"Получение фактора реактивации покоящихся форм M. tuberculosis RpfB для диагностики туберкулезной инфекции"

Примерно треть населения планеты подвержена латентной инфекции Mycobacterium tuberculosis. При латентной инфекции микобактерии находятся в так называемом дормантном состоянии, которое характеризуется пониженной метаболической активностью, неспособностью к росту на плотных питательных средах и резистентностью к антибиотикам. Нередко (до 23% случаев), при латентной инфекции происходит реактивация, т.е. переход возбудителя в активное состояние, обусловленный различными факторами, в том числе активностью белков Rpf-семейства, гидролизующих клеточную стенку микобактерий. В настоящее время не существует диагностического теста, который позволил бы отличить иммунную реакцию, вызванную латентным ТБ, от реакции, вызванной активным ТБ. В связи с этим необходим поиск новых методов, а также усовершенствование имеющихся методов диагностики латентного ТБ. Белок RpfB предположительно вносит наибольший вклад в реактивацию, что представляет интерес использования его для диагностики ЛТБ, а также создания более эффективных терапевтических вакцин, направленных как на активный, так и на латентный ТБ. Структурная организация RpfB включает каталитический домен, G5-домен, участвующий в адгезии, и три DUF-домена, функция которых на данный момент неизвестна. На первом этапе работы были подобраны условия получения препарата белка RpfB в растворимой форме. Для этого последовательность rpfB была клонирована в вектор pTSL, кодирующий на N-конце шаперон SlyD с His6-меткой. Полученные гибридные белки были очищены на Ni•NTA-сефарозе, гидролизованы TEV-протеазой для отщепление SlyD, что позволило получить препарат полноразмерного белка RpfB. Аналогичным образом были получены и очищены варианты белка RpfB с делециями по DUF-доменам. Функциональную активность полученного препарата полноразмерного белка RpfB оценивали по способности данного белка осуществлять реактивацию дормантных клеток М. tuberculosis. Коллегами был разработан метод определения реактивации М. tuberculosis с помощью литического микобактериофага D29, инфицирующего исключительно активно растущие клетки. Инфицирование клеток фагом D29 приводит к его размножению, которое детектируется методом ПЦР «в реальном времени». Способность к реактивации продемонстрирована для полученного препарата белка RpfB, а также для осветленного лизата активно растущей культуры М. tuberculosis, что согласуется с данными литературы [27, 35]. Участок между областью генов 63 и 64 фага D29 предположительно обладает высоким уровнем экспрессии [52]. Чтобы оценить возможность встраивания и экспрессионную активность данной области, был выбран ген eGFP, об экспрессии которого можно судить по флуоресценции соответствующего белка. Сконструирована рекомбинантная плазмида pSMT3-M_eGFP_63-64, кодирующая ген eGFP. Методом электропорации были получены клетки M. smegmatis, несущие pSMT3-M_eGFP_63-64. Проведена рекомбинация pSMT3-M_eGFP_63-64 с геномом фага D29 в клетках M. smegmatis.