Морфофункциональная характеристика тучных клеток в органах репродуктивной системы самцов крыс разного возраста

Анастасия Власова

Морфофункциональная характеристика тучных клеток в органах репродуктивной системы самцов крыс разного возраста

В работе были изучены тучноклеточные популяции органов мужской репродуктивной системы и их гистологические параметры у крыс на разных этапах онтогенеза. Для эксперимента были отобраны самцы крыс линии Wistar следующих возрастов: 3 месяца, 4 месяца, 10 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев и 24 месяца. У животных проводили забор семенных пузырьков и придатков семенников для изготовления гистологических препаратов. Препараты окрашивали гематоксилином - эозином для морфометрического анализа органов, толуидиновым синим для определения параметров тучных клеток и альциановым синим - сафранином для выявления степени зрелости мастоцитов. Полученные данные статистически обрабатывали с помощью критерия Манна-Уитни. Были получены следующие основные результаты. В семенных пузырьках и придатках семенников молодых 4-х месячных животных происходит резкое увеличение количества тучных клеток по сравнению с 3-х месячными животными. При этом в семенных пу-зырьках отмечается повышение синтетической активности мастоцитов наряду с усилением пролиферативной активности эпителиальных клеток самого органа. В то время как в придатках не происходит никаких существенных изменений. У зрелых животных показатели тучных клеток и тканей исследуемых органов изменяются по-разному. Так, в придатках происходит увеличение числа тучных клеток и их функциональной активности, а в семенных пузырьках данные показатели остаются на уровне молодых животных с одновременным усилением синтетической активности. При этом трофика тканей в придатках усиливается, а в семенных пузырьках снижается. Число молодых тучных клеток в исследуемых органах у зрелых животных максимально среди всех экспериментальных групп. У старых животных в семенных пузырьках и придатках к 24 месяцам происходит снижение числа тучных клеток и их синтетической активности на фоне резкого увеличения функциональной. При этом градиент их зрелости смещается в сторону молодой популяции в 18-19 месяцев и в сторону зрелой – в 24 месяца. Вместе с этим происходит угнетение функционирования клеток самих органов.

Биология

Диссертации

Вуз: Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина (УрФУ)

ID: 6040b68cccefde00012bbd8a

UUID: 6f02da70-5f02-0139-2b97-0242ac180002

Язык: Русский

Опубликовано: почти 4 года назад

Просмотры: 159

17.18

Анастасия Власова

Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина (УрФУ)

Комментировать 0

Рецензировать 1

Скачать - 2,0 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина ИНСТИТУТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК И МАТЕМАТИКИ Департамент биологии и фундаментальной медицины МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТУЧНЫХ КЛЕТОК В ОРГАНАХ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ САМЦОВ КРЫС РАЗНОГО ВОЗРАСТА Направление подготовки 06.04.01 «Биология» Образовательная программа «Физиология человека и животных» Директор департамента: Магистерская диссертация к. б. н., доц. М. В. Улитко Власовой Анастасии Алексеевны _____________________ Научный руководитель: Нормоконтролер: асс. К. Н. Забегалов к. б. н., доц. Ю. С. Храмцова Екатеринбург 2020

РЕФЕРАТ Магистерская диссертация изложена на 63 страницах печатного текста, содержит 25 таблиц и 13 рисунков. Библиографический указатель включает 139 названий (44 отечественных и 95 зарубежных). В работе были изучены тучноклеточные популяции органов мужской репродуктивной системы и их гистологические параметры у крыс на разных этапах онтогенеза. Для эксперимента были отобраны самцы крыс линии Wistar следующих возрастов: 3 месяца, 4 месяца, 10 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев и 24 месяца. У животных проводили забор семенных пузырьков и придатков семенников для изготовления гистологических препаратов. Препараты окрашивали гематоксилином эозином для морфометрического анализа органов, толуидиновым синим для определения параметров тучных клеток и альциановым синим - сафранином для выявления степени зрелости мастоцитов. Полученные данные статистически обрабатывали с помощью критерия Манна-Уитни. Были получены следующие основные результаты. В семенных пузырьках и придатках семенников молодых 4-х месячных животных происходит резкое увеличение количества тучных клеток по сравнению с 3-х месячными животными. При этом в семенных пузырьках отмечается повышение синтетической активности мастоцитов наряду с усилением пролиферативной активности эпителиальных клеток самого органа. В то время как в придатках не происходит никаких существенных изменений. У зрелых животных показатели тучных клеток и тканей исследуемых органов изменяются по-разному. Так, в придатках происходит увеличение числа тучных клеток и их функциональной активности, а в семенных пузырьках данные показатели остаются на уровне молодых животных с одновременным усилением синтетической активности. При этом трофика тканей в придатках усиливается, а в семенных пузырьках снижается. Число молодых тучных клеток в исследуемых органах у зрелых животных максимально среди всех экспериментальных групп. У старых животных в семенных пузырьках и придатках к 24 месяцам происходит снижение числа тучных клеток и их синтетической активности на фоне резкого увеличения функциональной. При этом градиент их зрелости смещается в сторону молодой популяции в 18-19 месяцев и в сторону зрелой – в 24 месяца. Вместе с этим происходит угнетение функционирования клеток самих органов. 2

ABSTRACT The master thesis is presented on 63 pages of printed text, contains 25 tables and 13 figures. The bibliographic list includes 139 names (44 Russian and 95 foreign). In this work, the mast cell population of the male reproductive system organs and their histological parameters were investigated in rats at different stages of ontogenesis. For the experiment, male Wistar rats of the following ages were selected: 3 months, 4 months, 10 months, 12 months, 18 months, 19 months and 24 months. The animals carried out the sampling of seminal vesicles and epididymis for the manufacture of histological specimens. The preparations were stained with hematoxylin - eosin for morphometric analysis of organs, toluidine blue for determining mast cell parameters and alcian blue - safranin to determine the degree of maturity of mast cells. The obtained data were statistically analyzed using the Mann-Whitney test. The following main results were obtained. In the seminal vesicles and epididymis of young 4-month-old animals, there is an increase in the number of mast cells compared to 3-month-old animals. Moreover, in the seminal vesicles, an increase in the synthetic activity of mast cells is noted along with an increase in the proliferative activity of the epithelial cells of the organ. While in the epididymis there are no significant changes. In mature animals, the parameters of mast cells and tissues of the studied organs vary in different ways. So in the epididymis there is an increase in the number of mast cells and their functional activity, and in the seminal vesicles these parameters remain at the level of young animals, but at the same time there is an increase in synthetic activity. Trophic tissue in the epididymis is enhanced, and in the seminal vesicles – decreases. The number of young mast cells in the studied organs in mature animals is the highest among all experimental groups. In old animals, in the seminal vesicles and epididymis by 24 months, there is a decrease in the number of mast cells and their synthetic activity against the background of an increase in functional activity. In this case, the gradient of their maturity shifts towards the young population at 18-19 months and towards the mature population at 24 months. Along with this, the functioning of the cells of the organs themselves is depressed. 3

МЕСТО ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ Работа выполнена на базе Института естественных наук и математики Уральского федерального университета имени первого Президента России Б. Н. Ельцина и Института иммунологии и физиологии УрО РАН. 4

СОДЕРЖАНИЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ...........................................................................................7 ВВЕДЕНИЕ ....................................................................................................................................8 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ...................................................................................................................10 1 Обзор литературы ...........................................................................................................10 1.1 Возрастные изменения органов мужской половой системы ...................................10 1.1.1 Возрастные изменения эпидидимиса ......................................................................10 1.1.2 Возрастные изменения семенных пузырьков .........................................................11 1.2 Современные представления о тучных клетках ........................................................12 1.2.1 Морфологические особенности тучных клеток .....................................................12 1.2.2 Функциональная характеристика тучных клеток ..................................................15 1.3 Тучные клетки в мужском репродуктивном тракте .................................................17 1.3.1 Тучные клетки в придатке семенника .....................................................................17 1.2.2. Тучные клетки в семенном пузырьке .....................................................................18 2 Методика эксперимента .................................................................................................20 2.1 Методика забора органов и приготовления гистологических препаратов .............20 2.2 Методики окраски гистологических препаратов ......................................................21 2.2.1 Окрашивание гематоксилином – эозином ..............................................................21 2.2.2 Окрашивание толуидиновым синим .......................................................................21 2.2.3 Окрашивание альциановым синим – сафранином .................................................21 2.3 Методика оценки гистологических препаратов ........................................................22 2.3.1 Оценка морфофункционального состояния тучных клеток .................................22 2.3.2 Оценка морфометрического состояния исследуемых органов ............................25 2.4 Анализ периферической крови ...................................................................................27 2.5 Статистические методы, использующиеся для обработки экспериментального материала ............................................................................................................................27 3 Результаты и их обсуждения ..........................................................................................29 5

3.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток, придатков и семенных пузырьков у молодых животных ......................................................................................29 3.1.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и придатков семенников у молодых животных .........................................................................................................31 3.1.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и семенных пузырьков у молодых животных ............................................................................................................32 3.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток, придатков и семенных пузырьков у зрелых животных .........................................................................................34 3.2.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и придатков семенников у зрелых животных ............................................................................................................36 3.2.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и семенных пузырьков у зрелых животных ...............................................................................................................38 3.3 Морфофункциональная характеристика тучных клеток, придатков и семенных пузырьков у старых животных .........................................................................................41 3.3.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и придатков семенников у старых животных ............................................................................................................43 3.3.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и семенных пузырьков у старых животных ...............................................................................................................46 ВЫВОДЫ .....................................................................................................................................49 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ ...................................52 6

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ БАВ – биологически активные вещества; ГПГ – гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось; ГЭР – гранулярный эндоплазматический ретикулюм; ИД – индекс дегрануляции; К3 ЭДТА – трикалиевая этилендиаминтетрауксусная кислота; СГХК – средний гистохимический коэффициент; ТК – тучные клетки; ФИММ – фактор ингибирования миграции макрофагов; FGF – фактор роста фибробластов; IgE – иммуноглобулин класса Е; IL – интерлейкин; LT – лейкотриены; LYST – регулятор лизосомального транспорта; MHC – главный комплекс гистосовместимости; MIF – фактор подавления миграции макрофагов; p – уровень значимости; PAF – фактор активации тромбоцитов; PDGF – фактор роста тромбоцитов; SCF – фактор стволовых клеток; SPAM1 – sperm adhesion molecule 1; TGF-β – трансформирующий фактор роста-β; TNFα – фактор некроза опухоли-альфа; VEGF – фактор роста эндотелия сосудов. 7

ВВЕДЕНИЕ Одной из наиболее актуальных проблем возрастной физиологии в настоящее время являются морфофункциональные изменения как женской, так и мужской половых систем в процессе онтогенеза. Интерес к данной теме обусловлен прогрессирующей проблемой бесплодия. При этом согласно различным исследованиям примерно в половине случаев инфертильность связана с нарушением мужского репродуктивного здоровья [1, 2]. Несмотря на многочисленные исследования причин мужского бесплодия, тенденции к его снижению не отмечается. Кроме этого, в современном обществе наметилась тенденция к увеличению возраста людей, собирающихся стать родителями. В связи с этим важно установить, какие изменения происходят в органах мужской репродуктивной системы и определить, что является возрастной нормой для каждого органа на разных этапах онтогенеза. Известно, что в регуляции работы репродуктивной системы принимают участие нервная, эндокринная и иммунная системы. Однако, если роль первых двух достаточно полно расшифрована, то участие иммунной системы в регуляции и реализации половой функции еще до конца не выяснена. В литературе можно встретить данные, свидетельствующие об активном участии иммунной системы в онтогенезе органов мужской репродуктивной системы. Так было показано, что в придатках тучные клетки способствуют развитию соединительной ткани благодаря выделению протеаз, вызывающих пролиферацию фибробластов [3 – 6]. В семенниках мастоциты являются важными посредниками в управлении Т-клеточной толерантностью, а также выделяют ряд цитокинов, участвующих в физиологически нормальном апоптозе зародышевых клеток [7]. А в семенных пузырьках дегрануляция тучных клеток может предшествовать как воспалительному процессу, так и поддерживать нормальную функцию вспомогательных желез [8, 9]. Тучные клетки, являясь частью иммунной системы и обладая известным функционалом [10, 11, 12], должны выступать в качестве регуляторного звена репродуктивной функции и оказывать влияние на функциональную активность органов мужской половой системы по аналогии с другими органами [10]. Известно, что тучные клетки принимают активное участие, как в патогенезе мужского бесплодия, так и в регуляции функций мужских половых органов в норме [13]. Данное противоречие приводит к выводу о необходимости более детального изучения состояния ТК в различных органах мужской репродуктивной системы таких, как семенники, семенные пузырьки и придатки. В предыдущих исследованиях нами было показано существование корреляции между числом тучных клеток в семеннике и его функциональной активностью [14]. В связи 8

с чем встает вопрос о наличии подобной зависимости в других органах мужского репродуктивного тракта, а именно в семенных пузырьках и придатках. В связи с вышесказанным целью данной работы является изучение тучноклеточной популяции органов мужской репродуктивной системы, их гистологических параметров у крыс на разных этапах онтогенеза. Задачи: а) Исследовать морфофункциональное состояние тучных клеток в придатках семенников и семенных пузырьках и изучить морфометрические параметры этих органов у молодых крыс; б) Оценить морфофункциональное состояние тучных клеток в придатках семенников и семенных пузырьках и проанализировать морфометрические параметры этих органов у зрелых крыс; в) Изучить морфофункциональное состояние тучных клеток в придатках семенников и семенных пузырьках и оценить морфометрические параметры этих органов у старых крыс; г) Провести сравнительный анализ возрастных изменений морфофункциональных показателей тучных клеток в разных органах мужской репродуктивной системы крыс; д) Установить взаимосвязь гистологических параметров мужской репродуктивной системы и морфофункционального состояния их тучноклеточной популяции у крыс на разных этапах онтогенеза. 9

