Получение бактериального удобрения на основе молочной сыворотки, содержащего бактерии рода Azospirillum, и исследование его влияния на прорастание овса

Полина Черкасова

Получение бактериального удобрения на основе молочной сыворотки, содержащего бактерии рода Azospirillum, и исследование его влияния на прорастание овса

Исследование посвящено получению бактериального удобрения в качестве альтернативы утилизации молочной сыворотки, которая сливается в окружающую среду в огромных объемах в качестве побочного продукта производства молочной продукции

Биология

Дипломы

Вуз: Удмуртский государственный университет (УдГУ)

ID: 60e1ac87e4dde50001921f9e

UUID: 1c910b90-bef3-0139-39d9-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 10

20.3

Полина Черкасова

Удмуртский государственный университет (УдГУ)

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 286,6 КБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Удмуртский государственный университет» Институт естественных наук Кафедра ботаники, зоологии и биоэкологии Направление подготовки 06.03.01-Биология Профиль – Ботаника Допущена к защите «__» _________ 2021 г. Зав. кафедрой _____________ (подпись) д.б.н. Н. И. Науменко ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА на тему: «Получение бактериального удобрения на основе молочной сыворотки, содержащего бактерии рода Azospirillum, и исследование его влияния на прорастание овса» Выполнил студент группы ОАБ-06.03.01-43б _______________ Черкасова (подпись) Научный руководитель П. В.

Старший преподаватель _______________ Маградзе (подпись) Ижевск, 2021 2 Е. И.

Содержание Введение...................................................................................... 4 Глава 1. Обзор литературы по теме исследования...................5 1.1. Общие сведения о бактериях рода Azospirillum...........5 1.1.1. Таксономическое положение азоспирилл....................5 1.2. Морфология и физиология Azospirillum..........................6 1.3. Среда обитания.................................................................7 1.4. Геном Azospirillum............................................................8 1.4.1. Гены, участвующие в процессе хемотаксиса и закрепления на поверхности корней растений..................9 1.5. Взаимодействие с растениями.......................................10 1.5.1. Колонизация корней.................................................11 1.5.2. Физиологические механизмы закрепления в ризосфере............................................................................ 15 1.5.3. Продуцирование фитогормонов...............................17 1.5.4. Влияние на рост растений и урожайность..............21 1.5.5. Влияние совместной инокуляции с другими микроорганизмами на рост растений и урожайность......22 Глава 2. Методология проведения экспериментов.................24 2.1. Объект исследования и питательная среда для культивирования....................................................................24 2.2. Выделение бактерий из прикорневой части растений.24 2.3. Получение удобрения путем выращивания Azospirillum на молочной сыворотке.........................................................25 3

2.4. Постановка эксперимента по проращиванию семян овса посевного (Avena sativa L.) в почве..............................25 2.5. Постановка эксперимента по проращиванию семян овса посевного (Avena sativa L.) на фильтровальной бумаге 26 2.6. Определение всхожести семян и энергии прорастания 26 2.7 Посев по методу Коха......................................................27 Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.............28 3.1. Выделение бактерий рода Azospirillum.........................28 3.2. Результаты опытов по проращиванию семян овса посевного (Avena sativa L.) в почве в зависимости от вида полива..................................................................................... 28 3.3. Результаты опытов по проращиванию семян овса посевного с использованием фильтровальной бумаги........36 Выводы....................................................................................... 40 Список литературы...................................................................41 4

Введение Население Земли беспрестанно растет, задавая сельскохозяйственной отрасли все более и более высокую планку объемов производства продовольствия. Существует ряд некоторых трудностей, ограничивающих возможности пищевой промышленности, например, нехватка пахотных земель и дороговизна удобрений, необходимых в выращивании различных культур растений, в том числе и кормовых культур для разведения скота. Однако, работу сельского хозяйства можно оптимизировать, сделав его более продуктивным, а влияние на окружающую среду менее разрушительным. Очевидно, что продуктивность отрасли во многом зависит от плодородия почв. Пригодной для использования почву делает в первую очередь ее химический состав и присутствие в ней микроорганизмов, способных вступать с культурами растений в симбиотические отношения, поскольку такие организмы влияют на способность растений к более активному росту и развитию. Бактериальные удобрения абсолютно безопасны для окружающей среды, что является их несомненным преимуществом перед другими видами удобрений. Цель работы: выявление влияния бактериального удобрения на основе молочной сыворотки, содержащего Azospirillum, на всхожесть и рост овса. Задачи: 1. Выделить азоспириллы из ризосферы злаковых. 2. Получить удобрения путем выращивания бактерий на молочной сыворотке. 5

3. Исследовать влияние удобрения на рост овса в почве. 4. Исследовать влияние удобрение на рост овса на фильтровальной бумаге 5. Сравнить влияние удобрений, содержащих азоспириллы и азотобактеры, на рост овса в почве. 6

Глава 1. Обзор литературы по теме исследования 1.1. Общие сведения о бактериях рода Azospirillum Azospirillum – это аэробные грамотрицательные гетеротрофы, ускоряющие рост растений, способные влиять на рост и урожайность многочисленных видов растений, осуществляют фиксацию азота в микроаэрофильных условиях, имеют агрономическое и экологическое значение [8]. Основная теория относительно способности бактерий к ускорению роста заключается в их способности синтезировать различные фитогормоны, которые, в свою очередь, улучшают рост корней, адсорбцию воды и минеральных веществ, что в конечном итоге дает более крупные и, в большинстве случаев, более продуктивные растения. Данная версия всё ещё обсуждается, так как продолжают накапливаться новые данные о фиксации азота и воздействии на мембраны. С момента повторного открытия в середине 1970-х было доказано, что азоспириллы являются весьма многообещающими ростостимулирующими бактериями (РСБ). В некоторых развивающихся и развитых странах для многих культур азоспириллы используются в качестве бактериологического инокулянта отдельно, либо совместно с другими РСБ или везикулярно-арбускулярными микоризными грибами потенциальными (ВАМ). агентами для Так же решения они служат экологических проблем. Согласно обширным генетическим, биохимическим и прикладным исследованиям, азоспириллы одними из наиболее изученных РСБ. [27] 7 считаются

1.1.1. Таксономическое положение азоспирилл К роду Azospirillum на относят 18 штаммов бактерий: A. Melinis, A. lipoferum, A. brasilense, halopraedoebereinerae, A. inerae, A. picis, A. A. oryzae, A. canadense, A. zeae, A. fermentarium, A. rugosum, A. palatum, A. largimobile, A. thiophilum, A. formosense, A. humicireducens, A. soli и A. Agricola. Эти штаммы относятся к отряду Rhodospirillales, к подклассу Alphaproteobacteria. Для них является характерным установление с растениями и патогенными микроорганизмами растений симбиотических отношений. Большинство известных штаммов были получены из прикорневой части растений или почвы, хотя некоторая часть была выделены из нехарактерных сред обитания для почвенных бактерий, а именно бактериальные маты, сформировавшиеся в серном источнике, и отработанное дорожное покрытие [2]. 1.2. Морфология и физиология Azospirillum Впервые азоспириллы выделил Мартин Бейеринк. Эти бактерии способны расти на безазотных агаровых средах и используют выделяемую слизь как защитный механизм от воздействия кислорода, тем самым препятствуя диффузии кислорода в среде [3]. Для азоспирилл характерна отличительная способность к метаболизму способствует азота и углерода, адаптации, 8 данная способность приживаемости и

