Разнообразие вирусов гриппа В, циркулирующих на территории России в 2019- 2021 гг.

Любовь Липко

Разнообразие вирусов гриппа В, циркулирующих на территории России в 2019- 2021 гг.

Работа посвящена изучению антигенных и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа В, циркулировавших в России в 2019-2021 гг. Вирусы гриппа В относятся к семейству Orthomyxoviridae, которое включает в себя 4 типа вирусов гриппа: А, В, С и D. На сегодняшний день выделяют две антигенно различные линии гриппа В: Викторианская и Ямагатская, родоначальниками которых являются штаммы B/Виктория/2/87 и B/Ямагата/16/88 соответственно. С середины 80-х годов они вызывали заболевания у людей раз в 3-4 года, а с 2000-х годов – ежегодно. Грипп – это острая высококонтагиозная респираторная вирусная инфекция, для которой характерны сезонные эпидемии и широкая распространенность. Около одной трети от общего числа заболеваний гриппом этиологически обусловлены патогенным воздействием вирусов гриппа В. Процент смертности от гриппа в мире составляет 0,1-0,2% случаев в год. Высокая изменчивость вирусов гриппа В обусловлена наличием сегментированного генома, мутации в котором возникают из-за большого количества ошибок во время репликации. Путем антигенного дрейфа или реассортации у штаммов появляются новые антигенные свойства – в результате возникают дрейф-варианты, которые отличаются от эпидемических штаммов предыдущих лет. Отсутствие у людей иммунитета к новым вариантам вирусов обусловливает необходимость вакцинации – как одной из превентивных мер по борьбе с распространением инфекции. Ввиду высокой изменчивости вирусов гриппа для поддержания актуальности состава противогриппозных вакцин необходимо проведение антигенного анализа, который проводится в рамках Глобального надзора за гриппом.

Биология

Дипломы

Вуз: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

ID: 60db88ece4dde5000191ecbb

UUID: 5c93a480-bb4a-0139-3773-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 7

39.08

Любовь Липко

Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Комментировать 1

Рецензировать 2

Скачать - 2,3 МБ

Поделиться работой

1 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Департамент образования, научно-технической политики и рыбохозяйственного комплекса ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины» Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Разнообразие вирусов гриппа В, циркулирующих на территории России в 20192021 гг. ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА по направлению подготовки 06.03.01. «Биология» (уровень бакалавриата) «К защите допустить» Заведующий кафедрой д. б. н., проф. (должность, ученая степень, звание) Сухинин А. А. / (фамилия и инициалы) / (подпись) «____» ________________ 20___ г. Научный руководитель к. в. н., доц. (должность, ученая степень, звание) Виноходов В. О. / (фамилия и инициалы) Обучающийся Липко Любовь Олеговна (фамилия, имя, отчество полностью) /____________________/ (подпись) Санкт-Петербург 2021 / (подпись)

2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 4 ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ......................................................................... 6 1.1 Характеристика возбудителя гриппа типа В .................................................. 6 1.2 Механизмы изменчивости вирусов гриппа типа В ......................................... 12 1.3 Эволюционная изменчивость вирусов гриппа типа В Викторианской и Ямагатской линий ................................................................................................... 14 1.4 Применение моноклональных антител в диагностике вирусных инфекций гриппа типа В .......................................................................................................... 16 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................... 18 2.1 Материалы исследования ................................................................................. 18 2.2 Методы исследования ....................................................................................... 20 2.2.1 Приготовление сред для выделения вирусов гриппа на клеточной культуре MDCK ................................................................................................... 20 2.2.2 Выделение вирусов гриппа на клеточной культуре MDCK ..................... 21 2.2.3 Накопление вируссодержащей культуральной жидкости ........................ 22 2.2.4 Выделение вирусов гриппа на куриных эмбрионах .................................. 23 2.2.5 Накопление вируссодержащей аллантоисной жидкости ......................... 25 2.2.6 Постановка реакции гемагглютинирующей активности (РГА)................ 25 2.2.7 Получение гипериммунных крысиных антисывороток ............................ 27 2.2.8 Постановка реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА)................................................................................................................... 27 2.2.9 Антигенная картография ............................................................................ 29 2.2.10 Статистическая обработка результатов..................................................... 29 2.2.11 Молекулярно-биологические методы...................................................... 29 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................ 31 3.1 Циркуляция вирусов гриппа типа В на территории России в эпидемический сезон 2019-2020 гг. .................................................................................................. 31 3.2 Циркуляция вирусов гриппа типа В на территории России в эпидемический сезон 2020-2021 гг. .................................................................................................. 34 3.3 Антигенный анализ и антигенное картирование вирусов гриппа типа В, выделенных в эпидемическом сезоне 2019-2020 гг. ............................................. 35

3 3.4 Соответствие штаммов, циркулировавших в России в сезон 2019-2020 гг. вирусам, включенным в состав вакцин.................................................................. 39 3.5 Антигенный анализ и антигенное картирование вирусов гриппа типа В, выделенных в эпидемическом сезоне 2020-2021 гг. ............................................. 39 3.6 Соответствие штаммов, циркулировавших в России в сезон 2020-2021 гг. вирусам, включенным в состав вакцин.................................................................. 40 3.7 Антигенный анализ вирусов гриппа типа В Викторианской эволюционной линии, выделенных на территории России в сезоны 2019-2020 гг. и 2020-2021 гг. с применением моноклональных антител ............................................................. 40 ВЫВОДЫ ................................................................................................................... 43 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................................................... 44 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ...................................................... 45 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 47 ПРИЛОЖЕНИЯ .......................................................................................................... 54 Приложение 1 .......................................................................................................... 54 Приложение 2 .......................................................................................................... 65 Приложение 3 .......................................................................................................... 67

4 ВВЕДЕНИЕ Грипп определяется как острая высококонтагиозная респираторная вирусная инфекция, характеризующаяся сезонными вспышками и обширным радиусом поражения, как людей, так и животных. Воздушно-капельный путь передачи инфекции способствует быстрому распространению ее среди населения, вызывая у людей заболевания от легкой до средней степени тяжести, которые могут перерасти в осложнения или летальный исход. К группе риска развития осложнений относятся недоношенные дети, лица а пожилого также люди возраста, с беременные хроническими женщины, заболеваниями и иммуносупрессией [6, 7]. Согласно данным отчета McCauley, процент смертности от гриппа в мире составляет 0,1-0,2% случаев в год [39]. Вирусы гриппа В по уровню вирулентности, контагиозности и эпидемиологическому значению занимают второе место после гриппа А [5]. Грипп В поражает преимущественно человека и иногда морских млекопитающих, в частности тюленей [45]. Вирусы гриппа В не способны к реассортации с вирусами гриппа животных, так как они не имеет природного резервуара и различных типов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA), и, следовательно, не обладает пандемическим потенциалом, но вызывают эпидемии [36]. На сегодняшний день выделяют две антигенно различные линии гриппа В: Викторианская и Ямагатская, родоначальниками которых являются штаммы B/Victoria/2/1987 и B/Yamagata/16/1988 соответственно [49]. Вклад вируса гриппа В в эпидемический процесс составляет около одной трети от общего числа гриппозных заболеваний [63], при этом штаммы Викторианской антигенной линии поражают преимущественно детей младшего возраста [26], в то время как, основная масса вирусов Ямагатской разновидности вызывают заболевания среди взрослых [19]. Высокая изменчивость вирусов гриппа В обусловлена наличием сегментированного генома, мутации которого возникают из-за большого количества ошибок во время репликации. Путем антигенного дрейфа или реассортации у штаммов появляются новые антигенные свойства – в результате

5 возникают дрейф-варианты, которые существенно отличаются от штаммов предыдущих лет [21, 41]. Отсутствие у людей иммунитета к новым вариантам вирусов обусловливает необходимость вакцинации – как одной из превентивных мер по борьбе с распространением инфекции и развитием постинфекционных осложнений [38]. Ввиду высокой изменчивости вирусов гриппа для поддержания актуальности состава противогриппозных вакцин необходимо проведение антигенного анализа [28, 41]. Отбор вакцинных штаммов для специфической профилактики гриппа [28] проводится путем выявления соответствия циркулирующих штаммов с референсштаммами, что является приоритетной задачей надзора за гриппом [65]. Цель работы: изучение антигенных характеристик вирусов гриппа типа В, выделенных в 2019-2020 и 2020-2021 гг., и выявление соответствия циркулирующих вирусов гриппа со штаммами, включенными в состав вакцин в сезоны 2019-2020, 2020-2021 гг. Задачи: 1. Определить удельный вес вирусов гриппа В Викторианской и Ямагатской линий в структуре вирусной популяции в эпидемические по гриппу сезоны в России в период 2019-2020 гг. и 2020-2021 гг. и сравнить с предыдущим сезоном. 2. Изучить антигенные свойства вирусов гриппа В 2019-2020 гг. и 2020-2021 гг. выделения методом антигенного анализа. 3. Оценить степень соответствия современных вирусов гриппа штаммам, введенным в состав гриппозных вакцин. 4. Изучить антигенные свойства вирусов гриппа В Викторианской эволюционной линии моноклональных антител. методом антигенного анализа с применением

6 ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Характеристика возбудителя гриппа типа В Вирусы гриппа В относятся к семейству Orthomyxoviridae, которое включает в себя 7 родов: Alphainfluenzavirus, Betainfluenzavirus, Gammainfluenzavirus, Deltainfluenzavirus, Isavirus, Quaranjavirus, Thogotovirus [5]. Вирионы гриппа В представляют собой патогены сферической формы диаметром от 80 до 120 нм, но иногда встречаются нитевидные формы до нескольких микрон в длину, особенно среди свежих изолятов [5, 27, 43]. Форма вирионов наглядно представлена на рисунке 1. Рисунок 1. Электронная фотография вируса гриппа типа В [1]. Химический состав вириона представлен 1% РНК, 70% белка, 24% липидов и 5% углеводов. Липиды и углеводы входят в состав суперкапсида и имеют клеточное происхождение [1]. Суперкапсидная оболочка вируса покрыта погруженными в нее шипами – около 600 шипов двух видов. Из них около 500 шипов представляют собой гомологичные тримеры гликозилированного белка НА, который функционально ответственен за прикрепление вируса и проникновение его в клетку. Остальные 100 шипов имеют грибовидную форму и представлены тетрамерами гликозилированного белка NA, обладающего ферментативной активностью. Геном вируса гриппа В, сегментированный на восемь частей, представлен односпиральной линейной РНК отрицательной полярности [38, 46, 52]. Строение вирусной частицы представлено на рисунке 2.

7 Рисунок 2. Структура вирусной частицы гриппа типа В [66]. Сегментированная РНК генома вируса гриппа имеет размер 13,5 Кб (килобаз). На 5′ и 3′-концах каждого сегмента вРНК (вирусной рибонуклеиновой кислоты) локализованы комплементарные последовательности, из-за чего РНК скручивается в структуру винта с петлей на дистальном конце, ее образно можно сравнить со «штопором» или «ручкой сковородки» [43]. Частично комплементарные концы пар оснований функционируют как промотор для транскрипции и репликации вРНК полимеразным комплексом. Некодируемые участки включают сигнал для полиаденилирования мРНК и фрагмент сигнала для сборки вируса [52]. Каждым сегментом генома вируса кодируется один или несколько структурных и неструктурных белков. Вирусные белки формируют структуру вириона и обеспечивают репликацию вируса в клетке хозяина. Структурные белки определяют круг хозяев, тканевой тропизм, эффективность трансмиссивности, антигенные свойства и в большой степени патогенность вируса гриппа. Неструктурные белки присутствуют только в инфицированной клетке, при этом они кодируют факторы вирулентности, позволяющие вирусу преодолевать защитные механизмы организма хозяина [38, 46]. Строение генома вириона гриппа В отображено на рисунке 3.

8 Рисунок 3. Сегменты РНК вируса гриппа В и кодируемые ими белки [66]. Шипы вирионов представлены двумя поверхностными структурными белками: гемагглютинином (HA) и нейраминидазой (NA). Гемагглютинин является одним из самых крупных белков вириона – на его долю приходится 25-35% от всех белков. НА – это тример, имеющий молекулярную массу 225 кДа (килодальтон). Тример состоит из субъединиц массой по 75 кДа. Каждая субъединица, в свою очередь, состоит из двух полипептидов: НА1 (55 кДа) и НА2 (20 кДа). Они представляют собой тяжелую и легкую цепь гемагглютинина соответственно. HA1 включает в себя 346 аминокислотных остатка для вирусов викторианской линии и 345 – для вирусов Ямагатской линии. Строение молекулы НА представлено на рисунке 4. Рисунок 4. Структура гемагглютинина и его мономера [31].

9 НА служит для прикрепления вирионов к поверхности клетки организма путем взаимодействия рецептор-связывающего сайта (РСС), расположенного в верхней части глобулярной области HA, со специфическим клеточным рецептором – сиаловой кислотой. РСС HA вируса гриппа представляет собой карман, локализованный на дистальном конце молекулы. Принимая во внимание этот факт, НА можно назвать прикрепительным белком. Помимо прикрепительной функции НА принимает участие в стадии проникновения вириона в клетку, а именно в процессе слияния клеточной и вирусной мембран, а также способствует экспорту генома вируса к месту сборки новых вирионов. В организме хозяина НА, а именно область РСС, представляет собой мишень для иммунного ответа хозяина [27, 53, 61]. Антитела распознают высоковариабельные петлевые структуры, окружающие РСС. Согласно подтвержденным данным, около 12 аминокислотных замен влияют на антигенные характеристики HA вируса гриппа В. Их можно отнести к одной из 4-х групп: 1. Петля 120 и близлежащие регионы (HA1 116-137) представляет собой один из наиболее часто подвергающихся изменениям участков полевых изолятов [37, 40]. Аминокислотные остатки субъединицы HA1: 75, 77, 116, 118 и 122, представляют собой уникальный эпитоп для штаммов Викторианской линии. 2. Петля 150 (HA1 141-150) – очень длинная. Она является нейтрализующим эпитопом для штаммов Ямагатской линии. 3. Петля 160 (HA1 162-167) является единственной у вирусов гриппа В, замены и делеции у которой наблюдались на протяжении многих сезонов среди полевых изолятов. Данная особенность представляет собой эффективный способ выживания в течение длительного периода без антигенных сдвигов. В последнее время 160 петля стала специфическим эпитопом для вирусов Викторианского рода. 4. Спираль 190 и прилегающий участок (HA1 194-202). Во внешних аминокислотных остатках этой спирали часто обнаруживаются аминокислотные замены. Один из важных участков расположен в области 194-196 HA1. Шип нейраминидазы на поверхности вирусной частицы представляет собой тетрамер с молекулярной массой 200-250 кДа. Молекулярная масса каждого

10 мономера равна 50-60 кДа. Аналогично субъединицам НА мономеры NA соединяются между собой дисульфидными связями, расположенными внутри мономера, стабилизирующие структуру этого белка. В структуре NA дисульфидных связей больше, чем в структуре НА. NA, как и НА, является гликопротеином, содержащим около 20% глюкозамина. Также в состав молекулы NA входит 464 аминокислотных остатка. Функция NA заключается в отщеплении N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты от молекулы НА, таким образом NA защищает вирионы от сиалированных муцинов, которые покрывают слизистые оболочки, что освобождает путь для продвижения возбудителя к поверхности эпителиальных клеток. По завершении репликативного цикла этот фермент способствует высвобождению и отделению созревших вирусных частиц от эпителиоцитов, а также препятствует их склеиванию между собой, что значительно расширяет инфекционную зону [8, 10, 27]. Кроме белков НА и NA в состав оболочки вирионов гриппа В встроены еще 2 белка: NB и BM2 [29]. Тетрамер BM2 представляет собой протонный канал, выполняющий аналогичные функции белка M2 вируса гриппа A, кроме того он играет роль внутриклеточного транспорта комплекса М1-вРНП (матриксный белок 1 - вирусный рибонуклеопротеин) к месту сборки вирусной частицы [32]. Белок NB тоже образует ионные каналы, необходимые для репликации вириона в организме, но не участвуют в репликации вируса in vitro [29, 36]. С внутренней стороны липидной оболочки выстилается матриксный белок М1 – самый большой компонент вирусной частицы – на его долю приходится около 40% всей массы белка вирусной частицы. Его молекулярная масса составляет 25 кДа. По своей природе он гидрофобен и образует слой толщиной в 35-40 ангстрем. В матриксный белок погружены цитоплазматические хвосты белков НА, NА, BM2 и NB, он является связующим звеном между оболочкой и расположенными внутри вириона структурами ядра: вРНП и NEP – белком ядерного экспорта. Также белок М1 участвует в детерминации формы вириона в процессе сборки и его дальнейшего отпочковывания. Помимо перечисленных функций матричный белок выполняет регуляторные функции в процессе репродукции вируса, а именно держит под

11 контролем транскрипцию вРНК и нуклеоцитоплазматический транспорт РНП в клетке [27, 64]. Белок NEP – по прежнему названию NS2, основанному на ошибочном представлении о неструктурной природе белка – минорный компонент вириона, выполняющий несколько биологически важных функций в процессе жизненного цикла вируса гриппа. NEP небольшого размера, в его состав входит 112 аминокислотных остатков. Данный белок способствует экспорту потомства сегментов вРНК от места синтеза в ядре в цитоплазму и к месту сборки вирусной частицы у клеточной мембраны. В данном процессе NEP действует как связующее звено между комплексом вРНП и экспортным механизмом клеточного ядра. NEP также участвует в регуляции уровня транскрипции и репликации вРНК, осуществляемых вирусными РНК-зависимыми РНК-полимеразами, и в переключении клеточной АТФ-азы на эффективное почкование вирионов [27, 44, 47]. В состав каждого из восьми дискретных рибонуклеопротеинов входит сегмент вРНК, представляющий собой ген, упакованный в протеиновый комплекс из нуклеопротеина и РНК-зависимой-РНК-полимеразы. Вирусная РНК-зависимаяРНК-полимераза состоит из субъединиц щелочных белков РВ2, РВ1 и кислого белка РА. Данный полимеразный комплекс отвечает за транскрипцию и репликацию вРНК [8, 18]. Белок РВ1 занимает центральное положение полимеразного комплекса, а также он является основной субъединицей для сборки вирусных полимераз. Особенностью РВ1 является его взаимодействие с белками РВ2 и PA, тогда как контакта РВ2 с РА обнаружено не было. По окончании синтеза полимеразных белков в цитоплазме клетки РВ1 в купе с РА перемещается в ядро отдельно от РВ2, и комплекс, состоящий из РВ1, РВ2 и РА, собирается уже непосредственно в ядре зараженной клетки. РВ1 ответственен за катализ РНК-зависимого РНК-синтеза, а также он отщепляет кэп-структуру от 3′-конца клеточной мРНК и переносит ее на вирусную мРНК [8, 18, 27].

12 Белок РВ2 отвечает за репликацию РНК и, как и РВ1, отщепляет кэпэлементы от клеточных мРНК. Основываясь на этом, РВ2 нередко называют кэпРНК-эндонуклеазой. Структура белка РВ2 содержит в себе две последовательности аминокислотных остатков, принимающих участие в связывании клеточных кэпфрагментов мРНК [8, 27]. Белок РА индуцирует протеолитические процессы, приводящие к снижению уровня накопления собственного белка и коэкспрессируемых белков. А также он отвечает за связывание с промотором вирусной РНК и участие в процессе инициации транскрипции [8, 27]. Подводя итоги вышесказанного, можно заключить, что часть функций белков полимеразного комплекса реализуется путем их объединения [8, 27]. Еще один внутренний белок NP (нуклеопротеин) составляет 17-20% от всей массы белков вирусной частицы и имеет молекулярную массу 60 кДа. Электростатическое взаимодействие обеспечивает контакт NP с РНК, при котором каждый мономер белка связывается с 24 нуклеотидными остатками РНК [8]. РНКсвязывающая активность NP необходима для транскрипции генома вируса. Вместе с этой функцией NP принимает участие в транспортировке вирусной РНК как в ядро клетки, так и из него к месту сборки новых вирусных частиц [27]. 1.2 Механизмы изменчивости вирусов гриппа типа В Уникальность вирусов гриппа обусловлена способностью в краткие сроки изменять свою генетическую и антигенную структуру, что позволяет возбудителю вызывать обширные эпидемии среди населения. Существует два пути антигенной изменчивости: антигенный шифт и антигенный дрейф. Шифтовые изменения не характерны для вирусов гриппа В. Из двух типов антигенной изменчивости вирусы гриппа В подвержены только одному – антигенному дрейфу, который происходит в результате точечных мутаций в геноме, таких как делеции (выпадения) и инсерции (вставки), которые

13 способствуют изменению аминокислотного состава белков, что приводит к изменению антигенных свойств и появлению нового варианта патогена [56, 62]. Для инсерций и делеций характерна цикличность [42, 58]. Наиболее подвержены изменчивости поверхностные белки вируса, гликопротеины НА и NА, в то время как внутренние белки, в частности NP и матриксный белок М, менее изменчивы. Изменения происходят в определенных участках на поверхности белка – детерминантах, иначе антигенных сайтах, которые окружают рецептор-связывающий домен и взаимодействуют с антителами [48]. Под воздействием селективного прессинга со стороны нейтрализующих антител организма и возникают мутации. Степень влияния аминокислотных мутаций на антигенные свойства вируса зависит от их количества, локализации и качественных характеристик аминокислотных замен [57]. От аминокислотных мутаций в сайте может измениться тропизм вируса и способность размножаться в разных биологических системах, таких как куриные эмбрионы и клеточные культуры, а также способность агглютинировать эритроциты животных [35.]. Отсутствие репарационных механизмов у РНК-содержащих вирусов гриппа в купе с особенностями протекания репликации фермента РНК-зависимая РНКполимераза обуславливает высокую степень изменчивости. Процесс синтеза РНКзависимой РНК-полимеразы протекает с большим количеством ошибок, в результате чего и возникают мутации. Каждый репликационный цикл содержит около 10% потомства с подобными мутациями. Механизмы для предотвращения или исправления возникших замен у вирусов гриппа отсутствуют [54]. Вторым механизмом изменчивости структуры белков, характерным для вируса гриппа типа В, является реассортация между антигенными вариантами, которая становится возможной благодаря социркуляции штаммов в один эпидемический сезон. Она может происходить между вирусами гриппа В одной эволюционной линии или между вирусами двух разных линий [21, 23]. Реассортанты возникают вследствие одновременного заражения человека

14 различными штаммами вируса гриппа [41]. При этом реассортантов, возникших между вирусами гриппа А и В, в природе обнаружено не было [60]. Существует понятие молекулярных часов вируса гриппа, обозначающее появление определенного количества мутаций в различные отрезки времени, то есть скорость накопления мутаций. Таким образом, с течением времени можно наблюдать появление нового антигенного варианта, в связи с чем, меняется штаммовый состав вакцины [33]. Реассортация генов, кодирующих вирусные белки, инсерции и делеции являются важными механизмами изменчивости, позволяющие вирусу менять генетические и антигенные характеристики, способствовать увеличению патогенности и вирулентности вирусов гриппа. Эти механизмы приводят к антигенному разнообразию, стабильной циркуляции вирусов в популяции людей и животных, а также затрудняют применение профилактических и лечебных мероприятий в борьбе с этой инфекцией [50]. 1.3 Эволюционная изменчивость вирусов гриппа типа В Викторианской и Ямагатской линий Впервые вирус гриппа В был выделен в 1940 году [25, 51]. В 1970-х годах образовались две антигенно различные линии путем сепарации штаммов Викторианской ветви от Ямагатской, которая до этого времени была единственной циркулирующей. С середины 1980-х годов, наблюдалась их попеременная циркуляция [20, 36]. Вирусы, относящиеся к Викторианской линии, доминировали в конце 1980х годов, а вирусы Ямагатской линии преобладали в 1990-х гг., за исключением вспышки гриппа в Азии в 1996-1997 гг., вызванной вирусами Викторианской линии. После этого штаммы Викторианской разновидности появились вновь лишь в 2001 году, с тех пор эти две ветви циркулируют вместе [13, 30].

15 Скорость эволюции вирусов гриппа В медленнее, чем у гриппа А и определяется скоростью нуклеотидных замен в сегментах белков [14, 15, 21]. Именно механизм ротации делеций-инсерций привел к появлению вирусов Ямагатской разновидности. Благодаря делециям и инсерциям наблюдается дивергентный характер эволюции вирусов гриппа типа В. Так, изоляты 1988-1996 года Ямагатской линии обладают шестью нуклеотидными делециями, в свою очередь изоляты 1993-1997 года Викторианской линии не имеют подобных изменений [42]. Не менее значимый вклад в эволюционные изменения вносит реассортация. Часто встречаются вирусы гриппа В Викторианской линии, которые приобрели гены штаммов Ямагатской разновидности [59]. Согласно гипотезе, именно частая реассортация внутренних генов между двумя эволюционными ветвями способствовала поддержанию активной распространенности вирусов гриппа В [21]. Смена отдельных кладов вирусов Викторианской линии преимущественно происходит с периодичностью в 1-3 года, в то время как различные клады штаммов Ямагатской линии чаще циркулируют в течение более длительного периода времени [59]. Помимо этого, для вирусов Викторианской разновидности характерно большее генетическое разнообразие в эпидемических сезонах в сравнении с вирусами Ямагатской линии. Также важно отметить, что штаммы, принадлежащие Викторианской линии, подвержены более быстрому антигенному дрейфу [59], чем вирусы Ямагатской линии и сохраняются дольше локально в географических регионах до более широкого распространения [14]. Следует отметить, что с 2016 года у штаммов Викторианской группы наблюдается принципиально новая антигенная характеристика: появление трех аминокислотных делеций в 160-й петле. Такая генетическая особенность сохраняется у штаммов по сей день [68].

16 1.4 Применение моноклональных антител в диагностике вирусных инфекций гриппа типа В Использование методов ранней диагностики вирусных инфекций позволяет своевременно определить их этиологическую природу, что необходимо для быстрого реагирования медицинских служб и разработки превентивных мероприятий в эпидемиологической практике. Благодаря достижениям в области клеточной инженерии повысить чувствительность диагностических методов определения вирусных агентов стало возможным с применением высокоспецифичной иммунореагентики моноклонального типа [9]. Моноклональные антитела (МКА) представляют собой однородные по своей структуре высокоспецифичные белки – иммуноглобулины, которые вырабатываются иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону. МКА вырабатываются против определенного природного антигена, который они при обнаружении специфически связывают – нейтрализуют [34]. МКА характеризуются высокой аффинностью – степенью специфического сродства активного центра к антигенной детерминанте, а также хорошими сорбционными свойствами и заданным спектром реактивности [3]. МКА получают путем иммунизации мышей антигеном с последующим выделением из сыворотки лимфоидных клеток. Следующим этапом является слияние лимфоцитов с клетками миеломы – получение гибридом, синтезирующих специфические антитела, которые и связываются с определенным эпитопом вирусной частицы [3]. Инженерные МКА применяются при постановке реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА), которая используется для определения типа/подтипа вируса гриппа. При постановке РТГА реализуется способность противовирусных МКА ингибировать взаимодействие гемагглютинина вируса гриппа с рецепторами на поверхности эритроцитов. РТГА позволяет определить характер взаимодействия МКА с антигенными сайтами гемагглютинина, выступающими в роли мишеней, благодаря чему появляется возможность

17 выяснить, в какой области сайта произошла аминокислотная замена – в этом заключается главное преимущество МКА перед гипериммунными поликлональными антисыворотками [3, 16, 22]. В связи с этим, РТГА отражает вируснейтрализующие свойства МКА, что является одной из важнейших их характеристик. Взаимодействие МКА с различными штаммами в РТГА позволяет оценить антигенные штаммовые различия, что имеет большое практическое и теоретическое значение [22].

18 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы исследования Вирусы. В работе были использованы: Вирусы гриппа, выделенные из назофарингеальных мазков больных 1) гриппом в 2019-2021 гг. – исследуемые вируссодержащие материалы. Наличие генома вируса гриппа В в отобранных мазках было подтверждено полимеразной цепной реакцией (ПЦР), которая была проведена в лаборатории молекулярной вирусологии ФГБУ «Научно-исследовательского института гриппа им. А. А. Смородинцева» Министерства Здравоохранения РФ. 2) Эталонные и референс-штаммы вируса гриппа В Викторианской и Ямагатской эволюционных линий из коллекции ФГБУ «Научно- исследовательского института гриппа им. А. А. Смородинцева» Министерства Здравоохранения РФ, а также присланные из Международных центров по гриппу ВОЗ (CDC&P, Атланта, США и FCI, Лондон, Англия). 3) Вакцинные и референс-штаммы вируса гриппа В Викторианской и Ямагатской эволюционных линий из коллекции ФГБУ «Научно- исследовательского института гриппа им. А. А. Смородинцева» Министерства Здравоохранения РФ, а также присланные из Международных центров по гриппу ВОЗ (CDC&P, Атланта, США и NIMR, Лондон, Англия). Сыворотки. При идентификации изолятов использовались крысиные гипериммунные диагностические сыворотки, полученные к эпидемическим и референс-штаммам вируса гриппа разных лет выделения. Для получения сывороток были использованы белые беспородные крысы, весом 300-400 г. (питомник АМН РФ «Рапполово»). Моноклональные антитела. Панель из 7 МКА к вирусам гриппа типа В Викторианской эволюционной линии была предоставлена лабораторией биотехнологии диагностических препаратов ФГБУ «Научно-исследовательского института гриппа им. А. А. Смородинцева» Министерства Здравоохранения РФ.

19 Куриные эмбрионы. В данной работе были использованы десятидневные куриные эмбрионы, предоставленные ООО «Племрепродуктор» (пос. Синявино, Ленинградская область, Россия). Клеточные культуры. В работе использовалась перевиваемая клеточная линия почки собаки MDCK. Клеточная линия МDСК впервые получена в 1958 г. Madin и Darby в результате спонтанной трансформации клеток из ткани нормальных почек собаки коккер-спаниеля. Клетки имеют эпителиоидную морфологию, отличаются поляризованностью – апикальная и базальная мембраны имеют различный молекулярный состав и на апикальной мембране присутствует слой ворсинок – и дифференцировкой: при высокой плотности клеток в монослое появляются характерные элементы – гемицисты, которые образуются вследствие сохранения клетками функции почечного эпителия. Продолжительность жизненного цикла клеток составляют 72-96 часов. В первые сутки после пересева клетки распластаны по поверхности, позже клетки приобретают эпителиоидную морфологию, уплотняются, образуя плотный монослой с признаками дифференцировки. Линия клеток получена из референслаборатории NIMR, Лондон, Англия. Поддерживающая среда необходима для благоприятного размножения вируса на культуре клеток MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Промывающая среда готовится для отмывки монослоя клеток от ростовой среды и белков, содержащихся в сыворотке, которые могут препятствовать активному размножению прикрепившиеся клетки. вируса. Также удаляются мертвые или не

20 2.2 Методы исследования 2.2.1 Приготовление сред для выделения вирусов гриппа на клеточной культуре MDCK Все среды для выделения вирусов гриппа готовятся непосредственно перед началом работы. Основу для сред составляет питательная среда Игла-МЕМ или ее модификации, например, альфа-МЕМ [4]. 1) Промывающая среда. Среда для отмывки монослоя клеток готовится из основной среды (альфа-МЕМ) с добавлением антибиотика (ингибирует рост бактериальной флоры) и ТРСК-трипсина. На 100 мл среды добавляется 0,1 мл рабочего раствора ТРСК-трипсина в концентрации 2000 мкг/мл (обработка трипсином ингибирует химотрипсиновую активность фермента) и 0,1 мл рабочего раствора антибиотиков (пенициллин или гентамицин) [4]. Необходимый объем среды рассчитывается из учета 2 мл среды на каждую пробирку (двукратное промывание по 1 мл). На каждый клинический образец необходимо 2 пробирки с клеточной культурой [4]. 2) Поддерживающая среда готовится из основной среды с добавлением антибиотика, ТРСК-трипсина, HEPES-буфера (регулирование рН), BSA фракции V альбумина бычьего сывороточного (поддержание жизнедеятельности клеточного монослоя). Для приготовления поддерживающей среды на 100 мл основной среды альфа-МЕМ добавляется: 0,1 мл рабочего раствора ТРСК-трипсина, 0,1 мл рабочего раствора антибиотиков, 2,6 мл BSA фракции V 7,5% и 1,6 мл HEPES буфера 1М. Готовые среды до начала работы оставляют в термостате. Оставшуюся среду хранить и повторно использовать нельзя.

21 2.2.2 Выделение вирусов гриппа на клеточной культуре MDCK В качестве системы для выделения вирусов гриппа В наиболее подходит культура клеток MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) – клетки почки спаниеля [4]. Выделение вирусов гриппа проводили согласно рекомендациям ВОЗ [67] и методическим рекомендациям «Выделение вирусов в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» [4]. Для выделения вирусов гриппа на MDCK необходимы: ● суточная монослойная культура клеток MDCK в пробирках со скошенным дном объемом 2 мл (Nunc, Дания) или культуральных флаконах по 10 мл; ● промывочная среда; ● поддерживающая среда; Этапы выделения вирусов на MDCK: 1. Аккуратно слить ростовую среду из пробирки или флакона. 2. Дважды промыть по 2 мл каждую пробирку или флакон промывающей средой (с антибиотиками и ТРСК-трипсином). 3. Аккуратно перемешать цельный клинический материал пипетированием, отобрать и внести по 0,2 мл клинического материала в каждую из двух параллельных пробирок для данного образца. Для культуральных флаконов берется 1 мл клинического материала на один флакон. 5. После инфицирования всех пробирок поставить их в термостат на 45 минут при 32ºС для беспрепятственного проникновения вируса в клетки; 6. В каждую пробирку внести по 1,8 мл среды для поддержания жизнедеятельности клеток. Если монослой заражают в культуральных флаконах, добавляют по 9 мл поддерживающей среды. Вносить среду необходимо осторожно, чтобы не повредить монослой. Все пробирки или флаконы снова поместить в термостат на 32ºС, ежедневно наблюдая за состоянием инвертированный микроскоп, проверяя его целостность [4]. монослоя в

22 Характерным признаком наличия гриппозной инфекции в культуре клеток MDCK служит цитопатический эффект, обнаруживаемый на 2-3 сутки после инфицирования монослоя. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса выражается в поражении монослоя клеток, при котором клетки теряют характерную форму, отделяются от монослоя, становятся округлыми и сильнее преломляют свет. При тотальном ЦПД вместо монослоя клеток регистрируются мертвые округлые клетки и их фрагменты [4]. Учет результатов производится на вторые-третьи сутки инкубирования путем постановки РГА. Если титр вируса равен или выше чем 1:8, то можно ставить реакцию торможения гемагглютинации для определения типа/подтипа вируса. При отрицательной РГА вирусы оставляются на дальнейшую инкубацию еще на три дня. На шестые сутки необходимо снова поставить РГА. При положительной РГА так же ставится РТГА. При отрицательной – проводится слепой пассаж [4]. Под слепым пассажем понимают заражение КЭ или культур клеток вируссодержащей жидкостью без видимых признаков репродукции вируса. Путем слепого пассажа в клетках живой системы происходит накопление вируса, что сопровождается появлением признаков репродукции. У КЭ они проявляются возникновением патологических изменений или гибели. У клеточных культур – появлением ЦПД, бляшек и гемадсорбции [4]. 2.2.3 Накопление вируссодержащей культуральной жидкости Вируссодержащую культуральную жидкость из пробирок и флаконов с появившимся выраженным ЦПД или с развившимися гемагглютининами используют для заражения пробирок или флаконов с выросшим монослоем клеток МDСК для дальнейшего накопления вируса. Перед заражением монослоя клеточной культуры МDСК необходимо провести вышеописанные манипуляции – удаление ростовой среды и отмывание средой. Далее готовят 10-кратные разведения клинического материала. Для этого

23 на 0,9 мл стерильного физиологического раствора отбирается 0,1 мл вируссодержащего материала. Затем в отмытую пробирку с монослоем вносят по 0,2 мл разведенного вируссодержащего материала. Для культуральных флаконов берется 1 мл разведенного материала на один флакон. После инкубации при 32°С в течение 30-40 минут в пробирку вносят 1,8 мл поддерживающей среды, во флакон – 9 мл, и снова помещают в термостат. Спустя трое суток производится оценка на наличие ЦПД и присутствие гемагглютининов. При гемагглютининов культуральную последующего появлении типирования выраженного среду возбудителя ЦПД собирают в и РТГА и/или появления используют в для присутствии специфических диагностических гриппозных сывороток. 2.2.4 Выделение вирусов гриппа на куриных эмбрионах Выделение вирусов гриппа на куриных эмбрионах является важной задачей, так как большинство современных противогриппозных вакцин являются эмбриональными. Своевременное получение актуальных штаммов с хорошими ростовыми характеристиками на куриных эмбрионах (КЭ) необходимо для изготовления определенного количества вакцин в срок [4, 11]. КЭ, как целостный организм, более устойчивы к воздействию бактериальной микрофлоры, часто присутствующей в образцах от больных и в секционных материалах. Однако не все вирусы гриппа одинаково хорошо выделяются на КЭ. Эффективность выделения вирусов гриппа В на КЭ довольно низкая [4]. Выделение и культивирование вирусов гриппа на эмбрионах часто приводит к появлению мутаций в НА и NA и изменению как рецепторных, так и антигенных свойств вируса, что представляет собой существенный недостаток данной системы выделения [4]. Выделение вирусов гриппа проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ [67].

24 Последовательность заражения КЭ: 1. Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют в затемненной комнате для определения области аллантоисной полости, проверки целостности кровеносных сосудов, а также подвижности эмбриона. 2. Дальнейшие манипуляции проводятся в стерильных условиях. Поверхность яйца дезинфицируют спиртом и фламбируют. Затем в скорлупе делается небольшое отверстие стерильным шилом. 3. В аллантоисную КЭ через отверстие вводится 0,2 мл цельной вируссодержащей жидкости при помощи одноразового шприца. Игла проходит через отверстие в скорлупе сквозь хорион-аллантоисную мембрану, и вирус инъекцируется в аллантоисную жидкость. Отверстие в скорлупе запечатывается расплавленным парафином. 4. Зараженные КЭ помещаются на 72 часа в термостат, установленный на 32°С. В течение инкубационного периода вирус размножается в клетках хорионаллантоисной мембраны, новые вирусные частицы выходят в аллантоисную жидкость. После инкубации эмбрионы помещают на ночь в холодильник при 4°С. 5. Чтобы собрать вируссодержащую аллантоисную жидкость, удаляют скорлупу, покрывающую воздушный мешок. Подскорлуповая оболочка и хорионаллантоисная мембрана протыкаются пипеткой, и собирается аллантоисная жидкость. 6. Учет результатов – определение титра – проводится постановкой РГА с 0,5% взвесью эритроцитов кур [Соминина А. А., Бурцева Е. И., Белоусова]. При отсутствии агглютинации эритроцитов проводятся два дополнительных пассажа путем заражения КЭ аллантоисной жидкостью от предыдущего пассажа. В случае, если после трех пассажей материалов, результат РГА отрицательный исследование прекращается [11].

25 2.2.5 Накопление вируссодержащей аллантоисной жидкости Заражение 10-дневных куриных эмбрионов производится в аллантоисную полость. Поверхность КЭ дезинфицируют спиртом и фламбируют. Далее делают 10-кратные разведения клинического материала, для чего в 0,9 мл разводят 0,1 мл вируссодержащего образца. После приготовления растворов в скорлупе стерильным шилом делается небольшое отверстие, через которое при помощи одноразового шприца в аллантоисную полость вводится по 0,2 мл разведенного вируссодержащего материала. После чего отверстие запаивают парафином. Затем КЭ инкубируют при 32°С в течение 72 часов. По истечении срока инкубации эмбрионы охлаждают при температуре 4°С в течение ночи, после чего производится вскрытие. Перед вскрытием верхнюю часть яйца обрабатывают спиртом, фламбируют, затем продезинфицированными ножницами вырезают отверстие диаметром около 1,5 см и стерильной пипеткой отбирают хорион-аллантоисную жидкость. Контроль на наличие вируса проводится в РГА. 2.2.6 Постановка реакции гемагглютинирующей активности (РГА) Эритроциты человека и млекопитающих содержат на поверхности клеточной мембраны сиаловые кислоты. Гемагглютинин вирусов гриппа обладает способностью связывать сиаловые кислоты на поверхности эритроцитов. Вирусы гриппа человека подтипа A(H1N1) pdm09 и вирусы гриппа В обладают способностью агглютинировать эритроциты человека, морской свинки и птиц (индейка, курица). Реакция гемагглютинации используется для определения наличия вируса гриппа в супернатанте зараженных культур клеток MDCK и аллантоисной жидкости зараженных КЭ при выделении вирусов гриппа за счет их свойств агглютинировать куриные эритроциты. А также для определения титра вируса и

26 при постановке реакции торможения гемагглютинации, использующейся для определения типа/подтипа вирусов гриппа. РГА проводилась согласно методике, рекомендованной ВОЗ. Для проведения РГА требуется: ● Физиологический раствор (рН = 7,2-7,4); ● 0,5% суспензия эритроцитов птиц (индейки или кур). Этапы постановки РГА: 1. Последовательные двукратные разведения вируса готовили в физиологическом растворе в полистироловых 96-луночных планшетах. В первый ряд лунок А1-А12 внести по 100 мкл вируссодержащих материалов. 2. В остальные лунки внести по 50 мкл нестерильного физ. раствора. 3. Сделать разведения вируссодержащих материалов, пипетирую по 3 раза в каждом ряду по 50 мкл. Последние 50 мкл сбросить в дезинфицирующий раствор. 4. Во все лунки планшета внести по 50 мкл куриных эритроцитов. 5. Оставить на 25 мин для оседания эритроцитов. 6. Учесть результаты. Контроль протекания реакции осуществляется путем учета скорости и времени оседания эритроцитов в контрольном ряду планшета. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. При наклоне планшета «пуговки» будут течь и давать характерный носик. Интенсивность реакции выражают знаками «+». Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

27 2.2.7 Получение гипериммунных крысиных антисывороток Получение крысиных гипериммунных антисывороток происходит путем 4-х кратной инъекции с интервалом 3-4 дня вируссодержащей жидкости – аллантоисной суспензии куриных эмбрионов или супернатанта клеточной культуры MDCK (титр в РГА не менее 1:32) – в брюшную полость белых беспородных крыс массой 300-400 г. По прошествии 9-12 дней после последней иммунизации производится обескровливание крыс с применением эфирного наркоза и получение гипериммунной антисыворотки. Для удаления из сыворотки неспецифических ингибиторов, ее обрабатывают раствором RDE (разведение 1:10 стерильным физиологическим раствором), после чего прогревают на водяной бане при температуре 56ºС в течении 30 минут. Манипуляции, проводимые с животными, соответствовали правилам гуманного обращения с лабораторными животными, утвержденными Министерством Здравоохранения РФ. 2.2.8 Постановка реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) Суть реакции торможения гемагглютинации состоит в том, что антитела к вирусу гриппа препятствуют прикреплению вируса к эритроцитам. Поэтому, если в диагностической сыворотке сыворотке (поликлональной или моноклональной) есть антитела к данному или родственному штамму и, если их количество достаточно для связывания 8 ГАЕ вируса, гемагглютинация подавляется в присутствии сыворотки. В этом случае гемагглютинации в лунках наблюдаться не будет, пока разведение сыворотки не приведет к такому разбавлению антител, что их будет недостаточно для торможения гемагглютинации. Наивысшее разведение сыворотки (наименьшая концентрация антител), гемагглютинацию, называется титром сыворотки в РТГА [12]. останавливающее

28 PТГA на сегодняшний день является основным инструментом надзора зa антигенными характеристиками вирусов гриппа. РТГА проводили согласно методике, рекомендованной ВОЗ [67]. Для проведения РТГА требуется: ● физиологический раствор (рН = 7,2-7,4); ● 0,5% эритроцитов птиц (индейки или кур); ● рабочие разведения антигенов; ● рабочие разведения моноклональных антител; ● поликлональные гипериммунные антисыворотки. Этапы постановки РТГА: 1. После определения в РГА титра вируса необходимо приготовить стандартизированный антиген, содержащий 8 ГАЕ вируса в 50 мкл. 2. Далее готовят двукратные разведения моноклональных антител в круглодонных микропланшетах. 3. К разведенным сывороткам добавляют 25 мкл стандартного антигена и инкубируют при комнатной температуре 30 минут. 4. После истечения срока инкубации вносят 50 мкл стандартизированного разведения эритроцитов во все лунки. 5. Учет результатов проводят после полного оседания эритроцитов (25 минут при комнатной температуре) [12]. Контроль правильности результатов регулируется использованием контрольных антигенов в РТГА. Результаты, полученные с контрольными антигенами, должны четко соответствовать типам/подтипам, указанным на флаконах. Негативная сыворотка должна давать отрицательную реакцию РГА и быть идентичной контролю эритроцитов. При двусмысленности результатов, получаемых для тестируемых антигенов, необходимо реакцию переставить, предварительно перепроверив титр разведенного антигена [12].

29 2.2.9 Антигенная картография Антигенная карта позволяет оценить направленность изменчивости вирусов. Преимущество карты заключается в простоте и наглядности представляемых данных, поскольку она может отражать до нескольких сотен антигенов и десятков сывороток. Недостатком метода является условие присутствия нескольких эволюционно отдаленных друг от друга антигенов для получения достоверных результатов [55]. Антигенная карта отображает числовую разницу во взаимодействии вирусов с антисыворотками в виде расстояния на карте. Один квадрат карты соответствует разнице в РТГА, равной 1/2 гомологичного титра. На карте антисыворотки представлены в виде квадратов, гомологичные антигены – в виде овалов, тестируемые антигены – в виде кругов [55]. Антигенную картографию проводят с использованием програмного обеспечения Antigenic Cartography. Данный метод был разработан для наглядного представления полученных результатов РТГА. Метод основан на использовании многомерных математических моделей, позволяющих получить двумерную или трехмерную антигенную карту, которая графически отображает результаты математической обработки таблиц РТГА [55]. 2.2.10 Статистическая обработка результатов Для построения таблиц, графиков и диаграмм, а также критерия Стьюдента используется программное обеспечение MS Excel 2010. 2.2.11 Молекулярно-биологические методы 1). Выделение вирусной РНК проводили при помощи набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN) и РИБО-сорб ЦНИИ эпидемиологии, Москва, РФ [Boom et al., 1990].

30 2). Синтез кДНК. Обратную транскрипцию проводили коммерческим набором «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Россия) с использованием случайных гексамерных праймеров (олиго d(N)6) при 37ºС в течение 40 мин. 3). Проведение ПЦР. Подбор праймеров для амплификации гена гемагглютинина вируса гриппа B был проведен в лаборатории молекулярной вирусологии ФГБУ «Научно-исследовательского института гриппа им. А. А. Смородинцева» Министерства Здравоохранения РФ с помощью программы Primer Premier 5.0. Состав ПЦР-смеси: 1x Green GoTaq буфер (Promega) (1,5 мM MgCl2), 0,2 mM дНТФ, по 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров, 2,5 ед GoTaq ДНК-полимеразы (Promega), DEPC-обработанная вода (Fermentas) до 30 мкл. Условия проведения ПЦР: 95ºС 2 мин; затем 94ºС 10 с, 58ºС 30 с, с понижением температуры на 1ºС за цикл, 72ºС 1 мин - 6 циклов; затем 94ºС 20 с, 48ºС 20 с, 72ºС 2 мин 30 сек - 35 циклов; и затем 72ºС 5 мин. ПЦР-фрагменты анализировали гель-электрофорезом в 1,7% агарозе и очищали при помощи DEAE-бумаги для последующего определения нуклеотидной последовательности. 4). Секвенирование. Прямое секвенирование выделенных фрагментов проводили с помощью набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit на приборе ABI 3130 Genetic Analyzer (“Applied Biosystems”, USA) в соответствии с инструкцией производителя.

31 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Циркуляция вирусов гриппа типа В на территории России в эпидемический сезон 2019-2020 гг. В эпидемический сезон 2019-2020 гг. территории России совместно циркулировали вирусы гриппа типов A(H1N1)pdm09, A(H3N2) и В Викторианской и Ямагатской линий. Сезон длился с 18 октября 2019 г. по 7 апреля 2020 г., в этот период в России было выделено 622 штамма вирусов гриппа, из них 233 (37,5%) относились к подтипу A(H1N1)pdm09, 118 (19%) штаммов принадлежали подтипу А(H3N2) и на долю вирусов гриппа В пришелся 271 (43,5%) штамм, из них 268 (98,9%) изолятов принадлежали Викторианской линии, 3 (1,1%) изолята были Ямагатской разновидности (рисунок 5). А(H3N2) 19% A(H1N1)pdm09 37,5% B 43,5% Рисунок 5. Соотношение выделенных вирусов гриппа на территории России в сезон 2019-2020 гг., выраженное в процентах Согласно географическому распространению вирусов гриппа по территории России вирусы гриппа В обеих эволюционных линий с наибольшей частотой выделялись в Южном, Северо-Кавказском и Уральском Федеральных Округах. А именно в следующих городах: Астрахань, Белгород, Владивосток, Гурзуф, Екатеринбург, Калининград, Красноярск, Новосибирск, Ставрополь, Тула, Хабаровск, Челябинск (рисунок 6). Омск, Самара,

32 Рисунок 6. Распространение вирусов гриппа В на территории России в 2019-2020 гг. Среди вирусов гриппа, циркулировавших на территории Санкт-Петербурга в сезон 2019-2020 гг., основную часть составляли вирусы гриппа В и А(H1N1)pdm09 – 48,9% и 42,1% соответственно, на долю вирусов А(H3N2) пришлось 8,6% (рисунок 7). А(H3N2) 8,6% A(H1N1)pdm09 42,1% В 48,9% Рисунок 7. Процентное соотношение вирусов гриппа, выделенных на территории г. Санкт-Петербурга в сезон 2019-2020 гг., по данным ПЦР-диагностики Первый положительный результат ПЦР на вирус гриппа В был зафиксирован на 46 неделе. Наибольшее число положительных проб было зарегистрировано на

33 7 неделе 2020 года. ПЦР-положительные пробы на вирус гриппа продолжали Количество ПЦР(+) материалов на грипп В поступать до 15 недели. (рисунок 8). 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 40 46 47 48 49 50 51 52 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Недели Рисунок 8. Результаты еженедельного поступления ПЦР-положительных на грипп В проб в Санкт-Петербурге в период с 2019 по 2020 гг. Наибольшее количество вирусов гриппа В было выделено от возрастной группы 15-29 лет, в то время как, от людей 65 лет и старше не было выделено ни одного вируса данного типа. Также очень низкий процент выделения был Количество выделенный вирусов гриппа В характерен для детей в возрасте до 12 месяцев (рисунок 9). 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0-1 1-4 5-14 15-29 30-64 65+ Возрастные группы Рисунок 8. Количество выделенных вирусов гриппа В у людей разных возрастных категорий по России в эпидемический сезон 2019-2020 гг.

34 За сезон 2019-2020 гг. в ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева» Минздрава России на клеточных культурах было выделено 298 вирусов гриппа, из них 213 (71,5%) изолятов гриппа В. Из 213 вирусов гриппа В только 7 (3,3%) штаммов удалось выделить в куриных эмбрионах. Эти штаммы были выделены как в КЭ, так и в клетках MDCK. Штаммы, выделенные напрямую от больных на куриных эмбрионах, являются залогом возможности своевременного отбора антигенно актуальных вирусов в качестве кандидатов для включения в состав гриппозных вакцин. Часть из указанных штаммов передается в Сотрудничающие Центры ВОЗ, которые проводят работу по выбору штаммов для включения в композицию противогриппозных вакцин на предстоящий эпидемический сезон. 3.2 Циркуляция вирусов гриппа типа В на территории России в эпидемический сезон 2020-2021 гг. Пандемия COVID-19, вызванная новой коронавирусной инфекцией SARSCoV-2, повлекла за собой необходимость предпринять ответные меры со стороны общественного здравоохранения, что повлекло за собой к снижению эпидемического надзора за гриппозной инфекцией и снижению формированию отчетности. С другой стороны, на активность распространения и циркуляцию вирусов гриппа среди населения повлияли введенные ограничения на перемещения, меры социального дистанцирования, а также применение средств индивидуальной защиты. За сезон 2020-2021 гг. в ФГБУ «Научно-исследовательский институт им. А. А. Смородинцева» Министерства Здравоохранения РФ было зафиксировано 33 положительных на вирус гриппа ПЦР образца, из которых 4 относились к типу В. При постановке ПЦР в реальном времени значение Ct (пороговый цикл амплификации) для образцов оказалось больше 25-30 циклов, поэтому из них не удалось выделить вирус гриппа В (рисунок 9).

35 A(H1N1)pdm09 6,1% A(H3N2) 3% B 12,1% А (неизвестный подтип) 78,8% Рисунок 9. Структура популяции вирусов гриппа в сезон 2020-2021 гг. в г. СанктПетербург по данным ПЦР-диагностики Однако были успешно выделены два вируса из образцов, присланных из Екатеринбурга - В/Екатеринбург/НИИГ-01/2021 и В/Екатеринбург/НИИГ-02/2021, которые принадлежат к Викторианской разновидности. 3.3 Антигенный анализ и антигенное картирование вирусов гриппа типа В, выделенных в эпидемическом сезоне 2019-2020 гг. Вирусы гриппа В составили значительную долю вирусов, циркулировавших среди населения в исследуемом эпидемическом сезоне. При этом стоит отметить абсолютное доминирование Викторианской разновидности: за текущий сезон было выделено только 3 штамма вирусов гриппа В Ямагатской разновидности, что составило 1,1% от всех вирусов гриппа В.

36 Таблица 1. Антигенная характеристика вирусов гриппа В Викторианской линии, выделенных на территории России в сезон 2019-2020 гг. № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/С.-Петербург/НИИГ328/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ340/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ345/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ347/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ348/2019 (MDCK) В/Астрахань/15/2020 (MDCK) B/Владивосток/1/2019 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-01/2020 (MDCK) В/Калининград/18/2020 (MDCK) В/Самара/04/2020 (MDCK) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 <10 <10 <10 40 40 40 <10 <10 10 <10 40 20 <10 <10 10 20 20 80 40 80 40 80 80 80 20 40 40 40 40 80 Примечание: НИИГ в названии штамма означает, что вирус был выделен в НИИ гриппа. Розовым цветом выделены эталонные штаммы. Жирным шрифтом выделены гомологичные титры. Антигенный анализ был проведен для 213 штаммов Викторианской разновидности. Все изученные изоляты Викторианской линии принадлежали к вирусам, имеющим три делеции в позициях 162-164, и были антигенно подобны референс-штамму В/Вашингтон/02/2019, однако только 107 штаммов (51,2% от общего числа проанализированных изолятов) реагировали с поликлональной крысиной сывороткой до высоких титров – до 1-1/4 гомологичного титра, что свидетельствует о сложившейся антигенной гетерогенности современных штаммов вируса гриппа В Викторианской линии (приложение 1). Из всех проанализированных штаммов 47 (22,1%) реагировали до высоких титров – 1-1/4 с сывороткой к штамму В/Колорадо/06/2017, введенному в состав вакцин на сезон 2019-2020 гг. и имевшего две аминокислотные делеции в

37 положении 162-163. Остальная часть вирусов реагировали до 1/8-1/16 гомологичного титра (приложение 1). По результатам антигенного анализа установлено также, что все три штамма Ямагатской линии были подобны референс-штамму В/Пхукет/3073/2013, входящему в состав противогриппозных вакцин, и реагировали с антисывороткой к нему до 1-1/2 гомологичного титра, все штаммы хорошо взаимодействовали и с сыворотками к более современным представителям данной разновидности 20172018 гг. выделения – до 1-1/4 гомологичного титра (приложение 1). Антигенное картирование вирусов гриппа, выделенных в сезоне 2019-2020 гг. на территории Российской Федерации отражает результаты антигенного анализа, представленные выше (рисунки 10 и 11). Штаммы текущего сезона выделены оранжевым, штаммы предыдущих лет выделения – зеленым, референсштаммы – другими цветами. Сыворотки обозначены квадратами. Один квадрат двумерной карты эквивалентен двукратной разнице титра в РТГА. Вирусы гриппа В Викторианской линии четко разорваны на два облака штаммов: В/Брисбен/60/2008-подобные, циркулировавшие в предыдущие сезоны, и В/Колорадо/06/2017-подобные, более близко на карте также прилегающие к новому вакцинному штамму В/Вашингтон/02/2019, несущему тройную делеция в положения 162-164 в молекуле НА1 (рисунок 10).

38 Рисунок 10. Антигенная карта вирусов гриппа типа B Викторианской эволюционной линии, циркулировавших в сезоне 2019-2020 гг. в России. Немногочисленные вирусы Ямагатской разновидности остаются антигенно гомогенными и образуют кластер с В/Пхукет/3073/2013-подобными штаммами предыдущих лет выделения (рисунок 11). Рисунок 11. Антигенная карта вирусов гриппа типа B Ямагатской эволюционной линии, циркулировавших в сезоне 2019-2020 гг. в России.

39 3.4 Соответствие штаммов, циркулировавших в России в сезон 2019-2020 гг. вирусам, включенным в состав вакцин В состав трехвалентных вакцин на сезон 2019-2020 гг. были включены штаммы: 1) А/Брисбен/02/2018 (H1N1pdm09) 2) А/Канзас/14/2017 (H3N2) 3) В/Колорадо/06/2017 (Викторианская линия) Квадривалентные вакцины дополнительно содержали: 4) В/Пхукет/3073/2013 Вирусы гриппа В Викторианской разновидности частично соответствовали штамму В/Колорадо/06/2017, несущему двойную делецию в положении 162-163, в то время как эпидемические штаммы прошедшего сезона имели делеции в положении 162-164 в составе вакцин. Единичные штаммы Ямагатской разновидности были антигенно близкими вирусу В/Пхукет/3073/2013, введенному в состав квадривалентных вакцин, однако низкий уровень их циркуляции не мог повлиять на показатели эффективности вакцин, тем более, что основная масса российских вакцин относилась к разряду трехвалентных и содержала в своем составе штамм В/Колорадо/06/2017 Викторианской линии. 3.5 Антигенный анализ и антигенное картирование вирусов гриппа типа В, выделенных в эпидемическом сезоне 2020-2021 гг. Антигенный разновидности. анализ Ввиду был низких проведен титров для 2 вирусов реагирования с Викторианской поликлональными крысиными антисыворотками, полученными к штаммам В/Колорадо/06/2017 и В/Вашингтон/02/2019, вирусы были проанализированы с сыворотками к штаммам, подобным В/Вашингтон/02/2019, и реагировали до 1/2 – 1/4 гомологичного титра, что позволяет сделать вывод, что исследуемые изоляты подобны штамму

40 В/Вашингтон/02/2019 и несут в себе три делеции в позициях 162-164 (приложение 2). 3.6 Соответствие штаммов, циркулировавших в России в сезон 2020-2021 гг. вирусам, включенным в состав вакцин Трехвалентные вакцины на сезон 2020-2021 гг. содержали штаммы: 1) A/Виктория/2570/2019 (H1N1pdm09) 2) A/Камбоджа/e0826360/2020 (H3N2) 3) B/Вашингтон/02/2019 (Викторианская линия) Квадривалентные вакцины дополнительно содержали: 4) B/Пхукет/3073/2013 (Ямагатская линия) Вирусы гриппа В Викторианской линии 2020-2021 гг. выделения соответствовали штамму В/Вашингтон/02/2019, несущему в себе тройную делецию в положениях 162-164. 3.7 Антигенный анализ вирусов гриппа типа В Викторианской эволюционной линии, выделенных на территории России в сезоны 2019-2020 гг. и 2020-2021 гг. с применением моноклональных антител Моноклональные антитела направлены к конкретному эпитому гемагглютинина. Применение РТГА с моноклональными антителами позволяет предположить о возникновении изменений в конкретных участках молекулы, которые могут влиять на антигенные свойства вирусов гриппа. С целью изучения антигенной изменчивости вирусов гриппа В Викторианской линии использовалась панель из семи моноклональных антител, полученных к эталонному штамму В/Брисбен/46/15, обозначенных как МКА 10D9, 10F1, 10B6, 7C8, 7G9, 7H8, 8A8 с известными моноклональными позициями (таблица 3). Изоляты были выделены на клеточной культуре MDCK. Установлено, что все моноклональные антитела обладали выраженной антигемагглютинирующей

41 активностью в отношении вируса-иммуногена В/Брисбен/46/15, выделенном на куриных эмбрионах (приложение 3). Таблица 3. Моноклональные антитела с указанными позициями аминокислотных замен Моноклональные антитела Позиции аминокислотных замен 10D9 10F1 10B6 7C8 7G9 7H8 8A8 141G→R 241P→T 182T→K 200Q→R 74G→E 75K→E 122H→N 206G→R 121T→I Эпидемический сезон 2019-2020 гг. Было проанализировано 54 вируса. МКА 10F1, 7G9 обладали выраженной антигемагглютинирующей активностью в отношении всех исследованных вирусов (приложение 3). Интересным исключением стал МКА 7H8, который не взаимодействовал ни с одним вирусом, в том числе с тремя эталонными штаммами B/Котд'Ивуар/1662/19, B/Гонконг/269/17, B/Мэриленд/15/16. МКА 10D9 и 10B6 реагировали до 1/2 - 1/4 гомологичного титра лишь с 25,9% и 46,3% вирусов соответственно. МКА 7C8 и 8A8 имели более хорошие показатели – реагировали с 90,7% и 87% штаммов, причем, до более высоких титров, чем с В/Брисбен/46/15, что объясняется особенностью МКА лучше взаимодействовать с изолятами, полученными на системе выделения MDCK (рисунок 12). Эпидемический сезон 2020-2021 гг. Было проанализировано 2 вируса эпидемического сезона 2020-2021 гг. – В/Екатеринбург/НИИГ-01/2021 и В/Екатеринбург/НИИГ-02/2021 (приложение 3). МКА 10D9 реагировал до гомологичного титра с обоими выделенными изолятами. МКА 10F1, 7С8, 7G9 и 8А8 реагировали до более высоких титров, чем с эталонным штаммом В/Брисбен/46/15. МКА 10В6 взаимодействовал с вирусами В/Екатеринбург/НИИГ-01/2021 и В/Екатеринбург/НИИГ-02/2021 до 1/8 - 1/16 гомологичного титра соответственно. Исключением стал МКА 7Н8, который не реагировал с обоими изолятами (рисунок 12).

42 Количество вирусов гриппа В в % Сезон 2019-2020 гг. 100 3.7 Сезон 2020-2021 гг. 3.7 90 3.7 3.7 80 70 60 50 96.3 1.85 40 30 3.7 96.3 7C8 7G9 87 46.3 20 10 90.7 25.9 0 10D9 10F1 10B6 0 7H8 8A8 Моноклональные антитела Рисунок 12. Процент взаимодействия МКА с вирусами гриппа В Викторианской линии, выделенных в России в сезоны 2019-2020 гг. и 2020-2021 гг. По данным РТГА, можно выдвинуть предположение, что низкие титры реагирования моноклональных антител 10D9, 10B6, 7H8 с большинством выделенных штаммов указывают на возникновение аминокислотных замен в соответствующих положениях гемагглютинина, а именно 141, 200, 206 и 241. Отдельное внимание стоит обратить на моноклональное антитело 7Н8, которое направлено к участку, близко располагающемуся к 190 спирали, но в то же время данный участок пространственно близко находится к петле 160, исходя из чего можно предположить наличие замены в одной из этих областей.

43 ВЫВОДЫ 1. В структуре вирусной популяции в эпидемический сезон 2019-2020 гг. в России преобладали штаммы Викторианской линии – 43,5%, из них 1,1% составили вирусы Ямагатской линии, в сравнении с предыдущим сезоном 2018-2019 гг., в котором доминировали вирусы Ямагатской разновидности. 2. Вирусы Викторианской линии сезона 2019-2020 гг. и 2020-2021 гг. были подобны референс-штамму В/Вашингтон/02/2019. Штаммы Ямагатской линии были подобны референс-штамму В/Пхукет/3073/2013. 3. Вирусы гриппа В Викторианской линии, циркулирующие в сезон 20192020 гг., не соответствовали вакцинному штамму В/Колорадо/06/2017, но соответствовали штамму В/Вашингтон/02/2019. Вирусы Ямагатской линии соотетствовали вирусу В/Пхукет/3073/2013, включенному в состав квадривалентных вакцин. Вирусы 2020-2021 гг. выделения соответствовали штамму В/Вашингтон/02/2019, включенному в состав вакцин на сезон 2020-2021 гг. 4. Низкие титры реагирования МКА 10D9, 10B6, 7H8 с большинством выделенных штаммов позволяют предположить о возникших аминокислотных заменах в соответствующих положениях гемагглютинина, а именно в положениях 141, 200, 206 и 241.

44 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Вирусы гриппа В по-прежнему остаются ежегодной причиной заболеваемости и смертности человеческой популяции, и полное понимание их биологических и эпидемиологических свойств крайне важно для улучшения контроля над этим патогеном. В работе собран значительный материал, характеризующийся новизной и представляющий значительный практический и научный интерес. За исследуемый период было изолировано и восстановлено более 100 штаммов вируса гриппа типа В, был проведен антигенный анализ и дана генетическая характеристика. Результаты работы позволяют отметить наметившийся антигенный дрейф вирусов гриппа типа В. Также определена доля вирусов гриппа данного типа на территории России в период с 2019 по 2021 гг., и обозначены важные аминокислотные замены. Полученные автором результаты являются актуальными и могут быть использованы для разработки диагностических препаратов и вакцин.

45 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ НА – гемагглютинин (hemagglutinin); NA – нейраминидаза (neuraminidase); РНК – рибонуклеиновая кислота; вРНП – вирусный рибонуклеиновый протеин; мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота; РСС – рецептор-связывающий сайт; NB – протонный канал; BM2 – протонный канал; М2 – матриксный белок 2; М1-вРНП – матриксный белок 1 - вирусный рибонуклеиновый протеин; NEP – белок ядерного экспорта (nuclear export protein); NS2 – неструктурный белок 2 (nonstructural protein 2); АТФ – аденозинтрифосфорная кислота; PB2 – белок полимеразного комплекса; PB1 – белок полимеразного комплекса; PA – белок полимеразного комплекса; NP – нуклеопротеин (nucleoprotein); МКА – моноклональные антитела; РТГА – реакция торможения гемагглютинирующей активности; ВОЗ – Всемирная Организация Здравоохранения; CDC&P – Центр по контролю и профилактике заболеваний (Centers for Disease Control and Prevention); FCI – Институт Фрэнсиса Крика (The Francis Crick Institute); MDCK – перевиваемая культура почечного эпителия собаки (Madin-Darby canine kidney cells); Трипсин ТРСК – трипсин бычьей поджелудочной железы, обработанный L-lTosylamide 2-Phenylethyl Chloromethyl Ketone; HEPES – цвиттерионный органический буферный агент (4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid);

46 BSA – бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin); КЭ – куриные эмбрионы; РГА – реакция гемагглютинации; Игла-МЕМ – среда МЕМ (Minimum Essential Medium) является модифкацией среды BME, за счет увеличения содержания аминокислот, эта среда ближе по белковому составу к человеческим клеткам; Альфа-МЕМ – среда альфа-MEM (α-MEM) содержит: незаменимые аминокислоты, пируват натрия, тиоктовую кислоту, витамин B12, биотин и витамин C; ЦПД – цитопатическое действие; ГАЕ – гемагглютинирующая единица.

47 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Вирусы гриппа. Иллюстрированное учебное пособие // Литусов Н. В. // 1. Екатеринбург: УГМУ. – 2018. – 22 с. Возможности 2. использования поликлональных крысиных антисывороток в антигенном анализе вирусов гриппа человека // Даниленко Д. М., Коновалова Н. И., Прокопец А. В. [и др.] // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2013. – Т. 68. – С. 73-79. Вопросы общей вирусологии: Учебное пособие // Под ред. О. И. 3. Киселева, И. Н. Жилинской – СПб.: СПбГМА им. И. И. Мечникова, 2007. – 374 с. Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных 4. эмбрионах и их идентификация: методические рекомендации / Соминина А. А., Бурцева Е. И., Лобова Т. Г. [и др.]; Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - СПб. - 2006. - URL: https://docs.cntd.ru/document/420214503 Грипп (сезонный, птичий пандемический) и другие ОРВИ // под ред. 5. проф. Малого В. П., проф. Андрейнича М. А. – М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2012. – 320 с.: ил. Грипп у взрослых: методические рекомендации по диагностике, 6. лечению, специфической и неспецифической профилактике // А. Г. Чучалин // Спб: Издательско-полиграфический комплекс «НП-Принт». – 2014. – 192 с. Грипп. Учебное пособие // А. Ф Попов, А. И. Симакова, О. И. Киселёв 7. // Владивосток – СПб. – 2014. Грипп: эпидемиология, диагностика, лечение, профилактика // под ред. 8. акад. РАМН проф. Киселева О. И., д-ра мед. наук Цыбаловой Л. М., акад. РАМН проф. Покровского В. И. — М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство». – 2012. – 496 с. 9. Медицинская вирусология: Руководство // Под ред. Д. К. Львова. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. – 656 с.: ил. 10. Патогенетическая микробиология // А. Н. Маянский. — Н. Новгород: Издательство НГМА. – 2006.

48 11. Практикум по ветеринарной вирусологии // Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская, И. В. Третьякова. – М.: Колос С, 2007. – 280с. 12. Реакция микронейтрализации в сравнении с реакцией торможения гемагглютинации при оценке иммуногенности гриппозных вакцин и диагностике гриппа // Кривицкая В. З., Кузнецова Е. В., Майорова В. Г. [и др.] // Инфекция и иммунитет. - 2019. - Т. 9. - №. 5-6. - С. 763-772. 13. Barr I.G., Komadina N., Durrant C. et al. Circulation and antigenic drift in human influenza B viruses in SE Asia and Oceania since 2000 // Communicable Deseases Intelligence. Quarterly report. – 2006. – V.30.№3. – P.350-357. 14. Bedford T., Steven R., Barr I.G. Global circulation patterns of seasonal influenza viruses vary with antigenic drift. Nature. 2015. 15. Bedford T., Suchard M.A., Lemey P. et al. Integrating influenza antigenic dynamics with molecular evolution. Elife. 2014 Feb 4. 16. Berton M. T., Naeve C. W., Webster R. G. Antigenic structure of the influenza B virus hemagglutinin: nucleotide sequence analysis of antigenic variants selected with monoclonal antibodies // J. Virol. -1984. -Vol. 52. -P. 919– 927 17. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.H. Rapid and simple method for purification of nucleic acid// Journal of Clinical Microbiology. – 1990. – V.28. – №3. – Р.495-503. 18. Braam, J. Molecular model of a eukaryotic transcription complex: functions and movements of influenza P proteins during capped RNA-primed transcription / J. Braam, I. Ulmanen, R.M. Krug // Cell. -1983. - 34 (2). - P. 609-618. 19. Caini S., Kusznierz G., Garate V. V., Wangchuk S., Thapa B., Global Influenza B Study team, et al. The epidemiological signature of influenza B virus and its B/Victoria and B/Yamagata lineages in the 21st century // PLOS ONE 14(9): e0222381. – 2019. 20. Chen J. M., Guo Y. J., Wu K. Y. et al. Exploration of the emergence of the Victoria lineage of influenza B virus // Arch. Virol. 152(2), 415–422. – 2007. 21. Chen R., Holmes E.C. The Evolutionary Dynamics of Human Influenza B Virus// Journal of Molecular Evolution. – 2008. – V.66 – P.655-663.

49 22. Daniels P. S., Jeffries S., Yates P., Schild G. C., Rogers G. N., Paulson J. C. et al. The receptor-binding and membrane-fusion properties of influenza virus variants selected using anti-haemagglutinin monoclonal antibodies // EMBO J. -1987 - 6(5) – Р. 1459–65. 23. Dudas G., Bedford T., Lycett S. et al. Reassortment between inﬂuenza B lineages and the emergence of a coadapted PB1–PB2– HA gene complex. Mol. Biol. Evol. 32(1), 162–172 (2015). 24. Ferguson, N. M., Galvani, A. P., Bush, R. M. Ecological and immunological determinants of influenza evolution/N.M. Ferguson, A. P. Galvani, R. M. Bush//Nature. –2003. –V. 422. –P. 428-433. 25. Francis, T., Jr., 1940. A new type of virus from epidemic influenza. Science 92 (2392), 405–408. 26. Garg S, Moore Z, Lee N, McKenna J, Bishop A, Fleischauer A, et al. A cluster of patients infected with I221V influenza b virus variants with reduced oseltamivir susceptibility—North Carolina and South Carolina, 2010–2011 // J Infect Dis – 2013 207(6) – Р. 966–73. https://doi.org/10.1093/infdis/jis776 PMID: 23242536 27. Garten R., Blanton L., Elal A. I. A. Update: Influenza Activity in the United States During the 2017–18 Season and Composition of the 2018–19 Influenza Vaccine. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2018; 67:634–642. 28. Grudinin M. P., Pisareva М. М., Komissarov А. В., Kosheleva А. А., Buzitskaya J. V., Stukova M. A., Prokopetz A. V., Danilenko D. M., Konovalova N. I., Lobova T. G., Sominina A. A., Kiselev O. I. Changes in the antigenic and genetic structure of influenza viruses: analysis of surveillance data of influenza A and B in Russia in 2006-2013. Research Institute of Influenza, Saint Petersburg, Russian Federation. – 2015. 29. Hatta, M. The NB protein of influenza B virus is not necessary for virus replication in vitro / М. Hatta, Y. Kawaoka // J Virol. - 2003. - 77 (10). - P. 6050-6054. 30. Hemphill M.L., Rota P.A., Ivanova V.T. et al. Antigenic and genetic analyses of influenza type B viruses isolated in Russia, 1987-91 // Epidemiol. Infect. –1993. – V.111. – P.539-546.

50 31. Hu Ge, Yi-Fei Wang, Jun Xu, Qiong Gu, Hai-Bo Liu, Pei-Gen Xia, Jiaju Zhou, Yanhuai Liu, Zirong Yangf and Hua Suf. Anti-influenza agents from Traditional Chinese Medicine// – 2010. – DOI: 10.1039/c0np00005a. 32. Imai, M. Cytoplasmic domain of influenza B virus BM2 protein plays critical roles in production of infectious virus / M. Imai, K. Kawasaki, T. Odagiri // J Virol. 2008. - 82 (2). - Р. 728-739. 33. Kendal A.P., Cox N. J., Harmon M. Antigenic and genetic variation of influenza A(H1N1) viruses// Applied virology research. Plenum Publishing Corporation. – 1990. – V.2. – P.131-141. 34. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. – 1975. 256(5517):495-7. 35. Lee H. K. et al. Comparison of mutation patterns in full-genome A/H3N2 influenza sequences obtained directly from clinical samples and the same samples after a single MDCK passage //PLoS One. – 2013. – Т. 8. – №. 11. 36. Lindstrom S.S., HiromotoY., Nishimura H. et al. Comparative Analysis of Evolutionary Mechanisms of the Hemagglutinin and Three Internal Protein Genes of Influenza B Virus: Multiple Cocirculating Lineages and Frequent Reassortment of the NP, M and NS Genes// Journal of Virology. – 1999. – V.73. №5. – P.4413-4426 37. Lugovtsev V.Y, Vodeiko G.M., Strupczewski C.M. et al. Generation of influenza B viruses with improved growth phenotype by substitution of specific amino acids of hemagglutinin// Virology. – 2007. – V.365. – P.315-323. 38. Machado A., Kislaya I., Nunes B., Rodrigues A.P., Guiomar R. Moderate influenza vaccine effectiveness in a B mismatch season: Preliminary results from the 2017/2018 season in Portugal. Pulmonology. 2018; 24:260–262. 39. McCauley J., WHO World Health Organization. Situation Update, 24-26 September 2019. P. 147. 40. Nakagawa N., Susuoki J., Kubota R et al. Discovery of the Neutralizing Epitope Common to Influenza B Virus Victoria Group Isolates in Japan// Journal of Clinical Microbiology. – 2006. – V.44. – №4. – P.1564-1566.

51 41. Nerome K., Nerome R. et al. Characteristic evolutionary mechanisms of the influenza B virus: It is dynamic deletion-insertion rotation mechanisms and frequent occurrence of genomic reassortment// Virus Research. – 2002. – №169. – P.171-185. 42. Nerome, R., Hiromoto, Y. et al. Evolutionary characteristies of influenza B virus since its first isolation in 1940: dynamic circulation of deletion and insertion mechanisms/R. Nerome, Y. Hiromoto//Arch Virol. – 1998. – P.1569-1583 43. Norkin, L.C. Orthomyxoviruses / L.C. Norkin // In: Virology. Molecular biology and pathogenesis. - 2010. - Washington DC, USA: Asm Press American Society Microbiol. - P. 296-345. 44. O'Neill, R.E. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins / R.E. O'Neill, J. Talon, P. Palese // EMBO J. - 1998. 17 (1). - P. 288- 296. 45. Osterhaus A.D., Rimmelzwaan G.F., Martina B.E. et al. Influenza B Virus in Seal // Science. – 2000. – V.288. – P.1051-1053. 46. Palese, P., Bouvier, N. The biology of influenza viruses/P. Palese, N. Bouvier//Vaccine. – 2008. –V. 26S. –P. D49-D53. 47. Paragas, J. Influenza B and C Virus NEP (NS2) proteins possess nuclear export activities / J. Paragas, J. Talon, R.E. O’Neill et al. // J. Virol. - 2001. - 75 (16). - Р. 73757383. 48. Rogers G. N., Paulson J. C. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin //Virology. – 1983. – Т. 127. – №. 2. – С. 361-373. 49. Rota P. A., Wallis T. R., Harmon M. W., Rota J. S., Kendal A. P., Nerome K. Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza type B virus since 1983. Virology. 1990 Mar;175(1):59-68. 50. Scholtissek, C. Molecular evolution of influenza viruses/C. Scholtissek//Virus Genes. – 1996. – V. 11. – P. 209-215 51. Sharp, D.G., Taylor, A.R., McLean, I.W., Jr., Beard, D., Beard, J.W., Feller, A.E., Dingle, J.H.,1943. Isolation and characterization of influenza virus B (Lee Strain). Science 98 (2544), 307–308

52 52. Shaw, M.L., Palese, P. Orthomyxoviruses: Molecular Biology//M.L. Shaw, P. Palese. / Encyclopedia of virology. Third edition. Amsterdam - Boston - Heidelberg London - New York - Oxford -Paris - San Diego - San Francisco - Singapore - Sydney Tokyo: Elsevier Academic Press; - 2008. - P. - 485-494 53. Skehel, J.J., Wiley D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin/J.J. Skehel, D.C. Wiley//Annu Rev Biochem. - 2000. - 69. P. 531-569. 54. Smith G. J. D. et al. Dating the emergence of pandemic influenza viruses //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2009. – Т. 106. – №. 28. – P. 11709-11712. 55. Smith J.D., Lapedes A.S., Jong J.C. et al. Mapping the Antigenic and Genetic Evolution of Influenza Virus// Science. – 2004. –V.305. – P.371-376. 56. Treanor, J. Influenza vaccine – outmaneuvering antigenic shift and drift/J. Treanor//The New England Journal of Medicine. –2004. –V. 350(No3). –P. 218-220. 57. Vemula S. V. et al. Current approaches for diagnosis of influenza virus infections in humans //Viruses. – 2016. – Т. 8. – №. 4. – С. 96. 58. Verhoeyen M., Rompuy L.V., Jou W.M. et al. Complete nucleotide sequence of the influenza B/Singapore/222/79 virus hemagglutinin gene and comparison with the B/Lee/40 hemagglutinin// Nucleic Acids Research. – 1983. – V.11. – №.14. – P.47034712. 59. Vijaykrishna D., Holmes EC., Joseph U. et al. The contrasting phylodynamics of human inﬂuenza B viruses. eLife 4, e05055 (2015). 60. Wanitchang А., Narkpuk J., Jaru-ampornpan P., Jengarn J., Jongkaewwattana A. Inhibition of influenza A virus replication by influenza B virus nucleoprotein: An insight into interference between influenza A and B viruses. – 2012. Virology 432. P. 194-203. 61. Wiley, D.C., Skehel J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus/D.C. Wiley, J.J. Skehel//Annu Rev Biochem. - 1987. – V. 56. - P. 365-394.

53 62. Williams MA, Lamb RA. Effect of mutations and deletions in a bicistronic mRNA on the synthesis of influenza B virus NB and NA glycoproteins // J. Virol. – 1989. - 63(1) – Р. 28–35 63. Yang J-R, Huang Y-P, Chang F-Y, Hsu L-C, Lin Y-C, Huang H-Y, et al. Phylogenetic and evolutionary history of influenza B viruses, which caused a large epidemic in 2011–2012, Taiwan // PLoS One. – 2012 - 158 7(10): e47179. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047179 PMID: 23071751 64. Yasuda, J. Molecular assembly of influenza virus: association of the NS2 protein with virion matrix / J. Yasuda, S. Nakada, A. Kato et al. // Virology. - 1993. - 196 (1). - Р. 249-255. 65. Global epidemiological surveillance standards for influenza. World Health Organization 2013. ISBN 978 92 4 150660 1 66. ViralZone. https://viralzone.expasy.org/ 67. WHO manual on influenza diagnosis and surveillance http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/whocdscsrncs20025rev.pdf. 2011. 68. Worldwide Influenza Centre: Annual and interim reports. Available from: https://www.crick.ac.uk/partnerships/worldwide-influenza-centre/annual-andinterim-reports –

54 ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1 Таблица 1. Антигенная характеристика вирусов гриппа В Викторианской линии, выделенных на территории России в сезон 2019-2020 гг. № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) B/Гурзуф/НИИГ-01/2020 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-02/2020 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-03/2020 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-04/2020 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-05/2020 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-06/2020 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-08/2020 (MDCK) B/Гурзуф/НИИГ-09/2020 (MDCK) B/Владивосток/1/2019 (MDCK) B/Владивосток/3/2019 (MDCK) B/Владивосток/4/2019 (MDCK) B/Владивосток/8/2019 (MDCK) B/Владивосток/11/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ328/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ340/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ345/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ347/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ348/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ349/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ350/2019 (MDCK) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 80 80 80 80 80 80 40 80 80 40 80 80 80 80 160 160 80 160 160 80 160 80 80 80 40 80 40 40 20 80 40 40 80 80 80 80 40 20 80 <10 <10 <10 40 40 40 <10 <10 10 <10 40 20 <10 <10 10 20 40 80 40 40 80

55 № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/С.-Петербург/НИИГ01/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-07/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-12/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-13/2020 (MDCK) В/Владивосток/2/2019 (MDCK) В/Владивосток/5/2019 (MDCK) В/Владивосток/6/2019 (MDCK) В/Владивосток/9/2019 (MDCK) В/Владивосток/13/2019 (MDCK) В/Екатеринбург/1/2020 (MDCK) В/Астрахань/15/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ332/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ336/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ352/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ06/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ10/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ11/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ12/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ13/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ14/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-17/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-20/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-22/2020 (MDCK) 4 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 40 40 40 <10 <10 40 <10 <10 20 <10 <10 20 20 <10 80 40 40 160 20 40 80 <10 20 40 <10 20 40 <10 <10 40 20 20 80 <10 <10 40 20 20 160 20 20 80 <10 <10 40 20 20 40 <10 <10 40 <10 20 80 <10 <10 20 <10 <10 20 20 20 80 20 40 160 40 20 80

56 № 1 2 3 4 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 Вирусы гриппа В В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/Гурзуф/НИИГ-26/2020 (MDCK) В/Калининград/02/2020 (MDCK) В/Хабаровск/02/2020 (MDCK) В/Белгород/НИИГ01/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ335/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ362/2019 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ15/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ19/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ20/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ07/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ08/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ09/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ23/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ35/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ40/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ43/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ45/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/05/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-23/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-26/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-28/2020 (MDCK) В/Белгород/НИИГ02/2020 (MDCK) Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 40 40 40 20 20 40 10 10 40 20 20 40 10 10 20 20 20 20 20 40 20 20 20 80 20 10 20 20 40 80 20 40 80 20 40 320 20 40 80 20 40 80 10 40 80 20 80 80 10 40 80 40 80 160 20 40 80 20 80 160 10 40 80 20 80 40

57 № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/Гурзуф/НИИГ-01/2020 (Egg) В/Новосибирск/92/2019 (MDCK) В/Новосибирск/02/2020 (MDCK) В/Новосибирск/03/2020 (MDCK) В/Новосибирск/04/2020 (MDCK) В/Новосибирск/05/2020 (MDCK) В/Новосибирск/07/2020 (MDCK) В/Новосибирск/09/2020 (MDCK) В/Новосибирск/10/2020 (MDCK) В/Тула/01/2020 (MDCK) В/Астрахань/03/2020 (MDCK) В/Астрахань/05/2020 (MDCK) В/Астрахань/06/2020 (MDCK) В/Хабаровск/07/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ34/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ48/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ46/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-10/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-16/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-21/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-23/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-24/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-27/2020 (MDCK) 4 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 <10 <10 40 40 80 160 40 80 80 20 40 40 40 80 160 20 40 40 20 80 80 <10 40 20 20 80 80 <10 80 40 20 80 40 20 80 40 40 160 160 <10 40 20 <10 40 <10 10 40 40 ??? 40 ??? 20 80 40 40 80 160 20 80 80 40 160 160 20 80 80 80 80 160

58 № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/Гурзуф/НИИГ-29/2020 (MDCK) В/Гурзуф/НИИГ-30/2020 (MDCK) В/Омск/НИИГ-01/2020 (MDCK) В/Калининград/08/2020 (MDCK) В/Астрахань/01/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ33/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ46/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ47/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ55/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ56/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ57/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ59/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ60/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ62/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ68/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ69/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ71/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ74/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ76/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ77/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ83/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ84/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ87/2020 (MDCK) 4 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 40 80 160 20 80 80 10 80 20 80 80 320 10 20 80 <10 40 40 10 40 20 10 80 40 <10 40 40 10 80 40 10 80 40 40 80 160 10 80 40 20 80 160 10 40 80 10 40 40 10 40 80 10 40 10 10 40 10 10 40 40 20 80 40 10 80 80 20 80 40

59 № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/С.-Петербург/НИИГ90/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ92/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ93/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ97/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ98/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ99/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ102/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ103/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ104/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ105/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ107/2020 (MDCK) В/Омск/05/2020 (MDCK) В/Омск/07/2020 (MDCK) В/Омск/08/2020 (MDCK) В/Омск/13/2020 (MDCK) В/Калининград/18/2020 (MDCK) В/Самара/04/2020 (MDCK) В/Самара/05/2020 (MDCK) В/Калининград/09/2020 (MDCK) В/Калининград/13/2020 (MDCK) В/Калининград/33/2020 (MDCK) В/Калининград/34/2020 (MDCK) В/Калининград/36/2020 (MDCK) В/Хабаровск/45/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ112/2020 (MDCK) 4 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 10 40 40 20 80 80 20 40 40 10 40 80 10 40 40 10 40 20 10 40 40 10 40 40 10 40 10 10 40 40 10 80 80 20 40 20 20 40 80 40 40 40 80 40 10 20 40 40 40 40 80 20 80 40 10 40 40 40 80 160 20 80 40 10 80 20 10 80 40 40 80 80 10 40 40

60 № 1 2 3 4 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 Вирусы гриппа В В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/С.-Петербург/НИИГ118/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ120/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ125/2020 (MDCK) В/Челябинск/01/2020 (MDCK) В/Челябинск/113/2020 (MDCK) В/Хабаровск/43/2020 (MDCK) В/Хабаровск/57/2020 (MDCK) В/Хабаровск/58/2020 (MDCK) В/Хабаровск/87/2020 (MDCK) В/Хабаровск/88/2020 (MDCK) В/Ставрополь/01/2020 (MDCK) В/Ставрополь/02/2020 (MDCK) В/Ставрополь/03/2020 (MDCK) В/Ставрополь/05/2020 (MDCK) В/Ставрополь/07/2020 (MDCK) В/Ставрополь/08/2020 (MDCK) В/Ставрополь/09/2020 (MDCK) В/Калининград/19/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ61/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ72/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ75/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ79/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ95/2020 (MDCK) Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 10 40 20 10 40 20 10 80 40 10 40 80 20 40 40 10 40 160 10 40 80 40 20 80 10 40 40 10 40 40 10 20 20 10 80 20 10 80 40 10 40 40 10 40 40 10 40 40 10 80 40 10 160 20 10 80 20 40 160 160 10 80 20 10 160 80 10 80 80

61 № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/С.-Петербург/НИИГ100/2020 (MDCK) В/Красноярск/01/2020 (MDCK) В/Красноярск/02/2020 (MDCK) В/Красноярск/03/2020 (MDCK) В/Красноярск/04/2020 (MDCK) В/Красноярск/05/2020 (MDCK) В/Красноярск/06/2020 (MDCK) В/Хабаровск/54/2020 (MDCK) В/Хабаровск/56/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ67/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ130/2020 (MDCK) В/Астрахань/41/2020 (MDCK) В/Астрахань/42/2020 (MDCK) В/Астрахань/43/2020 (MDCK) В/Астрахань/44/2020 (MDCK) В/Астрахань/45/2020 (MDCK) В/Калининград/21/2020 (MDCK) В/Калининград/35/2020 (MDCK) В/Омск/09/2020 (MDCK) В/Хабаровск/35/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ133/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ134/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ137/2020 (MDCK) 4 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 10 160 80 40 160 80 80 80 80 10 160 20 40 160 80 40 160 80 10 160 40 80 160 80 20 160 80 40 160 80 20 160 40 20 80 80 20 40 40 20 40 10 20 40 80 20 40 20 20 40 40 20 40 20 20 80 10 10 40 10 20 40 40 20 40 80 10 40 20

62 № 1 2 3 4 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 Вирусы гриппа В В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/С.-Петербург/НИИГ140/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ144/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ151/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ154/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ157/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ160/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ163/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ169/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ172/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ173/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ177/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ191/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ196/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ198/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ200/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ206/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ211/2020 (MDCK) В/С.-Петербург/НИИГ219/2020 (MDCK) В/Калининград/29/2020 (MDCK) В/Красноярск/07/2020 (MDCK) В/Красноярск/08/2020 (MDCK) В/Красноярск/09/2020 (MDCK) В/Красноярск/10/2020 (MDCK) Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 10 40 10 10 40 10 40 80 160 20 80 80 40 40 160 20 80 160 10 40 80 10 80 80 40 160 160 20 40 80 20 80 80 20 80 80 10 80 160 10 80 160 20 80 160 20 160 80 40 160 80 10 80 80 20 80 80 40 80 80 20 160 80 20 160 320 10 80 80

63 № Вирусы гриппа В 1 2 3 В/Брисбен/60/08 (Egg) B/Колорадо/06/17 (Egg) B/Колорадо/06/ 2017 (MDCK) B/Вашингтон/02/2019 (Egg) В/Тула/04/2020 (MDCK) В/Тула/05/2020 (MDCK) В/Тула/06/2020 (MDCK) В/Тула/10/2020 (MDCK) В/Тула/13/2020 (MDCK) В/Тула/14/2020 (MDCK) 4 212 213 214 215 216 217 Крысиные поликлональные сыворотки B/Колорадо/ B/Колорадо/06/20 B/Вашингтон/ 06/2017 Egg 17 MDCK 2/2019 Egg 80 40 10 160 160 160 160 160 40 160 80 320 10 10 10 20 10 20 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 Примечание: НИИГ в названии штамма означает, что вирус был выделен в НИИ гриппа. Розовым цветом выделены эталонные штаммы. Жирным шрифтом выделены гомологичные титры.

64 Таблица 2. Антигенная характеристика вирусов гриппа В Ямагатской разновидности, выделенных на территории России в сезон 2019-2020 гг. № 1 2 Вирусы гриппа В CDC диагн. сыв-ка B yam FR1569 160 160 B/Ваш/ 01/10 (Egg) 160 80 B/Мас/ 02/12 (Egg) 160 640 Крысиные поликлональные антисыворотки B/СПб/ В/Пхукет/ В/Пхукет/ B/СПб/ 91/13 3073/13 3073/13 123/14 (MDCK) (MDCK) (Egg) (MDCK) 160 160 160 160 320 80 160 80 B/СПб/ RII-118/17 (MDCK) 160 160 B/Вашингтон/1/10 (Egg) B/Массачусетс/2/12 (Egg) B/Санкт-Петербург/91/13 3 80 20 80 40 40 160 320 (MDCK) 4 В/Пхукет/3073/13 (MDCK) 320 40 40 320 320 80 160 5 В/Пхукет/3073/13 (Egg) 320 40 80 80 40 80 320 B/Санкт-Петербург/123/14 6 640 80 40 160 80 160 160 (MDCK) B/Санкт-Петербург/RII7 1280 40 40 160 80 160 160 118/2017 (MDCK) В/Маврикий/1791/2017 8 1280 20 10 80 40 320 160 (MDCK) В/Маврикий/I-762/2018 9 1280 20 10 80 40 160 160 (MDCK) В/Санкт-Петербург/RII10 2560 10 10 80 40 160 80 346/2019 (MDCK) В/Санкт-Петербург/RII11 2560 20 10 80 80 160 160 181/2020 (MDCK) В/Санкт-Петербург/RII12 2560 20 40 40 20 320 80 183/2020 (MDCK) Примечание: НИИГ в названии штамма означает, что вирус был выделен в НИИ гриппа. Розовым цветом выделены эталонные Жирным шрифтом выделены гомологичные титры. 40 160 80 160 160 80 160 80 160 40 штаммы.

65 Приложение 2 Таблица 1. Антигенная характеристика вирусов гриппа В Викторианской линии, выделенных в России в сезон 2020-2021 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Вирусы гриппа В B/Малайзия/2 506/04 (Egg) B/Брисбен/60/0 8 (Egg) B/Брисбен/46/1 6 (Egg) B/Колорадо/06 /17 (MDCK) B/Колорадо/06 /17 (Egg) B/Гонконг/267 /17 (MDCK) B/Гонконг/267 /17 (Egg) B/Вашингтон/ 02/19 (Egg) В/Гур/НИИГ01/20 (MDCK) В/Гур/НИИГ01/20 (Egg) B/РодАйленд/01/19 (Egg) В/СПб/НИИГ352/19 (MDCK) Крысиные поликлональные сыворотки, полученные к вирусам гриппа В B/Мала йзия/ 2506/04 B/Бр исб/6 0/08 B/Кол/ 06/17 С B/Кол/ 06/17 E В/Гонк/ 267/17 E B/Ваш/ 02/19 E В/Гур/ НИИГ01/20 Е B/Род Айленд/ 01/19E В/СПб/352/19 С В/СПб/157/20 С В/Калин/08/2 0С 80 160 <10 20 80 10 40 10 20 20 <10 40 >1280 20 80/20 40 20 20 20 40 40 20 <10 1280 <10 20 10 10 10 40 20 20 <10 <10 160 80 80 20 40 40 10 80 80 40 10 160 80 160 40 160 40 20 40 80 40 <10 80 40 40 40 40 40 40 160 160 40 80 160 40 80 320 80 160 40 160 80 20 10 160 40 160 20 320 80 80 160 160 160 <10 10 10 10 10 40 20 40 80 40 40 80 40 10 40 160 40 160 40 160 80 40 <10 80 10 20 10 40 20 320 40 80 80 10 40 10 20 40 80 80 40 160 160 40

66 В/СПб/НИИГ<10 160 40 80 20 320 40 13 157/20 (MDCK) В/Калин/08/20 <10 80 40 80 40 320 40 14 (MDCK) В/Екат/НИИГ<10 160 10 20 <10 20 20 15 01/21 (MDCK) В/Екат/НИИГ<10 80 10 20 10 10 20 16 02/21 (MDCK) Примечание: НИИГ в названии штамма означает, что вирус был выделен в НИИ гриппа. Жирным шрифтом выделены гомологичные титры. 40 160 160 160 40 80 160 160 160 40 40 20 160 40 40 10 Розовым цветом выделены эталонные штаммы.

67 Приложение 3 Таблица 1. Антигенный анализ вирусов гриппа В Викторианской эволюционной линии, выделенных на территории России в эпидемический сезон 2019-2020 гг. с использованием моноклональных антител Моноклональные антитела (с указанными позициями аминокислотных замен) № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Вирусы гриппа В (Викторианская линия) B/Брисбен/46/15 Egg B/Кот-д'Ивуар/1662/2019 MDCK B/Гонконг/269/2017 MDCK B/Мэриленд/15/2016 MDCK B/Астрахань/01/2020 MDCK B/Астрахань/06/2020 MDCK B/Владивосток/13/2019 MDCK B/Гурзуф/НИИГ-19/2020 MDCK B/Калининград/34/2020 MDCK B/Красноярск/07/2020 MDCK B/Красноярск/09/2020 MDCK B/Новосибирск/07/2020 10D9 10F1 10B6 7C8 7G9 7H8 8A8 141G→R 241P→T 182T→K 200Q→R 74G→E 75K→E 122H→N 206G→R 121T→I >20000 80 >20000 640 320 >20000 20 5120 80 5120 640 640 <10 160 2560 320 320 5120 2560 1280 640 >20000 320 >20000 5120 5120 5120 320 20000 160 20000 1280 640 <10 20 2560 160 10000 5120 2560 <10 320 320 160 320 2560 1280 <10 640 640 160 5120 1280 640 40 80 2560 80 1280 1280 640 40 80 >20000 160 >20000 1280 320 <10 80 5120 320 >20000 10000 2560 320 320 5120 320 >20000 10000 5120 40 320

68 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 MDCK B/Новосибирск/10/2020 MDCK B/Омск/НИИГ-01/2020 MDCK B/Омск/05/2020 MDCK B/Самара/04/2020 MDCK B/Тула/03/2020 MDCK B/Тула/09/2020 MDCK B/Тула/11/2020 MDCK B/Тула/14/2020 MDCK B/Хабаровск/02/2020 MDCK B/Хабаровск/07/2020 MDCK B/Челябинск/01/2020 MDCK B/Челябинск/113/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-60/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-84/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-95/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-97/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-118/2020 MDCK 5120 160 10000 640 640 80 <10 1280 160 5120 5120 640 320 160 2560 80 5120 320 640 40 10 10000 320 10000 20000 2560 40 160 >20000 320 >20000 2560 2560 <10 80 640 160 2560 2560 1280 10 640 10000 40 >20000 160 320 <10 <10 640 160 160 5120 2560 <10 160 >=20000 40 >20000 320 320 20 10 640 160 320 5120 1280 <10 160 2560 80 5120 1280 640 <10 80 640 80 160 2560 640 20 160 640 320 320 10000 1280 320 320 320 320 2560 5120 2560 <10 640 5120 160 10000 2560 1280 40 160 >20000 320 >20000 10000 5120 20 640 1280 80 320 1280 320 160 80

69 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 B/СПб/НИИГ-130/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-135/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-136/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-137/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-138/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-140/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-144/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-151/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-156/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-157/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-159/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-160/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-162/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-170/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-172/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-173/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-175/2020 MDCK B/СПб/НИИГ-177/2020 1280 80 320 1280 320 160 160 1280 160 5120 2560 640 40 160 5120 80 5120 5120 1280 80 160 2560 160 10000 10000 1280 40 160 >20000 40 >20000 160 320 40 <10 2560 80 5120 2560 640 <10 160 2560 40 5120 640 320 40 40 5120 320 20000 10000 2560 160 320 2560 80 5120 1280 320 <10 80 >20000 160 20000 1280 2560 160 80 2560 40 160 1280 320 <10 40 10000 40 10000 160 160 10 <10 1280 80 640 1280 320 160 40 640 320 640 2560 2560 <10 160 640 160 5120 640 640 80 80 5120 80 5120 1280 640 <10 80 1280 320 5120 5120 1280 10 320 10000 320 10000 10000 2560 40 320

70 MDCK B/СПб/НИИГ-182/2020 48 5120 640 20000 20000 5120 1280 1280 MDCK B/СПб/НИИГ-191/2020 49 160 5120 2560 1280 160 1280 <10 MDCK B/СПб/НИИГ-192/2020 50 160 5120 1280 40 5120 2560 40 MDCK B/СПб/НИИГ-199/2020 51 160 10000 2560 1280 320 2560 20 MDCK B/СПб/НИИГ-200/2020 52 160 5120 5120 2560 320 2560 40 MDCK B/СПб/НИИГ-203/2020 53 320 10000 10000 5120 640 5120 40 MDCK B/СПб/НИИГ-289/2020 54 10000 160 10000 10000 10000 320 320 MDCK B/СПб/НИИГ-336/2019 55 80 5120 320 320 5120 <10 <10 MDCK B/СПб/НИИГ-352/2019 56 >20000 160 >20000 1280 640 40 40 MDCK Примечание: НИИГ в названии штамма означает, что вирус был выделен в НИИ гриппа. Розовым цветом выделен эталонный штамм. Жирным шрифтом выделены низкие титры реагирования МКА (больше 1/8 от гомологичного титра).

71 Таблица 2. Антигенный анализ вирусов гриппа В Викторианской эволюционной линии, выделенных на территории России в эпидемический сезон 2020-2021 гг. с использованием моноклональных антител Моноклональные антитела (с указанными позициями аминокислотных замен) № п/п Вирусы гриппа В (Викторианская линия) 10D9 10F1 10B6 7C8 7G9 7H8 8A8 141G→R 241P→T 182T→K 200Q→R 74G→E 75K→E 122H→N 206G→R 121T→I B/Брисбен/46/15 >20000 80 >20000 640 320 >20000 20 Egg В/Екатеринбург/НИИГ2 20000 160 2560 1280 160 2560 640 01/2021 (MDCK) В/Екатеринбург/НИИГ3 >20000 160 5120 1280 160 5120 640 02/2021 (MDCK) Примечание: НИИГ в названии штамма означает, что вирус был выделен в НИИ гриппа. Розовым цветом выделен эталонный штамм. Жирным шрифтом выделены низкие титры реагирования МКА (больше 1/8 от гомологичного титра). 1

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Любовь Липко

Рецензия проф. Кузьмина В. А. на ВКР: «Разнообразие вирусов гриппа В, циркулирующих на территории России в 2019-2021 гг.»

больше 3 лет назад

Рецензия от Любовь Липко

Отзыв научного руководителя на ВКР: "Разнообразие вирусов гриппа В, циркулирующих на территории России в 2019- 2021 гг."

больше 3 лет назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

54.44

Светлана Солопекина

Познавательно и актуально! Ставлю плюс . Молодец! Я с интересом прочла работу!