ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ 12–БРОМ– И 12–СУЛЬФОДЕГИДРОАБИЕТИНОВОЙ КИСЛОТ И ИХ СОЛЕЙ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ.

Анисимова Анастасия

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ 12–БРОМ– И 12–СУЛЬФОДЕГИДРОАБИЕТИНОВОЙ КИСЛОТ И ИХ СОЛЕЙ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ.

Данная работа посвящена исследованию антимикробной активности смоляных кислот и их калиевых солей в отношении ряда микроорганизмов, а также расчету биологической активности (БА) изучаемых соединений с использованием пакета программ PASS online.

Биотехнология

Дипломы

Вуз: Санкт-Петербургский государственный политехнический университет (ФГБОУ ВПО «СПбГПУ»)

ID: 5f17fa91cd3d3e0001ae5e7c

UUID: 5f254d00-ae24-0138-0f94-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 78

14.56

Анисимова Анастасия

Санкт-Петербургский государственный политехнический университет (ФГБОУ ВПО «СПбГПУ»)

Комментировать 0

Рецензировать 3

Скачать - 1,1 МБ

Поделиться работой

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого Институт биомедицинских систем и биотехнологий Высшая школа биотехнологий и пищевых производств Работа допущена к защите Руководитель ОП _________Е.В. Москвичева «___» июня 2020 г. ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ 12–БРОМ– И 12–СУЛЬФОДЕГИДРОАБИЕТИНОВОЙ КИСЛОТ И ИХ СОЛЕЙ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ по направлению подготовки 19.03.01 Биотехнология Профиль 19.03.01_01 Пищевая биотехнология Выполнил студент гр. 4731901/60101 А.О. Анисимова Руководитель профессор, д.х.н., профессор Л.М. Попова Консультант по нормоконтролю Е.В. Москвичева Санкт-Петербург 2020

РЕФЕРАТ На 60 с., 18 рисунков, 15 таблиц. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ, ДИСПРОПОРЦИОНИРОВАНАЯ КАНИФОЛЬ, СМОЛЯНЫЕ КИСЛОТЫ, 12–БРОМДЕГИДРОАБИЕТИНОВАЯ КИСЛОТА, 12–СУЛЬФОДЕГИДРО-АБИЕТИНОВАЯ КИСЛОТА, КАЛИЕВЫЕ СОЛИ СМОЛЯНЫХ КИСЛОТ. Тема выпускной квалификационной работы: «Определение токсичности 12–бром – и 12–сульфодегидроабиетиновой кислот и их солей в отношении клеток микроорганизмов». Данная работа посвящена исследованию антимикробной активности смоляных кислот и их калиевых солей в отношении ряда микроорганизмов, а также расчету биологической активности (БА) изучаемых соединений с использованием пакета программ PASS online. Задачи, которые решались в ходе исследований: 1) Выбор объектов исследования: смоляных кислот и микроорганизмов. 2) Приготовление питательных сред. 3) Инкубация микроорганизмов, используемых в работе. 4) Приготовление растворов производных смоляных кислот и их солей. 5) Определение антимикробной активности исследуемых препаратов. 6) Расчет БА препаратов с помощью пакета программ PASS online. Работа проведена в лаборатории ВШБиПП, где изучалась антимикробная активность производных смоляных кислот и их солей. В результате исследование антибактериальной активности производных смоляных кислот показано, что наибольшим ингибирующим действием в отношении микроорганизмов Escherichia coli и Bacillus subtilis обладают изомеризованная канифоль и 12–бромдегидроабиетиновая кислота (ДАК) и их соли, в то же время калиевая соль 12–сульфо–ДАК незначительно подавляет рост Candida tropicalis. Расчет PASS online показал, все производные смоляных кислот и их калиевые соли (I–IV, VI*) могут обладать высоким протекторным действием для

слизистых оболочек (Pa 93 – 98 %) и выраженной противовирусной (грипп) защитой (Pa 70 – 80 %). ABSTRACT 60 pages, 18 figures, 15 tables. KEYWORDS: ANTIMICROBIC ACTIVITY, DISPROPORTED ROSIN, RESIN ACIDS, 12–BROMDEHYDROABIETHIC ACID, 12–SULPHODEHYDROABIETINIC ACID, The theme of the final qualification work: "Determination of toxicity of 12–bromo – and 12–sulfodehydroabietic acids and their salts in relation to microorganism cells." This work is devoted to the study of the antimicrobial activity of resin acids and their potassium salts in relation to several microorganisms, as well as the calculation of the biological activity (BA) of the studied compounds using the PASS online software package. Tasks that were solved in the course of research: 1) The choice of research objects: resin acids and microorganisms. 2) Preparation of culture media. 3) Incubation of microorganisms traditional in work. 4) Preparation of solutions of derivatives of resin acids and their salts 5) Determination of antimicrobial activity of the studied drugs. 6) Calculation of BA drugs using the PASS online software package. The work was carried out in the laboratory of GSB&FS, where the antimicrobial activity of derivatives of resin acids and their salts was studied. As a result of the study of the antibacterial activity of resin acids, it is shown that the greatest inhibitory effect on Escherichia coli and Bacillus subtilis microorganisms is exhibited by isomerized rosin and 12–bromodehydroabietic acid (DAK) and their salts, while the potassium salt of 12–sulfo–DAK slightly suppresses growth of Candida tropicalis. PASS online calculation showed that all derivatives of resin acids and their potassium salts (I–IV, VI *) can have a high protective effect for mucous membranes (Pa 93 – 98 %) and pronounced antiviral (flu) protection (Pa 70 – 80 %).

СОДЕРЖАНИЕ Введение ....................................................................................................................... 6 1. Литературный обзор ................................................................................................ 8 1.1. Характеристика канифоли ................................................................................... 8 1.2. Химические свойства и характеристика смоляных кислот ........................... 10 1.2.1. Характеристика смоляных кислот ................................................................. 10 1.3. Получение канифоли.......................................................................................... 14 1.4. Получение смоляных кислот из канифоли ...................................................... 15 1.5. Химические свойства канифоли ................................................................... 17 1.5.1. Процессы гидрирования и дегидрирования ................................................. 18 1.5.2. Солеобразование смоляных кислот и канифоли ........................................ 19 1.6. Применение канифоли и ее производных........................................................ 21 1.7. Токсичность смоляных кислот .......................................................................... 22 1.7.1. Биодеградация смоляных кислот ................................................................... 22 1.7.2. Биотрансформация смоляных кислот ........................................................... 23 1.8. Фармакологические свойства смоляных кислот ............................................. 25 1.8.1. Фитоалексиноподобная активность абиетиновой кислоты и ее производных .............................................................................................................. 27 1.9. Выводы по литературному обзору .................................................................. 28 2. Объекты и методы исследования ......................................................................... 29 2.1. Схема проведения экспериментов .................................................................... 29 2.2. Объекты исследования ....................................................................................... 30 2.3. Методы исследования ........................................................................................ 31 2.3.1. Метод определение антимикробной активности ......................................... 31 2.3.2. Метод определения биологической активности смоляных кислот ........... 32 3. Результаты исследований и их обсуждение ....................................................... 34 3.1. Подготовка к эксперименту .............................................................................. 34 3.1.1. Стерилизация посуды ..................................................................................... 34 3.1.2. Приготовление питательных сред ................................................................. 34 3.1.3. Выращивание микроорганизмов.................................................................... 36 3.1.4. Синтез калиевых солей смоляных кислот .................................................... 36 3.2. Метод определение антимикробной активности ............................................ 39 4

3.3. Расчет биологической активности .................................................................... 42 4. Обеспечение безопасности условий труда ......................................................... 47 4.1. Общая характеристика лаборатории ................................................................ 47 4.2. Анализ опасных и вредных факторов в лаборатории ..................................... 52 4.2.1. Характеристика веществ, применяемых в работе ........................................ 52 4.2.2. Характеристика микроорганизмов, применяемых в работе ....................... 54 4.3. Пожарная и электробезопасность ..................................................................... 54 Заключение ................................................................................................................ 56 Список использованных источников ...................................................................... 57 5

ВВЕДЕНИЕ Продукты синтеза на основе канифоли, скипидара и твердых политерпенов являются перспективными продуктами, так, канифольно – малеиновый аддукт, смоляные кислоты и производные на их основе нашли применение в лакокрасочной, пищевой и целлюлозно – бумажной промышленности. Эти кислоты обладают комплексом полезных свойств: стойкостью к окислению кислородом воздуха и воздействию воды, высокими пленкообразующими и физико – химическими свойствами, растворимостью во многих органических растворителях, а также хорошим совмещением со многими полимерными материалами. Дитерпены — органические соединения группы терпенов, состоящие из четырех изопреновых звеньев. Общая формула С20Н32. Кислородсодержащие производные дитерпенов называют дитерпеноидами. Входят в состав смол хвойных растений, камедей, эфирных масел. Неослабевающий интерес к производным дитерпенов связан с их высокой и разнообразной биологической активностью. В настоящее время, разработка и внедрение новых химических соединений немыслимы без всесторонней и объективной оценки их влияния на состояние объектов окружающей среды, выявления и предупреждения влияния на живые организмы, а также обеспечения экологической безопасности при их использовании. К настоящему времени большинство исследований посвящено изучению бактерицидной, фитонцидной, репеллентной, инсектицидной, противоопухолевой активностей этих веществ, однако пока недостаточно внимания уделено изучению влияния их на рост микроорганизмов как неотъемлемых объектов биоценозов. Актуальность темы заключается в важности изучения влияния производных смоляных кислот, побочно образующихся в процессе сульфатной варки древесины в производстве бумаги и попадающие в объекты окружающей среды в составе сточных вод, на некоторые виды микроорганизмов. Объект исследования научной работы – растворы производных смоляных кислот и их солей. 6

Целью данной научной работы являются исследования влияния строения производных смоляных кислот и их солей на подавление роста различных микроорганизмов и расчет вероятностей проявления биологической активности различных видов у изучаемых веществ в программе Pass online. В соответствии с поставленными целям были решены следующие задачи: 1) Выбор объектов исследования: смоляных кислот и микроорганизмов. 2) Приготовление питательных сред. 3) Инкубация микроорганизмов, используемых в работе. 4) Приготовление растворов производных смоляных кислот и их солей. 5) Определение антимикробной активности исследуемых препаратов. 6) Проведение расчета биологической активности исследуемых препаратов в программе Pass online. 7

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Характеристика канифоли Канифоль – (от назв. др. – греч. города Колофон в Малой Азии) – хрупкое аморфное вещество, имеющее стеклообразную структуру, получаемое изначально из живицы хвойных деревьев в процессе их механического повреждения и выпаривания из живицы скипидара и других летучих веществ. Канифоль содержит 60 – 92 % трициклических дитерпеноидов, представленных тремя структурно – стереохимическими группами: абиетана, пимарана и изопимарана [21], 0,5 – 12 % насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, 8 – 20 % нейтральных веществ (сескви–, ди– и тритерпеноиды) [17]. Растворимость канифоли хорошо прослеживается в эфире, спирте, ацетоне, скипидаре и бензоле, хуже — в бензине, керосине и фурфуроле; не растворима в воде. При температуре 53 – 70 °С канифоль размягчается; при температуре 250 °С кипит. Цвет канифоли колеблется от светло – желтого до темно красного. Канифольно – с кипидарное производство традиционно объединяет производство канифоли и скипидара из живицы (канифольно – терпентинное), из осмола (канифольно – экстракционное), а также сбор скипидара – сырца с последующей его переработкой и производство канифоли и других нужных продуктов (таловые продукты) в процессе сульфатной варки целлюлозы. В последнее время структура данного производства изменилась, прекращен выпуск экстракционной канифоли и скипидара, производство таловых продуктов выделилось в самостоятельную отрасль [15]. В составе канифоли содержится 80 – 95 % смоляных кислот (Табл.1.1) (общая формула которых С19Н29СООН, и неомыляемых веществ (5 – 12 %), которые содержат метилхавикол (C10H12О), стильбеновые производные, терпеновые димеры, альдегиды и смесь гидрофенантреновых углеводородов. При взаимодействии канифоли с минеральными и органическими основаниями образуются соли, например, канифольное мыло (С19Н29СООNa), а с различными гидроксилсодержащими соединениями образуются эфиры канифоли и другие ценные продукты [13]. 8

Живичная канифоль имеет в своем составе абиетиновую кислоту (35,8 – 42,7 %), палюстровую (17,9 – 23,2 %), неоабиетиновую (12,2 – 16,1 %), дегидроабиетиновую (6,7 – 8,6 %), пимаровую (6,6 – 8,8 %), изопимаровую (5,1 – 7,9 %), левопимаровую (1,5 – 3,2 %), сандарокопимаровую (2,5 – 3,0 %). Процент содержания нейтральных веществ, таких как, оксиды, спирты, сложные эфиры, составляет (6 – 8 %). Растворимость канифоли хорошо проявляется в полярных органических растворителях, хуже – в неполярных [13]. В талловой канифоли преобладают такие кислоты, как абиетиновая (33,5 – 36,6 %) и дегидроабиетиновая (31,6 – 34,7 %). В меньшей степени содержит такие смолянистые кислоты: палюстровую (6,5 – 9,0 %), изопимаровую (5,8 – 7,7 %), пимаровую (3,9 – 4,4 %), сандарокопимаровую (3,4 – 3,8 %), неоабиетиновую (0,6 – 1,5 %), левопимаровую (0,5 – 0,7 %). Процент содержания нейтральных веществ (8 – 10 %), жирных кислот (6 – 8 %). Так же, как и живичная канифоль хорошо растворяется в полярных органических растворителях, хуже – в неполярных [4]. В экстракционной канифоли содержание абиетиновой кислоты составляет (42,0 – 52,1 %), дегидроабиетиновой (12,1 – 17,0 %), неоабиетиновой (6,1 – 13,3 %), пимаровой (6,9 – 8,4 %) изопимаровой (5,4 – 8,4 %), сандарокопимаровой (0,5 – 3,4 %), левопимаровой (8,3 – 10,5 %), палюстровой (2,2 – 5,8 %). Содержание нейтральных веществ до 12 %. Хорошо растворяется в органических растворителях (спирте, ацетоне, эфире, бензоле, хлороформе), не растворяется в воде [13]. Сосновая живичная канифоль производится марки А, она делится на три сорта: высший сорт, 1 – й сорт и 2 – й сорт. Проверка качества канифоли проводится по ГОСТу 19113 – 84 [9]. Таблица 1.1 – Содержание смоляных кислот в различных сортах канифоли Содержание кислоты, % Абиетиновая Неоабиетиновая Палюстровая Вид канифоли Живичная Талловая Экстракционная 35,8 – 42,7 12,2 – 16,1 17,9 – 23,2 33,5 – 36,6 0,6 – 1,5 6,5 – 9,0 42,0 – 52,1 6,1 – 13,3 2,2 – 5,8 9

Окончание таблицы 1.1 Содержание кислоты, % Дегидроабиетиновая Пимаровая Изопимаровая Сандарокопимаровая Левопимаровая 1.2. Вид канифоли Живичная Талловая Экстракционная 6,7 – 8,6 6,6 – 8,8 5,1 – 7,9 2,5 – 3,0 1,5 – 3,2 31,6 – 34,7 3,9 – 4,4 5,8 – 7,7 3,4 – 3,8 0,5 – 0,7 12,1 – 17,0 6,9 – 8,4 5,4 – 8,4 0,5 – 3,4 8,3 – 10,5 Химические свойства и характеристика смоляных кислот Смоляные кислоты представляют из себя монокарбоновые кислоты. В основном канифоль состоит из смеси смоляных кислот, имеющих общую формулу C20 H30 O2 . Смоляные кислоты имеют разный состав в канифоли и в перерабатываемом сырье, т. к. при нагревании кислоты легко изомеризуются и окисляются, переходя во вторичные смоляные кислоты [28]. В канифоли могут содержаться не только смоляные кислоты, но и углеводороды состава 𝐶20 𝐻32 , жирные кислоты, оксиды, спирты, сложные эфиры и красящие вещества. 1.2.1. Характеристика смоляных кислот Смоляные кислоты можно разделить на две группы кислот – абиетиновую и декстрапимаровую. К абиетиновой группе относятся: левопимаровую, неоабиетиновую, палюстровую и абиетиновую кислоты, которые содержат две этиленовые связи, но находятся в разных положениях. Абиетиновая кислота находится во всех видах канифоли в достаточно больших количествах 27,3 – 52,1 %. Температура плавления 171 – 172 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 −116,2 (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻). На рисунке 1.1 представлена структурная формула абиетиновой кислоты. 10

Рисунок 1.1 – Структурная формула абиетиновой кислоты Содержание левопимаровой кислоты в канифоли не превышает 6 – ти %, т. к. она легко изомеризуется при взаимодействии кислот и нагреве до абиетиновой кислоты. Температура плавления 150 – 152 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 −275,2 (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻) [33]. На рисунке 1.2 представлена структурная формула левопимаровой кислоты. Рисунок 1.2 – Структурная формула левопимаровой кислоты Палюстровая кислота, так же легко преобразуется в абиетиновую при воздействии кислот и тепловой изомеризации. Структурная формула палюстровой кислоты: Содержание ее в различных видах канифоли 7 – 24 %. Температура плавления палюстровой кислоты 164 – 166 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 + 72,4 (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻). На рисунке 1.3 представлена структурная формула палюстровой кислоты. 11

Рисунок 1.3 – Структурная формула палюстровой кислоты Неоабиетиновая кислота присутствует в смоле хвойных деревьев. В канифоли содержится 1 – 11 % неоабиетиновой кислоты. Температура плавления неоабиетиновой кислоты 176 – 178 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 +175,4 (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻) [13]. На рисунке 1.4 представлена структурная формула неабиетиновой кислоты. Рисунок 1.4 – Структурная формула неабиетиновой кислоты К декстрапимаровой группе относятся: пимаровая, изопимаровая и сандарокопимаровая кислоты. Эти кислоты устойчивы к высоким температурам, самоокислению и взаимодействию с другими органическими кислотами, т.е переход из смолы в канифоль осуществляется почти без изменения состава. Пимаровая кислота содержится в канифоли от 3,5 – 9 % Температура плавления пимаровой кислоты 217 – 219 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 +79,2 (C2 H5 OH) [33]. На рисунке 1.5 представлена структурная формула пимаровой кислоты. 12

Рисунок 1.5 – Структурная формула пимаровой кислоты В канифоли содержится 5 – 8 % изопимаровой кислоты. Температура плавления изопимаровой кислоты 162 – 165 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 – 8,1 (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻). На рисунке 1.6 представлена структурная формула изопимаровой кислоты. Рисунок 1.6 – Структурная формула изопимаровой кислоты Содержание сандарокопимаровой кислоты в канифоле колеблется от 0,5 до 4 %. Температура плавления сандарокопимаровой кислоты 161 – 173 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 – 19,1 (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻). На рисунке 1.7 представлена структурная формула сандарокопимаровой кислоты. Рисунок 1.7 – Структурная формула сандарокопимаровой кислоты 13

Содержание дегидроабиетиновая кислоты в канифоле колеблется от 5,5 до 35,4 %. Температура плавления сандарокопимаровой кислоты 174 – 179 °С, угол вращения [𝛼]𝐷20 – 29,7 (𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻). На рисунке 1.8 представлена структурная формула дегидроабиетиновой кислоты. Рисунок 1.8 – Структурная формула дегидроабиетиновой кислоты 1.3. Получение канифоли В зависимости от вида лесохимического сырья в промышленных масштабах вырабатывают сосновую живичную, талловую и экстракционную канифоль, живичный, экстракционный, сульфатный и пиролизный (сухоперегонный) скипидар [13]. Получение живичной канифоли осуществляется путем механического повреждения таких деревьев как сосна, лиственница, ель, пихта и кедр. Сок, выделяемый из надрезов хвойных деревьев, называется живицей. Живица представляет из себя липкую, вязкую, бесцветную жидкость, содержащую 75 – 82 % смоляных кислот и 18 – 25 % летучих терпеновых углеводородов(скипидар). Ее очищают от сора и освобождают от воды, затем проводят перегонку под вакуумом, скипидар, как легколетучее вещество, отгоняется. Далее остаток при нагревании его до 160 – 170 °С сплавляется и уваривается, образуя канифоль — аморфную смесь смоляных кислот с не омыляемыми веществами [12]. Талловая канифоль есть побочный продукт сульфат – целлюлозного производства. Получение ее осуществляется из сырого сульфатного мыла, которое путем обработки серной кислотой (H2SO4) переходит в сульфатное масло, далее из масла путем перегонки под вакуумом получают талловую канифоль и другие продукты [23]. 14

Получение экстракционной канифоли включает в себя такие стадии как, измельчение, экстракцию пневого осмола из органическими растворителями (в основном бензином). После того как пни хвойных деревьях осмолятся их отчищают от сора, измельчают в щепу и обрабатывают легкокипящим бензином или тетрахлорметаном (CCl₄). Далее из экстракта, который был получен из щепы, отгоняют растворитель и скипидар, в результате получают канифоль [18]. 1.4. Получение смоляных кислот из канифоли Абиетиновая кислота впервые получила свое название в 1826 г. С.Бопом, который выделил из Pinus abies (Ель обыкновенная) кристаллическую смоляную кислоту, которая на самом деле была смесью кислот [16]. Смоляные кислоты легко изомеризуются при действии на них минеральных кислот, в результате этих реакций образуется абиетиновая кислота. На рисунке 1.9 показан процесс получения абиетиновой кислоты из сосновой живицы в процессе ее переработки, после отгонки скипидара недоваренную канифоль помещают в сатуратор с подачей хлороводорода и острого пара. После того как отгонка скипидара заканчивается добавляют бензин, перемешивая. Далее масса поступает в кристаллизатор, в процессе охлаждения образуются кристаллы абиетиновой кислоты, для дальнейшего отделения кристаллов от маточника их центрифугируют. После, их обрабатывают холодным бензином (плохо растворяет абиетиновую кислоту), а затем горячей водой для удаления остатка бензина и HCl. Для окончательного высушивания абиетиновой кислоты её помещают в сушилку камерного типа. На выходе получают белые или желтоватые кристаллы абиетиновой кислоты (96 – 97 %) [25]. 15

Рисунок 1.9 – Схема производства абиетиновой кислоты В 1956 г. В.М. Лоеблич с сотр [36] предложил способ выделения неоабиетиновой кислоты через аминовую соль: 400 г канифоли растворить в 1400 мл метилэтилкетона. Затем раствор поместить в 3 – х литровую колбу и нагревать при 75 °С. После добавить 120 г 2–амино–2–метил–1,3–пропандиола при постоянном перемешивании. Нагрев прекратить, и раствор оставить медленно 16

остывать в течение ночи. Далее аминовую соль превращают в свободную кислоту путем добавления к суспензии соли в ацетоне небольшого избытка 2н СН3СООН. Аминовая соль и свободная кислота, растворимы. Далее неоабиетиновую кислоту перекристаллизовывали из ацетона. В 1961 г. И.И. Бардышев [3] реализовал способ выделения изопимаровой кислоты из кедровой канифоли: кедровую канифоль (500 г) растворить в петролейном эфире (750 мл) и нейтрализовать пиперидином (до рН 10). Раствор охладить до 5 °С. Выпавшую соль промыть ацетоном (150 мл) и многократно перекристаллизовать из этилового спирта (96 %). Полученный продукт перекристаллизовать из этанола. 1.5. Химические свойства канифоли Канифоль хорошо растворяется в диэтиловом эфире, ацетоне, метиловом и этиловом спиртах, трихлорэтилене, уксусной и жирных кислотах, бензоле, ксилоле, толуоле и бензине. В воде канифоль нерастворима, при нагревании частично эмульгируется. Легко окисляется кислородом воздуха, особенно в мелкораздробленном состоянии. Наибольшей склонностью к окислению в чистом виде обладает абиетиновая кислота, тогда как неоабиетиновая, дегидроабиетиновая, палюстровая, левопимаровая, изопимаровая, пимаровая кислоты при хранении их на воздухе более 5 лет остаются неизменными. Высокая склонность канифоли к окислению делает ее пыль взрывоопасной. Так как канифоль представляет собой смесь изомерных смоляных кислот, то физико – химические константы ее имеют групповой характер. Плотность канифоли колеблется в пределах 1070 – 1085 кг/м3 . Теплотворная способность ее изменяется в пределах 38020 – 38426 кДж/кг. Горит канифоль ровным коптящим пламенем, ее теплопроводность 0,4609 Вт/(м∙К), теплота плавления 66,202 кДж/кг. Теплоемкость канифоли, кДж/(кг∙К), зависит от температуры и может быть определена по формуле 1.1: Сt=16927 + 0,00097 (Δt). где Δt – разница температур. 17 (1.1)

Температура самовозгорания канифоли 850 °С. Канифоль в обычных условиях нелетуча. Перегонку ее можно вести под глубоким вакуумом или в токе перегретого до 200 °С водяного пара. Зависимость температуры кипения канифоли под вакуумом от давления приведена ниже. При нагревании канифоли до 300 °С происходит ее разложение, сопровождающееся декарбоксилированием и дигидратацией смоляных кислот с образованием углеводородов, например, абиетина и абиетана: 2C 20 H 30 O 2 → C 19 H 30 + C 19H 28 + CO + CO 2 +H 2 O. Получающиеся при разложении канифоли абиетан и абиетин называют канифольными маслами, присутствие которых в канифоли резко снижает ее сортность, а выделившиеся СО и CO 2 ухудшают условия труда, поэтому разложения канифоли допускать нельзя [6]. 1.5.1. Процессы гидрирования и дегидрирования В результате каталического присоединения водорода к ненасыщенным смоляным кислотам в зависимости от применённого катализатора и условий процесса (температура, давления водорода, растворитель) образуется сложная смесь дигидро– и тетрагидросмоляных кислот (рис 1.10) [29]. В качестве катализатора в основном применяют никель и металлы платиновой группы (платина, палладий, родий, рутений). Водород присоединяется ступенчато сначала по одной связи, затем по другой. Один моль водорода с образованием в основном только дигидросмоляных кислот присоединяется в сравнительно мягких условиях, тогда как для образования полностью насыщенного продукта необходимо давление водорода более 9.8 МПа и температура выше 200 °С. На платиновой черни в уксусной кислоте это достигается при более низкой температуре. Никелевые катализаторы наиболее дешевы, но они ускоряют нежелательную реакцию декарбоксилирования смоляных кислот. Процессы дегидрирования проводят при температуре выше 200 °С в аппаратуре, сообщающейся с атмосферой, чтобы удалять избыточно образующийся водород, который может вступать в реакцию гидрирования канифоли. Основным катализатором, применяющимся в процессах дегидрирования, является сера и её 18

соединения. В качестве основного продукта в процессах дегидрирования получают дегидроабиетиновую кислоту. Рисунок 1.10 – Схема дегидрирования и гидрирования смоляных кислот Применение растворителя обеспечивает более мягкие условия проведения процесса, не требуется большого давления водорода и практически не наблюдается термического декарбоксилирования смоляных кислот. Продукты гидрирования и дегидрирования смоляных кислот более устойчивы к окислению, поэтому они находят широкое применение, где требуется повышенная стабильность материалов, например, в клеевых композициях [17, 29]. 1.5.2. Солеобразование смоляных кислот и канифоли Так как канифоль является смесью смоляных кислот, то для нее свойственны все реакции, характерные для кислот. Канифоль способна вступать в реакцию с металлами, с солями и щелочами. В лакокрасочной промышленности, кроме эфиров канифоли, часто применяется препарированная, или отвержденная, канифоль, которую получают сплавлением ее с известью или со смесью извести и окиси цинка. Сплавляют при температуре 200 – 280 °С. Полученные кальцевые или цинковые соли смоляных 19

кислот называют резинатами. Резинаты значительно тверже, чем исходная канифоль, хорошо растворяются в органических растворителях и имеют повышенную (на 15 – 25 °С) температуру плавления. По внешнему виду они мало чем отличаются от канифоли. Кислотное число снижается при обработке известью и окисью цинка до 80 – 90. Лак на основе канифоли, препарированный одной известью, получается твердым, но малоустойчив к внешним воздействиям и воде. Получаются лучшие результаты, если вместе с известью вводить и оксид цинка. Для полной нейтрализации канифоли требуется 10 – 11 % – й водный раствор извести. При сплавлении берут не более 8 % или 4 – 5 % извести и 1 – 2 % ZnO. Резинаты можно получать не только сплавлением, но и осаждением, например, при взаимодействии раствора канифольного мыла с раствором хлористого цинка [1]. 2C 19 H 29 COONa + ZnCl 2 → (C 19 H 29 COO) 2Zn + 2NaCl Соли смоляных кислот, полученные сплавлением канифоли с окислами металлов, применяются в лакокрасочной промышленности в качестве сиккативов, например: 2C 19 H 29 COOH + MnO→ (C 19H 29 COO)2 Mn + H 2O Резинат марганца хорошо растворяется в маслах, скипидаре, бензине и других растворителях. Добавленный в небольших количествах в масло лаков и красок он ускоряет процесс окисления и полимеризации, т. е. образования твердой пленки. Сиккативами могут быть и другие резинаты, например, резинат свинца, кальция, цинка и др [25]. При взаимодействии канифоли и едкого натра образуется резинат — Na – канифольное мыло: C 19 H 29 COOH + NaOH → C 19H 29COONa + H 2O Канифольное мыло представляет собой гидрофильный продукт, способный образовывать в органических растворителях коллоидные растворы, практически полностью растворимые в воде; обладает высокими поверхностно – активными свойствами [6]. 20

1.6. Применение канифоли и ее производных Целлюлозно – бумажная промышленность является одной из основных областей применения канифоли. Почти половина всей выпускаемой канифоли используется бумажной промышленностью. Благодаря пропитке из канифольного клея, чернила и краски не расплываются на бумаге. Пропитка другими производными канифоли делает цвета бумаги и картона более яркими и светоустойчивыми. Из канифоли получают сложные кислоты, соли, эфиры, смолы, канифольное мыло, сиккативы (вещества, ускоряющие отверждение лакокрасочных продуктов), эмульгаторы для производства искусственных эластичных материалов, строительных эмульсий с битумом; адгезионные добавки (вещества, улучшающие сцепление с поверхностью) в лаки и краски; ядохимикаты; креолин; смазочные материалы; сургуч. В пищевой промышленности канифоль используют для изготовления бутылочной смолки и эмалировки пивных бочек, в металлургии — для лужения и пайки, в химической индустрии канифоль служит сырьем для производства большого спектра веществ, реактивов и материалов. В косметологии используют для производства мыла и кремов, полезных для зрелой, воспаленной, проблемной, жирной кожи. Так же в пищевой промышленности используют добавку E 445 (50 мг/кг) для обработки цитрусовых, т. к. смоляные кислоты обладают высокими антибактериальными свойствами и способны образовывать пленку на поверхности продуктов. Это дает возможность сохранить свежесть фруктов, уменьшить испарение влаги, обеспечить защиту от заражения патогенной микрофлорой, увеличить срок хранения. По мимо этого ее добавляют ароматизированные замутненные напитки (в сочетании с мякотью, в сухие смеси, особенно цитрусовых) для стабилизации во взвешенном состоянии мелких дисперсий. Он предотвращает появление видимых частиц на поверхности и не дает всплывать эфирным частицам на поверхности. Иногда добавляется в состав жевательной резинки. В других продуктах питания вещества практически не используют [22]. 21

В полиграфии они используются для производства печатных красок, в текстильной промышленности – для отделки. Канифоль используется в производстве пластмасс, искусственной кожи, искусственных олиф и жиров. Канифоль также используется в автомобильной и нефтяной промышленности, в производстве креолина, линолеума и для защитных покрытий [24]. 1.7. Токсичность смоляных кислот Токсичность стоков бумажной промышленности обусловлена присутствием в них смолистых кислот. Это становится очевидным при рассмотрении острой токсичности для определенных видов рыб. Таким образом, исследования (Б.Р. Тейлора) показали, что величина острой токсичности (96 ч ЛД50 ) восьми смоляных кислот по отношению к нескольким типам лосося, радужной форели, гольяна распределяется от 0,5 до 1,7 мг/л, тогда как концентрация смоляных кислот в стоках может достигать 550 мг/л. Смоляные кислоты были обнаружены в желчи рыб в количестве от 120 до 330 мкг/л и от 13 до 620 мкг/л в тканях мозга, что указывает на их возможное накопление в открытых экосистемах. Было показано, что величина острой токсичности (48 ч ЛД50 ) смоляных кислот по отношению к daphnia magna в 2 – 3 раза меньше, чем по отношению к рыбе. Известно, что смоляные кислоты менее токсичны для беспозвоночных животных. 1.7.1. Биодеградация смоляных кислот Наиболее эффективным методом утилизации смоляных кислот является биологическая очистка сточных вод. По мнению некоторых авторов, использование активного ила и газообразных лагун может снизить уровень абиетиновой кислоты в сточных водах на 90 %, тогда как утилизация пимаровой кислоты менее продуктивно и составляет 60 %. [27] Анаэробные системы используются в качестве эффективного метода утилизации смоляных кислот. Приверженцы их использования предполагают, что внедрение замкнутых систем в процессе переработки целлюлозы значимо уменьшит объем водных отходов и приведёт к повышенной концентрации в стоках смоляных кислот. 22

Казалось бы, концентрированные подходы должны значительно повысить привлекательность систем для снижения эксплуатационных расходов, в частности, снижения энергопотребления или образования осадка. Однако, по мнению некоторых авторов, эта система менее продуктивна из-за наличия в ней специфических ингибиторов ферментных систем анаэробных микроорганизмов. Эффективным методом разложения отдельных смоляных кислот является использование чистых культивируемых микроорганизмов. Бактерии, выделяемые почками, корой деревьев и природными водами, способны утилизировать дитерпиновые кислоты. Представители рода Alcaligenes, Cornamonas, Pseudomonas, Sphingomonas способны деградировать АК. Представители более крупных родов микроорганизмов, таких как Alcaligenes, Arthobacter, Bacillus, Escherichia, Flavobacterium, Cornamonas, Pseudomonas, способны использовать ДАК. Предположительно, это связано с тем, что имеется больше данных о содержании ДАК в окружающей среде. Комплексное использование может осуществляться только отдельными представителями рода Cornamonas, Alcaligenes и pseudomonas. По мнению Т.А. Барнеса, представители Xanthomonas campestris и serratia marcescens разлагают до 40 % смоляных смесей древесных экстрактов. Грибные культуры также обладают разлагающей способностью по отношению к смоляным кислотам. Однако использование биоразложения при биодеградации смоляных кислот приводит к появлению опасных веществ, таких как споры, и способности синтезировать микотоксины с мутагенными и канцерогенными свойствами. 1.7.2. Биотрансформация смоляных кислот В настоящее время перспективным является не только поиск новых технологий, но и использование новых биологически активных соединений на их основе. Это стало возможным благодаря использованию микробной биотрансформации. Использование микроорганизмов в качестве биокатализатора, в отличие от химического синтеза, не требует использования агрессивных реагентов, 23

процесс происходит в одну технологическую стадию, а биокатализатор позволяет осуществлять направленную трансформацию с высокой степенью стерео – и региоселективности [27]. Примерами таких превращений являются реакции гидроксилирования, окисления и дегидрокарбоксилирования (рис. 1.11). Кислоты с гидрокси – и оксопродукцией обладают ярко выраженной биологической активностью, поэтому их можно использовать в качестве промежуточных продуктов для синтеза лекарств. Наиболее эффективным признаком является бактериальная трансформация смоляных кислот. Однако бактериальные клетки катализируют только ограниченный диапазон реакций гидроксилирования и окисления [37]. Таким образом, при превращении канифоли, которая содержит ДAK, присутствуют A.oxydans и B. Amyloliquefaciens, которые обнаруживаются как продукты 7 – гидроксидегидроабиетин, 15 – гидроксидегидроабиетик, 7 – оксогидроабиетин. Грибы могут катализировать более разнообразные реакции по сравнению с бактериями. Например, гидроксилирование абетиновых смоляных кислот с использованием отдельных представителей грибов чаще всего происходит только в определенных положениях [27]. 24

Рисунок 1.11 – Биотрансформация смоляных кислот 1.8. Фармакологические свойства смоляных кислот Абиетиновая кислота входит в состав смолы хвойных и является основным компонентом канифоли и янтаря. Имеется ряд исследований, подтверждающих противовоспалительные, кардиоваскулярные, антиконвульсантные, противовирусные, противоопухолевые и фунгицидные свойства абиентиновой кислоты. 25

Противовоспалительные свойства кислоты объясняются ее способностью подавлять экспрессию ФНО – α (фактор некроза опухоли, противовоспалительные цитокин) и циклоксигеназы – 2. Цитокин и фермент вовлечены в процесс воспаления в макрофагах [26]. Помимо противовоспалительной активности АК может выступать регулятором липидного метаболизма и атеросклероза. Были проведены исследования, доказывающие способность абиетиновой кислоты снижать холестерина в крови у крыс. Антиконвульсантная активность АК объясняется схожими структурными свойствами с противоэпилептическим препаратом вальпроатом натрия. Также в условиях in vitro была установлена способность данной кислоты снижать репликацию вирусов, ингибировать рост клеток карциомы человека и усиливать действие противоопухолевых препаратов, что объясняет ее противовирусную и противоопухолевую активность [26]. Производное АК – абиеталь подтвердил свои фунгицидные свойства в эксперименте против гриба А. fumigatus. Среднеспертельная доза (ЛД50) всех соединений абиетиновой кислоты находится в пределах от 2, 12 до 3, 98 г/кг. Вышеперечисленные свойства делают абиетиновую кислоту и ее производные основой для получения перспективных противовоспалительных средств, не требующих сложных технологий при производстве. Неоабиетиновая кислота была выделена из подвергнутых термической изомеризации абиетиновой кислоты и живичной канифоли В настоящее время доказана активность неоабиетиновой кислоты в качестве ингибитора аутоиммунной реакции у мышей. Эффективная доза – 40 мг/кг. Дегидроабиетиновая кислота. при нагревании канифоли и ее перегонке претерпевает ряд изменений. В результате образуется смесь из следующих кислот: дегидроабиетиновой, p – дигидроабиетиновой и p – тетрагидроабиетиновой. Дегидроабиетиновая кислота (ДАК) и ее метиловый эфир обладают гипохолестеринемическими свойствами. 26

Среди свойств ДАК и ее производных также выделяют противогрибковую активность против грибов рода Aspergileus (A. terreus, А. fumigates и А. niger) в концентрации 39,7 мкг/мл. Доказана способность дегидроабиетиновой кислоты активировать рецепторы PPAR α/γ, снижающие воспалительные изменения, приводящие к ожирению и связанные с сахарным диабетом. Выявлено токсическое действие ДАК на эритроциты. Кислота может вызывать 50 % гемолиз эритроцитов человека в концентрации 252 мкМ. Однако в сублитических концентрациях (125 мкМ) эта же кислота обладает протекторными свойствами и защищает эритроциты от гипотонического гемолиза [26]. 1.8.1. Фитоалексиноподобная активность абиетиновой кислоты и ее производных Фитоалексины имеют относительно низкую молекулярную массу соединения, они образуются, когда некоторые растения бросают вызов патогенными организмами. Эти молекулы играют большую роль в устойчивости организма к болезням (Чемберлин и Пакстон. Более 100 фитоалексинов были найдены и выделены из двудольных, наиболее изучены были виды семействах вида пасленовых и бобовых (Эрсек и Кирали). Хотя механизм действия фитоалексина до сих пор не ясен до конца, зато хорошо изучена и подтверждена способность многих фитоалексинов [34]. Глицоллины I, III и фазеоллин – птерокарпан, фитоалексины вызывают повреждение мембран обоих растений и корневых систем. Было доказано, что глицеллины I и III (Джаннини и др.,) и фазеоллин (Спессард и др.,) вызывают утечку протонов через тонопластовые везикулы и вакуолиб выделенные из красной свеклы без значительного ингибирования АТФазы [30]. Эти данные предполагают, что причина утечки протонов в присутствии птерокарпанов возможна из-за прямого взаимодействия фитоалексина с липидным бислоем мембраны. Абиетиновая кислота и ее производные напоминают структурно птерокарпаны, их легко модифицировать химически, и они, как известно, не присутствуют в ткань соевых бобов или красная фасоль. Абиетиновая кислота и ее 27

производные показывают переменную способность вызывать протонную утечку через мембранные системы красной свеклы и проявляют фунгитоксичность по отношению к двум разным видам грибов. 1.9. Выводы по литературному обзору Проведенный анализ литературных источников показал, что смоляные кислоты и их производные как продукты природного происхождения, обладают различными видами биологической активности: противовоспалительными, кардиоваскулярными, антиконвульсантными, противовирусными, противоопухолевыми и фунгицидными свойствами, что несомненно важно при практическом использовании технической продуктов, полученных из канифоли, в лакокрасочной, пищевой и целлюлозно – бумажной промышленности. 28

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Схема проведения экспериментов На рисунке 2.1 представлена схема подготовки и проведения экспериментов. Рисунок 2.1 – Схема проведения экспериментов 29

2.2. Объекты исследования В качестве исходных веществ в работе были использованы диспропорционированная канифоль (Pd/C) (I), 12–бром–(II), 12–сульфо– (III) дегидроабиетиновые кислоты (ДАК), а также калиевые соли диспропорционированной канифоли (IV) и 12 – бромДАК (V), полученные из соответствующих кислот (I, II) (см. табл. 1). Образцы (I – III) предоставлены для исследования ФГУП «НИИСК им. академика С.В. Лебедева». Диспропорционированная канифоль (I) по своему составу является смесью дегидро– и дигидроабиетиновой кислот. 12–Бром–ДАК (II) синтезирован по реакции прямого бромирования ДАК [31]: т. пл. 197 – 199 °С; УФ спектр (EtOH), нм (lg ε): 210 (плечо); спектр ЯМР 1Н, δ, м.д.: 6.90 (с. 1Н, Сар.14Н), 7.35 (с. 1Н, Сар.11Н). 12–Сульфо–ДАК (III) получен из диспропорционированной канифоли обработкой серной кислотой на основе метода [32]: т. пл. 330 °С; УФ спектр (EtOH), нм (lg ε): 206 (4,53); спектр ЯМР 1Н, δ, м.д.: 6.08 (с. 1Н, Сар.14Н), 7.64 (с. 1Н, Сар.11Н) Объектами исследования были выбраны вещества, представленные в таблице 2.1: Таблица 2.1 – Объекты исследования № Препарат Диспропорционированная канифоль Внешний вид Хрупкая, стеклообразная масса белого цвета II 12–Бромдегидроабиетиновая кислота Хрупкая, прозрачная стеклообразная масса, желтого цвета III 12–Сульфодегидроабиетиновая кислота Легкая, хлопьеобразная масса, белого цвета Калиевая соль диспропорционированной канифоли Прозрачный раствор IV Калиевая соль 12–бромдегидроабиетиновой кислоты Светло – желтый раствор Калиевая соль 12–сульфодегидроабиетиновой кислоты Слегка белый раствор I V VI Для определения антимикробной активности вышеуказанных препаратов были использованы такие культуры микроорганизмов как: 1) Escherichia coli – вид грамотрицательных палочковидных бактерий. 30

2) Bacillus subtilis – вид грамположительных спорообразующих факультативно аэробных почвенных бактерий. 3) Candida tropicalis – вид дрожжей. 2.3. Методы исследования 2.3.1. Метод определение антимикробной активности Метод определения антимикробной активности основан на МУК 4.2.1890 – 04 [20]. Для проведения данного опыта были подготовлены материалы и аппаратура: 1) Пробирки П1 – 16 – 150 ХС; 2) Чашки Петри ЧБВ – 100; 3) Колбы КГП – 4 – 250 – 29/32 ТХС; 4) Шпатель Дригальского и спиртовака по ГОСТу 25336 – 82 [11]; 5) Петля бактериологическая; 6) Фильтровальная бумага; 7) Питательные среды; 8) Микроорганизмы; 9) Шкаф сушильный электрический; 10) Весы лабораторные ГОСТ 24104 – 2001 [10]; 11) Лабораторный термостат; 12) Электроплита ГОСТ 14919 – 83 [8]. При определении антимикробной активности диско – диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносили бактериальную суспензию в нужном количестве и давали ей проникнуть в среду примерно 30 мин, затем помещали диски (диаметр 2 см), содержащие нужное количество исследуемого раствора. Диффузия раствора в агар приводила к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. По окончании культивирования измеряли зоны ингибирования или стимуляции роста культуры микроорганизма вокруг диска в опыте и контроле. 31

2.3.2. Метод определения биологической активности смоляных кислот Расчеты биологической активности смоляных кислот и их солей проводили с использованием программы PASS online [35]. Процесс поиска перспективных соединений осуществляется при помощи виртуального скрининга. По такому принципу работает программа компьютерного прогнозирования спектра биологической активности органических соединений PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances). Как известно PASS не предсказывает биологические активности соединения in situ, а лишь указывает на вероятность (Pa) наличия у соединения определенного вида биологической активности. При этом считается, что до Рa больше 0,5 вероятность экспериментального подтверждения предсказанной биологической активности высокая [2]. Математическая обработка результатов эксперимента 1. Рассчитывается среднее арифметическое значение экспериментально определяемой величины – 𝑥̅ по формуле 2.1: 1 x̅ = ∑ni=1 xi , (2.1) n где n – число измерений. 2. Среднее квадратическое отклонение результата измерения находится по формуле 2.2: n sx̅ =√ ∑i=1(xi -x̅ )2 n(n-1) , (2.2) 3.Определяется доверительный интервал при вероятности α=0,95 по формуле 2.3: Δx̅ =tα,n ⋅sx̅ , (2.3) где tα,n – коэффициент Стьюдента. Значения коэффициента Стьюдента для доверительной вероятности 0,95 приведены в табл. 2.2. 32

Таблица 2.2 – Значения коэффициента Стьюдента для доверительной вероятности 0,95 Число параллельных измерений tα,n 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12,7 4,3 3,2 2,8 2,6 2,4 2,4 2,3 2,3 Результаты определения 𝑥̅ округляется в соответствии с полученной величиной Δx̅. 4. Находится относительная погрешность измерения ε-x (%) по формуле 2.4: ε-x = Δx̅ x ⋅100 33 (2.4)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Подготовка к эксперименту Для проведения анализа на определение токсичности препаратов была проведена подготовка к эксперименту. 3.1.1. Стерилизация посуды Для проведения эксперимента на определение антимикробной активности требовалась стерильная посуда. Поэтому чашки Петри, пробирки и диски из фильтровальной бумаги стерилизовались в сушильном шкафу при температуре 160 °C 2 ч. 3.1.2. Приготовление питательных сред Известно большое количество питательных сред, используемых для культивирования или сохранения микроорганизмов. Питательной средой в микробиологии называют среды, которые содержат различные соединения сложного или простого состава и применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях [19]. Состав среды «Питательная среда №2 ГРМ (Сабуро): 1) Панкреатический гидролизат рыбной муки; 2) Панкреатический гидролизат казеина; 3) Дрожжевой экстракт; 4) Натрия фосфат однозамещенный; 5) Глюкоза; 6) Агар – агар. Для приготовления агаризованной среды 12,5 г порошка растворяли в 1 л дистиллированной воды, доводили до кипения и кипятили в течение 5 мин на электрической плите, после давали среде остыть, закрыв ее, стерильной пробкой и оставляли на сутки в холодильнике, процедуру повторяли 3 раза. Готовая среда – прозрачная, коричневого цвета. Срок хранения: 14 дней в холодильнике. Состав среды «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов» (ГРМ – бульон): 1) Пептон ферментативный – 8,0 г; 2) Панкреатический гидролизат рыбной муки – 8,0 г; 34

3) Натрий хлористый – 4,0 г. Для приготовления среды 20,0 г порошка растворяли в 1 л дистиллированной воды, доводили до кипения и кипятили в течение 5 мин, после давали среде остыть, закрыв ее, стерильной пробкой и оставляли на сутки в холодильнике, процедуру повторяли 3 раза. На третьи сутки готовая питательная среда становилась прозрачная, желтого цвета. Готовую среду можно использовать в течение 1 месяца при условии хранения ее при температуре 2 – 8 °С. Состав «Агар питательный сухой (МПА)» 1) Пептон мясной ферментативный – 21,0; 2) Агар микробиологический – 12,15 3) Натрий хлористый – 6,5; 4) Глюкоза – 6,25; 5) Натрий фосфорнокислый двузамещенный – 3,5; 6) Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,6. Для приготовления среды 50 г порошка смешивали с дистиллированной водой в объеме 1 л, раствор нагревали на электрической плитке для растворения агара, затем доводили до кипения и кипятили 5 минут, после чего давали среде остыть, закрыв ее, стерильной пробкой и оставляли на сутки в холодильнике, процедуру повторяли 3 раза. Готовая среда была прозрачная, светло – соломенного цвета, срок использования в течение 1 месяца. Состав «Бульон питательный сухой на основе мясного ферментативного пептона: 1) Гидролизат ферментативный белковый, сухой – 9,1 г; 2) Пептон ферментативный, сухой – 9,9 г; 3) Экстракт автолизированных дрожжей осветленный – 4,7 г; 4) Натрий хлористый – 5,0 г; 5) Натрий углекислый – 0,3 г. Для приготовления среды 30 г порошка разводили в 1 л дистиллированной воды, кипятили в течение 5 мин, после чего давали среде остыть, закрыв ее, стерильной пробкой и оставляли на сутки в холодильнике, процедуру повторяли 3 раза. Готовая к употреблению среда становилась прозрачной, желтого или светло 35

– коричневого цвета, пригодна к использованию в течение 7 суток при температуре хранения от 2 до 8 °C в темном месте. 3.1.3. Выращивание микроорганизмов Посев микроорганизмов осуществляли при помощи бактериологической петли. Отбор клеток микроорганизмов производили следующим образом. В правую руку брали петлю и стерилизовали ее нагреванием в пламени спиртовки. Пробирку с культурой брали в левую руку таким образом, чтобы поверхность питательной среды с выросшими колониями микроорганизмов была хорошо видна. Не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцами правой руки, прижимали пробку к ладони, вынимали ее из пробирки и держали так во время всех дальнейших манипуляций. Края открытой пробирки обжигали в пламени спиртовки и вводили в пробирку стерильную петлю. Затем петлю охлаждали, прикосновением к внутренней поверхности стекла пробирки или на свободной от микроорганизмов части среды и после этого захватывали небольшое количество микробной биомассы. Осторожно вынимали петлю из пробирки, горлышко пробирки вновь обжигали, ватную пробку проводили над пламенем спиртовки и закрывали ею пробирку. Далее извлеченную культуру переносили в жидкую питательную среду, находящуюся в другой пробирке [23]. После помещали пробирки с микроорганизмами в термостат на сутки: 1) Escherichia coli при температуре 35 °C; 2) Bacillus subtilis при температуре 37 °C; 3) Candida tropicalis при температуре 32 °C. 3.1.4. Синтез калиевых солей смоляных кислот Для получения калиевых солей диспропорционированной канифоли (IV), 12–бром – (V) и 12–сульфо – (VI) дегидроабиетиновых кислот был проведен синтез. Для данных реакций в качестве исходного были взяты эквимольные количества карбоната калия (K2CO3). Реакции проводили в круглодонных колбах при нагревании на водяной бане до образования солей (о чем судили по растворению поташа). Для получения калиевой соли диспропорционированой канифоли (IV) было взято 0,20 г (0,67 ммоль) продукта (I), к которому прибавляли 0,05 г (0,36 ммоль) 36

K2CO3 и 5 мл дистиллированной воды, и нагревали в течение 15 мин на водяной бане, не доводя до кипения, до полного растворения. В результате получился раствор с концентрацией 50 мкг/мл, реакция представлена на рисунке 3.1. Рисунок 3.1 – Синтез калиевой соли диспропорционированной канифоли (IV) Для получения соли 12–бромдегидроабиетиновой кислоты (V) использовали 0,212 г (0,55 ммоль) вещества (II), к которому прибавляли 0,038 г (0,27 ммоль) K2CO3 и 5 мл дистиллированной воды, и нагревали в течение 15 мин на водяной бане (без кипячения), до полного растворения, в результате получился раствор с концентрацией 50 мкг/мл, реакция представлена на рисунке 3.2. Рисунок 3.2 – Синтез калиевой соли 12–бромдегидроабиетиновой кислоты (V) Калиевую соль 12–сульфодегидроабиетиновой кислоты (VI) получали аналогично (V) из 0,18 г (0,47 ммоль) вещества (III), 0,07 г (0,51 ммоль) K2CO3 и 5 мл дистиллированной воды, в результате получился раствор с концентрацией 50 мкг/мл, реакция представлена на рисунке 3.3. 37

Рисунок 3.3 – Синтез калиевой соли 12–сульфодегидроабиетиновой кислоты (VI) Методы разведения основаны на использовании последовательных разведений концентраций раствора от максимальной к минимальной (например, от 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, и т.д. до 1 мкг/мл). Порядок выполнения разведений (рис.3.4): 1) Выбор подходящего растворителя; 2) Приготовление начального раствора с заданной концентрацией (50 мкг/мл); 3) Приготовление 5 пробирок с 5 мл ДМСО и 5 пробирок с 5 мл дистиллированной воды. Рисунок 3.4 – Схема приготовления растворов разной концентрации 38

3.2. Метод определение антимикробной активности При определении антимикробной активности диско – диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносили бактериальную суспензию в количестве 0,5 мл и затем помещали диски (диаметр 2 см), содержащие 0,1 мл раствора канифоли. Диффузия канифоли в агар приводила к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 32 – 37 ºС в течение суток учитывали результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис.3.5). Результаты исследований представлены в табл. 3.1 – 3.3 [23]. б а Рисунок 3.5 – Зона подавления микроорганизмов: а - зона подавления микроорганизма вокруг диска с раствором канифоли; б - нет зоны подавления микроорганизма вокруг диска с раствором канифоли Таблица 3.1 – Зона подавления роста грамотрицательных бактерий Escherichia coli препаратами I – VI Препарат I II III IV V VI Зона подавления роста, мм Концентрация препарата, мг/мл 1 0,9±0,130 - 5 1,0±0,140 2,0±0,070 1,0±0,140 - 10 6,1±0,020 7,6±0,030 2,9±0,090 - 39 25 6,2±0,020 4,6±0,050 4,6±0,070 1,7±0,150 - 50 7,3±0,020 -9,9±0,002 2,9±0,050 -

Примечания 1. «-» − отсутствие зоны подавления роста 2. «--» − раствор не диффундировал Ссылаясь на таблицу 3.1 можно сделать вывод, что наиболее токсичным веществом для Escherichia coli оказались препараты I, II и IV, менее токсичным – препарат V. Препараты III и VI не проявили токсичность на данный вид микроорганизмов Таблица 3.2 – Зона подавления роста грамположительных бактерий Bacillus subtilis препаратами I – VI Препарат I II III IV V VI Зона подавления роста, мм Концентрация препарата, мг/мл 1 3,1±0,250 2,0±0,160 - 5 9,5±0,050 3,9±0,090 - 10 3,4±0,060 9,7±0,04 7,9±0,020 1,0±0,220 - 25 6,0±0,040 10,5±0,030 8,9±0,052 3,2±0,13 - 50 8,5±0,040 -12,1±0,050 4,8±0,09 - Примечания 1. «-» − отсутствие зоны подавления роста 2. «--» − раствор не диффундировал По данным таблицы 3.2 можно заключить, что наиболее токсичным веществом для Bacillus subtilis оказались препараты II и IV, т.к зона подавления роста микроорганизма наблюдалась при всех концентрациях, менее токсичным – препараты I и V. Препараты III и VI не проявили токсичность на данный вид микроорганизмов Таблица 3.3 – Зона подавления роста грамотрицательных бактерий Candida tropicali препаратами I – VI Препарат I II III IV V VI 1 - 5 - Зона подавления роста, мм Концентрация препарата, мг/мл 10 25 1,1±0,24 - 40 50 --1,9±0,16 -

Примечания 1. «-» − отсутствие зоны подавления роста 2. «--» − раствор не диффундировал Так же исследовалась токсичность препаратов на Candida tropicalis из таблицы 3.3 следует, что только препарат V подействовал на подавление роста данного микроорганизма. От сюда можно сделать вывод, что данный микроорганизм самый устойчивый. Математическая обработка результатов 1 образец – Препарат I концентрация 5 мг/мл, Escherichia coli. 1. Рассчитано среднее арифметическое значение экспериментально определяемой величины: ̅ = 0,9+0,8+1,2+1,1+0,7+1,1+1,0+1,2 = 1 см; X 8 2. Найдено среднее квадратическое отклонение результата измерения: SX̅ =√ (0,9-1 )2 +(0,8-1 )2 +(1,2-1 )2 +(1,1-1 )2 +(0,7-1 )2 +(1,1-1 )2 +(1,0-1 )2 +(1,1-1 )2 3(3-1) = 0,06; 3. Определен доверительный интервал при вероятности α=0,95: ̅ =2,4×0,06=0,14; ∆X 4. Найдена относительная погрешность измерения ε-x = 0,14 1 100 = 0,14; 2 образец – Препарат I концентрация 10 мг/мл, Escherichia coli. 1. Рассчитано среднее арифметическое значение экспериментально определяемой величины: ̅ = 6,1+6,4+5,9+6,2+6,3+6,0+6,1+6,1 = 6,1 см; X 8 2. Найдено среднее квадратическое отклонение результата измерения: SX̅ =√ (6,1-6,1 )2 +(6,4-6,1 )2 +(5,9-6,1 )2 +(6,2-6,1 )2 +(6,3-6,1 )2 +(6,0-6,1 )2 +(6,1-6,1 )2 +(6,1-6,1 )2 3(3-1) 0,06; 3. Определен доверительный интервал при вероятности α=0,95: ̅ =2,4×0,06=0,14; ∆X 41 =

4. Найдена относительная погрешность измерения ε-x = 3.3. 0,14 6,1 ⋅100=0,02 Расчет биологической активности В настоящей работе были проведены расчеты биологической активности с использованием пакета программ «PASS online» исследованных производных дегидроабиетиновой кислоты (I – VI). Из данных, представленных в таблицах 3.4 – 3.9 следует, что наличие в молекулах (I – III), ионов калия приводит к снижению вероятностей проявления ряда видов активности. Протекторное действие для слизистых оболочек для соединения (I) достигает 98 %; для (II) – 97 %; для вещества (III) – 96 %, а для соединения (IV) – 93 %. Ингибиторное действие в отношении тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) для соединения (I) составляет 91 %; для соединений (II) и (III) – 86 %; а в соединении (IV) уже 81 %. Антигиперхолестеролемическое действие для соединения (I) характеризуется значением 88 %, для продукта (II) – 83 %. Субстратное для цитохрома P450 для соединения (III) равно 81 %, а для (IV) – 79 %. В соединениях (V), (VI) и (VI*) наоборот, присутствие иона калия увеличивает вероятности появления ряда активностей. Так, например, протекторное действие слизистых оболочек для соединении (V) составляет 93 %, а для соединений (VI) и (VI*) достигает 98 и 97 % соответственно. Так же появление бром– и сульфо – группы в 12 положении молекулы ДАК незначительно снижает вероятность проявления биологической активности. Например, протекторное действие в отношении слизистых оболочек: для соединения (I) составляет 98 %, для продукта (III) – 96 %, а для калиевой соли (V) – уже 93 %. 42

Ингибиторование тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) для соединения (I) достигает 91 %, для (III) равно 86 %, а для соединении (V) только 75 %. Таблица 3.4 – PASS online расчет биологической активности диспропорционированной канифоли (I) № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Активность Протектор слизистых оболочек Ингибитор тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) Субстрат для цитохрома P450 Антигиперхолестеролемическая Ингибитор оксидоредуктазы Ингибитор алкенилглицерофосфохолин гидролазы Ингибитор уреазы Антиэкзематозная Регулятор липидного обмена Противовирусная (грипп) Гиполипидемическая Субстрат для цитохрома P450 2J2 Ингибитор гастрина Ингибитор липазы Лечение острых неврологических расстройств Ингибитор мембранной проницаемости Антисекреторная Ингибитор простагландина–Е2 9–редуктазы Противозудная Вероятность проявления активности (Pa), % 98 91 88 88 87 83 81 82 78 76 75 76 74 75 74 74 72 73 71 43 Соединение (I)

Таблица 3.5 – PASS online расчет биологической активности калиевой соли диспропорционированной канифоли (II) № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Активность Протектор слизистых оболочек Ингибитор тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) Субстрат для цитохрома P450 Ингибитор оксидоредуктазы Антиэкзематозная Антигиперхолестеролемическая Ингибитор алкенилглицерофосфохолин гидролазы Ингибитор мембранной проницаемости Субстрат для цитохрома P450 2B5 Субстрат для цитохрома P450 2J2 Ингибитор гастрина Ингибитор уреазы Ингибитор липазы Вероятность проявления активности (Pa), % Соединение (II) 97 86 88 83 80 75 75 74 72 73 71 70 70 Таблица 3.6 – PASS online расчет биологической активности 12–бромдегидроабиетиновой кислоты (III) № п/п Активность Вероятность проявления активности (Pa), % 1 Протектор слизистых оболочек 96 2 Ингибитор тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) 86 44 Соединение (III)

Окончание таблицы 3.6 № п/п 3 4 5 6 Активность Вероятность проявления активности (Pa), % Ингибитор оксидоредуктазы Субстрат для цитохрома P450 Противовирусная (грипп) Антиэкзематозная Соединение (III) 80 81 77 73 Таблица 3.7 – PASS online расчет биологической активности калиевых солей 12–бромдегидроабиетиновой кислоты (IV) № п/п 1 2 3 4 Активность Вероятность проявления активности (Pa), % Протектор слизистых оболочек Ингибитор тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) Субстрат для цитохрома P450 Противовирусная (грипп) Соединение (IV) 93 81 79 70 Таблица 3.8 – PASS online расчет биологической активности 12–сульфодегидроабиетиновой кислоты (V) № п/п 1 2 3 4 Активность Протектор слизистых оболочек Ингибитор оксидоредуктазы Антигиперхолестеролемическая Лечение острых неврологических расстройств Вероятность проявления активности (Pa), % 93 86 85 84 45 Соединение (V)

Окончание таблицы 3.8 № п/п 5 6 7 8 9 10 11 Активность Ингибитор глицерил– эфира монооксигеназы Противовирусная (грипп) Ингибитор мембранной проницаемости Ингибитор алкоголь О– ацетилтрансферазы Вероятность проявления активности (Pa), % 83 Соединение (V) 80 78 76 Ингибитор холестанетриол-26-монооксигеназы Ингибитор транс–1,2– дигидробензол–1,2– диолдегидрогеназы Ингибитор тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) 73 73 75 Таблица 3.9 – PASS online расчет биологической активности моно (VI) – и дикалиевой солей 12 –сульфодегидроабиетиновой кислоты (VI*) № п/п 1 2 3 4 Активность Протектор слизистых оболочек Ингибитор уреазы Ингибитор гастрина Ингибитор тестостерона 17–бета–дегидрогеназы (НАДФ +) Вероятность проявления активности (Pa), % 98 97 85 71 76 − 72 − 46 Соединения (VI), (VI*)

4. ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ УСЛОВИЙ ТРУДА 4.1. Общая характеристика лаборатории Выпускная квалификационная работа выполнялась в лаборатории микробиологии ВШБТиПП. Данная лаборатория оснащена современными автоматизированными системами, которые значительно улучшают качество микробиологических исследований и сокращает сроки их проведения Деятельность лаборатории ВШБТиПП осуществляется следующими сотрудниками: − Директор; − Заместитель директора; − Заведующий лаборатории; − Старший научный сотрудник (заместитель заведующего лабораторией); − Младший специалист (беременная); − Старший научный сотрудник; − Специалист по охране труда; − Специалист по оборудованию; − Лаборант (студент); − Уборщик; − Уборщик. В табл.4.1 представлен график работы и должности сотрудников лаборатории, на рисунке 4.1 – Организационная структура управления лаборатории 47

Рисунок 4.1 – Организационная структура управления лаборатории 48

Таблица 4.1 – График работы Должность сотрудника ПН ВТ СР ЧТ ПТ Директор 08:00 17:00 08:00 17:00 - - 08:00 17:00 9:00 18:00 08:00 17:00 08:00 17:00 10:00 19:00 08:00 17:00 09:00 17:00 10:00 19:00 08:00 17:00 09:00 18:00 08:00 17:00 10:00 19:00 08:00 17:00 09:00 18:00 Зам. Директора Зав. лабораторией Ст.науч. сотрудник (заместитель зав) Старший научный сотрудник Младший спец. (беременная) Спец. по охране труда Спец. по оборудованию Лаборант (студент) Уборщик СБ ВС ПН ВТ СР ЧТ ПТ - - 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 - 08:00 17:00 - - 08:00 17:00 09:00 18:00 09:00 18:00 08:00 17:00 09:00 18:00 08:00 17:00 10:00 19:00 08:00 17:00 08:00 17:00 10:00 19:00 08:00 17:00 09:00 18:00 08:00 17:00 13:00 19:00 08:00 17:00 09:00 18:00 - - - - 09:00 18:00 09:00 18:00 09:00 18:00 09:00 18:00 09:001 8:00 09:00 16:00 09:00 16:00 09:00 16:00 09:00 16:00 09:00 16:00 - 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 13:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 - - 06:00 08:00 06:00 08:00 СБ ВС - - 08:00 17:00 - 08:00 17:00 - 09:00 18:00 09:00 18:00 - - - - 09:00 18:00 09:00 18:00 09:00 18:00 09:00 18:00 09:00 18:00 - 09:00 16:00 09:00 16:00 09:00 16:00 09:00 16:00 09:00 16:00 - - - - 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 - - - - 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 08:00 17:00 - - 08:00 13:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 - - 06:00 08:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 08:00 13:00 06:00 08:00 49

Для каждого сотрудника разрабатывается индивидуальная должностная инструкция, которая содержит информацию о должностных обязанностях сотрудника, его правах и ответственности, а также информацию о наказании за неисполнение своих прямых обязанностей В каждом учреждении или предприятии разрабатывается перечень документов, который обеспечивает контроль за организацией охраны труда. Такой перечень включает в себя большое количество документов, главными из которых являются: – Приказ «О назначении лиц, ответственных за обеспечение охраны труда на предприятии» – Положение «об организации работы в области охраны труда» – Приказ «О назначении ответственного лица за пожарную безопасность». Все исследования в данной лаборатории осуществлялись при помощи специального оборудования, наименования и характеристики которого представлены в таблице 4.2. Таблица 4.2 – Характеристика оборудования Оборудование Шкаф сушильный Аквадистиллятор Марка ES – 4620 (30 л / 300°С) ПЭ – 2210 (А) • • • • • • • • • • • • • • • • Характеристика Температурный диапазон – +10 до 300 °С; Погрешность поддержания температуры – ±4 °С; Неравномерность температуры по объему –±5 °С; Дискретность задания и отображения температуры – 0,1 °С; Потребляемая мощность – 850 Вт; Объем камеры – 30 л; Размеры камеры (ШхГхВ) – 340х320х320 мм; Наружные размеры (ШхГхВ) - 620х530х490 мм; Масса – 27 кг. Производительность – не менее 10 л/час; Расход воды на охлаждение – менее 80 л; Материал – нержавеющая сталь; Питание – 380 В; Мощность – 7,5 кВт; Габариты – 280х310х830 мм; Масса – 7,5 кг. 50

Продолжение таблицы 4.2 Термостат ПЭ-4522 (-20+120°С) • • • • • • Центрифуга лабораторная ПЭ – 6900 с ротором 12х10 мл • • • • • • • • • • • • Плита нагревательная графитовая ES – HG3545 • • • • • • • • • • • • Рабочий диапазон температур – 20 до +120 °С; Дискретность установки температуры – 0,1 °С; Точность поддержания температуры (при -10 °С) – ±0,1°С; Температурный градиент по объёму (при – 10 °С) – ±0,3 °С; Производительность насоса во внешнем контуре – 10 л/мин; Максимальное давление во внешнем контуре – 0,5 бар; Объем рабочей жидкости – 11 л; Размер ванны – 240х300х150 мм; Используемые размеры ванны – 240х120х150 мм; Габариты – 370х460х675 мм; Мощность нагревательного элемента – 800 Вт; Потребляемая мощность – 600 Вт; Масса – 35 кг. Максимальная скорость вращения – 12000 об/мин; Дискретность установки скорости вращения – 50 об/мин; Максимальное центробежное ускорение (RCF) – 13400 г; Вместимость штатного ротора – 12х10 мл; Максимальное время установки таймера – 99 ч 59 мин; Дискретность установки времени таймера – 1 мин; Уровень шума – не больше 65дБ; Номинальное напряжение питания – 220 (50 Гц) В; Максимальная потребляемая мощность – 350 Вт; Габариты– 380х260х310мм; Масса – 17кг; Рабочая температура – +50 +450 °С; Точность поддержания температуры – ±1 %. Неравномерность температуры по площади платформы – ±10 %; Максимальная допустимая распределённая нагрузка на платформу – 30 кг; Мощность – 1,9 кВт; Габаритные размеры – 450х510х180 мм; Масса – 18,2 кг. 51

Окончание таблицы 4.2 Микроскоп бинокулярный Микромед 3 • вар. 2–20М • • • • • • • • • • • Увеличение микроскопа, 40 – 1000 крат; Угол наклона визуальной насадки – 30 град; Регулируемое межзрачковое расстояние – 50 – 75 мм; Объективы: 4x/0,10; 10x/0,25; 20х/0,40; 40x/0,65; 100x/1,25 мм; Подсветка – 3 Вт; Габариты – 380х210х385 мм; Масса – 11 кг. На каждый вид оборудования создается инструкция по применению и безопасности использования данного оборудования. Инструкция должна включать в себя: – общие требования безопасности; – требования безопасности перед началом работы, во время работы, по окон- чании работ и в аварийных ситуациях; – требования руководства по эксплуатации; – паспорта на оборудование; – техническую документации. Также инструкция должна соответствовать Трудовому кодексу и федеральным законам Российской Федерации. 4.2. Анализ опасных и вредных факторов в лаборатории Данная дипломная работа выполнялась в химической лаборатории при использовании веществ, имеющих класс опасности с 3 – го по 4 – тый. Вещества, применяемые в синтезах: диспропорционированная канифоль, 12–бром – и 12–сульфо – дегидроабиетиновые кислоты, этанол, диметилсульфоксид. 4.2.1. Характеристика веществ, применяемых в работе Этанол (С2Н5ОН). ПДК 1000 мг/м3 Физические и химические свойства. Бесцветная летучая жидкость. Окисляется в уксусный альдегид и уксусную кислоту. 52

Общий характер действия. Наркотик, вызывающий сначала возбуждение, а затем паралич центральной нервной системы. При длительном воздействии больших доз может вызвать тяжелые органические заболевания нервной системы, печени, сердечно – сосудистой системы, пищеварительного тракта и т. д. [5]. Действие на кожу. Скорость проникания этилового спирта через кожу пропорциональна концентрации спирта в растворителе. Этиловый спирт в чистом виде вызывает у работающих сухость кожи, изредка – образование трещин. Денатурированный этиловый спирт раздражает кожу значительно сильнее. Спиртовые лаки и политуры вызывают «экзему полировщиков». Меры предупреждения. Герметизация аппаратуры и коммуникаций, недоступность этилового спирта, разъяснительная работа [5]. Диметилсульфоксид (CH3)2SO. Физические и химические свойства. Бесцветная жидкость без запаха со специфическим сладковатым вкусом (недостаточно чистый продукт имеет характерный запах диметилсульфидa). Важный биполярный апротонный растворитель. Находит широкое применение в различных областях химии, а также в качестве лекарственного средства. Токсическое действие. Диметилсульфоксид легко проникает через неповреждённую кожу, поэтому растворы токсичных веществ в ДМСО могут привести к отравлению при попадании на кожу (трансдермально). Может раздражать кожу, особенно при действии неразбавленного ДМСО. Побочные действия. Может вызывать зудящий дерматит, кожные высыпания, сухость кожи, легкое жжение, зуд, редко – бронхоспазм. возникновении аллергических реакций необходимо назначение антигистаминных ЛС. Канифоль. Физические и химические свойства. Твердое, хрупкое вещество, имеет цвет от бесцветного до янтарного. Т. плавл. 56 – 82°С. При хранении на воздухе 53

поглощает кислород. Пыль канифоли в смеси с воздухом взрывоопасна. Может содержать следы скипидара. Токсическое действие. Вызывает раздражение кожы, образуя папулезные и пузырьково – папулезные высыпи. Описаны массовые случаи дерматитов у работающих со смазкой ЛЗ – 158, содержащей канифоль. Индивидуальная защита. Меры предосторожности. Защитные крема типа «биологических перчаток», силиконовые крема. 4.2.2. Характеристика микроорганизмов, применяемых в работе При проведении данного эксперимента были использованы различные виды микроорганизмов, в таблице 4.3 представлена характеристика МО. Таблица 4.3 – Общая характеристика микроорганизмов, применяемых в работе Наименование микроорганизма – продуцента Назначение ПДК, кл/м3 Класс опасности Escherichia coli Bacillus subtilis Candida scotti продуцент треонина продуцент аминокислот продуцент корм, белка 1000 1000 1000 3 3 3 4.3. Пожарная и электробезопасность В лаборатории имеется много электроприборов, которые работают от общей сети с напряжением 220 В: сушильные шкафы, аналитические весы, плитки, мешалки, регистрирующие устройства. Все, кроме электроплиток и аналитических весов, заземлено согласно ПУЭ и ГОСТу 12.1.030 – 81 «Электробезопасность» [8]. При работе с такими приборами существует опасность возгорания и поражения электрическим током. Для предотвращения возгорания, должны соблюдаться следующие правила: 1. Лаборатория должна быть оснащена пожарными кранами с пожарными рукавами. Углекислотные, хладоновые огнетушители и песок всегда должны быть в наличии. 2. В лабораторных помещениях необходимо размещать план эвакуации сотрудников на видном месте. 54

3. Все сотрудники лаборатории обязаны пройти обучение правил обращения с огне – и взрывоопасными веществами, газовыми приборами, а также уметь обращаться с противогазом, огнетушителем и другими средствами пожаротушения, имеющимися в лаборатории. 4. В помещениях лаборатории и в непосредственной близости от них (в коридорах, под лестницами) запрещено хранить горючие материалы и устанавливать предметы, загромождающие проходы и доступ к средствам пожаротушения. 5. Курить разрешается только в отведенном и оборудованном для этой цели месте. 6. Все нагревательные приборы должны быть установлены на термоизолирующих подставках. 7. После окончания работы необходимо отключать электроэнергию, газ и воду во всех помещениях. 8. Каждый сотрудник лаборатории, заметивший пожар, задымление или другие признаки пожара обязан: – немедленно вызвать пожарную часть по телефону; – принять меры по ограничению распространения огня и ликвидации пожара; – поставить в известность начальника лаборатории, который в свою очередь должен известить сотрудников, принять меры к их эвакуации и ликвидации пожара. 55

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Проведено систематическое изучение современных литературных данных о строении и свойствах смоляных кислот, их промышленном применении и биологической активности. 2. Показано по результатам исследования антибактериальной активности производных смоляных кислот и их солей, что: – Наиболее выраженную токсичность в отношении Escherichia coli продемонстрировали препараты I, II и IV при концентрациях соответственно 25, 10 и 50 мг/мл, наименьшую –V, в то время как препараты III и VI не проявили токсичность. – Для Bacillus subtilis наиболее токсичными оказались препараты II и IV (зоны подавления роста микроорганизма наблюдались при всех концентрациях 1 – 50 мг/мл), менее токсичным – препараты I и V; препараты III и VI* не проявили ингибирующего действия. – Подавление роста Candida tropicalis обнаружено только у препарата V, т.е. C.t. проявил наибольшую устойчивость по отношению к препаратам (I – IV, VI*). 3. Проведен расчет вероятностей проявления биологической активности соединений (I – VI*) с помощью пакета программ PASS online. Показано, все производные смоляных кислот и их калиевых солей (I – IV, VI*) могут обладать высоким протекторным действием для слизистых оболочек (Pa 93 – 98 %) и выраженной противовирусной (грипп) защитой (Pa 70 – 80 %). А.О.Анисимова 09.06.2020 56

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Афонченко, О.В. Лесохимическое сырье для лакокрасочных предприятий / О.В. Афонченко , А.М. Кашников // Лакокрасочные материалы и их применение. – 2010. – № 5. – С. 20 – 21. 2. Базарнова, Ю.Г. PASS ONLINE – Расчет биоактивности окисленных полифторалкиловых эфиров смоляных кислот / Ю.Г. Базарнова, Л.М. Попова, Е.Б. Аронова // XXI ВЕК: итоги прошлого и проблемы настоящего плюс, – 2019. –Т. 8, № 2. – С. 150 – 154. 3. Бардышев И.И. О химическом составе эфирного масла сосны обыкновенной / Х.А. Черчес, Е.А. Рекунов // ЖПХ. – 1962. – № 2. – 325 – 329с. 4. Богомолов, Б.Д. Переработка сульфатного и сульфитного щелоков / Б.Д. Богомолов, С.А. Сапотницкий и др. – М.: Лесная промышленность, 1989. – 360с. 5. Водочной и пивоваренной промышленности в качестве растворителя лаков и политур для экстрагирования. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://samzan.ru/98498. (Дата обращения: 22.02.2020). 6. Выродов, В.А. Технология лесотехнических производств / В.А. Выродов, А.Н. Кислицын, М.И. Глухарева. – М.: Лесная промышленность, 1987. – 352с. 7. ГОСТ 12.1.030 – 81 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Защитное заземление. Зануление (с Изменением N 1. – М.: ИПК Издательство стандартов, 2001. – 13с. 8. ГОСТ 14919 – 83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия. – М.: Издательство стандартов, 2002. – 44с. 9. ГОСТ 19113 – 84. Канифоль сосновая. Технические условия (с Изменениями N 1, 2). – М.: Издательство стандартов, 1999. – 15с. 10. ГОСТ 24104 – 2001 Весы лабораторные. Общие технические требования. – М.: Издательство стандартов, 2002. – 11с. 11. ГОСТ 25336 – 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры. – М.: Стандартинформ, 2009. – 236с. 57

12. Жильников, В.И. Модифицированная канифоль / В.И. Жильников, Г.Ф. Хлопотунов. – М.: Лесная промышленность, 1968. –129с. 13. Журавлев, П. И. Канифоль, скипидар и продукты их переработки / П.И. Журавлев. – М.: Лесная промышленность, 1988. – 72с. 14. Канифоль. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.cniga.com.ua/index.files/kanifol.htm. (Дата обращения: 03.04.2020). 15. Ковернинский, И.Н. Комплексная химическая переработка древесины / В.И. Комаров, С.И. Третьяков, Н.И. Богданович и др.; под ред. И.Н. Ковернинского. – Архангельск, 2002. – 347с. 16. Комшилов, Н.Ф. Канифоль, её состав и строение смоляных кислот – М.: Лесная промышленность, 1965. – 96с. 17. Комшилов, Н.Ф. Состав канифоли и строение смоляных кислот сосны и ели / Н.Ф. Комшилов. – М.: Лесная промышленность, 1955. – 73с. 18. Лошкарев М.А. Вопросы химии и химической технологии выпуск 29 / А.Ф. Гуськов, А.В. Костарева, В.Н. Колосов, С.Я. Козлова. – Харьков, 1973. – 53с. 19. Лысак, В.В. Микробиология. Методические рекомендации к лабораторным занятиям, контроль самостоятельной работы студентов/ В.В.Лысак, М.А Титок, Р.А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2002. – С. 99. 20. МУК 4.2.1890 – 04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. – 92с. 21. Пентегова, В. А. Терпеноиды хвойных растений / Ж. В. Дубовенко, В. А. Ралдугин, Э. Н. Шмидт.; под ред. А.А. Семенова. – Новосибирск: Наука, 1987. – 95с. 22. Пищевая добавка Е 445: секрет аппетитного блеска цитрусовых фруктов. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://vkusologia.ru/dobavki/stabilizatoryemulgatory/e445.html. (Дата обращения: 17.02.2020). 23. Примаков, С.Ф. Производство картона. – М.: Экология, 1991. – 224с. 58

24. Производство, состав и применение живичной канифоли. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://msd.com.ua/kanifol/proizvodstvo-sostav-iprimenenie-zhivichnoi-kanifoli/. (Дата обращения: 14.02.2020). 25. Славянский, А. К., Химическая технология древесины/ А. А. Ливеровский, В. А. Лямин., Э. М. Цацка., Б. Ф. Никандров и др. – М.: ГОСЛЕСБУМИЗДАТ, 1962. – 576с. 26. Толстиков, Г.А. Смоляные кислоты хвойных России. Химия, фармакология / Г.А. Толстиков, Т.Г. Толстикова, Э.Э. Шульц, С.Е. Толстиков, М.В. Хвостов. – Новосибирск: Гео, 2011. – 395с. 27. Черемных, К.М. Биодеструкция смоляных кислот доминирующих токсичных соединений в отходах целлюлозно – бумажной промышленности/ К.М. Черемных, и др // Вестник Пермского университета. – 2014. – № 3. С. 57 – 62. 28. Чичибабин, А.Е. Основные начала органической химии/ А.Е. Чичибабин, П.Г. Сергеева. – М.: Книга по требованию, 2013. – 798с. 29. Чудинов, С.В. Справочник лесохимика / С. В Чудинов., А. Н. Трофимов, Г.А Узлов и др. – М.: Лесная промышленность – 1987. – 170с. 30. Adasanya, S. A, O’Neill, M. J, Roberts, M. F. Structurerelated Fungitoxicity of Isoflavanoids / J. Physiological Plant Pathology, – 1986. – V. 29. – P. 96 – 101. 31. Campbell, W.P, Morgana M. Substitution reactions of dehydroabietic acide. II / J. Am. Chem. Soc. – 1941. – V. 63, №. 11. – P. 1838 – 1843. 32. Fieser, L.F., Campbell W.P. Substitution reactions of dehydroabietic acide / J. Am. Chem. Soc. – 1938. – V. 60, №. 11. – P. 2631 - 2636. 33. George, C. Harris, Thomas F Sanderson. Resin Acids. III. The Isolation of Dextropimaric Acid and a New Pimaric-type1 Acid, Isodextropimaric Acid / J. Am. Chem. Soc. – 1948. – № 70. – P. 2079 – 2081. 34. Gary, O. Spessard, David R. Matthews, Michael D. Nelson,. Phytoalexin-like Activity of Abietic Acid and Its Derivatives / J. Agric Food Chem, – 1995. – V 43. – P. 1690 – 1694. 35. Passonline. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.pharmaexpert.ru/passonline/index.php. (Дата обращения: 21.03.2020). 59

36. Loeblich, V.M., Lawrence R.W /J. Org. Chem, – 1956. – V. 21, №. 6. – Р. 610 – 611. 37. Уайз, Луис Э, Джан Эдвин С. Химия древесины Т. I / Эдвин С. Джан, Луис Э. Уайз. – М.: Гослесбумиздат, 1959.– 654с. 60

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Попова

Рецензия на ВКР Анисимовой А.О. на тему: "Определение токсичности 12-бром- и 12-сульфодегидроабиетиновой кислот и их солей в отношении клеток микроорганизмов" от профессора, доктора химических наук Поповой Л.М.

больше 3 лет назад

Рецензия от Цырульникова Анжелика

Выпускная квалификационная работа Анисимовой Анастасии полностью соответствует нормативным требованиям. В литературном обзоре отмечена актуальность выбранной темы и подробно рассмотрены методы получения, применение и химические свойства канифоли и ее производных. В данной работе также приведена актуальная информация о биодеградации, микробной биотрансформации смоляных кислот, а также об их фарм...

больше 3 лет назад

Рецензия от Иванченко Ольга Борисовна

В работе Анисимовой Анастасии представлены исследования антимикробной активности производных смоляных кислот. Целью работы являлось изучение антимикробной активности диспропорционированной канифоли (Ia), широко используемой в качестве эмульгатора в процессах получения синтетических каучуков и включающей в свой состав дигидроабиетиновую кислоту (до 65% ДАК), а также 12-бром- (Ib), 12-сульфо- (Ic...

больше 3 лет назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв