Получение и характеристика фиброцитов, содержащих онкогенную мутацию JAK2 V617F

Фиброциты – клетки веретеновидной формы производные CD14+ моноцитов, которые обладают особенностями как гемопоэтических так и стромальных клеток Не смотря на их небольшую долю от циркулирующих лейкоцитов в норме, они играют важную роль во многих патологических состояниях, связанных с фиброзом, в частности с первичным миелофиброзом. Первичный миелофиброз относится к Ph негативным заболеваниям, основным критерием определения которого служит миелофиброз – явление, разрастания коллагеновых волокон в красном костном мозге с последующим вытеснением гемопоэтической ткани в другие органы и нарушением гемопоэза. Отсутствие соответствующей терапии миелофиброза связано с его неясной этиологией. Считается, что первичный миелофиброз развивается в результате злокачественной трансформации в гемопоэтических стволовых клетках, что приводит к нарушению клеточных сигнальных путей, регулирующих клеточный рост, активацию, дифференцировку, адгезию и апоптоз. Клональная миелопролиферация сопровождается изменением стромы костного мозга и патологической выработкой цитокинов и металлопротеиназ, которые могут участвовать в нарушении межклеточных взаимодействий нейтрофилов, моноцитов и мегакариоцитов, приводя к выходу CD34+ миелоидных предшественников и эндотелиальных клеток в периферическую кровь. Первоначальная причина, ведущая к злокачественной трансформации неизвестна, однако, для значительной части пациентов с первичным миелофиброзом наиболее характерна точечная мутация в гене янускиназы JAK2 V617F, которая приводит к гиперактивации янускиназы и фосфорилированию белков - мишеней в отсутствие стимуляции рецепторов, к запуску JAK-STAT сигнального пути и избыточной пролиферации миелоидного ростка. В связи с тем, что молекулярные механизмы первичного миелофиброза не ясны была поставлена цель получить фиброциты с мутацией JAK2 V617F, ассоциированной с развитием миелофиброза, и охарактеризовать профибротические свойства этих клеток. В задачи входило: 1) оптимизировать условия дифференцировки моноцитов в фиброциты на основе клеточной линии моноцитов ТНР-1. 2) выявить маркеры фиброцитов (в частности коллаген). 3)получить фиброциты из моноцитов ТНР-1 трех типов, используя условия, оптимизированные на первом этапе работы, и сравнить профибротические свойства этих клеток, а именно: А )Сравнить морфологию ТНР Б) Проанализировать количество матриксных металлопротеиназ. В) Оценить влияние ТНР на синтетическую активность МСК (на синтез коллагена). С помощью методов иммунофлюоресценции, цитофлюорометрии, вестерн блоттинга и желатиновой зимографии, а также морфометрии были получены результаты, которые привели к следующим выводам: 1)Общепринятый протокол получения фиброцитов из первичной культуры периферических мононуклеаров крови в бессывороточной среде не подходит для получения фиброцитов из клеточной линии моноцитов ТНР 1. Добавление форболового эфира в среду культивирования приводит к дифференцировке моноцитов, при этом образуется смешанная популяция клеток, морфологически схожих как с макрофагами, так и с фиброцитами. Уменьшение содержания сыворотки и форболового эфира в среде культивирования увеличивает долю веретеновидных клеток, схожих с фиброцитами. 2)Прямое сокультивирование моноцитов линии ТНР-1 и КМ МСК позволяет получить адгезионные моноциты без применения форболового эфира в бессывороточных условиях. При этом клетки прикрепляются вдоль коллагеновых фибрилл или на поверхность КМ МСК. 3)Моноциты ТНР-1, активированные форболовым эфиром, синтезируют маркер фиброцитов – коллаген I типа. Доля клеток, положительных по коллагену I типа, составляет 47%. 4)Активированные форболовым эфиром моноциты ТНР-1, несущие мутацию JAK2 V617F, достоверно более вытянутые, чем немодифицированные клетки дикого типа, что указывает на сдвиг в сторону образования фиброцитов. 5)Клетки ТНР-1 с экспрессией JAK2 синтезируют повышенное количество ММР2 по сравнению с немодифицированными клетками. 6)Моноциты THP-1 с мутацией JAK2 V617F стимулируют синтез коллагена в клетках КМ МСК, что свидетельствует о возможной роли моноцитов в патогенезе миелофиброза.