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1 Обзор литературы 1.1 Возрастные изменения органов мужской половой системы Старение мужской репродуктивной системы в первую очередь характеризуется изменениями эндокринной системы, гипогонадизмом, эректильной дисфункцией и пролиферативными нарушениями. Повреждения, накапливающиеся в организме, приводят к нарушению регуляции на уровне гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси (ГПГ) и к локальным ауто/паракринным взаимодействиям, вызывая тем самым морфологические изменения в репродуктивных органах-мишенях [15]. 1.1.1 Возрастные изменения эпидидимиса Физиология данного органа основана на функциональном разнообразии эпителиальных клеток просвета, которые выполняют несколько важных функций: секрецию и абсорбцию белка (главные клетки); эндоцитоз (прозрачные клетки); секреторную деятельность, ответственную за подкисление жидкости просвета (чистые клетки и узкие клетки); иммунную защиту; фагоцитоз и производство антиоксидантов (базальные клетки). Сочетание такого физического барьера и морфофункционального разнообразия клеток приводит к созданию высокоспециализированной эпидидимальной среды для транспорта, созревания и хранения сперматозоидов [16]. Функцией областей головки и тела придатка считается созревание спермы, в то время как область хвоста в первую очередь участвует в хранении сперматозоидов до эякуляции. В хвосте специфическая среда позволяет сперматозоидам выживать в течение нескольких недель [17]. Эпидидимальный транспорт обеспечивает ремоделирование плазматической мембраны и изменение биохимических характеристик сперматозоидов [18 – 23]. Большую роль в модификации сперматозоидов во время движения по придатку играют особые структуры - эпидидимосомы. Описанные у разных видов, эпидидимосомы доставляют в сперматозоиды эпидидимальные белки, которые несут ряд важных функций [24, 25]. Белок P26h участвует в связывание сперматозоида с яйцеклеткой в ходе оплодотворения, а HE5 связан с человеческим иммунологическим бесплодием [21]. Глутатионпероксидаза типа 5 участвует в защите эпидидимальной спермы от окислительного стресса. Гликопротеин SPAM1 (PH-20) отвечает за модификацию мужских половых клеток [26]. PH-20 играет роль рецептора в zona pellucida [27]. Также в эпидидимосомах были идентифицированы ферменты полиольного пути, включая альдозоредуктазу и сорбитолдегидрогеназу [28]. Они, по-видимому, вовлечены в механизм модуляции подвижности сперматозоидов во время эпидидимального транспорта. У крыс, человека и быка был обнаружен фактор 10

ингибирования миграции макрофагов (ФИММ). У самцов крыс ФИММ способствует приобретению оплодотворяющей способности путём поддержки элиминации цинка из комплексов цинк-меркаптид [29]. Из вышесказанного следует, что придаток семенника играет важную роль в созревании и приобретение подвижности сперматозоидов, и его возрастные изменения закономерно должны влиять и на качество спермы. Результаты исследования C. Bhanmeechao показали влияние возраста на дефекты эпидидимальных сперматозоидов от постпубертатного до преклонного возраста [30]. Все параметры качества спермы, наблюдаемые в этом исследовании, были подвержены дегенеративным изменениям с увеличением возраста. Молодые животные (собаки 1-2 года) имели более высокое качество спермы по сравнению с другими возрастными группами. В той же линии возрастные изменения качества эпидидимальной спермы были зарегистрированы у крыс [31, 32], хомяков [33], хорьков [34], кошек [35] и человека [36, 37]. В ряде исследований было изучено влияние возраста на морфологию придатка яичка у животных возрастом от 7 месяцев до 5 лет. Наиболее заметные изменения происходят в эпителиальных клетках, выстилающих проток. Было установлено, что с преклонным возрастом наблюдается ряд основных процессов: накопление пигмента липофусцина в основных и базальных клетках, увеличение количества внутриядерных включений и образование крупных мембраносвязанных цитоплазматических вакуолей. Данные исследований свидетельствуют о том, что у клеток, содержащих липофусциновые пигменты, снижена функциональная активность и способность реагировать на гормональную стимуляцию. В связи с чем, прослеживается зависимость увеличения количества липофусцина в клетках эпидидимиса и снижением его активности с возрастом. Что касается внутриядерных включений, то их происхождение до конца не известно, однако, наличие подобных образований предполагает изменения в клеточном синтезе РНК и протеинов, что подтверждает ранее описанные данные о возрастном снижении активности придатка семенника. Образование мембраносвязанных цитоплазматических вакуолей вполне возможно представляет собой дезорганизацию эндоплазматического ретикулума клеток или же заключительную стадию распада пигментных тел, что в свою очередь также ведет к снижению активности не только отдельных клеток, но и органа в целом. Предполагается, что все эти изменения свидетельствуют о постепенном снижение активности придатка яичка у стареющего самца [38]. 1.1.2 Возрастные изменения семенных пузырьков Семенные пузырьки являются вспомогательными железами для хранения спермы, участия в семяизвержении и утилизации неиспользованных сперматозоидов. Считается, 11

что в состав их секрета входят фруктоза и простогландины, обеспечивающие подвижность сперматозоидов. Также данная железа является источником белка семеногелина, который после семяизвержения расщепляется и оказывает прогрессирующее действие на высвобождение подвижных сперматозоидов в женском тракте [39]. Считается, что продукт расщепления семеногелина – ингибитор подвижности семенной плазмы – снижает подвижность сперматозоидов с поврежденной мембраной [26], что является своеобразным механизмом защиты от деформированных клеток. Не смотря на то, что функции семенных пузырьков у половозрелых особей кажутся незначительными, с возрастом у мужчин их роль возрастает. В частности, семенные пузырьки способны к выделению антиоксидантов, защищающих эякулят от активных форм кислорода и, следовательно, препятствуют бесплодию [40]. 1.2 Современные представления о тучных клетках Тучные клетки (ТК) являются многофункциональным компонентом иммунной системы и имеют крайне широкое распространение в организме. Практически повсеместная встречаемость ТК, а также большое разнообразие функций делает их незаменимыми участниками многих физиологических процессов. 1.2.1 Морфологические особенности тучных клеток ТК в организме позвоночных животных встречаются практически во всех тканях, за исключением сетчатки глаза [11, 12, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50]. Выделяют два типа тучноклеточных популяций: соединительнотканную, преимущественно локализующуюся в рыхлой соединительной ткани, и мукозальную, которая находится в слизистых оболочках нижних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта [12, 43, 51, 52]. Наибольшая концентрация ТК замечена возле кровеносных сосудов [50], а также в местах контакта организма с внешней средой, что указывает на роль ТК в инициации защитных механизмов [10, 11, 42, 43, 53, 54, 55, 56, 57, 58]. Что касается происхождения, ТК человека дифференцируются из плюрипотентной стволовой клетки-предшественницы красного костного мозга с иммунофенотипом CD34+, и распространяются в ткани за пределы микроциркуляторного русла. Детерминация и дифференцировка ТК происходят при участии фактора стволовых клеток (SCF) и IL-3 с приобретением характерного фенотипа соответственно органу, в котором они локализованы [47, 51, 59, 60, 61]. Рост популяции ТК и их образование подчинены цитокинам и некоторым факторам роста, таким как интерлейкины IL-3, IL-4 , IL-8, IL-9, IL10 и фактор роста нервов [62, 63, 64]. Окончательно ТК формируются в тканях своей итоговой локализации, где важную роль играет фибробласты, эпителиальные клетки и др.) [65]. 12 микроокружение (лимфоциты,

ТК отличаются от других клеток соединительной ткани значительной вариабельностью размеров и выраженным разнообразием даже в пределах одного вида [66, 67]. У человека диаметр ТК по разным данным колеблется от 3,5 до 24 мкм, а в некоторых источниках встречается информация о клетках диаметром до 100 мкм [62, 68, 69]. У мыши ТК имеют диаметр 17–27, у крысы 21,5–31,5 мкм [70, 71]. ТК в разных органах отличаются по площади. Так, например, самые мелкие наблюдались в миокарде, их диаметр составляет 54,6 мкм2, а самые крупные в брыжейке, с диаметром 120,4 мкм2, это говорит о том, что размеры клеток весьма вариабельны даже в пределах одного животного или человека [72]. Говоря о количестве ТК в организме, следует отметить, что оно подвержено видовому разнообразию. У одних животных их достаточно много (лошади, крысы, мыши, собаки, кошки), у других – мало (морские свинки, зайцы, кролики). Также число ТК зависит от возраста особи [73, 74, 75]. По форме ТК могут быть круглыми, овальными, иногда веретеновидными (около кровеносных сосудов и между коллагеновыми волокнами), редко отростчатыми. Основной формой ТК считается округлая, в то время как все остальные формы являются следствием движения ТК в тканях [51, 76]. Цитоплазматическая мембрана ТК характеризуется наличием складок и микроворсинок, а поверхности плазмалеммы несет мембранносвязанные антитела – иммуноглобулины класса Е (IgE). В цитоплазме находится ядро округлой формы, умеренно развитый набор органелл, а также гранулы, содержащие биологически активные вещества (БАВ). Ядро ТК повторяет округлую или овальную форму самой клетки и занимает 4-12 % её объёма. Хроматин ядра более конденсирован на периферии. Митохондрии, комплекс Гольджи и эндоплазматическая сеть имеют обычное строение для этих органелл. Цитоплазма бедна органоидами. Пластинчатый комплекс и гранулярный эндоплазматический ретикулюм (ГЭР) слабо развиты рибосомы и митохондрии, обычно имеющие компактную структуру и располагающиеся в перинуклеарной зоне малочисленны. Все эти органоиды лучше развиты в юных клетках, а также в клетках, находящихся на стадии регрануляции (восстановление после активной секреции и опустошения). Кроме того, в цитоплазме под плазмолеммой присутствуют микрофиламенты и микротрубочки, которые расположены рядом с центриолями, в перинуклеарных зонах, а также липидные включения и кристалловидные тельца. На поверхности ТК обнаружены своеобразные выпячивания цитоплазмы, заполненные трубчато-везикулярными структурами диаметром 50–100 нм, а также пальцевидные выпячивания типа микроворсинок макрофагов [62, 68, 77]. Своими свойствами ТК обязаны наличию специфических гранул, имеющих 13

однослойную мембрану и занимающих до 40% цитоплазмы [62, 66]. Количество зернистости в ТК у грызунов разных видов колеблется в широких пределах. Нередко гранулы могут частично или полностью закрывать ядро (например, у белой крысы, мыши, пеструшки). У ТК человека размер гранулы в диаметре около 0,2-0,5 мкм, у животных 0,5– 2,0 мкм. Но даже в одной и той же клетке можно видеть гранулы различных размеров, что связано с различным возрастом гранул, с их неодновременным формированием [78, 79]. Образуясь в аппарате Гольджи, гранулы всегда содержат физиологически активные вещества [62, 80]. Гранула ТК представляет собой осмиофильное вещество с кислой рН средой [81, 82], окруженное мембраной. Гранулы образуются при помощи комплекса Гольджи. Сначала образуются первичные гранулы из транс-отдела комплекса Гольджи, затем первичные гранулы сливаются, и происходит образование незрелых гранул, а затем они перерастают в зрелые подобно предыдущему процессу [82]. Созревание гранул стимулируют регулятор лизосомального транспорта LYST и белок Rab5, участвующий в слиянии первичных гранул [81]. Помимо Rab5 и LYST, в биогенезе и гомеостазе гранул ТК участвуют и другие белковые молекулы, такие как гистидин, декарбоксилаза, хромогранин А, клатрин, различные полиамины и др. [81, 82, 83]. Основными компонентами химического вещества гранул являются нейтральные протеазы и гепарин. Также в них накапливаются разнообразные БАВ, медиаторы и ферменты: гистамин, серотонин, дофамин, хондроитинсульфат, гиалуроновая кислота, хемотаксический фактор нейтрофилов, фактор активации тромбоцитов, нейропептиды, фосфолипиды, окислительные ферменты производные ненасыщенных жирных (супероксиддисмутаза кислот (например, и пероксидаза), арахидоновой), иммунорегуляторные цитокины [41, 52, 53, 57, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87]. Состав гранул различается у ТК с различной локализацией: так, например, у соединительнотканных ТК в гранулах содержится большое количество гистамина, триптазы, гепарина и химазы. В мукозальных же клетках содержатся протеаза, триптаза, но отсутствует химаза [51, 52, 76]. БАВ, которые образуются и выделяются мастоцитами, подразделяют на две группы – преформированные медиаторы, содержащиеся в секреторных гранулах ТК, и медиаторы, которые образуются при воздействии некоторых активаторов (триггеров) [43, 53, 81, 88, 89]. К группе преформированных медиаторов относятся гистамин, серотонин, кинины и протеазы [90]. Лейкотриены (LT), простагландины, фактор активации тромбоцитов (PAF), ряд цитокинов (например, IL-1, 2, 5, 6, 8, 9, 13), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор подавления миграции макрофагов (MIF) – эти медиаторы синтезируются в тучных клетках de novo и высвобождаются через несколько часов после активации [81, 80, 86, 88, 14

90, 91]. Нельзя чётко разграничить БАВ только на эти две группы, потому как некоторые медиаторы встречаются как в виде предварительно синтезированной, так и вновь синтезированной молекулы [41, 92]. Примером такого соединения является цитокин TNFα (фактор некроза опухоли-альфа) [41, 92]. 1.2.2 Функциональная характеристика тучных клеток Традиционно ТК общепризнаны как ключевые клетки аллергической реакции І типа и воспаления вследствие наличия высокоаффинных рецепторов IgЕ на их плазмолемме и функциональной связи этих рецепторов с секреторным механизмом [11, 68, 93, 94, 95, 89]. Однако, многочисленные гранулы, заполняющие их цитоплазму, содержат широкий спектр полифунциональных медиаторов, которые обеспечивают множество других процессов: ангиогенез, нейроиммунные взаимодействия, репаративные и гомеостатические реакции, а также развитие воспаления и фиброза [63, 68, 74, 97, 98, 99, 100, 101, 102]. Участие в данных механизмах обеспечивается наличием в тучных клетках БАВ. Так, при помощи гистамина ТК способны увеличивать проницаемость сосудистой стенки, ускорять капиллярный кровоток, стимулировать митоз клеток эпидермиса, что важно для процесса заживления ран [11, 88]. Гепарин же, напротив, снижает проницаемость межклеточного вещества и интенсивность клеточного метаболизма, а также активно участвует в поддержании гемостаза [11, 12, 53]. Протеазы ТК повышают проницаемость тканей, способствуя проникновению иммунных клеток и вазоактивных аминов, таких как гистамин и серотонин, влияя на проницаемость сосудов и стимулируя сокращение гладких мышц [82, 88, 90]. Таким образом, активация и дегрануляция ТК усиливает и расширяет воспалительную реакцию [103]. Гистамин воздействует путём связывания с H1 – H4-рецепторами. Рецепторы H1 находятся главным образом на поверхности миоцитов гладких мышц бронхов, эндотелиальных клеток и некоторых нейронов. Воздействие гистамина на H1-рецепторы регулирует сокращение гладкой мускулатуры бронхов, сосудистую проницаемость [104]. Н2-рецепторы расположены на эндотелии сосудов и на поверхности париетальных клеток желудка [104]. Таким образом, гистамин может регулировать ширину просвета кровеносных сосудов и желудочную секрецию. Также, взаимодействие гистамина на рецепторы Н1 и Н2 происходит при возникновении на кожных покровах волдыря и покраснений. Н3-рецепторы присутствуют в основном в ЦНС, тогда как рецепторы Н4 экспрессируются на иммунокомпетентных клетках, включая базофилы, ТК, эозинофилы и опосредуют хемотаксис [104]. Факторы VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), FGF (фактор роста фибробластов), TGF-β (трансформирующий фактор роста-β), PDGF (фактор роста 15

тромбоцитов), IL-8 и ангиопоэтин 1 участвуют в регуляции ангиогенеза [10]. Эти медиаторы тучных клеток могут действовать на различных стадиях ангиогенеза, включая деградацию внеклеточного матрикса, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, образование и распределение новых сосудов, синтез внеклеточного матрикса и мобилизацию перицитов [10]. Кроме того, VEGF, FGF-2 и совокупность триптазы и гепарина индуцируют миграцию и пролиферацию сосудистых эндотелиальных клеток. Активированные ТК выделяют профибротические медиаторы, такие как TGF-β и PDGF, а также многие другие, которые могут влиять на фибробласты. Гистамин может стимулировать миграцию, пролиферацию и дифференцировку фибробластов в сократительные миофибробласты. Активированные мастоциты высвобождают медиаторы, включая триптазу, которые стимулируют фибробласты к синтезу коллагена. Триптаза так же, как и гистамин, индуцирует дифференцировку фибробластов в миофибробласты [93]. Кроме того, химаза может расщеплять проколлаген типа I и способствовать образованию фибрилл коллагена [50, 89]. TNFα является важным цитокином, продуцируемым тучными клетками дыхательных путей [76], играет важную роль в защите организма хозяина и защищает от развития рака. При применении анти-TNFα терапии было замечено, что проявляется увеличение числа заболеваемости раком у пациентов, получающих терапию [76]. Механизм действия ТК состоит в том, что под влиянием фосфокиназы на фосфолипидном слое мембран начинается процесс образования ненасыщенных жирных кислот, главным образом арахидоновой кислоты, которая включается в метаболизм по липооксигеназному и циклооксигеназному путям. При циклооксигеназном пути образуются простогландины (тромбоксаны). При липооксигеназном пути образуются лейкотриены, которые формируют медленно реагирующую субстанцию аллергии [105]. Активаторы ТК бывают химической и физической природы. Триггерами химической природы могут служить различные по химической структуре и биологическим функциям вещества, которые подразделяются на IgE–зависимые (антигены) и IgE– независимые (миорелаксанты, опиоиды, рентгеноконтрастные средства, анафилатоксины, интерлейкин-1, 3) [43, 54, 106]. Активаторами физической природы является холод, солнечный свет, тепло и механическое раздражение [43, 107]. Под влиянием этих факторов ТК высвобождают содержимое гранул и тем самым оказывают влияние на пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток, а также могут вызывать аллергические реакции [43, 92]. Также существуют иммуннологические и неимуннологические факторы активации: иммунный механизм выделения медиаторов срабатывает при попадании в организм антигенов, которые, связываясь с IgE-зависимыми рецепторами на плазмалемме 16

мастоцитов, образует комплекс антиген-антитело, что и вызывает выброс БАВ тучными клетками [46, 52, 58, 59, 92, 106]. Неиммунный механизм воспроизводится под действием гормонов, лекарственных препаратов, ядов животного происхождения, бактериальных и вирусных геномов [82]. Помимо активаторов процесса дегрануляции ТК, существуют и ингибиторы, подавляющие выделение БАВ. В качестве таких веществ выступают хондроитин, гепарин, интерлейкин-10, оксид азота, TGF-β, и т.д. [90]. ТК не наделены фагоцитарной способностью. Их роль в воспалении, главным образом, сводится к концентрации в зоне воспаления макромолекул и клеток с антимикробными свойствами [42, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114]. Современные представления о физиологической роли ТК свидетельствуют об их участии в различных процессах организма, что доказано во многих клинических наблюдениях и экспериментах на животных. Однако, на сегодняшний день, связь между фенотипическими особенностями ТК и биологическими процессами, в которых они участвуют, раскрыта не до конца [48]. 1.3 Тучные клетки в мужском репродуктивном тракте Мастоциты имеют распространение во всех органах мужской половой системы, и их распределение высоко организовано. В отличие от семенников, где ТК преимущественно находятся во внешней оболочке, ТК придатка и семенных пузырьков распространены по всей площади органа. При этом количество ТК в семенных пузырьках достоверно меньше, чем суммарное количество мастоцитов в головке и хвосте придатка [115]. Что касается влияния ТК на репродуктивную функцию, согласно Haidl et al. (2011), увеличение мастоцитов в мужском репродуктивном тракте может ухудшать фертильность [116]. 1.3.1 Тучные клетки в придатке семенника Придаток семенника (эпидидимис) функционально является резервуаром для хранения сперматозоидов и защиты их от негативного воздействия. Сперматозоиды, которые образуются в яичках, поступают в головку эпидидимиса, затем перемещаются в тело и, наконец, достигают хвоста, где и хранятся. Известно, что сперматозоиды, покидающие семенник и направляющиеся в его придаток, фактически ещё являются нефункциональными гаметами [117]. Только после попадания в хвост придатка сперматозоиды приобретают прогрессивную подвижность и способность к оплодотворению [118]. Придаток яичка содержит большое количество иммунокомпетентных клеток. В эпителии протока придатка наблюдается большое число макрофагов и лимфоцитов. Последних часто называют гало-клетки [119]. В строме придатка находятся макрофаги, которые экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости MHC класса II, 17

необходимого для презентации антигена Т-лимфоцитам, причем превалирует активация CD4+ Т-хелперов, а не CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов. В эпителии эпидидимиса, наоборот, большинство макрофагов синтезирует молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса, что предопределяет активацию CD8+Т-лимфоцитов. Кроме того, антиген-презентирующие дендритные клетки формируют плотную сеть в базальной части эпителия, а их отростки простираются между эпителиальными клетками к апикальным соединениям. Эти дендритные клетки, по всей видимости, особенно активны в области головки придатка, поскольку их отростки достигают просвета эпидидимального протока, где они экспонируют антигены и представляют их CD4+ T лимфоцитам. Внутриэпителиальные дендритные клетки и макрофаги, очевидно, играют сложную двоякую роль в эпидидимисе, подавляя реакции на антигены спермы в нормальных условиях, но активируя реакции на патогены при инфекционном процессе [120, 121]. В эпидидимисе содержится большое количество соединительной ткани, в связи с чем в нём отмечается присутствие ТК. Интересно, что ТК представлены как в головке, так и в хвосте придатка. Однако количество их не велико и значительно уступает таковому в простате [115]. Другие авторы сообщают, что ТК преимущественно распределены в строме придатка и, по-видимому, участвуют в регуляции кровотока и пролиферации соединительной ткани [122]. В онтогенезе количество ТК незначительно увеличивается в детстве, круто возрастает во время полового созревания, а затем снижается с возрастом. Данная закономерность наблюдается во всех частях придатка и подтверждает факт участия тучноклеточной популяции в развитие соединительной ткани данного органа [123, 124]. Как и в семенниках, ТК придатка выделяют сериновую протеазу триптазу, которая вызывает активацию протеаза-активируемого рецептора и, как следствие, пролиферацию фибробластов [3 – 6]. Следовательно, увеличение этих клеток в придатке яичка может нарушить процесс созревания сперматозоидов и жизнеспособность гамет [116, 124]. 1.2.2. Тучные клетки в семенном пузырьке Семенные пузырьки присоединяются к ампуле семявыносящего протока и образуют начало эякуляторного протока. Основными функциями этого органа являются участие в семяизвержении и спермиофагия нереализованных сперматозоидов. Секреция семенных пузырьков составляет основную (50%) и последнюю фракцию эякулята. Помимо этого семенные пузырьки служат источником секреции фруктозы, которая служит источником энергии для поддержания жизнеспособности и подвижности сперматозоидов [125]. Несмотря на то, что ТК уже давно идентифицированы в семенных пузырьках крыс [122] и людей [126], мало внимания уделяется фенотипическим и функциональным 18

свойствам мастоцитов в этом органе. Известно, что ТК распределяются равномерно по всей площади органа, и их количество суммарно меньше числа ТК в придатках семенника [115]. Ряд исследований показал, что дегрануляция ТК во вспомогательных железах (в том числе и в семенных пузырьках) способствует распространению воспалительного процесса [8, 9]. Кроме того, увеличение числа ТК предшествует появлению хронического воспаления, поскольку ТК инициируют привлечение лейкоцитов: нейтрофилов и макрофагов, а также Т-лимфоцитов, которые и поддерживают воспалительную реакцию [127, 128]. При наличии лейкоцитоспермии для сохранения нормального качества семенного материала и, следовательно, нормальной фертильности очень важна адекватная функция семенных пузырьков, в том числе и ТК этого органа. Исследование показало, что количество, подвижность и морфология сперматозоидов были нарушены у мужчин с лейкоцитоспермией и гипофункцией семенных пузырьков, тогда как у мужчин как с лейкоцитоспермией и с нормальной функцией семенных пузырьков было нормальное качество семенного материала [129]. Эти результаты согласуются с предположением, что активность ТК в семенном пузырьке может непосредственно влиять на качество семенного материала. 19

2 Методика эксперимента Материалом для исследования являлись семенные пузырьки и придатки самцов крыс линии Wistar. С целью изучения роли тучноклеточной популяции в функционировании мужского репродуктивного тракта в онтогенезе образцы органов были взяты у интактных самцов разных групп [130, 131]: − 1 группа: молодые животные 3 мес. (n=5), 4 мес. (n=7); − 2 группа: зрелые животные 10 мес. (n=6), 12 мес. (n=6); − 3 группа: старые животные 18 мес. (n=4), 19 мес. (n=4), 24 мес. (n=5). Все животные были выведены из эксперимента путем передозировки диэтилового эфира. 2.1 Методика забора органов и приготовления гистологических препаратов Для оценки общего состояния животных измеряли массу тела и массы исследуемых органов, а также определяли весовой индекс по формуле (2.1): 𝑚 I= , 𝑀 (2.1) где m - масса органа (мг), M - масса крысы (г). Фрагменты семенных пузырьков и придатков семенника, взятые для гистологического исследования, помещали в гистологические кассеты и фиксировали в заранее подготовленных растворах 10% растворе нейтрального формалина и жидкости Карнуа. После чего фрагменты органов помещали на промывку, и делали стандартную проводку в спиртах восходящей концентрации на автомате для гистологической проводки закрытого типа Shandon Excelsior (MICROM International GmbH, Германия). Далее проводили заливку в парафин с помощью станции для заливки биологических тканей парафином Leica EG 1160 (Leica, Германия). После заливки делали срезы толщиной 4-5 мкм на моторизированном санном микротоме Thermoscientific Microm HM 450 (MICROM International GmbH, Германия). Полученные срезы помещали в специальную емкость с водой, разогретую до 36°-37° С, затем их размещали на предметных стеклах в термостате при 37° С на 1 сутки. Подсушенные срезы окрашивали гематоксилином-эозином, толуидиновым синим и альциановым синим-сафранином по стандартным методикам в автоматизированной системе для окраски гистологических препаратов Leica ST5010 (Leica, Германия), заключали в монтирующую среду Glasseal, накрывали покровными стёклами и оставляли сохнуть при комнатной температуре. Далее на готовых постоянных препаратах семенных пузырьков и придатков семенника проводили оценку морфометрических показателей тучных клеток и тканей органов с помощью светового микроскопа Leica DM2500 (Leica, Германия), оснащенном камерой Levenhuk M1400 Plus (Levenhuk, США). 20

2.2 Методики окраски гистологических препаратов Для изучения морфофункционального состояния тучноклеточной популяции, а так же проведения морфометрического описания исследуемых органов срезы после депарафинирования окрашивали гематоксилином – эозином, толуидиновым синим и альциановым синим – сафранином. 2.2.1 Окрашивание гематоксилином – эозином Для изучения общей морфологии семенных пузырьков и придатков семенника срезы окрашивали гематоксилином – эозином по следующей схеме: а) Депарафинирование срезов (3 порции ксилола, 3 порции спирта 96% по 2 мин.); б) Промывка дистиллированной водой (2 порции по 2 мин.); в) Окраска гематоксилином (20 мин.); г) Промывка проточной водой (15 мин.); д) Окраска эозином (5 мин.); е) Промывка проточной водой (5 мин.); ж) Просветление (3 порции спирта 96%, 3 порции ксилола по 2 мин.); з) Заливка в монтирующую среду. 2.2.2 Окрашивание толуидиновым синим Для идентификации ТК и выявления степени их дегрануляции применяли окраску толуидиновым синим по стандартной методике: а) Депарафинирование срезов (3 порции ксилола, 3 порции спирта 96% по 2 мин.); б) Промывка дистиллированной водой (2 порции по 2 мин.); в) Окраска толуидиновым синим (40 мин.); г) Промывка дистиллированной водой (2 порции по 1 мин.); д) Просветление (3 порции спирта 96%, 3 порции ксилола по 2 мин.); е) Заливка в монтирующую среду. Выявление ТК толуидиновым синим основано на взаимодействии красителя с кислыми мукополисахаридами (в первую очередь с гепарином) в составе гранул мастоцитов. При этом наблюдается фиолетовое (метахроматическое) окрашивание гранул, в то время как ядра и базофильные структуры цитоплазмы приобретают синее (ортохроматическое) окрашивание [132]. 2.2.3 Окрашивание альциановым синим – сафранином Для выявления разных стадий зрелости ТК применяли следующий протокол окраски: а) Депарафинирование срезов (3 порции ксилола, 3 порции спирта 96% по 2 мин.); б) Промывка дистиллированной водой (2 порции по 2 мин.); 21

в) Окраска альциановым синим – сафранином (15 мин.); г) Промывка дистиллированной водой (2 порции по 1 мин.); д) Просветление (3 порции спирта 96%, 3 порции ксилола по 2 мин.); е) Заливка в монтирующую среду. Содержащиеся в гранулах ТК мукополисахариды имеют разную степень сульфатации, в связи с чем проявляют различное сродство к одному из красителей [133]. В результате данная окраска позволяет дифференцировать гранулы, содержащие высокосульфатированный гепарин (красное окрашивание – сафранин) и гранулы, содержащие слабо- или несульфатированные глюкозамингликаны (синее окрашивание – альциановый синий). 2.3 Методика оценки гистологических препаратов Во всех экспериментальных группах была дана оценка морфофункционального состояния тучноклеточной популяции, а так же проведено морфометрическое описание исследуемых органов. 2.3.1 Оценка морфофункционального состояния тучных клеток Оценка морфофункционального состояния ТК включала в себя подсчет их числа в 1 мм2 ткани, определение среднего гистохимического коэффициента (СГХК), индекса дегрануляции (ИД), а также соотношения степеней зрелости мастоцитов. Подсчет числа ТК производился в 20 полях зрения с последующим пересчетом на 1 мм2 площади органа. На основании данных литературы для оценки синтетической активности ТК была проведена классификация мастоцитов по 4 типам (см. рисунок 2.1). 22

Рисунок 2.1 — Примеры степени дегрануляции тучных клеток тимуса мыши для расчета индекса дегрануляции Примечание – а – неактивная ТК, б – слабо дегранулирующая ТК, в – умеренно дегранулирующая ТК, г – сильно дегранулирующая ТК. Окраска толуидиновым синим. Увеличение ×100, масляная иммерсия. [134] К 1 типу относили клетки с малым содержанием гранул секрета в цитоплазме, который располагается околомембранно. В соответствии с расчетом СГХК по формуле J. Astaldi, L. Verga [135] это клетки со степенью интенсивности окрашивания +. Ко 2 типу относили клетки с хорошо дифференцированной гранулярностью в цитоплазме и хорошо контурированным ядром. Гранулы располагались диффузно. Степень интенсивности окрашивания по формуле СГХК ++. К 3 типу относили крупные клетки с плотными диффузным расположением гранул в цитоплазме, которые придавали ей гомогенный вид. Степень интенсивности окрашивания гранул по формуле СГХК +++. 23

К 0 типу относили дегранулированные клетки с явными признаками нарушения целостности цитоплазматической мембраны и выделения в окружающее тканевое пространство цитопазматических гранул. Синтетическую активность оценивали с помощью среднего гистохимического коэффициента (СГХК), который рассчитывали по формуле J. Astaldi, L. Verga (2.2): СГХК = 3а+2б+1в+0г а+б+в+г , (2.2) где буквы а-г обозначают количество клеток с определенной интенсивностью окрашивания. Цифры 3-0 характеризуют степень интенсивности окрашивания, т.е. +++ (3+), ++ (2+), + (1+) и 0. Для оценки функциональной активности по выбросу гранул тучных клеток в межклеточное пространство все мастоциты делили на: а) Неактивные или слабо дегранулирующие (выделение единичных гранул); б) Умеренно дегранулирующие; в) Активно дегранулирующие (с полным разрушением цитоплазматической мембраны). Индекс дегрануляции (ИД) тучных клеток рассчитывали по формуле (2.3): ИД = Д Д+Н * 100% , (2.3) где Д – количество тучных клеток с явными признаками дегрануляции (0 тип), Н – количество неактивированных тучных клеток (1,2,3 типы). По степени зрелости все ТК были разделены на 3 группы: 1 – наименее зрелые ТК, характеризующиеся наличием в цитоплазме гранул, окрашенных в синий цвет вследствие сродства их компонентов исключительно к альциановому синему (Alc+ гранулы); 2 – клетки промежуточной степени зрелости (имеют фиолетовую окраску), содержащие в цитоплазме как Alc+ гранулы, так и Saf+ гранулы, окрашенные в красный цвет вследствие сродства их компонентов к сафранину; 3 – наиболее зрелые ТК, содержащие в цитоплазме исключительно Saf+ гранулы, что придаёт цитоплазме данных клеток ярко-красную или ярко-малиновую окраску (см. рисунок 2.2). 24

А Б В Рисунок 2.2 — Тучные клетки разных степеней зрелости Примечание – А – наименее зрелая (молодые), Б – ТК промежуточной степени зрелости, В – наиболее зрелая (зрелая). Окраска альциановый синий – сафранин. Увеличение х100. 2.3.2 Оценка морфометрического состояния исследуемых органов Для определения функционального состояния семенных пузырьков и придатков были сделаны микрофотографии препаратов с помощью камеры Levenhuk M1400 Plus (Levenhuk, США). На препаратах семенных пузырьков измеряли высоту эпителиальных клеток, толщину собственной пластинки, больший и меньший диаметры ядер эпителиоцитов [136, 137] (см. рисунок 2.3). 25

Рисунок 2.3 — Морфометрические измерения, проводимые для семенных пузырьков Примечание – D – больший диаметр ядра, d – меньший диаметр ядра, L – ширина собственной пластинки, H – высота эпителиальных клеток. Окраска гематоксилином – эозином. Увеличение х40. А также вычисляли объем ядер эпителиоцитов по формуле (2.4): V= 𝜋𝐴𝐵2 , 6 (2.4) где V – объем ядра, A – больший диаметр, B – меньший диаметр. [136, 137] На препаратах придатков семенника были определены большой и малый диаметры просвета протока, высота эпителия (исключая стереоцилии) и толщина собственной пластинки [138, 139] (см. рисунок 2.4). 26

А Б Рисунок 2.4 — Морфометрические измерения, проводимые для придатков семенников Примечание – D – больший диаметр протока, d – меньший диаметр протока, L – ширина собственной пластинки, – H высота эпителиальных клеток. Окраска гематоксилином – эозином. Увеличение А – х20, Б – х40. Все измерения проводились с использованием программного комплекса ImageJ для обработки изображений. 2.4 Анализ периферической крови Для определения общего состояния у животных проводили забор периферической крови. Анализ крови проводили на гематологическом анализаторе «Celly 70 Biocode Hycel». Для этого из хвостовой вены на всех сроках эксперимента брали 20 мкл крови в специальные пробирки, обработанные К3 ЭДТА. При анализе использовали следующие показатели: а) Абсолютное содержание лейкоцитов, Г/л; б) Абсолютное содержание лимфоцитов, Г/л; в) Абсолютное содержание гранулоцитов, Г/л; г) Абсолютное содержание моноцитов, Г/л; д) Общее количество эритроцитов, Т/л; е) Концентрация гемоглобина, г/л. Концентрацию тестостерона в крови (нмоль/л) определяли методом иммуноферментного анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе (Lazurite, США) с помощью набора реагентов (Тестостерон-Имаксиз, Россия). 2.5 Статистические методы, используемые для обработки экспериментального материала Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрических методов статистики, ввиду небольшого объема выборки. Сравнение групп выполняли с использованием критерия Манна-Уитни при помощи приложения для 27

статистической обработки данных STATISTICA 8. Различия считали достоверными при p<0,05. Данные представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m). 28

3 Результаты и их обсуждения В данной работе исследовали морфофункциональное состояние ТК и морфометрические параметры органов мужской репродуктивной системы: придатков и семенных пузырьков. Первые обеспечивают созревание и хранение спермы, вторые участвуют в семяизвержении и утилизации неиспользованных сперматозоидов. В связи с этим данные органы играют важную роль в реализации половой функции в ходе онтогенеза. 3.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток, придатков и семенных пузырьков у молодых животных В группу молодых животных были включены крысы 3 и 4 месяцев. Данные особи относятся к предслучному (ювенильному) возрасту периода полового созревания [130,131]. У самцов этого возраста хорошо выражены вторичные половые признаки, активного размножения пока не происходит. Динамичен линейный рост животных, патологических процессов во внутренних органах не обнаружено. Для оценки общего состояния животных измеряли массу тела и массы исследуемых органов, а также определяли весовой индекс (см. таблицу 3.1). Таблица 3.1 — Массы молодых животных и их исследуемых органов (г), весовые индексы исследуемых органов (мг/г) Срок Параметр 3 месяца 4 месяца Масса крысы, г 360,5 ± 10,1 405,5 ± 22,9* Масса левого придатка, г 0,647 ± 0,021 0,715 ± 0,036* Масса правого придатка, г 0,601 ± 0,036 0,699 ± 0,018* Масса левого семенного пузырька, г 0,481 ± 0,031 0,853 ± 0,168* Масса правого семенного пузырька, г 0,408 ± 0,039 0,670 ± 0,124* Весовой индекс левого придатка, мг/г 1,79 ± 0,05 1,76 ± 0,06 Весовой индекс правого придатка, мг/г 1,67 ± 0,03 1,72 ± 0,10 Весовой индекс левого семенного пузырька, мг/г 1,33 ± 0,06 2,10 ± 0,13* Весовой индекс правого семенного пузырька, мг/г 1,13 ± 0,02 1,65 ± 0,05* Примечание – отличия достоверны по сравнению с 3 мес. (*), p<0,05. Из данных таблицы видно, что массы животных и их органов увеличиваются к 4 месяцам, однако, увеличение весовых индексов можно отметить только у семенных пузырьков. Помимо этого проводили общий анализ крови (см. таблицу 3.2) и измеряли уровень тестостерона в крови (см. таблицу 3.3). 29

Таблица 3.2 — Общий анализ крови молодых животных Срок Параметр 3 месяца 4 месяца Абсолютное содержание лейкоцитов, Г/л 5,63 ± 0,63 5,68 ± 0,40 Абсолютное содержание лимфоцитов, Г/л 3,75 ± 0,31 3,85 ± 0,43 Абсолютное содержание гранулоцитов, Г/л 0,50 ± 0,03 0,40 ± 0,16 Абсолютное содержание моноцитов, Г/л 1,45 ± 0,20 1,43 ± 0,28 Общее количество эритроцитов, Т/л 9,08 ± 0,23 9,03 ± 0,19 Концентрация гемоглобина, г/л 149,75 ± 10,18 149,00 ± 8,49 Таблица 3.3 — Концентрация тестостерона в крови молодых животных, нмоль/л Срок Параметр Концентрация тестостерона, нмоль/л 3 месяца 4 месяца 28,64 ± 11,01 29,56 ± 8,22 Достоверных отличий, а также отклонений от нормальных значений по каждому показателю выявлено не было. При работе с ТК в первую очередь была дана оценка морфологического состояния этих клеток во всех исследуемых органах. Анализ показал однотипное строение ТК во всех органах репродуктивной системы самцов крыс. ТК имеют овальную форму и практически не отличаются по размеру (см. рисунок 3.1). Рисунок 3.1 — Тучная клетка в придатке семенника Примечание – Окраска толуидиновым синим. Увеличение х100. Это свидетельствует об однородности тучноклеточной популяции в органах репродуктивной системы самцов крыс. 30

3.1.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и придатков семенников у молодых животных Для оценки морфофункционального состояния ТК в придатках были измерены число ТК в 1 мм2 ткани, средний гистохимический коэффициент (СГХК), индекс дегрануляции (ИД), а также соотношение степеней зрелости ТК (см. таблицу 3.4). Таблица 3.4 — Морфофункциональные показатели ТК придатков семенников молодых животных Параметр Соотношение Срок Число ТК, шт/1 мм2 органа СГХК, усл.ед. степеней зрелости, ИД, % мол./промеж./зрел., % 3 мес. 3,60 ± 1,30 1,36 ± 0,20 9,44 ± 5,80 - 4 мес. 19,14 ± 2,66* 1,63 ± 0,18 8,03 ± 3,18 44,87/18,05/37,08 Примечание – отличия достоверны по сравнению с 3 мес. (*), p<0,05. Можно заметить, что в придатках семенников происходит резкое увеличение числа ТК к 4 месяцам (см. рисунок 3.2), при этом функциональные показатели остаются неизменными. А Б Рисунок 3.2 — Тучные клетки в придатках молодых животных Примечание – А – 3 месяца; Б – 4 месяца. Окраска толуидиновым синим. Увеличение х40. Для оценки морфофункционального состояния морфометрические показатели, представленные в таблице 3.5. 31 придатков измеряли

Таблица 3.5 — Морфометрические показатели придатков семенников молодых животных Параметр Толщина Больший Меньший Высота диаметр диаметр эпителиальных протока, мкм протока, мкм клеток, мкм 3 мес. 32,25 ± 9,83 24,11 ± 1,21 1,398 ± 0,120 0,342 ± 0,019 4 мес. 27,58 ± 1,29 19,87 ± 0,74* 1,252 ± 0,050 0,281 ± 0,013* Срок собственной пластинки, мкм Примечание – отличия достоверны по сравнению с 3 мес. (*), p<0,05. В придатках к 4 месяцам происходит небольшое уменьшение малого диаметра протока и толщины собственной пластинки, что может свидетельствовать о снижении трофики тканей в период полового созревания. Однако данные изменения незначительны (см. рисунок 3.3). А Б Рисунок 3.3 — Протоки придатков молодых животных Примечание – А – 3 месяца, Б – 4 месяца. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х20. Делая вывод об изменениях в придатках у молодых животных, можно сказать, что резкое возрастание числа ТК сопровождается незначительными изменениями в морфометрических показателях, которые свидетельствуют о несущественном снижении функциональной активности данного органа к 4 месяцам. 3.1.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и семенных пузырьков у молодых животных Анализ морфофункциональных показателей ТК в семенных пузырьках показал, что к 4 месяцам происходит увеличение числа ТК и СГХК при одновременном снижении ИД (см. таблицу 3.6). 32

Таблица 3.6 — Морфофункциональные показатели ТК семенных пузырьков молодых животных Параметр Соотношение Число ТК, Срок шт/1 мм2 СГХК, усл.ед. степеней зрелости, ИД, % мол./промеж./зрел., органа % 3 мес. 17,4 ± 6,7 1,02 ± 0,05 27,19 ± 7,63 - 4 мес. 42,00 ± 4,97* 1,78 ± 0,14* 6,86 ± 3,22* 19,16/20,52/60,32 Примечание – отличия достоверны по сравнению с 3 мес. (*), p<0,05. Данные изменения свидетельствуют о небольшом усилении синтетической активности при одновременном значительном снижении функциональной. При неизменном синтезе клетки практически прекращают дегрануляцию, увеличивая при этом свою популяцию (см. рисунок 3.4). А Б Рисунок 3.4 — Тучные клетки в семенных пузырьках молодых животных Примечание – А – 3 месяца; Б – 4 месяца. Окраска толуидиновым синим. Увеличение х40. Также к 4 месяцам в семенных пузырьках увеличивается объем ядер эпителиоцитов (см. таблицу 3.7). Таблица 3.7 — Морфометрические показатели семенных пузырьков молодых животных Параметр Срок Высота Объем ядер эпителиальных эпителиоцитов, мкм3 клеток, мкм Толщина собственной пластинки, мкм 3 мес. 0,009 ± 0,002 1,23 ± 0,08 0,21 ± 0,03 4 мес. 0,057 ± 0,002* 1,36 ± 0,10 0,29 ± 0,01 33

Примечание – отличия достоверны по сравнению с 3 мес. (*), p<0,05. Величина объема ядер эпителиоцитов косвенно свидетельствует об их функциональной̆ активности. Увеличение данного показателя характеризует усиление пролиферативной функции эпителиальных клеток. Можно предположить, что организм таким образом готовит семенные пузырьки к активной работе во время предстоящего полового размножения (см. рисунок 3.5). А Б Рисунок 3.5 — Семенные пузырьки молодых животных Примечание – А – 3 месяца, Б – 4 месяца. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х20. В целом можно сказать, что к 4 месяцам в исследуемых органах репродуктивной системы самцов крыс начинается активация ТК, что закономерно предшествует началу репродуктивного периода. При этом клетки самих органов ведут себя разнонаправленно: в придатках функциональная активность эпителиоцитов незначительно снижается, а в семенных пузырьках, наоборот, увеличивается. 3.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток, придатков и семенных пузырьков у зрелых животных В группу зрелых животных были включены крысы 10 и 12 месяцев. Данные особи относятся к молодому и зрелому возрасту репродуктивного периода [130,131]. В этом периоде уже завершено развитие половых органов, дифференцированы вторичные половые признаки. У особей значительно снижается линейный рост, животные становятся физически крепкие, имеют густой, глянцевый шерстяной покров. В молодом возрасте (5 10 месяцев) происходит активное размножение с многочисленным приплодом, интенсивность которого снижается к зрелому возрасту (11 - 18 месяцев). Для оценки общего состояния животных измеряли массу тела и массы исследуемых органов, а также определяли весовой индекс (см. таблицу 3.8). 34

Таблица 3.8 — Массы зрелых животных и их исследуемых органов (г), весовые индексы исследуемых органов (мг/г) Срок Параметр 10 месяцев 12 месяцев Масса крысы, г 471,8 ± 17,9 529,7 ± 56,7 Масса левого придатка, г 0,725 ± 0,013 0,756 ± 0,023 Масса правого придатка, г 0,676 ± 0,044 0,698 ± 0,054 Масса левого семенного пузырька, г 0,828 ± 0,101 0,689 ± 0,081 Масса правого семенного пузырька, г 0,902 ± 0,083 0,704 ± 0,112* Весовой индекс левого придатка, мг/г 1,53 ± 0,11 1,43 ± 0,05 Весовой индекс правого придатка, мг/г 1,43 ± 0,06 1,32 ± 0,07 Весовой индекс левого семенного пузырька, мг/г 1,75 ± 0,03 1,30 ± 0,04* Весовой индекс правого семенного пузырька, мг/г 1,91 ± 0,12 1,33 ± 0,03* Примечание – отличия достоверны по сравнению с 10 мес. (*), p<0,05. Помимо этого проводили общий анализ крови (см. таблицу 3.9) и измеряли уровень тестостерона в крови (см. таблицу 3.10). Таблица 3.9 — Общий анализ крови зрелых животных Срок Параметр 10 месяцев 12 месяцев Абсолютное содержание лейкоцитов, Г/л; 7,68 ± 0,40 8,13 ± 0,16 Абсолютное содержание лимфоцитов, Г/л; 3,65 ± 0,33 4,23 ± 0,26 Абсолютное содержание гранулоцитов, Г/л; 3,15 ± 0,37 3,20 ± 0,44 Абсолютное содержание моноцитов, Г/л; 0,63 ± 0,05 0,75 ± 0,15 Общее количество эритроцитов, Т/л; 9,63 ± 0,26 9,77 ± 0,08 Концентрация гемоглобина, г/л; 157,75 ± 1,11 163,75 ± 1,32* Примечание – отличия достоверны по сравнению с 10 мес. (*), p<0,05. 35

Таблица 3.10 — Концентрация тестостерона в крови молодых и зрелых животных, нмоль/л Срок Параметр 3 месяца 4 месяца 10 месяцев 12 месяцев 28,64 ± 11,01 29,56 ± 8,22 38,66±2,85 27,69±3,5* Концентрация тестостерона, нмоль/л. Примечание – отличия достоверны по сравнению с 10 мес. (*), p<0,05. Отклонений от нормальных значений по каждому показателю выявлено не было. Из данных таблицы 3.10 видно, что концентрация тестостерона у 12-ти месячных животных снижается по сравнению с 10 месяцами. 3.2.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и придатков семенников у зрелых животных Для отслеживания возрастных изменений исследуемых показателей было проведено последовательное сравнение возрастных групп. В придатках явные изменения прослеживались в количестве ТК и их функциональной активности (см. таблицу 3.11), а также в соотношении степеней зрелости ТК (см. таблицу 3.12). Таблица 3.11 — Морфофункциональные показатели ТК придатков семенников зрелых животных Параметр Срок Число ТК, шт/1 мм2 органа СГХК, усл.ед. ИД, % 4 мес. 19,14 ± 2,66 1,63 ± 0,18 8,03 ± 3,18 10 мес. 23,17 ± 5,02 1,88 ± 0,13 10,48 ± 2,01 12 мес. 30,80 ±7,04* 1,59 ± 0,20 18,47 ± 4,15*’** Примечание – отличия достоверны по сравнению с 4 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 10 мес. (**), p<0,05. 36

Таблица 3.12 — Соотношение типов зрелости ТК придатков семенников зрелых животных Параметр Срок Количество молодых Количество Количество зрелых ТК, ТК, % промежуточных ТК, % % 4 мес. 44,87 ± 11,58 18,05 ± 3,99 37,08 ± 9,22 10 мес. 60,18 ± 7,97 24,06 ± 4,71 15,76 ± 3,99* 12 мес. 64,40 ± 7,02*’** 10,59 ± 2,69*’** 25,01 ± 7,76 Примечание – отличия достоверны по сравнению с 4 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 10 мес. (**), p<0,05. Можно заметить, что в 4 месяца количество молодых и зрелых ТК примерно одинаковое и составляет в 2 раза большее число, чем количество промежуточных. К 10 месяцам число молодых ТК увеличивается почти в 1,5 раза, при этом число зрелых уменьшается. К 12 месяцам большую часть тучноклеточной популяции составляют молодые ТК, при том, что присутствует тенденция к увеличению зрелых ТК. Таким образом, можно сказать, что у зрелых животных происходит миграция ТК в придатки семенников. Вместе с этим к 12 месяцам увеличивается число ТК и усиливается их функциональная активность (см. рисунок 3.6). А Б Рисунок 3.6 — Тучные клетки в придатках зрелых животных Примечание – А – 10 месяцев; Б – 12 месяцев. Окраска толуидиновым синим. Увеличение х40. Что касается морфометрии самого органа, то анализ данных показал увеличение толщины собственной пластинки в 10 месяцев и дальнейшую тенденцию к увеличению на срок 12 месяцев, что свидетельствует об усилении трофики тканей данного органа (см. таблицу 3.13 и рисунок 3.7). Таблица 3.13 — Морфометрические показатели придатков семенников зрелых животных 37

Параметр Толщина Больший Меньший Высота диаметр диаметр эпителиальных протока, мкм протока, мкм клеток, мкм 4 мес. 27,58 ± 1,29 19,87 ± 0,74 1,252 ± 0,050 0,281 ± 0,013 10 мес. 27,59 ± 8,30 21,75 ± 6,59 1,353 ± 0,036 0,335 ± 0,027* 12 мес. 26,90 ± 0,91 21,50 ± 0,78 1,276 ± 0,056 0,373 ± 0,043* Срок собственной пластинки, мкм Примечание – отличия достоверны по сравнению с 4 мес. (*), p<0,05. А Б Рисунок 3.7 — Протоки придатков зрелых животных Примечание – А – 10 месяцев, Б – 12 месяцев. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х20. Делая вывод о функционировании придатков семенников в зрелом возрасте, можно сказать, что в период активного размножения особей (10 месяцев) морфофункциональные показатели ТК не изменяются, но смещается градиент их зрелости в сторону молодой популяции. При этом усиливается трофика эпителиальных клеток, выстилающих протоки придатка. К 12 месяцам, когда интенсивность размножения снижается, увеличивается число ТК и их функциональная активность, трофика тканей остается на уровне 10-ти месячных животных. 3.2.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и семенных пузырьков у зрелых животных Анализ данных показал достоверное усиление синтетической активности ТК семенных пузырьков у 12-ти месячных животных (см. таблицу 3.14). Таблица 3.14 — Морфофункциональные показатели ТК семенных пузырьков зрелых животных 38

Параметр Срок Число ТК, шт/1 мм2 органа СГХК, усл.ед. ИД, % 4 мес. 42,00 ± 4,97 1,78 ± 0,14 6,86 ± 3,22 10 мес. 41,2 ± 9,61 1,72 ± 0,13 9,06 ±3,32 12 мес. 38,14 ± 6,31 2,06 ± 0,10*’** 7,10 ± 1,99 Примечание – отличия достоверны по сравнению с 4 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 10 мес. (**), p<0,05. Функциональная активность ТК при этом не изменяется, что свидетельствует об активном синтезе и накоплении секрета гранул ТК для дальнейшей работы. Помимо этого изменения происходят и с градиентом зрелости ТК (см. таблицу 3.15) Таблица 3.15 — Соотношение типов зрелости ТК семенных пузырьков зрелых животных Параметр Срок Количество молодых Количество Количество зрелых ТК, ТК, % промежуточных ТК, % % 4 мес. 19,16 ± 4,71 20,52 ± 0,98 60,32 ± 5,28 10 мес. 37,28 ± 4,48* 18,19 ± 3,25 44,52 ± 4,98* 12 мес. 36,35 ± 8,57* 16,18 ± 2,72 47,47 ± 8,86 Примечание – отличия достоверны по сравнению с 4 мес. (*), p<0,05. У зрелых животных происходит миграция ТК, и градиент зрелости смещается в сторону молодой популяции, данные показатели сохраняются на протяжении всего репродуктивного периода. Число ТК при этом не изменяется (см. рисунок 3.8). 39

А Б Рисунок 3.8 — Тучные клетки в семенных пузырьках зрелых животных Примечание – А – 10 месяцев; Б – 12 месяцев. Окраска толуидиновым синим. Увеличение х40. Морфометрические показатели семенных пузырьков так же претерпевают изменения именно в молодом возрасте репродуктивного периода – в 10 месяцев (см. таблицу 3.16). Таблица 3.16 — Морфометрические показатели семенных пузырьков зрелых животных Параметр Срок Высота Объем ядер эпителиальных эпителиоцитов, мкм3 клеток, мкм Толщина собственной пластинки, мкм 4 мес. 0,057 ± 0,002 1,36 ± 0,10 0,29 ± 0,01 10 мес. 0,033 ± 0,005* 1,76 ± 0,20* 0,20 ± 0,01* 12 мес. 0,042 ± 0,007* 1,54 ± 0,08 0,23 ± 0,03* Примечание – отличия достоверны по сравнению с 4 мес. (*), p<0,05. Можно заметить, что происходит уменьшение толщины собственной пластинки и объема ядер эпителиоцитов с одновременным увеличением высоты этих клеток (см. рисунок 3.9) 40

А Б Рисунок 3.9 — Семенные пузырьки зрелых животных Примечание – А – 10 месяцев, Б – 12 месяцев. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х20. Данные изменения могут свидетельствовать о снижении пролиферативной активности клеток и, как следствие, замедлении регенераторных процессов в эпителии семенных пузырьков в период активного полового размножения. Однако, стоит отметить, что угнетение регенерации и снижение трофики тканей компенсируется увеличением самих клеток. Таким образом, можно сказать, что в период активной половой функции семенные пузырьки выполняют интенсивную работу, что сказывается на общем состоянии этого органа. Анализируя все данные, можно заметить, что функциональная активность исследуемых органов практически не изменяется с началом активного размножения, поскольку органы уже были подготовлены к этому этапу в ювенильном возрасте. При этом активация ТК и в придатках, и в семенных пузырьках повторно происходит в зрелом возрасте репродуктивного периода, когда снижается активность половой деятельности животных. 3.3 Морфофункциональная характеристика тучных клеток, придатков и семенных пузырьков у старых животных В группу старых животных были включены крысы 18, 19 и 24 месяцев. Данных особей относят к концу зрелого возраста репродуктивного периода (18 мес.), а также к предстарческому (19 мес.) и старческому (24 мес.) возрастам периода выраженных старческих изменений [130,131]. В этом периоде уже завершается размножение особей. Животные становятся физически хилыми, во внутренних органах происходят патологические изменения (в том числе нарастают опухоли). Шерстный покров теряет блеск, снижается густота, образуются проплешины. 41

Для оценки общего состояния животных измеряли массу тела и массы исследуемых органов, а также определяли весовой индекс (см. таблицу 3.17). Таблица 3.17 — Массы старых животных и их исследуемых органов (г), весовые индексы исследуемых органов (мг/г) Параметр Срок 18 месяцев 19 месяцев 24 месяца Масса крысы, г 696,2 ± 26,5 573,7 ± 35,4* 597,25 ± 45,3* Масса левого придатка, г 0,633 ± 0,104 0,705 ± 0,151 0,794 ± 0,056 Масса правого придатка, г 0,759 ± 0,053 0,865 ± 0,026* 0,658 ± 0,029 *’** 0,952 ± 0,120 0,930 ± 0,203 0,985 ± 0,086 0,901 ± 0,089 0,769 ± 0,205 0,874 ± 0,076 0,91 ± 0,03 1,23 ± 0,06* 1,33 ± 0,08* 1,09 ± 0,02 1,51 ± 0,02* 1,10 ± 0,04** 1,37 ± 0,05 1,62 ± 0,05* 1,65 ± 0,10 1,29 ± 0,04 1,34 ± 0,07 1,46 ± 0,03*’** Масса левого семенного пузырька, г Масса правого семенного пузырька, г Весовой индекс левого придатка, мг/г Весовой индекс правого придатка, мг/г Весовой индекс левого семенного пузырька, мг/г Весовой индекс правого семенного пузырька, мг/г Примечание – отличия достоверны по сравнению с 18 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (**), p<0,05. Из данных таблицы видно, что многие исследуемые параметры крыс старческого и предстарческого возраста имеют достоверные отличия по сравнению с животными 18 месяцев. Помимо этого проводили общий анализ крови (см. таблицу 3.18) и измеряли уровень тестостерона в крови (см. таблицу 3.19). 42

Таблица 3.18 — Общий анализ крови старых животных Срок Параметр Абсолютное содержание лейкоцитов, Г/л; Абсолютное содержание лимфоцитов, Г/л; Абсолютное содержание гранулоцитов, Г/л; Абсолютное содержание моноцитов, Г/л; Общее количество эритроцитов, Т/л; Концентрация гемоглобина, г/л; 18 месяцев 19 месяцев 24 месяца 8,95 ± 0,20 9,95 ± 0,98 11,80 ± 1,28* 3,50 ± 0,17 3,78 ± 0,64 2,95 ± 0,57 4,20 ± 0,47 5,83 ± 0,24* 0,70 ± 0,25 0,35 ± 0,10 0,40 ± 0,12 10,16 ± 0,21 9,77 ± 0,21 9,66 ± 1,20 163,25 ± 4,49 168,25 ± 2,95 162,00 ± 13,96 8,53 ± 1,02 *’** Примечание – отличия достоверны по сравнению с 18 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (**), p<0,05. Таблица 3.19 — Концентрация тестостерона в крови зрелых и старых животных, нмоль/л Срок Параметр Концентрация тестостерона, нмоль/л. 12 месяцев 18 месяцев 19 месяцев 24 месяца 27,69±3,5 17,94±0,11* 26,71±4,66** 23,95±7,1 Примечание – отличия достоверны по сравнению с 12 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 18 мес. (**), p<0,05. Из данных таблицы 3.19 видно, что уровень тестостерона снижается к 18 месяцам, а затем возрастает к 19. 3.3.1 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и придатков семенников у старых животных Анализ данных не показал значительных изменений морфофункциональных показателей ТК при наступлении предстарческого возраста, однако, было выявлено, что к 2 годам в придатках семенников изменениям подвергаются все исследуемые показатели ТК (см. таблицу 3.20). 43

Таблица 3.20 — Морфофункциональные показатели ТК придатков семенников старых животных Параметр Срок Число ТК, шт/1 мм2 органа СГХК, усл.ед. ИД, % 12 мес. 30,80 ±7,04 1,59 ± 0,20 18,47 ± 4,15 18 мес. 35,00 ± 6,26 1,70 ± 0,18 9,78 ± 3,53* 19 мес. 35,50 ± 5,56 1,80 ± 0,07 6,06 ± 2,51* 24 мес. 22,80 ± 4,61** 1,31 ± 0,12** 18,78 ± 6,21** Примечание – отличия достоверны по сравнению с 12 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (**), p<0,05. Можно заметить, что к 18 месяцам снижается функциональная активность ТК, которая к 2 годам возвращается к значениям зрелых животных (12 месяцев). Помимо этого в 2 года снижается число ТК (см. рисунок 3.10) и их синтетическая активность, значения данных показателей приближаются к значениям молодых животных. А Б В Рисунок 3.10 — Тучные клетки в придатках старых животных Примечание – А – 12 месяцев; Б – 19 месяцев; В – 24 месяца. Увеличение х40. 44

Градиент зрелости ТК в зрелом и предстарческом возрастах смещен в сторону молодой популяции, а к старческому возрасту смещается в сторону зрелых и промежуточных ТК (см. таблицу 3.21). Таблица 3.21 — Соотношение типов зрелости ТК придатков семенников старых животных Параметр Срок Количество молодых Количество Количество зрелых ТК, ТК, % промежуточных ТК, % % 12 мес. 64,40 ± 7,02 10,59 ± 2,69 25,01 ± 7,76 18 мес. 59,67 ± 10,92 22,51 ± 6,26* 17,81 ± 4,70 19 мес. 67,11 ± 6,47 18,50 ± 4,29 14,39 ± 5,16 24 мес. 37,43 ± 5,38*’**’*** 28,25 ± 3,41*’*** 34,32 ± 7,05**’*** Примечание – отличия достоверны по сравнению с 12 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 18 мес. (**); отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (***), p<0,05. Данные изменения говорят о том, что в старческом возрасте происходит снижение миграции ТК в этот орган. Что касается состояния самой ткани, то изменения морфометрических показателей придатков у старых крыс практически отсутствуют, за исключением толщины собственной пластинки, которая уменьшается к 18 месяцам, затем резко возрастает в 19 месяцев, после чего возвращается к значениям 12 месячных животных (см. таблицу 3.22 и рисунок 3.11). Таблица 3.22 — Морфометрические показатели придатков семенников старых животных Параметр Больший Меньший Высота Толщина диаметр диаметр эпителиальных собственной протока, мкм протока, мкм клеток, мкм пластинки, мкм 12 мес. 26,90 ± 0,91 21,50 ± 0,78 1,276 ± 0,056 0,373 ± 0,043 18 мес. 27,80 ± 1,53 22,00 ± 0,87 1,309 ± 0,080 0,276 ± 0,015* 19 мес. 30,63 ± 2,30 24,21 ± 1,58 1,304 ± 0,151 0,653 ± 0,093*’** 24 мес. 30,85 ± 2,97 22,58 ± 1,76 1,610 ± 0,240 0,409 ± 0,065**’*** Срок Примечание – отличия достоверны по сравнению с 12 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 18 мес. (**); отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (***), p<0,05. 45

А Б В Рисунок 3.11 — Протоки придатков старых животных Примечание – А – 18 месяцев, Б – 19 месяцев, В – 24 месяца. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х20. Такие скачки показателя могут говорить о нестабильности трофической функции собственной пластинки с увеличением возраста, что возможно связано с деструктивным процессом в этой ткани. В целом можно сказать, что, несмотря на угнетение тканей самих придатков, их ТК возвращаются к состоянию молодых животных. Число ТК и их синтетическая активность находятся на уровне животных 3-10 месяцев, однако при этом клетки активно дегранулируют, что может сигнализировать о наличии патологических процессов в этом органе. 3.3.2 Морфофункциональная характеристика тучных клеток и семенных пузырьков у старых животных В семенных пузырьках с возрастом происходят скачкообразные изменения исследуемых показателей. Самым явным из них является изменение числа ТК у 18-ти месячных животных (см. таблицу 3.23). 46

Таблица 3.23 — Морфофункциональные показатели ТК семенных пузырьков старых животных Параметр Срок Число ТК, шт/1 мм2 органа СГХК, усл.ед. ИД, % 12 мес. 38,14 ± 6,31 2,06 ± 0,10 7,10 ± 1,99 18 мес. 58,00 ± 4,02* 1,79 ± 0,13* 7,54 ± 1,18 19 мес. 43,25 ± 11,63 1,51 ± 0,03*’** 11,35 ± 1,19*’** 24 мес. 46,40 ± 5,59** 1,44 ± 0,20* 15,80 ± 6,87*’** Примечание – отличия достоверны по сравнению с 12 мес. (*); отличия достоверны по сравнению с 18 мес. (**); отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (***), p<0,05. Градиент зрелости к 19 месяцам смещается в сторону молодой популяции, а в 24 месяца миграция ТК в орган прекращается (см. таблицу 3.24). Таблица 3.24 — Соотношение типов зрелости ТК семенных пузырьков старых животных Параметр Срок Количество молодых Количество Количество зрелых ТК, ТК, % промежуточных ТК, % % 12 мес. 36,35 ± 8,57 16,18 ± 2,72 47,47 ± 8,86 18 мес. 13,23 ± 0,79 34,75 ± 6,95 52,02 ± 7,32 19 мес. 50,58 ± 7,30** 25,17 ± 2,86 24,26 ± 7,47** 24 мес. 19,99 ± 4,70*** 20,61 ± 4,43 59,40 ± 6,47*** Примечание – отличия достоверны по сравнению с 18 мес. (**); отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (***), p<0,05. Из таблиц видно, что в конце зрелого возраста происходит резкое увеличение количества ТК, которое затем снижается до значений годовалых животных (см. рисунок 3.12). 47

А Б В Рисунок 3.12 — Тучные клетки в семенных пузырьках старых животных Примечание – А – 12 месяцев; Б – 18 месяцев; В – 24 месяца. Окраска толуидиновым синим. Увеличение х20. Помимо этого начиная с 18 месяцев снижается синтетическая активность ТК и усиливается функциональная, что может говорить о наличии патологических процессов в органе. Анализ морфометрических данных семенных пузырьков показал увеличение объема ядер эпителиоцитов с возрастом (см. таблицу 3.25 и рисунок 3.13). 48

Таблица 3.25 — Морфометрические показатели семенных пузырьков старых животных Параметр Срок Высота Объем ядер эпителиальных эпителиоцитов, мкм3 клеток, мкм Толщина собственной пластинки, мкм 12 мес. 0,042 ± 0,007 1,54 ± 0,08 0,23 ± 0,03 18 мес. 0,033 ± 0,006 1,49 ± 0,10 0,18 ± 0,02 19 мес. 0,027 ± 0,009 1,26 ± 0,16 0,17 ± 0,02 24 мес. 0,052 ± 0,007*** 1,11 ± 0,13 0,21 ± 0,02 Примечание – отличия достоверны по сравнению с 19 мес. (***), p<0,05. А Б Рисунок 3.13 — Семенные пузырьки старых животных Примечание – А – 19 месяцев, Б – 24 месяца. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х20. Увеличение линейных и объемных показателей ядер эпителиальных клеток может указывать на усиление их функциональной активности, направленной на поддержание нормальной функции органа вследствие избыточной нагрузки на клетки. Обобщая результаты можно сказать, что в семенных пузырьках у старых крыс происходят похожие процессы, что и в придатках у животных этого возраста. 49

ВЫВОДЫ 1. В семенных пузырьках и придатках семенников молодых 4-х месячных животных происходит резкое увеличение количества тучных клеток по сравнению с 3-х месячными животными за счет их возможной миграции в эти органы. При этом в семенных пузырьках отмечается повышение синтетической активности мастоцитов наряду с усилением пролиферативной активности эпителиальных клеток самого органа. В то время как в придатках не происходит никаких существенных изменений. Подготовка молодых животных к периоду размножения предположительно сопровождается активной миграцией тучных клеток в органы мужской репродуктивной системы, при этом в семенных пузырьках отмечаются более существенные изменения, чем в придатках. 2. У зрелых животных показатели тучных клеток и тканей исследуемых органов изменяются по-разному. Так в придатках происходит увеличение числа тучных клеток и их функциональной активности, а в семенных пузырьках данные показатели остаются на уровне молодых животных, но при этом происходит усиление синтетической активности. При этом трофика тканей в придатках усиливается, а в семенных пузырьках снижается. Число молодых тучных клеток в исследуемых органах у зрелых животных максимально среди всех экспериментальных групп, что может свидетельствовать об активной миграции мастоцитов в эти органы в период размножения. 3. У старых животных в семенных пузырьках и придатках к 24 месяцам происходит снижение числа тучных клеток и их синтетической активности на фоне резкого увеличения функциональной. При этом градиент их зрелости смещается в сторону молодой популяции в 18-19 месяцев и в сторону зрелой – в 24 месяца, что может говорить о прекращении миграции тучных клеток в эти органы к 2 годам. Вместе с этим происходит угнетение функционирования клеток самих органов, что в совокупности с активной дегрануляцией тучных клеток может свидетельствовать о наличии патологических процессов в органах. 4. На основе предыдущих экспериментов был проведен сравнительный анализ возрастных изменений семенников, семенных пузырьков и придатков и их тучноклеточных популяций. Анализ морфофункциональных показателей тучных клеток выявил однородность тучноклеточной популяции в органах репродуктивной системы самцов крыс и показал одинаковый характер изменений во всех исследуемых органах. В 3 месяца семенники, семенные пузырьки и придатки содержат наименьшее число тучных клеток, которое увеличивается в последующие сроки. У зрелых животных изменения в семенниках схожи с изменениями в придатках. В этот период количество тучных клеток и индекс дегрануляции в этих органах максимальны среди всех исследуемых групп. У старых животных в семенниках, семенных пузырьках и придатках происходит снижение 50

исследуемых показателей тучных клеток, при этом градиент их зрелости смещается в сторону молодой популяции в 18-19 месяцев и в сторону зрелой – в 24 месяца. 5. Присутствие тучных клеток в органах мужской репродуктивной системы указывает на их регуляторную роль в процессах функционирования семенников, семенных пузырьков и придатков. Однако состояние тучных клеток в этих органах сопряжено с различными изменениями. В семенниках и их придатках прослеживаются аналогичные процессы трансформации, тогда как в семенных пузырьках не отмечается подобных изменений. 51

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 1 Чадаев В. Е., Козуб Н. И., Мироненко М. В. Мужское бесплодие: современные аспекты // Международный медицинский журнал. – 2007. – Т. 13, № 4. – С. 81–83. 2 Zegers-Hochschild F., Adamson D., Dyer S., Racowsky C., Mouzon J., Sokol R., Rienzi L., Sunde A., Schmidt L., Cooke I. D., Simpson J. L., Poel S. The international glossary on infertility and fertility care // Human Reproduction. – 2017. – V. 32, № 9. – P. 1786–1801. 3 Frungieri M. B., Weidinger S., Meineke V., Köhn F. M., Mayerhofer A. Proliferative action of mast-cell tryptase is mediated by PAR2, COX2, prostaglandins, and PPARγ: possible relevance to human fibrotic disorders // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2002. – V. 99, № 23. – P. 15072–15077. 4 Li N. Structural, cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis // Front Immunol. – 2012. – V. 3, № 152.10. – P. 3389. 5 Perez C. V. Dual role of immune cells in the testis: Protective or pathogenic for germ cells? // Spermatogenesis. – 2013. – V. 3, № 1. – P. 1–12. 6 Yamanaka K., Fujisawa M. Tanaka H., Okada H., Arakawa S., Kamidono S. Significance of human testicular mast cells and their subtypes in male infertility // Human Reproduction. – 2000. – V. 15, № 7. – P. 1543–1547. 7 Allam J.P., Langer M., Fathy A., Oltermann I., Bieber T., Novak N., Haidl G. Mast cells in the seminal plasma of infertile men as detected by flow cytometry // Andrologia. –2009. – V. 41, № 1. – P. 1–6. 8 Keith I. M., Jin J., Neal D. Jr., Teunissen B. D., Moon T. D. Cell relationship in a Wistar rat model of spontaneous prostatitis // J. Urol. – 2001. – V. 166, № 1. – P. 323–328. 9 Bankl H. C., Samorapoompichit P., Pikula B. et al. Characterization of human prostate mast cells and their increase in periprostaticvein thrombosis // Am. J. Clin. Pathol. – 2001. – V. 116, № 1. – P. 97–106. 10 Da Silva E. Z. M., Jamur M. C., Oliver C. Mast cell function: a new vision of an old cell // Journal of histochemistry and cytochemistry. – 2014. – V. 62, № 10. – Р. 698–738. 11 Алексеева Н. Т. , Глухов А. А. К вопросу о роли тучных клеток в процессе заживления ран // Вестник экспериментальной и клинической хирургии – 2011. – Т. 4, № 4. – С. 864–670. 12 Krystel-Whittemore M., Dileepan K. N., Wood J. G. Mast cell: a multi-functional master cell // Frontiers in Immunology. – 2015. – V. 6, № 620. – Р. 1–12. 52

13 Hussein M. R. Phenotypic characterization of the immune and mast cell infiltrates in the human testis shows normal and abnormal spermatogenesis // Fertility and sterility. – 2005. – V. 83, № 5. – P. 1447–1453. 14 Храмцова, Ю. С., Тюменцева, Н. В., Юшков, Б. Г., Жилякова, М. А. Реакция тучных клеток семенников на стресс разной интенсивности // Морфология. – 2018. – Т. 153, № 2. – С. 47–51. 15 Sampson N., Untergasser G., Plas E., Berger P. The ageing male reproductive tract // J. Pathol. – 2007. – V.211, № 2. – P. 206–218. 16 Franca L. R., Avelar G. F., Almeida F. F. L. Spermatogenesis and sperm transit through the epididymis in mammals with emphasis on pigs // Theriogenology. – 2005. – V. 63, № 2. – P. 300–318. 17 Moore H. D. M. Post-testicular sperm maturation and transport in the excurrent ducts // Gametes. The spermatozoon. – 1995. – P. 140–155. 18 Bedford J. M. Changes in fine structure of the rabbit sperm head during passage through the epididymis // Journal of anatomy. – 1965. – V. 99, № 4. – P. 891. 19 Bedford J. M., Nicander L. Ultrastructural changes in the acrosome and sperm membranes during maturation of spermatozoa in the testis and epididymis of the rabbit and monkey // Journal of anatomy. – 1971. – V. 108, № 3. – P. 527. 20 Retamal C., Urzua J., Lorca C., Lopez M. L., Alves E. W. Changes in the plasma membrane proteins of stallion spermatozoa during maturation in the epididymis // J. Submicrosc. Cytol. Pathol. – 2000. – V. 32, № 2. – P. 229–239. 21 Colasante A., Minasi M. G., Scarselli F., Casciani V., Zazzaro V., Ruberti A., Greco P., Varricchio M. T., Greco E. The aging male: Relationship between male age, sperm quality and sperm DNA damage in an unselected population of 3124 men attending the fertility centre for the first time // Archivio Italiano di urologia e andrologia. – 2018. – V. 90, № 4. – P. 254–259. 22 Sullivan R., Saez F., Girouard J., Frenette G. Role of exosomes in sperm maturation during the transit along the male reproductive tract // Blood cells, molecules, and diseases. – 2005. – V.35, № 1. – P. 1–10. 23 Sostaric E., Aalberts M., Gadella B. M., Stout T. A. E. The roles of the epididymis and prostasomes in the attainment of fertilizing capacity by stallion sperm // Animal reproduction science. – 2008. – V. 107, № 3-4. – P. 237–248. 24 Sullivan R., Mieusset R. The human epididymis: its function in sperm maturation // Human reproduction update. – 2016. – V. 22, № 5. – P. 574–587. 53

25 Thimon V., Frenette G., Saez F., Thabet M., Sullivan R. Protein composition of human epididymosomes collected during surgical vasectomy reversal: a proteomic and genomic approach // Human reproduction. – 2008. – V. 23, № 8. – P. 1698–1707. 26 Yoshida K., Yamasaki T., Yoshiike M., Takano S., Sato I., Iwamoto T. Quantification of seminal plasma motility inhibitor/semenogelin in human seminal plasma // Journal of andrology. – 2003. – V. 24, № 6. – P. 878–884. 27 Cherr G. N., Yudin A. I., Overstreet J. W. The dual functions of GPI-anchored PH-20: hyaluronidase and intracellular signaling // Matrix Biology. – 2001. – V. 20, № 8. – P. 515–525. 28 Frenette G., Lessard C., Sullivan R. Polyol pathway along the bovine epididymis // Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research. – 2004. – V. 69, № 4. – P. 448–456. 29 Eickhoff R., Jennemann G., Hoffbauer G., Schuring M. P., Kaltner H., Sinowatz F., Gabius H. J., Seitz J. Immunohistochemical detection of macrophage migration inhibitory factor in fetal and adult bovine epididymis: release by the apocrine secretion mode? // Cells Tissues Organs. – 2006. – V. 182, № 1. – P. 22–31. 30 Bhanmeechao C., Srisuwatanasagul S., Prapaiwan N., Ponglowhapan S. Reproductive aging in male dogs: The epididymal sperm defects and expression of androgen receptor in reproductive tissues // Theriogenology. – 2018. – V. 108, № 1. – P. 74–80. 31 Wang C., Leung A., Sinha-Hikim A. P. Reproductive aging in the male brown-Norway rat: a model for the human // Endocrinology. – 1993. – V. 133, № 1. – P. 2773–2781. 32 Wright W.W., Fiore C., Zirkin B.R. The effect of aging on the seminiferous epithelium of the brown Norway rat // J. Androl. – 1993. – V. 14, № 1. – P. 110–117. 33 Calvo A., Pastor L.M., Martinez E., Vazquez J.M., Roca J. Age-related changes in the hamster epididymis // Anat. Rec. – 1999. – V. 256, № 1. – P. 335–346. 34 Wolf K.N., Wildt D.E., Vargas A., Marinari P.E., Kreeger J.S., Ottinger M.A. Age dependent changes in sperm production, semen quality, and testicular volume in the black-footed ferret (Mustela nigripes) // Biol. Reprod. – 2000. – V. 63, № 1. – P. 179–187. 35 Elcock L.H., Schoning P. Age-related changes in the cat testis and epididymis // Am. J. Vet. Res. – 1984. – V. 245, № 1. – P. 2380–2384. 36 Neaves W.B., Johnson L., Petty C.S. Seminiferous tubules and daily sperm production in older adult men with varied numbers of Leydig cells // Biol. Reprod. – 1987. – V. 36, № 1. – P. 301–308. 37 Vermeulen J.A. Androgens in the aging male // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1991. – V. 73, № 1. – P. 221–224. 54

38 Cran D. G., Jones R. Aging male reproductive system: changes in the epididymis // Exp. Gerontol. – 1980. – V. 15, № 2. – P. 93–101. 39 Robert M., Gagnon C. Semenogelin I: a coagulum forming, multifunctional seminal vesicle protein // CMLS. – 1999. – V. 55, № 6. – P. 944–960. 40 Risbridger G. P., Taylor R. A. Physiology of the male accessory sex structures: the prostate gland, seminal vesicles, and bulbourethral glands // Knobil and Neill's physiology of reproduction. – 2006. – V.1. – P. 1149–1172. 41 Beghdadi W., Madjene L. C., Benhamou M. Mast cells as cellular sensors in inflammation and immunity // Frontiers in immunology. – 2011. – V. 2, № 37. – Р. 1–15. 42 Гусельникова В. В., Пронина А. П., Назаров П. Г., Полевщиков А. В. Происхождение тучных клеток: современное состояние проблемы // Вопросы морфологии XXI века: сб. науч. тр. к 80-летию со дня рождения профессора Алексея Андреевича Клишова. – ДЕАН, 2010. – С. 108–115. 43 Ефимов А. Д. Изучение критериев диагностики мастоцитомы // Бюллетень науки и практики. – 2016. – № 12. – С. 114–120. 44 Гусельникова В. В., Синицина В. Ф., Королькова Е. Д., Харазова А. Д., Полевщиков А. В. Локализация тучных клеток в тимусе мыши на разных этапах онтогенеза // Морфология. – 2012. – № 2. – С. 40–45. 45 Ерохина И. Л. Резкое увеличение плотности тучных клеток в легких и перикарде при индуцированный монокроталином легочной гипертензии у крыс // Цитология. – 2011. – № 1. – С. 39–43. 46 Ефимова О. А. Половой диморфизм тучных клеток красного костного мозга крыс в норме и под влиянием препарата “Эндорфаин” // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № 3. – С. 330–332. 47 Смелова И. В., Голощапова Ж. А., Попов Г. К. Особенности миграции тучных клеток // Вестник ЮУрГУ, серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». – 2012. – № 42. – С. 121–123. 48 Яковлева Л. М., Соркина О. А. Реакция тучных клеток в околоушной слюнной железе на хроническую алкогольную интоксикацию // Морфология. – 2016. – № 2. – С. 27– 31. 49 Polyzoidis S., Koletsa T., Panagiotidou S., Ashkan K., Theoharides T. C. Mast cells in meningiomas and brain inflammation // Journal of neuroinflammation. – 2015. – V. 12, № 170. – Р. 1–8. 55

50 Brown M. A., Hatfield J. K. Mast cells are important modifiers of autoimmune disease: with so much evidence, why is there still controversy? // Frontiers in Immunology. – 2012. – V. 3, № 147. – Р. 1–14. 51 Юшков Б. Г., Черешнев В. А., Климин В. Г., Арташян О. С. Тучные клетки. Физиология и патофизиология : учеб.-справ. пособие. – Москва : Медицина, 2011. – 240 с. 52 Синельникова Н. А., Калинина Н. М., Савенкова Н. Д. Хроническая крапивница в детском возрасте. Иммунопатология хронической крапивницы у детей // Медицинская иммунология. – 2013. – Т. 15, № 3. – С. 203–214. 53 Maciel T. T., Moura I. C., Hermine O. The role of mast cells in cancers // F1000Prime Reports. – 2015. – V. 7, № 9. – Р. 1–6. 54 Мухлынина Е. А. Анализ функциональной активности тучных клеток кожи крыс при хроническом воспалении // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2014. – №3. – С. 35–36. 55 Надин К. А. Тучные клетки как фактор развития воспалительных процессов в соедин ительной ткани // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2012. – Т. 10, № 1. – С. 22–27. 56 Уханова О. П. Современные представления о программированной гибели тучных клеток и базофилов при аллергическом воспалении // Аллергология и иммунология. – 2009. – Т. 10, № 4. – С. 463–468. 57 Баглай Е. О., Дубиков А. И. Тучные клетки – ключевые участники патогенеза иммуновоспалительных заболеваний // Научно-практическая ревматология. – 2015. – № 2. – С. 182–189. 58 Киричек Л. Т., Соколова И. И., Ананько С. Я., Миронченко С. И., Стороженко Е. В. Степень дегрануляции тучных клеток как показатель противоаллергического действия лекарственных средств // Материалы всеукраинской научно-практической конференции “Медицинская наука”. – 2010. – С. 107–110. 59 Яглова Н. В., Яглов В. В. Биология секреции тучных клеток // Клиническая и экспериментальная морфология. – 2012. – № 4. – С. 4–10. 60 Ribatti D. Mast cells in lymphomas // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 2016. – V. 101. – P. 207–212. 61 Welle M. Development, significance, and heterogeneity of mast cells with particular regard to the mast cell‐specific proteases chymase and tryptase // Journal of leukocyte biology. – 1997. – V. 61, №. 3. – P. 233–245. 62 Омельяненко Н. П., Слуцкий Л.И. Соединительная ткань (Гистофизиология и биохимия): учеб.-справ. пособие. – М. : Известия, 2009. – Т. 1. – 357 с. 56

63 Быков В. Л. Развитие и гетерогенность тучных клеток // Морфология. – 2000. – Т. 117, №. 2. – С. 86–92. 64 Gurish M. F., Boyce J.A. Mast cells: ontogeny, homing, and recruitment of a unique innate effector cell // Clin. Immunol. – 2006. – V. 117, № 6. – P. 1285–1291. 65 Mumcuoglu K. Y., Ingber A., Gilead L., Stessman J., Friedmann R., Schulman H., Bichucher H., Ioffe-Uspensky I., Miller J., Galun R., Raz I. Maggot therapy for the treatment of intractable wounds // International journal of dermatology. – 1999. – V. 38, №. 8. – P. 623–627. 66 Туриева-Дзодзикова М.Э. Органная гетерогенность тучных клеток в норме и при воздействии постоянных магнитных полей: автореф… канд. биол. наук. – Москва, 1999. – 25 с. 67 Туриева-Дзодзикова М.Э., Салбиева К.Д., Какабадзе С.А. Влияние постоянного магнитного поля на лаброциты брыжейки крыс // Морфология. – 1995. – Т. 108, №. 1. – С. 45–46. 68 Быков В.Л. Секреторные механизмы и секреторные продукты тучных клеток // Морфология. – 1999. – Т. 115, № 2. – С. 64–72. 69 Войткевич А.А. Тучные клетки при различных состояниях организма // Усп. совр. биол. М., 1963. – Т. 56, № 1. – С. 56–76. 70 Виноградов В. В., Воробьёва Н. Ф. Тучные клетки. – Новосибирск : Наука, 1973. – 120 с. 71 Виноградов В. В., Орловская Г. В., Павлова В. Н. Современные биохимические и морфологические проблемы соединительной ткани. – Москва : Наука, 1971. – 392 с. 72 Шурин С. П., Мелешин С. В., Григорьев Ю. А. Некоторые аспекты изучения функционального состояния системы тучных клеток. – Новосибирск : Наука, 1968. – 144 с. 73 Виноградов В.В. Тучные клетки (генез, структура, функции) / В. В. Виноградов, Н. Ф. Воробьева. – Новосибирск : Наука, 1973. – 126 с. 74 Юрина Н. А., Радостина А. И. Морфофункциональная гетерогенность и взаимодействие клеток соединительной ткани. – Москва : Изд-во УДН. – 1990. – С. 62–143. 75 Юрина Н.А., Радостина А.И. Тучные клетки и их роль в организме: учебное пособие. – Москва : Изд-во РУДН, 1977. – 74 с. 76 Shikotra A., Ohri C. M., Green R. H., Waller D. A., Bradding P. Mast cell phenotype, TNFα expression and degranulation status in non-small cell lung cancer // Scientific reports. – 2016. – V. 6, № 38352. – Р. 1–11. 77 Bloom G.D. Structural and biochemical characteristics of mast cells // The Inflammatory Process (Second Edition). – 1974 – V. 1. – P. 545–599. 57

78 Ogasawara T., Murakami M., Suzuki-Nishimura T. et al. Mouse bone marrow-derived mast cells undergo exocytosis, prostanoid generation, and cytokine expression in responseto G protein-activating polybasic compounds after coculture with fibroblasts in the presence of c-kit ligand // J. Immunol. – 1997. – V. 158, № 1. – P. 393–404. 79 Wasserman S.I. Mast cell biology // Journal of allergy and clinical immunology. – 1990. – V. 86, №. 4. – P. 590–593. 80 He S.H. Key role of mast cells and their major secretory products in inflammatory bowel disease // World journal of gastroenterology. – 2004. – V. 10, №. 3. – P. 309. 81 Moon T. C., Befus A. D., Kulka M. Mast Cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved // Frontiers in immunology. – 2014. – V. 5, № 569. – Р. 1–18. 82 Azouz N. P., Hammel I., Sagi-Eisenberg R. Characterization of mast cell secretory granules and their cell biology // DNA and cell biology. – 2014. – V. 33, № 10. – Р. 647–651. 83 Nautiyal K. M., Dailey C. A., Jahn J. L., Rodriquez E., Son N. H., Sweedler J. V., Silver R. Serotonin of mast cell origin contributes to hippocampal function // The European journal of neuroscience. – 2012. – V. 36, № 3 – Р. 2347–2359. 84 Калмантаева О. В., Фирстова В. В., Потапов В. Д., Зырина Е. В., Герасимов В. Н., Ганина Е. А., Бурмистров В. А., Борисов А. В. Особенности воздействия наночастиц серебра на иммунную систему мышей в зависимости от пути введения // Российские нанотехнологии. – 2014. – № 9. – С. 78–82. 85 Caughey G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators // Advances in experimental medicine and biology. – 2011. – V. 716 – Р. 212–234. 86 Theoharides T. C., Alysandratos K. D., Angelidou A., Delivanis D. A., Sismanopoulos N., Zhang B., Asadi S., Vasiadi M., Weng Z., Miniati A., Kalogeromitros D. Mast cells and inflammation // Biochimica et biophysica acta. – 2012. – V. 1822, № 1. – P. 21–33. 87 Zhang J., Shi G. P. Mast cells and metabolic syndrome // Biochimica et biophysica acta. – 2012. – V. 1822, № 1. – Р. 14–20. 88 Sherman M. A. The Role of mast cells in bacterial enteritis // The American journal of pathology. – 2010. – V. 171, № 2. – Р. 399–401. 89 Wulff B. C, Wilgus T. A. Mast cell activity in the healing wound: More than meets the eye? // Experimental dermatology. – 2013. – V. 22, № 8. – Р. 507–510. 90 Urb M., Sheppard D. C. The role of mast cells in the defence against pathogens // Plos pathogens. – 2012. – V. 8, № 4. – Р. 1–3. 91 Ningyan G., Xu Y., Hongfei S., Jingjing C., Min C. The role of macrophage migration inhibitory factor in mast cell-stimulated fibroblast proliferation and collagen production // Plos one. – 2015. – V. 10, № 3. – Р. 1–14. 58

92 Aich A., Afrin L. B., Gupta K. Mast cell-mediated mechanisms of nociception // International Journal of Molecular Sciences. – 2015 – V. 16, № 12. – Р. 29069–29092. 93 Bosquiazzo V.L. et al. Mast cell degranulation in rat uterine cervix during pregnancy correlates with expression of vascular endothelial growth factor mRNA and angiogenesis // Reproduction. – 2007. – V. 133, №. 5. – P. 1045–1055. 94 Crivellato E., Ribatti D., Mallardi F., Beltrami C.A. The mast cell: a multifunctional effector cell // Adv. Clin. Path. – 2003. – V. 7, № 1. – P. 13–26. 95 Douaiher J., Succar J., Lancerotto L., Gurish M. F., Orgill D. P., Hamilton M. J., Krilis S. A., Stevens R. L. Development of mast cells and importance of their tryptase and chymase serine proteases in inflammation and wound healing // Advances in immunology. – Academic Press. – 2014. – V. 122. – P. 211–252. 96 Gaber M. A., Seliet I. A., Ehsan N. A., Megahed M. A. Mast cells and angiogenesis in wound healing // Anal. Quant Cytopathol. Histpathol. – 2014. – V. 36, №. 1. – P. 32–40. 97 Парахонский А.П. Взаимосвязь тучных и нервных клеток // Современные наукоемкие технологии. – 2007. – №. 2. – С. 79–80. 98 Bulut K., Felderbauer P., Deters S., Hoeck K., Schmidt-Choudhury A., Schmidt W. E., Hoffmann P. Sensory neuropeptides and epithelial cell restitution: the relevance of SP-and CGRPstimulated mast cells // International journal of colorectal disease. – 2008. – V. 23, №. 5. – P. 535– 541. 99 Арташян О. С., Юшков Б. Г., Мухлынина Е. А. Изучение функциональной активности тучных клеток при иммобилизационном стрессе // Цитология. – 2006. – Т. 48, №. 8. – С. 665–668. 100 Кондашевская М. В. Тучные клетки и гепарин – ключевые звенья в адаптивных и патологических процессах // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2010. – №. 6. – С. 49–54. 101 Kalesnikoff J., Galli S.J. New developments in mast cell biology // Nature immunology. – 2008. – V. 9, №. 11. – P. 1215. 102 Sridharan G., Shankar A.A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility // Journal of oral and maxillofacial pathology. – 2012. – V. 16, №. 2. – P. 251. 103 Chen L., Schrementi M. E., Ranzer M. J., Wilgus T. A., DiPietro L. A. Blockade of mast cell activation reduces cutaneous scar formation // Plos one. – 2014. – V. 9, № 1. – Р. 1–10. 104 Gilfillan A. M., Beaven M. A. Regulation of mast cell responses in health and disease // Critical reviews in immunology. – 2011. – V. 31, № 6. – P. 475–529. 105 Лебедева Т. Ю. Федерякина О.Б., Дубенский В.В., Катунина О.Р. Мастоцитоз у детей // Верхневолжский медицинский журнал. – 2012. – № 3. – С. 26–32. 59

106 Halova I., Draberova L., Draber P. Mast cell chemotaxis – chemoattractants and signaling pathways // Frontiers in immunology. – 2012. – V. 3, № 119. – P. 1–19. 107 Шабельников С. В., Быстрова О. А., Мартынова М. Г. Наличие и локализация белка теплового шока Hsp 70 в тучных клетках крысы // Цитология. – 2012. – Т. 54, № 2. – С. 130– 134. 108 Арташян О. С. Система тучных клеток при действии на организм экстремальных факторов: автореф. дис. ... канд. биол. наук. – Екатеринбург, 2006. – 28 с. 109 Арташян О. С., Юшков Б. Г., Храмцова Ю. С. Морфологические аспекты участия тучных клеток в формировании общего адаптационного синдрома // Таврический медикобиологический вестник. – 2012. – Т. 15, № 3. – С. 22–25. 110 Лебедев К. А. Понякина И. Д. Иммунограмма в клинической практике – М. : Наука, 1990. – 224 с. 111 Hueber A. J., Asquith D. L., Miller A. M, Reilly J., Kerr S., Leipe J., Melendez A. J., McInnes I. B. Mast cells expressil-17A in rheumatoid arthritis synovium // J. Immunol. – 2010. – №184. – P. 3336–40. 112 Metcalfe D. D., Baram D., Mekori Y. A. Mast cells // Physiol. Rev. – 1997. – V.77. – P. 1033–1079. 113 Olsson N., Piek E., Dijke P., Nilsson G. Human mast cell migration in response to members of the transforming growth factor‐β family // Journal of leukocyte biology. – 2000. – V. 67, №. 3. – P. 350–356. 114 Silverman A. J., Asarian L., Khalil M., Silver R. GnRH, brain mast cells and behavior // Progress in Brain Research. – 2002. – V.141. –P.317–327. 115 Fritz F. J., Pabst R. Numbers and heterogeneity of mast cells in the male genital tract of the rat // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. – 1989. – V.88, № 3. – P.360–362. 116 Haidl G., Duan Y.G., Chen S. J., Kohn F. M., Schuppe H. C., Allam J. P. The role of mast cells in male infertility // Expert Rev. Clin. Immunol. – 2011. – V.7, № 5. – P.627–634. 117 Белый Л. Е., Коньшин И. И. Гемато-эпидидимальный барьер и его повреждение при инфекционном воспалении в придатке яичка // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 2. – С. 23–23. 118 Cornwall G. A. New insights into epididymal biology and function // Human reproduction update. – 2009. – V. 15, № 2. – P. 213–227. 119 Flickinger C. J., Bush L. A., Howards S. S., Herr J. C. Distribution of leukocytes in the epithelium and interstitium of four regions of the Lewis rat epididymis // The Anatomical Record: An Official Publication of the American Association of Anatomists. – 1997. – V. 248, № 3. – P. 380–390. 60

120 Michel V., Pilatz A., Hedger M. P., Meinhardt A. Epididymitis: revelations at the convergence of clinical and basic sciences // Asian journal of andrology. – 2015. – V. 17, № 5. – P. 756–763. 121 Yakirevich E. et al. Cytotoxic phenotype of intra-epithelial lymphocytes in normal and cryptorchid human testicular excurrent ducts // Human Reproduction. – 2002. – V. 17, № 2. – P. 275–283. 122 Gaytan F., Carrera G., Pinilla L., Aguilar R., Bellido C. Mast cells in the testis, epididymis and accessory glands of the rat: effects of neonatal steroid treatment // Journal of andrology. – 1989. – V. 10, № 5. – P. 351–358. 123 Nelson L. Sperm motility // Fertilization. – 1967. – V. 1. – P. 27–97. 124 Punhagui A. P. F., Vieira H. R., De Lion Siervo G. E. M., Da Rosa R., Fernandes G. S. A. Ethanol exposure during peripubertal period increases the mast cell number and impairs meiotic and spermatic parameters in adult male rats // Microsc. Res. Tech. – 2016. – V.79, № 6. – P.541– 549. 125 Gonzales G. F. Function of seminal vesicles and their role on male fertility // Asian J. Androl. – 2001. – V. 3, № 4. – P. 251–258. 126 Theoharides T. C., Flaris N., Cronin C. T., Ucci A., Meares E. Mast cell activation in sterile bladder and prostate inflammation // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. – 1990. – V. 92, № 3. – P. 281–286. 127 Ellem S. J., Wang H., Poutanen M., Risbridger G. P. Increased endogenous estrogen synthesis leads to the sequential induction of prostatic inflammation (prostatitis) and prostatic premalignancy // Am. J. Pathol. – 2009. – V. 175, № 3. – P. 1187–1199. 128 Fibbi B., Penna G., Morelli A., Adorini L., Maggi M. Chronic inflammation in the pathogenesis of benign prostatic hyperplasia // Int. J. Androl. – 2010. – V. 33, № 3. – P. 475–488. 129 Gonzales G. F., Kortebani G., Mazzolli A. B. Leukocytospermia and function of the seminal vesicles on seminal quality // Fertil. Steril. – 1992. – V. 57, № 1. – P. 1058–1065. 130 Абрашова Т.В., Гущин Я.А., Ковалева М.А., Рыбакова А.В., Селезнева А.И., Соколова А.П., Ходько С.В. Справочник. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных. – СПБ. : ЛЕМА, 2013. – 116 с. 131 Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. – М. : Высшая школа, 1983. – 383 с. 132 Enerback L. Mast cell heterogeneity: the evolution of the concept of a specific mucosal mast cell // Mast Cell Differentiation and Heterogeneity. – 1986. – P. 1-26. 61

133 Spicer S.S. A correlative study of the histochemistry properties of rodent acid mucopolysaccharides // J. Histochem. Cytochem. – 1960. – V. 8. – P. 18-35. 134 Гусельникова В. В. Морфофункциональная характеристика популяции тучных клеток тимуса мыши: дис… канд. биол. наук. – Санкт-Петербург, 2016. – 127 с. 135 Astaldi G., Verga L. The glycogen content of the cells of lymphatic leukemia // Acta haematol. – 1957. – V. 17, № 3. – Р. 129–136. 136 Кащенко С. А., Захаров А. А. Морфологические особенности семенных пузырьков неполовозрелых животных после циклофосфамид-индуцированной иммуносупрессии // Ульяновский медико-биологический журнал. – 2018. – № 1. – С. 119–126. 137 Mukerjee B., Rajan T. Morphometric study of seminal vesicles of rat in normal health and stress conditions // J. Anat. Soc. India. – 2006. – V. 55, № 1. – Р. 31–36. 130 138 Miller R. J., Killian G. J. Morphometric analyses of the epididymis from normal and vasectomized rats // J. Androl. – 1987. – № 8. – P. 279–291. 139 Aguilera-Merlo C., Mun-Oz E., Domingues S., Scardapane L., Piezzi R. Epididymis of Viscacha (Lagostomus maximus maximus): morphological changes during the annual reproductive cycle // The Anatomical record Part A. – 2005. – V. 282. – P. 83–92. 62

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Анастасия Власова

Рецензент Тюменцева Н.В., к.б.н., старший научный сотрудник Института иммунологии и физиологии УрО РАН

почти 4 года назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв