Получение рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3)

Евгений Кивилев

Получение рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3)

В рамках данной работы была получена генетическая конструкция, кодирующая ген белка модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3). Научно обоснована перспективность использования данной конструкции в качестве активной молекулы генотерапевтического лекарственного препарата для лечения мышечной дистрофии и карликовости. Синтезирован целевой белок в модельной культуре клеточной линии фибробластов.

Биотехнология

Диссертации

Вуз: Санкт-Петербургский государственный политехнический университет (ФГБОУ ВПО «СПбГПУ»)

ID: 5f3d1a40cd3d3e00014f05b8

UUID: 02002a80-c445-0138-1cdd-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: больше 4 лет назад

Просмотры: 313

27.06

Евгений Кивилев

Санкт-Петербургский государственный политехнический университет (ФГБОУ ВПО «СПбГПУ»)

Комментировать 5

Рецензировать 7

Скачать - 3,2 МБ

Поделиться работой

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого Институт биомедицинских систем и биотехнологий Высшая школа биотехнологий и пищевых производств Работа допущена к защите Руководитель ОП _________Н.В. Барсукова «___» июня 2020 г. ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННОГО ИНСУЛИН-ПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА (IGF-LR3) по направлению подготовки 19.04.01 Биотехнология Профиль 19.04.01_01 Бионанотехнология Выполнил студент гр. 4741901/80101 Е.В. Кивилев Руководитель доцент, к.т.н., доцент Е.Б. Аронова Консультант по нормоконтролю Н.В. Барсукова Санкт-Петербург 2020

РЕФЕРАТ На 85 с., 13 рисунков, 12 таблиц, 3 приложения. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, ИНСУЛИНПОДОБНЫЙ ФАКТОР РОСТА 1, IGF LR3, ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ. Тема выпускной квалификационной работы: «Получение рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3)». Данная работа посвящена созданию генетической конструкции, экспрессирующей синтез IGF-LR3 в клетках млекопитающих. Задачи, которые решались в ходе исследования: 1. Получение плазмиды, экспрессирующей целевой ген. 2. Создание рекомбинантного бактериального штамма для наработки полученной плазмидной конструкции в опытно-промышленном масштабе. 3. Получение модельной клеточной культуры-продуцента рекомбинантного белка IGF-LR3. Работа проведена на базе ФГУП ГНИИ Военной Медицины МО РФ при поддержке фирмы ООО «БИОССЕТ». В ходе экспериментов создана плазмида pcDNA3.1(+)-IGF-LR3, кодирующая целевой ген, а также рекомбинантный штамм Escherichia coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3. Проведены эксперименты по выделению плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 из бактерий. Получена рекомбинантная культура клеток фибробластов, несущая плазмиду pcDNA3.1(+)-IGF-LR3. На культуре клеток фибробластов продемонстрирована экспрессия целевого гена с получением белка IGF-LR3. В результате была разработана технология получения плазмидной конструкции pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 в опытно-промышленном масштабе, что может послужить основой для промышленной разработки генотерапевтического препарата.

ABSTRACT 85 pages, 13 figures, 12 tables, 3 appendices. KEYWORDS: RECOMBINANT DNA, INSULIN-LIKE GROWTH 1 FAСTOR, IGF LR3, GENE THERAPY. Theme of the graduate qualification work is “Preparation of recombinant DNA encoding the synthesis of the modified insulin-like growth factor (IGF-LR3)”. This work is devoted to the creation of a genetic construct expressing the IGFLR3 in mammalian cells. Tasks that were solved during this study: 1. Preparation of plasmid expressing the target gene. 2. Creation of recombinant bacterial strains for pilot scale production of target plasmid construction. 3. Preparation of model cell culture which were producing recombinant protein IGF-LR3. This work was carried out on the basis of the FSUE SRI Military Medicine of the Russian Federation Ministry of Defense with the support of the BIOSSET company. During the experiments, the plasmid pcDNA3.1 (+)-IGF-LR3 that encodes the target gene, as well as the recombinant Escherichia coli strain DH5α/pcDNA3.1 (+)IGF-LR3 was created. The plasmid pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 from bacteria was isolated. A recombinant fibroblast cell culture carrying the plasmid was obtained. In a fibroblast cell culture, expression of a target gene to produce IGF-LR3 protein has been demonstrated. As a result, a technology to obtain the plasmid construct pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 on a pilot scale was developed, which can serve as the basis for the industrial development of a gene therapy drug.

СОДЕРЖАНИЕ Введение ..................................................................................................................... 7 1. Аналитический обзор............................................................................................ 10 1.1. Характеристика IGF1 ......................................................................................... 10 1.2. Характеристика IGF-LR3 .................................................................................. 11 1.2.1. Перспективы применения IGF-LR3 .............................................................. 11 1.3. Обзор заболеваний, связанных с нарушением роста...................................... 12 1.4. Препараты на основе инсулин-подобного фактора роста 1 .......................... 13 1.5. Основные этапы разработки генотерапевтического препарата .................... 14 1.5.1. Подготовительный этап .................................................................................. 15 1.5.2. Выбор терапевтического гена ........................................................................ 15 1.5.3. Выбор пути введения ...................................................................................... 15 1.5.4. Подбор системы доставки гена ...................................................................... 16 1.5.5. Обеспечение клеточной специфичности (клеточный таргетинг) .............. 17 1.5.6. Экспрессия доставленного гена в клетках млекопитающих и человека 17 1.6. Системы доставки терапевтического гена....................................................... 18 1.7. Классификация невирусных методов доставки .............................................. 19 1.7.1 Физические методы доставки ......................................................................... 19 1.7.1.1. Микроинъекция ............................................................................................ 19 1.7.1.2. Биобаллистика ДНК ..................................................................................... 19 1.7.1.3. Электропорация ............................................................................................ 20 1.7.1.4. Сонопорация ................................................................................................. 21 1.7.1.5. Фотопорация ................................................................................................. 22 1.7.1.6. Магнитофекция ............................................................................................ 22 1.7.1.7. Гидропорация ............................................................................................... 22 1.7.2 Химические методы доставки......................................................................... 23 1.7.2.1 Неорганические частицы .............................................................................. 23 1.7.2.2. Синтетические и натуральные биоразлагаемые носители ...................... 24 1.8. Классификация вирусных методов доставки .................................................. 25 1.8.1. Аденовирусные векторы ................................................................................ 26 4

1.8.2. Аденоассоциированные вирусные векторы ................................................. 26 1.8.3. Ретровирусные векторы.................................................................................. 27 1.9. Выводы по литературному обзору ................................................................... 29 2. Материалы и методы исследования .................................................................... 30 2.1. Материалы исследования .................................................................................. 30 2.2. Перечень сырья и материалов исследования .................................................. 33 2.3. Методы исследования ........................................................................................ 35 2.3.1. Твердофазный синтез олигонуклеотидов ..................................................... 35 2.3.2. Сборочная полимеразно-цепная реакция ..................................................... 37 2.3.3. Очистка целевого гена колоночным методом.............................................. 37 2.3.4. Амплификация целевого гена методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) ........................................................................................................... 38 2.3.5. Реакция рестрикции-модификации ............................................................... 40 2.3.6. Лигирование фрагментов ДНК ...................................................................... 41 2.3.7. Приготовление компетентных бактериальных клеток для трансформации .......................................................................................................... 42 2.3.8 Трансформация бактериальных клеток методом электропорации ......... 42 2.3.9. Создание банка клеток бактериального штамма ....................................... 43 2.3.10. Микроскопирование бактериальных культур ............................................ 44 2.3.11. Культивирование клеток бактериального штамма в биореакторе ......... 45 2.3.12. Выделение плазмиды щелочным методом ................................................. 47 2.3.13. Получение клеточной культуры фибробластов ......................................... 49 2.3.14. Приготовление компетентных клеточных культур для трансформации 49 2.3.15. Трансформация клеточных культур методом электропорации ............... 50 2.3.16. Создание банка клеточных культур ............................................................ 50 2.3.17. Микроскопирование клеточных культуры................................................. 51 2.3.18. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле ............................. 52 2.3.19. Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях .............................................................................. 54 2.3.20. Секвенирование ДНК по методу Сэнгера .................................................. 59 3. Описание эксперимента........................................................................................ 61 5

4. Результаты и обсуждение ..................................................................................... 65 Заключение ................................................................................................................ 74 Список использованных источников ...................................................................... 75 Приложение А. Схема перекрытия праймеров при сборочной полимеразноцепной реакции .......................................................................................................... 79 Приложение Б. Полный сиквенс плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 .................... 80 Приложение В. График изменения показателей во время культивирования ..... 85 6

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. Инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF1, молекулярная масса 7,6 кДа) – гормон, стимулирующий рост тканей организма. Он является основным медиатором действия гормона роста (GH, соматотропина). Гормон роста вырабатывается в передней части гипофиза, выделяясь в кровоток, а затем, попадая в печень, стимулирует выработку IGF1. Затем IGF1 запускает каскад молекулярных механизмов, вызывающих в конечном итоге системный рост организма и стимулирующих рост почти всех клеток организма: скелетных мышц, хрящей, костей, печени, почек, кожи, клеток легких [44]. IGF-LR3 (молекулярная масса 9,1 кДа) - его модифицированный аналог с удлиненной цепью (L - long) и заменой в третьем положении c C-конца глютамина на аргинин (R3). Преимущество данного белка заключаются в его большей специфичности по сравнению с природным белком [26]. Препараты на основе рекомбинантного IGF-LR3 применяются в спортивной медицине для стимуляции роста мышц, сжигания жира. Однако, препараты данного типа являются запрещенными допинговыми препаратами при подготовке олимпийских спортсменов. Патологическая недостаточность IGF1, вызванная генетическими аномалиями, приводит к нарушениям роста, таким, как синдром Ларона [18]. В качестве терапии при патологической недостаточности данного гормона используется заместительная терапия, которая заключается в пожизненных регулярных подкожных инъекциях препарата. В качестве примера препаратов такого типа можно привести: Инкрелекс® (Increlex®), представляющий собой рекомбинантный IGF1, имеющий период полураспада в организме около 5,8 часов [8]. Известен также его родственный препарат Иплекс® (Iplex®), представляющий собой комбинацию (троичный комплекс) рекомбинантных белков: IGF1, белка, связывающего инсулиноподобный фактора роста (IGFBP-3) и белка, связывающего кислотолабильную субъединицу инсулиноподобного фактора роста (IGFALS). Период полураспада у данного препарата вдвое больше и составляет 13,4 часов для лиц с острой недостаточностью IGF1 [12]. 7

Относительно невысокий период полураспада известных препаратов стимулируют к поиску новых путей лечения данных патологических состояний. Генная терапия является одним из перспективных подходов к лечению подобного рода нарушений [11]. Суть генной терапии заключается в парентеральном введении пациенту инъекций нормально функционирующего гена, выполняющего правильную функцию, взамен мутантного. Исследования эффективности IGF1 для генной терапии описаны в литературе. Так, например, для изучения эффективности данного белка проводилась стимуляция роста эпителия у крыс в районе открытых поражений кожи с использованием трансдуцированных in vitro фибробластов кДНК IGF1 [3]. Иными словами, IGF1 как и его модифицированный аналог – IGF-LR3, являются перспективными объектами для создания на их основе генотерапевтических молекул. Объектом настоящих исследований является белок - модифицированный инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-LR3), предметом данного исследования является создание челночной экспрессирующей конструкции, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста IGF-LR3 в клетках прокариот и эукариот. Таким образом, целью настоящей работы является создание плазмидной конструкции, способной экспрессировать ген модифицированного инсулин-подобного фактора роста 1 (IGF-LR3) в клетках млекопитающих. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучение литературных источников по выбранной теме. 2. Получение плазмидной конструкции, экспрессирующей целевой ген. 3. Создание рекомбинантного бактериального штамма для наработки плазмидной конструкции, несущей ген IGF-LR3 в опытно-промышленном масштабе. 4. Получение модельной клеточной культуры-продуцента рекомбинантного белка IGF-LR3. 8

Научная новизна данных исследований заключается в том, что генно-инженерными методами создана плазмидная конструкция, способная экспрессировать ген igf-lr3 в клетках млекопитающих. Практическая значимость работы состоит в том, что на основе полученной рекомбинантной ДНК-конструкции, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста возможно создание генотерапевтического лекарственного средства. Результаты данной работы были опубликованы в следующих научных изданиях: 1. Тезисы «Создание конструкции, экспрессирующей ген igf-lr3, как основы для генотерапевтического лекарственного препарата» / Кивилев Е.В., Аронова Е.Б., Шевченко В.А., Кувакин К.В. // Неделя науки СПбПУ материалы научной конференции с международным участием, Институт биомедицинских систем и биотехнологий. В 2 частях. 2019 г. С. 139-142. 2. Тезисы «Перспективы генной терапии в лечении нарушений роста детей раннего возраста» / Кивилев Е.В., Аронова Е.Б. // Пищевые технологии и биотехнологии материалы ХVI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием, посвященной 150-летию Периодической таблицы химических элементов: в 3 частях. 2019 г. С. 344-347. 3. Тезисы «Создание клеточной культуры-продуцента модифицированного инсулин-подобного фактора роста 1» / Кивилев Е.В., Аронова Е.Б., Базарнова Ю.Г. // VII Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: наука и практика» (принято в печать). 9

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР 1.1. Характеристика IGF1 Инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF1, соматомедин С) - белок из семейства инсулин-подобных факторов роста, по структуре и функциям похожий на инсулин. Модель белка приведена на рисунке 1.1. Рисунок 1.1 – Модель пространственной структуры инсулин-подобного фактора роста 1 В его функции входит эндокринная, аутокринная и паракринная регуляция процессов роста, развития и дифференцировки клеток и тканей организма. Рекомбинантный IGF1 состоит из 70 аминокислот в одной цепочке с тремя внутримолекулярными дисульфидными мостиками. Молекулярная масса IGF1 составляет 7,6 кДа. Считается, что этот белок играет активную роль в процессах старения организма: мутации гена IGF1 приводили к увеличению продолжительности жизни у лабораторных животных. IGF1 является важнейшим эндокринным посредником действия соматотропного гормона, поэтому называется также соматомедином С. IGF1 производится гепатоцитами печени в ответ на стимуляцию их соматотропиновых рецепторов [36]. В периферических тканях именно IGF1 обеспечивает практически все физиологические эффекты соматотропного гормона. IGF1 стимулирует рост почти всех тканей организма и всех внутренних 10

органов и глаз. Однако мышечные ткани, находящиеся под постоянной нагрузкой, более восприимчивы к действию IGF1. Таким образом, IGF1 является важным белком, участвующим в процессе роста и развития организма. 1.2. Характеристика IGF-LR3 Модифицированный инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-LR3) отличается от эндогенного белка IGF1 тем, что в его третьем положении, начиная Cконца аргинин заменен на глютамин (обозначается как R3), а также он имеет удлиненную цепь (L - long). Исследования на трансгенных нокаутных мышах показали, насколько сильно влияет замена аргинина на рост мышечной ткани. Когда R3 применили для культуры кардиомиоцитов, это показало сильное увеличение экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток [36]. Что, таким образом, свидетельствует об усилении физиологических свойств, проявляемых природным IGF1 Иными словами, IGF-LR3 проявляет больший физиологический эффект in vivo по сравнению с природным IGF1. 1.2.1. Перспективы применения IGF-LR3 Сейчас IGF-LR3 в подавляющем большинстве случаев применяется как анаболический нестероидный препарат для ускорения роста мышц спортсменов в виде препаратов для внутримышечных инъекций. Анаболический эффект IGFLR3 в мышечных тканях тела объясняется тем, что в клетку поставляется большее количество питательных веществ и повышается уровень синтеза белка. Также возрастает количество «спутниковых клеток», обеспечивающих транспорт питательных веществ, что происходит благодаря тому, что IGF1 сокращает выделение ингибитора роста p27Kip1 [41]. В организме, естественные уровни соматотропина и IGF1 регулируются миостатином, который также ограничивает рост тканей. У чистого рекомбинантного IGF1 очень быстрый период распада в организме, поэтому для постоянного поддержания его уровня в крови, его необхо- 11

димо инъецировать не менее двух раз в день. Для того, чтобы он дольше оставался активным в крови был предложен путь присоединения к нему аргининовых кислотных остатков в некоторых позициях. Этому препарату было дано название IGF-LR3 - у него более долгий период полураспада (порядка 20 - 30 часов) по сравнению с IGF1 (порядка 12-15 часов), он очень устойчив к связывающим белкам крови, и он намного более активен по сравнению с эндогенным соматотропином [15]. Таким образом, все это делает IGF-LR3 эффективным терапевтическим агентом в лечении таких заболеваний, как дистрофия мышц, недостаточность соматотропина и инсулн-подобного фактора 1 при нарушениях процесса роста организма. Что также указывает на перспективу применения его в целях создания активной генотерапевтической молекулы. 1.3. Обзор заболеваний, связанных с нарушением роста Нарушение нормального роста у детей раннего возраста является в наши дни довольно редким генетическим заболеванием, однако способно существенно снизить качество жизни страдающих подобными расстройствами. По приблизительным оценкам Всемирной Организации Здравоохранения частота генетических нарушений составляет 1 случай на 100 000 рождений [43]. Основными причинами нарушения роста являются: 1. Ахондроплазия - аутосомно-доминантное генетическое заболевание, вызываемое наличием дефектного аллеля в гене рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR3), который отвечает за синтез белка, способствующего выработке коллагена и других структурных компонентов в тканях и костях. Причем проявление гомозигот по этой мутации приводит к летальному исходу. 2. Дефицит гормона роста (соматотропина) – может иметь несколько причин: − мутации определенных генов, кодирующих синтез соматотропина; − наследственные или травматические повреждения гипофиза; − синдром Тернера – состояние, когда частично или полностью отсутствует Х-хромосома по женской линии; 12

− синдром Ларона – мутация гена, кодирующего рецептор гормона роста, что ведет к тому, что гормон не взаимодействует с рецептором. В качестве лечения при недостаточности соматотропина назначают заместительную терапию, которая заключается в пожизненных регулярных инъекциях препарата, содержащего рекомбинантный IGF1 и/или гормон роста пациенту. 1.4. Препараты на основе инсулин-подобного фактора роста 1 Одобренным к применению препаратом является: Инкрелекс® (Increlex®), представляющий собой рекомбинантный IGF1, имеющий период полураспада в организме около 5,8 часов [8]. Известен также его родственный препарат Иплекс® (Iplex®), представляющий собой комбинацию (троичный комплекс) рекомбинантного IGF1; белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-3) и белка, связывающего кислотолабильную субъединицу инсулиноподобного фактора роста (IGFALS). Период полураспада у данного препарата вдвое больше и составляет 13,4 часов для лиц с острой недостаточностью IGF-1 [12]. Относительно невысокий период полураспада известных препаратов и проявление случайного иммунного ответа на введение рекомбинантного гормона [19] стимулируют к поиску новых путей лечения данных патологических состояний. Генная терапия является одним из перспективных подходов к лечению подобного рода нарушений [11]. Исследования эффективности IGF1 для генной терапии описаны в литературе. Так, например, для изучения эффективности данного белка проводилась стимуляция роста эпителия у крыс в районе открытых поражений кожи с использованием трансдуцированных in vitro фибробластов кДНК IGF1 [3]. Таким образом, IGF1 является перспективным белком для создания генотерапевтического препарата на его основе. 13

1.5. Основные этапы разработки генотерапевтического препарата Генная терапия – относительно недавнее направление экспериментальной медицины, зародившееся в США в 1970х годах. Первое клиническое исследование в данной сфере было проведено в 1990 г. [11]. Суть данного метода сводится к использованию «здоровой» ДНК (у которой отсутствуют какие-либо мутации) в качестве лекарства (терапевтического гена), которое способно некоторое время давать терапевтический эффект, за счет экспрессии «правильного» белка [1]. Терапевтические гены – это, в сущности, гены, полученные от здоровых родственников пациента или рекомбинантные молекулы ДНК, кодирующие необходимый белок и полученные с применением методов генной инженерии и биотехнологии. Причем, в случае человека, речь идет только о соматических клетках, поскольку по соображениям этики и отсутствием исчерпывающих знаний о молекулярных механизмах переноса генетической информации половые клетки и зиготы не используются в качестве объектов генной терапии [23]. В более общей перспективе выделяют два типа генной терапии: 1) Заместительная – введение в соматическую клетку неповрежден- ного гена. Это основной подход, используемый в клинических испытаниях генотерапевтических лекарственных перпаратов для человека. 2) Корректирующая – замена дефектного гена нормальным при реком- бинации. Эффективность данного вида генокоррекции – очень низка и не применяется для людей. Преимуществом генной терапии как новейшего подхода является: его высокая эффективность и возможность возврата пациента к нормальной жизни. К недостаткам данного подхода можно отнести: − иммунный ответ, возникающий у пациентов при введении терапевтического гена; − в некоторых случаях имеет место ограниченный по времени период действия и возврат к патологическому состоянию с возможным ухудшением. 14

Методика генной терапии включает в себя несколько этапов [25]: 1.5.1. Подготовительный этап На предварительном этапе проводится: − определение первичного биохимического дефекта; − исследование структуры и функций белкового продукта гена; − тщательный анализ тканеспецифической экспрессии «нарушенного» гена; − биохимический анализ патологического процесса. 1.5.2. Выбор терапевтического гена Сейчас известен широкий спектр нуклеиновых кислот с потенциальной терапевтической функцией: − кодирующие белок гены и регуляторные элементы; − небольшие некодирующие нуклеиновые кислоты: антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, миРНК, и аптамеры. 1.5.3. Выбор пути введения Существует два общих пути введения, основанных на [11]: − выделении клеток пациента с последующей передачей гена в лабораторных условиях (генная терапия ex vivo); − прямой доставке терапевтического гена пациентам (генная терапия in vivo). В генной терапии ex vivo клетки извлекаются у пациентов и затем культиви-руются. В течение этого периода терапевтический ген переносится в клетки. В конечном итоге клеточная суспензия вводится обратно тем же пациентам, у которых клетки были собраны. К преимуществам этого подхода следует отнести: а. возможность доставки генотерапевтического лекарства в различные популяции клеток ex vivo (например, T-лимфоциты); б. возможность селективного отбора клеток, в которых произошел перенос гена; в. возможность избежать иммунного ответа против вектора. 15

Однако данный подход является значительно более сложным и дорогим, чем перенос генов in vivo. Кроме того, не все клетки способны культивироваться (ткани легких) и длительно расти, не изменяя своих физиологических свойств. В генной терапии in vivo терапевтический ген вводится непосредственно пациенту. Этот метод более прост, чем перенос генов ex vivo, и, будучи оптимизированным, может быть применен к широкому кругу пациентов с аналогичным заболеванием. Тем не менее, существуют ограничения: а. в некоторые ткани трудно доставить терапевтический ген in vivo. Например, трудно добиться глубокого переноса генов в мозг, хрящ, соединительную ткань или кость; в этих случаях генная терапия обязательно ограничивается введением терапевтического гена в конкретные районы (например, в суставы или специфические области мозга). б. после введения in vivo ген может проникать в клетки, отличные от желаемых мишеней, что может вызывать нежелательные эффекты. в. если вектор используется для доставки генов, он может подвергаться инактивации (системой комплемента сыворотки крови) или вызывать иммунный ответ. г. большинство клеток нашего организма, включая кардиомиоциты, нейроны, эндотелиальные клетки сосудов и гепатоциты, находятся постмитотической фазе или в фазе покоя. Это существенно ограничивает применение некоторых векторов, например, основанных на гамма-ретровирусах, которые требуют, чтобы клетки-мишени находились в активной репликации. 1.5.4. Подбор системы доставки гена Плазматическая мембрана клеток млекопитающих – гидрофобна и представляет собой серьезный барьер для больших полианионов, таких, как ДНК или РНК. Поэтому, чистые нуклеиновые кислоты очень плохо поглощаются клетками. Перенос гена может осуществляться с использованием: 1. Невирусных систем доставки [25]; 2. Вирусных систем доставки [14, 45]. 16

В случае «голой» ДНК перенос гена в клетки млекопитающих известен как трансфекция; когда вместо этого используется вирусный вектор, доставка гена называется трансдукцией. В настоящее время в клинических экспериментах рассматриваются как минимум четыре семейства вирусов, основанных на ретровирусах (гаммаретровирусах и лентивирусах), аденовирусах, аденоассоциированных вирусах (AAV) и герпесвирусах. 1.5.5. Обеспечение клеточной специфичности (клеточный таргетинг) Для лучшего «узнавания» необходимых клеток, ДНК конъюгируют с моноклональными антителами, которые распознают специфические клеточные рецепторы. Включение таких специфических лигандов в катионные комплексы липид/ДНК (где используется трансфекция) или их конъюгирование на поверхности капсидов вирусных векторов (для трансдукции) позволяет направлять терапевтический ген к определенному типу клеток. Кроме того, при дизайне вводимой конструкции вводимый ген ставят под контроль видоспецифического промотора. Другой подход для достижения клеточной специфичности заключается в ограничении экспрессии трансгена в определенном типе клеток на уровне транскрипции путем помещения самого трансгена под контроль тканеспецифичного промотора. Таким образом, независимо от количества типов клеток, в которых будет происходить перенос гена, трансген будет экспрессироваться только в клетках, в которых активен промотор, управляющий его экспрессией [1]. 1.5.6. Экспрессия доставленного гена в клетках млекопитающих и человека Непосредственный синтез необходимого белка посредством молекулярных механизмов организма. Самая серьезная проблема на данном этапе – достижение длительности поддержания экспрессии доставленного гена, которая варьируется от нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от типа переноса гена, природы гена, природы клеток-хозяев терапевтического гена. Существует эффект так называемого «замолкания» введенного гена, когда его экспрессия в 17

клетках-мишенях прекращается. Точные молекулярные механизмы данного эффекта пока до конца не установлены [1]. Критичной стадией в случае разработки является подбор системы доставки терапевтического гена. Обзор способов доставки и их преимущества и недостатки представлен ниже. 1.6. Системы доставки терапевтического гена Как отмечалось выше, гидрофобная клеточная мембрана препятствует проникновению внутрь полианионов – ДНК и РНК, поэтому существует необходимость в разработке вектора. Функция вектора - доставить терапевтический ген в клетку-мишень пациента. Векторы - это транспортные молекулы, которые переносят генетический материал в самые разнообразные клетки, ткани и целые органы. Оптимальный вектор и система доставки зависят от клеток-мишеней и их характеристик, длительности экспрессии и размера генетического материала, который будет включен в вектор [2, 30]. Эффективность трансфекции клеток-хозяев вирусными векторами относительно высока по сравнению с невирусными методами. Основными недостатками использования вирусных векторов являются их иммуногенность и цитотоксичность. Первое клиническое исследование, связанное с летальностью генной терапии, было связано с воспалительной реакцией на вирусный вектор (аденовирусный). Дополнительным поводом для беспокойства за использование вирусного пути переноса генов - это явление, известное как инсерционный мутагенез, т. е. эктопическая (неспецифичная) интеграция вирусной ДНК в хромосому, что нарушает экспрессию гена подавления канцерогенеза или активирует онкогены, что приводит к злокачественной трансформации клеток. Благодаря своей продемонстрированной сниженной патогенности, низкой стоимости и простоте производства, невирусные векторы имеют важное преимущество по безопасности перед вирусными подходами. Основным преимуществом использования невирусных векторов является их биобезопасность. Однако применение невирусного переноса генов в прошлом долгое время игнорировалось из-за низкой эффективно- 18

сти их доставки, что приводило к низкой кратковременной экспрессии их трансгенов. Невирусные векторы привлекли заслуженный большой интерес благодаря своей низкой иммунотоксичности. Использование невирусных векторов в клинических испытаниях увеличилось с 2004 по 2013 год, в то время как использование вирусных векторов значительно сократилось [39]. К сожалению, ни один из доступных в настоящее время невирусных векторов не обладает идеальными векторными свойствами [1], поэтому внимание исследователей сейчас сосредоточено на совершенствование векторов. Классификация систем доставки терапевтического гена представлена ниже. 1.7. Классификация невирусных методов доставки Все методы невирусной доставки могут быть классифицированы как [2, 30]: 1. Физические 2. Химические 1.7.1 Физические методы доставки Самая простая группа методов. Эти методы используют физическое воздействие для того, чтобы пробить барьер в виде клеточной мембраны таким образом облегчая внутриклеточную доставку генетического материала [10, 21-22, 27, 38, 40]. Выделяют несколько способов: 1.7.1.1. Микроинъекция Целевой генетический материал впрыскивается в ткань или системный кровоток через шприц. Без какого-либо носителя это самый простой и безопасный метод переноса генов. Предпочтительные ткани-кандидаты: мышцы, кожа, печень, сердечная мышца и солидные опухоли. Однако эффективность данного метода низка из-за быстрой деградации нуклеазами ДНК в сыворотке крови и удалением её системой мононуклеарных фагоцитов. 1.7.1.2. Биобаллистика ДНК Представляет собой бомбардировку частицами, перенос генов с помощью микроснарядов. Этот метод был впервые использован в качестве метода передачи генов растениям. Метод основан на принципе обстрела наночастицами тя- 19

желых металлов, покрытых ДНК ткани-мишени с определенной скоростью. Достаточная скорость достигалась высоковольтным электрическим разрядом, искрой или перепадом давления гелия. Давление газа, размер частиц, частота обстрела являются критическими параметрами при определении эффективности переноса генов этим методом. Золото, вольфрам и серебро со стандартным диаметром 1 мкм используются в качестве бомбардирующих частиц. Основным преимуществом генной пушки является точная доставка микродоз ДНК. Наиболее часто метод используется в ex vivo генотерапевтических исследованиях рака яичников. 1.7.1.3. Электропорация Суть данного способа заключается в то, что создается электрическое поле, которое больше, чем емкость мембраны, что приводит к смене полярности распределению равного заряда с обеих сторон мембраны клетки и, таким образом, формируется разница потенциалов на специфическом участке на поверхности клетки. В результате распада мембраны образуется пора, что позволяет крупной молекуле ДНК пройти внутрь. Формирование пор происходит примерно за 10 наносекунд. Поры в мембране могут быть обратимыми в зависимости от напряженности поля и длительности импульса. Если эти поры обратимы - клетки остаются жизнеспособными, в противном случае - электропорация приводит к гибели клеток. Необратимая электропорация используется в лечении рака, чтобы уничтожить раковые клетки. Проницаемость мембраны для переноса генов контролируется амплитудой и длительностью импульса. В настоящее время используются либо высокая напряженность поля (>700В/см), либо низкая напряженность поля (<700В/см) с короткими импульсами (микросекунды) или длинные импульсы (миллисекунды). Определяет эту комбинацию переменных целевая ткань. Показано, что раковые клетки требуют низкой напряженности поля с длинным импульсом, тогда как мышечным клеткам нужен короткий импульс с высокой напряженостью поля. 20

Электропорация стала надежным физическим методом доставки плазмидной ДНК. Терапию можно проводить внутрикожно, внутримышечно или внутри опухоли ex vivo или in vivo. На данный момент данный способ является наиболее хорошо исследуемым. 1.7.1.4. Сонопорация В данном способе ex vivo сайт-специфичной техники переноса ДНК, используются ультразвуковые волны для создания временной проницаемости клеточной мембраны, чтобы позволить клетке поглотить ДНК. Генетический материал интереса, включенный в микро-пузырь, вводиться в системный кровоток. Затем следует наружное применение ультразвука. Ультразвуковые волны ковитуют микропузырьки внутри системного кровотока тканимишени, производя биоэффекты, которые приводят к целенаправленной трансфекции терапевтического гена. Микропузыри составят из наполненного газом ядра (воздух/азот/инертный газ) с высокомолекулярным наполнителем - перфторуглеводороды или гексафторид серы. Внешняя оболочка состоит из биосовместимых соединений, таких как липиды, белки или синтетические биополимеры. Микропузырьки напоминают красные кровяные тельца (средний диаметр 2-4 мкм). Метод Сонопорации в основном использовали на мозге, роговице, почке, перитонеальной полости, и тканях мышцы и сердца. Генные продукты соединяются с микропузырьками любым из следующих трех способов: − генерация микропузырьков в сочетании с генотерапевтической молекулой (ДНК включается в оболочку / полость). − электростатическая конъюгация (инкубация раствора ДНК с микропузырьком - прикрепление к оболочке ДНК за счет электростатического взаимодействия). − без конъюгации (совместное введение микропузырька и генетического материала). 21

1.7.1.5. Фотопорация В данном способе используется одиночный импульс лазера для того, чтобы произвести сквозные поры на клеточной мембране, что позволяет ДНК проникнуть в клетку. От частоты импульса лазера зависит эффективность. Утверждается, что уровень экспрессии трансгенов идентичен таковому при электропорации. Данная методика не имеет документальных подтверждений воспроизводимости. 1.7.1.6. Магнитофекция Способ основан на гипотезе магнитно-направленной доставки лекарств. Заключается в связывании терапевтического гена с магнитной наночастицей. Этот комплекс вводится в культуру клеток. Градиент поля, возникающий под действием точечных насыпных электромагнитов, которые помещены под культурой клеток, увеличивает осаждение комплексов ген-наночастица и увеличивает скорость трансфекции. В случае in vivo терапевтический комплекс ген-магнитные частицы вводят внутривенно. Использование сильных внешних магнитов с высоким градиентом магнитного поля, приводит к захвату и удерживанию комплекса на целевых клетках. Генетический материал высвобождается ферментативным расщеплением молекулы-спейсера, воздействием электрического заряда или деградацией матрицы. Этот метод в основном используется в исследованиях in vitro для трансфекции первичных клеток и клеток, которые трудно трансфецировать другими средствами. 1.7.1.7. Гидропорация Этот способ также называют гидродинамической передачей генов. Заключается использовании гидродинамического давления для того, чтобы создать поры в мембране клетки. Гидродинамическое давление создается путем введения большого объема раствора ДНК за единицу времени. Это создает повышенную проницаемость эндотелия капилляров и образует поры в плазматической мембране клетки, опоясывающие паренхимы. 22

Терапевтический ген интереса может попасть внутрь клетки через эти поры, которые позднее закрываются, тем самым сохраняя перенесенный генетический материал внутри клетки. Данная методика используется для in vitro генотерапевтических исследований в культурах клетках печени. 1.7.2 Химические методы доставки Химические векторы четко классифицированы – ими могут быть (по химической природе): − неорганические частицы; − носители, основанные на липидах, синтетических полимерах и пептидах. В общем по назначению быть классифицированы как: − формирующие конденсированный комплекс с терапевтическим геном для того, чтобы защитить его от нуклеаз и других компонентов кров; − созданные для целевых специфичных клеток; − созданные для увеличения переноса генетического материала в цитоплазму или ядро; − разлагаемые с ДНК/РНК в цитоплазме; − сконструированные для поддержания стабильности или контроля высвобождения терапевтического гена в ткани; Невирусные системы доставки нуклеиновых кислот химического типа это, как правило, комплексы: − ДНК/катионный липид (Липоплексы); − ДНК/катионный полимер (Полиплексы); − ДНК/катионный полимер/катионный липид (Липополиплексы). 1.7.2.1 Неорганические частицы Это, как правило, наночастицы, которые могут быть созданы путем изменения размера, формы и пористости материала, с целью: избежать ретикуло-эндотелиальной системы организма или защиты захваченной целевой молекулы от деградации. Сульфат кальция, оксид кремния (IV), золото, магнитные соединения, углеродные нанотрубки, фуллерены, супрамолекулярные системы – все они относятся к данной категории носителей. 23

1.7.2.2. Синтетические и натуральные биоразлагаемые носители Наиболее широко используемые после способа электропорации в in vitro генотерапевтических исследованиях носители [1]: Катионные липиды Все они имеют общую структуру: положительно заряженной гидрофильной головки и гидрофобного хвоста со структурой линкера, которая соединяет липид и целевой ген. Положительно заряженная головка липида связывается с отрицательно заряженной фосфатной группой в нуклеиновых кислотах и образуя очень плотную структуру, называемую липоплексом. Эффективность трансфекции зависит от общей геометрической формы, количества заряженных групп в молекулах, характера липидного якоря и силы линкерной связи. Липоплексы за счет своего положительного заряда электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженными гликопротеинами и протеогликанами клеточной мембраны, что может способствовать поглощению клетками нуклеиновых кислот. Положительно заряженные липиды, окружающие генетический материал, помогают защитить его от внутриклеточных и внеклеточных нуклеаз. Однако проблема состоит в поверхностном заряде, что уменьшает полувыведение, время циркуляции липоплексов в крови, ограничивая тем самым применение до клеток эндотелия сосудов. Нейтральный полимер как, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) может быть использован как поверхностный протектор для того, чтобы снизить избыточный заряд и увеличить период полувыведения. Хотя рассмотренные липоплексы имеют низкую токсичность, они становятся цитотоксичными в соотношении липид:ДНК - 3:1. Наноэмульсии липидов Эмульсии липидов в качестве переносчиков, получают диспергированием их в несмешивающейся жидкости. Эмульсии липидов имеют диаметр нм и состоят из масла, воды и сурфактанта. 24

Считается, что липидные наноэмульсии превосходят липосомы в способности к расширению и стабильности, что делает их более устойчивыми в сыворотке крови. Данные показывают, что они менее токсичны, чем липосомы [2]. Твердые липидные наночастицы Твердые липидные частицы состоят из липидов, находящихся в твердом состоянии при комнатной температуре и температуре тела. Они имеют преимущества перед катионоактивными липидами и липидными наноэмульсиями: было показано, что катионные твердые липидные наночастицы способны эффективно защищать нуклеиновые кислоты от деградации нуклеазами. В настоящее время используются в качестве основы для создания системы доставки миРНК [2]. Таким образом, как было отмечено ранее, наиболее распространенным широко применяемым методом невирусной доставки в генотерапевтических исследованиях и испытаниях является электропорация клеток. Однако, не смотря на все попытки и разнообразие невирусных методов доставки, данная группа методов уступает вирусным методам в селективности и избирательной пронизаемости. 1.8. Классификация вирусных методов доставки В основе вирусных векторов - нативные вирусные частицы, модифицированные путем замены собственных генов вируса на генноинженерные конструкции. Вирусные вектора состоят из генетического материала (ДНК или РНК), окруженного белковой оболочкой (капсидом). Кроме того, у некоторых вирусов присутствует липидная оболочка поверх белковой. Специфические белковые структуры на поверхности оболочки вируса взаимодействуют со специфическими рецепторами на поверхности клеток, что облегчает интернализацию конструкций в клетки-мишени и повышает эффективность доставки [29]. Наибольшее применение в исследованиях по генотерапии различных заболеваний получили векторы на основе аденовирусов, аденоассоциированных вирусов и ретровирусов. 25

1.8.1. Аденовирусные векторы Данные векторы представляют собой безоболочные вирусные частицы диаметром до 100 нм, содержащие двухцепочечную ДНК. Проникают в клетки путем эндоцитоза, связываясь с коксаки-аденовирусным рецептором. ДНК вируса после проникновения переносится в ядро, обеспечивая эффективную трансдукцию широкого спектра делящихся и неделящихся клеток, таких как кардиомиоциты, одноядерные клетки скелетных мышц, клетки гладкой мускулатуры и др. [7]. Аденовирусные векторы с трудом преодолевают эндотелиальный барьер при системной доставке. Эффективность трансдукции также зависит от серотипа вируса. К преимуществам аденовирусных векторов можно отнести большой размер транспортируемой дцДНК (до 35 тыс. пар оснований, т.п.о.), высокий функциональный титр, а также быструю экспрессию трансгена (1–2 дня после доставки). Кроме того, дцДНК аденовирусных векторов не встраивается в геном клеткихозяина, что уменьшает риск инсерционного мутагенеза. В то же время, аденовирусные векторы обладают одним существенным недостатком: компоненты их капсида вызывают Т-клеточный иммунный ответ. Трансдуцированные клетки-мишени могут опознаваться и элиминироваться клетками иммунной системы. Кроме того, широкая специфичность аденовирусных векторов приводит к неспецифической трансдукции нецелевых клеток (например, гепатоцитов или антиген-презентирующих клеток) [5]. 1.8.2. Аденоассоциированные вирусные векторы Аденоассоциированные векторы (ААВ) имеют небольшой безоболочечный вирион диаметром порядка 20 нм и геном размером 4,7 тыс. п.о., представленный одноцепочечной ДНК (оцДНК) [34]. Относительно небольшой размер генома позволяет легко встраивать в него различные трансгены для доставки в клетки. С другой стороны, это накладывает ограничение на размер трансгена: стандартные ААВ не подходят для переноса больших генов. 26

Репликация вирусов этого рода в клетках хозяина происходит при коинфекции вирусом-помощником (аденовирусом или вирусом простого герпеса, ВПГ). В отсутствие вируса-помощника, развития вируса в клетках не происходит. Ввиду различий в белковом составе капсида, существует множество серотипов аденоассоциированных вирусов с различной тканевой специфичностью и эффективностью трансдукции. Исследования в этой области позволили создать широкий спектр рекомбинантных ААВ, способных доставлять генетический материал в ткани-мишени с минимальными побочными эффектами (трансдукция других клеток, органов и тканей). ААВ обеспечивает длительную экспрессию трансгена, особенно в неделящихся клетках. К достоинствам ААВ как носителей терапевтически значимых генов можно отнести то, что ни с вирусами дикого типа, ни с рекомбинантными ААВ не связаны известные заболевания, а введение ААВ в организм вызывает умеренный иммунный ответ. В то же время ввиду того, что человеческая популяция постоянно встречается с различными серотипами аденоассоциированных вирусов, иммунная система продуцирует антитела, нейтрализующие ААВ. Для решения этой проблемы предлагают модифицировать иммуногенные эпитопы ААВ или использовать более редкие серотипы капсидов, однако это может повелечь за собой «отключение» иммунной системы организма, что делает его уязвимым перед штаммами дикого типа. 1.8.3. Ретровирусные векторы Семейство Retroviridae включает семь основных родов, их представители – активно исследуются в качестве основы для создания новых вирусных векторов для доставки терапевтически значимых генов. На сегодняшний день большая часть работ в этой области сконцентрирована на исследовании гамма-ретровирусов (вирус лейкемии мышей) и лентивирусов (ВИЧ-1) [6]. Низкая эффективность трансдукции неделящихся клеток гамма-ретровирусными векторами ограничивает их применение переносом генов в гемопоэтические клетки. 27

Лентивирусные векторы, напротив, способны трансдуцировать неделящиеся и медленно делящиеся клетки, что существенно расширяет возможности их использования для доставки генетического материала в различные ткани и органы, включая ЦНС [37]. Лентивирусные векторы представляют собой белковый капсид диаметром до 100 нм, упакованный в липидную оболочку, содержат оцРНК-геном длиной порядка 9 т.п.о. В клетке их геном проходит стадию обратной транскрипции и интегрируется в хромосомы в виде кДНК, что позволяет добиться долговременной (в идеале, пожизненной) экспрессии терапевтически значимого трансгена. Однако ввиду того, что интеграция в геном клетки-хозяина происходит случайным образом, она может запускать инсерционный онкогенез [28]. Риск перерождения клетки-хозяина можно уменьшить путем оптимизации состава и строения вектора. 28

1.9. Выводы по литературному обзору Была рассмотрена характеристика и основные свойства инсулин подобного фактора роста 1 (IGF1) и его рекомбинантного модифицированного аналога (IGF-LR3). Рассмотрены основные заболевания, вызываемые недостаточностью данного белкового гормона. Доказана перспективность применения данного гормона и его модифицированного аналога как мишеней для создания генотерапевтических молекул для лечения заболеваний, связанных с недостаточностью IGF1. Рассмотрены основные этапы разработки генотерапевтических молекул, систем и способов доставки терапевтического гена и их классификация. В частности, было установлено, что электропорация является основным и наиболее изученным способом доставки генотерапевтических молекул. И, таким образом, данный способ использован как основной способ доставки гена в настоящих исследованиях. 29

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования Объектами настоящего исследования являются: 1. Модифицированный инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-LR3), молекулярная масса 9117,6 Да. Аминокислотная последовательность (в порядке от N-концевого до С-концевого участков) данного белка представлена ниже (полужирным и курсивом выделены дополнительный фрагмент (L) и глютаминовая кислота, замененная на аргинин (R3), по сравнению с природным белком, соответственно; подчеркиванием обозначены дисульфидные связи между цистеинами в белковой молекуле). 40 MFPAMPLSSL FVNGPRTLCG AELVDALQFV CGDRGFYFNK 80 PTGYGSSSRR APQTGIVDEC CFRSCDLRRL EMYCAPLKPA 83 KSA 2. Ген модифицированного IGF-LR3 (261 п.н.) инсулин-подобного фактора роста Кодирующий рекомбинантный белок ген IGF-LR3 был получен в компании ООО «БИОССЕТ» с помощью метода сборочной ПЦР. Последовательность нуклеотидов в одной цепи, фланкированная сайтами рестрикции-модификации EcoRI и XbaI, представлена ниже (серым отмечены сайты рестрикции-модификации EcoRI и XbaI, соответственно). 40 80 120 160 200 240 261 GAATTCATGT TCCCAGCCAT GCCCTTGTCC AGCCTGTTTG TTAACGGCCC AAGAACACTT TGTGGAGCCG AACTGGTGGA TGCTCTCCAA TTCGTTTGCG GCGACCGCGG ATTCTACTTT AACAAGCCCA CCGGTTACGG GTCTTCAAGC CGGAGGGCCC CGCAGACTGG CATCGTCGAC GAGTGCTGTT TTAGAAGCTG CGATCTGCGA CGGTTGGAGA TGTATTGTGC ACCTCTGAAG CCCGCGAAAA GTGCTTCTAGA 3. Клонирующий вектор pcDNA3.1(+) В качестве носителя гена IGF-LR3 был использован челночный вектор представляющий собой кольцевую плазмиду pcDNA3.1(+), карта которой представлена на рисунке 2.1. 30

Рисунок 2.1 - Физическая карта вектора pcDNA3.1(+) Функция основных элементов вектора pcDNA3.1(+) представлена в таблице 2.1. Таблица 2.1 - Конструкционные особенности плазмиды pcDNA3.1(+) Элемент Расположение в цепи ДНК, ориентация CMV enhancer 235 – 614, прямая CMV promoter 615 – 818, прямая T7 promoter MSL 863 – 881, прямая 895 - 1002 bGH poly (A) signal 1028 – 1252, прямая F1 origin 1298 – 1726 прямая Название Функция Эукариотический гибридный энхансер цитомегловируса (CMV) Эукариотический гибридный промотор цитомегловируса (CMV) Промотор для полимеразы фага Т7 Полилинкер Сигнал полиаденилирования гена бычьего гормона роста (bovine growth hormone, bGH) Обеспечение экспрессии целевого трансгена в клетках млекопитающих Обеспечение экспрессии целевого трансгена в клетках млекопитающих Обеспечение экспрессии целевого трансгена в клетках прокариот Вставка целевого трансгена Обеспечение терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК целевого гена Обеспечение упаковки вектора в фаговые частицы при котрансформации с фагамипомощниками VCSM13 и M13K07 Точка начала репликации F1 31

Продолжение таблицы 2.1 Элемент Расположение в цепи ДНК, ориентация Название Функция SV40 promoter 1740 – 2069, прямая Эукариотический промотор вируса обезьян SV40 Обеспечение экспрессии гена устойчивости к селективному маркеру в клетках млекопитающих Enhancer SV40 1920 – 2055, прямая NeoR/KanR 2136 – 2930, прямая Энхансер вируса обезьян SV40 Ген устойчивости к канамицину SV40 poly (A) signal 3104 – 3225, прямая Сигнал полиаденилирования гена вируса обезьян SV40 Rep ori 3676 – 4261, обратная Точка начала репликации pUC AmpR 4432 – 5292, обратная Ген бета-лактамазы AmpR promoter 5293 – 5397, обратная Промотер лактамазы гена бета- Усиление экспрессии целевого гена Ген устойчивости к селективному маркеру в клетках млекопитающих Обеспечение терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК гена устойчивости к антибиотику Обеспечение репликации вектора в клетках E. coli Обеспечение устойчивости E.coli к ампициллину Обеспечение экспрессии гена беталактамазы Экспрессионная плазмида содержит два ориджина репликации (Escherichia coli, полиомавирус SV40), промотор для полимеразы фага Т7, гены устойчивости к канамицину и ампицилину, промотр цитомегаловируса и соответствующий ему энхансер, а также полилинкер, содержащий множество сайтов рестрикциимодификации для различных рестриктаз. Таким образом, любая клонированная в векторе нуклеотидная последовательность способна копироваться в составе плазмиды в бактериальных клетках и экспрессироваться в виде белка в клетках млекопитающих. 4. Бактериальный штамм Для проведения генно-инженерных работ использовали клетки Escherichia coli DH5α с генотипом supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1. 32

2.2. Перечень сырья и материалов исследования Информация о сырье и материалах, использованных в настоящей работе, представлена в таблице 2.2. Таблица 2.2 - Перечень сырья и материалов, использованных в настоящей работе Наименование Вода очищенная Вода ультрачистая, для ВЭЖХ Пептон Дрожжевой экстракт LB агар SOC среда Натрия хлорид Глюкоза Трис(гидроксиметил)-аминометан Динатриевая соль ЭДТА Фенилметаносульфонил фторид (ФМСФ) Этанол, 95% Пеногаситель A Соляная кислота Фосфорная кислота 85% Мочевина 2-Меркаптоэтанол Изорпропанол Тритон Х-100 Натрия ацетата тригидрат Уксусная кислота ледяная Натрия гидроксид Ампициллина натриевая соль Канамицина сульфат Неомицина сульфат Пенициллин Phusion Green Hot Start II Hight-Fidelity DNA polymerase Мастер-микс для ПЦР с высокоточной ДНК-полимеразой с «горячим» стартом Phusion U Hot Start dNTP Mix, 10 mM each Олигонуклеотиды T4 DNA лигаза XbaI фермент рестрикции EcoRI фермент рестрикции 10X FastDigest Buffer 10X DNA-ligase T4 Buffer РНКаза А QIAquick Gel Extraction Kit QIAprep Spin Miniprep Kit Производитель страна Каталожный номер ФГУП ГНИИИ Военной Медицины МО РФ, Российская Федерация - Sigma-Aldrich, США NeoFroxx GmbH, Германия Bio Springer S.A., Франция Merck, Германия Thermo Fisher Scientific, США Panreac Quimica S.L.U., Испания AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия 270733 1421 YT-100/19 110283 15544034 LC-4524 A1422 141940 141669 Sigma-Aldrich, США BCCB9214 ОАО «Медхимпром», Российская Федерация Sigma-Aldrich, США ООО «Химмед Синтез», Российская Федерация AppliChem GmbH, Германия NeoFroxx GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия Panreac Quimica S.L.U., Испания AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия NeoFroxx GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия Sigma-Aldrich, США AppliChem GmbH, Германия 141032 LC-10007 A1108 361090 142314 141632 141008 141929 LC-10450 A4789 480100 A8943 Thermo Fisher Scientific, США F537S Thermo Fisher Scientific, США F533S Thermo Fisher Scientific, США Евроген, Россия Thermo Fisher Scientific, США Thermo Fisher Scientific, США Thermo Fisher Scientific, США Thermo Fisher Scientific, США Thermo Fisher Scientific, США Thermo Fisher Scientific, США Qiagen, США Qiagen, США R0194 15224090 FD0685 ER0275 B64 B69 EN0531 K0692 K0503 33 010217 A6582 -

Продолжение таблицы 2.2 Наименование QIAquick PCR Purification Kit Plasmid Maxi Plus Kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit Taq буфер Полиэтиленгликоль 4000 LE Agarose Этидиум бромид Буфер для образцов 6Х DNA Loading Dye Буфер для образцов 4X NuPAGE LDS Тетраметилэтилендиамин (TEMED) Акриламид Бисакриламид Хлористоводородная кислота Натрия додецилсульфат Глицерин Аммония персульфат Бромфеноловый синий Набор реагентов для окрашивания нитратом серебра ProteoSilver Silver Stain Kit Стандартные белки для электрофореза LMW-SDS Marker Kit (маркеры молекулярных масс) Кумасси брильянтовый голубой G250 Модифицированная среда ИглаДульбекко (DMEM) Эмбриональная бычья сыворотка (FBS) Трипсин-ЭДТА 0,25 % L-глутамин Диметилсульфоксид (ДМСО) 99,5 Раствор заменимых аминокислот (NEAA) без L-глутамина Набор для проведения трансфекции Neon Kit (10 mkl) Буфер для электропорации тканевых клеток BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V.3.1 E.coli DH5α GeneRuler DNA Ladder Mix GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder Производитель страна Qiagen, США Qiagen, США Thermo Fisher Scientific, США Евроген, Россия AppliChem GmbH, Германия Lonza, Швейцария VWR, США Каталожный номер 28106 12963 123544 PB008 142438 50004 97064-970 Thermo Fisher Scientific, США R0611 Thermo Fisher Scientific, США AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия AppliChem GmbH, Германия Merck, Германия NP0008 A1148 A3812 A3636 131020 142363 141339 A2941 1.08122 Sigma-Aldrich, США PROTSIL1-1KT GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция 17-0446-01 Thermo Fisher Scientific, США 20279 Thermo Fisher Scientific, США 31885049 Thermo Fisher Scientific, США 26400044 Thermo Fisher Scientific, США Gibco (ThermoFisher Scientific), США AppliChem GmbH, Германия Gibco (ThermoFisher Scientific), США Invitrogen (ThermoFisher Scientific), США T4049 25030081 A3672 11140035 MPK1025 Bio-Rad, США 1652677 Thermo Fisher Scientific, США 4337458 Thermo Fisher Scientific, США Thermo Fisher Scientific, США Thermo Fisher Scientific, США 18265017 SM0331 10787018 34

2.3. Методы исследования 2.3.1. Твердофазный синтез олигонуклеотидов Твердофазный синтез олигонуклеотидов осуществляли в компании ООО «БИОССЕТ» (Россия) согласно протоколу производителя (поскольку протокол является коммерческой тайной поставщика, его описание в данном разделе не приводится. Взамен приведено теоретическое описание данного метода) [13]. Синтез всех олигонуклеотидов сводится к поэтапной (цикловой) конденсации химически модифицированных (различными защитными группами) нуклеотидов от 3'- к 5'-концу растущей цепи, пока не будет собрана целевая последовательность (максимальная длина олигонуклеотида при данном методе составляет порядка 200 нуклеотидных остатков). Цикл синтеза и состоит из четырёх химических реакций: 1) Удаление защиты (как правило тритильной - DMT) Защитную группу (DMT) удаляют обработкой раствором органической кислоты в инертном растворителе, в результате чего образуется закреплённый на твердофазном носителе предшественник олигонуклеотида со свободной (не защищенной) 5'-OH группой. 2)Конденсация Раствор модифицированного нуклеотида или со-смеси нескольких модифицированных нуклеотидов активируют раствором кислотного катализатора на ос-нове азола (например, 1H-тетразола). Активированный амидофосфит (модифи-цированный нуклеотид) в 1,5-20-кратном избытке вводят во взаимодействие с 5'-OH группой, образуя фосфитную триэфирную связь. 3)Кэпирование Кэпирование проводят путём обработки твердофазного носителя смесью уксусного ангидрида и 1-метилимидазола в качестве катализатора для: − предотвращения образования олигонуклеотидов с недостающими нуклеотидными остатками внутри цепи. Для этого оставшиеся OH-группы защищаются ацетильными группами (CH3CO-), устойчивыми к действию растворов кислот, используемых для снятия DMT-защиты. 35

− удаления некоторых побочных продуктов синтеза. 4) Окисление Обрабатывают носитель йодом и водой в присутствии слабого основания (например, пиридина) фосфит окисляется в фосфотриэфир, предшественник фосфодиэфирной связи. Общая схема синтеза представлена на рисунке 2.2. Рисунок 2.2 – Схема синтеза твердофазного синтеза олигонуклеотидов Очищают синтезированные нуклеотиды методом обращено-фазовой ВЭЖХ согласно протоколу производителя. 36

2.3.2. Сборочная полимеразно-цепная реакция Синтез целевого гена igf-lr3 с предварительно включенными сайтами рестрикции-модификации EcoRI и XbaI проводили в компании ООО «БИОССЕТ» (Россия) согласно протоколу производителя методом полимеразно-цепной реакции с помощью синтезатора ДНК ASM-800 с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, синтезированных химическим методом. Поскольку протокол является коммерческой тайной поставщика, его описание в данном разделе не приводится. Праймеры для синтеза гена представлены в таблице 2.3 (в порядке от 5'- к 3'-концу). Таблица 2.3 – Праймеры, использованные для синтеза гена igf-lr3 Обозначение Длина, п.н. 1F 58 2R 60 3F 56 4R 55 5F 59 6R 59 Последовательность GAATTCA TGTTCC CAGCCA TGCCCT TGTCCA GCCTGT TTGTTA ACGGCC CAAGAA CAC GCCGCA AACGAA TTGGAG AGCATC CACCAG TTCGGC TCCACA AAGTGT TCTTGG GCCGTT CCAATT CGTTTG CGGCGA CCGCGG ATTCTA CTTTAA CAAGCC CACCGG TTACGG GT CGTCGA CGATGC CAGTCT GCGGGG CCCTCC GGCTTG AAGACC CGTAAC CGGTGG G CTGGCA TCGTCG ACGAGT GCTGTT TTAGAA GCTGCG ATCTGC GACGGT TGGAGA TGTAT TCTAGA AGCACT TTTCGC GGGCTT CAGAGG TGCACA ATACAT CTCCAA CCGTCG CAGAT Схема перекрытия праймеров сборки представлена в Приложении А. 2.3.3. Очистка целевого гена колоночным методом Целевой ген IGF-LR3 очищают при помощи набора QIAquick PCR Purification Kit согласно протоколу производителя [33]. Приготовление растворов Буферный раствор PB. 2,5 мл 95 %этанола добавляют к 7,5 мл концентрата буфера PE. Раствор используют сразу после приготовления. Процедура 500 мкл буфера PB добавляют к 100 мкл испытуемого образца и перемешивают. 37

Помещают центрифужную колонку QIAquick впробирку объёмом 2 мл. В центрифужную колонку вносят образец и центрифугируют со скоростью 17900g в течение 30 – 60 с при комнатной температуре. Элюат сливают и колонку возвращают обратно в ту же пробирку. Осуществляют промывку добавлением 0,75 мл буфера PE в колонку и центрифугированием со скоростью 17900g в течение 30 – 60 с при комнатной температуре. Элюат сливают и колонку возвращают обратно в ту же пробирку. Пробирку с колонкой центрифугируют дополнительно 1 мин при тех же условиях. Колонку помещают в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Для элюции ДНК добавляют 30 мкл буфера EB (10 мМ Трис-HCl, рН 8,5) в центр мембраны колонки выдерживают в течение 1 мин при комнатной температуре и центрифугируют пробирку с колонкой в течение 1 мин со скоростью 17900g при комнатной температуре. Элюат содержащий целевые молекулы ДНК хранят при температуре – (20 ± 2)°C. В дальнейшем фрагмент нужной длины определяют методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Фрагмент нужной длины вырезают из геля и экстрагируют в раствор набором QIAquick Gel Extraction Kit согласно протоколу производителя. 2.3.4. Амплификация целевого гена методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) Целевой ген амплифицируют при помощи набора Мастер-микс Phusion U HotStart согласно протоколу производителя. ПЦР проводят в термоциклере MyCycler (Bio-Rad, США). Приготовление растворов Полимеразную смесь готовят при температуре 0°C последовательно по рецепту, предложенному производителем. Рецепт приготовления представлен в таблице 2.4. 38

Таблица 2.4 – Состав и порядок приготовления полимеразной смеси № п/п Компонент, исходная концентрация pH Количество на 50 мкл реакции Конечная концентрация 5 мкл 1× 1 Taq буфер (300 mM Трис-HCl, 166 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2), 10× 8.6, 2 dNTPs (нуклеотиды), 10 мМ 1 мкл 200 мкМ 3 Прямой праймер (IG-F), 10 мкМ 1 мкл 0,2 мкМ (0,05–1 мкМ) 4 Обратный праймер (IG-R), 10 мкМ 1 мкл 0,2 мкМ (0,05–1 мкМ) 5 Образец ДНК, целевой ген IGF-LR3 0,5 мкл <1000 нг 6 Taq ДНК-полимераза, 2 U/мкл 0,25 мкл 1,25 единиц / 50 мкл ПЦР 7 Нуклеазная вода до 50 мкл Реакционную смесь осторожно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха. Процедура Для амплификации целевого гена, кодирующего белок IGF-LR3, используют праймеры, представленные в таблице 2.5. Таблица 2.5 – Праймеры, использованные для амплификации гена igf-lr3 Название праймера Последовательность Температура отжига,°C IG-F 5'-AATTCATGTTCCCAGCCATGCC-3' 60 IG-R 5'-CTAGAAGCACTTTTCGCGGG-3' 59,1 Условия ПЦР подбирали экспериментально с учетом температуры отжига праймеров. Температуру отжига праймеров считают по формуле: T = 2(A+T)+3(G+C), где A, T, G, C – количество соответствующих нуклеотидов в синтетическом олигонуклеотиде (аденини, тиамин, гуанин цитозин). Реакционную смесь прогревают 5 мин. при температуре 95°С для денатурации ДНК. Для амплификации целевого гена, фланкированного сайтами рестрикциимодификации EcoRI и XbaI проводят 35 циклов: 39

− термостатирование при температуре 94°C – 40 сек, − отжиг олигонуклеотидов при температуре 64°C – 20 сек, − элонгация при температуре 72°C – 1 мин. Для достраивания образовавшихся цепей ДНК проводят дополнительный цикл: инкубируют в течение 7 мин при температуре 72°C. Полученные амплификаты хранят при температуре – 20°C. Результат ПЦР анализировуют методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Фрагмент нужной длины вырезают из геля и экстрагируют в раствор набором QIAquick Gel Extraction Kit согласно протоколу производителя. 2.3.5. Реакция рестрикции-модификации Приготовление растворов Готовят рестриктазную смесь последовательно согласно рецепту, приведенному в таблице 2.6. Таблица 2.6 - Состав и порядок приготовления рестриктазной смеси № п/п Компонент, исходная концентрация Количество на 50 мкл реакции Конечная концентрация 1 FastDigest Buffer, 10× 5 мкл 1× 2 Рестриктаза EcoRI, 10 U/мкл 3 мкл 6 U/мкл 3 Рестриктаза XbaI, 10 U/мкл 3 мкл 6 U/мкл 4а Образец ДНК, целевой ген IGF-LR3 1 мкл 100 мкг 10 мкл 4 мкг ИЛИ 4б Образец ДНК, плазмиды pcDNA3.1(+), 20 мкг/мкл 5 Нуклеазная вода до 50 мкл Реакционную смесь осторожно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха. Смесь используют сразу же. Процедура Реакцию проводят в течение 15 минут при температуре 37°С. Инактивируют прогреванием до температуры 65°С в течение 5 минут. 40

Результаты анализируют с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле. Фрагменты нужной длины вырезают из геля и экстрагируют в раствор набором QIAquick Gel Extraction Kit согласно протоколу производителя. 2.3.6. Лигирование фрагментов ДНК Приготовление растворов 50 % полиэтиленгликоль 4000. 50 г полиэтиленгликоля 4000 растворяют в 100 мл воды ультрачистой, перемешивают до полного растворения навески. Готовят лигазную смесь последовательно согласно рецепту, приведенному в таблице 2.7. Таблица 2.7 - Состав и порядок приготовления лигазной смеси № п/п Компонент, исходная концентрация Количество на 35 мкл реакции Конечная концентрация 1 Буфер для лигазы, 10× 3,5 мкл 1× 2 Полиэтиленгликоль 4000, 50 % 3,5 мкл 17,5 % 3 Рестрицированный ген IGF-LR3 2 мкл 1 мкг 4 Рестрицированная плазмида pcDNA3.1(+) 1 мкл 0,5 мкг 5 Лигаза фага T4, 10 U/мкл 5 мкл 6 U/мкл 6 Безнуклеазная вода до 35 мкл Реакционную смесь осторожно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха. Смесь используют сразу же. Процедура Реакционную смесь инкубируют при температуре 22°С в течение 4 часов. Ферментативную реакцию останавливают инкубацией реакционной смеси при температуре 65°С в течение 15 минут. Результаты анализируют с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле. Фрагменты нужной длины вырезают из геля и экстрагируют в раствор набором QIAquick Gel Extraction Kit согласно протоколу производителя. 41

2.3.7. Приготовление компетентных бактериальных клеток для трансформации Бактериальные клетки, компетентные к трасформации готовят согласно протоколу, описанному в [24]. Биомассу отдельной колонии клеток E.coli DH5α, выращенных на LB-агаре, помещают в 5 мл жидкой стерильной среды LB. Клетки выращивают в течение 12 ч. при температуре 37°C и постоянном перемешивании со скоростью 250 об./мин. 2 мл полученной клеточной суспензии помещают в 200 мл стерильной LBсреды. Клетки выращивают при аналогичных условиях до достижения оптической плотности суспензии клеток OD600 равной 0,6, после чего осаждают центрифугированием в течение 10 мин. со скоростью 4000g при температуре 4°C. Клеточный осадок ресуспендируют в 200 мл стерильной воды очищенной при температуре 4°C и затем центрифугируют в аналогичных условиях. Аналогично, процедуру повторяют трижды. После, осадок клеток ресуспендируют в 5 мл стерильной воды очищенной и центрифугируют в течение 30 сек со скоростью 10000g при температуре 4°C. К полученному клеточному осадку добавляют 2 – 5 мл стерильного 15 % раствора глицерина, осадок ресуспендируют и разливают по 500 мкл в криовиалы. Готовые к трансформации клетки хранят при температуре – (80 ± 5)°С. 2.3.8 Трансформация бактериальных клеток методом электропорации Электропорацию осуществляют в электропораторе Gene Pulser (Bio-Rad, США) согласно протоколу, описанному в [42]. Приготовление растворов Испытуемый образец. 1 мкл десятикратно разведенной лигазной смеси добавляют к 100 мкл суспензии компетентных клеток и перемешивают при температуре 0°C. 42

Процедура Трансформацию проводят в стерильных кюветах для электропорации (Eppendorf, Германия) с общим объемом 100 мкл, с шириной между обкладок электродов - 1 мм, при электрическом импульсе напряженностью 1,7 кВ длительностью 5-5,5 мсек. После трансформации клетки помещают в 1 мл среды SОС-cреды и инкубируют в течение 40 минут при температуре 37°C и постоянном перемешивании со скоростью 250 об./мин. Затем полученную суспензию клеток пересевают на LB-агар, содержащий ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. 2.3.9. Создание банка клеток бактериального штамма Для длительного хранения создают музейные образцы штаммов E.coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF -LR3 и рабочий банк клеток. Для этого единичную колонию штамма E.coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 инокулируют в 10 мл жидкой среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Культуру инкубируют в течение 24 ч. при температуре 37°C и постоянном перемешивании со скоростью 250 об./мин до достижения оптической плотности суспензии клеток OD600 равной 1,0. Далее, полученную культуральную суспензию разливают по 500 мкл в криовиалы и добавляют 500 мкл 20 % стерильного раствора глицерина, перемешивают и замораживают при температуре – (80 ±2)°C. Жизнеспособность культуры подтверждают путем микроскопирования прижизненных мазков культуры через 3, 6, 12, 16, 24 часа культивирования соответственно. Число мертвых клеток оценивают при помощи окраски фиксированного препарата 0,1% метиленовой синью. Наличие вставки на конец периода культивирования оценивают путем отбора 5 мл клеточной суспензии, выделения плазмиды и проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле. Для этого плазмиду из клеток, осажденных центрифугированием при 14000g, выделяют методом химического лизиса клеточных стенок и сорбции плазмид на колонках с последующей их элюцией при 43

помощи набора GeneJET PlasmidMiniPrep Kit, согласно инструкции производителя. Измерение концентрации выделенной плазмидной ДНК проводят с использованием прибора NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, США). 2.3.10. Микроскопирование бактериальных культур Микроскопирование бактериальных культур проводят методом оптической микроскопии с использованием светового микроскопа Nikon Eclipse E100 PH (Nikon, Япония). Приготовление препаратов Испытуемый образец. В случае подготовки фиксированного мазка: 100 мкл клеточной суспензии наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и проводят высоко над пламенем горелки до испарения воды. При необходимости подготовленный таким образом мазок остужают и окрашивают требуемым красителем. В случае подготовки препарата «раздавленная капля» (прижизненный мазок): 10 мкл клеточной суспензии наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и разводят в 90 мкл стерильной воды очищенной. Разбавленную таким образом суспензию аккуратно придавливают покровным стеклом и микроскопируют, излишки влаги убирают. Процедура Подготовленные, как описано выше, препараты просматривают на микроскопе при 100-кратном увеличении с иммерсионной системой. При просмотре фиксируют в начале центральное поле зрения, а затем просматривают как минимум 10 полей зрения. Если значимые различия между морфологическими свойствами клеток обнаруживаются, то к анализу еще добавляют 10 дополнительных полей зрения и отмечают морфологию клеток, подвижность (в случае прижизненного мазка). 44

2.3.11. Культивирование клеток бактериального штамма в биореакторе Культивирование проводят в биореакторе Sartorius BIOSTAT C plus (Sartorius, Франция) с рабочим объемом 30 л, оснащенным верхнеприводной шестилопастной мешалкой типа Раштон. Приготовление растворов 20 % раствор фосфорной кислоты. 235 мл 85 % раствора фосфорной кислоты добавляют в 765 мл воды очищенной и перемешивают. Раствор стерилизуют фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. 10% раствор натрия гидроксида. В градуированный мерный стакан вносят 350 мл воды очищенной, а затем добавляют 100 г натрия гидроксида и доводят водой очищенной до 1000 мл, раствор перемешивают. Раствор стерилизуют фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Среда LB. Готовят 30 л среды LB растворением 300 г пептона, 300 г натрия хлорида и 150 г дрожжевого экстракта в 5 л воды очищенной и перемешивают до полного растворения компонентов. Раствор доводят до 30 л водой очищенной и стерилизуют автоклавированием. 1000× раствор ампициллина (100 мг/мл). 5 г ампициллина натриевой соли разводят в 30 мл воды очищенной и перемешивают до полного растворения, а затем доводят водой до 50 мл. Раствор стерилизуют фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. 20 % раствор глюкозы. В 500 мл воды очищенной медленно при перемешивании добавляют 200 г глюкозы до полного растворения. Доводят до 1 л водой очищенной и стерилизуют автоклавированием. Среда LB с антибиотиком. Непосредственно перед культивированием к 30 л стерильной среды LB вносят 30 мл 1000× раствора ампициллина до конечной концентрации ампициллина – 100 мкг/мл. 1 % раствор пеногасителя A. 10 мл концентрата пеногасителя А разводят водой очищенной до 1 л. Раствор стерилизуют автоклавированием. 45

Процедура Подготовка биореактора. Подготовка ферментера состояла из следующих стадий: 1) Подключение блоков управления и коммуникаций (кислота, щелочь, 1 % пеногаситель А, 20 % раствор глюкозы). 2) Калибровка датчика рН по буферным растворам. 3) Настройка и калибровка датчика температуры. 4) Добавление среды LB, корректировка рН. 5) Стерилизация ферментера и среды LB. 6) Калибровка датчика растворенного кислорода (рО2) до 100% насыщения среды кислородом. 7) Асептическое добавление 1000× раствора ампициллина до конечной концентрации ампициллина – 100 мкг/мл. 8) Внесение посевного материала (инокулята). Культивирование. Культивирование штамма осуществляют в течение 24 часов при температуре (30 ± 2)°C со скоростью мешалки (300 ± 50) об/мин, скоростью подачи стерильного воздуха 1,2 мл/мин при pH (7,2 ± 0,2). Съем биомассы. Полученную культуральную суспензию сливают до полного опорожнения ферментера. Биореактор затем моют и стерилизуют паром под давлением. Биомассу концентрируют путем центрифугирования при 12000g и температуре 4 С, культуральную жидкость отбрасывают. Сконцентрированную биомассу хранят при – (20 ± 2)°C 46

2.3.12. Выделение плазмиды щелочным методом Выделение плазмиды осуществляют согласно протоколу, описанному в [20]. Приготовление растворов Плазмидный буфер I. Плазмидный буфер I готовят согласно рецепту, приведенному в таблице 2.8. Таблица 2.8 - Состав и порядок приготовления плазмидного буфера I № п/п Компонент, конечная концентрация Концентрация стокового раствора 1 2 3 4 50 мМ глюкоза 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0 10 мМ натрий ЭДТА Вода ультрачистая 2М 1М 0,5 М - Объем стока на 100 мл 2,5 мл 2,5 мл 2,0 мл 93 мл Объем стока на 200 мл 5,0 мл 5,0 мл 4,0 мл 186 мл Объем стока на 5000 мл 125 мл 125 мл 100 мл 4650 мл Примечание: Все стоковые растворы компонентов готовят с использованием воды ультрачистой и используют свежеприготовленными. Плазмидный буфер II. Плазмидный буфер II готовят согласно рецепту, приведенному в таблице 2.9. Таблица 2.9 - Состав и порядок приготовления плазмидного буфера II № п/п Компонент, конечная концентрация Концентрация стокового раствора 1 2 3 0,2 Н натрия гидроксида 1 % натрия додецилсульфат Вода ультрачистая 1Н 10 % - Объем стока на 1 мл 0,2 мл 0,1 мл 0,7мл Объем стока на 11 мл 2,2 мл 1,1 мл 26 мл Объем стока на 100 мл 20 мл 10 мл 70 мл Примечание: Итоговый раствор хранят в плотно укупоренной таре без доступа воздуха. Буфер TE с добавлением РНКазы A. К 1 мл 1 M Трис-HCl, pH 8.0 добавляют 200 мкл 0,5 М натрия ЭДТА и доводят водой ультрачистой до 100 мл. К приготовленному буферу добавляют РНКАазу А до конечной концентрации 50 мкг/мл. Раствор используют свежеприготовленным. Остатки утилизируют. 10 М раствор аммония ацетата. 770,83 г аммония ацетата растворяют в 1000 мл воды ультрачистой. 47

Процедура Клеточный осадок ресуспензируют в плазмидном растворе I. Объем раствора I рассчитывают, исходя из соотношения клеточный осадок : раствор I как 1:2. Добавляют плазмидный раствор II, исходя из соотношения раствор I : раствор II как 1:2, смесь медленно переворачивают 5 раз. Затем центрифугируют со скоростью 5000g при температуре 0°C в течение 5 минут. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют 10 М раствор аммония ацетата, охлаждённого до 0°C, исходя из соотношения супернатант : 10 М раствор аммония ацетата как 3:1. Смесь медленно переворачивают 5 раз. Затем центрифугируют со скоростью 5000g при температуре 0°C в течение 5 минут. Осадок отбрасывают. Супернатант смешивают с изопропиловым спиртом в соотношении 2:1 и перемешивают. Инкубируют в течение 10 мин. Затем центрифугируют со скоростью 5000g при температуре 0°C в течение 10 минут. Супернатант отбрасывают. Центрифугируют повторно со скоростью 5000g при температуре 0°C в течение 10 минут. Остатки супернатанта сбрасывают. Быстро добавляют минимальное количество 2 M аммония ацетата и примешивают, инкубируют 5 мин при температуре 0°C. Затем центрифугируют со скоростью 5000g при температуре 0°C в течение 5 минут. Супернатант объединяют с изопропиловым спиртом в соотношении 1:1, инкубируют 10 мин при температуре 0°C. Затем центрифугируют со скоростью 5000g при температуре 0°C в течение 10 минут. Супернатант отбрасывают. Осадок промывают 70 % раствором этилового спирта, затем растворяют в 100-10 000 мкл воды ультрачистой (в зависимости от объема исходной клеточной массы). В 25 мкл полученного раствора определяют концентрацию ДНК путем спектрофотометрического измерения на приборе NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) и проводят электрофорез в агарозном геле. 48

2.3.13. Получение клеточной культуры фибробластов Культуры клеток фибробластов получают согласно описанной методике [3]. Процедура Первичный клеточный материал получают из образцов кожи (размер образцов составлял около 5×5 мм) крыс Rattus norvegicus, которые обрабатывают 70 % этанолом, а затем трижды промывают стерильным фосфатно-солевым буфером (pH 7.4 ± 0.2). Часть обработанных образцов кожи отделяют от эпидермиса, используя стерильный 0,25 % трипсин-ЭДТА. Далее образцы дермы размельчают на куски менее 1×1 мм и помещают в 100-миллиметровую чашку для тканевых культур с полной модифицированной средой Игла-Дульбекко (DMEM) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1 % раствора пенициллина; инкубируют при 37°C с 5 % насыщением СО2. Через каждые 20 часов культивирования вносят дополнительно 1,5 мл среды аналогичного состава в течение 3 суток. После размножения клеток до монослоя 85-95 %, их собирают трипсинолизом. Полученную суспензию центрифугируют при 300g в течение 7 мин, очищенные фибробласты пассируют в культуральные флаконы со свежей средой DMEM с добавлением 1 % раствора пенициллина. Субкультивирование таким образом продолжают аналогично в течение 7 пассажей. Полученную культуру клеток фибробластов (Fib) в седьмом пассаже fib7 с плотностью около 3×104 клеток/мл высевают и культивируют в 6-луночном планшете. 2.3.14. Приготовление компетентных клеточных культур для трансформации Клетки, компетентные к трасформации готовят согласно протоколу, описанному в [31]. Процедура Клетки выращивают до плотности 4 × 10 7 клеток/мл, а затем обрабатывают 0,25 % трипсином, затем трипсин инактивируют, добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. 49

Клетки осаждают путем центрифугирования в течение 5 минут при 640g при температуре 4°C. Ресуспендируют осадок клеток в охлажденном льдом буфере для электропорации в объеме, меньшем вполовину от первоначального объема. Клетки осаждают путем центрифугирования в течение 5 минут при 640g при температуре 4°C. Ресуспендируют клетки буфере для электропорации до концентрации 1×10 7 клеток/мл при температуре 0°C. 2.3.15. Трансформация клеточных культур методом электропорации Электропорацию осуществляют в электропораторе Gene Pulser (Bio-Rad, США). Трасформацию проводят согласно протоколу, описанному в [31]. Приготовление растворов Испытуемый образец. 1 мкл десятикратно разведенной плазмиды pDNA3.1(+)-IGF-LR3 с концентрацией 20 нг/мкл добавляют к 900 мкл суспензии компетентных клеток и перемешивают при температуре 0°C. Процедура Трансформацию проводят в стерильных кюветах для электропорации (Eppendorf, Германия) с общим объемом 100 мкл, с шириной между обкладок электродов - 1 мм, при электрическом импульсе напряженностью 0,8 кВ длительностью 3-4,5 мсек. После трансформации клетки разводят в 20 мл среды DMEM с добавлением неомицина до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в течение 60 ч. при температуре 37°C с 5 % насыщением СО2. Затем полученную суспензию клеток пересевают в 50 мл среды DMEM с добавлением неомицина до конечной концентрации 50 мкг/мл. 2.3.16. Создание банка клеточных культур Процедуру криоконсервации клеточных культур осуществляют согласно протоколу, описанному в [32]. Для длительного хранения создают музейные образцы пула клеточной линии fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 и рабочий банк клеток. Для этого единичную 50

биомассу клеточной линии fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 в виде суспензии засевают в среду DMEM с добавлением неомицина до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в течение 56 часов при температуре 37°C с 5 % насыщением СО2 до достижения монослоя 78-86 %. Далее, полученную культуру аккуратно разливают по 500 мкл в криовиалы и добавляют 500 мкл 20 % стерильного диметилсульфоксида, перемешивают и замораживают со скоростью 1°C/мин. понижая температуру до – 80°C. Замороженную культуру затем хранят при – (190 ± 2)°C в атмосфере жидкого азота. Жизнеспособность и морфологическую однородность культуры подтверждают путем микроскопирования прижизненных мазков культуры. Наличие вставки на конец периода культивирования оценивают путем отбора 1 мл клеточной суспензии, выделения плазмиды и проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле. Для этого плазмиду из клеток, осажденных центрифугированием при скорости 650g, выделяют методом химического лизиса клеточных стенок и сорбции плазмид на колонках с последующей их элюцией при помощи набора GeneJET PlasmidMiniPrep Kit, согласно инструкции производителя. Измерение концентрации выделенной плазмидной ДНК проводят с использованием прибора NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, США). 2.3.17. Микроскопирование клеточных культуры Микроскопирование клеточных культур проводят методом оптической микроскопии с использованием инвертированного светового микроскопа Eclipse Ti2A (Nikon, Япония). Приготовление препаратов Испытуемый образец. Готовят препарат «раздавленная капля» (прижизненный мазок): 20 мкл клеточной суспензии наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и разводят в 10 мкл стерильного раствора натрия хлорида 0,9%. Разбавленную таким образом суспензию аккуратно придавливают покровным стеклом и микроскопируют, излишки влаги убирают. 51

Процедура Подготовленный, как описано выше, препарат просматривают на микроскопе при 40-кратном увеличении. При просмотре фиксируют в начале центральное поле зрения, а затем просматривают как минимум 10 полей зрения. Если значимые различия между морфологическими свойствами клеток обнаруживаются, то к анализу добавляют еще 10 дополнительных полей зрения и отмечают морфологию клеток, видимое физиологическое состояние, подсчитывают количество дифференцированных клеток и клеточных агрегатов. 2.3.18. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле проводят с использованием прибора Bio-Rad Powerpac basic (Bio-Rad, США) на основе методики, описанной Сэмбрук [35]. Приготовление растворов 0,5 М раствор натрия ЭДТА pH 8,0. К 93 г натрия ЭДТА добавляют 350 мл воды ультрачистой. Перемешивают до полного растворения, доводят pH до 8,0 потенциометрически. Объем раствора доводят до 500 мл водой ультрачистой. Готовый раствор хранят при комнатной температуре не более 6 месяцев. 50× буферный раствор TAE. 242 г трис(гидроксиметил)аминометана, добавляют 700 мл воды ультрачистой. Перемешивают до полного растворения соли. Добавляют 57 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл 0,5М раствора натрия ЭДТА, рН 8,0. Доводят объем раствора до 1000 мл водой ультрачистой. Готовый раствор хранят при комнатной температуре не более 2 месяцев. 1× буферный раствор TAE. Отбирают 20 мл 50× TAE-буфера и доводят объем раствора до 1000 мл водой ультрачистой. Готовый раствор хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Процедура Приготовление и заливка агарозного геля. На аналитических весах взвешивают навеску агарозы, необходимую для получения геля расчетной процентной концентрации. Параметры расчета навесок для одной гелевой рамки размером 12,5×7,6 мм приведены в таблице 2.10. Концентрация геля выбирается, исходя из 52

предполагаемых размеров молекул ДНК в образцах (согласно таблице 2.11). Поместить навеску в колбу на 300 мл. Таблица 2.10 - Пример расчета массы навесок агарозы Масса навески агарозы для приготовления 80 мл геля, г 0,64 ± 0,01 0,80 ± 0,02 0,96 ± 0,06 1,20 ± 0,01 1,60 ± 0,03 2,40 ± 0,01 Концентрация агарозы, % 0,8 1 1,2 1,5 2 3 Таблица 2.11 - Выбор процентности геля в зависимости от размера разделяемых молекул Концентрация агарозы, % 0,8 1 1,2 1,5 2 3 Диапазон размеров разделяемых молекул ДНК, пар оснований 800 – 10000 500 – 7000 400 – 6000 200 – 3000 100 – 2000 <100 Навеску агарозы растворяют в 80 мл 1× TAE-буфера при нагревании до полного растворения. Раствор агарозы остужают до 50-60°C. Добавляют водный раствор бромистого этидия до конечной концентрации 0,2 мкг/мл и перемешивают, избегая образования воздушных пузырьков. Заливают полученный раствор агарозы в гелевую рамку, устанавливают в рамку необходимое количество гребенок определенного размера, сообразно количеству и объему наносимых образцов ДНК. Дождаются полного застывания геля при комнатной температуре. Осторожно извлекают гребенки из геля. Проведение электрофореза. В электрофоретическую камеру помещают гелевую рамку с гелем так, чтобы лунки располагались ближе к катоду. Камеру заполняют 1× TAE-буфером так, чтобы он полностью покрывал гель. Смешивают образцы ДНК с буфером для нанесения 6× DNA Loading Dye в пропорции 5:1 по объему. Объем наносимого образца рассчитывают в зависимости от предполагаемой концентрации ДНК. По очереди вносят образцы ДНК и маркер молекулярных весов (GeneRuler DNA Ladder Mix или 1 Kb Plus DNA Ladder) в отдельные лунки агарозного геля под слой буферного раствора TAE. 53

Проводят электрофорез при напряжении 120 В при комнатной температуре в течение времени, необходимого для завершения фракционирования: при достижении окрашенных маркеров малых масс отметки, соответствующей 0,5 см от нижней границы геля. При необходимости, выделяют продукты фракционирования ДНК из геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit. Окрашенный гель сканируют на приборе Azure biosystems c600 (Azure Biosystems, США). 2.3.19. Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях проводят с использованием прибора Bio-Rad Powerpac basic (Bio-Rad, США) на основе методики, разработанной Лэммли [17]. Приготовление растворов 30 % раствор акриламида/бисакриламида (36,5:1). 29,20 г акриламида и 0,80 г бисакриламида растворяют в 80 мл воды ультрачистой, перемешивают до полного растворения навески. Доводят объем раствора водой до 100 мл, фильтруют через фильтр с диаметром пор не более 0,45 мкм. Срок годности раствора: 1 мес. при температуре (5 ± 3)°C в защищенном от света месте. 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида рН 8,8. 45,425 г трис(гидроксиметил)аминометана растворяют в 150 мл воды ультрачистой, перемешивают до полного растворения навески. Доводят рН раствора до (8,80 ± 0,05) 1 М раствором кислоты хлористоводородной (потенциометрически). Доводят объем раствора водой ультрачистой до 250 мл, перемешивают и фильтруют через фильтр с диаметром пор не более 0,45 мкм. Срок годности раствора: 1 мес. при температуре (5 ± 3)°C. 0,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида рН 6,8. 6,06 г трис(гидроксиметил)аминометана растворяют в 60 мл воды ультрачистой, перемешивают до полного растворения навески. Доводят рН раствора до (6,8 ± 0,05) 1 М раствором 54

кислоты хлористоводородной (потенциометрически). Доводят объем раствора водой ультрачистой до 100 мл, перемешивают и фильтруют через фильтр с диаметром пор не более 0,45 мкм. Срок годности раствора: 1 мес. при температуре (5 ± 3)°C. 0,5 М раствор натрия ЭДТА. 1,86 г натрия ЭДТА и 0,2 г натрия гидроксида растворяют в 5 мл воды очищенной, перемешивают до полного растворения навески. Доводят объем раствора водой очищенной до 10 мл, перемешивают. Срок годности раствора: 3 мес. при температуре (5 ± 3)°C. 50 % раствор глицерина. 50 г глицерина помещают в химический стакан вместимостью 200 мл, прибавляют 40 мл воды очищенной, перемешивают. Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают. Срок годности раствора: 1 мес. при комнатной температуре. 10 % раствор аммония персульфата. 100,0 мг аммония персульфата растворяют в 1,0 мл воды очищенной. Раствор используют свежеприготовленным. 10 % раствор натрия додецилсульфата. 10,0 г растворяют в 80 мл воды очищенной, перемешивают до полного растворения навески., доводят объем раствора водой очищенной до 100 мл, перемешивают. Срок годности раствора: 1 мес. при комнатной температуре. Раствор для формирования разделяющего геля 12,5 %. 25 мл 30 % раствора акриламид/бисакриламида, 12,5 мл 1,5 М буферного раствора трис-гидрохлорида рН 8,8, 500 мкл 10 % раствора натрия додецилсульфата, 10 мл 50 % раствора глицерина, 13 мл воды ультрачистой, 200 мкл 0,5 М раствора натрия ЭДТА помещают в химический стакан вместимостью 100 мл, перемешивают. К полученному раствору прибавляют 250 мкл 10 % раствора аммония персульфата и 25 мкл TEMED, перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. 55

Раствор для формирования концентрирующего геля 4 %. 3,75 мл 30 % раствора акриламида/бисакриламида, 6,25 мл 0,5 М буферного раствора трис-гидрохлорида рН 6,8, 250 мкл 10 % раствора натрия додецилсульфата, 15 мл воды ультрачистой, 100 мкл 0,5 М раствора натрия ЭДТА помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, перемешивают. К полученному раствору прибавляют 75 мкл 10 % раствора аммония персульфата, 25 мкл TEMED, перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. Электродный буферный раствор 10-кратный рН 8,3. 30,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 144,0 г глицина и 10,0 г натрия додецилсульфата растворяют в 800 сл воды очищенной перемешивают до полного растворения навески. Доводят объем раствора водой очищенной до 1000 мл, перемешивают. Срок годности раствора: 1 мес. при температуре (5 ± 3)°C. Электродный буферный раствор 1-кратный pH 8,3. 100 мл электродного буферного раствора 10-кратного pH 8,3 помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, прибавляют 800 мл воды, перемешивают. Доводят объем раствора водой до метки, перемешивают. Срок годности: 1 мес. при комнатной температуре. 0,5 % раствор бромфенолового синего. 0,25 г бромфенолового синего растворяют в 50 мл воды, перемешивают до полного растворения навески. Срок годности раствора: 1 мес. при комнатной температуре. Буферный раствор для нанесения образцов, не содержащий 2-меркаптоэтанол. 3,4 мл воды, 1,0 мл 0,5 М буферного раствора трис-гидрохлорида рН 6,8, 1,6 мл 50 % раствора глицерина, 1,6 мл 10 % раствора натрия додецилсульфата и 0,4 мл 0,5 % раствора бромфенолового синего помещают в химический стакан вместимостью 10 мл, перемешивают. По 1,0 мл полученного раствора помещают в пробирки вместимостью 1,5 мл. Срок годности раствора: 1 мес. при температуре не выше – 20°C. Буферный раствор для нанесения образцов, содержащий 2-меркаптоэтанол. 3,0 мл воды, 1,0 мл 0,5 М буферного раствора трис-гидрохлорида рН 6,8, 56

1,6 мл 50 % раствора глицерина, 1,6 мл 10 % раствора натрия додецилсульфата, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола и 0,4 мл 0,5 % раствора бромфенолового синего помещают в химический стакан вместимостью 10 мл, перемешивают. По 1,0 мл полученного раствора помещают в пробирки вместимостью 1,5 мл. Срок годности раствора: 1 мес. при температуре не выше – 20°C. Испытуемый раствор. Образец при необходимости разводят водой ультрачистой до концентрации белка 0,5 мг/мл (а). 0,1 мл разведенного испытуемого раствора (а) помещают в пробирку вместимостью 1,5 мл, прибавляют 0,3 мл буферного раствора для нанесения образцов, содержащего 2-меркаптоэтанол. Раствор используют свежеприготовленным. Процедура Вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле проводят в восстанавливающих условиях в присутствии натрия додецилсульфата с последующей окраской раствором Кумасси G-250 брильянтовым голубым. В электрофоретическую ячейку заливают раствор для формирования разделяющего геля 12,5 %. Мениск раствора в ячейке должен находиться на расстоянии 3 – 4 см от верхнего края внутреннего стекла. На раствор в ячейке наслаивают 1,0 мл воды так, чтобы гель и вода не перемешивались. Полимеризация геля происходит в течение 30 – 40 мин при комнатной температуре. Сначала граница между гелем и водой размывается, а затем становится резкой. Это является моментом окончания полимеризации. После окончания полимеризации разделяющего геля, воду сливают, поверхность геля тщательно подсушивают с помощью фильтровальной бумаги и заливают в ячейку раствор для формирования концентрирующего геля 4 %. После этого в ячейку вставляют гребенку для формирования лунок. Полимеризация геля происходит до четкого образования лунок при комнатной температуре. После завершения полимеризации гребенку удаляют, промывают образовавшиеся лунки один раз водой. 57

Нижнюю камеру прибора для электрофореза заполняют электродным буферным раствором 1-кратным pH 8,3 и вставляют в нее электрофоретическую ячейку с подготовленным гелем. Верхний резервуар заполняют электродным буферным раствором 1-кратным pH 8,3, удаляют из лунок пузырьки воздуха. Под слой электродного буферного раствора 1-кратного pH 8,3 в лунки разделяющего геля 4 % вносят исследуемые образцы. В лунку 1 вносят 10 мкл раствора маркеров молекулярных масс, предварительно разведенного буферным раствором для нанесения образцов, содержащим 2-меркаптоэтанол в соотношении (1:3). В лунку 2 вносят по 40 мкл буферного раствора для нанесения образцов, содержащего 2-меркаптоэтанол. В лунки 4-10 вносят по 30 мкл испытуемого(ых) раствора(ов) (по необходимости). Электрофорез проводят при комнатной температуре в режиме постоянного напряжения. При прохождении фронта красителя через концентрирующий гель напряжение составляет 100 В. После вхождения фронта красителя в нижний разделяющий гель на 5 – 7 мм напряжение увеличивают до 180 В. После продвижения красителя на 10 см от нижнего края концентрирующего геля ток отключают, отделяют гель от стекол ячейки и окрашивают нитратом серебра. Окрашивание геля раствором Кумасси G-250 брильянтовым голубым проводят с использованием соответствующего красителя согласно инструкции производителя. Время выдерживания геля в проявляющем растворе контролируют визуально. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в лунке со стандартным раствором. Окрашенный гель сканируют на сканере. 58

2.3.20. Секвенирование ДНК по методу Сэнгера Секвенирование фрагментов ДНК проводят с использованием капиллярного секвенатора Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и гелей 3500/3500xL Genetic Analyzer Polymer “POP-6” (Applied Biosystems, США). Процедура Амплифицируют, клонированные в плазмиде pcDNA3.1(+)/IGF-LR3, целевые фрагменты ДНК белка IGF-LR3 для секвенирования, используя набор BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit согласно инструкции производителя. Для маркировки продуктов реакции используют меченные флуоресцентным красителем ддНТФ, причем каждому ддНТФ соответствовал свой краситель. Используют немеченные праймеры IGF-F IGF-R для секвенирования клонированных фрагментов, последовательность которых представленав таблице 2.12. Таблица 2.12 – Праймеры для секвенирования Название праймера IGF-F IGF-R Последовательность Температура отжига,°C 5'-ATGTTCCCAGCCATGCCC-3' 5'-AGCACTTTTCGCGGGCT-3' 60,2 59,7 Реакционная смесь для амплификации целевого фрагмента для секвенирования содержит: • 2 мкл плазмидной ДНК pcDNA3.1(+)/IGF-LR3, 0,5 мкл праймера (5 пмоль), • 1,75 мкл 5x Sequencing buffer (350 mM Tris-HCl pH 9, 2.5 mM MgCl2), • 0,5 мкл BigDye Terminator ReactionMix, • 5,25 мкл воды безнуклеазной. Реакцию амплификации целевого гена проводят с помощью Taq-полимеразы в термоциклере ThermalCycler (Bio-Rad, США) в течение 35 циклов: • термостатирование при 95°C – 20 сек, • отжиг олигонуклеотидов при температуре 60°C – 20 сек, • элонгация при температуре 72°C – 2 мин. 59

Для достраивания образовавшихся цепей ДНК проводят дополнительный цикл: 7 мин при температуре 72°C. Реакционную смесь очищают от свободных меченых ddNTP согласно инструкции к набору. Секвенирование клонированных в плазмиде pcDNA3.1(+)/IGF-LR3 фрагментов ДНК проводят с использованием капиллярного секвенатора. Результаты разделения продуктов реакции секвенирования регистрируют путем сканирования лазером и детекции четырех флуоресцентных красителей, включенных во все типы ddNTP. Выравнивание последовательности ДНК осуществляют при помощи программного обеспечения Applied Biosystems (США), а также сопоставления полученных данных с генетическими базами данных клонотек алгоритмами BLAST. Референтная последовательность гена представлена в [4] (MA868014.1). 60

3. ОПИСАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА В достижение поставленных целей были проведены эксперименты по получению плазмидной конструкции pcDNA3.1(+)/IGF-LR3, экпрессирующей модифицированный инсулин подобный фактор роста 1 в клетках млекопитающих с использованием методов, указанных выше (срок хранения всех растворов химических веществ за исключением, растворов, использованных в генно-инженерных манипуляциях, составляет 1 год, если не было указано иное. Растворы, приготовленные в рамках генно-инженерных методик, использовали свежеприготовленными, если не было указано иное). Схема эксперимента представлена на рисунке 3.1. Рисунок 3.1 – Общая схема экспериментальных работ с указанием промежуточных этапов Коммерчески синтезированный методом сборочной ПЦР ген IGF-LR3, фланкированный сайтами рестрикции EcoRI и XbaI в количестве 5 нг амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров IG-F и IG-R (ООО «БИОССЕТ», Россия). Целевой ген IGF-LR3 очищали колоночным методом при помощи набора QIAquick PCR Purification Kit согласно протоколу производителя. Элюат после экстракции анализировали методом горизонтального электрофореза в агарозном 61

геле. Фрагмент нужной длины аккуратно вырезали из геля и экстрагировали целевой ген при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit согласно протоколу производителя. Очищенный целевой ген хранили при температуре – 20°C. Для проведения генно-инженерных работ в качестве вектора-переносчика целевого гена была выбрана плазмида pcDNA3.1(+), способная поддерживаться в клетках прокариот и экспрессировать белок в клетках млекопитающих. Коммерческую плазмиду в количестве 20 мкг разводили водой ультрачистой до концентрации 20 мкг/мл. Растворенную плазмиду хранили при температуре – 20°C. Отбирали аликвоту плазмиды pcDNA3.1(+) и разводили до концентрации 15 нг/мкл и подвергали рестрикции ферментами EcoRI и XbaI. Отбирали аликвоту очищенного целевого гена с концентрацией ~ 65,5 нг/мкл и разводили водой ультрачистой до концентрации 20 нг/мкл. Далее, образец подвергали рестрикции ферментами EcoRI и XbaI. Рестрикционные смеси фрагментов плазмиды и целевого гена разделяли методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Фрагменты нужной длины аккуратно вырезали из геля и экстрагировали независимо друг от друга при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit согласно протоколу производителя. Рестрицированные фрагменты плазмиды pcDNA3.1(+) и гена IGF-LR3 объединяли между собой в соотношении 1:2. Проводили лигирование фрагментов при помощи лигазы фага T4. Для получения больших количеств собранной плазмидной конструкции были выбраны клетки штамма Escherichia coli DH5α в качестве клетки-носителя получаемой плазмидной конструкции pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 со встроенным геном IGF-LR3, поскольку клетки штамма E. coli DH5α способны поддерживать множество копий рекомбинантной ДНК. Клетки E. coli DH5α готовили к электропорации, а затем проводили электропорацию с добавлением лигазной смеси. 62

Клетки после электропорации культивировали в 1 мл среды SOC с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в качестве селективного маркера до достижения оптической плотности суспензии OD600 равной 0,9. Полученную клеточную суспензию центрифугировали, 900 мкл культуральной жидкости отбрасывали. В оставшихся 100 мкл культуральной среды клетки ресуспендировал и пересевали на LB-агар с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в качестве селективного маркера. Культивирование проводили при температуре 37°C в течение 24 часов. Биомассу единичных колоний, выросших на LB-агаре с добавлением 100 мкг/мл ампициллина отбирали и засевали в жидкую среду LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и культивировали в аналогичных условиях. Таким образом, отобрали параллельно 6 выросших штаммов. У всех отобранных штаммов была проанализирована морфология методом микроскопирования прижизненных и окрашенных фиксированных мазков, а также проведено выделение плазмиды щелочным методом. Наличие вставки целевого гена подтверждали ПЦРамплификацией с использованием праймеров IG-F и IG-R и последующим анализом методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. У 2 из 6 штаммов было подтверждено наличие вставки. Данные штаммы были использованы в дальнейшем для создания главного и рабочего банка клеток, согласно методике описанной выше (см. п. 2.3.9). Биомассу клеток штамма E. coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 использовали для получения посевного материала для синтеза биомассы в биореакторе. В 1000 мл среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина засевали 100 мкл бимассы из клеточного банка. Культивировали при температуре 37°C в течение 24 часов при перемешивании со скоростю 250 об./мин. Для получения большого объема рекомбинантной плазмиды pcDNA3.1(+)IGF-LR3 клетки E. coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 культивировали в ферментере в 30 л среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Затем плазмиду pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 выделяли щелочным методом и анализировали методом горизонтального электрофореза в агарозном геле, а также определяли концентрацию ДНК в растворе на приборе NanoDrop ND-2000 63

(Thermo Fisher Scientific, США). Выделенную плазмиду хранили при температуре – (20 ± 2)°C. В качестве модельной культуры были выбраны клетки фибробластов, поскольку данные клетки, синтезирующие внеклеточный матрикс, составляют основу соединительной ткани организма. Фибробласты секретируют предшественники белков коллагена и эластина, а также мукополисахариды. Культуру клеток фибробластов выделяли из образцов дермы крыс Rattus norvegicus согласно методике, описанной выше (см. п. 2.3.13). Стабильно перевиваемые клетки фибробластов были получены на 7 пассаже, поэтому культуре клеток было дано название fib7. Культуру клеток fib7 готовили к трасформации, а затем встраивали плазмиду, несущую рекомбинантный ген IGF-LR3 - pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 методом эектропорации. Подлинность вставки анализировали методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Правильность вставки анализировали методом секвенирования по Сенгеру с использованием праймеров IFG-F и IGF-R. Экспрессию белка оценивали методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле на лизатах, полученных из клеточной суспензии методом УЗИ. Полученные рекомбинантные клетки fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 использовали для создания банка клеток. 64

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Физическая карта полученной плазмидной конструкции представлена на рисунке 4.1. Полный сиквенс данной плазмидной конструкции представлен в Приложении Б. Рисунок 4.1 - Физическая карта полученной плазмидной конструкции pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 Результаты электрофоретического разделения рестрицированных фрагментов гена IGF-LR3 и плазмиды pcDNA3.1(+) представлены на рисунке 4.2. 65

bp 20 000 10 000 7 000 5000 4000 3000 2000 1500 1000 700 500 400 300 200 75 MW 1 2 A MW 1 Б Рисунок 4.2 - Результаты электрофореза ДНК: bp – число пар оснований А – электрофорез плазмиды pcDNA3.1(+) (MW – маркеры GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder, 1 – плазмида pcDNA3.1(+), рестрицированная по сайту EcoRI, 2 – плазмида pcDNA3.1(+) без рестрикции); Б – электрофорез гена IGF-LR3 (MW – маркеры GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder, 1 – рестрицированный ген IGF-LR3) Как видно, фрагменты имеют требуемую величину, являющуюся сопоставимой с маркерами. При этом, при анализе плазмидной ДНК без рестрикции наблюдаемые полосы отличаются от плазмидной рестрицированной ДНК. Это связано с тем, что природная плазмидная ДНК находиться в трех состояниях: линейной (минорные количества), кольцевой (минорные количества) и суперскрученной (основная полоса в лунке 2 на рисунке 4.2 A). Результаты электрофоретического разделения плазмиды pcDNA3.1(+)-IGFLR3, несущей ген IGF-LR3 представлены на рисунке 4.3. 66

bp 20 000 10 000 7 000 5000 4000 3000 2000 1500 1000 700 500 400 300 200 75 MW 1 2 Рисунок 4.3 - Результаты электрофореза ДНК: MW – маркеры GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder, 1 – плазмида pcDNA3.1(+)-IGF-LR3, рестрицированная по сайту EcoRI, 2 – плазмида pcDNA3.1(+), рестрицированная по сайту EcoRI Полученные результаты показывают незначительную разницу между положениями образцов на дорожках 1 и 2, что свидетельствует о вставке гена IGF-LR3. Фиксированные и окрашенные по Граму мазки клеток E. coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 просматривали под микроскопом со 100-кратным увеличением объектива и характеризовали морфологию (рисунок 4.4). 67

Рисунок 4.4 - Типичная микроскопическая картина фиксированного мазка клеток E. coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 Показано, что клетки представляют собой грамотрицательные палочки правильной формы, часто собранные в небольшие цепочки или парами. Посторонних клеток с отличающейся морфологией не просматривается. Вставку целевого гена в 6 клонах подтверждали ПЦР-амплификацией с использованием праймеров IG-F и IG-R и последующим анализом методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Результаты электрофореза представлены на рисунке 4.5. 68

bp 20 000 10 000 7 000 5000 4000 3000 2000 1500 1000 700 500 400 300 200 75 MW 1 2 3 4 5 6 Рисунок 4.5 - Результаты электрофореза ДНК: MW – маркеры GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder, 1 – 6 амплификаты генов, выделенных плазмид pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 из штаммов E. coli DH5α после процедуры электропорации По результатам амплификации из шести отобранных штаммов только у двух была обнаружена вставка целевого гена. Данные штаммы были использованы для создания рабочего банка клеток и, в дальнейшем, для опытно-промышленного получения плазмидных конструкций pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 в биореакторе. Биореактор засевали 1000 мл инокулята при оптической плотности клеточной суспензии OD600 равной 1,5. По результатам культивирования отклонений в параметрах процесса зафиксировано не было, график изменения показателей (pH, концентрация растворенного кислорода, скорость перемешивания) во время культивирования представлен в Приложении В. Плазмиду pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 выделяли из биомассы E. coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3, сконцентрированную путем центрифугирования щелочным методом. Концентрация плазмиды в растворе составила 35,7 мг/мл. 69

После 8 часов культивирования было зафиксировано повышение концентрации растворенного кислорода, что свидетельствует о переходе культуры в фазу экспоненциального роста. Прижизненные образцы клеток фибробластов fib7 а также культур после трансфекции fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 после трасфекции просматривали под микроскопом с 10-кратным увеличением объектива и характеризовали однородность и гомологию. Типичные картины микроскопирования представлены на рисунках 4.6 - 4.7. Рисунок 4.6 - Типичная микроскопическая картина образца клеток фибробластов fib7 до трасфекции 70

Рисунок 4.7 - Типичная микроскопическая картина образца клеток фибробластов fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 после траснфекции Все клетки имеют морфологически однородную гомологию, клетки после трансфекции имели более маленький размер, что, по-видимому, связано с переносом стресса после воздействия электрического тока при вставке рекомбинантного гена. Пробы клеточных лизатов анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях. Полученный гель окрашивали раствором Кумасси R-250. Результаты электрофореза представлены на рисунке 4.8. 71

kDa 180 130 100 1 2 3 4 5 75 63 48 35 28 17 10 Рисунок 4.8 - Электрофореграмма клеточной культуры fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3: 1 – маркеры молекулярных масс, 2, 3 – лизаты клеточной культуры fib7/pcDNA3.1(+)-IGFLR3 (стрелками указаны полосы целевого белка IGF-LR3), 4, 5 – лизаты клеточной культуры fib7 без вставки плазмиды Правильность и подлинность встраивания гена в культуры клеток фибробластов контролировали секвенированием по методу Сэнгера с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V.3.1. Секвенирование клонированных в плазмиде pcDNA3.1(+)/IGF-LR3 фрагментов ДНК проводят с использованием капиллярного секвенатора 3500/3500xL Genetic Analyzer и гелей 3500/3500xL Genetic Analyzer Polymer “POP-6”. Выравнивание последовательности ДНК проводили при помощи программного обеспечения Applied Biosystems, а также сопоставления полученных данных с известной последовательностью IGF-LR3 банка генов алгоритмами BLAST (Sequence Viewer). Референтная последовательность гена представлена в [4] (MA868014.1). 72

Анализ данных секвенирования показал, что была достигнута 99 % степень гомологии с целевым геном. Неполное перекрытие, по-видимому, свидетельствует о наличии замененных нуклеотидах и/или наличии ошибок при амплификации полимеразами, а также погрешностью методики. 73

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Был проведен анализ литературы, показана актуальность данного исследования, а также актуальность создания генетической конструкции, экспрессирующей ген модифицированного иснулин-подобного фактора роста 1 (IGF-LR3) в качестве активной молекулы для получения генотерапевтического препарата. В результате генно-инженерных экспериментов была получена плазмида, кодирующая синтез IGF-LR3 - pcDNA3.1(+)-IGF-LR3. Далее был получен рекомбинантный штамм E.coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGFLR3, несущий плазмиду, кодирующую ген IGF-LR3. Было показано, что полученный штамм перспективно использовать для получения опытно-промышленных количеств плазмидной ДНК, способной экспрессироваться в клетках млекопитающих. Была выделена щелочным методом и в дальнейшем использована для создания рекомбинантной клеточной культуры плазмида pcDNA3.1(+)-IGF-LR3. Таким образом, разработана технология получения генетического материала (плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3) в опытно-промышленном масштабе. Также получена модельная клеточная культура клеток фибробластов fib7. Создана рекомбинантная клеточная культура клеток фибробластов fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 - продуцент рекомбинантного белка IGF-LR3. Показана экспрессия рекомбинантного белка в клетках фибробластов методом вертикального электрофореза в восстанавливающих условиях. Проведен анализ и подтверждено соответствие ориентации и места встраивания гена IGF-LR3 в плазмиду методом секвенирования по методу Сэнгера. Таким образом, была получена рекомбинантная ДНК, кодирующая синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3), что соответствует поставленной цели исследования. Кивилев Евгений Владимирович 15.06.2020 74

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и приме- нение. – М.: Мир, 2002. – C. 589. 2. Al-Dosari M. S., Gao X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress // The AAPS journal. – 2009. – V. 11. – №. 4. – P. 671. 3. Amiri F. T. et al. The effects of insulin-like growth factor-1 gene therapy and cell transplantation on rat acute wound model // Iranian Red Crescent Medical Journal. – 2014. – V. 16. – №. 10. 4. Antipov L. D. J. et al. Bi-Specific Therapeutic Proteins for Tissue Repair: patent № 16026319, USA. – 2019. 5. Chuah M. K. L., Collen D., VandenDriessche T. Biosafety of adenoviral vectors //Current gene therapy. – 2003. – V. 3. – №. 6. – P. 527-543. 6. Cooray S., Howe S. J., Thrasher A. J. Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning // Methods in enzymology. – Academic Press, 2012. – V. 507. – P. 29-57. 7. Du L. et al. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis // Human gene therapy. – 2011. – V. 22. – №. 8. – P. 959-968. 8. Fintini D., Brufani C., Cappa M. Profile of mecasermin for the long-term treatment of growth failure in children and adolescents with severe primary IGF-1 deficiency // Therapeutics and clinical risk management. – 2009. – V. 5. – P. 553. 9. Gao X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress //The AAPS journal. – 2009. – V. 11. – №. 4. – P. 671. 10. Gascón A. R., del Pozo-Rodríguez A., Solinís M. Á. Non-viral delivery systems in gene therapy // Gene Therapy-Tools and Potential Applications. – InTech, 2013. 11. Giacca M. Gene Therapy // Italia: Springer-Verlag. – 2010 г. – P. 383 12. Guevara-Aguirre J. et al. A randomized, double blind, placebo-controlled trial on safety and efficacy of recombinant human insulin-like growth factor-I in children with growth hormone receptor deficiency // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. – 1995. – V. 80. – №. 4. – P. 1393-1398. 75

13. Guidebook for the Synthesis of Oligonucleotides // LGC Genomics Ltd. – 2015. – P. 25. 14. Hawley R. G. et al. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy // Gene therapy. – 1994. – V. 1. – №. 2. – P. 136-138. 15. Jan H. et al. IGF-1 has plaque-stabilizing effects in atherosclerosis by altering vascular smooth muscle cell phenotype // The American journal of pathology. – 2011. – V. 178. – №. 2. – P. 924-934. 16. Jin L. et al. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers // Theranostics. – 2014. – V. 4. – №. 3. – P. 240. 17. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – V. 227. – №. 5259. – P. 680-685. 18. Laron Z. et al. Body composition in untreated adult patients with Laron syndrome (primary GH insensitivity) // Clinical endocrinology. – 2006. – V. 65. – №. 1. – P. 114-117. 19. Lee E. J., Jameson J. L. Gene therapy of pituitary diseases // Journal of endocrinology. – 2005. – V. 185. – №. 3. – P. 353-362 20. Lee S. Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. – 1990. – V. 9. – №. 6. – P. 676-679. 21. Li S. D., Huang L. Gene therapy progress and prospects: non-viral gene therapy by systemic delivery // Gene therapy. – 2006. – V. 13. – №. 18. – P. 1313. 22. Li S. D., Huang L. Non-viral is superior to viral gene delivery // Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society. – 2007. – V. 123. – №. 3. – P. 181. 23. Lippert-Rasmussen K. Gene Therapy and Ethics // Journal of Medical Ethics. – 2002. – V. 28. – P. 58. 24. Making your own electrocompetent cells // NEB URL: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-electrocompetent-cells (дата обращения: 26.10.2019). 25. Mintzer M. A., Simanek E. E. Nonviral vectors for gene delivery // Chemical reviews. – 2008. – V. 109. – №. 2. – P. 259-302 76

26. Mohan S., Baylink D. J. Beyond carrier proteins: IGF-binding proteins are multifunctional and act via IGF-dependent and–independent mechanisms //J endocrinol. – 2002. – V. 175. – P. 19-31. 27. Newman C. M. H., Bettinger T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer // Gene therapy. – 2007. – V. 14. – №. 6. – P. 465. 28. Papayannakos C., Daniel R. Understanding lentiviral vector chromatin targeting: working to reduce insertional mutagenic potential for gene therapy // Gene therapy. – 2013. – V. 20. – №. 6. – P. 581. 29. Petrus I., Chuah M., VandenDriessche T. Gene therapy strategies for hemophilia: benefits versus risks // The journal of gene medicine. – 2010. – V. 12. – №. 10. – P. 797-809. 30. Ponder K. P. Vectors in gene therapy. An introduction to molecular medicine and gene therapy. // John wiley & sons Inc, USA. – 2000 – P. 77-112. 31. Potter H., Heller R. Transfection by electroporation // Current protocols in molecular biology. – 2018. – V. 121. – №. 1. – P. 9.3.1-9.3. 13. 32. Protocol for Preparation of Frozen Stock // NEB URL: https://international.neb.com/protocols/2012/05/24/protocol-for-preparation-of-frozen-stock (дата обращения: 20.11.2019). 33. QIAquick® Spin Handbook // Qiagen Ltd. – 2001. – P. 19-20. 34. Rey-Rico A., Cucchiarini M. Controlled release strategies for rAAV -mediated gene delivery // Acta Biomater. – 2016 – V. 29 – P. 1-10. 35. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. – 2001 – P. 2344 36. Sandri M. Signaling in muscle atrophy and hypertrophy // Physiology. – 2008. – V. 23. – №. 3. – P. 160-170. 37. Seidlits S. K. et al. Hydrogels for lentiviral gene delivery // Expert opinion on drug delivery. – 2013. – V. 10. – №. 4. – P. 499-509. 38. Shirley S. A., Heller R., Heller L. C. Electroporation gene therapy. Gene Therapy of Cancer // Academic Press. – 2014. – P. 93-106. 77

39. Somia N., Verma I. M. Gene therapy: trials and tribulations //Nature Reviews Genetics. – 2000. – V. 1. – №. 2. – P. 91. 40. Su C. H. et al. Nonviral gene therapy targeting cardiovascular system //American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. – 2012. – V. 303. – №. 6. – P. H629-H638. 41. Tomas F. M. et al. Superior potency of infused IGF-I analogues which bind poorly to IGF-binding proteins is maintained when administered by injection //Journal of endocrinology. – 1996. – V. 150. – №. 1. – P. 77-84. 42. Transformation Protocol // NEB URL: https://international.neb.com/protocols/2012/05/21/transformation-protocol (дата обращения: 06.11.2019). 43. European health report, 2018 // World Health Organization URL: https://www.euro.who.int/en/publications/abstracts/european-health-report-2018.more-than-numbers-evidence-for-all-2018 (дата обращения: 26.09.2019). 44. Yakar S. et al. Circulating levels of IGF-1 directly regulate bone growth and density // The Journal of clinical investigation. – 2002. – V. 110. – №. 6. – P. 771-781 45. Yu M., Poeschla E., Wong-Staal F. Progress towards gene therapy for HIV infection // Gene therapy. – 1994. – V. 1. – №. 1. – P. 13-26. 78

ПРИЛОЖЕНИЕ А Схема перекрытия праймеров при сборочной полимеразно-цепной реакции 79

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Полный сиквенс плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 80

Примечание: Ген IGF-LR3 выделен. Описание остальных значимых фрагментов приведено в подразделе 2.1. 84

ПРИЛОЖЕНИЕ В График изменения показателей во время культивирования Примечание: Обозначения на осях графика: T – температура,°C; dO – концентрация растворенного кислорода, %; Stirrer – скорость оборотов мешалки, об./мин. 85

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Яна Пазенко

Рецензия на диссертационную работу по теме «Получение рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3)» от инженера-химика ООО "Ассоциация Медицины и Аналитики" Пазенко Я.Э.

больше 4 лет назад

Рецензия от Вершилов Сергей Вячеславович

Рецензия от С.В. Вершилова, к.х.н., старший научный сотрудник ФГУП НИИСК

больше 4 лет назад

Рецензия от Попова

Рецензия на магистерскую диссертацию Кивилева Е.В. "Получение рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3)" для конкурса "Путь в науку" от профессора, доктора химических наук Поповой Л.М.

больше 4 лет назад

Рецензия от Екатерина Аронова

Рецензия на работу Кивилева Е.В. доцента СПбПУ к.т.н. Ароновой Е.Б.

больше 4 лет назад

Рецензия от Цырульникова Анжелика

Диссертационная работа посвящена созданию генной конструкции, способной экспрессировать белок - модифицированный инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-LR3) в клетках млекопитающих. Показана перспективность использования полученной конструкции в качестве основы для генотерапевтических препаратов, предназначенных для терапии наследственных генетических нарушений роста.

больше 4 лет назад

Рецензия от Ирина Тимошенкова

Рецензия на работу Кивелева Е.

больше 4 лет назад

Рецензия от Евгений Кивилев

Рецензия на работу Заведующего кафедрой молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) д. б. н. Виноходова Д. О.

больше 4 лет назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

0.5

Дарья Черникова

Научно-исследовательская часть магистерской диссертации Кивилева Евгения, выполненная на базе ФГУП ГНИИ Военной Медицины МО РФ при поддержке фирмы ООО «БИОССЕТ», направлена на получение рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3). В ходе работы была разработана технология получения генетического материала (плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3) в опытно-промышленном масштабе, получена модельная клеточная культура клеток фибробластов fib7, создана рекомбинантная клеточная культура клеток фибробластов fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 - продуцент рекомбинантного белка IGF-LR3, показана экспрессия рекомбинантного белка в клетках фибробластов методом вертикального электрофореза в восстанавливающих условиях, проведен анализ и подтверждено соответствие ориентации и места встраивания гена IGF-LR3 в плазмиду методом секвенирования по методу Сэнгера. Магистерская диссертация Кивилева Евгения актуальна, обладает несомненной научной новизной и практической значимостью и представляет собой совокупность теоретических положений и практических разработок и рекомендаций.

0.5

Светлана Елисеева

В магистерской диссертации Евгений Кивилев разработал и обосновал технологию получения генетического материала (плазмиды pcDNA3.1(+) IGF-LR3) в опытно-промышленном масштабе: получена модельная клеточная культура клеток фибробластов fib7, проведен анализ и подтверждено соответствие ориентации и места встраивания гена IGF-LR3 в плазмиду методом секвенирования по методу Сэнгера, получена рекомбинантная ДНК, кодирующая синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3), что соответствует поставленной цели исследования. Данная работа представляет законченное научное исследование, тема которого является актуальной и перспективной и требует дальнейшей разработки.

0.5

Смятская Юлия

В данной работе освещена актуальная проблема - создание генетической конструкции, экспрессирующей синтез IGF-LR3 в клетках млекопитающих. Для решения поставленных задач автором использовались современные методы анализа, что подтверждает практическую значимость исследования. Диссертация представляет большой интерес для фармкомпаний и поэтому очень важно продолжить данные исследования и опубликовать результаты в высоко рейтинговых изданиях базы Scopus и WoS.

0.5

Виктория Преловская

Данная работа имеет большую значимость как в научной, так и в практической области. Автор подробно описывает строение, методы конструирования, получения и доставки, а также возможности применения генетической конструкции, включающей в себя целевой ген IGF-LR3, необходимый в создании генотерапевтических молекул для лечения заболеваний, связанных с недостаточностью IGF1 (инсулин-подобного фактора роста). Кроме этого, Евгений Кивилев детально раскрывает аспекты, затрагивающие приготовление бактериальных клеток для трансформации и собственно процедуру трансформации, стадии культивирования в биореакторе и проведение вертикального и горизонатльного электрофореза для разделения и последующего выделения продуктов фракционирования ДНК. Автор доказал актуальность создания генетической конструкции, экспрессирующей ген модифицированного инсулин-подобного фактора роста 1 (IGF-LR3), перспективной для применения в генной терапии и для получения промышленных количеств рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста.

3.5

Иванченко Ольга Борисовна

Представленная работа построена по традиционному плану. Обзор литературы отражает анализ работ по теме исследования. Довольно подробно представлены имеющиеся на сегодняшний день данные о инсулиноподобных факторах роста, молекулярных механизмах генной терапии. В отдельных главах освещены современные методы доставки гена. Представленная работа выполнена на высоком методическом уровне. В ходе экспериментов создана плазмида pcDNA3.1(+)-IGF-LR3, кодирующая целевой ген, а также рекомбинантный штамм Escherichia coliDH5α/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3. Проведены эксперименты по выделению плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 из бактерий. В ходе исследований автором получена рекомбинантная культура клеток фибробластов, несущая плазмиду pcDNA3.1(+)-IGF-LR3. На культуре клеток фибробластов показана экспрессия целевого гена с получением белка IGF-LR3. В результате была разработана технология получения плазмидной конструкции pcDNA3.1(+)-IGF-LR3. Это может послужить основой для промышленной разработки генотерапевтического препарата. Следует отметить, что Кивилевым Евгением была проделана большая работа и, в целом, оставляет благоприятное впечатление. Результаты исследований могут быть опубликованы в рецензируемом научном периодическом издании и/или отраслевом журнале, т.к. исследования представляют большой практический интерес, и результаты могут быть использованы фармацевтическими компаниями для расширения ассортимента продукции.