа «центрально-российских» вирусов бешенства (центр Европейской части РФ); E) подгруппа «северо-восточно-европейских» вирусов бешенства (северозападная часть РФ); В исследовании, опубликованном в 2007 г., подтверждаются и дополняются результаты предыдущей работы о молекулярной эпидемиологии бешенства в Российской Федерации [82]. Авторы дополнительно выделили подгруппу вируса бешенства, распространѐнную на Северном Кавказе. Благодаря развитию байесовых методов молекулярных часов стало возможно воспроизводить хронологию основных событий в эволюции вируса бешенства. Были проведены исследования для вирусов, изолированных в разных регионах мира [28, 39, 54, 56, 61, 74, 87, 94, 96, 101, 103, 115], однако до выполнения текущей работы целостная картина динамики распространения бешенства на территории Российской Федерации не была охарактеризована.

10 Цель исследования Усовершенствование и стандартизация методов лабораторной молекулярной диагностики бешенства на территории Российской Федерации на основе актуальных данных о циркулирующих геновариантах вируса. Задачи исследования 1. Описать филогенетические группы вируса бешенства, циркулирующие на территории Российской Федерации. 2. Провести филогенетический анализ фрагментов генома вируса бешенства. 3. Определить динамику распространения различных геновариантов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных стран. 4. Разработать и апробировать набор реагентов для определения РНК вируса бешенства (Rabies virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени. 5. Провести сравнительные испытания разработанного набора реагентов с существующими методами лабораторной диагностики бешенства. Научная новизна Впервые была воспроизведена хронология основных событий в эволюции вируса бешенства на территории Российской Федерации. Впервые в Российской Федерации определена первичная нуклеотидная последовательность геномов вирусов бешенства, выделенных из мозговой ткани человека (Homo Sapiens), медведя (Ursus Arctos), песца (Vulpes Lagopus).

11 Впервые разработан отечественный набор реагентов для диагностики бешенства путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени, для которого описаны основные аналитические характеристики. Проведено сравнение предлагаемого подхода в диагностике бешенства с «золотым стандартом» — методом биологической пробы на белых мышах. Теоретическая и практическая значимость. Использование разработанного набора реагентов позволило выявить присутствие РНК вируса бешенства в мозговой ткани двух пациентов, погибших в результате развития энцефалита неясной этиологии в Астраханской областной инфекционной больнице в 2003 году. Внедрение в лабораторную диагностику бешенства метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией повышает эффективность диагностики рабической инфекции. В ходе работы были проанализированы все нуклеотидные последовательности N-гена вируса бешенства, находящиеся в открытом доступе на момент выполнения исследования и описанные как выделенные на территории Российской Федерации. На основании филогенетического анализа описаны молекулярные механизмы популяционных перестроек, определены временные интервалы основных эволюционных событий. Было показано сравнительно низкое генетическое разнообразие популяции вируса бешенства. Выдвинуто предположение, что популяция вируса бешенства, находясь под давлением стохастических факторов окружающей среды, является нестабильной и может исчезать по естественным причинам. Добавление фактора оральной вакцинации диких плотоядных животных способно привести к искоренению вируса. Результаты проведѐнного филогенетического анализа свидетельствуют о том, что при условии проведения регламентированных мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных в отдельных регионах Российской Федерации возможна элиминация вируса бешенства. Тем не менее, дальнейшие полевые

12 исследования необходимы для разработки стратегии эффективной элиминации бешенства на федеральном уровне. Методология и методы исследования Работа выполнена с использованием общенаучных и специальных методов исследования (молекулярно-биологические, биоинформатические методы). Основной объем исследований проведен автором самостоятельно, отдельные этапы работы выполнены с участием коллабораторов и сотрудников лаборатории. Положения, выносимые на защиту Разработанная диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК штаммов классического вируса бешенства RABV применима как в рамках надзорных мероприятий, так и для диагностики бешенства у животных и человека. При помощи предлагаемого подхода проведена ретроспективная диагностика бешенства у пациентов, погибших в результате развития энцефалита неясной этиологии. Распространение вируса бешенства на Российской Федерации происходило в течение последних 500 лет, причем превалирующая группа степного бешенства возникла в середине 20 века. Показана передача вирусов бешенства арктической группы между континентами в течение последних десятилетий. Показана возможность антропогенного распространения вируса бешенства, выделяемого от диких животных. Степень достоверности и апробация результатов исследования

13 Достоверность проведению результатов исследований, определяется выполненных с комплексным использованием подходом к современных методов. При проведении филогенетических исследований были использованы стандартные методы оценки статистической значимости результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на научнопрактической конференции «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, 26-28 сентября 2013 года), на VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2014» (Москва, 18-20 марта 2014 года), на конференции молодых учѐных «Фундаментальная и прикладная микробиология» (Москва, 28 апреля 2014 года). По теме диссертации опубликовано десять научных статей, в том числе шесть статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, четыре в зарубежных журналах, индексируемых в международных системах цитирования (библиографических базах – Web of Science, Scopus, PubMed); пять публикаций в материалах научнопрактических конференций. Структура и объѐм диссертации Диссертационная работа изложена на 123 страницах. Список литературы включает 26 отечественных и 90 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 7 Таблицами и 22 рисунками.

14 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая характеристика вируса бешенства 1.1.1. Развитие представлений о бешенстве Бешенство – вирусное заболевание теплокровных животных и человека, характеризующееся тяжелым прогрессирующим поражением центральной нервной системы. Первое упоминание об инфекции зафиксировано в законах из Эшнуны – одном из старейших законодательных кодексов Месопотамии, который датируется XIX веком до н.э. В случае заражения человека бешенством в результате укуса собаки, хозяин животного был обязан выплатить штраф в размере 2/3 мины (~400 г) серебра [91]. Древнегреческий писатель Гомер уподобляет литературного персонажа Гектора бешеной собаке, свидетельствуя о том, что древние греки также были знакомы с рабической инфекцией [65]. Древнеримский учѐный Цельс впервые выдвинул гипотезу о передаче патогена через слюну [73]. Римлянин допускал возможность излечения больного от бешенства путѐм насыщения организма водой. Неизлечимость болезни привела к возникновению суеверий. Например, в средневековой Европе почитали святого Губерта — священника, жившего в Льеже в VIII веке, впоследствии канонизированного католической церковью. Считалось, что святой был способен излечить больного от бешенства молитвой. В результате появления культа святого-покровителя, защищающего от рабической инфекции, выработался ритуал: человек, покусанный животным, приходил к священнослужителю; больной подставлял лоб священнику, который делал надрез, «отпарывая» небольшой лоскут кожи, чтобы вложить фрагмент одеяния святого

15 Губерта. Затем лоб обвязывали чѐрной повязкой. Ежегодно проводили до 800 подобных «операций» [65]. Переход из Средневековья в эпоху Возрождения привел к смене господствующих концепций и методов познания. В 1546 году венецианский врач Джироламо Фракасторо точно описал в трактате «О контагии, о контагиозных болезнях и лечении» механизм заражения, инкубационный период и клиническую симптоматику бешенства [23]: «Вот что наблюдается при этом контагии. Во-первых, известно, что его не получают ни от соприкосновения, ни от очага, ни на расстоянии, но только в том случае, когда при укусе собаки кожа разрывается настолько, что выступает кровь, как будто контагий образуется в самой крови вследствие соприкосновения с зубом и пеной бешеного животного. Затем он распространяется так медленно и продолжительно, что поражение лишь очень редко проявляется ранее двадцатого дня; как сообщают, большей частью оно выявляется спустя тридцать дней, у многих только через четыре или шесть месяцев; у некоторых только через год, а иногда и через пять лет. Я сам видел мальчика, у которого контагий проявился восемь месяцев после укуса и который вскоре же погиб. В течение этого времени человек не ощущает никакой горячки, никакого иного недомогания; больной не знает, какая погибель в нѐм таится; он быстро начинает ощущать еѐ, когда она достигает сердца. Дойдя до последнего, она начинает причинять человеку невероятные мучения; сердце и внутренности терзаются; больной не может ни стоять, ни отдохнуть, но, как безумный, носится и туда и сюда, разрывая тело руками и тяжко страдая от жажды. Но тут присоединяется ещѐ одно величайшее страдание: больной настолько боится воды и всего жидкого, что предпочитает умереть, но только не напиться или приблизиться к воде. Тогда же больные и сами кусают других. Рот у них покрыт пеной, взгляд дикий; наконец, изнурѐнные, несчастные больные испускают дух». В 1804 году Георг Цинке доказал, что бешенство передаѐтся через слюну. Учѐный втирал слюну бешеной собаки в надрезы в передней лапе здоровой собаки. Животное заболевало на седьмой день. На восьмой день собака

16 отказывалась от еды и воды, избегая окружающих. На десятый день в полной мере проявлялись клинические симптомы бешенства [65]. Важнейший прорыв в области разработки методов лечения гидрофобии произошѐл в 1885 году, когда французский микробиолог Луи Пастер разработал и успешно применил вакцину против бешенства. Учѐный полагал, что патоген в ходе своих метаболических процессов выделяет отходы, тормозящие «развитие вируса». Микробиолог подвергал воздействию высоких температур и иссушению спинной мозг животных, погибших от бешенства. В результате инъекции полученного материала в подопытных собак учѐный обнаружил, что животные становились абсолютно невосприимчивыми к вирусу бешенства [60]. Впервые работоспособность вакцины на человеке проверили на 9-летнем мальчике (Йозеф Мейстер), который был сильно покусан бешеной собакой. Ребѐнок, получивший в совокупности 13 инокуляций, выжил [67]. Итальянский микробиолог Адельчи Негри, работая в лаборатории Камило Гольджи, выполнял окрашивание по Манну (обработка водным раствором метиленового синего и эозина) гистологических препаратов мозговой ткани животных. В течение нескольких месяцев учѐный протестировал 75 собак, 50 из которых погибли вследствие развития рабической инфекции. В нейронах гиппокампа (устар. аммонов рог) больных животных учѐный обнаружил внутриклеточные включения, которые отсутствовали у здоровых собак. В 1903 году Негри сделал сообщение в медицинском сообществе Павии (Италия), связав наличие внутриклеточных телец с развитием инфекции. Подобные включения, как ошибочно полагал микробиолог, представляли собой скопления паразитического агента (якобы принадлежащего к царству Простейшие) — возбудителя бешенства [30]. Несколько месяцев спустя французский учѐный Поль Ремленже, работая в Константинополе, показал вирусную природу бешенства. Ремленже смешал гомогенат мозговой ткани, содержащий фиксированный вирус бешенства, с культурой возбудителя птичьей холеры (Pasteurella multocida); пропустил смесь через фильтр; инокулировал кроликов фильтратом. Отсутствие Pasteurella

17 multocida в зараженных животных подтвердило успешность фильтрации. В то же время последующая смерть кроликов доказала то, что возбудитель бешенства проходит через бактериальные фильтры, т.е. является вирусом [64]. 1.1.2. Таксономия вируса бешенства Классический вирус бешенства, Rabies virus (RABV) — нейротропный (–) РНК вирус, принадлежащий к порядку Mononegavirales (mono — одиночный, nega — «негативная» минус-цепь РНК, т.к. геном представителей порядка представляет собой одноцепочечную молекулу РНК, продукт транскрипции которой кодирует белки), семейству Rhabdoviridae (от греч. rhabdos – стержень, т.к. вирионы представителей семейства имеют продолговатую форму), роду Lyssavirus (Lyssa – древнегреческая богиня, персонификация бешенства). Помимо семейства Rhabdoviridae, в состав порядка Mononegavirales входят 3 других семейства: Paramyxoviridae, Bornaviride и Filoviridae (Рисунок 1). Рисунок 1. Бескорневое филогенетическое древо представителей порядка Mononegavirales, аминокислотных построенное последовательностей на основании консервативного выравнивания домена III

18 полимеразы [68]. Используемые аббревиатуры: avian parainfluenza virus types 3 (APMV3), avian parainfluenza virus types 4 (APMV4), avian parainfluenza virus types 6 (APMV6), Beilong virus (BeV), Fer de Lance virus (FDLV), J virus (JV), Menangle virus (MenV), Tioman virus (TioV), Tupaia paramyxovirus (TupV), avian bornavirus (ABV), avian metapneumovirus (AMPV), avian parainfluenza virus types 2 (APMV2), Borna disease virus (BDV), bovine ephemeral fever virus (BEFV), canine distemper virus (CDV), hendra virus (HeV), human metapneumovirus (HMPV), human respiratory syncytial virus (HRSV), infectious hemorraghic necrosis virus (IHNV), lettuce necrotic yellows virus (LNYV), Marburg virus (MarV), measles virus (MeV), maize mosaic virus (MMV), mumps virus (MuV), Newcastle disease virus (NDV), Nipah virus (NiV), parainfluenza virus type 3 (PIV3), pneumonia virus of mice (PVM), rabies virus (RabV), Sendai virus (SeV), simian virus 5 (SV5), Sonchus yellow net virus (SYNV), vesicular stomatitis Indiana virus (VSV), viral hemorrhangic septicemia virus (VHSV), Zaire ebolavirus (ZeboV) . У семейств Paramyxoviridae, Rhabdoviridae и Filoviridae наблюдают ряд сходных характеристик: схема организации генома (3’нетранслируемая область [НТО] – гены коровых белков – гены оболочечных белков – ген РНК-зависимой РНК-полимеразы — 5’ НТО); нуклеокапсид со спиральным типом симметрии; инициация транскрипции ассоциированной с вирионом РНК-зависимой РНКполимеразой с единственного 3’ промотора; использование механизма стоп-старт для транскрипции для каждого гена; комплементарность 5’ и 3’ концов генома [69]. Rhabdoviridae — одно из самых разносторонних с точки зрения занимаемых экологических ниш семейств РНК-содержащих вирусов [110]. Семейство Rhabdoviridae состоит из более чем 185 вирусов, носителями которых могут быть как растения, так и животные. Форма вирионов рабдовирусов пулевидная или палочкообразная. В 9-м докладе международного комитета по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) в состав

19 семейства были включены 6 родов: Vesiculovirus, Lyssavirus, Ephemerovirus, Novirhabdovirus, Cytorhabdovirus и Nucleorhabdovirus [68]. Представители родов Vesiculovirus, Lyssavirus и Ephemerovirus выделены из большого числа представителей царства Животные (млекопитающие, рыбы, беспозвоночные), которые являются хозяевами и переносчиками патогенов. Вирусы трѐх других родов обладают большей специфичностью в плане выбора организма-хозяина: новирабдовирусы инфицируют морских и пресноводных рыб, в то время как циторабдовирусы и нуклеорабдовирусы, переносчиками которых являются членистоногие, способны заражать растения [36]. Ожидается, что в обновлѐнном перечне утверждѐнных видов вирусов в составе семейства Rhabdoviridae будут выделены уже 10 родов: Vesiculovirus, Lyssavirus, Ephemerovirus, Novirhabdovirus, Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus, Perhabdovirus, Sigmavirus, Sprivivirus, Tibrovirus и Tupavirus [62].

21 Рисунок Филогенетическое 2. древо 100 аминокислотных последовательностей полимеразы рабдовирусов [110]. Цвет ветвей указывает известных переносчиков патогена. Известные хозяева указаны символами. Длина горизонтальных ветвей отображает число аминокислотных замен на 1 позицию. Узлы, для которых показатель бутстрэп-поддержки (bootstrap proportion values) превышает 85%, обозначены символом *. Роды Cytorhabdovirus, Novirhabdovirus и Nucleorhabdovirus были исключены из анализа, т.к. в их присутствии не достигалось надѐжное укоренение древа В другой работе авторы, основываясь на филогенетическом исследовании консервативных фрагментов белка полимеразы, утверждают, что в состав семейства Rhabdoviridae следует в дополнение к утверждѐнным родам включить еще 7 новых родов: Almendravirus, Bahiavirus, Curiovirus, Hapavirus, Ledantevirus, Sawgravirus and Sripuvirus (Рисунок 2) [110]. Для значимой части рабдовирусов, изолированных из растений, беспозвоночных и позвоночных животных, экологические особенности остаются неясными. В то же время существует убеждѐнность в ключевой роли насекомыхпереносчиков в эволюции рабдовирусов. Жизненный цикл лиссавирусов, успешно адаптировавшихся беспозвоночных к циркуляции в среде переносчиков, является млекопитающих нетипичным для без участия представителей семейства Rhabdoviridae. Эволюционная реконструкция представителей рода Lyssavirus показывает, что, скорее всего, в прошлом у представителей рода произошла смена хозяина-носителя с насекомых на млекопитающих [46]. Все лиссавирусы являются нейротропными инфекционными агентами, вызывающими необратимые поражения головного мозга человека и теплокровных животных. Представители отряда Хищные (лат. Carnivora) являются основным естественным резервуаром для собственно вируса бешенства (Rabies virus), в то время как летучие мыши (отряд Рукокрылые — лат. Chiroptera) — для большинства остальных лиссавирусов.

22 В 9-м докладе ICTV на основании филогенетического родства и антигенных характеристик род Lyssavirus подразделяют на две филогруппы: филогруппа 1 (RABV, Australian bat lyssavirus (ABLV), Duvenhage virus (DUVV), European bat lyssaviruses 1 и 2 (EBLV1 и EBLV2), Aravan virus (ARAV), Khujand virus (KHUV), Irkut virus (IRKV)) и филогруппа 2 (Lagos bat virus (LBV), Mokola virus (MOKV)). Следует отметить, что наиболее отличающийся представитель рода - West Caucasian bat virus (WCBV) не был отнесѐн ни к одной из филогрупп [68]. В обновлѐнном перечне утверждѐнных видов вирусов в состав рода Lyssavirus добавлены 3 генотипа: Shimoni bat virus (SHIBV) [филогруппа 2], Bokeloh bat lyssavirus (BBLV) [филогруппа 2] и Ikoma lyssavirus (IKOV) [62]. С другой стороны, в научной литературе существуют публикации, в которых на основании филогенетических исследований предполагается возможным объединить IKOV и WCBV в филогруппу 3 (Рисунок 3) [52]. Таким образом, род Lyssavirus включает большое количество разнообразных вирусов, число которых постоянно растет. Несмотря на наличие генетически сильно отличающихся друг от друга видов лиссавирусов, наибольшее эпидемиологическое и эпизоотологическое значение имеет классический вирус RABV, поскольку он является этиологическим агентом подавляющего большинства случаев бешенства, зарегистрированных у животных и человека. Прочие лиссавирусы имеют ограниченные ареалы распространения и ограниченный круг хозяев, которыми в первую очередь являются летучие мыши. Вследствие этого инфицирование человека происходит в единичных случаях (Рисунок 3).

23 Рисунок 3. Филогенетическое древо лиссавирусов, построенное на основании выравнивания фрагментов N-гена (405 нуклеотидов). На основании предполагаемых антигенных характеристик вирусы разделены на филогруппы. Известное количество случаев заболеваний человека указано в скобках рядом с человеческим силуэтом. Полные названия вирусов приведены в тексте. Таким образом, семейство Rhabdoviridae объединяет многочисленные вирусы, способные заражать основные таксоны эукариот (надкласс Рыбы (Pisces),

24 класс Пресмыкающиеся (Reptilia), класс Птицы (Aves), класс Млекопитающие (Mammalia), тип Членистоногие (Arthropoda), царство Растения (Plantae)). Вирусы рода Lyssavirus заражают только млекопитающих и также отличаются разнообразием, однако только вирус бешенства распространѐн практически повсеместно и регулярно вызывает заболевания домашних животных и человека. 1.1.3. Структура вириона вируса бешенства Вирионы вируса бешенства имеют пулевидную форму, то есть представляют собой подобие изменѐнного цилиндра, у которого одно из оснований полусферическое (Рисунок 4). Длина вирусной частицы составляет в среднем 180 нм (возможный диапазон значений: 130–250 нм), диаметр вириона в среднем 75 нм (возможный диапазон значений: 60–110 нм). Следует отметить, что помимо вирусных частиц обычной формы можно наблюдать так называемые дефектные интерферирующие (ДИ) частицы, которые отличаются от стандартных вирионов размером (в меньшую сторону) и формой (конической). ДИ-частицы не способны к самостоятельному воспроизведению, т. к. геном дефектной формы вируса сильно редуцирован, его размер не превышает 66% от размера нормального генома. ДИ-частицы реплицируются за счѐт ресурсов стандартных вирионов вируса бешенства. Считается, что подобная стратегия может быть выгодна для замедления размножения вируса за счѐт ингибирования излишне быстрого распространения патогена [65]. конкурентного

25 Рисунок 4. Строение вириона вируса бешенства [111] Геномная РНК вируса бешенства способна выступать в качестве матрицы для транскрипции и репликации только при условии, что она находится в комплексе с тремя вирусными белками (нуклеопротеин, фосфопротеин и полимераза), формируя рибонуклеопротеиновый (РНП) комплекс. Подобно другим (–) РНК вирусам, рибонуклеиновая кислота вируса бешенства защищена нуклеопротеином. В состав белка входят 2 основных домена, каждый из которых связан с 9 рибонуклеотидами [29]. Искусственно синтезированный нуклеопротеин вируса бешенства взаимодействует с любой РНК независимо от еѐ происхождения. Отметим, что в случае совместного синтеза нуклеопротеина с фосфопротеином способность нуклеопротеина к неспецифическому связыванию РНК значительно уменьшается. Таким образом фосфопротеин регулирует образование РНП, выступая в качестве шаперона для нуклеопротеина [95]. Вследствие ассоциации РНП комплекса с матриксным белком, выполняющим каркасную функцию, нуклеокапсид приобретает типичную для

26 представителей семейства Rhabdoviridae пулевидную форму. Таким образом, матриксный белок выступает в качестве связующего структурного звена между РНП-комплексом и вирусной оболочкой, состоящей из гликопротеина и плазматической мембраны. Гликопротеин является гликозилированным белком, образующим трѐхпиковые выступы — пепломеры, расположенные на вирусной оболочке. 1.1.4. Организация генома вируса бешенства Геном вируса бешенства представляет собой одноцепочечную несегментированную минус-цепь РНК (длина генома ≈12 kb). Пять вирусных белков (нуклеопротеин (N), гликопротеин (G), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), РНК-зависимая РНК-полимераза (L)) транслируются с продукта транскрипции молекулы РНК (Рисунок 5). Короткие (58 и 70 нуклеотидов) некодирующие последовательности на 3’ и 5’ концах генома называются лидерной и трейлерной последовательностями, соответственно [104]. Первые и последние 8 консервативны нуклеотидов в пределах вирусной вида, РНК что обратно является комплементарны классической и чертой представителей порядка Mononegavirales. 5 генов разделены между собой короткими некодирующими межгенными участками, представляющими собой 1 динуклеотид (N-P), 2 пентануклеотида (P-M, M-G) или 1 длинную 423нуклеотидную последовательность (G-L). Участок между G и L генами называют псевдогеном (Ψ), или «остаточным» геном [105].

27 Рисунок 5. Организация генома вируса бешенства. Гены разделены вариабельными межгенными участками (intergenic sequences). Некодирующие регионы на концах генома состоят из 3’ лидерной (Le RNA) и 5’ трейлерной (Tr RNA) последовательностей [65]. Лидерная последовательность является сигнальным участком для узнавания матрицы вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой (L) и/или полимеразным комплексом (L + P). Трейлерная последовательность участвует в терминации транскрипции и репликации генома. Каждый ген состоит из внутреннего кодирующего участка, окружѐнного некодирующими регионами, которые фланкированы сигналами инициации транскрипции (СИТ) и сигналами терминации транскрипции и полиаденилирования (СТТП). Консенсусная последовательность СИТ (3’UUGURRNGA-5’) строго консервативна в пределах рода Lyssavirus. Консенсусная последовательность СТТП (3’-[A/U]CUUUUUUUG-5’) содержит 7 уридинов, которые итеративно копируются РНК-полимеразой для синтеза поли(А)-хвоста мессенджерной РНК. 1.1.5. Особенности транскрипции генов, репликации генома и синтеза белка вируса бешенства Транскрипция генов и репликация генома вируса бешенства находится под строгим контролем ряда факторов. В то время как стратегия некоторых других рабдовирусов (например, вируса везикулярного стоматита) нацелена на

28 максимально быстрое воспроизводство патогена, вирус бешенства стремится предотвратить гибель инфицированных клеток по двум причинам. Во-первых, гибель заражѐнных нейронов приведет к прекращению нейронального транспорта, вследствие чего вирусные частицы не смогут оказаться в центральной нервной системе, где происходит массивная репликация вируса. В этом случае нарушится жизненный цикл патогена – вирус не сможет достигнуть слюнных желез, где наблюдается наиболее продуктивная экскреция вирионов. В результате вариант вируса, вызывающий цитопатогенный процесс в нейронах, неизбежно прекратит циркуляцию в окружающей среде. Во-вторых, синтез вирусных белков (особенно гликопротеина) в высокой концентрации может вызвать сильный гуморальный иммунный ответ организма, который нейтрализует вирус до того, как он завершит жизненный цикл. Регуляторные механизмы вируса бешенства эволюционировали таким образом, чтобы производить компоненты вириона с одной стороны в оптимальных количествах, необходимых для эффективного воспроизводства вируса, с другой — настолько малых, что вирусу удаѐтся избегать активации иммунной системы, а также не препятствовать выполнению жизненно важных функций клеток хозяина [49]. После высвобождения в цитоплазму хозяйской клетки рибонуклеопротеиновый комплекс (РНП) переходит из конденсированной и скрученной формы в релаксированную и становится способным к активной транскрипции. Показано, что репликация и транскрипция вируса бешенства преимущественно происходит в тельцах Негри – цитоплазматических включениях в заражѐнных нейронах [77]. Полимеразный комплекс, состоящий из РНК-зависимой РНК-полимеразы и фосфопротеина, транскрибирует вирусную РНК. Транскрипция начинается с 3’ конца геномной РНК и приводит к появлению короткой некэпированной неполиаденилированной лидерной РНК (лРНК) длиной 55-58 п.о. Затем происходит последовательный синтез кэпированных с 5’ конца и

29 полиаденилированных мессенджерных РНК (мРНК), с которых впоследствии транслируются вирусные белки. Общепринятой моделью транскрипции у вируса бешенства является так называемая стоп-старт модель, согласно которой полимеразный комплекс останавливается при полиаденилирования, считывании сигнала терминации игнорирует межгенные участки транскрипции и и возобновляет транскрипцию при считывании сигнала инициации транскрипции. Успешная реинициация транскрипции происходит не всегда, поэтому количество произведѐнных мРНК уменьшается в направлении от 3’ к 5’ концу геномной РНК вируса бешенства. Таким образом, последовательность кодирующих участков в геноме влияет на уровень транскрипции вирусных генов. Дополнительным регуляторным фактором является длина межгенного участка – чем длиннее участок, тем больше вероятность того, что полимеразный комплекс не сможет перейти через него. Лидерная РНК также способна регулировать транскрипцию генов вируса бешенства. Поскольку нуклеопротеин связывается с лидерной РНК в 10 раз сильнее, чем с другими вирусными мРНК, было высказано предположение о том, что лРНК содержит сигнальную последовательность, стимулирующую взаимодействие нуклеопротеина с РНК [114]. В случае справедливости описанной гипотезы логичен следующий механизм: при наработке достаточного количества нуклеопротеина белок начинает «обволакивать» полноантигеномную молекулу РНК, прекращая транскрипцию и инициируя репликацию генома вируса бешенства. 1.1.6. Жизненный цикл вируса бешенства Жизненный цикл вируса бешенства можно условно разделить на 3 стадии. Первый этап состоит из связывания поверхностных белков вируса с рецептором хозяйской клетки, вхождения в клетку путѐм эндоцитоза, последующего слияния мембран вируса и эндосомы, высвобождения генома патогена в цитоплазму.

30 Вторая стадия включает в себя транскрипцию генов, синтез белков и репликацию генома вируса. На заключительной стадии происходит сборка вириона и выход из зараженной клетки. Для присоединения вируса к хозяйской клетке необходимо присутствие гликопротеина, что было продемонстрировано в экспериментах с заражением клеточных культур вирусом бешенства, содержащим делецию в гене, кодирующем этот белок [95]. На сегодняшний день остаѐтся неизвестной молекула хозяйской клетки, которая взаимодействует с гликопротеином, опосредуя тем самым вход вируса. Первоначально потенциальным кандидатом на указанную роль был никотиновый ацетилхолиновый рецептор (н-холинорецептор). Так как н-холинорецептор расположен на постсинаптической мембране мышечной клетки и отсутствует на пресинаптической мембране нейрона, представляется маловероятным то, что этот рецептор используется при вхождении вириона в мотонейроны. Вероятнее всего, н-холинорецептор повышает концентрацию вирусных частиц в нейро-мышечном соединении, увеличивая эффективность заражения нейронов. Другими возможными рецепторами являются молекула адгезии клеток нервной ткани (NCAM) и рецептор фактора роста нервов (NGFR, p75NTR). Было экспериментально показано, что резистентные к вирусу клеточные линии становятся восприимчивы к инфекции после наработки белка NCAM. В то же время, при связывании молекулы специфическими антителами и взаимодействии рецептора с лигандом инфекционная способность вируса бешенства снижалась [102]. С другой стороны, мыши, нокаутные по гену, кодирующему NCAM, остаются восприимчивы к вирусу бешенства, хотя развитие инфекционного процесса протекает дольше. Это может указывать на то, что рецептор, с одной стороны, не является незаменимым компонентом каскада патогенеза, с другой — выполняет важную роль в его осуществлении. Синтез NGFR (подобно NCAM) делает возможным заражение вирусом бешенства невосприимчивых клеток. В то же время, разницы между патогенезом инфекции у мышей дикого типа и мышей, несущих делецию NGFR, не

31 наблюдали. Считается, что этот рецептор может функционировать только совместно с какими-то другими поверхностными белками клетки, так как при инфицировании первичных афферентных нейронов, продуцирующих NGFR, заражаются только 25% клеток [106]. Таким образом, в настоящее время конкретный механизм проникновения вируса в клетку остаѐтся неясным. После взаимодействия гликопротеина вируса с поверхностными белками клетки вирион попадает в клетку по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза, что подразумевает образование ограниченных мембраной везикул, которые содержат в себе вирусные частицы. Во время везикулярного транспорта pH окружающей вирион среды падает, вызывая конформационные изменения гликопротеина, что приводит к слиянию оболочки вируса и мембраны эндосомы [67]. В результате лишѐнный оболочки вирион оказывается в цитоплазме хозяйской клетки. Матриксный белок, ингибирующий переход рибонуклеопротеинового комплекса в релаксированную форму, диссоциирует. Рибонуклеопротеиновый комплекс оказывается в цитоплазме инфицированной клетки, инициируя процессы транскрипции генов, репликации генома и синтеза белков вируса бешенства. После того, как произошла наработка достаточного количества компонентов вириона, образуются новые рибонуклеопротеиновые комплексы; начинается сборка вирусных частиц, которая продолжается до тех пор, пока заражѐнная клетка остаѐтся метаболически активной. РНП-комплекс переходит в конденсированную форму и стабилизируется при помощи матриксного белка, который выполняет главную роль при высвобождении вируса из клетки [80]. Вирион формируется на цитоплазматической мембране и отпочковывается без лизиса клетки. Процесс почкования опосредован взаимодействием матриксного белка с белками клеточного происхождения, участвующими в образования мультивезикулярных телец (поздних эндосом) [69]. 1.1.7. Патогенез вируса бешенства

32 Заражение человека обычно наступает при укусах, реже при ослюнении повреждѐнных участков кожи больными бешенством животными. Вирус реплицируется в поперечно-полосатой мышечной ткани в области повреждения. Затем патоген инфицирует нерв периферической нервной системы и мигрирует по направлению к центральной нервной системе (ЦНС) со скоростью 50–100 мм в день. После достижения тканей головного мозга наблюдается обильная репликация вируса в нейрональных клетках, приводящая к неврологическим нарушениям. Вирион передаѐтся от клетки к клетке через синаптические соединения. При появлении первых неврологических симптомов бешенства не происходит значительных гистопатологических изменений. Центробежное распространение бешенства по организму из ЦНС приводит к тому, что РНК вируса бешенства можно обнаружить в скелетной и сердечной мускулатуре, надпочечниках, почках, сетчатке, поджелудочной железе, а также в нервах вокруг волосяных фолликулов. Особенно обильная экскреция вируса происходит в слюнных железах, что делает возможным передачу бешенства другому теплокровному животному [111]. 1.2. Молекулярная эпидемиология вируса бешенства 1.2.1. Популяция вируса бешенства – динамическая сеть взаимосвязанных мутантных форм Возбудителем бешенства является вирус, геном которого представляет собой одноцепочечную несегментированную цепь РНК отрицательной полярности, т.е. комплементарную мРНК. РНК-зависимая РНК-полимераза вируса не обладает 3'-5'-экзонуклеазной корректирующей активностью, вследствие чего при репликации генома патогена с высокой вероятностью возникают ошибки. Это приводит к существованию динамической сети мутантных вариантов [Рисунок 6А] [78]. В результате вирус бешенства не существует в форме однородного, дискретного объекта, а представляет собой

33 квазивид, совокупность различных геновариантов, которые минимально отличаются от консенсусной последовательности генома [Рисунок 6Б]. В относительно стабильных для патогена условиях (например, геновариант хорошо адаптирован к организму хозяина) нуклеотидный код консенсуса остаѐтся практически неизменным. Периодически (например, при каждой передаче новому хозяину) вирусная популяция подвергается переходу через так называемое «бутылочное горлышко», когда передается только малая часть общей популяции вируса. Субпопуляция вируса, успешно преодолевшая возникшее препятствие – «основатель линии», может обладать нуклеотидной последовательностью, отличной от консенсусной. Иногда подобный «основатель» значительно улучшит свою приспособленность к новой окружающей среде, но чаще всего он отличается от своих прародителей лишь незначительным количеством нейтральных мутаций [65]. Потенциальная значимость существования вирусной популяции в виде дискретных форм была показана на штамме адаптированного к собакам вируса бешенства. В гене, кодирующем гликопротеин, обнаружили возникшие под давлением отбора точечные мутации, однозначно связав их присутствие с гетерогенной природой изначальной вирусной популяции [32].

34 Рисунок 6. Вирусные популяции в качестве сети взаимосвязанных мутантных форм. А) консенсусная последовательность (серая линия) – некий усреднѐнный вариант последовательностей штаммов вируса. Неточность репликации приводит к появлению множества дискретных, первоначально слабо различающихся появляющиеся во геновариантов время вируса. репликации, Единичные обозначены мутации, разноцветными трегольниками. Б) Совокупность квазивидов вируса изображена в виде связного графа, вершинами (разноцветные шары) которого являются разные геноварианты Вершины (каждый графа обладает соединены между уникальной собой приспособленностью). рѐбрами (чѐрные линии), представляющими собой последовательность мутационных изменений [78]. Разные геноварианты вируса приспособлены к различным условиям, что делает систему динамически подвижной и устойчивой. При попадании вирусных частиц в определѐнный вид ткани большая часть популяции будет вытеснена более приспособленными для этих условий индивидами. Схожая картина будет наблюдаться при попадании вирионов в организм с ослабленным или нормальным иммунитетом, при инфицировании новых видов (Рисунок 7).

35 Рисунок 7. Динамика вирусной популяции под влиянием отбора, происходящего в организме хозяина. Взаимосвязанная сеть исходных геновариантов вируса изображена на диаграмме в центре рисунка. Каждый дискретный квазивид представлен шаром, цвет которого иллюстрирует приспособленность штамма. Все геноварианты связаны между собой генетической сетью. В случае изменения внешних условий изменяется представленность мутантных форм в соответствии с тем, для каких условий отдельно взятый представитель вируса лучше адаптирован (репликация протекает эффективнее в ткани A или в ткани Б, в организме А или организме Б и т.д.). Большая часть геновариантов плохо адаптированы к новым условиям окружающей среды (серые шары). Однако, чем больше фенотипическое разнообразие исходной популяции основателя, тем больше вероятность того, что хотя бы один из геновариантов успешно приспособится к изменившемуся внешнему окружению [78].

36 1.2.2. Распространение вируса бешенства в мире Бешенство относится к зоонозам с контактным механизмом передачи возбудителя. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики [47], случаи заболевания бешенством ежегодно регистрируются на всех континентах за исключением Антарктиды [11]. В мире существует значительное количество вариантов вируса бешенства, каждый из которых соответствует своему животному-носителю в определенной географической местности. Для контроля и мониторинга распространения вируса бешенства необходимо обладать средствами дифференцирования вирусных геновариантов. На протяжении последних 20 лет используют как антигенные, так и молекулярно-генетические методики типирования вирусов бешенства. Постоянно растущее число работ по филогенетике вируса бешенства позволяет утверждать, что огромное разнообразие изолятов вируса бешенства группируются в ограниченное число основных подвидов вируса: линия (lineage) эндемичных американских изолятов (выявлены только в Новом Свете, основные переносчики – летучие мыши); линия арктических изолятов (распространены на приполярных территориях Евразии и Северной Америки, в центральной и южной Азии, носителями являются хищные млекопитающие), «собачья» линия вирусов в западной Африке; «мангустовая и виверровая» линия вирусов в Южной Африке; «космополитные» (не привязанные к определенному региону) изоляты (ассоциированные с собаками в Европе, на Ближнем Востоке, в Азии, большей части Африки; ассоциированные с мангустами, скунсами и собаками на территории обеих Америк и Карибского региона). Широкую представленность космополитных изолятов объясняют высокой колонизаторской активностью людей в XVI–XVIII веках [85]. 1.2.3. Распространение вируса бешенства в Российской Федерации

37 На территории Российской Федерации бешенство является эндемичным заболеванием. Ежегодно более 250 тысяч человек вследствие укусов животных подвергаются риску заражения вирусом бешенства и нуждаются в проведении экстренной вакцинопрофилактики. В период 2007-2011 гг. зарегистрировано 22 264 случаев бешенства животных и 67 случаев бешенства людей [21]. Ежегодно случаи заболеваемости бешенством среди животных регистрируются в большинстве субъектов Российской Федерации (Рисунок 8). Рисунок 8 Карта неблагополучия субъектов Российской Федерации по бешенству (по данным СМИ) [17] Несмотря на проведение организационных и профилактических мероприятий, направленных на борьбу с инфекцией, наблюдается тенденция ухудшения эпизоотической обстановки по бешенству на территории Российской Федерации [21].

38 1.2.4. Молекулярная эпидемиология бешенства на территории Российской Федерации Первая работа, описывающая молекулярную эпидемиологию бешенства на основании анализа 39 последовательностей N-гена (1353 оснований) и 55 фрагментов G-гена (405 оснований) штаммов, выделенных на территории бывшего СССР, была опубликована в 2004 г [75]. Авторы выделили 5 дискретных филогрупп вируса бешенства, циркулирующего на территории бывшего Советского Союза (Рисунок 9): А) подгруппа «собственно арктических» вирусов бешенства (северная часть Евразии и Северной Америки); B) подгруппа «арктически-подобных» вирусов бешенства (Восточная Сибирь и Дальний Восток); C) подгруппа «степных» вирусов бешенства (степная и лесостепная часть РФ от Европейской части до Алтая и Саян); D) подгруппа «центрально-российских» вирусов бешенства (центр Европейской части РФ); E) подгруппа «северо-восточно-европейских» вирусов бешенства (северозападная часть РФ);

39 Рисунок 9. Карта бывшего СССР, показывающая распространение вируса бешенства (окрашено серым цветом). Буквами (A, B, C, D, E) обозначены разные филогруппы [75]. Описанные геноварианты вируса соответствовали в конкретных географических регионах. В то же время, связь филогруппы с определѐнным видом животного-переносчика была не столь очевидна. Основной хозяин однозначно соотносился с геновариантом вируса только в Арктическом районе (песец Vulpes lagopus) и на Дальнем Востоке (енотовидная собака Nyctereutes procyonoides). В других регионах распространение вируса бешенства, скорее всего, ассоциировано с популяциями лисиц (Vulpes corsac и Vulpes vulpes). В первые десятилетия XX века в Европе основными переносчиками бешенства были городские собаки и волки. В это время происходил плавный эволюционный процесс, связанный с приобретением вирусом способности циркулировать в новой популяции – популяции диких лисиц [37]. Следует отметить, что инфицирование животного лиссавирусом, происходящим из

40 популяции патогена, циркулирующей в организме «резервуарного хозяина» другого вида, вероятнее всего приведѐт к быстрой смерти нового хозяина и прерыванию линии патогена (подобное явление наблюдается при заражении бешенством людей), что является невыгодным событием с точки зрения выживания вируса. Первоначально случаи передачи вируса от собак не приводили к устойчивой циркуляции в популяции диких лисиц Восточной Европы, что отражено в записях о высокой смертности среди животных [100]. Заражѐнных лисиц стали обнаруживать на советско-польской границе в 1940-х годах. Впоследствии инфицированные животные распространялись в западном направлении со средней скоростью 30–60 км в год [30], достигнув Франции к 1968 [37]. Таким образом, возникновение и распространение бешенства лисиц в Европе в 20 веке является хорошо документированным историческим фактом. В то время как в западной части Российской Федерации местность преимущественно лесистого типа, районы распространения вирусов бешенства подгруппы C представляют собой степи и лесостепи. В подобном биотопе потенциальная скорость миграции животных существенно выше и достигает 160– 513 км/год [75], благодаря чему геноварианты вируса типа С могут распространяться в степных регионах Российской Федерации с высокой скоростью. В исследовании, опубликованном в 2007 г., были подтверждены и дополнены результаты предыдущей работы по молекулярной эпидемиологии бешенства в Российской Федерации [82]. Авторы дополнительно выделили подгруппу вируса бешенства, распространѐнную на Северном Кавказе. Таким образом, Российская Федерация является эндемичным по бешенству государством с несколькими генетически разными дискретными линиями вируса. Для разработки эффективной стратегии эпидемиологического надзора за инфекцией, недопущения ухудшения эпизоотической ситуации по бешенству,

41 разработки стратегии эрадикации вируса необходимо понимание динамики распространения патогена во времени. 1.3. Бешенство является Меры профилактики природно-очаговым зоонозом, переносчиками («резервуарами») которого являются теплокровные животные. Передача инфекции людям является итогом патогенных процессов в организме поражѐнных болезнью животных. В результате заболевания животное становится агрессивным, что повышает вероятность передачи вируса – агрессивное животное, в слюне которого есть вирусные частицы, скорее покусает другое животное и передаст ему инфекцию. Случаи заражения бешенством человека от другого человека неятрогенным путѐм не описаны. Для бешенства люди выступают в качестве «тупиковых» хозяев. 1.3.1 История вакцинопрофилактики бешенства Первым шагом в борьбе с бешенством было введение в медицинскую практику экстренной вакцинопрофилактики для людей, покусанных животными, при малейшем подозрении на наличие рабической инфекции в животном. Со времени первого успешного применения антирабической вакцины Луи Пастером в 1885 году был достигнут значительный прогресс в области иммунопрофилактики бешенства. В начале 1900х гг. Ферми и Семпл предложили проводить инактивацию заражѐнной вирусом нервной ткани фенолом, что значительно снизило вероятность заражения пациента вакцинным штаммом патогена [65]. Несмотря на очевидные преимущества вакцин Ферми и Семпла перед предыдущим поколением препаратов, новые вакцины обладали существенным

42 недостатком – в них мог оставаться живой фиксированный вирус бешенства, что делало вакцину потенциально небезопасной. Кроме того, медикамент содержал в себе иммуногенный белок – миелин, что создавало вероятность возникновения поствакцинальных неврологических осложнений. Важной вехой в развитии специфической иммунотерапии бешенства стал переход от нервно-тканевых вакцин к инактивированным вакцинам нового поколения, созданных с использованием клеточных культур (клеточная линия WI38, первичная культура клеток почек сирийского хомяка, культура клеток куриного эмбриона, перевиваемая культура клеток Vero) и лишѐнных перечисленных выше недостатков [16]. С 1984 года ВОЗ рекомендовал прекратить применение вакцин Ферми и Семпла, заменив их более современными препаратами [113]. 1.3.2 Современные меры профилактики бешенства В настоящее время в Российской Федерации для проведения экстренной иммунопрофилактики развития бешенства используют вакцину антирабическую культуральную концентрированную очищенную инактивированную сухую (КОКАВ), представляющую собой вакцинный вирус бешенства (штамм Внуково-32) 30-38 пассажа, выращенный на первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, инактивированный ультрафиолетовым излучением, а затем концентрированный и очищенный методами ультрафильтрации, ультрацентрифугирования или ионообменной хроматографии. Для предотвращения развития инфекции в ряде случаев («тяжѐлые» укусы, иммунодефицитные пациенты) необходимо совместное применение антирабической вакцины и антирабического иммуноглобулина [16, 113]. 1.3.3 Пути искоренения бешенства

43 Как правило, люди сталкиваются с домашними животными чаще, чем с дикими; поэтому следующим закономерным шагом (после внедрения успешной практики вакцинопрофилактики бешенства у человека) в борьбе с бешенством было введение плановой вакцинации домашних животных. При проведении плановой вакцинации преимущественно применяют инактивированные вакцины, хотя в настоящее время имеются разные варианты препаратов: атенуированные вакцины (признаны небезопасными) и живые рекомбинантные вакцины (в США зарегистрирован препарат для кошек, представляющий собой рекомбинантный вирус оспы канареек, синтезирующий гликопротеин вируса бешенства, белки калицивируса, герпесвируса и вируса панлейкемии кошек). Домашние животные могут заразиться бешенством в случае контакта с дикими животными, среди которых может циркулировать вирус (Рисунок 10). Заключительным шагом искоренения бешенства должно стать удаление патогена из популяции диких животных. Одним из возможных путей достижения этой цели первоначально считалось установление контроля над численностью популяции диких животных путѐм отстрела и/или стерилизации. Однако при превышении некоторого показателя изъятия животных из популяции возникает опасность полного истребления вида, что чревато экологическими последствиями. В случае недостижения этого критерия не будет оказано значимого эффекта на плотность популяции вследствие высокого репродуктивного потенциала и мобильности диких животных [30, 84].

44 Рисунок 10. Циркуляция вируса бешенства в природе. Патоген персистирует в популяции диких животных. От диких животных вирус передаѐтся домашним животным и людям контактным механизмом. Инфицированные домашние животные способны заразить людей. Более эффективным методом является проведение оральной вакцинации диких животных. Оральная вакцина представляет собой съедобную приманку, содержащую аттенуированный штамм вируса. При этом нет потребности в поголовной вакцинации всех диких животных – необходимо создать иммунную прослойку особей, невосприимчивых к инфекции. Больное животное способно покусать конечное число других особей; если достаточная часть особей будет иммунизирована, то линия передачи вируса будет скорее прерываться, чем продолжаться, и циркуляция вируса станет невозможна.

45 Следует отметить, что все представители вида RABV относятся к единому серотипу. В результате этого применение антирабической вакцины приводит к возникновению универсальных по отношению к любому геноварианту вируса классического бешенства нейтрализующих антител. Рисунок 11. Взаимосвязь между долей вакцинированных лисиц (ось ординат) и плотностью животных [особей/км2] (ось абсцисс). Заштрихованная область показывает значения, при которых бешенство ликвидируется [30]. Пояснения см. в тексте. Существует математическая модель, дающая чѐткий ответ на вопрос о необходимой доле иммунизированных животных (рассчитано для популяции лисиц Vulpes Vulpes в Европе) [30]: (формула 1) где

46 p — доля вакцинированных лисиц; R — число случаев передачи вируса от 1 заражѐнной лисицы; Число случаев передачи вируса (R) от 1 заражѐнной лисицы можно формализовать в следующем виде: (формула 2) где σ — величина, обратная инкубационному периоду 13 лет-1); значения доли (~ [инкубационный период принят равным 1/13 года]* β — коэффициент передачи инфекции; [~79,69 км2/год]* К — плотность популяции лисиц; [~1 особь/км2]* a — уровень рождаемости на 1 лисицу; [~ 1 особь/год]* α — уровень смертности больных животных; [~ 73 особи/год]* * приблизительные оценки для популяции европейских лисиц. Таким образом, при превышении порогового вакцинированных животных, определѐнного по приведѐнной выше формуле, вирус прекращает персистировать в популяции (Рисунок 11). 1.3.4 Опыт применения оральной вакцинации диких животных Разработка аттенуированных оральных вакцин во второй половине ХХ века предоставила уникальную возможность искоренения рабической инфекции, циркулирующей на европейском субконтиненте [33]. Первая успешная попытка практического применения нового типа вакцин имела место в Швейцарии в 1978 году. Вскоре этот подход стал наиболее распространѐнным методом искоренения бешенства в популяции диких животных. Многообещающие результаты первых полевых испытаний в 1980-х годах привели к разработке и внедрению длительных программ оральной вакцинации диких животных [84].

47 Рисунок 12. Территории, на которых осуществляли оральную вакцинацию диких животных в 1978-2014 гг. Разные цвета обозначают соответствующие вакцины [84] Начиная с 1978 года общая площадь территории, на которой проводили оральную вакцинацию диких животных, составила более 2,5 миллионов км 2 (Рисунок 12). Всего было использовано 10 препаратов, основанных на разных линиях ослабленного вируса, и 1 рекомбинантный препарат (V-RG) – модифицированный вирус осповакцины (Vaccinia virus), синтезирующий гликопротеин вируса бешенства линии ERA. Первоначально (в 1978–1984 гг.) приманка представляла собой куриную голову, начинѐнную пакетиком из алюминиевой фольги и пластика с 1,8 мл вакцины (SAD). Впоследствии в качестве съедобного компонента использовали рыбную муку. В приманку вкладывали ѐмкость для препарата, изготовленную из разных материалов (парафин, полимерные соединения или кокосовый жир).

48 Суммарно с 1978 по 2014 г. использовали примерно 665 миллионов доз вакцины со средней плотностью распределения 20 приманок/км2. В результате проводимая на протяжении десятилетий программа по оральной вакцинации диких животных привела к ликвидации бешенства в популяции диких животных в отдельных странах западной и центральной Европы (например: Франция, Бельгия, Германия, Австрия, Чехия) и значительно снизила распространенность вируса в ряде других государств (например: Польша, Венгрия, Словакия) (Рисунок 13) [53]. Рисунок 13 А. Зарегистрированные случаи бешенства среди млекопитающих (за исключением летучих мышей) в 1991 году. Б. Зарегистрированные случаи бешенства среди млекопитающих (за исключением летучих мышей) в 2014 году. В. Территории, на которых в 2005-2014 гг. проводили оральную вакцинацию диких животных. [Rabies Information System of the WHO Collaboration Centre for Rabies Surveillance and Research. http://www.who-rabies-bulletin.org/Queries/Maps.aspx]. Было отмечено, что успешная реализация программы целиком и полностью зависит от строгого соблюдения требований по контролю и мониторингу результатов мероприятия. В случае бессистемного выборочного участия отдельно взятых регионов страны положительный результат полностью исключается. Наглядным примером служит первый опыт применения оральных вакцин в Чехии (1989 г.) и Польше (1992 г.), безуспешный в силу организационных проблем. Впоследствии в этих странах перешли к планомерному использованию чѐтко регламентированной «Баварской модели» — сплошной многократной

49 интенсивной вакцинации диких животных [15]. Подобная практика привела к тому, что в Чехии с 2003 года не было зарегистрировано ни одного случая заражения бешенством среди диких животных, домашних животных и людей, в то время, как в 1991 году этот показатель составлял 1097 случаев. В Польше в настоящее время вирус не искоренен, однако заметна положительная динамика: в 1991 году зарегистрировано 2288 случаев заражения бешенством, в 2014 – 98. [Rabies Information System of the WHO Collaboration Centre for Rabies Surveillance and Research. http://www.who-rabies-bulletin.org/Queries/Dynamic.aspx]. В Российской Федерации неоднократно пытались внедрить в практику программы оральной вакцинации диких животных. В 1998 г. в 25 регионах использовали 1 050 000 доз вакцины «Лисвульпен» (линия вируса SAD Bern); в 1999 г. в 28 субъектах федерации использовали 1 030 000 доз препарата «Синраб» (линия вируса RV 97); в 2000 г. в 29 регионах использовали 941 000 доз вакцины. Новосибирская, Челябинская, Свердловская, Оренбургская, Курганская, Курская, Тульская, Смоленская, Калужская области, республики Татарстан, Башкортостан были включены в программу. В 1998 г. на территории перечисленных субъектов было зарегистрировано 683 очага бешенства диких животных, в 2000 г. - 126. В ряде других регионов вакцина применялась бессистемно [1]. Описываемые эпизодические масштабные мероприятия проводили без должного соблюдения требований по контролю и мониторингу результатов, что привело к отсутствию долгосрочных положительных результатов [15]. 1.4. Лабораторная диагностика бешенства 1.4.1. Необходимость применения лабораторных методов для идентификации возбудителя бешенства Вирус бешенства — нейротропный инфекционный агент, вызывающий необратимые поражения головного мозга человека и теплокровных животных. Теоретически инфекция вирусом бешенства может быть причиной любого случая

50 энцефалита. Установление достоверной причины развития энцефалита является непростой задачей, требующей обязательного подтверждения диагноза лабораторными методами. Предварительная диагностика бешенства не вызывает затруднений в случае возникновения болезни у человека после укуса животным, в организме которого вирус бешенства обнаружили лабораторными методами. Наличие специфических клинических симптомов (например, гидрофобия и аэрофобия) значительно повышает вероятность идентификации болезни. Тем не менее в случае отсутствия информации о контактах больного с животными до развития болезни и/или отсутствия выраженных симптомов диагностика бешенства, основанная исключительно на клинической симптоматике, представляется ненадѐжной [113]. В силу возможности течения болезни в паралитической (тихой) форме, во время которой не проявляются явные клинические симптомы, значительная доля случаев бешенства может быть не диагностирована [42]. По этой причине бешенство необходимо рассматривать в качестве вероятной причины развития острого энцефалита неясной этиологии. Наличие контакта с животными в анамнезе также не является абсолютно надежным диагностическим критерием. В литературе описаны случаи заражения рабической инфекцией в результате трансплантации органов. Например, в 2005 году в Германии 6 реципиентам пересадили легкое (пациент 1), почку (пациент 2), почку и поджелудочную железу (пациент 3), печень (пациент 4), роговицу (пациент 5), роговицу (пациент 6) от погибшего донора, не проверенного на предмет наличия вируса бешенства. Спустя 42 дня у первых трѐх пациентов наблюдали впоследствии развитие к клинических летальному симптомов исходу. бешенства, Пациент 4 приведших прошѐл курс вакцинопрофилактики против бешенства в 1990 году; концентрация вируснейтрализующих антител сохранилась на достаточном для предотвращения развития инфекции уровне, что было показано при исследовании отобранной перед операцией сыворотки больного. После выяснения обстоятельств

51 случившегося реципиентам роговицы провели экстренную вакцинопрофилактику против бешенства и предотвратили развитие болезни [92]. 1.4.2. Посмертная диагностика бешенства В силу особенностей патогенеза бешенства во время длительного инкубационного периода (описан случай, в котором между заражением человека инфекцией и проявлением клинических симптомов бешенства прошло не менее 8 лет [34]) практически заболевание, поэтому нет возможности распространение достоверно патогена в идентифицировать организме является непредсказуемым. Как правило, концентрация циркулирующих антител достигает детектируемых значений не ранее, чем через неделю после начала проявления клинических признаков бешенства [65]. Поэтому прижизненная диагностика бешенства не практикуется. Кроме того, при прижизненной диагностике бешенства существует высокая вероятность получения ложно-отрицательных результатов, что является неприемлемым. Например, было показано, что при проведении прижизненной диагностики бешенства путѐм постановки ОТ-ПЦР для 9 случаев (с подтверждѐнным впоследствии диагнозом бешенства) результат ОТ-ПЦР был положительным в 5 случаях исследования слюны и 2 случаях исследования ликвора [41]. В настоящее время при лабораторной диагностике бешенства исследуют преимущественно аутопсийный материал — ткани головного мозга, где концентрация вирусных частиц является максимальной. Показано, что концентрация РНК вируса в мозговой ткани погибшего от бешенства человека превышает концентрацию РНК вируса в слюне в 250–200 000 раз, в коже — в 1 000–16 666 раз [92]. 1.4.3. Современные методы диагностики бешенства

52 Микроскопическое исследование тканей головного мозга, окрашенных методом флуоресцирующих антител (МФА) (Рисунок 14), является признанным «золотым стандартом» в диагностике бешенства, относительно которого оцениваются другие пути идентификации патогена [50]. Сущность метода заключается в реакции меченых флуорохромом антител с вирусным нуклеокапсидом и наблюдении светящихся комплексов «антитело-антиген» при помощи люминесцентного микроскопа (Рисунок 13) [4]. Б A Рисунок 14. А. Зоны локализации вирусного антигена в отпечатке головного мозга инокулированных вирусом бешенства белых мышей (Метод флуоресцирующих антител) Б. Биологическая проба на белых мышах [изображение предоставлено Полещук Е.М.]. В случае отрицательного или сомнительного результата МФА используют вспомогательные способы диагностики заболевания: метод выделения вируса бешенства на животных (белые мыши) или в культуре клеток, иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию диффузионной преципитации [113]. При диагностике бешенства животных путѐм выделения вируса наиболее достоверным методом исследования материала считается метод биологической пробы на мышах [112], который заключается в выделении вируса от больных и падших животных путѐм инокуляции суспензии мозга или иного материала белым мышам и последующей идентификации патогена. Небольшие фрагменты ткани, взятой из разных областей головного мозга, смешиваются, затем готовится единая гомогенизированная суспензия, которой впоследствии интрацеребрально инокулируют лабораторных мышей. Заражѐнных животных осматривают

53 ежедневно в течение 30 суток. Мышей, у которых наблюдают клинические симптомы бешенства (например, тремор, параличи, нарушение координации движения) подвергают эвтаназии и исследуют методом МФА наличие вирусного антигена в мозговой ткани. Значимым недостатком биопробы (помимо необходимости содержать виварий, а также проблем биоэтического характера) является длительность проведения анализа — с момента инокуляции до начала проявления клинической картины бешенства, как правило, проходит не менее недели. В рамках рекомендаций ВОЗ молекулярные методы диагностики бешенства играют вспомогательную роль, однако их успешное использование является многообещающей практикой [48], внедрѐнной в ряде стран [50, 57, 59, 86, 108, 109]. В литературе описаны случаи, в которых молекулярно-генетические методы являлись основными в диагностике у человека летальной инфекции, вызванной лиссавирусами. Например, в 2009 году в Приморском крае из головного мозга пациентки, умершей от менингоэнцефалита неясной этиологии, на мышахсосунках выделили вирус, который идентифицировали благодаря использованию молекулярно-биологических методов [13]. Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области, погибших в 2003 г. от энцефалита неясной этиологии, проводимая в рамках работы по расшифровке случаев нейроинфекций, стала возможна в первую очередь благодаря применению молекулярно-биологических методов [9]. В настоящее время одним из наиболее широко применяемых методов молекулярной диагностики является технология ПЦР с детекцией в реальном времени. Это обусловлено высокими показателями специфичности и чувствительности метода, а также высокой скоростью проведения анализа. Существенный недостаток метода в случае применения для идентификации РНКвирусов заключается в том, что в силу высокой изменчивости и генетического разнообразия генома патогенов (например, к виду Rabies virus относят вирусы, геномы которых имеют не менее 80% идентичных рибонуклеотидов [68]) проведение анализа путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени может

54 привести к ложно-отрицательному результату в случае присутствия в исследуемом материале геноварианта вируса, отличного от того, на который были выбраны специфичные праймеры и зонды. 1.5. Предпосылки для данного исследования Бешенство – широко распространѐнное на территории Российской Федерации вирусное заболевание животных. Для разработки эффективной стратегии эпидемиологического надзора над инфекцией необходимо понимание динамики распространения патогена в реальном времени, но последняя работа, описывающая разнообразие геновариантов вируса бешенства на основании первичных нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов широкой выборки штаммов вируса бешенства, была опубликована в реферируемом журнале в 2004 году [75]. Современные методы филогенетического анализа, которые стали доступны в 2008–2010 гг., позволяют проводить реконструкцию эволюционной истории вирусов во времени, но анализ репрезентативной выборки российских штаммов вируса бешенства ранее не выполнялся. В настоящее время одним из наиболее широко применяемых методов молекулярной диагностики является технология ПЦР в реальном времени. Это обусловлено высокими показателями специфичности и чувствительности метода, а также высокой скоростью проведения анализа. Применение молекулярногенетических методов в диагностике бешенства способствует повышению эффективности мероприятий по эпидемиологическому надзору за бешенством. Описан ряд технологий, успешно внедренных в практику диагностики бешенства в зарубежных странах [50, 57, 59, 86, 108, 109], однако ранее в литературе не было опубликовано данных об отечественных разработках подобных методов.

55 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Биологический материал Для определения первичной нуклеотидной последовательности вируса бешенства с целью дизайна диагностических олигонуклеотидов в работе использовали материал 28 штаммов RABV. Штаммы изолировали из источников, собранных в период 2003–2011 гг., в том числе от диких (14 шт.), домашних (5 шт.) и сельскохозяйственных (9 шт.) животных на территориях Ненецкого АО (4 шт.), республики Дагестан (4 шт.), республики Тыва (4 шт.), республики Хакасия (2 шт.), Воронежской области (1 шт.), Тверской области (2 шт.), Омской области (1 шт.), Липецкой области (2 шт.), Алтайского края (2 шт.), Красноярского края (2 шт.), Астраханской области (2 шт), Приморского края (1 шт.), Архангельской области (1 шт.) (Таблица 1). С целью оценки диагностической чувствительности метода ОТ-ПЦР в реальном времени в работе использовали 23 образца первичного положительного по бешенству материала (Таблица 2), для 8 из которых (8202, 8247, 8300, 8313, 8315, 8317, 8318, 1п8202) была известна концентрация вируса в LD50. Для определения диагностической специфичности метода ОТ-ПЦР в реальном времени использовали 22 образца, охарактеризованных методом биологической пробы на белых мышах как не содержащие вирус бешенства (Таблица 3). В работе для оценки аналитической специфичности метода ОТ-ПЦР в реальном времени использовали нуклеиновые кислоты следующих вирусов и млекопитающих: сем. Rhabdoviridae (вирус Араван, вирус Худжанд), сем. Bunyaviridae (вирус Тягиня, вирус Батаи, вирус Дхори, вирус крымской геморрагической лихорадки, вирус Инкоо); сем. Reoviridae (вирус Кемерово, ротавирус); сем. Togaviridae (вирус Чикунгунья, вирус жѐлтой лихорадки, вирус Синдбис, вирус лихорадки западного Нила, вирус клещевого энцефалита, вирус

56 краснухи); сем. Picornaviridae (энтеровирус ECHO-71); сем. Retroviridae (вирус иммунодефицита человека); ДНК из тканей головного мозга мыши, собаки, кошки, человека. Штаммы RABV, РНК вирусов сем. Rhabdoviridae и первичный материал являются частью рабочей коллекции лиссавирусов ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора. Остальной материал являлся собственностью ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Таблица 1 Штаммы, первичные нуклеотидные последовательности которых были использованы для выбора диагностических олигонуклеотидов Наименование Год выделения изолята/штамма материала 7466 7494 7495 7496 2008 2008 2008 2008 Тыва Ненецкий АО Ненецкий АО Ненецкий АО корова н/д н/д северный олень 7497 7511 7558 2008 2008 2008 Ненецкий АО Воронежская Дагестан область н/д лисица крупный рогатый Регион Источник выделения скот (крс) 7559 7560 7561 7573 7574 7719 7891 7892 7941 7943 8000 2008 2008 2008 2008 2008 2010 2011 2011 2011 2011 2011 Дагестан Дагестан Дагестан Тверская область Тверская область Тыва Хакасия Хакасия Красноярский Красноярский край Омская область край собака кошка собака собака лисица волк корова корова лисица лисица лисица

57 8041 8042 8061 8064 8092 8093 KC595280 (8052) KC595281 (8053) KC595282 (8054) KC595283 (8057) 2011 2011 2011 2011 2012 2012 2011 2011 2011 2011 Алтайский край Алтайский край Липецкая Липецкая область Тыва область Тыва Липецкая Липецкая область Липецкая область Липецкая область н/д н/д корова лисица волк верблюд лисица кошка лисица лисица область Таблица 2 Первичные образцы, положительные по бешенству, использованные для определения диагностической чувствительности метода ПЦР в реальном времени Наименование Год выделения изолята/штамма материала 7985 Регион Источник выделения 2011 Якутия северный олень 8202 2013 Омская область лисица 7496 2008 Ненецкий АО северный олень 7511 2008 7551 2008 7555 2008 Тюменская область северный олень 7557 2008 Тюменская область песец Воронежская область Белгородская область лисица лисица

58 7558 2008 Дагестан крс 7559 2008 Дагестан собака 7560 2008 Дагестан кошка 7561с 2008 Дагестан собака 7576 2008 Тверская область енотовидная собака 7941 2008 Красноярский край лисица 7990 2011 Якутия песец 8093 2011 Тыва верблюд 8300 2013 Омская область енотовидная собака 828 1989 8247 2013 Омская область енотовидная собака 8313 2013 Омская область лисица 8315 2013 8317 2013 Воронежская область Новосибирская область Новосибирская область лисица крс лисица

59 8318 2013 1п8202 2013 Новосибирская область Омская область лисица лисица Таблица 3 Первичные образцы, отрицательные по бешенству, использованные для определения диагностической специфичности метода ПЦР в реальном времени Наименование Год получения образца материала 8215 Регион Источник выделения 2013 Омская область норка 8217 2013 Омская область норка 8218 2013 Омская область норка 8219 2013 Омская область норка 8221 2013 Омская область норка 8222 2013 Омская область норка 8224 2013 Омская область енотовидная собака 8225 2013 Омская область лисица 8226 2013 Омская область лисица

60 8229 2013 Омская область енотовидная собака 8230 2013 Омская область енотовидная собака 8233 2013 Омская область лисица 8234 2013 Омская область лисица 8235 2013 Омская область лисица 8236 2013 Омская область лисица 8237 2013 Омская область лисица 8238 2013 Омская область лисица 8239 2013 Омская область лисица 8241 2013 Омская область лисица 8270 2013 Омская область соболь 8271 2013 Омская область куница 8316 2013 Новосибирск собака 2.2. Использованные олигонуклеотиды

61 В международной базе данных ГенБанк представлены преимущественно последовательности N- и G-генов вируса бешенства. Согласно литературным данным, в геноме вируса бешенства N-ген, кодирующий нуклеопротеин, обладает меньшей скоростью изменения нуклеотидного состава по сравнению с G-геном [44]. По этой причине выбор целевого фрагмента для амплификации и детекции RABV осуществляли в пределах последовательности N-гена. На основании выравнивания известных на момент начала выполнения работы нуклеопротеин-кодирующих нуклеотидных последовательностей штаммов, циркулирующих на территории Российской Федерации, был определѐн консервативный участок N-гена, для которого выбрали праймеры и зонд (рисунок 16). Структурно зонд представляет собой пробу с инвертированным концевым повтором («молекулярный маячок») (Рисунок 15). При синтезе зонда Rt_Rabz2_neu в качестве флуорофора использовали R6G (6-Карбоксиродамин), а в качестве тушителя BHQ-1 (black hole quencher 1) (Таблица 4). Таблица 4. Структура праймеров и зонда, используемых в наборе реагентов для диагностики бешенства Название Нуклеотидная последовательность, 5’-3’ Позиция в Длина геноме* ампликона, п.о. Rt_Rab- AAGAACTTTGAGGAAGAGATAAGAAG 857–882 2f_Neuer Rt_Rabz2_neu Rt_Rab2r_Neu R6G- 900–925 140 AGGAGACAGCTGTTCCTCACTCCTATBHQ1 AACACATGACCAACRGCATTCGAT 973–997 * Позиция в геноме указана согласно референсной нуклеотидной последовательности JQ944704.

62 Дизайн олигонуклеотидов проводили, следуя общим требованиям, предъявляемым к дизайну олигонуклеотидов, используемых при проведении ПЦР [116]. Рисунок 15. Структура зонда Выбор олигонуклеотидов, использованных для амплификации и последующего секвенирования фрагментов генома вируса бешенства (Таблица 5), осуществляли на основании анализа выравненных друг относительно друга полных нуклеотидных последовательностей штаммов RABV, выделенных на территории Российской Федерации (JQ944704, JQ944705, JQ944706, JQ944707, JQ944708, JQ944709). Оценку температур отжига олигонуклеотидов проводили при помощи программного обеспечения Oligonucleotide Properties Calculator [66]. Таблица 5. Олигонуклеотиды, использованные для амплификации и последующего секвенирования фрагментов генома вируса бешенства Название rab 0020f Нуклеотидная последовательность 5’-3’ ACg CTT AAC AAC MAR ATC ADA gAA RAA R Позиция геноме* 1-28 Rab1r AAC ATG TCG TAG GTT CCG GC 689-708 Rab2f-bis ATG ACA ACT CAC AAA ATG TGY GC 632-653 Rab2r-bis GGA TTG ACG AAG ATC TTG CTC AT 1515-1537 в

63 NP-f ATG AAT GGA GGT CGA CTA AAG AGA TC 1301-1326 NP-r TCT CAC CGA GGT TGG ACG ATT TTC 1695-1718 Rab3f ATG AGC AAG ATC TTC GTC AAT CC 1515-1537 Rab3r AGA AAG TTC ATT TTG TCA GTG GTG 2483-2506 PM-f TGC TTT GGC CAA TTC CAA GAA ATT CC 2312-2336 PM-r ATA CAA AAG TTC CTC ATG TTC TTC TTG C 2632-2659 Rab-4f AAC ACC ACT GAC AAA ATG AAC TTT C 2481-2505 Rab-4r AGC CCG TAT GTT CTC TCC TC 3146-3165 MG-f TCT GGT GTA TCA ACA TGA ATT CAA GAG C 2998-3025 MG-r TAA ATT GTT TGG GCA GCT GAG ATG ATG 3431-3457 Rab-5fbis AGC CTC TTG GAT GTG AAA AAA AC 3263-3285 Rab5r TTC CRT CCA TAA GTC TAA GTC C 4067-4087 Rab-6fbis AAG ACY TGT GGV TTT GTR GAT G 3986-4007 Rab-6r AAA CAC CTT TTT GAR GGG ATG 4387-4407 Rab-7f TTG ATG GAG GCT GAW GCT CAC 4337-4357 Rab-7r TCC ACM ACC TTT GRT ATC AG T 5123-5143 Rab-add1f TCA GTG CAA CAG GGT AGA TTT AAG AG 4984-5009 Rab-add1r TGA AAA GCT TAG ATG ACC CAG CCC 5320-5343 Rab-8f CTG ATA CCA AAG GTG GTG GA 5124-5143 Rab-8r ATA YCT CCC RAA TGC CTT RTC 5888-5908 Rab- add2f TCC AAG TCA TCC CCC ATA GAG AAG 5783-5806 Rab-add2r AAG CAC TCT TGG TAG GAC TTA TCT ATC 6592-6618 Rab-9f TCY GAA TCA AAC AGG AGY CGG 5732-5752 Rab-9r TCC CRA ATG CCT TRT CAT ART C 5882-5903 Rab-10f TTT AGA GTT CTG KAT CAA TTY GAC 6455-6478 Rab-10r AAA RAA TCG RCC YTC AAT CTT C 7051-7072 Rab-add3f TTG GCT GTC AGA GAA CCG GGG 6886-6906 Rab-add3r TTC AAT CCA AAC ACC CGA TCC AGG 7321-7344

64 Rab-11f ACT TGA TAA TTG GYC TYA AGC C 7014-7035 Rab-11r TAT GTC GGA CAT AGA ACC TG 7601-7620 Rab-12fbis TCA GAC AGR TCA GAC CTY ATC GG 7397-7419 Rab-12rbis TCT CTC CRA GAT CHG GGT TCC C 8243-8264 Rab-13fbis ATG TCR AGR ATA ATC TAT CTA GAC C 8072-8096 Rab-13rbis TTT CTW GTG ATG AAC CAG TTT ATR G 9003-9027 Rab-14fbis TCA CYA ATG TTC ATG TGG TRA AAA G 8958-8982 Rab-14rbis TYT CTC CTC TAA GAG AYG GTT CTC 9825-9848 Rab-15f TTT gAA TCT YTA AgT ggT AgR G 9510-9531 Rab-15r AAC ATC CTR CCT TgC gWg 10288-10305 Rab-add4f CC 10176-10204 Rab-add4r TGA TTG AAA GTA TCT CCA GGT GGC C 10732-70756 Rab-16f ATC AAG ARG TSC GCC AYG C 10227-10245 Rab-16r AAT CAA RCA RYC AGA GGT YC 11871-11890 Rab-16fa TTC CCA TCA gTC ACA ggR TTT 10956-10976 Rab-16ar TgC ATC TCA CTY TTR ggg CTg 11111-11131 Rab 3’R ACg CTT AAC AAA AAA CCA ACA AAg A 11899-11923 TgT CCC TAg CTT CgC AAg ACT 11465-11485 Rab 11500f * ACG ACA TTC AAA GAT TAC TAA AAG ACT Позиция в геноме указана согласно референсной нуклеотидной последовательности JQ944704. 2.3. Секвенирование фрагментов генома вируса бешенства 2.3.1 Выделение РНК и синтез кДНК Вирусную РНК изолировали при помощи набора реагентов РИБО-преп (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) согласно рекомендациям

65 производителя. ДНК/РНК элюировали в 50 мкл РНК-буфера (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) и хранили при –70 ºC. Реакцию обратной транскрипции проводили при помощи набора реагентов «Реверта-L» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) согласно рекомендациям производителя. 2.3.2 Амплификация фрагментов ДНК Для определения первичной нуклеотидной последовательности амплифицировали перекрывающиеся фрагменты генома. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 10 мкл ПЦР-смеси-2-blue (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), по 0,4 мкМ прямого и обратного праймера (последовательности олигонуклеотидов приведены в Таблице 1), 2,5 мкл 10x dNTP-mix (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), 2 мкл кДНК вируса бешенства. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) в следующем режиме: 15 с – денатурация при 95 ºС, 25 с – отжиг праймеров при 57 ºС, 30 с – элонгация при 72 ºС (40 циклов амплификации). При неудовлетворительном результате амплификации температуру отжига праймеров либо повышали (для повышения специфичности ПЦР), либо понижали (для повышения чувствительности ПЦР). 2.3.3 Определение первичной нуклеотидной последовательности Наличие ПЦР-продукта необходимой длины контролировали электрофоретическим методом в 1,5% агарозном геле (1xTAE) с добавлением бромистого этидия. Затем проводили очистку ампликонов при помощи набора реагентов QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Германия). Очищенный ПЦРпродукт секвенировали на приборе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США).

66 Обработку хроматограмм осуществляли при помощи программного обеспечения CLC Main Workbench 5 (Qiagen, Германия). 2.4. Разработка набора реагентов для определения РНК вируса бешенства (Rabies virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени 2.4.1 Положительные контрольные образцы Для осуществления постадийного контроля проведения анализа синтезировали рекомбинантные положительные контрольные образцы: кДНК положительный контрольный образец (К+), РНК-защищѐнный положительный контрольный образец (ПКО). В качестве К+ использовали генноинженерную конструкцию, содержащую фрагмент генома вируса бешенства, содержащий места посадки выбранных праймеров и зонда. Целевой фрагмент кДНК вируса бешенства (905 п.о.) клонировали в плазмиду pGem (Promega, США), содержащую ген резистентности к ампициллину (bla), который кодирует фермент бета-лактамазу. Концентрацию полученного контрольного образца определяли при помощи набора реагентов CQS-Bla (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), содержащего праймеры и зонд к гену bla. В качестве ПКО использовали рекомбинантную РНК на основе MS2-фага в защитной белковой оболочке, содержащую фрагмент гена gag ВИЧ и целевой фрагмент N-гена вируса бешенства длиной 905 пар оснований [14]. Концентрацию полученного контрольного образца определяли при помощи набора реагентов CQS-Gag (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), содержащего праймеры и зонд к гену gag.

67 2.4.2 Условия постановки ОТ-ПЦР в реальном времени Реакцию обратной транскрипции РНК и амплификации участка кДНК вируса бешенства (RABV) проводили в одношаговом формате. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, в состав которой входили: dNTP (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), прямой праймер Rt_Rab-2f_Neuer, обратный праймер Rt_Rab-2r_Neu, зонд Rt_Rab-z2_neu (последовательности олигонуклеотидов приведены в Таблице 4), олигонуклеотиды для детекции внутреннего контроля, буфер для амплификации (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), TaqF-полимераза (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), TM-ревертаза (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), RT-G-mix-2 (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). Амплификацию проводили по следующему протоколу: 50 ºС — 15 минут (реакция обратной транскрипции), 95 ºС — 15 минут (активация TaqF полимеразы), 45 циклов амплификации (15 с – денатурация при 95 ºС, 25 с – отжиг праймеров при 57 ºС, 10 с – элонгация при 72 ºС). Уровень флуоресценции измеряли после каждого этапа отжига праймеров по зелѐному (сигнал ВКО) и жѐлтому (специфический сигнал) каналам. ПЦР в реальном времени проводили на программируемых амплификаторах роторного типа (Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Германия)) и амплификаторах планшетного типа (iCycler iQ5 (BioRad, США), «ДТ-96» («ДНКТехнология», Россия)). Пороговую линию флуоресценции устанавливали в середине линейного участка прироста выраженного в значения флуоресценции логарифмических единицах. положительного Результаты контроля, амплификации интерпретировали как положительные, если наблюдали пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.

68 2.4.3 Определение чувствительности и специфичности набора реагентов. Для оценки аналитической чувствительности готовили с десятикратным шагом разведения положительного контрольного образца (ПКО) известной концентрации на плазме от здоровых людей. С помощью разработанной диагностической системы выявили минимальное пороговое разведение, при котором образец идентифицируется как положительный. Порог чувствительности устанавливали по минимальному разведению, детектированному в трех повторах. Также аналитическую чувствительность оценивали с помощью 8 штаммов RABV (8202, 8247, 8300, 8313, 8315, 8317, 8318, 1п8202) (Таблица 2) с известной концентрацией, рассчитанной по методу Рида и Менча в единицах LD50/мл [90]. Порог чувствительности устанавливали по минимальному разведению, детектированному в трех повторах. Диагностическую материал от 23 чувствительность изолятов (Таблица измеряли, 2), в используя которых вирус первичный бешенства идентифицировали ранее путѐм постановки биологической пробы на мышах. Диагностическую специфичность определяли с использованием 22 образцов, охарактеризованных методом биологической пробы на белых мышах как не содержащие вирус бешенства (Таблица 3). Оценку аналитической специфичности набора реагентов проводили посредством добавления в реакцию геномной ДНК/РНК следующих вирусов и организмов: сем. Rhabdoviridae (вирус Араван, вирус Худжанд, европейский летучемышиный вирус 1), сем. Bunyaviridae (вирус Тягиня, вирус Батаи, вирус Дхори, вирус крымской геморрагической лихорадки, вирус Инкоо); сем. Reoviridae (вирус Кемерово, ротавирус); сем. Togaviridae (вирус Чикунгунья, вирус жѐлтой лихорадки, вирус Синдбис, вирус лихорадки западного нила, вирус клещевого энцефалита, вирус краснухи); сем. Picornaviridae (энтеровирус); сем. Retroviridae (вирус иммунодефицита человека); мышь (ДНК/РНК получена из тканей головного мозга); собака (ДНК/РНК получена из тканей головного мозга);

69 кошка (ДНК/РНК получена из тканей головного мозга); человек (ДНК/РНК получена из тканей головного мозга). 2.5 Филогенетический анализ Из международной базы данных ГенБанк получили все доступные на 4-е июля 2016 года последовательности, содержавшие в своѐм названии ключевые слова «rabies» и «nucleoprotein» (n=12 051). Затем все последовательности короче 1110 нуклеотидов исключили из выборки. Для идентификации целевых (российских) последовательностей в рассмотрении оставили только последовательности, имеющие не менее 94% идентичных нуклеотидов в сравнении с KC538853 (штамм изолирован в Липецке в 2012 году) – линия вирусов-космополитов, а также последовательности, имеющие не менее 91% идентичных нуклеотидов в сравнении с KY002890 (штамм изолирован в Ненецком АО в 2008 году) — линия вирусов арктического и арктическиподобного типов. Последовательности, не содержащие информации о периоде изолирования штаммов, были исключены из выборки. Последовательности, относящиеся к филогруппам, представители которых не циркулируют на территории Российской Федерации, были исключены из выборки. Для удаления практически идентичных последовательностей в выборке оставили только последовательности, различающиеся между собой на не менее, чем 0,1% идентичных нуклеотидов. В качестве внешней группы использовали JQ685915 (штамм изолирован в США в 2002 году). Последовательности #FJ424484, U43433, U22475, U22840, JF973787, JF973796, KU198463, KU198471, KU198469 и U11375 искусственно добавили в выборку с целью еѐ расширения. Финальный размер выборки составил 108 последовательностей. Коды нуклеотидных последовательностей, аннотированных в международной базе данных ГенБанк, приведены в Таблице 6.

70 Таблица 6. Сведения о штаммах вируса бешенства, использованных в филогенетическом анализе. Названия штаммов, полученных в ходе выполнения работы, выделены жирным шрифтом. Код штамма Год получения Регион изоляции материала KC538849 2011 Россия, Липецкая область KC538850 2011 Россия, Липецкая область KC538851 2011 Россия, Липецкая область KC538852 2011 Россия, Липецкая область KC538853 2012 Россия, Липецкая область KC538854 2012 Россия, Липецкая область KC538855 2012 Россия, Липецкая область KC538856 2012 Россия, Липецкая область KC538857 2012 Россия, Липецкая область KC538858 2012 Россия, Липецкая область KC538859 2012 Россия, Липецкая область KC538860 2012 Россия, Липецкая область KC794007 2008 Россия, Воронежская область KC794008 2008 Россия, Воронежская область KC794009 2008 Россия, Воронежская область KC794010 2008 Россия, Воронежская область KC794011 2008 Россия, Воронежская область KC794012 2008 Россия, Белгородская область KC794013 2008 Россия, Белгородская область KC794014 2008 Россия, Белгородская область KJ958221 2008 Россия, Республика Алтай KJ958222 2008 Россия, Республика Алтай KJ958223 2008 Россия, Республика Алтай

71 KJ958224 2008 Россия, Республика Алтай KJ958225 2011 Россия, Республика Хакасия KJ958226 2011 Россия, Республика Хакасия KJ958227 2011 Россия, Республика Хакасия KJ958228 2011 Россия, Республика Хакасия KJ958229 2011 Россия, Республика Хакасия KJ958230 2011 Россия, Республика Хакасия KJ958231 2008 Россия, Красноярский край KJ958232 2008 Россия, Красноярский край KJ958233 2008 Россия, Красноярский край KJ958234 2008 Россия, Красноярский край KJ958235 2008 Россия, Красноярский край KJ958236 2008 Россия, Красноярский край KJ958237 2008 Россия, Красноярский край KJ958238 2008 Россия, Красноярский край KJ958239 2011 Россия, Красноярский край KJ958240 2011 Россия, Красноярский край KJ958241 2011 Россия, Красноярский край KJ958242 2011 Россия, Красноярский край KJ958243 2011 Россия, Красноярский край KJ958244 2011 Россия, Красноярский край KJ958245 2011 Россия, Красноярский край KJ958246 2011 Россия, Красноярский край KJ958247 2008 Россия, Омская область KJ958248 2008 Россия, Омская область KJ958249 2008 Россия, Омская область KJ958250 2009 Россия, Омская область KJ958251 2009 Россия, Омская область KJ958252 2010 Россия, Омская область

72 KJ958253 2010 Россия, Омская область KJ958254 2011 Россия, Омская область KJ958255 2011 Россия, Омская область KJ958256 2008 Россия, Республика Тыва KJ958257 2008 Россия, Республика Тыва KJ958258 2008 Россия, Республика Тыва KJ958259 2008 Россия, Республика Тыва KJ958260 2008 Россия, Республика Тыва KJ958261 2010 Россия, Республика Тыва KJ958262 2011 Россия, Республика Тыва KJ958263 2012 Россия, Республика Тыва KJ958264 2012 Россия, Республика Тыва KJ958265 2008 Россия, Тверская область KJ958266 2008 Россия, Тверская область KJ958267 2008 Россия, Тверская область KJ958268 2008 Россия, Тверская область KJ958269 2008 Россия, Тверская область KJ958270 2008 Россия, Тверская область KY172632 2011 Россия, Республика Алтай KY172633 2011 Россия, Республика Алтай KX954123 2016 Россия, Земля Франца-Иосифа KY002886 2008 Россия, Республика Дагестан KY002887 2008 Россия, Республика Дагестан KY002888 2008 Россия, Республика Дагестан KY002889 2008 Россия, Республика Дагестан KY002890 2008 Россия, Ненецкий АО KY002891 2008 Россия, Ненецкий АО KY002892 2008 Россия, Ненецкий АО KY002893 2008 Россия, Ненецкий АО

73 AB571004 2007 Монголия, аймак Туве AB570999 2006 Монголия, аймак Говь-Алтай AB570998 2005 Монголия, аймак Завхан AB570997 2006 Монголия, аймак Хувсгел AB570996 2006 Монголия, аймак Завхан AB570995 2005 Монголия, аймак Говь-Алтай AB571007 2008 Монголия, аймак Хувсгел KM016899 2014 КНР, АР Внутренняя Монголия KJ748631 2014 КНР, АР Внутренняя Монголия KJ748634 2014 КНР, АР Внутренняя Монголия KJ748636 2014 КНР, АР Внутренняя Монголия KJ152773 2013 КНР, Синьцзян-Уйгурский АР AY352481 1996 Россия, Республика Тыва AY352482 1989 Россия, Республика Тыва AY352483 1987 Россия, Республика Тыва AY352490 1988 Казахстан, Алма-Ата AY352491 1988 Казахстан, Алма-Ата AY352456 1991 Россия, Воронежская область AY352474 1990 Россия, Псковская область AY352475 1990 Россия, Псковская область AY352486 1995 Россия, Республика Якутия AY352487 1986 Россия, Республика Якутия AY352488 1988 Россия, Республика Якутия AY352462 1998 Россия, Красноярский край AY352458 1980 Россия, Хабаровский край AY352459 1977 Россия, Читинская область JX423808 2011 Россия, Республика Бурятия KT965734 2014 Казахстан, ВосточноКазахстанская область

74 KT965735 2014 Казахстан, ВосточноКазахстанская область KT965736 2014 Казахстан, Актюбинская область KT965737 2014 Казахстан, ЗападноКазахстанская область KT965738 2014 Казахстан, Алма-Ата KP997032 2014 Россия, Приморский край JQ944705 2008 Россия, Нижегородская область JQ944706 2008 Россия, Краснодарский край JQ944708 2008 Россия, Краснодарский край KT728348 2003 Россия, Астраханская область KT728349 2003 Россия, Астраханская область JX987744 1974 Иран, провинция Фарс U43025 1991 Венгрия U43433 1974 Франция U22475 1991 Германия U22840 1985 Польша U42707 1991 Эстония FJ424484 2008 Италия JF973787 1998 Сербия JF973796 1998 Босния AY854581 2000 Иран, провинция Ардебиль KF155000 2010 Ирак DQ837474 2000 Турция JN258592 2008 США, штат Аляска KU198460 1989 США, штат Аляска KU198478 2013 Канада, территория Нунавут JN258588 2007 США, штат Аляска KX036364 2002 Гренландия

75 KU198471 2007 США, штат Аляска KU198463 1990 США, штат Аляска KU198469 2001 Канада, провинция Онтарио U11735 1993 Канада, провинция Онтарио KM016898 2011 КНР, провинция Хэйлунцзян EU284093 2007 КНР, провинция Гирин KM034905 2012 КНР, провинция Ганьсу JQ685915 2002 США, штат Техас Выравнивание фрагментов N-генов (1110 нуклеотидов) выполняли с помощью программного обеспечения MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). Филогенетический анализ провели методом Байесовского моделирования при помощи программного обеспечения BEAST 2.2.1 [35]. В качестве модели нуклеотидных замен выбрали модель «обратного прыжка» («reversible-jump based substitution model»), автоматически подбирающую наиболее подходящее для выборки количество параметров в процессе перебора дендрограмм [35]. Разные временные и популяционные модели сравнили на основании сравнения Байесовых факторов. Наивысший показатель достоверности наблюдали при использовании комбинации некоррелированных логнормальных расслабленных молекулярных часов (uncorrelated lognormal relaxed clock) и постоянной популяционной модели. Следует отметить, что статистически значимых отличий между разными комбинациями двух временных (строгие и расслабленные молекулярные часы) и трѐх популяционных (постоянная, экспоненциальная, байесовский горизонт) моделей выявлено не было. Филогенетический анализ выполнялся в ходе 100 миллионов генераций марковских цепей Монте-Карло (модель «обратимых прыжков»). Достоверность программного полученных обеспечения Tracer результатов v. 1.6.0 оценивали при помощи (http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer).

76 Параметр считали достоверным, если его значение размера эффективной выборки превышало 200. Полученный набор дендрограмм аннотировали, используя программное обеспечение TreeAnnotator v2.2.1. Окончательный вариант дендрограммы визуализировали в программном обеспечении FigTree v 1.4.2.

77 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1 Разработка набора реагентов для диагностики бешенства методом ПЦР в реальном времени 3.1.1 Выбор праймеров и зонда В международной базе данных ГенБанк представлены преимущественно последовательности N- и G-генов вируса бешенства. Согласно литературным данным в геноме вируса бешенства N-ген, кодирующий нуклеопротеин, обладает меньшей скоростью изменения нуклеотидного состава по сравнению с G-геном [44]. По этой причине с целью поиска наиболее консервативных фрагментов нуклеотидной последовательности РНК вируса бешенства отсеквенировали нуклеопротеин-кодирующие регионы генома вируса бешенства 24-х штаммов, циркулирующих на территории РФ (рабочая коллекция ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора) (табл. 1).

78 Рисунок 16. Выравнивание консервативных фрагментов N-генов штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных стран. Позиция в геноме указана согласно референсной нуклеотидной последовательности JQ944708. На выравнивании показаны области посадки диагностических праймеров и зонда.

79 Также в выравнивание (Рисунок 16) добавили известные на момент начала выполнения работы последовательности консервативных фрагментов N-генов штаммов вируса бешенства, выделенных на территории Российской Федерации и сопредельных стран. На основании полученного выравнивания выбрали видоспецифичные праймеры и зонд (Табл. 4). 3.1.2 Основные характеристики диагностического набора реагентов В результате работы был создан набор реагентов для выявления РНК вируса бешенства в мозговой ткани методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, позволяющий проводить анализ как в одношаговом формате (реверсия и амплификация происходят в одной пробирке), так и в двухшаговом формате (реверсия и амплификация происходят в разных пробирках) [10]. Для возможности контроля качества всех этапов проведения анализа был разработан положительный контрольный образец (ПКО) на основе защищенной РНК. При проверке аналитической специфичности перекрѐстных реакций для тестируемых организмов и вирусов (см. материалы и методы) не было зарегистрировано. Аналитическая чувствительность системы, оцененная с помощью разведений препарата ПКО, составила 2,5х103 копий РНК в мл (при выделении из 100 мкл образца). Для измерения аналитической чувствительности набора реагентов приготовили разведения СОП (стандартный образец предприятия) ПKO RABVrec c концентрациями 5х105, 5х104 и 2,5х104 копий/мл (СОП1, СОП2, СОП3 соответственно). К 10 мкл СОП добавили 90 мкл воды (развели в 10 раз). Экстракцию проводили в двух повторах для каждого разведения. Этап обратной транскрипции и амплификации выполняли в трѐх повторах для каждой точки.

80 Рисунок 17. Определение аналитической чувствительности системы. В итоге наблюдали следующие результаты: для СОП1 (3 образца 1-й повторности выделения) Ct=30,42; для СОП1 (3 образца 2-й повторности выделения) Ct=30,47; для СОП2 (3 образца 1-й повторности выделения) Ct=33,71; для СОП2 (3 образца 2-й повторности выделения) Ct=34.03; для СОП3 (3 образца 1-й повторности выделения) Ct=35,28; для СОП3 (3 образца 2-й повторности выделения) Ct=34,94 (Рисунок 17). Сравнение предлагаемого подхода в диагностике бешенства путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени с «золотым стандартом» — методом биологической пробы на белых мышах проводили, используя материал 8 изолятов вируса бешенства (8202, 8247, 8300, 8313, 8315, 8317, 8318, 1п8202) (Таблица 2) с известной концентрацией вируса в исходной суспензии (измеренной в LD50/мл). Каждый образец разводили до концентраций 10 LD50/1 мл, 1 LD50/1 мл, 0.1 LD50/1 мл, выделяли РНК, затем проводили постановку ОТ-ПЦР в реальном времени в трѐх повторах (Таблица 6). Таблица 6. Результаты постановки ОТ-ПЦР в реальном времени, полученные в ходе сравнительных испытаний набора реагентов (три повтора исследования каждой точки с разной концентрацией вируса)

81 10 LD50/1 мл 1 LD50/1 мл 0.1 LD50/1 мл 8202л_Омская_2013 + + + + + + + + + 8247ен.соб._Омская_2013 + + + + + + + - - 8300_ен.соб._Омская_2013 + + + + + + + + + 8313л_ Омская_2013 + + + + + + + + + 8315крс_Новосибирская_2013 + + + + + + + + + 8317л_Новосибирская_2013 + + + + + + + + - 8318л_Новосибирскя_2013 + + + + + + + + + 1п8202л_Омская_2013 + + + + + + + + + При проведении анализа методом биологической пробы детекция патогена возможна при концентрации вирусных частиц не ниже 10 LD50/мл (согласно экспериментальным данным, полученным в результате совместной работы с Полещук Е.М.); в то время как при постановке ОТ-ПЦР в реальном времени во всех образцах, в которых концентрация вируса бешенства превышала 1 LD50/мл результат анализа был положительным (Таблица 6). Таким образом набор реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом постановки ОТ-ПЦР в реальном времени имеет более низкий предел обнаружения и, следовательно, более высокую аналитическую чувствительность. Соответствие LD50/мл количеству копий защищенного контроля устанавливали в реакции количественной ОТ-ПЦР. В качестве калибраторов использовали разведения препарата ПКО известной концентрации (Рисунок 15). Концентрации 1 LD50/мл для разных штаммов соответствовали разные концентрации геном-эквивалентов (Таблица 7). Наблюдаемые результаты обуславливаются разными патогенными свойствами штаммов вируса бешенства. Таблица 7. Сопоставление числа геном-эквивалентов, содержащихся в 1 мл, с концентрацией 1 LD50/мл

82 Наименование образца геном-эквиваленты/1 LD50 8202 431 650 8247 27 600 8300 321 500 8313 115 150 8315 59 600 8317 29 700 8318 589 450 1п8202л 415 950 Диагностическую чувствительность набора реагентов определяли с использованием 23 образцов, охарактеризованных методом биологической пробы на белых мышах как содержащие вирус бешенства (Таблица 2). При проведении анализа методом ОТ-ПЦР в реальном времени РНК вируса бешенства детектировали во всех образцах. Диагностическую специфичность набора реагентов определяли с использованием 22 образцов, охарактеризованных методом биологической пробы на белых мышах как не содержащие вирус бешенства (Таблица 3). При проведении анализа путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени РНК вируса бешенства ни в одном из образцов не обнаружили. В ходе работы при помощи набора реагентов был идентифицирован 28 штаммов вируса бешенства (табл. 1), последующее секвенирование кодирующих нуклеопротеин фрагментов генома которых выявило принадлежность изолятов к 5 из 6 подгрупп вируса, циркулирующих на территории Российской Федерации. Процент идентичных нуклеотидов в N гене в использованной выборке штаммов варьируется от 100,00% до 88.40% (Рисунок 18). Несмотря на это, все вирусы были успешно детектированы при помощи диагностического набора.

83 Рисунок 18. Попарное сравнение процента идентичных нуклеотидов в N-гене 31 штамма вируса бешенства, идентифицированных при помощи набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства Таким образом, разработанный набор реагентов позволяет детектировать штаммы вируса бешенства, принадлежащие разным филогенетическим подгруппам, циркулирующим на территории РФ. 3.1.3 Практическое применение набора реагентов Разработанный набор реагентов был апробирован на биологическом материале разного происхождения. 3.1.3.1 Идентификация вируса бешенства в образце мозговой ткани медведя из Приморского края В ноябре 2014 г. в селе Барабаш (Хасанский район Приморского края), расположенном возле национального парка «Земля леопарда», произошло нападение бурого медведя (Ursus arctos) на человека. Девиантное поведение медведя позволило предположить бешенство. После отстрела животного из ткани головного мозга медведя выделили РНК. Результат постановки ОТ-ПЦР в реальном времени был положительным. Значение флуоресценции достигло

84 порогового уровня (Ct, Cycle threshold) на 11 цикле амплификации, что свидетельствуют о значительной концентрации вирусных частиц в исследуемом образце. Впоследствии выполнили полногеномное секвенирование этого штамма (KP997032) при помощи набора соответствующих олигонуклеотидов (табл. 5). Штамм PO 01 является первым полностью секвенированным дальневосточным штаммом вируса бешенства [26, 97]. 3.1.3.2 Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области В рамках ретроспективного исследования аутопсийного материала, собранного от пациентов, погибших вследствие развития энцефалита неясной этиологии, из шести образцов приготовили библиотеку фрагментов ДНК, которую затем секвенировали с целью выяснить причину смертельного исхода. При анализе полученных в результате массового параллельного секвенирования библиотеки 6 041 914 прочтений выявили 124 781 прочтений, картирующихся на геном вируса бешенства. При помощи набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени в двух образцах (мозговая ткань семилетнего мальчика, мозговая ткань пятидесятилетнего мужчины) обнаружили присутствие патогена. Оба образца были собраны в 2003 году в Астраханской инфекционной больнице. Клиническое течение болезни позволило заподозрить лиссавирусную этиологию. Однако лабораторные исследования, проведенные в то время, диагноз не подтвердили. Впоследствии выполнили полногеномное секвенирование этих штаммов вируса бешенства (KT728348, KT728349) при помощи набора соответствующих олигонуклеотидов (табл. 5) [43].

85 Идентификация вируса бешенства в образце мозговой ткани 3.1.3.3 песца с острова Земля Франца-Иосифа В рамках мониторинга эпизоотологической заболеваемости падших животных на архипелаге Земля Франца-Иосифа был обнаружен труп песца (Alopex lagopus), находившегося в неестественной позе. Из образца мозговой ткани выделили РНК. Результат постановки ОТ-ПЦР в реальном времени был положительным секвенирование (Ct~17). этого Впоследствии штамма при выполнили помощи набора полногеномное соответствующих олигонуклеотидов (табл. 5). Штамм был идентифицирован как представитель подгруппы арктического бешенства. Первичная нуклеотидная последовательность была депонирована в международную базу данных ГенБанк (KX954123). 3.2 Филогенетический анализ штаммов вируса бешенства на основании выравнивания N-генов Перед филогенетическим анализом репрезентативную выборку N-генов штаммов вируса бешенства протестировали на предмет наличия рекомбинационных событий. Доказательства рекомбинации в штамме U43432 (штамм изолирован в Эстонии в 1991 году) обнаружили при помощи алгоритмов GENECONV, BootScan, Maxchi, Chimaera, SiScan, 3Seq [99] и подтвердили филогенетическими реконструкциями. Значимость этого единичного факта трудно интерпретировать. Для недопущения искажения результатов анализа последовательность U43432 была исключена из выборки. Скорость изменения нуклеотидного состава, оцененная на выборке N-генов, составила 2,47 *10-4 замен/сайт/год (95% байесовский доверительный интервал (БДИ) = 1,82*10-4 – 3,12*10-4 замен/сайт/год). Этот показатель находится в соответствии с предыдущими оценками скорости эволюции в разных фрагментах генома вируса бешенства [38].

86 На территории Российской Федерации циркулируют 2 основных линии вируса бешенства: Арктическое/Арктически-подобное бешенство (группы A и B согласно ранее предложенной классификации [75]) и космополитическое бешенство (группы C, D, E, F) (Рисунок 19).

87 Рисунок 19. Филогенетическое древо, полученное байесовым методом для 108 изолятов вируса бешенства на основании выравнивания нуклеотидной последовательности фрагмента N-гена (1110 нуклеотидов).

88 Шкала отображает время (в годах). Ветви раскрашены в зависимости от групп вируса. Узлы, апостериорные вероятности которых превышают 95%, обозначены чѐрными квадратами. Узлы, апостериорные вероятности которых составляют 80-95%, обозначены соответствующими числами. Узлы, апостериорные вероятности которых меньше 80%, не обозначены. Названия последовательностей, полученных в текущем исследовании выделены жирным шрифтом. Согласно результатам проведѐнного филогенетического анализа последний общий предок (ПОП) (англ. The most recent common ancestor (TMRCA)) всех циркулирующих на территории Российской Федерации геновариантов вируса бешенства существовал в 1670 году (95% БДИ = 1560-1782) [8, 45]. Группы C, D, E и F («вирусы-космополиты») являются потомками предковой формы, существовавшей в 1849 году [95% БДИ = 1796-1894]. Следует отметить, что эти группы были представлены в исследуемой выборке неравномерно. Группа D включала в себя семь штаммов вируса бешенства, изолированных в центральном федеральном округе Российской Федерации. Общий предок этих штаммов существовал в 1969 году [95% БДИ = 1950-1986]. Вирус, изолированный в Венгрии в 1991 году, являлся близкородственным с российскими представителями группы D. ПОП группы D существовал в 1941 [95% БДИ = 1915-1966], поэтому вероятнее всего эта группа появилась в Российской Федерации в промежутке между 1915 и 1986 годами (крайние значения БДИ). Большинство российских изолятов, представленных в репрезентативной выборке (44/64), принадлежали группе С (см. Рисунок 19). Один штамм вируса, выделенный из кошки в Белгородской области в 1991 (AY352456), являлся внешней группой относительно других представителей группы С, на основании чего этот штамм следует рассматривать как представителя независимой подгруппы С0. Другие вирусы группы С группировались вместе с апостериорной

89 вероятностью (АВ) 1,0 и подразделялись на две подгруппы (С1 и С2). ПОП этих подгрупп существовал приблизительно в 1948 [95% БДИ = 1929-1964]. Подгруппа С1 не имела значимой статистической поддержки (АВ 0.55) и может быть обозначена как «все представители группы С, которые не входят в состав подгрупп С0 и С2». Подгруппа С1 включала в себя 23 штамма вируса, преимущественно изолированных к западу от горных хребтов Тяньшаня и Алтая (см. Рисунок 20). Подгруппа С1 состояла из линии С1a [АВ=1.0] (степные и лесостепные регионы Российской Федерации (Липецкая, Воронежская, Белгородская, Волгоградская, Владимирская, Брянская, Саратовская, Нижегородская области Краснодарский край, республика Дагестан), Западно-Казахстанская область республики Казахстан, центральные и восточные регионы Украины) и С1b [АВ=1.0] (субъекты Российской Федерации (Омская, Астраханская, Оренбургская области, республика Башкортостан); Актюбинская, Алматинская, Восточно-Казахстанская области Казахстана, Синцзян-Уйгурский АР КНР). Линии С1a и С1b имеют дискретные географические паттерны распространения. Рисунок 20. Распространение геновариантов вируса бешенства на территории Российской Федерации и соседних стран. Точность обозначений

90 ограничена на уровне административных образований первого уровня (области и т.п.). На основании филогенетического анализа подгруппа С2 может быть разделена на 3 линии: представители С2a [АВ=0.83] распространены на территории южной Сибири (республики Бурятия, Хакасия, Тыва, Красноярский край), Алматинской области Казахстана, автономного региона КНР Внутренняя Монголия, аймаков Монголии Завхан, Говь-Алтай, Хувсгел. Линия С2b [АВ=0.91] представлена на территории Российской Федерации (Алтайский край, Омская область), Монголии (аймак Хувсгел), Казахстана (Алматинская, Восточно-Казахстанская область); представители С2c [АВ=1.0] обнаружены в Омской области Российской Федерации и Алматинской области Казахстана. ПОП группы Е (российские представители северо-восточно-европейской линии) существовал ориентировочно в 1974 [95% БДИ=1962–1983]. В группу Е вошли три штамма вируса бешенства, изолированных в северозападной части Российской Федерации. Эти штаммы являлись близкородственными с вирусом, выделенным в Эстонии в 1991 году. ПОП группы Е (российские представители северо-восточно-европейской линии) существовал ориентировочно в 1971 году [95% БДИ=1962–1983]. ПОП этих вирусов и эстонского штамма существовал в 1920 году [95% БДИ=1889–1950]. Группа Е являлась родственной по отнощению к ранее описанным западноевропейской, восточноевропейской и центральноевропейской (WE, EE, CE, соответственно) группами [37]. ПОП этих групп существовал приблизительно в 1889 году [95% БДИ=1858-1924]. Предок представителей группы F, зарегистрированных на территории республики Дагестан и Краснодарского края, скорее всего, появился примерно в 1992 году [95% БДИ=1979–2004]. Другие вирусы этой группы были ранее описаны на Ближнем Востоке (Ирак, Иран, Турция). Иранские представили были ранее

91 охарактеризованы как принадлежащие к филогруппе Iran-1a [88]. ПОП группы F существовал примерно в 1966 году [95% БДИ=1947–1983]. Группы A (арктическое бешенство) и B (арктически-подобное бешенство) разделились ориентировочно в 1806 году [95% БДИ=1732–1871]. Ранее было описано разделение группы арктического бешенства на четыре подгруппы: Arctic-1 (A1), Arctic-2 (A2), Arctic-3 (A3) и Arctic-4 (A4) [76]. Подгруппа А1 состояла из штаммов, циркулирующих только в канадской провинции Онтарио. Представителей подгруппы А4 обнаруживали только на территории штата Аляска (США). Подгруппы А2 и А3 широко распространены на обширных полярных территориях: северная часть Якутии и штат Аляска (А2), северные части Красноярского края, Канады и Гренландия (А3) [56]. Исходя из собственных результатов, подгруппы А2 и А3 возникли примерно в 1979 [95% БДИ=1973–1985] и 1971 [95% БДИ=1962–1979] годах. ПОП подгрупп А2 и А3 существовал ориентировочно в 1960 году [95% БДИ=1946–1972]. Подобные результаты находятся в соответствии с ранее полученными оценками [87]. Следует отметить, что в ходе выполнения текущей работы представители подгруппы А2 были впервые обнаружены в северной части европейской России (Ненецкий АО, республика Коми) и на земле Франца-Иосифа.

92 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 4.1 Усовершенствование лабораторной диагностики рабической инфекции на территории Российской Федерации Несмотря на бурное развитие молекулярно-генетических методов диагностики инфекционных заболеваний, на момент начала выполнения представленной работы на территории Российской Федерации отсутствовали стандартизированные наборы реагентов, позволяющие идентифицировать бешенство путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени. Нормативными актами регламентируются разные методы проведения лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА), метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1), биологическая проба на белых мышах, метод иммуноферментного анализа (ИФА), реакция диффузной преципитации (РДП) [3]. Эффективность выполнения противоэпизоотических мероприятий и успешность проведения экстренной вакцинопрофилактики во многом зависит от своевременной и точной идентификации возбудителя болезни [24], поэтому в ряде случаев критически важно иметь возможность выявить вирус бешенства в исследуемом материале в кратчайшие сроки. На текущий момент золотым стандартом в диагностике рабической инфекции признан метод постановки биологической пробы на белых мышах с последующим исследованием МФА [113], хотя подобный подход не лишѐн существенных недостатков – продолжительность проведения анализа составляет до 30 суток (отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 суток наблюдения при условии ); для учѐта результатов МФА необходима высокая квалификация специалиста; для проведения исследования необходимо наличие вивария [3]. Проведение диагностики бешенства путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени не обладает этими недостатками – продолжительность проведения

93 анализа составляет не более 120 минут; вся процедура выполнения исследования стандартизирована (с целью осуществления постадийного контроля качества проведения анализа в состав набора реагентов включены рекомбинантные положительные контроли); проведение исследования возможно при помощи программируемых амплификаторов как роторного (например, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Германия)), так и планшетного типа (iCycler iQ5 (BioRad, США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия)). В ходе выполнения работы провели сравнительные испытания «золотого стандарта» в диагностике бешенства - метода биологической пробы на белых мышах с последующим исследованием МФА и методики постановки ОТ-ПЦР в реальном времени. В результате выяснили, что при проведении анализа методом биологической пробы идентификация бешенства возможна при концентрации вируса не ниже 10 LD50/мл, в то время как при постановке ОТ-ПЦР в реальном времени во всех образцах, в которых концентрация вируса бешенства превышала 1 LD50/мл результат анализа был положительным (Таблица 6). На основании полученных результатов сделали вывод о том, что набор реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом постановки ОТ-ПЦР в реальном времени имеет более низкий предел обнаружения и, следовательно, более высокую аналитическую чувствительность. На момент начала выполнения работы на территории Российской Федерации отсутствовали зарегистрированные наборы реагентов, позволяющие проводить диагностику бешенства путѐм постановки ОТ-ПЦР в реальном времени. Кроме того, в научной литературе отсутствовали сведения о диагностических наборах, разработанных на основании выборки геномных последовательностей вирусов бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных стран. В ходе работы при помощи набора реагентов был идентифицирован 28 штаммов вируса бешенства (табл. 1), секвенирование кодирующих нуклеопротеин фрагментов генома которых выявило принадлежность изолятов к 5 из 6 групп вируса, циркулирующих на территории Российской Федерации (описание

94 подгрупп см. в главе «Филогенетическое разнообразие геновариантов вируса бешенства на территории Российской Федерации»). Работоспособность набора реагентов не была проверена на вирусах бешенства, принадлежащих группе арктически-подобных вирусов, по причине их отсутствия в нашей выборке. Следует отметить, что единственные (среди опубликованных в международной базе данных ГенБанк на момент написания представленной работы) «российские» представители этой группы (AY352502, AY352459, AY352460, AY352502) были изолированы не менее чем 20 лет назад на территории Хабаровского края и Читинской области. Точный диагноз бешенства может быть констатирован только на основании проведения лабораторных исследований, и его постановка часто требует применения комплекса методов. Разработка стандартизированного набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени позволит использовать дополнительный диагностический метод и совершенствовать диагностику, согласно рекомендациям ВОЗ. Это, в свою очередь, позволит улучшить эффективность мероприятий по эпидемиологическому надзору за рабической инфекцией [5, 6, 19]. 4.2 Вирус бешенства как возможный этиологический агент энцефалитов неясной этиологии Известны две возможные формы течения бешенства: буйная (2/3 случаев) и паралитическая (тихая) (1/3 случаев) [58]. Классические симптомы заболевания (непроизвольные, болезненные сокращение диафрагмы и глоточных мышц в ответ на глотание жидкости; обильное слюноотделение; аэрофобия; изменѐнное сознание) проявляются лишь при развитии буйного бешенства [81]. В случае развития паралитического бешенства клиническая картина схожа с синдромом Гийена — Барре (острая аутоиммунная воспалительная полирадикулоневропатия), что может привести к неверной диагностике

95 заболевания. Кроме того, бешенство, вызванное геновариантами вируса, циркулирующими у летучих мышей, протекает в атипичной форме и приводит к развитию очагового неврологического дефицита, миоклонуса, хореи, признаков синдрома Горнера. Дополнительные трудности в выявлении болезни вызывает длительный инкубационный период (описан случай, в котором между заражением человека инфекцией и проявлением клинических симптомов бешенства прошло не менее 8 лет [34]). В силу приведѐнных черт особо опасная инфекция может быть идентифицирована медицинским работником неверно. Согласно официальной статистике, ежегодно в мире от бешенства умирает от 26 400 (95% доверительный интервал 15 200 – 45 200) до 61 000 (95% доверительный интервал 37 000 -86 000) человек [113]. В то же время, приведѐнные данные могут быть существенно занижены. Например, при проверке информации о количестве случаев бешенства у людей в Объединѐнной Республике Танзания выявили, что реальные числа вероятнее всего превышают официально зарегистрированные не менее, чем в 10 раз [40]. В случае: 1) несвоевременного обращения пациента за помощью, 2) слабой выраженности классических симптомов бешенства, 3) отсутствия классических симптомов бешенства, 4) низкой квалификации медицинского персонала, возможна постановка диагноза «энцефалит неясной этиологии». Также состояние больного, вызванное бешенством, может быть описано как неврологическое нарушение неинфекционной этиологии. Частным случаем описанной проблемы является трансплантация тканей и органов от доноров, погибших в результате неврологических нарушений, природа которых на момент пересадки трансплантата была неясна [92]. Ряд отечественных авторов [12, 14] описывает, что примерно в половине случаев бешенства могут иметься затруднения в постановке диагноза.

96 Таким образом, представляется необходимым проводить проверку биологического материала пациентов, для которых был поставлен диагноз «энцефалит неясной этиологии», и потенциальных доноров, умерших в результате неизвестных неврологических нарушений, на предмет присутствия генетического материала вируса бешенства. В ходе выполнения представленной работы были выявлены неустановленные ранее случаи заболеваемости бешенством среди людей [9, 43]. В 2003 году в областную инфекционную больницу имени А.М. Ничоги (г. Астрахань) поступило 2 пациента (мужчина 50 лет и ребенок 7 лет). Клиническое течение болезни позволяло заподозрить лиссавирусную этиологию. Однако лабораторные исследования, проведенные в то время, диагноз не подтвердили. В рамках работы по расшифровке случаев нейроинфекций с помощью метода высокопроизводительного секвенирования были изучены образцы аутопсийного материала (мозговой ткани) пациентов. При подготовке образцов материал обогащали при помощи ПЦР в присутствии праймеров, специфичных для различных родов вирусов (всего 30 пар для 30 родов). Структура праймеров любезно предоставлена докторами F. Drexler и C. Drosten (Institute of Virology, University of Bonn Medical Centre, Germany). По результатам анализа данных массового параллельного секвенирования полученных библиотек из 6041914 полученных прочтений было идентифицировано 124781, имевших высокий процент схожести с нуклеотидными последовательностями, относящимися к таксономической группе Rabies virus. Подтверждение полученных результатов проводили путѐм постановки ОТПЦР в реальном времени с использованием выделенной из биологического материала РНК. Оба образца от пациентов из Астрахани были определены как положительные. Проведѐнное впоследствии полногеномное секвенирование этих штаммов вируса бешенства (KT728348, KT728349) позволило установить, что 99.24% нуклеотидов между ними идентично. Сравнительный анализ полученных

97 последовательностей выявил их принадлежность к подгруппе степных вирусов классического бешенства. Данный факт подтвердил распространение указанной подгруппы вирусов на территории Астраханской области. Следует отметить, что верный диагноз мог быть установлен своевременно на основании применения стандартизированного набора реагентов. 4.3 Филогенетическое разнообразие геновариантов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации. Одной из основных целей текущей работы являлось описание целостной картины распространения бешенства на территории Российской Федерации. Для исследования взаимоотношений между разными геновариантами вируса было использовано 64 последовательности фрагментов N-генов (1110 нуклеотидов) штаммов, выделенных на территории 21 административного региона Российской Федерации. Также в анализ были включены 44 последовательности, выделенных на территории 16 окружающих Российскую Федерацию стран. Степное бешенство (группа С) – наиболее распространѐнный геновариант вируса в Российской Федерации. Группа циркулирует в степном и лесостепном экологических регионах Евразии; естественным резервуаром являются лисицы (Vulpes vulpes и Vulpes corsac). В используемой выборке группа С была представлена 61 штаммом, изолированным на огромной территории. ПОП степных штаммов существовал приблизительно в 1948 году. В первой половине ХХ века бешенство регистрировали преимущественно среди волков, собак и кошек. В 1942 г. в Астраханской области (один из эндемичных по бешенству районов, в котором циркулируют вирусы-космополиты) зафиксировали первые случаи бешенства енотовидных собак (Nyctereutes procyonoides), а осенью 1945 — зимой 1946 годов зарегистрировали первую на территории СССР в ХХ веке вспышку заболеваемости бешенством среди лисиц [2]. На основании исторических статистических данных ранее было предположено, что именно из этого региона инфекция мелких псовых впоследствии распространилась в

98 пределах всей Великой Степи (обширный степной экорегион, расположенный в центре Евразии) со скоростью 40-60 км/год [98]. В 1949 году было зарегистрировано бешенство среди лисиц в Казахстане. В южной Сибири (Новосибирск) первые случаи бешенства среди лисиц описали в 1958 году [75]. Описанный путь распространения бешенства и гипотеза о возникновении подгрупп С1 и С2 в 1940-х годах были поддержаны результатами молекулярнофилогенетического анализа - ПОП циркулирующих на сегодняшний день на территории Российской Федерации вирусов-космополитов степного типа подгрупп С1 и С2 существовал ориентировочно в 1948 году [95% БДИ=1929– 1964]. Кроме того, описанная вспышка бешенства в Новосибирске в 1958 году соотносится с вычисленными временными промежутками существования ПОП подгруппы С2 – 1956 год [95% БДИ=1941–1970]. Эта подгруппа включает в себя вирусы, изолированные в Омской и Красноярской областях, которые граничат с Новосибирской областью с запада и востока. Таким образом, результат байесовского моделирования совпадает с историческими данными. Быстрое распространение степной группы бешенства на обширных территориях степной и лесостепной Евразии произошло в 1940-х и 1950-х годах и может иллюстрировать так называемую эволюционную модель «биологического большого взрыва» [71, 72]. Эта модель подразумевает две качественно разные стадии эволюционного процесса: инфляционную стадию (создание новых различающихся геновариантов) и стадию медленной эволюции. В 1940-х и 1950-х годах на территории СССР происходили масштабные миграции населения, вызванные социоэкономическими причинами. Вероятнее всего животныепереносчики предка современных степных штаммов вируса бешенства также перемещались и входили в контакт с восприимчивыми к вирусной инфекции эндемичными животными. Внедрение патогена в новую экологическую нишу (например, инфицирование распространению (инфляционная лисиц) могло и диверсификации стадия, приводящая привести вируса к на к стремительному новых возникновению территориях географически и филогенетически дискретных динамических сетей геновариантов вируса). Так как

99 бешенство описано повсеместно и известно с древнейших времен, вероятным является то, что подобные экспансии вирусной популяции происходили ранее, однако следов этих древних событий не осталось вследствие последующей элиминации большинства геновариантов вируса бешенства. Геновариант вируса бешенства, принадлежащий к филогруппе С1a, изолировали в селе Барабаш Приморского края в 2014 году (KP997032). Стоит отметить, что ближайшие описанные родственники этого штамма циркулировали в степных регионах Европейской части Российской Федерации (Липецкая и Воронежская области) и Западно-Казахстанской области республики Казахстан. Например, KP997032 и KT965737 (изолированный в 2014 году в ЗападноКазахстанской области) имеют 99,67% идентичных нуклеотидов в фрагменте Nгена (1228 нуклеотидов). ПОП KP997032 и KT965737 существовал ориентировочно в 2004 году [95% БДИ = 1997-2012]. Расстояние между Уральском (столица Западно-Казахстанской области) и селом Барабаш Приморского края составляет 5817 км, при этом на территории Южной Сибири, Монголии, Казахстана и северо-западных провинций Китая обнаружены вирусыкосмополиты степного типа подгруппы С2, отличные от вирусов, циркулирующих в центрально-чернозѐмном экономическом районе Российской Федерации [7, 18, 22, 89] (Рисунок 20). Поэтому наиболее вероятным механизмом возникновения новой филогруппы на Дальнем Востоке предполагается антропогенный занос геноварианта вируса бешенства из степных экорегионов европейской части России и западного Казахстана в Приморский край, произошедший не ранее 1997 года. В Европе ранее были описано две вероятных исторических смены основного переносчика бешенства [37]. Первая произошла при «перескоке» вируса с популяции собак на популяцию лисиц ориентировочно в начале ХХ века [79]. Это предполагаемое событие привело к возникновению общего предка групп WE, EE, CE и E (Западная, Восточная, Центральная и Северо-Восточная Европа, соответственно) (Рисунок 19). ПОП этих широко распространѐнных европейских

100 подгрупп вируса бешенства существовал примерно в 1889 [95% БДИ = 18581924], что соотносится с эпидемиологической гипотезой. С 1939 года на бывшей советско-польской границе регистрировали миграцию лисиц, зараженных бешенством, в западном направлении. Согласно результатам анализа молекулярных часов ПОП штаммов, выделенных в Польше и Германии (группа СЕ), во Франции и Италии (группа WE) существовал примерно в 1939 году [95% БДИ = 1919-1958], что соответствует полевым данным [30]. Вторая смена переносчика бешенства произошла в северо-восточной Европе в результате инфицирования вирусом бешенства популяции енотовиных собак. В 1928-1957 годах примерно 9100 животных было транспортировано из Восточной Азии в более, чем в 70 административных регионов СССР с целью обогащения фауны пушными животными с ценным мехом [83]. Енотовидные собаки успешно колонизировали западные регионы бывшего СССР. На сегодняшний день этот инвазивный вид распространился по большей части Европы (от Российской Федерации на востоке до Германии на западе, от Финляндии на севере до Словакии и Молдавии на юге). Группа Е (NEE согласно другой классификации[37]) описана в двух основных природных резервуарах: лисицах и енотовидных собаках. Согласно полученным оценкам ПОП этой группы существовал примерно в 1920 году [95% БДИ = 1889-1950]. Кавказское бешенство (группа F) принадлежит ранее описанной группе Iran-1a [88]. Основным переносчиком этой распространѐнной на Среднем Востоке (Ирак, Ирна, Турция) группы являются собаки. Первые российские представители этой группы были выделены в 2005 году [82]. Кроме того, самые глубокие ветви в группе F были образованы штаммами, выделенными на Среднем Востоке (Рисунок 19). На основании изложенного возможно предположить, что эта группа вируса не циркулировала на территории Российской Федерации до 1979 года (минимальное крайнее значение БДИ ПОП российских представителей) и, вероятнее всего, была привнесена в Российскую Федерацию из пограничных государств. Тем не менее, случаи бешенства на Северном Кавказе регистрировались значительно раньше (нуклеотидные последовательности этих

101 вирусов неизвестны). В результате целостная эволюционная история группы F на территории Российской Федерации остаѐтся неизвестной. Подгруппы арктического бешенства А2 и А3 распространены на территории обширного полярного региона; однако их внутригрупповое разнообразие значительно ниже аналогичных показателей для других групп бешенства. Например, N-ген KX954123 (выделен на Земле Франца-Иосифа в 2016 году) обладает 99.3% идентичными нуклеотидами с N-геном JN258592 (выделен на Аляске в 2008). Эти штаммы филогенетически ближе друг к другу, чем к штаммам, выделенным на соседних территориях (Рисунок 19). Значения доли идентичных нуклеотидов среди всех анализированных штаммов подгрупп А2 и А3 составили 97,39-100,00%. Подобное низкое разнообразие может быть объяснено быстрым распространением вируса вследствие дальних миграций полярных лисиц (песцов). Следует отметить, что в марте арктический ледовый покров достигает максимальных значений, и все приполярные территории (Аляска, северная Канада, Гренландия, север России) образуют единый экологический регион (Рисунок 21). Основным переносчиком арктического бешенства являются песцы (Vulpes lagopus), которые способны мигрировать на более чем 5000 км [55]. Таким образом, подгруппы А2 и А3, ПОП которых существовали ориентировочно не ранее 1973 и 1962 (нижние границы БДИ) годов соответственно, распространены на огромных территориях полярного региона вследствие высокой миграционной активности песцов.

102 Рисунок 21. Средний уровень ледового покрова в сентябре (слева) и марте (справа) 2015 года. Лиловая линия обозначает средний уровень ледового покрова за период 1981-2010. Карты были получены от NSIDC (National Snow and Ice Data Center) http://www.nsidc.org/data/seaice_index. Следует отметить, что согласно нашим результатам ПОП всех геновариантов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации, существовал ориентировочно 347 лет назад (95% БДИ = 235-457 лет назад). При этом минимальная нижняя граница БДИ среди всех отдельных групп вируса составила 158 лет назад, то есть все группы вируса бешенства, циркулирующие в настоящее время на территории Российской Федерации, возникли (были занесены) на территорию страны после 1858 года. ПОП всех филогрупп вируса бешенства в мире существовал примерно 749 лет назад (95% БДИ = 363–1215 лет назад) [38]. В то же время, первые случаи заражения человека бешенством описаны более 4 000 лет назад [91], что, на первый взгляд, противоречит результатам молекулярно-филогенетических анализов. Это возможно объяснить двумя вероятными причинами: 1) в ходе эволюционного процесса неизбежно

103 появляются геноварианты вируса, обладающие повышенной приспособляемостью к изменениям окружающей среды, и, как следствие, вытесняющие другие подгруппы вируса (происходит положительный отбор); 2) динамическая сеть взаимосвязанных мутантных форм вируса бешенства находится в состоянии шаткого равновесия, балансируя на грани вымирания, постоянно проходя через «бутылочные горлышки» (периоды резкого сокращения генетического разнообразия). Анализ соотношения синонимичных и несинонимичных замен в геноме вируса бешенства позволяет считать, что положительный отбор не играет существенной роли в эволюции вируса бешенства [38, 63]. Поэтому предполагается наиболее вероятной гипотеза о том, что большая часть линий вируса периодически вымирает по стохастическим причинам (Рисунок 22), вследствие чего наблюдается сравнительно низкое генетическое разнообразие современных штаммов вируса бешенства. Это подтверждается литературными данными по истории эпизоотий бешенства в Европе – в первой половине XIX века бешенство у лисиц было распространенно широко, начиная с 1850-х годов случаев заболеваемости людей бешенством в результате укусов лисицами практически не регистрировали [98]. Впоследствии были описаны случаи бешенства среди лисиц на территории современной Польши лишь в 1940-х годах [30], откуда инфекция затем распространилась в другие государства Европы.

104 Рисунок 22. Схематическое отображение эффекта прохождения "бутылочного горлышка" на генетическое разнообразие популяции [1]. Следует отметить успешный опыт проведения оральной вакцинации диких плотоядных животных в странах Западной Европы. Мы предполагаем, что искоренение инфекции стало возможным в первую очередь по причине неустойчивости персистенции вируса в популяции диких плотоядных животных (отсутствовала животных). необходимость охвата 100% особей популяции хищных Низкий уровень генетического разнообразия является признаком неустойчивой популяции вируса. Хотя на территории Российской Федерации выделяют 6 филогенетически дискретных групп вируса бешенства, ареалы их распространения практически не пересекаются, то есть в каждом отдельно взятом экологическом регионе генетическое разнообразие патогена невелико. Бешенство передаѐтся преимущественно путѐм прямого физического контакта. Поэтому для эффективной трансмиссии необходима высокая плотность популяции животных-переносчиков [30]. Этот параметр постоянно флуктуирует вследствие изменяющихся условий окружающей среды, что может приводить к

105 вымиранию геновариантов вируса бешенства. Тем не менее после сокращения популяции животных-переносчиков до критического уровня и элиминации вируса популяция, как правило, быстро восстанавливается и становится восприимчивой для распространения новых геновариантов вируса. Проведѐнный анализ поддерживает эту модель, подразумевающую регулярные экспансии и элиминации вирусных популяций. Этот вывод имеет большое практическое значение. Теоретически существует два способа элиминации бешенства. Этого можно достигнуть либо путѐм частичного истребления животных-переносчиков, приводящего к сокращению плотности популяции хозяев вируса, либо проведением оральной вакцинации животных, снижая плотность восприимчивых к инфекции особей. Попытки контролировать распространение бешенства в Европе путѐм истребления части популяции переносчиков были признаны неэффективными [30]. В то же время проведение оральной вакцинации диких плотоядных животных в западноевропейских странах (Рисунок 12,13) привели к положительному результату [107]. Ранее в Российской Федерации проводили безуспешные кампании оральной вакцинации диких плотоядных животных, скомпрометировавшие возможность элиминации бешенства [1], хотя подобный исход мог быть вызван плохой организацией программы мероприятий[15]. С учѐтом того, что согласно полученным результатам на продолжительных временных интервалах вирусная популяция является нестабильной и может исчезать по естественным причинам, усиление давления окружающей среды на вирусную популяцию путѐм оральной вакцинации диких плотоядных животных должно привести к искоренению вируса. Тем не менее для детальной разработки стратегии эффективной элиминации бешенства на федеральном уровне необходимы дальнейшие полевые исследования. В то же время некоторые естественные резервуары бешенства (например, летучие мыши) не могут быть вовлечены в программы оральной вакцинации диких плотоядных животных [93]. Поэтому даже в случае искоренения наиболее широко распространѐнных геновариантов вируса бешенства, глобальная элиминация бешенства и других

106 лиссавирусных инфекций представляется маловероятной вследствие возможности межвидового перехода вируса [31].

107 4.4 Несмотря на Заключение значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики заболеваемости бешенством, инфекция продолжает оказывать значимый социально-экономический эффект на человеческое сообщество, оставаясь самым смертоносным зоонозом. Территория Российской Федерации является эндемичной по бешенству – ежегодно регистрируются тысячи случаев заболеваемости среди животных. Точный диагноз бешенства может быть установлен только на основании проведения лабораторных исследований, и его постановка часто требует применения комплекса методов. Разработка стандартизированного набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени позволяет использовать дополнительный диагностический метод и совершенствовать диагностику в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Это, в свою очередь, улучшает эффективность мероприятий по эпидемиологическому надзору за рабической инфекцией. Филогенетический анализ показал, что обособленные группы вируса бешенства, представляющие собой динамические сети взаимосвязанных мутантных форм, циркулируют в различных экологических регионах. Временная датировка основных эволюционных событий позволила предположить отсутствие долговременной циркуляции геновариантов вируса на территории Российской Федерации. Это означает, что популяция вируса бешенства находится под давлением стохастических факторов окружающей среды, является нестабильной и может исчезать по естественным причинам. В отсутствие дополнительного давления со стороны вакцинации сохранившиеся штаммы вируса способны стремительно заполнять экологические ниши. В странах Западной Европы проведение масштабной и чѐтко регламентированной кампании оральной вакцинации диких плотоядных привело к возникновению невосприимчивой к

108 бешенству прослойке животных, повысив давление среды на популяцию вируса. В результате этих мер достигнуто искоренение бешенства в странах Западной Европы. Результаты проведѐнного филогенетического анализа свидетельствуют о том, что при условии проведения регламентированных мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных в отдельных регионах Российской Федерации возможна элиминация вируса бешенства. Тем не менее, для разработки стратегии эффективной элиминации бешенства на федеральном уровне необходимы дальнейшие полевые исследования.

109 ВЫВОДЫ Разработана диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном 1. времени для выявления РНК штаммов классического вируса бешенства RABV. Разработанная 2. диагностическая система обладает высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности и позволяет проводить выявление РНК любых геновариантов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации. Предлагаемый подход может применяться как в рамках надзорных мероприятий, так и для расшифровки случаев бешенства у животных и человека. При проведении работ по расшифровке случаев нейроинфекции 3. неясной этиологии рекомендуется проводить проверку биологического материала на наличие РНК вируса бешенства. С 4. использованием метода молекулярных часов выполнено датирование появления разных геновариантов вируса бешенства на территории Российской Федерации. Показано, что все группы вируса бешенства, циркулирующие в настоящее время на территории Российской Федерации, возникли (были занесены) на территорию страны после 1858 года. 5. Показано отсутствие долговременной циркуляции геновариантов вируса на территории Российской Федерации. Это означает, что популяция вируса бешенства находится под давлением стохастических факторов окружающей среды, является нестабильной и может исчезать по естественным причинам. При условии проведения чѐтко регламентированных мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных в отдельных регионах Российской Федерации возможна элиминация вируса бешенства.

110 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ BHQ – Black Hole Quencher; Ct – Cycle threshold, пороговый цикл; LD50 – полулетальная доза; R6G – Rhodamine 6G; RABV – Rabies virus, вирус бешенства; АВ – апостериорная вероятность; БДИ – байесовский доверительный интервал; ВОЗ – всемирная организация здравоохранения; ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; ИФА – иммуноферментный анализ; кДНК – комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота; крс – крупный рогатый скот; лРНК – лидерная рибонуклеиновая кислота; Мл – милилитр; мРНК – мессенджерная рибонуклеиновая кислота; МФА – метод флуоресцирующих антител; ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; ПОП – последний общий предок; ПЦР – полимеразная цепная реакция; РДП – реакция диффузионной преципитации; РНК – рибонуклеиновая кислота; СОП – стандартный образец предприятия;

111 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авилов В.М. Иммунизация антирабическими вакцинами диких плотоядных в зонах повышенного риска этой инфекции / В. М. Авилов, В. В. Сочнев, И. Н. Резябкин, А. А. Алиев, А. В. Саввин, И. И. Горячев // Ветеринарная патология – 2004. – Т. 3– С. 134–138 2. Березина Е.С. Значение мелких диких псовых в заболеваемости людей бешенством в России / Е. С. Березина, Г. Н. Сидоров, Е. М. Полещук, Д. Г. Сидорова // Российский ветеринарный журнал – 2011. – Т. 2– С. 26–29 3. ГОСТ 26075-2013 Методы лабораторной диагностики бешенства – 2014. – 12с. 4. ГОСТ 26075-84. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства. – 1984. – 10с. 5. Девяткин А.А. Характеристика набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства (rabies virus) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени «Амплисенс® RABV-FL» / А. А. Девяткин, М. В. Бекова, В. Г. Дедков, Е. М. Полещук, Г. А. Шипулин // Инфекция и Иммунитет – 2014. – Т. 17– С. 191–195 6. Девяткин А.А. Разработка набора реагентов «Амплисенс® RABV-FL» для выявления РНК вируса бешенства (rabies virus) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией / А. А. Девяткин, М. В. Бекова, В. Г. Дедков, Е. М. Полещук, Г. А. Шипулин // материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием ―Молекулярная диагностика 2014‖. - Москва. – 2014. – С. 454–455 7. Девяткин А.А. Полногеномное секвенирование вирусов бешенства , изолированных на территории России / А. А. Девяткин, В. Г. Дедков, Е. М. Полещук, Г. Н. Сидоров, Ю. В. Очкасова, И. А. Ходякова, М. Л. Маркелов, Г. А. Шипулин // Материалы научно-практической конференции ―Диагностика и профилактика инфекционных болезней‖ - Новосибирск – 2013. – С. 127–128

112 8. Девяткин А.А. Молекулярная эпидемиология вируса бешенства на территории Российской Федерации / А. А. Девяткин, А. Н. Лукашев, Е. М. Полещук, С. Е. Ткачѐв, В. Г. Дедков, Г. Н. Сидоров, М. Ю. Щелканов, И. В. Галкина, Г. Г. Карганова, М. В. Гаврило, Г. А. Шипулин, Ф. Центральный, Ф. Институт, М. П. Чумакова // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика – 2017. – Т. 1 – № 92 – С. 39–42 9. Дедков В.Г. Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области / В. Г. Дедков, М. В. Бекова, А. А. Девяткин, К. В. Кулешов, Е. М. Полещук, М. Л. Маркелов, Г. А. Шипулин // материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием ―Молекулярная диагностика 2014‖. - Москва. – 2014. – С. 453–454 10. Дедков В.Г. Разработка и апробация набора реагентов для определения РНК классического вируса бешенства методом ОТ-ПЦР в реальном времени / В. Г. Дедков, А. А. Девяткин, Е. М. Полещук, М. В. Сафонова, М. Л. Маркелов, Г. А. Шипулин // Вопросы вирусологии – 2016. – Т. 61 – № 5– С. 235–240 11. Информационный бюллетень ВОЗ № 99 – 2015. 12. Кузьмичев Б.Ю. Клинико-эпидемиологическая характеристика бешенства в Астраханской области / Б. Ю. Кузьмичев, Л. П. Черенова // Концепт – 2016. – Т. 15 – С. 671–675 13. Леонова Г.Н. Впервые выявленный случай лиссавирусной инфекции в Приморском крае / Г. Н. Леонова, И. В. Ченцова, С. А. Петухова, Л. М. Сомова, С. И. Беликов, И. Г. Кондратов, Н. В. Крылова, Н. Г. Плехова, Е. В. Павленко, Е. В. Романова, В. А. Мацак, Г. А. Смирнов, Д. В. Новиков // Тихоокеанский медицинский журнал – 2010. – Т. 3 – С. 90–94 14. Ляпина Е.П. Клинико-эпидемиологические особенности бешенства на территории Саратовской области / Е. П. Ляпина, М. С. Эдиев, Н. Н. Красильникова, Г. М. Кожевникова, Е. В. Воробьева, А. В. Помякшева, Е. А. Никифорова // Эпидемиология и инфекционные болезни. актуальные вопросы – 2012. – Т. 1. – С. 14–17 15. Макаров В.В. Оральная вакцинация лисиц против бешенства безальтернативна

113 / В. В. Макаров // Ветеринарная патология – 2009. – Т. 4– С. 2–5 16. Мовсесянц А.А. Медицинские иммунобиопрепараты для специфической профилактики бешенства / А. А. Мовсесянц, Г. Б. Агеенко // Ветеринарная патология – 2002. – С. 48–51 17. Отчѐт Россельхознадзора «Эпизоотическая ситуация в РФ» за 2014 год 18. Очкасова Ю.В. Вирусологические особенности рабической инфекции на территории / Ю. В. Очкасова, И. А. Ходякова, И. А. Щукина, С. И. Савельев, Е. М. Полещук, Г. Н. Сидоров, С. Е. Ткачев, А. А. Девяткин, В. Г. Дедков, А. . Голенских // материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием ―Молекулярная диагностика 2014‖. - Москва. – 2014. 19. Полещук Е.М. Пути совершенствования лабораторной диагностики бешенства на территории россии / Е. М. Полещук, А. А. Девяткин, М. В. Бекова, В. Г. Дедков // Инфекция и Иммунитет – 2014. – Т. 4 – № 1– С. 85–86 20. Полещук Е.М.Бешенство в Российской Федерации. Информационноаналитический бюллетень / Е. М. Полещук, Г. Н. Сидоров, Е. С. Березина – Омск. 2013.– 64c. 21. Полещук Е.М. Бешенство животных в России в 2007—2011 гг / Е. М. Полещук, Г. Н. Сидоров, Д. Г. Сидорова // Российский ветеринарный журнал – 2012. – Т. 6 – С. 8–12 22. Полещук Е.М. Эколого-вирусологические особенности эпизоотического процесса бешенства в Центрально-Чернозѐмном районе России / Е. М. Полещук, Г. Н. Сидоров, С. Е. Ткачѐв, А. А. Девяткин, В. Г. Дедков, Ю. В. Очкасова, И. А. Ходякова, И. А. Щукина, С. И. Савельев, А. Г. Голенских, С. Б. Носков, Е. С. Бережная, Н. М. Чешева, Е. А. Колесников // Ветеринарная патология – 2013. – Т. 2– С. 101–108 23. Фракасторо Д.О контагии, контагиозных болезнях и лечении / Д. Фракасторо / под ред. К.М. Быков. – Издательство Академии наук СССР, 1954.– 324c. 24. Хисматуллина Н.А. Ускоренный метод диагностики бешенства в культуре клеток невриномы гассерова узла крысы (НГУК-1) / Н. А. Хисматуллина, А. М. Гулюкин, Э. А. Шуралев, К. С. Хаертынов, А. Н. Чернов, М. Н. Филимонова, А.Ф.

114 Авзалова, А. В. Паршикова, А. В. Иванов // Гены и Клетки – 2014. – Т. 9 – № 3– С. 276–280 25. Черкасский Б.Л.Справочник по особо опасным инфекциям / Б. Л. Черкасский – Москва: Медицина, 1996.– 160c. 26. Щелканов М.Ю. Изоляция и секвенирование полноразмерного генома штамма вируса бешенства, изолированного от бурого медведя (Ursus arctos), напавшего на человека в Приморском крае (ноябрь 2014 г.) / М. Ю. Щелканов, А. А. Девяткин, В. Ю. Ананьев, И. . Домбровская, В. Г. Дедков, А. В. Ардашев, С. А. Коломеец, Е. В. Фролов, Н. А. Порошин, И. П. Короткова, Е. Н. Любченко, В. В. Бандеев, М. Н. Просянникова, И. В. Галкина, Е. С. Иванушко, Н. П. Емельянова, Н. И. Баранов, С. А. Ульянова, С. В. Арамилев, П. В. Фоменко, А. Л. Суровый, Н. Н. Сокол, Д. В. Маслов, Е. Е. Махиня, Г. А. Шипулин // Вопросы вирусологии – 2016. – Т. 61 – № 4– С. 180–186 27. Abel S. Analysis of Bottlenecks in Experimental Models of Infection. / S. Abel, P. Abel zur Wiesch, B. M. Davis, M. K. Waldor // PLoS Pathog. – 2015. – V. 11 – Issue 6– e1004823p. 28. Ahmed K. Molecular Epidemiology of Rabies Viruses Circulating in Two Rabies Endemic Provinces of Laos, 2011–2012: Regional Diversity in Southeast Asia / K. Ahmed, P. Phommachanh, P. Vorachith, T. Matsumoto, P. Lamaningao, D. Mori, M. Takaki, B. Douangngeun, B. Khambounheuang, A. Nishizono // PLoS Negl. Trop. Dis. – 2015. – V. 9 – Issue 3– e0003645p. 29. Albertini A.A.V. Crystal Structure of the Rabies Virus Nucleoprotein-RNA Complex / A. A. V. Albertini, A. K. Wernimont, T. Muziol, R. B. G. Ravelli, C. R. Clapier, W. Weissenhorn, R. W. H. Ruigrok // Science (80-. ). – 2006. – V. 313 – Issue 5785– P. 360–363 30. Anderson R.M. Population dynamics of fox rabies in Europe / R. M. Anderson, H. C. Jackson, R. M. May, A. M. Smith // Nature – 1981. – V. 289 – Issue 5800 – P. 765– 771 31. Badrane H. Host switching in Lyssavirus history from the Chiroptera to the Carnivora orders. / H. Badrane, N. Tordo // J. Virol. – 2001. – V. 75 – Issue 17– P.

115 8096–8104 32. Benmansour A. Rapid sequence evolution of street rabies glycoprotein is related to the highly heterogeneous nature of the viral population / A. Benmansour, M. Brahimi, C. Tuffereau, P. Coulon, F. Lafay, A. Flamand // Virology – 1992. – V. 187 – Issue 1– P. 33–45 33. Black J.G. Further studies of sylvatic rabies in the fox (Vulpes vulpes). Vaccination by the oral route / J. G. Black, K. F. Lawson // Can. Vet. J. – 1973. – V. 14 – Issue 9– P. 206–211 34. Boland T.A. Phylogenetic and Epidemiologic Evidence of Multiyear Incubation in Human Rabies / T. A. Boland, D. McGuone, J. Jindal, M. Rocha, M. Cumming, C. E. Rupprecht, T. F. S. Barbosa, R. de N. Oliveira, C. J. Chu, A. J. Cole, I. Kotait, N. A. Kuzmina, P. A. Yager, I. V. Kuzmin, E. T. Hedley-Whyte, C. M. Brown, E. S. Rosenthal // Ann Neurol – 2009. – V. 130 – Issue 29 – P. 9492–9499 35. Bouckaert R. BEAST 2: A Software Platform for Bayesian Evolutionary Analysis / R. Bouckaert, J. Heled, D. Kuhnert, T. Vaughan, C. H. Wu, D. Xie, M. A. Suchard, A. Rambaut, A. J. Drummond // PLoS Comput. Biol. – 2014. – V. 10 – Issue 4 – P.1–6 36. Bourhy H. Phylogenetic relationships among rhabdoviruses inferred using the L polymerase gene. / H. Bourhy, J. a Cowley, F. Larrous, E. C. Holmes, P. J. Walker // J. Gen. Virol. – 2005. – V. 86– Issue 10– P. 2849–2858 37. Bourhy H. Ecology and evolution of rabies virus in Europe. / H. Bourhy, B. Kissi, L. Audry, M. Smreczak, M. Sadkowska-Todys, K. Kulonen, N. Tordo, J. F. Zmudzinski, E. C. Holmes // J. Gen. Virol. – 1999. – V. 80 Issue 10 – P. 2545–2557 38. Bourhy H. The origin and phylogeography of dog rabies virus. / H. Bourhy, J.-M. Reynes, E. J. Dunham, L. Dacheux, F. Larrous, V. T. Q. Huong, G. Xu, J. Yan, M. E. G. Miranda, E. C. Holmes // J. Gen. Virol. – 2008. – V. 89– Issue 11– P. 2673–2681 39. Brunker K. Elucidating the phylodynamics of endemic rabies virus in eastern Africa using whole-genome sequencing / K. Brunker, D. a Marston, D. L. Horton, S. Cleaveland, A. R. Fooks, R. Kazwala, C. Ngeleja, T. Lembo, M. Sambo, Z. J. Mtema, L. Sikana, G. Wilkie, R. Biek, K. Hampson // Virus Evol. – 2015. – V. 1 – Issue 1– P. 1–11

116 40. Cleaveland S. Estimating human rabies mortality in the United Republic of Tanzania from dog bite injuries. / S. Cleaveland, E. M. Fèvre, M. Kaare, P. G. Coleman // Bull. World Health Organ. – 2002. – V. 80 – Issue 4 – P. 304–310 41. Crepin P. Intravitam diagnosis of human rabies by PCR using saliva and cerebrospinal fluid / P. Crepin, L. Audry, Y. Rotivel, A. Gacoin, C. Caroff, H. Bourhy // J. Clin. Microbiol. – 1998. – V. 36 – Issue 4 – P. 1117–1121 42. Dacheux L. A reliable diagnosis of human rabies based on analysis of skin biopsy specimens. / L. Dacheux, J.-M. Reynes, P. Buchy, O. Sivuth, B. M. Diop, D. Rousset, C. Rathat, N. Jolly, J.-B. Dufourcq, C. Nareth, S. Diop, C. Iehlé, R. Rajerison, C. Sadorge, H. Bourhy // Clin. Infect. Dis. – 2008. – V. 47 – Issue 11– P. 1410–1417 43. Dedkov V.G. Retrospective diagnosis of two rabies cases in humans by high throughput sequencing / V. G. Dedkov, A. N. Lukashev, A. A. Deviatkin, K. V. Kuleshov, M. V. Safonova, E. M. Poleshchuk, J. F. Drexler, G. A. Shipulin // J. Clin. Virol. – 2016. – V. 78– P. 74–81 44. Delmas O. Genomic diversity and evolution of the lyssaviruses. / O. Delmas, E. C. Holmes, C. Talbi, F. Larrous, L. Dacheux, C. Bouchier, H. Bourhy // PLoS One – 2008. – V. 3 – Issue 4– e2057 45. Deviatkin A.A. The phylodynamics of the rabies virus in the Russian Federation / A. A. Deviatkin, A. N. Lukashev, E. M. Poleshchuk, V. G. Dedkov, S. E. Tkachev, G. N. Sidorov, G. G. Karganova, I. V. Galkina, M. Y. Shchelkanov, G. A. Shipulin // PLoS One – 2017. – V. 12 – Issue 2– e0171855p. 46. Dietzgen R.G.Rhabdoviruses Taxonomy / R. G. Dietzgen, I. V Kuzmin / ed. R.G. Dietzgen, I. V Kuzmin. – Norfolk, UK: Caister Academic Press, 2012 – 279 p. 47. Dietzschold B. New approaches to the prevention and eradication of rabies. / B. Dietzschold, M. Faber, M. J. Schnell // Expert Rev. Vaccines – 2003. – V. 2 – Issue 3– P. 399–406 48. Dupuis M. Comparison of Automated Quantitative Reverse Transcription-PCR and Direct Fluorescent-Antibody Detection for Routine Rabies Diagnosis in the United States / M. Dupuis, S. Brunt, K. Appler, A. Davis, R. Rudd // J. Clin. Microbiol. – 2015. – V. 53 – Issue 9– P. 2983–2989

117 49. Faber M. Overexpression of the Rabies Virus Glycoprotein Results in Enhancement of Apoptosis and Antiviral Immune Response Overexpression of the Rabies Virus Glycoprotein Results in Enhancement of Apoptosis and Antiviral Immune Response / M. Faber, R. Pulmanausahakul, S. Suchita, S. Spitsin, J. P. Mcgettigan, M. J. Schnell, B. Dietzschold, S. S. Hodawadekar // J. Virol. – 2002. – V. 76 – Issue 7– P. 3374–3381 50. Fischer M. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. / M. Fischer, K. Wernike, C. M. Freuling, T. Müller, O. Aylan, B. Brochier, F. Cliquet, S. Vázquez-Morón, P. Hostnik, A. Huovilainen, M. Isaksson, E. a Kooi, J. Mooney, M. Turcitu, T. B. Rasmussen, S. Revilla-Fernández, M. Smreczak, A. R. Fooks, D. a Marston, M. Beer, B. Hoffmann // PLoS One – 2013. – V. 8 – Issue 3– e58372 51. Fooks A.R. Rabies remains a ―neglected disease‖ / A. R. Fooks // Eurosurveillance – 2005. – V. 10 – Issue 10–12– P. 211–212 52. Fooks A.R. Current status of rabies and prospects for elimination. / A. R. Fooks, A. C. Banyard, D. L. Horton, N. Johnson, L. M. McElhinney, A. C. Jackson // Lancet – 2014. – V. 6736 – Issue 13– P. 1–11 53. Freuling C. The elimination of fox rabies from Europe: determinants of success and lessons for the future / C. Freuling, K. Hampson, T. Selhorst, R. Schroder, F. X. Meslin, T. C. Mettenleiter, T. Muller // Philos. Trans. R. Soc. B – 2013. – V. 368 – Issue 1623– 20120142 54. Gong W. Temporal and spatial dynamics of rabies viruses in China and Southeast Asia. / W. Gong, Y. Jiang, Y. Za, Z. Zeng, M. Shao, J. Fan, Y. Sun, Z. Xiong, X. Yu, C. Tu // Virus Res. – 2010. – V. 150 – Issue 1 – P. 111–118 55. Hamilton G. Polar nomads: Ghost foxes of the Arctic / G. Hamilton // New Sci. – 2011. URL: https://www.newscientist.com/article/mg20927981-700-polar-nomadsghost-foxes-of-the-arctic/ 56. Hanke D. Spatio-temporal Analysis of the Genetic Diversity of Arctic Rabies Viruses and Their Reservoir Hosts in Greenland / D. Hanke, C. M. Freuling, S. Fischer, K. Hueffer, K. Hundertmark, S. Nadin-Davis, D. Marston, A. R. Fooks, A. Bøtner, T. C. Mettenleiter, M. Beer, T. B. Rasmussen, T. F. Müller, D. Höper // PLoS Negl. Trop.

118 Dis. – 2016. – V. 10 – Issue 7– e0004779 57. Hayman D.T.S. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses David / D. T. S. Hayman, A. C. Banyard, P. R. Wakeley, G. Harkess, D. Marston, J. L. N. Wood, A. A. Cunningham, A. R. Fooks, W. Z. Group, I. D. Consortium, M. Road, R. Park, F. Collins, C. High // J. Virol. Methods – 2011. – V. 177 – Issue 1– P. 87–93 58. Hemachudha T. Human rabies : neuropathogenesis , diagnosis , and / T. Hemachudha, G. Ugolini, S. Wacharapluesadee, W. Sungkarat, S. Shuangshoti, J. Laothamatas // Lancet Neurol. – 2013. – V. 12 – Issue 5– P. 498–513 59. Hoffmann B. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR ―double check‖ strategy. / B. Hoffmann, C. M. Freuling, P. R. Wakeley, T. B. Rasmussen, S. Leech, a R. Fooks, M. Beer, T. Müller // J. Clin. Microbiol. – 2010. – V. 48 – Issue 11 – P. 3970–3978 60. Horsley V. On rabies : its treatment by M. Pasteur, and on the means of detecting it in suspected cases / V. Horsley // Br. Med. J. – 1889. – P. 342–344 61. Horton D.L. Complex Epidemiology of a Zoonotic Disease in a Culturally Diverse Region: Phylogeography of Rabies Virus in the Middle East / D. L. Horton, L. M. McElhinney, C. M. Freuling, D. a. Marston, A. C. Banyard, H. Goharrriz, E. Wise, A. C. Breed, G. Saturday, J. Kolodziejek, E. Zilahi, M. F. Al-Kobaisi, N. Nowotny, T. Mueller, A. R. Fooks // PLoS Negl. Trop. Dis. – 2015. – V. 9– e0003569 62. International Committee on Taxonomy of Viruses2014 Release. EC 46 / International Committee on Taxonomy of Viruses – Montreal, Canada, 2014. 63. Jackson A.C.research advances in Rabies / A. C. Jackson – Elsevier Inc., 2011. 64. Jackson A.C.Rabies: scientific basis of the disease and its management / A. C. Jackson / ed. A.C. Jackson. – – San Diego: Elsevier, 2013. Third Edit. 65. Jackson A.C.Rabies / A. C. Jackson, W. H. Wunner / ed. A.C. Jackson, W.H. Wunner. – – Amsterdam: Elsevier/Academic, 2007. second edi. 66. Kibbe W.A. OligoCalc: An online oligonucleotide properties calculator / W. A. Kibbe // Nucleic Acids Res. – 2007. – V. 35– P. 43–46 67. Kienzle T.E.Rabies / T. E. Kienzle / ed. T.E. Kienzle. – – New York, 2007. 68. King A.M.Q.IXth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses /

119 A. M. Q. King, M. J. Adams, E. B. Carstens, E. J. Lefkowitz / ed. A.M.Q. King, M.J. Adams, E.B. Carstens, E.J. Lefkowitz. – 2012. 69. Knipe D.M.Field’s Virology / D. M. Knipe, P. M. Howley / ed. D.M. Knipe, P.M. Howley. – Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, 2013. Вып. 6th ed. 70. Knobel D.L. Re-evaluating the burden of rabies in Africa and Asia / D. L. Knobel, S. Cleaveland, P. G. Coleman, E. M. Fèvre, M. I. Meltzer, M. Miranda, E. G, A. Shaw, J. Zinsstag, F. Meslin // Bull. World Health Organ. – 2005. – V. 83 – Issue 3– P. 360– 366 71. Koonin E. V The Biological Big Bang model for the major transitions in evolution. / E. V Koonin // Biol. Direct – 2007. – V. – P. 2– 21 72. Koonin E. V The Big Bang of picorna-like virus evolution antedates the radiation of eukaryotic supergroups. / E. V Koonin, Y. I. Wolf, K. Nagasaki, V. V Dolja // Nat. Rev. Microbiol. – 2008. – V. 6 – Issue 12– P. 925–939 73. Kumar D.Rabies / D. Kumar – Westport, Connecticut: Greenwood Press, 2009. 74. Kuzmin I. V. Molecular inferences suggest multiple host shifts of rabies viruses from bats to mesocarnivores in Arizona during 2001-2009 / I. V. Kuzmin, M. Shi, L. A. Orciari, P. A. Yager, A. Velasco-Villa, N. A. Kuzmina, D. G. Streicker, D. L. Bergman, C. E. Rupprecht // PLoS Pathog. – 2012. – V. 8 – Issue 6. 75. Kuzmin I. V Molecular epidemiology of terrestrial rabies in the former Soviet Union / I. V Kuzmin, A. D. Botvinkin, L. M. McElhinney, J. S. Smith, L. A. Orciari, G. J. Hughes, A. R. Fooks, C. E. Rupprecht // J. Wildl. Dis. – 2004. – V. 40 – Issue 4– P. 617–631 76. Kuzmin I. V Arctic and Arctic-like rabies viruses: distribution, phylogeny and evolutionary history. / I. V Kuzmin, G. J. Hughes, A. Botvinkin, S. G. Gribencha, C. E. Rupprecht // Epidemiol. Infect. – 2008. – V. 136 – Issue 4 – P. 509–519 77. Lahaye X. Functional characterization of Negri bodies (NBs) in rabies virusinfected cells: Evidence that NBs are sites of viral transcription and replication. / X. Lahaye, A. Vidy, C. Pomier, L. Obiang, F. Harper, Y. Gaudin, D. Blondel // J. Virol. – 2009. – V. 83 – Issue 16– P. 7948–7958

120 78. Lauring A.S. The role of mutational robustness in RNA virus evolution / A. S. Lauring, J. Frydman, R. Andino // Nat. Rev. Microbiol. – 2013. – V. 11 – Issue 5– P. 327–336 79. McElhinney L.M. Molecular diversity and evolutionary history of rabies virus strains circulating in the Balkans. / L. M. McElhinney, D. A. Marston, C. M. Freuling, W. Cragg, S. Stankov, D. Lalosević, V. Lalosević, T. Müller, A. R. Fooks, D. Lalosevic, V. Lalosevic, T. Müller, A. R. Fooks // J. Gen. Virol. – 2011. – V. 92– Issue Pt 9– P. 2171–2180 80. Mebatsion T. Budding of rabies virus particles in the absence of the spike glycoprotein. / T. Mebatsion, M. Konig, K. K. Conzelmann // Cell – 1996. – V. 84 – Issue 6– P. 941–951 81. Melorose J.Harrison’s principles of internal medicine / J. Melorose, R. Perroy, S. Careas – , 2015. 17th ed. 82. Metlin A. Genetic heterogeneity of Russian, Estonian and Finnish field rabies viruses. / A. Metlin, S. Rybakov, K. Gruzdev, E. Neuvonen, A. Huovilainen // Arch. Virol. – 2007. – V. 152 – Issue 9– P. 1645–1654 83. Mulder J.L. A review of the ecology of the raccoon dog (Nyctereutes procyonoides) in Europe / J. L. Mulder // Lutra – 2012. – V. 55 – Issue 2– P. 101–127 84. Müller T.F. Spatio-temporal Use of Oral Rabies Vaccines in Fox Rabies Elimination Programmes in Europe / T. F. Müller, R. Schröder, P. Wysocki, T. C. Mettenleiter, C. M. Freuling // PLoS Negl. Trop. Dis. – 2015. – V. 9 – Issue 8– e0003953 85. Nadin-Davis S.A.Lyssaviruses: current trends. / S. A. Nadin-Davis, C. FehlnerGardiner / ed. M. Kielian, K. Maramorosch, T.C. Mettenleiter. – , 2008.– P. 207-250 86. Nadin-Davis S.A. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis / S. A. Nadin-Davis, M. Sheen, A. I. Wandeler // J Med Virol – 2009. – V. 81 – Issue 8– P. 1484–1497 87. Nadin-Davis S.A. Recent emergence of the Arctic rabies virus lineage. / S. A. Nadin-Davis, M. Sheen, A. I. Wandeler // Virus Res. – 2012. – V. 163 – Issue 1– P. 352–62 88. Nadin-Davis S.A. Molecular and antigenic characterization of rabies viruses from

121 Iran identifies variants with distinct epidemiological origins. / S. A. Nadin-Davis, S. Simani, J. Armstrong, A. Fayaz, A. I. Wandeler // Epidemiol. Infect. – 2003. – V. 131 – Issue 1 – P. 777–790 89. Poleshchuk E.M. Complete Genome Sequences of Four Virulent Rabies Virus Strains Isolated from Rabid Animals in Russia / E. M. Poleshchuk, A. A. Deviatkin, V. G. Dedkov, G. N. Sidorov, J. V Ochkasova, I. A. Hodjakova, I. A. Schukina, S. I. Savel’ev, A. G. Golenskih, G. A. Shipulin // Genome Announc. – 2013. – V. 1 – Issue 3– e00140-13-e00140-13 90. Reed L.J. A simple method of estimation of fifty percent endpoints / L. J. Reed, H. Muench // Am. J Hyg – 1938. – V. 27– P. 493–497 91. Rosner F. Rabies in the Talmud / F. Rosner // Med Hist. – 1974. – P. 198–200 92. Ross R.S. Instructive even after a decade: Complete results of initial virological diagnostics and re-evaluation of molecular data in the German rabies virus ―outbreak‖ caused by transplantations / R. S. Ross, B. Wolters, B. Hoffmann, L. Geue, S. Viazov, N. Grüner, M. Roggendorf, T. Müller // Int. J. Med. Microbiol. – 2015. – V. 305 – Issue 7– P. 636–643 93. Rupprecht C.E. Why we can prevent, control and possibly treat – but will not eradicate – rabies / C. E. Rupprecht, I. V Kuzmin // Future Virol. – 2015. – V. 10 – Issue 5– P. 517–535 94. Saito M. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. / M. Saito, H. Oshitani, J. R. C. Orbina, K. Tohma, A. S. de Guzman, T. Kamigaki, C. S. Demetria, D. L. Manalo, A. Noguchi, S. Inoue, B. P. Quiambao // PLoS Negl. Trop. Dis. – 2013. – V. 7 – Issue 4– e2144 95. Schnell M.J. The cell biology of rabies virus: using stealth to reach the brain. / M. J. Schnell, J. P. McGettigan, C. Wirblich, A. Papaneri // Nat. Rev. Microbiol. – 2010. – V. 8 – Issue 1– P. 51–61 96. Seetahal J.F.R. Evolutionary History and Phylogeography of Rabies Viruses Associated with Outbreaks in Trinidad / J. F. R. Seetahal, A. Velasco-Villa, O. M. Allicock, A. a. Adesiyun, J. Bissessar, K. Amour, A. Phillip-Hosein, D. a. Marston, L. M. McElhinney, M. Shi, C. A. Wharwood, A. R. Fooks, C. V. F. Carrington // PLoS

122 Negl. Trop. Dis. – 2013. – V. 7 – Issue 8– P. 1–9 97. Shchelkanov M.Y. Complete Genome Sequence of a Rabies Virus Strain Isolated from a Brown Bear ( Ursus arctos ) in Primorsky Krai, Russia (November 2014) / M. Y. Shchelkanov, A. A. Deviatkin, V. Y. Ananiev, V. G. Dedkov, G. A. Shipulin, N. N. Sokol, I. E. Dombrovskaya, I. V. Galkina, M. E. Shmelev, V. N. Gorelikov, V. N. Kozhan, M. N. Prosyannikova, S. V. Aramilev, P. V. Fomenko // Genome Announc. – 2016. – V. 4 – Issue 4– e00642-16 98. Sidorov G.N. Aspects of the historical development of raibes natural foci in Europe and northern Asia / G. N. Sidorov // Vet Pathol. – 2002. – V. 1– P. 21–25 99. Smith J.M. Analyzing the mosaic structure of genes / J. M. Smith // J. Mol. Evol. – 1992. – V. 34 – Issue 2– P. 126–129 100. Steck F. The epidemiology of fox rabies in Europe. / F. Steck, A. Wandeler // Epidemiol. Rev. – 1980. – V. 2– P. 71–96 101. Talbi C. Evolutionary history and dynamics of dog rabies virus in western and central Africa / C. Talbi, E. C. Holmes, P. de Benedictis, O. Faye, E. Nakouné, D. Gamatié, A. Diarra, B. O. Elmamy, A. Sow, E. V. Adjogoua, O. Sangare, W. G. Dundon, I. Capua, A. a. Sall, H. Bourhy // J. Gen. Virol. – 2009. – V. 90– P. 783–791 102. Thoulouze M.I. The neural cell adhesion molecule is a receptor for rabies virus. / M. I. Thoulouze, M. Lafage, M. Schachner, U. Hartmann, H. Cremer, M. Lafon // J. Virol. – 1998. – V. 72 – Issue 9– P. 7181–7190 103. Tohma K. Phylogeographic Analysis of Rabies Viruses in the Philippines. / K. Tohma, M. Saito, T. Kamigaki, L. T. Tuason, C. S. Demetria, J. R. C. Orbina, D. L. Manalo, M. E. Miranda, A. Noguchi, S. Inoue, A. Suzuki, B. P. Quiambao, H. Oshitani // Infect. Genet. Evol. – 2014. – V. 23– P. 86–94 104. Tordo N. The rabies virus genome: an overview / N. Tordo, A. Kouknetzoff // Onderstepoort J Vet Res – 1993. – V. 60 – Issue 4– P. 263–269 105. Tordo N. Walking along the rabies genome: is the large G-L intergenic region a remnant gene? / N. Tordo, O. Poch, a Ermine, G. Keith, F. Rougeon // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1986. – V. 83 – Issue 11– P. 3914–3918. 106. Tuffereau C. The rabies virus glycoprotein receptor p75NTR is not essential for

123 rabies virus infection. / C. Tuffereau, K. Schmidt, C. Langevin, F. Lafay, G. Dechant, M. Koltzenburg // J. Virol. – 2007. – V. 81 – Issue 24– P. 13622–13630 107. Vitasek J. A review of rabies elimination in Europe / J. Vitasek // Vet. Med. – Czech – 2004. – V. 2004 – Issue 5– P. 171–185 108. Wacharapluesadee S. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. / S. Wacharapluesadee, P. Phumesin, P. Supavonwong, P. Khawplod, N. Intarut, T. Hemachudha // J. Virol. Methods – 2011. – V. 175 – Issue 2– P. 278–282 109. Wakeley P.R. Development of a Real-Time , TaqMan Reverse Transcription-PCR Assay for Detection and Differentiation of Lyssavirus Genotypes 1 , 5 , and 6 / P. R. Wakeley, N. Johnson, L. M. Mcelhinney, D. Marston, J. Sawyer, A. R. Fooks // J. Clin. Microbiol. – 2005. – V. 43 – Issue 6– P. 2786–2792 110. Walker P.J. Evolution of Genome Size and Complexity in the Rhabdoviridae / P. J. Walker, C. Firth, S. G. Widen, K. R. Blasdell, H. Guzman, T. G. Wood, P. N. Paradkar, E. C. Holmes, R. B. Tesh, N. Vasilakis // PLOS Pathog. – 2015. – V. 11 – Issue 2– e1004664 111. Warrell M.J. Rabies and other lyssavirus diseases. / M. J. Warrell, D. a Warrell // Lancet – 2004. – V. 363 – Issue 9413 – P. 959–969 112. Webster L.T. Early diagnosis of rabies by mouse inoculation. Measurement of humoral immunity to rabies by mouse protection test / L. T. Webster, J. . Dawson // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1935. – V. 32– P. 570–573 113. WHOExpert Consultation on Rabies / WHO, 2013. 114. Yang J. The specificity of rabies virus RNA encapsidation by nucleoprotein. / J. Yang, D. C. Hooper, W. H. Wunner, H. Koprowski, B. Dietzschold, Z. F. Fu // Virology – 1998. – V. 242 – Issue 1– P. 107–117 115. Yu J. The spatial and temporal dynamics of rabies in China. / J. Yu, H. Li, Q. Tang, S. Rayner, N. Han, Z. Guo, H. Liu, J. Adams, W. Fang, X. Tao, S. Wang, G. Liang // PLoS Negl. Trop. Dis. – 2012. – V. 6 – Issue 5– e1640 116. Yuryev A.PCR Primer Design / A. Yuryev – Humana Press, 2007. Ed. 1st.

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Андрей Девяткин

Публикация в высокорейтинговом международном журнале, которая описывает основные результаты диссертационной работы.

около 6 лет назад

Рецензия от Андрей Девяткин

Автореферат.

около 6 лет назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

20.16

Андрей Девяткин

Публикация в высокорейтинговом международном журнале, которая описывает основные результаты диссертационной работы: http://journals.plos.org/plosone/article/file?id=10.1371/journal.pone.0171855&type=printable

20.16

Андрей Девяткин

Процент "заимствований" 96,24% , так как моя диссертация выложена в открытом доступе на сайте диссовета МГУ.03.01, в котором я защищался (https://istina.msu.ru/dissertations/60000984/) . Правда, непонятно, почему при сравнении идентичных документов процент "заимствований" не 100%.