жизнедеятельности микроорганизмов в условиях конкуренции с другими бактериями [6]. При неблагоприятных условиях среды, таких как, например, дефицит питания, бактерии способны переходить в цистоподобные состояния, за счет чего повышается выживаемость. Морфологическим изменениям сопутствуют развитие внешней оболочки, состоящей из полисахаридов, и накопление поли–β–гидроксибутирата. Поли–β– гидроксибутират служит источником энергии и углерода в стрессовых условиях [4]. Для азоспирилл характерна повышенная подвижность, являющаяся дополнительным защитным фактором ввиду возможности к миграции в более благоприятные зоны, а именно в ризосферу. Подвижность достигается благодаря дополнительным флагеллам, которые нужны бактериям для способности к движению в плотных и жидких средах. У азоспирилл корневым отмечается сахарам, положительный органическим хемотаксис кислотам, к экссудатам, аминокислотам. В опытах выявлена миграция A. brasilense в ризосферу проростков пшеницы и показана ее зависимость от уровня влаги в почве, которой и лимитируется. На примере Azospirillum brasilense были представлены доказательства способности азоспирилл к свободному движению водную пленку в исследованиях Йова Башана. через Данный процесс в естественных условиях оказывает значительное влияние на хемотаксис микроорганизмов. К тому же, Azospirillum способны к аэротаксису [50]. Azospirillum отличаются многообразием метаболизма N2. Эти бактерии способны к осуществлению всех реакций цикла N2, кроме нитрификации. Азоспириллы, в зависимости от 9

свойств штамма, обеспечивают растения N2 в процессе азотфиксации и денитрификации. В качестве источников N2 для микроорганизмов служит азот из атмосферы, различные нитраты и нитриты, а также аммоний [15]. В условиях отсутствия кислорода бактерии используют как акцептор дыхательного электрона нитрат и восстанавливают его до молекулярного азота через нитрит и одновалентный оксид азота. В жидких средах Azospirillum способны осуществлять азотфиксацию только лишь в условиях пониженного давления О2. Присутствие нитратов в среде угнетает азотфиксацию, но определенные концентрации необходимы для процесса денитрификации, за протекание которой у азоспирилл ответвечают диссимиляторные нитритредуктазы, превращающие –NO2 в N2O [9]. Бактерии по форме прямые или немного изогнуты, а диаметр составляет около 1 мкм, длина 2,1-3,8 мкм [1]. 1.3. Среда обитания Все представители Azospirillum sp., кроме A. halopraeferanse, факультативные эндофиты, по причине того, что они способны колонизировать поверхность, а также и внутреннюю часть корней. При том, могут проникать внутрь корня и расти в межклеточных пространствах как эндофиты, но чаще всего представлены эпифитами. Некоторые штаммы способны заселять внутреннюю корневую часть [18]. Какое-то представителями время азоспириллы субтропической 10 и считались тропической зоны,

позднее были обнаружены и в зонах умеренного и субарктического климата [11]. По численности, на грамм ризосферной почвы в почвах умеренной зоны азоспириллы встречаются в меньшем количестве, чем в тропических и субтропических зонах. По данным исследователей из Польши, в ризосфере культур ячменя и кукурузы плотность бактерий составила от нескольких единичных клеток до двух тысяч на один грамм почвы [13]. 1.4. Геном Azospirillum Как одни используются молекулярных из в самых качестве изученных модели исследований РСБ для азоспириллы генетических ризосферных и бактерий. Согласно данным Мартина и Дидонет, размер генома этих бактерий варьируется от 4,8 Mbp у A. irakense до 9,7 Mbp у штамма A. lipoferum. Геномы 5 штаммов (A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. irakense, A. halopraeferens), анализируемые методом электрофореза в пульсирующем поле, обладали несколькими мега-репликонами размером 0,2 - 2,7 Mbp и гибридизовались с 16s рДНК у A. brasilense [25]. Горизонтальный электрофорез в опытах Кабаллеро и Меладо показал, что ризосферные и эндофитные изоляты A. brasilense, выделенные из растений сахарного тростника и референс-штамм A. brasilense Sp7 и Cd, содержали 5 - 8 репликонов более 1,8 Mbp. Самыми маленькие бактериальные хромосомы, среди описанных на данный момент, являются репликоны Azospirillum размером около 0,6 Mbp, данные результаты свидетельствуют о том, что геном A. 11

brasilense состоит из нескольких мини-хромосом вместо одной кольцевой. Функции этих репликонов неизвестны, вероятно они способствуют экологическому распределению и метаболическим особенностям азоспирилл. Согласно сообщениям Джамаса и Билака, такие хромосомы также характерны для tumefaciens, Rhodobacter Burkholderia sphaeroides, cepacia, Agrobacterium Brucella spp., Vibrio parahaemo-lyticus и Phyllobacterium. [44]. В экспериментах Педраза и Риччи было отмечено, что внутренняя защитной часть средой прохождения корня для через сахарного A. тростника brasilense. внутреннюю После часть является 4-кратного корня в ходе выполнения различных экспериментов никаких изменений в геноме бактерий не наблюдалось [18]. 1.4.1. Гены, участвующие в процессе хемотаксиса и закрепления на поверхности корней растений Azospirillum прикрепляются к корневым поверхностям растений и колонизируют их, данный процесс зависит от активности подвижности и хемотаксиса по отношению к корневым экссудатам. В работах Вандерлайдена репортерная система β-глюкуронидазы (GUS) у нефлагеллированных мутантных штаммов и мутантного штамма Tn5 с низкой хемотаксической подвижностью по отношению к различным аминокислотам, сахарам и органическим кислотам показала, что мутанты колонизировали корни пшеницы в гораздо меньшей степени, чем родительский штамм. Методом фенотипической комплементации хемотаксических мутантов Хауваертс идентифицировал 12 гены, которые кодируют

центральный путь передачи сигнала для хемотаксиса у A. brasilense. Секвенирование фрагмента ДНК мутантных по хемотаксису штаммов, выявило область из 5 открытых рамок считывания, кодирующих гомологи известных генов (cheA, cheW, cheY, cheB и частичный ген cheR). По сообщениям ученого, эти гены включают пути возбуждения и адаптации для хемотаксиса и у других видов бактерий [23]. Ван Доммелен пишет, что ген кодирующий белок, подобный ChvE у Agrobacterium tumefaciens, необходим для индукции гена vir при реакции на сахара. Ген был клонирован у A. brasilense Sp245. Метод инсерционного мутагенеза показал, что сахаросвязывающий белок А (SbpA) штамма A. brasilense участвует в хемотаксисе в направлении D-галактозы, L-арабинозы и D-фукозы и является частью высокоаффинной системы поглощения D-галактозы [6]. Катупитий отмечает, что подвергшийся спонтанному мутагенезу штамм A. brasilense Sp7 не имел капсульных полисахаридов, снизил количество продуцируемого ацетилена и колонизировал поверхность корня в меньшей степени, чем родительский штамм, что в результат привело к идентификации нового регуляторного гена у A. brasilense, flcA. В процессе изучения влияния мутантного гена flcA на пшеницу была выявлена его ключевая роль в клеточных процессах, связанных с адгезией, а именно в образовании капсульных колонизации полисахаридов, корней. флокуляции Перегдерк в культуре предполагает, что и flcA напрямую влияет на скорость активности нитрогеназы [22]. Обилие различных экспериментов, направленных на изучение хемотаксиса, показывают, что хемотаксис является основным процессом, ведущим к колонизации корней. 13

1.5. Взаимодействие с растениями Несмотря на активные исследования физиологии и молекулярной биологии этих бактерий, их точный механизм воздействия на растения сегодня ненамного яснее, чем и десять лет фактов: назад. Существует бактерии фиксируют несколько азот неоспоримых и продуцируют фитогормоны как в культуре, так и при ассоциации с растением, но перенос этих продуктов ограничен и не всегда обнаруживается. Тем не менее, реакция роста очевидна. Бактерии влияют на метаболические пути растений, включая активность клеточных мембран. Наиболее очевидным результатом инокуляции является изменение морфологии корневой системы отрицательные). (как положительные, Инокулированные так растения и лучше усваивают минералы и воду [14]. Для объяснения этих явлений было предложено несколько возможных механизмов, некоторые из которых имели больше экспериментальных данных, чем другие. Тем не менее, нет однозначного согласия относительно того, как именно бактерии влияют на рост растений, каковы основные механизмы или существует ли один основной механизм, ответственный за наблюдаемые эффекты на рост растений и, в частности, являются на урожайность движущей силой растений. в области Эти вопросы исследований азоспирилл. Аддитивная гипотеза, предложенная более 30 лет назад, по-видимому, рассматривает участвующего несколько в все еще механизмов, ассоциации. 14 Эти верна. Гипотеза вместо механизмы одного, действуют

одновременно или последовательно, причем вклад отдельного механизма менее значим, если оценивать его отдельно. Сумма их активности, вызванная соответствующими условиями окружающей среды, приводила к наблюдаемым изменениям в росте растений. Сегодня наиболее распространенным объяснением воздействия этих бактерий на растения является выработка фитогормонов, которые изменяют метаболизм и морфологию растения, улучшая усвоение минеральных веществ и воды. Вклад азотофиксации более спорный. В 1990 году Башан и Леванони выдвинули идею непосредственного воздействия бактерий на мембраны растительных клеток [26]. 1.5.1. Колонизация корней Ассоциация между бактериями и растением может успешно возникнуть только в том случае, если бактерии способны выжить в почве и найти подходящую по размерам популяцию корней [12]. В ризосфере градиент уменьшения питательных веществ от корня к его окружению генерируется экссудатами растений. [16] Благодаря механизмам хемотаксиса и подвижности, бактерия может перемещаться к растению и использовать экссудаты в качестве источника углерода. Инокуляция азоспириллами приводит к внешним и физиологическим изменениям корней, в них понижается активность окислительных ферментов, содержание жиров, скорость усвоения нитратов, наоборот увеличивается. калия Согласно 15 и дигидрофосфатов исследованиям Хехт-

Буххольца, а также Бенизри, недостаточная колонизация приводит к минимальному росту растений или во все к его отсутствию [19]. Некоторые штаммы A. lipoferum и A.brasilense способны колонизировать внутреннюю часть корней пшеницы. Данное свойство не проявляется на начальной стадии колонизации (стадия закрепления) [21]. В исследованиях наблюдались в Рамоса, местах крупные появления группы боковых клеток корней и в межклеточном пространстве клеток эпидермиса корней. А по сообщениям Лью, иногда большая часть бактерий обитала на поверхности корня, внутри корня меньше. В зоне корневых волосков бактерий наблюдалось больше, но преимущественно они располагались в углублениях между эпидермальными клетками [20]. Хорошо известно, что A. brasilense, выращенные в стандартных условиях, распределяются по всей корневой системе пшеницы, за исключением зоны роста. Однако в работах Фишера бактерии, подвергшиеся физиологическому стрессу, в основном локализовались на кончиках корней и боковых корнях [49]. Точно так же, согласно сообщениям Пуэнте, инокуляция саженцев черных мангровых деревьев в морской воде A. halopraeferens, либо плотности halopraeferens A. brasilense колонизации в основном приводила поверхности давали к высокой корней. одиночные A. клетки, заключенные в толстую оболочку, тогда как A. brasilense производят в основном микроскопления. Клетки A. brasilense были скреплены с поверхностью корней и между собой сетью фибрилл. A. halopraeferens были лучшими колонизаторами 16

поверхности корней, в то время как A. brasilense были успешнее в колонизации всего корня. [17]. Шлотером и Хартманом были проанализированы различные сорта пшеницы, корни которых колонизировали бактерии A. brasilense (штаммы Sp7, Sp245 и Wa5). Все из них обильно колонизировали кончики корней. A. brasilense Sp245 показал самый высокий колонизационный потенциал даже и может быть обнаружен в других частях корня, включая внутреннюю корневую межклеточном образовывали ткань, пространстве. колонии образуя Два микроколонии других исключительно на в штамма поверхности корней. Далее, после этапа колонизации, от семядоли до стадии цветения исследователи продемонстрировали, что, в то время как показатели колонизации всего корня A. brasilense Sp7 и Wa5 непрерывно падали, внутри корней Sp245 оставались постоянными во время этих стадий роста. Среди штаммов азоспирилл была продемонстрирована конкуренция - совместная инокуляция всех 3 штаммов A. brasilense привела к сходным закономерностям колонизации, но популяция штамма Wa5 на корнях сократилась [22]. В 1997 году Асмус с сотрудниками обнаружил, что после совместной инокуляции штаммов Sp7, Wa3 и Sp7 показала лучшие результаты, чем только Wa3, для колонизационных ниш. Конкуренция с естественным эндофитным РСБ на рисе исключала колонизацию корней инокулированных A. brasilense. [24]. У пшеницы, кукурузы и риса могут развиться опухоли (параклубеньки) на первичных и вторичных корнях при обработке низкими концентрациями ауксинов, наиболее известным из которых является гербицид 2,4-дихлорфенокси17

уксусная кислота (2,4-Д). Как следствие, между ними может развиться эндофитный Гистологически диазотрофный “симбиоз”. ауксин-индуцированные опухоли проявляются в виде злокачественных корневых меристем. Изза воздействия ауксина корневые меристемы не восстанавливаются и в дальнейшем развиваются в крупные клубеньковидные структуры. Теоретически, привнесенные диазотрофы (Azospirillum spp., Azorhizobium caulinodans, Rhizobium spp.) населяют параклубеньки в качестве основной колонизационной ниши. Кристенсен-Венигер продемонстрировал в своих работах как колонизирующие бактерии проникают через “входную трещину” в места, в которых развивающиеся опухоли появились через ритидом корня и эпидермис, формируют высокую плотность клеток внутри межклеточных пространств кортикальных и других тканей. Происходит инфицирование опухолевых клеток бактериями, находящимися внутри клеточной цитоплазмы, которая окружает мембраноподобные структуры. Как только они заселяют параклубеньки, инокулированные диазотрофы эндофитно колонизируют большим числом клеток [25]. В своих исследованиях Кеннеди говорил о том, что не все диазотрофы способны эффективно колонизировать параклубеньки. В пшенице только Herbaspirillum seropedicae, Azorhizobium caulinodans и мутантный штамм A. brasilense Sp7S показали значительную эндофитную колонизацию параклубеньков, в то время как Acetobacter diazotrophicus, Azotobacter vinelandii, Derxia gummosa и другие штаммы Azospirillum колонизировали ризоплану, а не внутреннюю часть параклубеньков [31]. 18

Также, согласно Фишеру, при влиянии солевого стресса на колонизацию параклубеньков пшеницы бактериями A. brasilense Cd, параклубеньки ведут себя как защищенные бактериями ниши, бактериальные поддерживающие популяции, чем более у высокие растений без параклубеньков. В параклубеньках большинство бактерий присутствовало вокруг базальной поверхности модифицированных боковых корневых структур. Никакого серьезного прорыва в изучении процесса прикрепления и последующей колонизации корней не произошло. Сообщалось лишь об уточнениях предыдущих исследований. Возможно, лучшее понимание генов растений, участвующих во взаимодействии, прольет дополнительный свет на эти ключевые моменты [48]. Клеточная агрегация является одним из самых основных явлений, характерных для азоспирилл при колонизации корней. Процесс агрегации был детально изучен Башаном и Леванони. Данные их экспериментов взаимодействия показали, что явление агрегации опосредуется белками и полисахаридами, но сам механизм действия пока не ясен. Поскольку агрегацией можно легко манипулировать, это может дать возможность создать лучшие инокулянты азоспирилл [30]. 1.5.2. Физиологические механизмы закрепления в ризосфере Башан и Хольгин азоспирилл к корням установили, представляет что собой прикрепление двухэтапный процесс, состоящий из адсорбции и закрепления. Первая 19

фаза адсорбции протекает достаточно быстро, в течение 2 часов после воздействия бактерий обратимый и, вероятно, белковыми соединениями. несколько часов, благодаря бактериальным она на корни, управляется Фаза бактериальными закрепления необратима процесс и занимает осуществляется внеклеточным поверхностным полисахаридам, включающих сеть фибриллярного материала, который соединяет бактерии с поверхностью корня и предотвращает их отсоединение. В своей работае Егоренкова подтвердила данную последовательность процесса закрепления на примере пшеницы [27]. Кастелланос заряда клеточной штаммов умеренной значений, оценивал поверхности Azospirillum spp. гидрофобностью которые микроорганизмов адсорбцию и Azospirillum и На измерения гидрофобности зарядом отмечались человека. путем spp. ниже у у 10 обладал известных патогенных гидрофобность и заряд поверхности клеток азоспирилл можно повлиять внешним воздействием, но общую закономерность для всех штаммов выявить не удалось [39]. Федоненко сравнивал А. brasilense Sp245 и мутанты штаммы, дефектные по липополисахаридам. Несмотря на сходство динамики адсорбции родительского и мутантного штамма, способность к прикреплению мутантных организмов была ниже, чем у родительского штамма. Мутантный штамм обладал значительно сниженной гидрофобностью поверхности клеток. Эти результаты демонстрируют, что гидрофобность и заряд не играют большой роли в первичной адсорбции Azospirillum spp. к корневым поверхностям [43]. 20

Также Кастелланос подвергал бактериальные клетки голоданию,при стенки этом многие изменялись, но характеристики эти изменения клеточной не были существенными, вследствие чего был сделан вывод, что голодание не является основным ограничивающим фактором в прикреплении азоспирилл к поверхности корней[39]. Пинейро было изучено влияние рН и катионов. Наличие значительных концентраций Ca+2 или (PO4)-3 в элективной среде снижало адсорбцию бактерий. Влияние рН среды на адсорбцию азоспирилл показало, что штаммы из корней или ризосферы пшеницы имели оптимальную адсорбцию при показателях рН равных 6,0, в то время как все остальные штаммы предпочитали Егоренковой и рН 7,0. Кроме Федоненко того, в работах липополисахариды, экстрагированные из наружной мембраны A. brasilense Sp245 и его мутантных клеток, индуцировали деформацию корневых волосков проростков пшеницы после воздействия [26]. Кастелланос предпологает, что некоторые лектины, играют определенную роль в фазе адсорбции, поскольку эти соединения были идентифицированы в клеточной стенке A. brasilense и A. lipoferum. Адсорбция A. brasilense на корнях яровой пшеницы зависела от концентрации бактерий и возможного участия лектинов. Количество прикрепленных клеток увеличивалось с увеличением инокулята и времени контакта. Насыщение поверхностной адсорбции корней наблюдалось через 3-24 часа инкубации, в зависимости от штамма. Чем дольше длился период инкубации, тем сильнее было закрепление на поверхности корня. Адсорбция на корнях частично ингибировалась, в случаях, если корни 21

обрабатывались N-ацетил-D-глюкозамином, что и указывает на возможное участие лектинов [19]. Бурдман занимался очищением основного белока внешней мембраны A. brasilense Cd, действующего в качестве адгезина и участвующего в адсорбции корней и аггрегации клеточных бактерий. Белок способен связывается с экстрактами корней различных видов растений, наиболее выраженная адгезия наблюдалась с корнями злаковых. Эти исследования указывают на участие молекул лектина в процессе прикрепления. 1.5.3. Продуцирование фитогормонов Azospirillum spp. известны главным образом своей способностью продуцировать растительные гормоны, а также полиамины и аминокислоты в культуре. Среди этих гормонов большую роль могут играть индолы, главным образом 3индолилуксусная кислота (ИУК) и гиббереллины [29]. 1.5.3.1. 3-индолиуксусная кислота Синтез ИУК зависит от типа питательной среды и наличия триптофана в качестве предшественника. Также значительное влияние на количество вырабатываемой ИУК оказывает рН. В своих исследованиях Захарова выявила, что очень низкие пиридоксина уровни и витаминов никотиновой группы кислоты, В, особенно способствуют увеличивали выработку ИУК. [34]. Считается, что продуцирование ауксинов азоспириллами играет основную роль в стимулировании роста растений. В 22

экспериментах Эль-Хаваса и Адати A. brasilense продуцировали большое количество внеклеточной ИУК и триптофола в питательную среду обогащенной триптофаном, предшественником надосадочной ИУК. жидкости Добавление культуры отфильтрованной к корням риса, выращенных в гидропонных резервуарах, по сравнению с необработанными корнями привело к удлинению корней, увеличению площади поверхности и сухого вещества корней, развитию высокие боковых корней концентрации и корневых надосадочной волосков. жидкости Более сильно ингибировали удлинение корней, развитие боковых корней и вызывали узелковидные опухоли на корнях. Аналогично, в работах Молла, внеклеточная надосадочная жидкость A. brasilense Cd, примененная к растениям сои, индуцировала наибольшее количество корней и увеличивала их длину. Инокуляция пшеницы дикими штаммами A. brasilense Sp245 и Sp7 приводила к сильному уменьшению длины корней и увеличению образования корневых волос, что характерно для таких инокуляций [35]. Исследования Доббеларе показывают, что влияние на морфологию корней было дополнительно усилено добавлением триптофана, это можно было имитировать, заменив клетки Azospirillum на ИУК. Кунду в своих работах продемострировал, что мутантные A. brasilense с низкой продукцией фитогормонов, но с высокой корней группой. нитрогеназной по сравнению Напротив, активностью с не усиливали неокулированной мутанты с повышенной рост контрольной продукцией фитогормонов существенно влияли на морфологию корней. В целом, увеличение биомассы растений и N2-фиксации было 23

замечено у штаммов, имеющих повышенную продукцию индольных соединений [47]. Воздействием на параклубеньки корней риса ауксинами 2,4-Д, нафталинуксусной кислотой (НУК) и ИУК Секар усиливал полигалактуроназную активность в корнях при образовании параклубеньков азоспириллами. небольшой При степени активность рисовых и эндофитной инокуляции возрастала корней колонизации азоспириллами в полигалактуроназная без какого-либо видимого влияния на корневой морфогенез; применение ауксинов, совместно с инокуляцией Azospirillum, повышало активности полигалактуозную активность риса корней до высокого уровня, таким образом, продуктивность корней менялась внутри параузелков, которые позже были колонизированы А. brasilense [46]. Еще одним является из эффектов увеличение инокуляции интенсивности Azospirillum дыхания, что демонстрировал в своих опытах Веддер-Веисс [33]. 1.5.3.2. Гиббереллины По Кассану бактериальным ферментом, ответственным за синтез гиббереллинов является 2-оксоглутарат-зависимая диоксигеназа. Пикколи высказывал предположение, что благоприятное воздействие обусловлено Azospirillum выработкой spp. на растения гиббереллинов. частично Применение гиббереллинов оказывает влияние, аналогичное инокуляции Azospirillum – увеличению густоты корневых волосков. При культивировании штамма A. 24 lipoferum USA 5b,

продуцирующего гиббереллин, в присутствии глюкозилового эфира или гликозида гиббереллина А20, оба конъюгата подвергались гидролизу. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что стимуляция роста растений, вызванная инокуляцией Azospirillum, является результатом комбинации как продукции гиббереллина, так и деконъюгации гиббереллин-глюкозид/глюкозилового эфира бактерией [37]. Известно, что с увеличением происходит увеличение (основного гиббереллина, водного количества потенциала гиббереллина выявленного у А3 Azospirillum), продуцируемого на клетку [7]. Лукангели и предположение Боттини об было причастности также высказано гиббереллина А3, продуцируемого Azospirillum spp., к стимулировани роста кукурузы [38]. 1.5.3.3. Этилен В своих работах Глик продемонстрировал, что у растений на протяжении большинства фаз роста дозировка продуцируемого этилена минимальна. Этилен играет важную роль в прорастании семян, фитогормон пробуждает их из состояния покоя, хотя высокие концентрации этилена ингибируют последующее удлинение корней. В ответ на биологические или экологические стрессы этилен может синтезироваться в большом количестве, вызывая увядание и старение. В сельском хозяйстве контроль концентраций этилена предотвращает ощутимые экономические затраты. Одним из предшественников синтеза этилена является 1аминоциклопропан-1-карбоновая 25 кислота (АКК). АКК-

дезаминаза является ферментом, который встречается у многих почвенных микроорганизмах и ростостимулирующих бактерий, способных понижение разрушать концентрации этилена АКК. Таким образом, в растениях можно рассматривать, как способ стимулирования роста растений. У штаммов Azospirillum spp. отсутствует АКК-дезаминаза, но не смотря на этот факт, некоторые штаммы могут продуцировать этилен [41]. Модуляция этилена воздействием ростостимулирующих бактерий происходит за счёт деградации предшественника этилена AКК с помощью AКК-дезаминазы, в результате чего в качестве побочных продуктов образуются аммиак и α- кетобутират [23]. Структурный ген AКК-дезаминазы (acdS) ростостимулирующих бактерий Enterobacter cloacae UW4 Хольгин и Глик клонировали в плазмиде широкого спектра хозяев под контролем lac-промотора, а затем переносили в A. brasilense Cd и Sp245. Корни проростков рапса и томатов, чувствительных к этилену, получились значительно длиннее у растений, привитых трансформантами A. brasilense, чем у растений, привитых нетрансформированными штаммами той же бактерии. Предположив, что конструкция с геном AКК-дезаминазы под контролем конститутивного промотора, более слабого, чем lac-промотор, может оказывать меньшую метаболическую нагрузку на азоспирилл, ген acdS был клонирован под контролем промотора гена устойчивости к тетрациклину: удерживающие трансформанты acdS, слитые с A. brasilense промотором гена Cd, Tet r, показали более низкую активность AКК-дезаминазы, чем 26

трансформанты с acdS, контролируемыми lac-промотором. Однако, acdS, оказывали контролируемые меньшую промотором метаболическую гена нагрузку Tet r, на Cd- трансформанты A. brasilense, чем acdS, контролируемые lac, что приводило к увеличению синтеза ИУК, скорости роста, выживаемости на поверхности листьев томата и способности стимулировать рост проростков [27]. 1.5.4. Влияние на рост растений и урожайность Продуктивность климата и азотфиксации интенсивность тропической зоне. в зонах фотосинтеза Азоспириллы умеренного ниже, являются чем в важным составляющим компонентом азотфиксирующей микрофлоры корней злаковых трав в умеренной климатической зоне. [44]. Волкогон изучал эффективность инокуляции азоспириллами костреца безостого и райграса пастбищного с применением азотных удобрений. При внесении 40–80 кг/га минерального азота в первый год жизни трав был замечен значительный эффект от инокуляции. Снижение же прибавок было замечено от инокуляции на второй и третий годы жизни [5]. В ходе своих исследований Башан и Хольгин сделали вывод, что инокуляции азоспириллы более чем обладают сотни видов способностью других к незлаковых культур. Окон проводил оценку применения азоспирилл в течении двадцати лет и продемонстрировал способность микроорганизмов увеличивать урожайность злаковых культур в различных климатических зонах. Так прибавки 27

урожайности кукурузы составили 10–20% в Джорджии и Нью–Джерси, 20-30% в Израиле и Индии, а у злаковых растений 11–24% во Флориде, в Израиле 15–20%, в Индии 20– 30% [36]. Отмечается, что стабильность результатов экспериментальных исследований зависит в том числе от выбора штамма для инокуляции. [32] В ходе полевых экспериментов злаковыми травами были которым бактериальное Михайловской получены данные, удобрение с согласно «Азобактерин» обеспечивало положительный эффект на четырех видах злаковых трав. наблюдалась На костреце наибольшая безостом и эффективность еже сборной инокуляции. Увеличение содержащегося в урожае белка подтвердило влияние азотфиксации на азотное питание [40]. 1.5.5. Влияние совместной инокуляции с другими микроорганизмами на рост растений и урожайность Инокуляция азоспирилл более успешна, когда совместно с ними инокулируются и другие микроорганизмы. Такие консорциумы эффективнее работают, когда встречаются фосфатсолюбилизирующие бактерии, азотобактерии, ризобии и везикулярно-арбускулярные микоризные грибы, так как способствуют обеспечения продуктов, росту друг друга питательными замедляющих за счет совместного веществами, протекание реакций, удалению повышая таким образом продуктивность растений, улучшая усвоение питательных веществ. [28]. 28

Анализ научной перспективность литературы использования показал, азоспирилл в что качестве действующих агентов бактериальных удобрений обусловлена их свойствами: способностью стимулировать рост растений, фиксировать молекулярный азот в ассоциации с различными культурами, хемотаксисом и аэротаксисом, способность осуществлять мобилизацию почвенного фосфора. При выборе соответствующего колонизации корней азотфиксирующей процессе штамма, и культуры, минерального Azospirillum может способность высокий ростостимулирующей улучшения применение сочетающего уровень активности. азотного обеспечить к В питания, повышение содержания белка в урожае. Необходимые условия для успешной инокуляции качественного удобрения, – правильное корректное внесение. [45] 29 изготовление хранение и его

Глава 2. Методология проведения экспериментов 2.1. Объект исследования и питательная среда для культивирования Объект исследования – бактерии рода Azospirillum. Состав твердой селективной питательной среды для культивирования азоспирилл на 100 мл.: K2HPO4 – 0,3 г.; KH2PO4 – 0,2 г.; NH4CL – 0,05 г.; MgSO4*7H2O – 0,02 г.; лактат Na (50%) – 2 капли; агар микробиологический – 2г. Компоненты смешивались Эрленмейера, водопроводной доводился 100 до мл. и помещались водой Содержимое объем колбы в колбу раствора тщательно перемешивалось. Среда нагревалась до кипения, постоянно перемешивалась. Питательную среду разливали по пробиркам на 2/3 объема, пробирки укупоривали ватно-марлевыми пробками. Питательная среда подвергалась стерилизации в автоклаве при 1,1 ати. в течение 30 минут, после чего среду слегка остужали и разливали по стерильным чашкам Петри. 2.2. Выделение бактерий из прикорневой части растений. Чтобы выделить культуру было собрано несколько видов злаковых растений вместе с корневой частью и почвой с 30

глубины до 15 см., по причине того, что азоспириллы обитают в ризосфере злаков. Корни растений промывались под проточной водой до полного удаления почвы и помещались стерильным пинцетом в чашки Петри с питательной средой. Чашки помещались в термостат крышками вниз на три дня при температуре 28±1ºС. Изолировать получилось только колонии, выделенные с корней мятлика обыкновенного (Poa travialis L.). Путем многократного пересева была получена чистая культура Azospirillum. В дальнейшем работали с данной культурой. 2.3. Получение удобрения путем выращивания Azospirillum на молочной сыворотке Готовилась жидкая питательная среда того же состава, что и у твердой питательной среды, но без добавления агара. Раствор разливался по колбам и подвергался стерилизации в автоклаве. питательной Чистые культуры средой микробиологической из пробирок пересевались петлей в на пламени с твердой жидкую горелки среду для сохранения стерильных условий. После чего колбы с жидкой средой отправляли в термостат для культивирования на неделю с постоянной температурой 28±1ºС. Молочная сыворотка разводилась в 8 раз водой и стерилизовалась в автоклаве, далее в нее засевались бактерии, выращенные на жидкой среде. Колба с удобрением помещалась на неделю в термостат для культивирования бактерий при температуре 28±1ºС. 31

2.4. Постановка эксперимента по проращиванию семян овса посевного (Avena sativa L.) в почве Семена овса были посажены в контейнеры, по 12 штук в каждом. Всего было 9 контейнеров, содержимое 3 из них поливалось только удобрением с бактериями, 3 только сывороткой и 3 только водой. Такой полив происходил однократно при закладке эксперимента, после все семена поливались уже водой по мере необходимости, не допуская переувлажненности или пересыхания почвы. 2.5. Постановка эксперимента по проращиванию семян овса посевного (Avena sativa L.) на фильтровальной бумаге Семена овса были помещены между несколькими слоями листов фильтровальной бумаги в чашках Петри, в каждой чашке было по 12 семян. Всего было взято 9 чашек, содержимое 3 из них при закладке эксперимента единожды было смочено удобрением с бактериями, 3 сывороткой, 3 водой (контрольная группа). В дальнейшем все 9 чашек периодически смачивались обычной водой. Чашки помещались в темный ящик для исключения возможности попадания солнечного света Чашки Петри ежедневно приоткрывались на несколько секунд для попадания воздуха, проверялась увлажненность слоев бумаги, смачивалось при водой, необходимости не допуская переувлажнения. 32 содержимое высыхания чашек или

2.6. Определение всхожести семян и энергии прорастания На 4 сутки, в соответствие с ГОСТ 12038-84, просчитывалась энергия прорастания семян, а на 7 сутки всхожесть, энергии длина корней прорастания и побегов. При подсчитывали определении только нормально проросшие семена, удаляли только те, которые загнили. Для овса к нормально проросшим семенам относятся те, которые имеют не меньше двух нормально развитых корешков размером больше длины семени, а росток не менее половины его длины с занимающими различимыми не меньше первичными половины длины листочками, колеоптиля. Длину ростка учитывают по той его части, которая вышла за пределы цветковых чешуй. 2.7 Посев по методу Коха Для определения числа бактерий использовался метод Коха, определяли Аликвоту из колониеобразующие удобрения разводили единицы (КОЕ). последовательными десятикратными разведениями в 7 пробирках. Из каждой пробирки 1 мл высевался в чашку Петри, после чего туда добавлялась агаризованная питательная среда. Для сравнения параллельно проводился такой же эксперимент, но полученные разведения уже заливались в чашку Петри по 0,1 мл поверх питательной среды. Результаты обрабатывали программы Microsoft Excel 33 статистически с помощью

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 3.1. Выделение бактерий рода Azospirillum Для того, чтобы получить бактерии рода Azospirillum использовались такие растения как: ежа сборная (Dactylis glomerata L.), тимофеевка луговая (Phleum pretense L.), мятлик обыкновенный корневой системы (Poa trivialis которых L.), с поверхности выделялись образцы микроорганизмов. В процессе выделения и культивирования на элективной питательной твердой среде из полученных культур наиболее удачными оказались образцы с корневой части мятлика обыкновенного. Данные культуры содержали большие по численности колонии, к тому же среди них отсутствовали плесневые грибы. В ходе дальнейшего многократного пересева удалось получить чистую культуру бактерий рода Azospirillum. Бактерии идентифицировались методом микроскопирования и по характерному налету на среде. В препарате азоспириллы имеют форму вибриона и обладают спиральной подвижностью. 3.2. Результаты опытов по проращиванию семян овса посевного (Avena sativa L.) в почве в зависимости от вида полива Для оценки влияния удобрения на рост овса посевного (Avena sativa L.) было исследовано несколько параметров, а 34

именно зависимость длины корней и длины побегов от вида полива в различные сезонные периоды. На рисунке 1 представлены данные по зависимости прорастания семян овса в почве от вида полива (лето). Как видно из графика, среди общей массы семян, больше всего проросло тех, в почву с которыми было внесено удобрение, что составило 75% от количества посаженых семян в контейнерах с этим видом полива. Промежуточные результаты показали семена, выросшие на сыворотке, 61%, К оли ч ество объектов, ш т меньше всего взошло семян на воде без дополнительного внесения других веществ, 47%. 27 30 22 17 20 10 0 вода удобрение сыворотка Полив Рис. 1. Зависимость прорастания семян овса в почве от вида полива (лето) По длине побега проросшие семена продемонстрировали следующие результаты, отображенные на рисунке 2: По данным графика можно заметить, что среди наиболее длинных стеблей преобладают растения, которые росли на удобрении, среди более низкорослых растений чаще всего встречаются результаты те, у что росли растений, на воде, выращиваемых промежуточные на сыворотке. Максимальная длина побегов растений составила 36,5 см, а минимальная 23,3 см. 35

К оличество объектов, ш т 8 4 0 Длина побега, см Рис. 2. Зависимость длины побегов овса от вида полива (лето). Условные обозначения: столбцы синего цвета – результаты после полива водой, столбцы оранжевого цвета – результаты после полива удобрением, столбцы серого цвета – результаты полива сывороткой. Можно сказать, что в конкретно этом случае показатели для удобрения и сыворотки практически одинаковые и сильных различий не имеют. Вероятно, это связано с тем, что в сыворотке содержится большое число различных веществ и элементов, которые благоприятно повлияли на рост растений. Мы считаем, что для более четкой картины следует провести эксперименты в открытом грунте, так как бактериям в удобрении нужно больше времени для того, чтобы проникнуть в ризосферу и закрепиться в ней, так же не исключается влияние конкурентных отношения растений за ограниченное пространство в контейнере. Для сравнения эффективности удобрения в другие сезонные периоды были проведены опыты в осенне-зимний период, результаты представлены на рисунке 3 и 4. На рисунке 3 показаны данные по всхожести семян. Больше всего семян взошло при поливе сывороткой, что 36

составило 75% от числа посаженных в контейнер с К оли ч ество объектов, ш т удобрением. По 61% взошло на удобрении и воде. 30 20 27 20 20 вода удобрение 10 0 сыворотка Полив Рис. 3. Зависимость прорастания семян овса в почве от вида полива (осень). Проросшие растения показали следующие результаты, рисунок 4: Среди самых высоких побегов преобладали растения, выращенные на удобрении. Промежуточные результаты были характерны для растений, которые поливались сывороткой, аналогичные, но более низкие показатели встречались на растениях, выращенных только на воде. При этом минимальные и максимальные значения длины растений были гораздо ниже, чем в летний период. Минимальная длина побегов составила 14 см, а максимальная 26,9 см. 37

Количество объектов, шт 12 8 4 0 Длина побега, см Рис. 4. Зависимость длины побегов овса от вида полива (осень-зима). Условные обозначения: столбцы синего цвета – результаты после полива водой, столбцы оранжевого цвета – результаты после полива удобрением, столбцы серого цвета – результаты полива сывороткой. Мы считаем, что такие показатели прежде всего связаны с характерным для этого времени года уменьшением длины светового дня, а также с меньшей влажностью воздуха, чем в летний период. В весенний период показатели несколько изменились, что показано на рисунках 5 и 6. На рисунке 5 отображено количество проросших семян. Больше всего семян проросло в контейнерах, содержимое которых поливалось удобрением, что составило 80,5% от изначально заложенного числа семян в контейнеры с удобрением. На сыворотке взошло 66,7% от изначального количества семян в контейнерах, на воде 50%. 38

К оли ч ество объектов, ш т 40 30 20 10 0 29 24 18 вода удобрение сыворотка Полив Рис. 5. Зависимость прорастания семян овса в почве от вида полива (весна) Проросшие растения выросли со следующими растений чаще показателями, рисунок 6: Среди самых высоких остальных встречались те, что выросли на удобрении, промежуточные показатели чаще были у растений, которые росли на сыворотке, самые низкорослые экземпляры в большинстве случаев встречались у растений, семена которых поливались водой. Самые низкими был побеги длиной 23 см, а самые Количество объектов, шт длинные 36 см. 12 8 4 0 Длина побега, см Рис. 6. Зависимость роста побегов овса от вида полива (весна). 39

Условные обозначения: столбцы синего цвета – результаты после полива водой, столбцы оранжевого цвета – результаты после полива удобрением, столбцы серого цвета – результаты полива сывороткой. 40

Мы считаем, что такие результаты получились по причине увеличения долготы солнечного дня, и повышения влажности воздуха. Таким образом, мы можем сделать вывод, что удобрение на основе молочной сыворотки и бактерий рода Azospirillum оказывает положительный эффект на рост побегов овса посевного. 3.3. Результаты опытов по проращиванию семян овса посевного с использованием фильтровальной бумаги Как и в опытах по проращиванию семян в почве, при проращивании с использованием фильтровальной бумаги исследовались такие показатели, как длина побегов и длина корней в зависимости от полива в летний и осенне-зимний периоды. Так, на рисунке 7 продемонстрирована зависимость роста побегов овса от вида полива (лето) при выращивании на фильтровальной бумаге. Лучше всего показала в работе себя молочная сыворотка К оли ч ес т в о объек т ов , ш т и вода, длина побегов составила от 6,40 см. до 21,80 см. 8 4 0 Длина побега, см 41

Рис. 7. Зависимость роста побегов овса от вида полива (лето) при выращивании на фильтровальной бумаге Условные обозначения: столбцы синего цвета – результаты после полива водой, столбцы оранжевого цвета – результаты после полива удобрением, столбцы серого цвета – результаты полива сывороткой. Аналогичные повторении результаты опыта в были получены осенне-зимний и период, при что демонстрируется на рисунке 8, отражающем зависимость роста побегов овса от вида полива (осень-зима) при выращивании на фильтровальной бумаге. Лучше всего показала в работе себя снова молочная сыворотка и вода, длина побегов составила 4,0 см. для самых Количество объектов, шт низкорослых побегов, самые длинные составили 19,9 см. 8 4 0 0 4, 27 , 6 0- 2 6, 54 , 8 7- 5 8, ,8 0 1 4- 2 ,8 0 1 09 , 13 2 , 13 0 ,3 5 1 9- 6 ,3 5 1 63 , 17 6 ,6 7 1 90 , 19 3 Длина побега, см Рис. 8. Зависимость роста побегов овса от вида полива (осеньзима) при выращивании на фильтровальной бумаге Условные обозначения: столбцы синего цвета – результаты после полива водой, столбцы оранжевого цвета – результаты после полива удобрением, столбцы серого цвета – результаты полива сывороткой. 42

Такие показатели объясняются тем, что для работы удобрения прежде всего необходима почва, поскольку азоспириллы являются ризобактериями. Исходя из данных рисунков 9 и 10, посвященных зависимости длины корней овса от вида полива при выращивании на фильтровальной бумаге, видно, что корни растений также лучше росли на воде и сыворотке, чем на удобрении. 43

Количество объектов, шт 12 8 4 0 Длина корней, см Рис. 9. Зависимость длины корней овса от вида полива (лето) при выращивании на фильтровальной бумаге Условные обозначения: столбцы синего цвета – результаты после полива водой, столбцы оранжевого цвета – результаты после полива удобрением, столбцы серого цвета – Количество объектов, шт результаты полива сывороткой. 8 4 0 2 8, ,0 0 1 0- 6 ,0 0 1 6 77 63 49 35 20 , , , , , 13 19 21 15 17 92 77 63 49 35 , , , , , 11 13 15 17 19 ,9 1 -1 2 Длина корней, см. Рис. 10. Зависимость длины корней овса от вида полива (осень-зима) при выращивании на фильтровальной бумаге 44

Мы считаем, что показатели зависимости длины корней овса от вида полива при выращивании на фильтровальной бумаге тоже связаны с тем фактом, что для работы удобрения прежде всего необходима почва, поскольку азоспириллы являются ризобактериями. Ввиду отсутствия возможности для создания симбиоза, удобрение не оказало эффекта на рост растений. 3.4. Результаты опытов по проращиванию семян овса посевного (Avena sativa L.) в почве с использованием удобрения на основе молочной сыворотки и бактерий рода Azotobacter. Для сравнения эффективности работы удобрения на основе бактерий рода Azospirillum мы провели опыт по проращиванию семян овса посевного в почве с применением удобрения на основе бактерий рода Azotobacter, рисунок 11. В большинстве показатели у семян, случаев которые самыми высокими поливались были сывороткой, промежуточные результаты у семян, поливаемых удобрением и водой, ростки семян, поливаемых удобрением, попадают во все интервалы, но их встречается меньше, чем тех, которые поливали водой. Минимальная длина побегов составила 6,5 см, а максимальная 37,6 см. Диапазон значений оказался меньше в сравнении с работой удобрения на основе бактерий рода Azospirillum. 46

Количество объектов, шт 15 10 5 0 Длина побега, см Рис. 11. Зависимость роста побегов овса от вида полива (весна). В качестве удобрения Azotobacter. Условные обозначения: столбцы синего цвета – результаты после полива водой, столбцы оранжевого цвета – результаты после полива удобрением, столбцы серого цвета – результаты полива сывороткой. Вероятнее всего такие показатели объясняются тем, что для овса более азоспирилл, предпочтительно поскольку в удобрение отличие от на основе свободноживущего азотобактера, азоспириллы образуют с растениями симбиоз в ризосфере, на установление которого хоть и требуется время. 3.5. Результаты по выявление количества КОЕ в удобрении Проведя посев методом Коха мы выяснили, что бактерии хорошо растут на разбавленной молочной сыворотке, в семикратно разведенном колониеобразующих растворе единиц 47 (КОЕ). насчитывалось Бактерии 10 10 показали

активный рост после многократных разведений, так как Azospirillum spp. относятся к микроаэрофилам. 48

Выводы 1. Азоспириллы были выделены из прикорневой части мятлика обыкновенного. 2. Опыты показали, что выделенные бактерии хорошо растут на разведенной сыворотке. 3. Удобрение положительно влияет на рост овса в почве, поскольку бактерии вступают в симбиоз с растениями. Длина побегов растений, которые были выращены с применением удобрения, была больше, чем у тех, что выращивались на воде на 2,5% (лето), на 20% (весна), на 16% (осень-зима). 4. Удобрение не оказало положительного влияния на рост овса на микроорганизмов фильтровальной отсутствует бумаге, возможность так как у попасть в ризосферу. 5. Удобрение, содержащее азоспириллы, лучше влияет на рост овса, чем удобрение, содержащее азотобактеры. 49

Список литературы 1) Белимов, А.А. Эффективность инокуляции ячменя смешанными культурами диазотрофов: автореф. дис. …канд. биол. наук: 06.01.04 / А.А. Белимов. 1990 − 19 с. 2) Берестецкий, О.А. Азотфиксирующая активность в ризосфере и на корнях небобовых растений / О.А. Берестецкий, Л.Ф. Васюк // Изв. АН СССР, серия биол. 1983 − с. 44−50. 3) В.Н. Нестеренко, Л.А. Карягина, Т.Б. Барашенко, Н.А. Михайловская, Н.А. Курилович, Г.В. Мороз. Штамм ассоциативных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense B–4485 для обработки семян зерновых культур и многолетних злаковых трав. 2002 – с.76-80. 4) Васюк, Л.Ф. Азотфиксирующие микроорганизмы на корнях небобовых растений и их практическое использование / Л.Ф. Васюк // Биологический азот в сельском хозяйстве СССР. 1989 − с. 88−98. 5) Волкогон, злаковых трав В.В. Эффективность азоспирилла-ми / В.В. бактеризации Волкогон // Сельскохозяйственная биология. 1997 − с. 75−77. 6) .Стинхаунд И., О. Вандерлайден, Д. Azospirillum, свободноживущая связанная с азотфиксирующая травами: генетический, бактерия, тесно биохимический и экологический аспекты. FEMS микробиологические обзоры. 2000 – с.487-506. 7) Гомез М. М., Меркадо Э. К., Пинеда, Э.Г. Azospirillum ризобактерии с потенциальным использованием в сельском хозяйстве. Биологический журнал DES Сельскохозяйственные биологические науки. 2015 - с. 11-18. 50

8) Каннаян С. Биотехнология биоудобрений. Alpha Science Int'l Ltd. 2002 - 3с. 9) Карягина, Л.А. Влияние микроорганизмов рода Azospirillum на урожайность многолетних злаковых трав / Л.А. Карягина, В.Н. Нестеренко // Весцi АН БССР. 1988 − с. 79−82. 10) Лукин, С.А. Азоспириллы и ассоциативная азотфиксация у небобовых культур в практике сельского хозяйства / С.А. Лукин, П.А. Кожевин, Д.Г. Звягинцев // Сельскохозяйственная биология. 1987 − с. 51−58. 11) Майорова, Т.Н. Подходы к оптимизации интродукции азоспирилл /Т.Н. Майорова, П.А. Кожевин, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. 1996 − с. 277−279. 12) Мальцева, Azospirillum lipoferum Н.Н. Азотфиксирующая бактерия (Beijerinck) в почве, ризосфере и ризоплане сельскохозяйственных растений / Н.Н. Мальцева, В.В. Волкогон // Микробиология. 1984 - с.6−8. 13) Михайловская, Н.А. Влияние минерального питания на эффективность бактеризации овсяницы луговой Azospirillum brasilense В–4485 / Н.А. Михайловская, Л.А. Юрко // Земляробства i ахова раслiн.2005 − с. 15−16. 14) Михайловская, Н.А. Эффективность бактеризации ежи сборной Azospirillum brasilense B–4485 на дерновоподзолистой супесчаной почве / Н.А. Михайловская, Г.В. Жила, Л.А. Юрко // Почвенные исследования и применение удобрений. –Минск. 2004 − с. 217−222. 15) Н.А. Михайловская, Н.Н. Курилович, Л.Н. Лученок, Л.А. Юрко, С.В. Дюсова. Способ повышения продуктивности многолетних трав: пат. 8239 Респ. Беларусь; заявитель РУП 51

«Ин-т почвоведения и агрохимии» – № а 20010740// Афiцыйны бюл. / Нац. цэнтр iнтэлект. уласнасцi. 2006 − 82с. 16) Н.А. Михайловская. Активность азотфиксации и азотфиксирующие микроорганизмы ризосферы озимой ржи // Микробиологический журнал. 1992 - с. 10−16. 17) Н.А. Михайловская. Активность фосфатмобилизации у ризобактерий // Почвоведение и агрохимия. − 2007. − № 1(38). − С. 225−231. 18) Н.А. Михайловская. Эффективность бактеризации разных видов трав Azospirillum brasilense // Почвоведение и агрохимия. 2006 - с. 202−207. 19) Нестеренко, В.Н. Использование ассоциативных микроорганизмов для повышения урожайности ячменя и многолетних злаковых трав. / В.Н. Нестеренко. − Минск, 1993. − 23 с. 20) Нестеренко, В.Н. Корневые диазотрофы небобовых культур в дерново-подзолистых почвах Белоруссии / В.Н. Нестеренко // Почвоведение и агрохимия. 1987 − с. 116−119. 21) Несцярэнка, В.М. Асацыятыуная азотфiксацыя у рызаплане небабовых раслiн ва умовах Беларусi / В.М. Несцярэнка, Л.А. Карагiна // Весцi АН БССР. 1986 − с. 36−39. 22) О.А. Берестецкий. Азотфиксирующая активность и эффективность спирилл, обитающих на корнях растений. Микробиология. 1985 − с. 1102−1104. 23) Умаров, М.М. Ассоциативная азотфиксация / М.М. Умаров. − М.: МГУ. 1986 − 132 с. 24) Хальчицкий, А.Е. Приживаемость и эффективность действия бактерий рода сельскохозяйственных Azospirillum растений/ Ленинград. 1989 − 16 с. 52 А.Е. при инокуляции Хальчицкий. −

25) Barak R. Aerotactic response of Azospirillum brasilense // J. Bacteriol. 1982- с. 643−649. 26) Barak, R. Detection of chemotaxis in Azospirillum brasilense / R. Barak, I. Nur, Y. Okon // J. Appl. Bacteriol. 1983 с. 399−403. 27) Bashan, Y. Migration of the rhizosphere bacteria Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens towards wheat roots in the soil / Y. Bashan // J. Gen. Micro- biol. 1986 - с. 3407−3414. 28) Dobereiner, J. Nitrogen fixing rhizocoenoses / J. Dobereiner, H. De Polli // Nitro- gen Fixation: Acad. Press, London. / Eds. W.D.P. Stewart and Y.R. Gallon. – London. 1980 с. 301−333. 29) Fages, J. An individual view of Azospirillum inoculants: formulation and application technology / J. Fages // Symbiosis. 1992 − с. 15−26. 30) Heinrich, D. Chemotactic attraction of Azospirillum lipoferum by wheat roots and characterization of some attractants / D. Heinrich, D. Hess // Can. J. Microbiol. 1985 − с. 26−31. 31) Holl, P.G. immunoperoxidase Application stain technique of to the the indirect flagella of Azospirillum brasilense / P.G. Holl, N.R. Kreig // Appl. Environ. Microbiol. 1984 − с. 433−435. 32) Kennedy, I.R. Biological nitrogen fi xation in non– leguminous fi eld crops: recent advances / I.R. Kennedy, Y. Tchan // Plant Soil. 1992 - с. 93−118. 33) Kennedy, I.R. Non-symbiotic bacterial diazotrophs in crop–farming systems: can their potential for plant growth promotion be better exploited? 53 / I.R. Kennedy, A.T.M.A.

Chouhury, M.L. Kecskes // Soil Biol. Biochem. 2004 – с. 1229−1244. 34) Michiels, K. Azospirillum – plant root associations: а review / K. Michiels, J. Vanderleyden, A. Gool // Biol. Fertil. Soils. 1989- с. 356−368. 35) Mikhailovskaya, N. The effect of seed inoculation by Azospirillum brasilense B–4485 on flax yield and its quality / N. Mikhailovskaya // Plant, Soil and Environment. 2006 - с. 402−406. 36) Moens S. Cloning sequencing and phenotypic analysis of laf1, encoding the flagellum of the lateral flagella of Azospirillum brasilense Sp. 7 // J. Bacteriol. 1995 - с. 5419−5426. 37) Okon, Y. Advances in agronomy and ecology of the Azospirillum/plant associa- tion. Nitrogen Fixation: Fundamentals and applications / Y. Okon // Kluwer Academic Publishers. – Netherlands. 1995 − 655с. 38) Okon, Y. Agronomic application of Azospirillum: an evaluation of 20 years worldwide field inoculation / Y. Okon, C.A. Labandera–Gonzalez // Soil Biol. Bio-chem. 1994 − с. 1591−1593. 39) Patriquin, D.G. Light microscopy observations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other grasses in Brazil / D.G. Patriquin, J. Dobereiner // Can. J. Microbiol. 1978 − с. 734−735. 40) Patriquin, D.G. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses / D.G. Patriquin, J. Dobereiner, D.K. Jain // Can. J. Microbiol. 1983 - с. 900−902. 41) Recent advances in BNF with non-legume plants / J.I. Baldani [et al.] // Soil. Biol. Biochem. 1997 - с. 911−912. 54

42) Reinhold, B. Stain-specific chemotaxis of Azospirillum spp. / B. Reinhold, T. Hurek, I. Fendrik // J. Bacteriol. 1985 – с. 190−191. 43) Sadasivan, L. Cyst production and brown pigment formation in aging cultures of Azospirillum brasilense ATCC 29145 / L. Sadasivan, C.A. Neyra // J. Bacteriol. 1987 - с. 1670−1671. 44) Schank S.C. Fluorescent antibody technique to identify Azospirillum brasilense associated with roots of grasses. Soil Biol. Biochem. 1979 - с. 287−295. 45) Sumner, M.E. Crop responses to Azospirillum inoculation / M.E. Sumner // Advances in Soil Science. 1990 - 53 с. 46) Tal, S. Production of the reserve material poly-βhydroxybutyrate and its func- tion in Azospirillum brasilense Cd. / S. Tal, Y. Okon // Can. J. Microbiol. 1985 - с. 608−609. 47) Tal, S. The regulation of poly-β-hydroxybutyrate metabolism in Azospirillum brasilense during balanced growth and starvation / S. Tal, P. Smirnoff, Y. Okon // J. Gen. Microbiol. 1990 – 1196 с. 48) Yoav Bashan, Gina Holguin, and Luz E. de-Bashan / Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmenta advances. 2003 – с. 765-766. 49) Zhulin I.B. // J. Bacteriol. Oxygen taxis and proton motive force in Azospirillum brasilense. 1996 - с. 5199−5200. 50) Zhulin, I.B. Motility, chemokinesis and methylationindependent chemotaxis in Azospirillum brasilense / I.B. Zhulin, J.P. Armitage // J. Bacteriol. 1993. − с. 952−953. 55

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв