Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для геннотерапевтической  модели мыши

Кузьмина Елена Юрьевна

Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для геннотерапевтической модели мыши

Гемофилия А - наиболее распространённый дефект свёртывания крови, вызванная мутациями в гене фактора свёртываемости крови VIII. Современная терапия является дорогостоящей и не может обеспечить продолжительный эффект. Одним из многообещающих подходов к излечению гемофилии А может быть генная терапия с использованием искусственной хромосомы человека, несущей нормальную копию гена фактора VIII. Первый этап этой системы - получение индуцированных стволовых клеток из соматических клеток пациента.

Биология

Дипломы

Вуз: Санкт-Петербургский государственный университет (СПбГУ)

ID: 587d36695f1be77c40d58ec9

UUID: 49348355-22e8-4fd7-a4fc-567b2f60b147

Язык: Русский

Опубликовано: почти 8 лет назад

Просмотры: 57

Кузьмина Елена Юрьевна

Источник: Санкт-Петербургский государственный университет

Комментировать 0

Рецензировать 0

Скачать - 1232115 bytes

Поделиться работой

Санкт-Петербургский государственный университет Биологический факультет Кафедра цитологии и гистологии Кузьмина Елена Юрьевна Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для геннотерапевтической модели мыши Выпускная квалификационная работа бакалавра Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток Института Цитологии РАН (зав. лаб. – д. б. н., член-корр. РАН, Томилин А.Н.) Научный руководитель: науч.сотр. ИНЦ РАН, к.б.н. Спивак Ирина Михайловна Куратор (если есть): науч.сотр. ИНЦ РАН, PhD., Синенко Сергей Анатольевич Санкт-Петербург 2016

СОДЕРЖАНИЕ. СОДЕРЖАНИЕ.............................................................................................................................. 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................4 ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................... 6 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................. 8 1.1. Основные характеристики индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.........8 1.1.1. Предпосылки изучения плюрипотентных свойств клеток.............................................. 8 1.1.2. Основные факторы, участвующие в репрограммировании.............................................9 1.1.3. Стадии репрограммирования клеток................................................................................. 9 1.1.3.1. Стадия инициации репрограммирования.......................................................................9 1.1.3.2. Стадия созревания иПС клеток..................................................................................... 10 1.1.3.3. Стадия стабилизации иПС клеток.................................................................................11 1.1.4. Использование иПС клеток в генной терапии................................................................ 11 1.2. Использование лентивирусных векторов для репрограммирования клеток..................14 1.2.1. Характеристика лентивирусной векторной системы..................................................... 14 1.2.1.1. Геном вируса иммунодефецита человека-1..................................................................14 1.2.1.2. Ранние векторы, основанные на ВИЧ-1....................................................................... 15 1.2.1.3. Первое поколение лентивирусных векторов................................................................16 1.2.1.4. Второе поколение лентивирусных векторов................................................................ 17 1.2.1.5. Третье поколение лентивирусных векторов.................................................................17 1.2.2. Использование лентивекторов в репрограммировании клеток.....................................17 1.3. Искусственные хромосомы человека в генной терапии................................................... 19 1.3.1. Способы доставки генетического материала для генной терапии................................19 1.3.1.1. Вирусные системы доставки генетического материала..............................................19 1.3.2. Искусственная хромосома как вектор для доставки генетического материала...........21 1.3.2.1. Методы конструирования искусственных хромосом.................................................. 21 1.4. Генетическая терапия гемофилии А................................................................................... 24 1.4.1. Фактор свёртываемости крови VIII................................................................................. 24 1.4.1.1. Участие FVIII в каскаде коагуляции............................................................................. 24 1.4.2. Современная терапия гемофилии А.................................................................................25 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................................26 2.1. Линии клеток и среды.......................................................................................................... 26 2.2. Получение первичных фибробластов мыши......................................................................26 2

2.3. Трансфекция клеток кальций-фосфатным методом.......................................................... 27 2.4. Сборка вирусных частиц в HEK293T клетках................................................................... 27 2.5. Титрование вирусных частиц.............................................................................................. 28 2.6. Получение индуцированных плюрипотентных клеток мыши......................................... 28 2.7. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток, находящихся в культуре......................29 2.8. Тест на формирование тератом иПС клетками и приготовление препаратов.................30 2.8.1. Окрашивание препаратов тератом гематоксилином.......................................................31 2.8.2. Иммуногистохимическое окрашивание полученных опухолей на маркер энтодермы альфа-фетопротеин...................................................................................................................... 31 3. РЕЗУЛЬТАТЫ...........................................................................................................................32 3.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток из первичных фибробластов мышей линии FVIII-/-...............................................................................................................................32 3.1.1. Наработка лентивирусных векторов с индуцируемой экспрессией репрограммирующих факторов..................................................................................................32 3.1.2. Репрограммирование фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки............................................................................................................................................33 3.2. Доказательство плюрипотентного статуса полученных FVIII-/- иПС клеток мыши.....35 3.2.1. Анализ экспрессии Oct4 в полученных иПС FVIII-/- клетках......................................35 3.2.2. Тестирование полученных иПС клонов на формирование тератом в мышах линии NU/J...............................................................................................................................................37 3.2.3. Окрашивание срезов опухолей гематоксилином............................................................ 38 3.2.4. Иммуногистохимическое окрашивание опухолей на маркер энтодермы альфафетопротеин................................................................................................................................. 40 4. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................................................41 4.1. Репрограммирование соматических клеток является низкоэффективным процессом..41 4.2. Полученные иПС клоны гетерогенны................................................................................ 42 7. ВЫВОДЫ..................................................................................................................................43 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................44 БЛАГОДАРНОСТИ.....................................................................................................................50 3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. CHO - клетки яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary); DMEM – Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium; FVIII – фактор свёртываемости крови VIII; HA – гемофилия А (Hemophilia A); HLA – человеческие лейкоцитарныей антигены (Human Leukocyte Antigens); HEK293T клетки – клетки эмбриональной почки человека (Human Embryonic Kidney); LIF – ингибирующий фактор лейкемии (Leukemia Inhibitory Factor); LTR – длинные концевые повторы (Long Terminal Repeats); MET – мезенхимально-эпителиальный переход (Mesenchymal-to-Epithelial Transition); mES среда – среда для эмбриональных стволовых клеток мыши (mouse Embryonic Stem cells); MMCT – метод переноса хромосом, опосредованный микроклетками (Microcell Mediated Chromosome Transfer); OSKM – факторы репрограммирования Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc; PBS – фосфатно-солевой буферный раствор (Phosphate-Buffered Saline); rtTA – последовательность тетрациклинового трансактиватора; SCNT – метод переноса ядер соматических клеток (Somatic Cell Nuclear Transfer); tetO – последовательность тетрациклинового оператора; TU/мкл – титр вирусных частиц, количество трансформирующих единиц (Transforming Units) в микролитре; VSV-G – гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (Vesicular Stomatitis Virus); БСА - бычий сывороточный альбумин; ВИЧ-1 – вирус иммунодефицита человека-1; ДМСО – диметилсульфоксид; иПС клетки – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; ИХЧ – искусственная хромосома человека; МЭФ среда – среда для эмбриональных фибробластов мыши; ПФА – параформальдегид; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; ЭС клетки – эмбриональные стволовые клетки; мг – миллиграмм; мин – минуты; 4

мкг – микрограмм; мкл – микролитры; мкм – микрометры; мл – миллилитры; мкМ – микромоль; мМ – миллимоль; об/мин – обороты в минуту; см – сантиметры; ч – часы; 5

ВВЕДЕНИЕ. Гемофилия А (HA, hemophilia A) – наиболее распространённый дефект свёртывания крови (Bi et al., 1995), вызванный мутациями в находящемся на Х-хромосоме гене фактора свёртываемости крови VIII (FVIII). HA встречается преимущественно у мужчин (1 из 5 000-10 000 во всех популяциях), но может проявляться и у женщинносительниц в результате различной инактивации Х-хромосом. . До 70% пациентов с HA демонстрируют угрожающий жизни фенотип, имея меньше чем 1% от нормального уровня активности FVIII в плазме крови (Porada et al., 2014), и страдают от частых спонтанных кровотечений, приводящих к гематомам, хроническим болезненным заболеваниям суставов и потенциально угрожающему жизни внутреннему кровотечению. Современное лечение - регулярное профилактическое внутривенное вливание рекомбинантного или полученного из донорской плазмы фактора крови FVIII, является дорогостоящей процедурой и не может обеспечить долговременного эффекта. Перспективной методикой лечения НА представляется генная терапия с использованием искусственной хромосомы человека (ИХЧ) в качестве вектора, несущего нормальной копии гена FVIII в клетки пациента. В качестве клеток-носителей для доставки ИХЧ в организм пациента могут выступить индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки, полученные из соматических клеток самого пациента путем форсированной экспрессии генов, кодирующих факторы репрограммирования Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (OSKM) (Okita and Yamanaka, 2011). Использование иПС клеток снимает проблему поиска подходящего донора и возможного отторжения трансплантата. Целью данной работы является получение индуцированных стволовых клеток (иПС) из фибробластов мыши, мутантной по гену фактора VIII свёртываемости крови для геннотерапевтической модели лечения гемофилии А с помощью искусственных хромосом. В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи: 1. Наработать лентивирусные векторы с индуцируемой экспрессией репрограммирующих факторов – Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc (OSKM). 2. Получить первичные фибробласты мыши, мутантные по гену фактора VIII свёртываемости крови, и провести их репрограммирование с помощью лентивирусной системы экспрессии OSKM. 6

3. Провести отбор индивидуальных иПС клонов и подтвердить экспрессию эндогенного плюрипотентного маркера Oct4. 4. Подтвердить плюрипотентность полученных иПС клеток с помощью анализа на формирование тератом и наличию в них производных трёх зародышевых листков. 7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Основные характеристики индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Индуцированными плюрипотентными стволовыми (иПС) клетками называют клетки, полученные из соматических предшественников путем форсированной экспрессии четырех факторов репрограммирования: Oct4 , Sox2 , Klf4 и c-Myc (OSKM) (Okita and Yamanaka, 2011). Впервые иПС клетки были получены из эмбриональных фибробластов мыши и соматических фибробластов человека Синъя Яманака (Takashi and Yamanaka, 2006; Takahashi et.al., 2007), за что в 2012 году ему была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. Процесс репрограммирования происходит путем возвращения соматических клеток к первичному, плюрипотентному состоянию. 1.1.1. Предпосылки изучения плюрипотентных свойств клеток. Плюрипотентность – это способность давать начало всем клеткам зародышевых листков организма (Binder, 2009). Большинство клеток теряют эту способность в ходе дифференцировки, и только некоторые типы клеток, такие, как стволовые, сохраняют её. Возможность вернуть дифференцированные клетки в плюрипотентное состояние исследовалась давно. Было показано, что перемещение ядер кишечного эпителия амфибий в ооциты, предварительно повреждённые рентгеновским облучением, приводили к развитию жизнеспособных головастиков (Gurdon, 1962). Эффективность этого метода, получившего название метода переноса ядер соматических клеток ( SCNT, Somatic Cell Nuclear Transfer), была показана и для репрограммирования клеток млекопитающих, таких как овцы (Wilmut et al., 1997) и мыши (Wakayama et al., 1998). Репрограммирование соматических клеток также может быть получено в результате их слияния с эмбриональными стволовыми (ЭС) клетками мыши (Tada et al., 1997) и человека (Cowan et al., 2005). Это позволило сделать вывод, что и неоплодотворённые яйцеклетки, и ЭС клетки содержат в цитоплазме факторы, которые играют важную роль в поддержании их плюрипотентности и могли бы вернуть соматические клетки в плюрипотентное состояние. 8

1.1.2. Основные факторы, участвующие в репрограммировании. Двадцать четыре фактора-кандидата было доставлено в мышиные фибробласты с помощью ретровирусных векторов, что позволило репрограммировать их в плюрипотентные стволовые клетки. Дальнейшее последовательное вычитание каждого из данных транскрипционных факторов позволило определить четыре из них, способных конвертировать фибробласты в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПС): Oct3 / 4 , Sox2 , Klf4 и c-Myc (OSKM) (Takahashi and Yamanaka, 2006). Однако эктопическая экспрессия только одного из этих факторов не могла привести к репрограммированию клеток. Их взаимодействие представляет собой сложную сеть с элементами взаимной регуляции и саморегуляции (Pan et.al., 2006). Например, мономеры Oct4 и Sox2 образуют гетеродимер, который играет роль транскрипционного комплекса (Botquin et.al., 1998). Играет роль и количество присутствующих факторов: так, при сверхэкспрессии Oct4 происходит дифференцировка клеток по энто- или мезодермальному пути, а отсутствие фактора Oct4 приводит к формированию клеток трофобласта (Niwa et.al. , 2000). Как небольшое повышение уровня экспрессии Sox2, так и его полное удаление приводят к дифференцировке (Kopp et.al., 2008). 1.1.3. Стадии репрограммирования клеток. По последним данным, репрограммирование клеток – трехстадийный процесс, состоящий из инициации, созревания и стабилизации (Samavarchi-Tehrani et.al., 2010). 1.1.3.1. Стадия инициации репрограммирования. На первом этапе после трансфекции клеток факторами Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc (OSKM) происходит метилирование промоторов генов, экспрессия которых была характерна для соматических клеток (Hanna et.al., 2009). Затем происходит увеличение числа быстро пролиферирующих клеток и метаболическое переключение с окислительного фосфорилирования на гликолиз, что характерно для эмбриональных стволовых клеток как адаптация к условиям гипоксии на ранних стадиях эмбриогенеза (Kondoh et.al., 2007). Запускается процесс мезенхимально-эпителиального перехода ( MET, Mesenchymal-to-Epithelial Transition), который включает потерю мезенхимальных характеристик, таких как подвижность, и появление эпителиальных – клеточной полярности и экспрессии E-кадгерина (David and Polo, 2014). MET является обратимым, 9

так как при непродолжительной экспрессии генов, кодирующих факторы OSKM, все клетки, вступившие в репрограммирование, обретают мезенхимальный фенотип (Samavarchi-Tehrani et.al., 2010). Поэтому экзогенные Oct4 , Sox2 , Klf4 и c-Myc должны присутствовать в клетках достаточно продолжительное время. Ведущим геном MET во время репрограммирования является Sox2, продукт которого супрессирует фактор Snail, в норме обеспечивающий обратный процесс – эпителиально-мезенхимальный переход (Liu et.al., 2013). Klf4 отвечает за индукцию гена, кодирующего E-кадгерин (Li et.al., 2010), в поддержание экспрессии которого затем вступают факторы BMP семейства. В отсутствие Klf4 его может функционально заменять один из эндогенных BMP, что приводит к возможности репрограммирования фибробластов мышей только при внесении экзогенного Oct4 (Chen et.al., 2011). Но конститутивная сверхэкспрессия генов, кодирующих семейство факторов BMP, предотвращает появление иПС клеток из фибробластов человека ( Hamasaki et.al., 2012). Подобная разница в механизмах, лежащих в основе репрограммирования, характерна для клеток человека и мыши. Через три дня после трансфекции факторами OSKM наблюдается повышение пролиферативной активности клеток, обусловленное сверхэкспрессией c-Myc (Apostolou and Hochedlinger, 2013). Также на данном этапе происходит усиление экспрессии LIN28, что приводит к регуляции пролиферации за счет взаимодействия с циклинами A, B и циклин-зависимой киназой Cdk4 (Xu et.al., 2009). Во время стадии инициации минимальное число клеток становятся устойчивыми к апоптозу и старению. Возможно, это происходит за счет глушения локуса INK4/ARF (Li et.al., 2009), который кодирует генысупрессоры опухолей, их продукты активируют белок ретинобластомы (Rb) и p53- зависимые сигнальные каскады. Переключение метаболического пути с окислительного фосфорилирования на гликолиз происходит через 7 дней после начала процесса репрограммирования ( Park et.al., 2014). Ключевым сигнальным каскадом в данном переходе является фосфатидилинозитол-3-киназный (PI3K/AKT) путь. Во время репрограммирования участники данного пути, такие как PI3, Pdk1 и Akt киназы, активированы, гены, кодирующие белки гликолиза высоко экспрессированы (Chen et.al., 2012). 1.1.3.2. Стадия созревания иПС клеток. 10

Только небольшое число клеток проходит стадию созревания успешно, что проявляется в низкой эффективности репрограммирования в целом ( Tanabe et.al., 2013). На данном этапе эпигенетические модификации позволяют активировать экспрессию генов, кодирующих эндогенные факторы плюрипотентности, такие как Oct4, Nanog, Sall4 и др. (Feng et.al., 2009). Важную роль в созревании иПС клеток играет LIF-STAT сигнальный путь. При культивировании клеток на среде без добавления LIF (ингибирующий фактор лейкемии, leukemia inhibitory factor), который служит активирующим лигандом данного сигнального пути, формируются колонии, схожие по морфологии с эмбриональными стволовыми клетками, но после шести дней с момента образования они открепляются от адгезивной поверхности. Активация LIF-STAT пути приводит к деметилированию промоторов генов, обеспечивающих поддержание плюрипотентного состояния. Было показано, что транскрипционный фактор Stat3 напрямую блокирует ДНК-метилтрансферазу DNMT1 и гистоновые деацетилазы HDAC2, HDAC3 и HDAC8 (Tang and Tian, 2013). WNT-сигнальный путь участвует в созревании иПС клеток, так как добавление Wnt3a-активирующего лиганда между шестым и девятым днями после начала репрограммирования увеличивает количество сформированных иПС колоний (Ho et.al., 2013). Такие колонии экспрессируют эндогенный Nanog, возможно, именно продукт данного гена необходим клеткам для перехода из стадии созревания в стадию стабилизации (Samavarchi-Tehrani et.al., 2010). 1.1.3.3. Стадия стабилизации иПС клеток. Только 1% клеток, вступивших на путь репрограммирования, доходит до этапа стабилизации. Она характеризуется наличием эндогенной экспрессии факторов поддержания плюрипотентности. Было показано, что на девятый день при элиминации экзогенных факторов репрограммирования не происходит фенотипической реверсии клеток (Samavarchi-Tehrani et.al., 2010). На данном этапе наиболее четко прослеживаются различия между иПС клетками мыши и человека. При репрограммировании соматических клеток мышей, происходит реактивация X-хромосомы, которая в норме инактивирована у особей женского пола. В клетках человека реактивации X-хромосомы не происходит (Plath and Lowry, 2011). 1.1.4. Использование иПС клеток в генной терапии. 11

Возможность генной коррекции индуцированных плюрипотентных стволовых клеток открывает широкие возможности использования их в тканезаместительной терапии. На данный момент целый ряд различных типов соматических клеток был успешно репрограммирован. Удалось получить иПС клетки из нейральных стволовых клеток, кератиноцитов, B-лимфоцитов, периферических мононуклеарных клеток крови и панкреатических β-клеток (Hawkins et.al., 2014). Первые эксперименты по использованию иПС клеток в терапевтических целях были проведены в лаборатории Йениша. Из фибробластов мышей, больных серповидноклеточной анемией, были получены иПС клетки, мутацию в гене гемоглобина которых затем элиминировали с помощью гомологичной рекомбинации. После генетической коррекции иПС клетки дифференцировали в культуре в предшественники эритроцитов и вводили мутантным мышам, где клетки проходили окончательную дифференцировку в эритроциты in vivo. В результате наблюдалось полное выздоровление больных животных (Hanna et. al., 2007). Также иПС клетки использовались в заместительной терапии анемии Фанкони мышей, в которой генетически скорректированные клетки также проходили дифференцировку в эритроциты in vivo. В результате наблюдалось выздоровление животных (Raya et. al., 2009). иПС клетки человека впервые были получены из фибробластов кожи (Takahashi et.al., 2007). На данный момент было репрограммировано множество клеток пациентов с такими заболеваниями, как болезнь Гоше, мышечная дистрофия, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, серповидно-клеточная анемия, и ведутся исследования в направлении генотерапевтических модификаций полученных иПС клеток (Walia et.al., 2012). иПС клетки, полученные от пациентов с различными заболеваниями, могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов болезней, поиска новых лекарственных соединений для терапии, тестирования эффективности уже разработанных медикаментов и проверки их токсичности. Впервые такой подход был использован для описания эффектов, оказываемых кардиоактивными соединениями на кардиомиоциты, дифференцированные из иПС клеток (Yokoo et.al., 2009). Получение иПС клеток от каждого пациента индивидуально является долгим и дорогостоящим процессом, зачастую непригодным для экстренной терапии заболеваний, таких как, например, повреждения спинного мозга. Наиболее перспективным представляется создание банка иПС клеток, полученных от определенной выборки доноров. Проблему иммунного ответа при трансплантации чужеродных клеток можно частично решить при использовании доноров, которые являются гомозиготами по аллелям 12

HLA генов гистосовместимости (Takahashi and Yamanaka, 2013). При совпадении одной из аллелей HLA гетерозиготного донора с аллелями гомозиготного пациента риск отторжения иПС клеток будет минимален. В данный момент под руководством Синъя Яманака в Японии создается банк иПС клеток, полученных от доноров с наиболее распространенными HLA аллелями (Синъя Яманака, 2014, устное сообщение). 13

1.2. Использование лентивирусных векторов для репрограммирования клеток. Впервые иПС клетки были получены путем одновременной трансдукции четырьмя ретровирусами, несущими Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (OSKM) (Takashi and Yamanaka, 2006). Ретровирусы и лентивирусы интегрируют в геном хозяина, что обеспечивает высокий уровень экспрессии трансгена, эффективное заражение делящихся клеток, но при этом существует опасность инсерционного мутагенеза и активацию протоонкогенов, что может увеличить риск образования опухолей (Okita et al., 2007). 1.2.1. Характеристика лентивирусной векторной системы. Лентивирусная векторная система основана на вирусе иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), хорошо изученном патогенном вирусе человека. Она обладает рядом свойств, делающих её удобной для доставки генов, таких как широкий тропизм клеток-мишеней, способность заражать как делящиеся, так и не делящиеся клетки, отсутствие экспрессии вирусных белков после трансдукции, возможность доставки сложных генетических элементов, таких, как полицистронные или интрон-содержащие последовательности, безопасность и простота использования (Sakuma et al., 2012). При попытке разработать наиболее безопасную для использования векторную систему было разработано несколько поколений лентивирусных векторов (Ramezani et al., 2002), из которых наиболее часто используются векторы третьего поколения. 1.2.1.1. Геном вируса иммунодефецита человека-1. Геном ВИЧ-1 – одноцепочечная молекула РНК длиной приблизительно 9 тысяч пар оснований, кодирующая девять вирусных белков (Sakuma et al., 2012) (рис.1). Продукты экспрессии генов gag, pol и env – соответственно белки вирусного кора, ферменты для репликации вируса и вирусный поверхностный гликопротеин gp160. Белки генов tat и rev активируют вирусную транскрипцию, контролируют сплайсинг транскриптов и их экспорт в ядро. Четыре оставшихся гена кодируют вспомогательные белки Vif, Vpr, Vpu и Nef. Вирусный геном содержит длинные концевые повторы (LTR, long terminal repeats), необходимые для обратной транскрипции и интеграции вируса в геном, и сигнал упаковки «ψ». 14

Рис. 1. Схематическое изображение генома ВИЧ-1 (по Sakuma et al., 2012). Вирусный геном содержит структурные (gag, pol и env), регуляторные (tat и rev) и вспомогательные (vif, vpr, vpu и nef) гены и LTR. Белок-предшественник Gag состоит из матриксного белка (MA), белка капсида (CA), белка нуклеокапсида (NC) и белка p6. Белок-предшественник Gag-Pol содержит три ключевых фермента вирусной репликации – обратную транскриптазу (RT), интегразу (IN) и протеазу (PR). Белокпредшественник Env, или p120, разрезается протеазой на два белка, образующие субмембранную (SU) и трансмембранную (TM) субъединицы оболочки вирусной частицы. 1.2.1.2. Ранние векторы, основанные на ВИЧ-1. Самыми первыми лентивирусными векторами были вирусы, несущие трансгены и способные к репликации. Для безопасности использования была проведена серия модификаций, в результате которой геном ВИЧ-1 был разделён на две плазмиды: (i) плазмиду, содержащую геном ВИЧ-1 с делецией в гене env; (ii) плазмиду, экспрессирующую Env и не содержащую сигнала упаковки (Page et al., 1990). Такая конструкция позволяла производить вирусы, способные вызывать только один раунд инфицирования, так как в заражаемые клетки не попадал ген env, необходимый для формирования полноценной вирусной частицы. Продукт гена env, поверхностный гликопротеин gp160 процессируется на два белка, gp120 и gp41. Вместе они составляют субъединицу на поверхности вирусной частицы, играющий роль лиганда для молекул CD4, CXCR4 и CCR5. Таким образом, ВИЧ-1 может инфицировать только экспрессирующие их клетки: Т-лимфоциты, моноциты, макрофаги, дендритные клетки. Для повышения клеточного тропизма использовалось «псевдотипирование» лентивирусных векторов путём замены гликопротеина Env на гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (VSV-G, от vesicular stomatitis virus) (Akkina et al., 1996). VSV-G способен связываться с распространённым компонентом клеточной мембраны фосфатидилсерином, что дало векторам возможность заражать больший спектр клеток, включая клетки не млекопитающих (рыб). Также VSV-G значительно стабильней, чем белки env, что позволило получать при концентрировании ультрацентрифугированием большие титры вируса. 15

ис.2. Схематичное изображение генома векторов, основанных на ВИЧ-1(по Sakuma et al., 2012, с изменениями). (А) Первое поколение лентивирусных векторов содержало в «паковочной» плазмиде все вирусные гены, кроме env, а также LTR и ген целевого рекомбинантного белка под сильным промотором, такого как CMV. VSV-G находится на отдельной плазмиде. (Б) Во втором поколении лентивирусных векторов были удалены все вспомогательные вирусные белки. Так же, как и в первом поколении, VSV-G и целевой ген расположены на отдельных плазмидах. (В) В третьем поколении в дополнение к модификациям первых двух поколений ген rev вынесен на отдельную, четвёртую, плазмиду. 1.2.1.3. Первое поколение лентивирусных векторов. Для уменьшения вероятности случайного образования лентивирусов, способных к репликации, при использовании лентивиральной системы доставки трансгенов было создано так называемое первое поколение векторов. Геном ВИЧ-1 делился на три плазмиды: (i) плазмиду, содержащую гены gag, pol, а также гены регуляторных и упаковочных белков; (ii) плазмиду с VSV-G; (iii) плазмиду с целевыми рекомбинантными белками. Первые две плазмиды не содержали LTR и сигнала упаковки, которые позволили бы генам вирусных белков попасть в формирующиеся вирусные частицы. Таким образом, в клетках-мишенях будет экспрессироваться только трансгенные белки. Также разделение на три плазмиды значит, что для образования лентивирусов, способных к репликации, потребуется как минимум два события рекомбинации. 16

1.2.1.4. Второе поколение лентивирусных векторов. Вспомогательные вирусные белки Vif, Vpu, Vrp и Nef необходимы для эффективной вирулентности ВИЧ-1 in vivo. Например,Vif и Vpu нейтрализуют клеточные антивирусные факторы APOBEC3G и Tetherin, а Nef способствует деградации молекул MHC I и CD4 (Sakuma et al., 2012). Но в случае лентивекторов вспомогательные белки можно удалить без влияния на эффективность трансфекции. Таким образом, второе поколение лентивирусных векторов содержит всего четыре из девяти генов ВИЧ-1: gag, pol, tat и rev. 1.2.1.5. Третье поколение лентивирусных векторов. Регуляторные белки Tat и Rev абсолютно необходимы для репликации ВИЧ-1 (Terwilliger et al., 1988). Tat служит активатором и усилителем транскрипции вирусных генов, а Rev способствует ядерному экспорту вирусных транскриптов в ядро. Для повышения безопасности использования лентивекторной системы ген белка Rev встроен в отдельную плазмиду. Также достигнута независимость от Tat заменой промоторного региона в 5’-LTR в плазмиде с трансгеном на сильный промотор цитомегаловируса или респираторного синцитиального вируса. В третьем поколении лентивекторов используются четыре плазмиды: (i) плазмида с генами gag и pol; (ii) плазмида, экспрессирующая Rev; (iii) плазмида, экспрессирующая VSV-G; (iv) плазмида с трансгеном. Для формирования лентивирусов, способных к репликации, потребовалось бы как минимум три события рекомбинации, но даже в этом случае получившиеся вирусы не имели бы Tat и вспомогательных белков. 1.2.2. Использование лентивекторов в репрограммировании клеток. В лаборатории Йениша была разработана система репрограммирования на основе лентивирусов, дефектных по гену интегразы, которые не способны интегрировать в геном клеток. Первая лентивиральная кострукция несет последовательность, кодирующую саморазрезающуюся полицистронную конструкцию факторов OSKM под единым промотором тетрациклинового оператора. В данной конструкции все четыре репрограммирующих фактора разделены саморазрезающимися 2А пептидами, которые в проце сс е т рансляции поз воляют синт е з ироват ь сме сь соот вет ст вую щ их 17

транскрипционных факторов. В присутствии доксициклина с промотором связывается белок-трансактиватор, последовательность гена которого доставляется с помощью второго типа лентивирального вектора. В результате для активации экспрессии OSKM необходимо одновременное попадание только двух лентивирусов в клетку. Гетерогенность иПС клонов, полученных с помощью такой системы репрограммирования, значительно ниже (Carey et.al., 2009). 18

1.3. Искусственные хромосомы человека в генной терапии. Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток – одно из наиболее перспективных направлений в лечении заболеваний, вызванных дефектами экспрессии генов. В иПС клетки, полученные из соматических клеток больного, вносится нормальная копия гена, в результате чего происходит восстановление его функции. Доставка ДНК в плюрипотентные клетки возможна различными способами, и наиболее перспективный из них – использование искусственных хромосом. 1.3.1. Способы доставки генетического материала для генной терапии. Существует большое количество различных способов доставки генетического материала в клетку. Их можно условно разделить на две группы: с использованием плазмидных векторов или с применением линеаризованных молекул ДНК, кодирующих целевой ген. Идеальный вектор для доставки генетической информации должен удовлетворять ряду условий (по: Kouprina et. al., 2014): 1) возможность использования полноразмерных генов со всеми эндогенными регуляторными элементами; 2) возможность физиологической, нативной регуляции экспрессии гена; 3) стабильная долговременная экспрессия внесенного гена, без интеграции в геном либо регулируемая временная экспрессия; 4) высокая эффективность и специфичность трансфекции целевых клеток; 5) отсутствие риска раковой трансформации клеток и вызова иммунного ответа. 1.3.1.1. Вирусные системы доставки генетического материала. Наиболее распространенными вирусами, используемыми для передачи генетического материала, являются аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы (включая лентивирусы, способные интегрировать в геном хозяина) и лентивирусы (дефектные по интегразе). Аденовирусы являются вирусами с линейным двуцепочечным ДНК-геномом. Он не интегрируется в геном клетки-носителя, поэтому аденовирус не может эффективно заражать делящиеся клетки. Также есть ограничение на размер последовательности, 19

клонруемой в геном аденовируса (меньше, чем 10 Кб), что вызвано небольшим размером капсида. Но главным минусом в использовании аденовирусов является сильный и быстрый иммунный ответ при попадании вируса в клетку. Аденоассоциированные вирусы являются безоболочечными вирусами с линейным одноцепочечным ДНК-геномом. Они не являются автономными, для репликации и экспрессии вирусного генома и сборки капсида необходимо присутствие аденовируса или вируса герпеса. В отсутствии вирусов-помощников аденоассоциированные вирусы переходят в латентную фазу и могут интегрироваться в ядро клетки хозяина только по определенным сайтам девятнадцатой хромосомы. Возможно клонирование в вирусный вектор только небольших последовательностей (до 9 Кб). Вызывают умеренный иммунный ответ. Ретровирусы – вектор, наиболее часто применяемый для доставки генетического материала. Геном представлен одноцепочечной молекулой РНК. Происходит интеграция в геном клетки хозяина, что способствует устойчивой экспрессии трансгена. Но встраивание происходит преимущественно по сайтам, находящимся рядом с местами старта транскрипции в геноме клетки, что может приводить к инсерционному мутагенезу (Wu et. al., 2003). В стволовых и гематопоэтических клетках мыши наблюдается транскрипционный сайленсинг трансгена. Лентивирусы относятся к ретровирусам, но могут заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки благодаря интеграции в их геном. Лентивекторная система сконструирована на основе вируса иммунодефицита человека-1, но является непатогенной и безопасной для использования. Также были созданы лентивирусы, мутантные по гену интегразы, а потому не способные встраиваться в геном. Такие вирусы обеспечивают стабильную экспрессию трансгена в неделящихся клетках и временную – в делящихся (Wanisch and Yanez-Munoz, 2009). Лентивирусы, дефектные по интегразе на данный момент являются одними из наиболее перспективных вирусных систем доставки генетического материала. Главным недостатком всех вирусных систем доставки трансгенов является их малая емкость и возможность использования только кДНК гена без эндогенных регуляторных элементов (Kouprina et. al., 2013). При таких условиях невозможно достичь нативного контроля экспрессии гена. Таким образом, для успешной экспресии трансгенов в целевых клетках необходим вектор без ограничений по размеру клонируемой последовательности, стабильно экспрессирующийся как в делящихся, так и в неделящихся клетках, при этом без осуществления интеграции в геном и не вызывающий иммунный ответ. Векторной системой, обладающей этими свойствами, являются искусственные хромосомы. 20

1.3.2. Искусственная хромосома как вектор для доставки генетического материала. Искусственная хромосома человека (ИХЧ) - экзогенная мини-хромосома, которая стабильно поддерживается как дополнительная 47-ая хромосома без интеграции в хозяйский геном и инсерционного мутагенеза. Она содержит функциональный кинетохор и стабильно наследуется в ряду поколений. Искусственная хромосома позволяет клонировать неограниченные по размеру последовательности, гены со всеми регуляторными элементами, что делает данную векторную систему незаменимой для генной терапии заболеваний человека. 1.3.2.1. Методы конструирования искусственных хромосом. Существует две стратегии конструирования искусственных хромосом. Первая, так называемая “сверху-вниз” (“top-down”) стратегия – сборка искусственной хромосомы посредством теломер-ассоциированной фрагментации хромосом в клетках в клетках линии DT40 (линия B клеток курицы) (Farr et. al., 1992). Клетки DT40 с внесенной человеческой хромосомой трансфецируют линейным вектором с последовательностями клонированной теломерной ДНК (TTAGGG)n и сайтов гомологичной рекомбинации. Посредством рекомбинации происходит последовательное укорочение плечей хромосомы до образования линейной минихромосомы размером 0.5-10 Мб с функциональной центромерой, которая стабильно наследуется в делящихся мышиных и человеческих клетках. Далее в хромосому вносят сайты рекомбинации, например, loxP, для клонирования генов в конструкцию. Наиболее передовой ИХЧ, сконструированной подобным образом, является 21ΔpqHAC, построенная на основе 21 хромосомы человека. Она характеризуется полностью изученной структурой, наличием пяти рекомбинантных платформ (jC3 1 attP, R4 attP, TP901-1 attP, Bxb1 attP и FRT) и гена тимидин-киназы, с помощью которой при добавлении в среду ганцикловира происходит индуцированная элиминация клеток, несущих эту искусственную хромосому (Kazuki et. al., 2011; Yamaguchi et. al., 2011). Вторая стратегия, “снизу-вверх” (“bottom-up”), основана на de novo построении искусственной хромосомы из повторяющихся последовательностей альфа-сателлитной (альфоидной) ДНК или высокоупорядоченных повторов (high organized repeats, HOR). Чаще всего используют альфа-сателлитную ДНК хромосомы 17, содержащую 21

последовательность связывания центромерного белка B (CENP-B box) и слитую с последовательностью тетрациклинового оператора (tet-O). Последовательность тетрациклинового оператора полностью синтетическая. Она основана на альфоидной Д Н К , в к о т о р о й CENP-B связывающие последовательности заменены на последовательности, кодирующие тетрациклиновый оператор. Данный димер амплифицируется по механизму катящегося кольца in vitro до фрагментов размером 5-10 Кб. В процессе последующих модификаций в клетках Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli и клетках линии HT1080 (клетки фибросаркомы) в конструкцию вводятся маркер HIS3 для позитивной селекции, ген устойчивости к бластицидину для селекции в клетках млекопитающих и нормальный кинетохор при образовании комплекса CENP-B и CENP-A белков на последовательностях, связывающих CENP-B. В результате образуется стабильно наследуемая в ряду поколений искусственная хромосома человека (tet-OHAC) размером 1-5 Мб, содержащая множество раз повторяющиеся последовательности тетрациклинового оператора и альфоидной ДНК, на которой может собираться кинетохорный комплекс. В искусственную хромосому вносят loxP сайт для осуществления Cre-Lox опо средованной рекомбинации при клонировании в конструкцию терапевтического гена (Kouprina et. al., 2014). Одним из главных плюсов альфоидной тетрациклиновой искусственной хромосомы является возможность ее индуцибельной потери в ходе клеточных делений. В последовательность ИХЧ был введен ген, кодирующий тетрациклиновый репрессор, находящийся под промотором, активируемым доксициклином. При добавлении доксициклина в среду синтезируется белок, который связывается с последовательностями тетрациклинового оператора, находящимися во всех участках искусственной хромосомы. При взаимодействии оператора с репрессором последний физически закрывает доступ белкам кинетохора к сайтам CENP-B связывающей последовательности. Формирования кинетохора не происходит, и при следующем делении нити веретена деления не прикрепляются, что приводит элиминации ИХЧ (Nakano et. al., 2008). Для клонирования генов в ИХЧ в основном используют линию клеток CHO (chinese hamster ovary, клетки яичника китайского хомячка; Puck et.al., 1958). В них вносят конструированную искусственную хромосому с loxP сайтом, плазмиду, несущую целевой ге н с с е л е кт и в н ы м и м а р ке р а м и и loxP сайтом, и плазмиду, содержащую по сл едоват ель но ст ь , которая кодирует Cre- р е ком б и н а зу. П р оход и т Cre-Lox опосредованная рекомбинация, в результате которой происходит клонирование в искусственную хромосому по loxP сайту всей челночной плазмиды (Saffery and Choo, 2002). 22

Для переноса ИХЧ из СНО клеток в целевые клетки используют метод переноса хромосом посредством образования микроклеток (microcell mediated chromosome transfer, MMCT) (Fournier and Ruddle, 1977). В основе метода лежит центрифугирование клеток, несущих ИХЧ, на стадии метафазы, в результате чего образуются микроклетки, каждая из которых представляет собой отдельную хромосому, окруженную липидной мембраной. Затем происходит слияние микроклеток с целевыми клетками при помощи полиэтиленгликоля (Yang and Shen, 2006). 23

1.4. Генетическая терапия гемофилии А. Гемофилия А (Hemophilia A, HA) – наиболее распространённый дефект свёртывания крови, классическая рецессивная, связанная с Х-хромосомой болезнь, которая может наследоваться или быть вызванной спонтанной мутацией. Она встречается преимущественно у мужчин (1 из 5 000-10 000 во всех популяциях) (Bi et al., 1995), но может проявляться и у женщин-носительниц в результате различной инактивации Ххромосом. До 70% пациентов с HA демонстрируют угрожающий жизни фенотип, имея меньше чем 1% от нормального уровня активности FVIII в плазме крови (Porada et al., 2014). Такие пациенты страдают от частых спонтанных кровотечений, приводящих к гематомам, хроническим болезненным заболеваниям суставов и потенциально угрожающему жизни внутреннему кровотечению. 1.4.1. Фактор свёртываемости крови VIII. Ген фактора свёртываемости крови VIII 186 kb длиной, содержит 26 экзонов, кодирующих белок длиной 2 332 аминокислот. 35% мутаций, приводящих к HA, вызваны двумя событиями инверсии, вызванными рекомбинацией между непарными гомологичными последовательностями, расположенными в интроне FVIII, во время мейоза у мужчин. Оставшиеся 65% - разнообразные точечные мутации и делеции ( Bi et al., 1995). 1.4.1.1. Участие FVIII в каскаде коагуляции. Фактор свёртываемости крови VIII является кофактором для активированным фактора IX (FIXa) и, будучи протеолитически активированным, взаимодействует с FIXa, образует нековалентный комплекс, который связывает и активирует фактор X (FX) (Orlova et al., 2013). Клеточный источник FVIII остаётся спорным. Исторически считалось, что, как и многие белки свёртывания крови, FVIII продуцируется в печени (Bontempo et al., 1987). Но было показано, что также случается его синтез за её пределами – вовлечены такие органы, как лёгкие, селезёнка, лимфатические ткани (Hollestelle et al., 2001). По некоторым данным, основным источником FVIII являются клетки эндотелия сосудов, так как элиминация продукции FVIII в них приводила к развитию у мышей тяжёлого фенотипа HA. (Fahs et al., 2014) 24

1.4.2. Современная терапия гемофилии А. Современное обычное лечение HA – регулярное профилактическое внутривенное вливание рекомбинантного или полученного из донорской плазмы фактора крови FVIII. Такая терапия хоть и значительно улучшает качество жизни больных, но, тем не менее, далека от идеальной. Так как время полужизни FVIII в крови составляет 10-12 часов (Lee et al., 2005), пациенты вынуждены 2-3 раза в неделю получать вливание, что может обходиться в до 300 000$/год. У 30% людей, получивших доступ к лечению, происходит выработка антител против FVIII и развивается иммунный ответ. В лучшем случае это приводит к снижению эффективности терапии, в худшем – к её неуспеху, предотвращающему восстановление системы гемостаза и создающему риск угрожающего жизни кровотечения. Эти значительные недостатки существующей терапии демонстрируют необходимость разработки способов долговременного лечения или перманентного исцеления. На это может быть способна генетическая терапия HA. Несколько аспектов этого заболевания делают его идеальным для подобной коррекции. Во-первых, для терапевтического эффекта нет необходимости в экспрессии FVIII в специфической ткани или клеточном типе, в отличие от белков многих других генетических заболеваний. Вовторых, FVIII циркулирует в плазме крови в небольших количествах (200 нг/мл), и восстановление хотя бы 3-5% от нормального уровня FVIII в плазме крови вызовет значительное улучшение качества жизни пациентов с тяжёлой HA, сделав их фенотип средним. В то же время, даже уровни в 150% от нормального содержания FVIII безопасны. Таким образом, у FVIII очень широкое терапевтическое окно (Kay and High, 1999).. Было разработано несколько модельных объектов для изучения способов лечения расстройств свёртывания крови, таких как овцы, собаки и крысы со спонтанной мутацией в гене FVIII, мыши с нокаутированным геном FVIII (Lozier et al., 2013). 25

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 2.1. Линии клеток и среды. HEK293T (human embryonic kidney) – иммортализованные клетки эмбриональной почки человека, использовались для продукции лентивирусов. Данные клетки культивировали в стандартной культуральной среде для эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ-среда): DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) (Gibco, США), 10% фетальная коровья сыворотка (Gibco, США), 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкл/мл стрептомицина (Gibco, США), 2мМ L-глютамина (Gibco, США). Первичные FVIII- / - фибробласты мышей получали из хвостов взрослых особей мыши, культивировали в стандартной МЭФ-среде. Индуцированные плюрипотентные стволовые FVIII-/- клетки мыши культивировали на полной среде для эмбриональных стволовых клеток мыши (mES-среда): KnockOut DMEM (Gibco, США), 15% фетальная коровья сыворотка (Sigma, Германия), 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкл/мл стрептомицина (Gibco, США), 2мМ L-глютамина (Gibco, США), 50мкМ β-меркаптоэтанола (Sigma, Германия), активная концентрация ингибирующего фактора лейкемии (leukemia inhibitory factor, LIF). 2.2. Получение первичных фибробластов мыши. В работе были использованы гомозиготные мыши, мутантные по гену фактора коагуляции VIII, B6;129S-F8tm1Kaz/J (The Jackson Laboratory). Взрослым особям возраста 5-10 месяцев проводили резекцию кончика хвоста, который обрабатывали 70% раствором этанола и несколько раз отмывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (Биолот, РФ). С помощью хирургического скальпеля хвост измельчали, фрагменты помещали в 1 мг/мл раствор коллагеназы IV (Sigma, США) в PBS, инкубировали при 37оС 15 минут. Ткани отмывали в PBS, после центрифугирования (1200 об/мин, 3 мин) инкубировали в 0,05% раствором трипсина/EDTA (Gibco, США) при 37оС 20 минут. Затем добавляли равный объём полной МЭФ-среды для ингибирования действия трипсина. Содержимое интенсивно перемешивали, центрифугировали при 1200 об/мин, 3 мин. К осаждённым клеткам добавляли МЭФ-среду с 0,25 мкг/мл фунгизоном (амфотерицин В, Invitrogen, США), ресуспендировали, переносили на 6 см культуральную чашку (Eppendorf, Германия). Полученные соматические фибробласты оставляли в инкубаторе при 37 оС и 5% СО2 на 2-4 дня. Плотность фибробластов, прикрепившихся к поверхности чашки, 26

оценивали визуально с помощью световой микроскопии (микроскоп Carl Zeiss Axiovert40). При достижении клетками плотности 70-90% монослоя фибробласты пассировали на две новые 6 см культуральные чашки. 2.3. Трансфекция клеток кальций-фосфатным методом. За день до трансфекции клетки линии HEK293T рассевали в плотности 4×10 6 на 10 см культуральную чашку в МЭФ-среде. За 2 ч до трансфекции клеткам меняли среду на стандартную DMEM. Смешивали 87.5 мкл 2М CaCl2 (Sigma, Германия), 32.5 мкл ТЕ, необходимое количество плазмидной ДНК и доводили стерильной H2O до 600 мкл. В полученный раствор по каплям добавляли 600 мкл 2-кратного буфера HBS (280 мМ NaCl, 100 мМ Hepes, 1.5 мМ Na2HPO4; 7.11≤pH≤7.13). Полученную смесь оставляли на 15 мин при комнатной температуре для образования преципитата, который затем по каплям добавляли к клеткам. В течение ночи инкубировали при 37°C и 5% CO2. Через 18 часов среду меняли на стандартную МЭФ. 2.4. Сборка вирусных частиц в HEK293T клетках. Для репрограммирования фибробластов использовали лентивирусные векторы tetO-FUW-OSKM и FUW-M2rtTA (Carey et al., 2009). Для сборки вирусных частиц проводили кальций-фосфатную трансфекцию клеток л и н и и HEK293T плазмидами pMD2G (кодирует белки оболочки вируса), pCMVdR8.74PAX2 (кодирует белки, необходимые для сборки вирусной частицы) (Wiznerowicz and Trono, 2003) и целевым вектором tetO-FUW-OSKM или FUW-M2rtTA. На следующий день после трансфекции клеткам меняли среду. В течение двух последующих дней собирали супернатант, содержащий вирусные частицы. Затем полученный супернатант фильтровали через целлюлозо-ацетатные фильтры 0,45 мкм (Millipore, Германия). Вирусные частицы концентрировали при помощи ультрацентрифугирования (Backman, ротор SW-32-Ti, США) при 47000g, 16°C в течение 2 ч. Осаждённые вирусы растворяли в бессывороточной среде OptiMEM (Gibco, США) и хранили в 50 мкл аликвотах при -80°C. 27

2.5. Титрование вирусных частиц. За день до заражения клетки HEK293T высевали на 24-луночный планшет в количестве 5x104 клеток на лунку в МЭФ-среде. На следующий день вирусы tetO-FUWOSKM и FUW-M2rtTA, растворенные в среде OptiMEM, добавляли в количестве 10, 40 и 60 мкл каждого вируса на лунку 24 луночного планшета, и доводили объем до 250 мкл на лунку. На следующий день отбирали среду содержащую вирус и в каждую лунку добавляли по 1 мл МЭФ- среды, содержащей 5 мкг/мл доксициклина (Gibco, США). Через 72 часа после заражения клетки фиксировали 4% параформальдегидом и проводили иммуноцитохимическое окрашивание на белок Oct4, закодированный в лентивирусном векторе tetO-FUW-OSKM. После окрашивания рассчитывали титр вирусных частиц, TU/мл (TU = transforming units). Для этого подсчитывали процент светящихся клеток и, зная число клеток в лунке на момент заражения, определяли количество активных вирусных частиц, содержащихся в миллилитре. Для определения титра вирусов, несущих tetO-FUW-OSKM и FUW-M2rtTA, использовали три повторности объёмов каждого вируса (10, 40, 60 мкл) (9 комбинаций). Для подсчета величины TU/мл брали наименьший объем, при добавлении которого было инфицировано 50% клеток. Из трех значений TU/мл для трех повторностей при использовании данного объёма, вычисляли среднее арифметическое и принимали это за титр вируса. Например: 10 мкл вирусного супернатанта заражало 50% клеток (окрашенные клетки) из исходного количества 5x104 клеток, то есть 2,5х104 клеток инфицировано. Значит, 1 мкл стока вируса содержит 2,5х10 4 /10= 2500 вирусных частиц. Таким образом, титр вируса составляет 2500 TU/мкл или 2,5х106 TU/мл. 2.6. Получение индуцированных плюрипотентных клеток мыши. За сутки до заражения лентивирусами фибробласты высевали в количестве 1,5×10 4 клеток на лунку 6-луночного планшета в стандартной МЭФ-среде. На следующий день среду удаляли и добавляли 600 мкл свежей МЭФ-среды и лентивирусы, содержащие tetOFUW-OSKM и FUW-M2rtTA, в ранее найденном объёме, позволяющем инфицировать 70100% клеток. Через 8 часов после заражения к клеткам добавляли 800 мкл МЭФ-среды. Через 16 часов меняли среду на свежую. На третий день после заражения среду меняли на полную для эмбриональных стволовых клеток мыши (mES) с добавлением 5 мкг/мл доксициклина (Gibco, США), что необходимо для индукции экспрессии Oct4, Sox2, Klf4 и 28

c-Myc, ключевых генов репрограммирования. В течение четырёх дней клетки культивировали на mES-среде с доксициклином, каждый день меняя её на свежую. На пятый день клетки переносили на 10-сантиметровые чашки Петри, покрытые митомицининактивированными эмбриональными фибробластами и культивировали в mES-среде с доксициклином (5 мкг/мл). В течение последующих двух недель каждый день или через день среду меняли на свежую с добавлением доксициклина. При появлении морфологически отличимых колоний (12-14 день после пересадки фибробластов на 10 см чашки Петри), индивидуальные колонии собирали и переносили в лунки 96-луночного планшета предварительно покрытые митомицин-инактивированными эмбриональными фибробластами. Для этого среду меняли на PBS, захватывали индивидуальные клоны пипеткой и переносили в лунки, содержащие 10 мкл 0.05%-ного раствора трипсина-ЭДТА. Клетки инкубировали 10 мин с 0.05%-ным раствором трипсинаЭДТА при 37°C, после чего добавляли среду, содержащую сыворотку, тщательно ресуспензировали до одноклеточного состояния и переносили весь объем суспензии в лунки 96-луночного планшета, покрытые митомицин-инактивированными фибробластами. Далее клетки культивировали на mES-среде с доксициклином, меняя её через день. Затем клетки последовательно растили в лунках 48- и 6-луночных планшетов без добавления доксициклина, покрытых митомицинин-инактивированными фибробластами. После достижения 80% покрытия площади поверхности, клетки переносили на 10-сантиметровые чашки Петри, покрытые 0.1% желатином (Sigma Aldrich, США). После нескольких пассажей часть клонов анализировали, а часть замораживали для хранения в среде, содержащей 80% mES-среды, 10% FBS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) (Amresco, США). Эффективность репрограммирования фибробластов вычисляли как отношение количества образовавшихся колоний иПС к общему числу фибробластов, прошедших репрограммирование (4 колонии/1×10 4 клеток = 0.04%) . 2.7. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток, находящихся в культуре. За два дня до окрашивания полученные иПС-клетки высевали в количестве 4×10 3 на лунку 24-луночного планшета. Через два дня клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида (ПФА) в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего промывали PBS. Для пермеабилизации мембран клетки 15 минут инкубировали в 0 , 1 % Triton X-100 (Sigma Aldrich, США) и промывали PBS. Для блокирования неспецифического связывания клетки инкубировали в PBS, содержащем 0,1% Tween20 29

(SigmaAldrich, США), 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Roche, Швейцария) и 2% овечьей сыворотки (Jackson ImmunoResearch, CША) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки промывали 0,1% раствором Tween 20 в PBS-T. Первичные моноклональные антитела мыши к фактору Oct4 (Santa Cruz, США) разводили в растворе PBS-T и инкубировали клетки в течение 12 часов при +4° C. После чего клетки промывали 5 раз раствором PBS-Т с интервалом 5 мин и инкубировали их с вторичными антителами, специфичными к иммуноглобулинам мыши и конъюгированными с флюорофором Alexa488 (Jackson ImmunoResearch, CША) в PBS-Т в течение 1 часа при комнатной температуре, затем 5 раз промывали PBS-Т. Для визуализации ядер клеток к ним добавляли раствор 1 мкг/мл DAPI в PBS. Далее клетки анализировали с помощью флюоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axiovert40. Для оценки эффективности окрашивания подсчитывали отношение количества флюоресцерующих в зеленой части спектра клеток к общему количеству клеток в поле зрения, которое считали по флюоресценции DAPI. Подсчёт для каждого клона проводили в трех повторностях, затем вычисляли среднее арифметическое, отражающее долю клеток, экспрессирующих OCT4 и выражали эффективность в процентах. 2.8. Тест на формирование тератом иПС клетками и приготовление препаратов. Полученные индуцированные плюрипотентные клетки культивировали в культуральных чашках, один раз отмывали PBS и готовили аликвоту от 1×10 6 до 5×106 клеток в 100 мкл PBS. Взрослым мышам линии NU/J (The Jackson Laboratory, США) вводили 100 мкл клеточной суспензии подкожно в верхнюю часть задней конечности. Через 6 недель образовавшиеся опухоли вырезали и фиксировали 4% раствором ПФА в PBS. Образцы дегидратировали в этаноловом спирте, постепенно повышая его концентрацию в растворе (70% - 80% - 96%), затем переносили в изобутанол и в его смеси с парафином в следующей последовательности: изобутанол:парафин (2:1), изобутанол:парафин (1:1), изобутанол:парафин (1:2), затем дважды отмывали в чистом парафине и инкубировали при +60°C в течении ночи. На следующий день тератомы заливали парафином в специальные формы, охлаждали и делали срезы толщиной 7-10 мкм с помощью микротома (Reichert, Австрия). 30

2.8.1. Окрашивание препаратов тератом гематоксилин-эозином. Препараты отмывали от парафина в ксилоле 2 раза по 5 минут, а затем в серии спиртов нисходящей концентрации (96%-80%-70% ) один раз по 5 минут, промывали водой и инкубировали в растворе гематоксилина (Sigma, США) 20 минут. Затем срезы промывали водой и окрашивали эозином в течение 1 минуты. После этого промывали водой и дегидратировали в той же серии спиртов, но в обратном порядке: от 70% этанола к ксилолу. Окрашенные срезы покрывались заключающим раствором (“Histomount Mounting Solution”, Life Technologies, США) и покровными стёклами. 2.8.2. Иммуногистохимическое окрашивание полученных опухолей на маркер энтодермы альфа-фетопротеин. Препараты отмывали от парафина в ксилоле 2 раза по 5 минут, а затем в серии спиртов нисходящей концентрации (96%-80%-70%) один раз по 5 минут и промывали водой. Затем заливали цитратным буфером (состав 10х буфера: 100 мМ лимонной кислоты, NaOH до pH 6.0) и автоклавировали 20 минут при 121 оС. После этого для блокировки неспецифичного связывания препараты инкубировали в PBS, содержащем 0,1% Tween20 (SigmaAldrich, США), 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Roche, Швейцария) и 2% овечьей сыворотки (Jackson ImmunoResearch, CША) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки промывали 0,1% раствором Tween 20 в PBS-T. Первичные моноклональные антитела козы к альфа-фетопротеину (Santa Cruz, США) разводили в растворе PBS-T, содержащем 0,1% Tween20 (SigmaAldrich, США), 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Roche, Швейцария) и 2% овечьей сыворотки (Jackson ImmunoResearch, CША), и инкубировали клетки в течение ночи при +4°C. На следующий день препараты промывали дистиллированной водой 3 раза с интервалом 5 мин и заливали перекисью водорода на 15 минут. Затем препараты инкубировали с вторичными антителами, специфичными к иммуноглобулинам козы и конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение 2 ч при комнатной температуре. После препараты промывали дистиллированной водой 3 раза с интервалом 5 мин и наносили смесь субстрата для пероксидазы 3,3'-диаминобензидин (DAB) и пероксида водорода, инкубировали в течение 1 минуты и при появлении признаков сигнала промывали дистиллятом. Затем препараты окрашивали гематоксилином и заключали по вышеописанной методике. 31

3. РЕЗУЛЬТАТЫ. На первом этапе создания геннотерапевтической модели мыши с использованием искусственной хромосомы человека, несущей нормальный ген FVIII, необходимо получить и охарактеризовать индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки. 3.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток из первичных фибробластов мышей линии FVIII-/-. 3.1.1. Наработка лентивирусных векторов с индуцируемой экспрессией репрограммирующих факторов. Для репрограммирования клеток использовали систему лентивирусных векторов, разработанную в лаборатории Рудольфа Йениша (Rudolf Jaenisch). Она состоит из двух типов лентивирусов. Первый вирус, 4F2A, несет лентивирусный вектор tetO-FUW-OSKM (Lois et.al., 2002), в который клонированы гены Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, разделенные последовательностями “саморазрезающихся” пептидов 2 A. Эта полицистронная конструкция находится под контролем минимального промотора тетрациклинового оператора (tetOP). Второй вирус, rtTA, необходим для активации экспрессии факторов репрограммирования. Он содержит по следовательно сть тетрациклинового трансактиватора (rtTA), который находится под контролем промотора гена убиквитина и экспрессируется конститутивно. В присутствии доксициклина в среде, белок rtTA связывается с минимальным промотором тетрациклинового оператора, что обуславливает форсированную сверхэкспрессию Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc (Carey et.al., 2009). Схема лентивирусной системы для репрограммирования представлена на рисунке 3. Для упаковки лентивирусов использовали плазмиды pCMVdR8.74PAX2, кодирующую белки, необходимые для сборки вирусной частицы, и pMD2G, кодирующую белки вирусной оболочки (Wiznerowicz and Trono, 2003). 32

Рис. 3. Схема генетических конструкций вирусов 4F2A и rtTA (по Carey et.al., 2009, с изменениями). M2-rtTA - последовательность тетрациклинового трансактиватора. h-UB – промотор гена убиквитина, обеспечивает конститутивную экспрессию последовательности, кодирующей rtTA. tetOP - промотор тетрациклинового оператора. P2A, F2A, E2A – “саморазрезающиеся” пептиды. LTR – длинные концевые повторы. . Далее определяли титр вирусов 4F2A и rtTA на культуре клеток HEK293T, который составил 4,5×104 TU/мкл. Для обоих вирусов титр единый, так как экспрессия генов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc возможна только в присутствии трансактиватора rtTA и доксициклина, которые вместе активируют минимальный промотор тетрациклинового оператора. 3.1.2. Репрограммирование фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Первичные фибробласты получали из тканей хвоста мышей линии FVIII-/-. После второго пассажа фибробласты одновременно заражали вирусами 4F2A и rtTA. На следующий день после заражения клетки начинали культивировать на mES-среде с доксициклином. Через 3-4 дня после заражения клетки переносили и культивировали на подложке из митомицин-инактивированных эмбриональных фибробластов мыши на mESсреде с доксициклином (5 мкг/мл). В последующие дни в популяциях фибробластов наблюдались значительные изменения в морфологии и пролиферации. Морфология, характерная для эмбриональных стволовых клеток, то есть округлая форма и малое ядерно-цитоплазматическое соотношение, указывает на успешный процесс репрограммирования (Takahashi and Yamanaka, 2006). Подобные клеточные колонии были обнаружены на 10 день (рис.4). На 12-16 день индивидуальные колонии были перенесены 33

в лунки микропланшета, заранее покрытые митомицин-инактивированными эмбриональными фибробластами. Рис. 4. Изменения в морфологии клеток в процессе репрограммирования. (а) Первичные FVIII-/- фибробласты мыши. (б) Индуцированные плюрипотентные стволовые FVIII-/- клетки на 12 день после начала селекции на доксициклине. Индивидуально отобранные клоны в дальнейшем культивировали на среде без добавления доксициклина, в результате чего плюрипотентные свойства клеток поддерживались за счет экспрессии всех эндогенных факторов, учавствующих в репрограммировании. Всего было отобрано четыре FVIII-/- иПС клона. Полученные репрограммированные клетки культивировали до двенадцати пассажей на среде без добавления доксициклина. Наблюдались некоторые незначительные отличия между клонами по интенсивности пролиферации и морфологическим особенностями клеток. Так, наиболее быстро делящимися являлись клоны №1 и №2. (табл. 1). Полученные в ходе репрограммирования первичных FVIII-/- фибробластов клоны стабильно поддерживались в культуре без добавления в клеточную среду доксициклина и обладали морфологическими свойствами, характерными для иПС клеток. 34

Табл. 1. Характеристики полученных FVIII-/- иПС клонов по ростовым показателям. FVIII-/- иПС клон, № 1 2 3 4 Ростовые показатели клонов ++ ++ + + Примечания. + - деление клеток наблюдалось, ++ - более интенсивное деление клеток по сравнению с другими клонами. 3.2. Доказательство плюрипотентного статуса полученных FVIII-/- иПС клеток мыши. 3.2.1. Анализ экспрессии Oct4 в полученных иПС FVIII-/- клетках. Одной из характерных особенностей плюрипотентных клеток является экспрессия стволовых транскрипционных факторов, таких как Oct4 (Томилин А.Н., 2009). Мы провели иммуноцитохимический анализ всех четырёх полученных FVIII-/- иПС клонов. Наличие экспрессии Oct4 в клонах выявляли с помощью специфичных к Oct4 моноклональных антител мыши и вторых антител против иммуноглобулинов мыши, меченных флюорофором FITC, длина волн эмиссии которого соответствует зеленой части спектра. Для анализа брали только клетки клона №2. Снимки окрашенных иПС клеток представлены на рисунке 3. 35

Рис. 3. Результат иммуноцитохимического окрашивания FVIII-/- иПС клонов на маркер стволовых клеток Oct4. ( а) Иммуноцитохимическое окрашивание на Oct4 , FITC (зеленый); (б) Окраска ДНК, DAPI (синий); (в) Совмещение изображений, показывающее ядерную локализацию Oct4. Клетки клона №2. 36

Табл. 2. Характеристики полученных FVIII-/- иПС клонов по экспрессии Oct4. FVIII-/- иПС клон, № 1 2 3 4 Экспрессия Oct4 ? + ? ? Примечание. + - экспрессия Oct4 была детектирована; ? – клоны не анализировались. Клетки выбранного клона в большом количестве экспрессировали Oct4. Также была подтверждена его ядерная локализация. 3.2.2. Тестирование полученных иПС клонов на формирование тератом в мышах линии NU/J. Основным методом оценки плюрипотентных свойств репрограммированных клеток является тест на формирование тератом (Takahashi and Yamanaka, 2006; Okita et.al., 2007). Плюрипотентные клетки способны дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка) (Evans and Kaufman, 1981). Наличие производных всех трех зародышевых листков (экто-, мезо- и энтодермы), в образованных иПС клетками опухолях подтверждает плюрипотентную природу полученных клеток. Для анализа образования тератом мы использовали иммунодефицитных мышей линии NU/J. Мышам подкожно, в бедренную часть задней конечности вводили FVIII-/иПС клетки в количестве 1х10 6 клеток каждого клона. По прошествии месяца только клетки клонов №1 и №2 вызвали формирование тератом (табл. 3). 37

Табл. 3. Характеристики полученных FVIII-/- иПС клонов по образованию тератом. FVIII-/- иПС Инъекции иПС клеток Образование клон, № 1 2 3 4 NU/J мышам 1х106 /1 мышь 1х106 /1 мышь 1х106 /1 мышь 1х106 /1 мышь тератом + + - 3.2.3. Окрашивание срезов опухолей гематоксилин-эозином. Для визуализации клеток, находящихся в составе тератом, проводили окраску срезов опухолей гематоксилином. Гематоксилин связывается с молекулами ДНК, эозин связывается с внутри- и внеклеточными белками, что приводит к окраске цитоплазмы и экстраклеточных белков в красный цвет. На рисунке 4 представлен гистологический анализ срезов тератомы, полученной после инъекции иПС клеток клона №2. В тканях тератом мы смогли различить производные трёх зародышевых листков, энтодермы, мезодермы и эктодермы. Кишечный эпителий, в состав которого входят хорошо заметные бокаловидные клетки, является производным энтодермы. Хрящ – производное мезодермы. На препарате видно межклеточное вещество и лакуны с хондроцитами. Многослойный эпителий – производное эктодермы. 38

Рис. 4. Гистологический анализ срезов тератомы, образованной при инъекции FVIII-/иПС клеток (клон №2) NU/J мышам, окраска гематоксилин-эозином. 2 (а) Пример эндодермального зачатка – бокаловидный эпителий кишечника; (б) Мезодермальная ткань формирует хрящ; (в) Эктодермальная ткань представлена эпителием роговицы. 3.2.4. Иммуногистохимическое окрашивание опухолей на маркер энтодермы альфа-фетопротеин. Альфа-фетопротеин является маркером производных энтодермального зародышевого листка. На рисунке 5 представлен гистологический анализ срезов тератомы, полученной после инъекции иПС клеток клона №2. Иммуногистохимическое окрашивание показало локализацию альфа-фетопротеина в кишечном эпителии, который является производным энтодермы. Рис.5. Иммуногистохимический анализ срезов тератомы, образованной при инъекции FVIII-/- иПС клеток (клон №2) NU/J мышам. 40

Видно локализацию сигнала в клетках кишечного эпителия. 41

4. ОБСУЖДЕНИЕ. 4.1. Репрограммирование соматических клеток является низкоэффективным процессом. В данной работе репрограммирование соматических фибробластов проводили с помощью 4F2A и rtTA лентивирусов (Carey et.al., 2009). Главное достоинство данной системы – гены, кодирующие Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, находятся в пределах одной полицистронной последовательности, что убирает необходимость одновременного попадания четырех различных вирусов, каждый из которых несет по фактору, в одну клетку. Но при использование второго вируса, rtTA, все же снижает возможную эффективность репрограммирования, так как вероятность попадания двух вирусов в одну клетку уменьшается. Для увеличения числа клеток, в которых происходит запуск экспрессии генов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, можно использовать искусственную хромосому человека (ИХЧ) как вектор для доставки факторов репрограммирования. Такая ИХЧ была разработана в лаборатории Ошимуры (Hiratsuka et.al., 2011), но ее недостатком является невозможность индуцибельно элиминировать хромосому и экспрессию OSKM вме сте с ней. Сверхэкспрессия c-Myc может вызвать неконтролируемое деление клеток. Избежать онкотрансформации клеток возможно путем замены фактора c-Myc на Glis1, присутствие которого вместе с Oct4 , Sox2 и Klf4 также обеспечивает процесс репрограммирования (Maekawa et.al., 2011). Достигнутый нами процент получения иПС клеток не превышал 0.04%, что говорит о чрезвычайной низкой эффективности процесса. Были опубликованы две работы, описывавшие высокоэффективные системы репрограммирования. В лаборатории Ханна предложили использовать малую интерфирурующую РНК к Mbd3, кодирующему белок ком пл екс а ремоделирования хромат ина NuRD. В р а б о т е э ф ф е к т и в н о с т ь репрограммирования эмбриональных фибробластов мыши достигала около 100% ( Rais et.al., 2013). Позднее была опубликована работа, в которой показали, что снижение уровня экспрессии Mbd3, напротив, приводит к уменьшению количества полученных иПС клеток из нейральных стволовых клеток. А сверхэкспрессия данного гена вместе с Nanog приводит к более эффективному репрограммированию стволовых клеток, полученных из эпибласта (Dos Santos et.al., 2014). Mbd3 участвует в ремоделировании хроматина, возможно, влияние уровня его экспрессии на эффективность репрограммирования зависит 42

от типа клеток, из которых получают иПС клетки. Области, где находятся последовательности, кодирующие эндогенные факторы плюрипотентности, могут обладать различной степенью компактизации хроматина в разных типах исходных клеток. Поэтому, возможно, эффект экспрессии Mbd3 по-разному влияет на репрограммирование различных клеток. Высокой эффективности репрограммирования B-клеток (близкой к 100%), так же удалось добиться при совместной экспрессии факторов OSKM и C/EBPα (CCAAT/enhancer binding protein-α). Сверхэкспрессия C/EBPα приводит к релаксированию хроматина в области кодирования факторов плюрипотентности (Di Stefano et.al., 2014). Но подобного эффекта C/EBPα на других линиях клеток-предшественников еще не было показано. Использование низкомолекулярных химических соединений, ингибиторов метилтрансфераз и деацетилаз, может повышать эффективность репрограммирования, но не позволяет достичь 100% (Hou et.al., 2013). Использование специфических микроРНК также увеличивает процент полученных иПС клеток, но из-за большого количества мишеней могут наблюдаться побочные эффекты. На данный момент, поиск универсального фактора, который может специфически повысить эффективность репрограммирования до 100%, является одним из наиболее перспективных направлений изучения плюрипотентности. 4.2. Полученные иПС клоны гетерогенны. Из четырёх клонов иПС только для одного показана экспрессия Oct4. Наличие эндогенного Oct4 является одним из ключевых признаков плюрипотентности клеток (Томилин А.Н., 2009). Не все клетки иПС клона могут экспрессировать Oct4 при нормальном процессе репрограммирования (Li et. al., 2015). К тому же, использованные нами методы детекции могли обладать недостаточной чувствительностью для выявления сигнала, обусловленного экспрессией Oct4. При этом тератомы образовали как клетки клона №2, экспрессия эндогенного Oct4 для которого была показана, так и клетки клона №1, окрашивание которого на Oct4 не дало результатов. Для полного подтверждения плюрипотентных свойств полученных иПС клонов, необходимо несколько раз пассировать клетки в отстуствии LIF, который поддерживает недефференцированное состояние клеток в культуре. Если в результате такого культивирования мы сможем наблюдать производные всех трех зародышевых листков, то иПС клоны действительно обладают истинной плюрипотентностью. 43

7. ВЫВОДЫ. 1. Получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки мыши, дефектные по гену, кодирующему фактор VIII свёртываемости крови. 2. Полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки экспрессируют эндогенный фактор Oct4, и способны развиваться в ткани всех зародышевых листков, что свидетельствует о их полном репрограммировании и плюрипотентности. 44

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Томилин А.Н. 2009. Роль и механизм действия транскрипционного фактора Oct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих. Докторская диссертация. Санкт-Петербург. ИНЦ РАН. 111 с. 2. Akkina R.K., Walton R.M., Chen M.L., Li Q.X., Planelles V. and Chen I.S. 1996. Highefficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70 : 2581–2585. 3. Apostolou E., Hochedlinger K. 2013. Chromatin dynamics during cellular reprogramming. Nature. 502 : 462–471. 4. Bi L., Lawler A.M., Antonarakis S.E., High K.A., Gearhart J.D., Kazazian H.H. Jr. 1995. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nat Genet. 10(1) : 119-121. 5. Binder M.D., Hirokawa N., Windhorst U. 2009. Encyclopedia of Neuroscience. Berlin: Springer. 6. Bontempo F.A., Lewis J.H., Gorenc T.J., Spero J.A., Ragni M.V., Scott J.P., Starzl T.E. 1987. Liver Transplantation in Hemophilia A. Blood. 69(6) : 1721–1724. 7. Botquin V., Hess H., Fuhrmann G., Anastassiadis C., Gross M.K., Vriend G., Schöler H.R. 1998. New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2. Genes Dev. 12 : 2073–2090. 8. Carey B.W., Markoulaki S., Hanna J., Saha K., Gao Q., Mitalipova M., Jaenisch R. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. 2009. Proc Natl Acad Sci. 106 : 157-162. 9. Chen J., Liu J., Yang J., Chen Y., Chen J., Ni S., Song H., Zeng L., Ding K., Pei D. 2011. BMPs functionally replace Klf4 and support efficient reprogramming of mouse fibroblasts by Oct4 alone. Cell Res. 21 : 205-212. 10. Chen M., Zhang H., Wu J., Xu L., Xu D., Sun J., He Y., Zhou X., Wang Z., Wu L., Xu S., Wang J., Jiang S., Zhou X., Hoffman A.R., Hu X., Hu J., Li T. 2012. Promotion of the induction of cell pluripotency through metabolic remodeling by thyroid hormone triiodothyronine-activated PI3K/AKT signal pathway. Biomaterials. 33 : 5514-5523. 11. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A. & Eggan K. 2005. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science. 309 : 1369–1373. 12. David L., Polo J.M. 2014. Phases of reprogramming. Stem Cell Res. 12 : 754-761. 45

13. Di Stefano B., Sardina J.L., van Oevelen C., Collombet S., Kallin E.M., Vicent G.P., Lu J., Thieffry D., Beato M., Graf T. 2014. C/EBPα poises B cells for rapid reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature. 506 : 235-239. 14. Dos Santos R.L., Tosti L., Radzisheuskaya A., Caballero I., Kaji K., Hendrich B., Silva J. 2014. MBD3/NuRD Facilitates Induction of Pluripotency in a Context-Dependent Manner. Cell Stem Cell. 15 : 1-9. 15. Evans M.J., Kaufman M.H. 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 : 154-156. 16. Fahs S.A., Hille M.T., Shi Q., Weiler H., Montgomery R.R. 2014. A conditional knockout mouse model reveals endothelial cells as the principal and possibly exclusive source of plasma factor VIII. Blood. 123(24) : 3706-3713. 17. Farr C.J., Stevanovic M., Thomson E.J., Goodfellow P.N., Cooke H.J. 1992. Telomere-associated chromosome fragmentation: applications in genome manipulation and analysis. Nat Genet. 2 : 275–282. 18. Feng B., Jiang J., Kraus P., Ng J.H., Heng J.C., Chan Y.S., Yaw L.P., Zhang W., Loh Y.H., Han J., Vega V.B., Cacheux-Rataboul V., Lim B., Lufkin T., Ng H.H. 2009. Reprogramming of fibroblasts into induced pluripotent stem cells with orphan nuclear receptor Esrrb. Nat. Cell Biol. 11 : 197-203. 19. Gurdon J.B. 1962. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J Emb. Exp. Morphol. 10 : 622-640. 20. Hamasaki M., Hashizume Y., Yamada Y., Katayama T., Hohjoh H., Fusaki N., Nakashima Y., Furuya H., Haga N., Takami Y., Era T. 2012. Pathogenic mutation of ALK2 inhibits induced pluripotent stem cell reprogramming and maintenance: mechanisms of reprogramming and strategy for drug identification. Stem Cells. 30 : 2437-2449. 21. Hanna J., Saha K., Pando B., van Zon J., Lengner C.J., Creyghton M.P., van Oudenaarden A., Jaenisch R. 2009. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 : 595-601. 22. Hanna J., Wernig M., Markoulaki S., Sun C.W., Meissner A., Cassady J.P., Beard C., Brambrink T., Wu L.C., Townes T.M., Jaenisch R. 2007. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science. 318 : 1920–1923. 23. Hawkins K., Joy S., McKay T. 2014. Cell signalling pathways underlying induced pluripotent stem cell reprogramming. World J Stem Cells. 6 : 620–628. 24. Hiratsuka M., Uno N., Ueda K., Kurosaki H., Imaoka N., Kazuki K., Ueno E., Akakura Y, Katoh M., Osaki M., Kazuki Y., Nakagawa M., Yamanaka S., Oshimura M. 2011. Integration-free iPS cells engineered using human artificial chromosome vectors. PLoS One. 6 : e25961. 46

25. Ho R., Papp B., Hoffman J.A., Merrill B.J., Plath K. 2013. Stage-specific regulation of reprogramming to induced pluripotent stem cells by Wnt signaling and T cell factor proteins. Cell Rep. 3 : 2113–2126. 26. Hollestelle M.J., Thinnes T., Crain K., Stiko A., Kruijt J.K., van Berkel T.J., Loskutoff D.J., van Mourik J.A. 2001. Tissue distribution of factor VIII gene expression in vivo – a closer look. Thromb Haemost. 86(3) : 855-861. 27. Hou P., Li Y., Zhang X., Liu C., Guan J., Li H., Zhao T., Ye J., Yang W., Liu K., Ge J., Xu J., Zhang Q., Zhao Y., Deng H. 2013. Pluripotent Stem Cells Induced from Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds. Science. 341 : 651-654. 28. Kay M.A., and High K. 1999.Gene therapy for the hemophilias. Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A. 96 (18) : 9973–9975. 29. Kazuki Y., Hoshiya H., Takiguchi M., Abe S., Iida Y., Osaki M., Katoh M., Hiratsuka M., Shirayoshi Y., Hiramatsu K., Ueno E., Kajitani N., Yoshino T., Kazuki K., Ishihara C., Takehara S., Tsuji S., Ejima F., Toyoda A., Sakaki Y., Larionov V., Kouprina N., Oshimura M. 2011. Refined human artificial chromosome vector for gene therapy and animal transgenesis. Gene Ther. 18 : 384–393. 30. Kondoh H., Lleonart M.E., Nakashima Y., Yokode M., Tanaka M., Bernard D., Gil J., Beach D. 2007. A high glycolytic flux supports the proliferative potential of murine embryonic stem cells. Antioxid. Redox Signal. 9 : 293-299. 31. Kopp J.L., Ormsbee B.D., Desler M., Rizzino A. 2008. Small increases in the level of Sox2 trigger the differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 26 : 903-911. 32. Kouprina N., Earnshaw W.C., Masumoto H., Larionov V. 2013. A new generation of human artificial chromosomes for functional genomics and gene therapy. Cell. Mol. Life Sci. 70 : 1135– 1148. 33. Kouprina N., Tomilin A., Masumoto H., Earnshaw W.C., Larionov V. 2014. Human artificial chromosome-based gene delivery vectors for biomedicine and biotechnology. Expert Opin. Drug. Deliv. 7 : 11-17. 34. Lee C.A., Berntorp E.E., Hoots W.K., eds. 2005. Textbook of Hemophilia. Malden, MA: Blackwell. 35. Li C., Klco J.M., Helton N.M., George D.R., Mudd J.L., Miller C.A., Lu C., Fulton R., O'Laughlin M., Fronick C., Wilson R.K., Ley T.J. 2015. Genetic heterogeneity of induced pluripotent stem cells: results from 24 clones derived from a single C57BL/6 mouse. PLoS One. 10 : e0120585. 36. Li R., Liang J., Ni S., Zhou T., Qing X., Li H., He W., Chen J., Li F., Zhuang Q., Qin B., Xu J., Li W., Yang J., Gan Y., Qin D., Feng S., Song H., Yang D., Zhang B., Zeng L., Lai L., Esteban 47

M.A., Pei D. 2010. A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 7 : 51-63. 37. Liu X., Sun H., Qi J., Wang L., He S., Liu J., Feng C., Chen C., Li W., Guo Y., Qin D., Pan G., Chen J., Pei D., Zheng H. 2013. Sequential introduction of reprogramming factors reveals a timesensitive requirement for individual factors and a sequential EMT-MET mechanism for optimal reprogramming. Nat. Cell Biol. 15 : 829-838. 38. Lois C., Hong E.J., Pease S., Brown E.J., Baltimore D. 2002. Germline transmission and tissuespecific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 : 868-872. 39. Lozier J.N., Nichols T.C. 2013. Animal models of hemophilia and related bleeding disorders. Semin Hematol. 50(2) : 175-184. 40. Maekawa M., Yamaguchi K., Nakamura T., Shibukawa R., Kodanaka I., Ichisaka T., Kawamura Y., Mochizuki H., Goshima N., Yamanaka S. 2011. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 : 225-229. 41. Nakano M., Cardinale S., Noskov V.N., Gassmann R., Vagnarelli P., Kandels-Lewis S., Larionov V., Earnshaw W.C., Masumoto H. 2008. Inactivation of a human kinetochore by specific targeting of chromatin modifiers. Dev. Cell 14 : 507–522. 42. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. 2000. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24 : 372-376. 43. Okita K., Ichisaka T. & Yamanaka S. 2007. Generation of germ-line competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 : 313–317. 44. Okita K., Yamanaka S. 2011. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 366 : 2198-2207. 45. Orlova N.A., Kovnir S.V., Vorobiev I.I., Gabibov A.G., Vorobiev A.I. 2013. Blood Clotting Factor VIII: From Evolution to Therapy. Acta Naturae. 5(2) : 19-39. 46. Page K.A., Landau N.R. and Littman D.R. 1990. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64 : 5270–5276 47. Pallister C.J. and Watson M.S. 2010. Haematology. Scion Publishing. 336-347. 48. Pan G., Li J., Zhou Y., Zheng H., Pei D. 2006. A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal. FASEB J. 20 : 1730-1732. 49. Park S.J., Yeo H.C., Kang N.Y., Kim H., Lin J., Ha H.H., Vendrell M., Lee J.S., Chandran Y., Lee D.Y., Yun S.W., Chang Y.T. 2014. Mechanistic elements and critical factors of cellular reprogramming revealed by stepwise global gene expression analyses. Stem Cell Res. 12 : 730741. 50. Plath K., Lowry W.E. 2011. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat. Rev. Genet. 12 : 253-265. 48

51. Porada C. , Rodman C., Ignacio G., Atala A. and Almeida-Porada G. 2014. Hemophilia A: an ideal disease to correct in utero. Front Pharmacol. 5 : 1–12. 52. Rais Y., Zviran A., Geula S., Gafni O., Chomsky E., Viukov S., Hanna J. 2013. Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. Nature. 502 : 65-73. 53. Ramezani A., Hawley R.G. 2002. Overview of the HIV-1 lentiviral vector system. Curr Protoc Mol Biol. 16 : Unit 16.21. 54. Raya A., Rodríguez-Pizà I., Guenechea G., Vassena R., Navarro S., Barrero M.J., Consiglio A., Castellà M., Río P., Sleep E., et.al. 2009. Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. Nature. 460 : 53-59. 55. Saffery R., Choo K.H. 2002. Strategies for engineering human chromosomes with therapeutic potential. J Gene Med. 4 : 5-13. 56. Sakuma T., Barry M.A., Ikeda Y. 2012. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem. J. 443 : 603-618. 57. Samavarchi-Tehrani P., Golipour A., David L., Sung H.K., Beyer T.A., Datti A., Woltjen K., Nagy A., Wrana J.L. 2010. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-toepithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7 : 64-77. 58. Tada M., Tada T., Lefebvre L., Barton S.C. & Surani M.A. 1997. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. EMBO J. 16 : 6510–6520. 59. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 : 861-872. 60. Takahashi K., Yamanaka S. 2013. Induced pluripotent stem cells in medicine and biology. Development. 140 : 2457-2461. 61. Takahashi K.,Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 : 663–676. 62. Tanabe K., Nakamura M., Narita M., Takahashi K., Yamanaka S. 2013. Maturation, not initiation is the major roadblock during reprogramming toward pluripotency from human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 : 12172-12179. 63. Tang Y., Tian X.C. 2013. JAK-STAT3 and somatic cell reprogramming. JAKSTAT. 2 : e24935. 64. Terwilliger E., Burghoff R., Sia R., Sodroski J., Haseltine W. and Rosen C. 1988. The art gene product of human immunodeficiency virus is required for replication. J. Virol. 62 : 655–658. 65. Wakayama T., Perry A.C., Zuccotti M., Johnson K.R. & Yanagimachi R. 1998 Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 : 369–374. 49

66. Walia B., Satija N., Tripathi R.P., Gangenahalli G.U. 2012. Induced pluripotent stem cells: fundamentals and applications of the reprogramming process and its ramifications on regenerative medicine. Stem Cell Rev. 8 : 100-115. 67. Wanisch D., Yáñez-Muñoz K. 2009. Integration-deficient lentiviral vectors: a slow coming of age. Mol. Ther. 7 : 1316–1332. 68. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A. J. & Campbell K. H. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 385 : 810–813. 69. Wiznerowicz M., Trono D. 2003. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vectormediated drug–inducible RNA interference J. Virol. 77 : 8957–8961. 70. Wu D., Li Y., Crise K., Burgess F. 2003. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300 : 1749-1751. 71. Xu B., Zhang K., Huang Y. 2009. Lin28 modulates cell growth and associates with a subset of cell cycle regulator mRNAs in mouse embryonic stem cells. RNA. 15 : 357-361. 72. Yamaguchi S., Kazuki Y., Nakayama Y., Nanba E., Oshimura M., Ohbayashi T. 2011. A method for producing transgenic cells using a multi-integrase system on a human artificial chromosome vector. PLoS One. 6 : e17267. 73. Yang J., Shen M.H. 2006. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods Mol. Biol. 325 : 59–66. 74. Yokoo N., Baba S., Kaichi S., Niwa A., Mima T., Doi H., Yamanaka S., Nakahata T., Heike T. 2009. The effects of cardioactive drugs on cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biochem. and Bioph. Res. Com. 387 : 482–488. 50

БЛАГОДАРНОСТИ. Я благодарю своих научных руководителей, Сергея Анатольевича Синенко и Ирину Михайловну Спивак, за помощь и поддержку в процессе написания работы. Благодарю Алексея Николаевича Томилина, заведующего лабораторией, за возможность заниматься исследованиями. Я искренне признательна Михаилу Александровичу Лисковых за обучение методам работы, поддержку и вдохновение. Благодарю Елену Николаевну Толкунову, Игоря Борисовича Назарова, Сергея Вячеславовича Пономарцева, Александру Михайловну Кондрашкину и Андрея Александровича Кузьмина за бесценную помощь, поддержку и создание дружественной обстановки в коллективе. Также хотелось бы поблагодарить весь коллектив кафедры цитологии и гистологии. 51

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв