Регуляция функций гранулоцитов костного мозга никотиновыми холинорецепторами

Элина Жирова

Регуляция функций гранулоцитов костного мозга никотиновыми холинорецепторами

Никотиновые холинорецепторы (нХР) являются типичными рецепторами нейронов, но в конце XX – начале XXI веков эти рецепторы были найдены в иммунных клетках. Обнаружение физиологической связи между нервной и иммунной системами побудило ученых исследовать влияние нХР на защитные функции иммунных клеток. Большинство исследований было проведено на макрофагах и лимфоцитах,в то время как данные по влиянию нХР на функциональную активность нейтрофилов носят противоречивый характер, что, возможно, связано с присутствием в организме двух субпопуляций нейтрофилов: иммуностимулирующих и иммуносупрессивных. Однако молекулярных маркеров для такого разделения до сих пор не обнаружено. Возможно, изучение роли определенных типов нХР в регуляции функций нейтрофилов и передаче сигнала от нХР внутрь клетки поможет разобраться в противоречивом поведении нейтрофилов, стимулированных агонистами нХР. Целью работы явилось исследование влияния лигандов нХР на функции нейтрофилов костного мозга мыши в модели острого воспаления и оценка роли внутриклеточных сигнальных молекул, как предполагаемых компонентов передачи сигнала от данных рецепторов. В качестве анализируемых функций нейтрофилов мы выбрали адгезию и респираторный взрыв. Адгезия – это способность прикрепляться к различным поверхностям, в том числе к эндотелиальным клеткам кровеносных сосудов, что важно для дальнейшей миграции нейтрофилов в ткань, в очаг воспаления. Респираторный взрыв – это массированный выброс активных форм кислорода (АФК), который происходит в месте наибольшей концентрации патогенных агентов с целью их уничтожения. Модуляция данных функций нейтрофилов с помощью нХР может иметь важное значение в исходе различных иммунопатологий. В ходе нашей работы было выявлено, что никотин, агонист нХР, усиливает адгезию и понижает продукцию активных форм кислорода нейтрофилов костного мозга мыши, если сравнивать с показателями интактных клеток. Статистически значимые отличия между контрольной и опытной группой свидетельствовали о влиянии системного воспалительного процесса в организме мышей на опосредованную нХР активность нейтрофилов. С помощью антагонистов, специфичных к определенным типам нХР, мы исследовали участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мыши. Для исследования роли сигнальных молекул в действии никотина на защитные функции нейтрофилов использовали селективные ингибиторы. Кроме того, мы оценили экспрессию гена субъединицы α10 нХР на уровне белка с помощью первичных антител, специфичных к α10 субъединице нХР, и вторичных антител, меченных флуоресцентным красителем, сигнал от которого регистрировали методом проточной цитометрии. В результате исследований были сделаны следующие выводы: 1) показано участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в регуляции адгезии нейтрофилов костного мозга мышей, находящихся в нормальном физиологическом состоянии, и мышей с воспалением; 2) участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в продукции АФК нейтрофилами костного мозга мышей обеих групп выявлено не было; 3) показано присутствие α10 субъединиц нХР в нейтрофилах костного мозга мышей контрольной и опытной групп, а также в нейтрофилах брюшной полости мышей опытной группы; 4) выявлено участие гетеротримерныхG-белков, ПКС и ROCK в действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши; 5) обнаружено участие ПКС, РТК, PI3K и ROCK в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши. Полученные результаты могут помочь в объяснении двойного потенциала нейтрофилов, стимулированных агонистами нХР: возможно, определенная функция нейтрофилов регулируется конкретным набором типов нХР, и это приводит к иммуностимуляции или иммуносупрессии активности клеток. Например, в нашем исследовании на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши влияют α7, α3β2 и α9α10 нХР, однако в продукции АФК участия данных типов нХР выявлено не было. Возможно, в продукции АФК нейтрофилами участвуют другие типы нХР, изучением влияния которых предстоит заняться в дальнейшем. Как показали наши исследования, механизм действия никотина на функциональную активность нейтрофилов может опосредоваться такими сигнальными молекулами, как гетеротримерные G-белки, ПКС, РТК, PI3K и ROCK, причем развитие воспаления у мышей влияет на регуляторную роль данных молекул. Дальнейшее изучение закономерностей и механизмов участия определенных типов нХР в регуляции функций нейтрофилов может помочь в разработке новых подходов к лечению воспалительных заболеваний и развитию терапевтических стратегий против иммунопатологий, связанных с нарушениями активности нейтрофилов.

Биология

Диссертации

Вуз: Пущинский государственный естественно-научный институт (ПущГЕНИ)

ID: 60db46b4e4dde5000191e88c

UUID: e45c29e0-bb22-0139-3736-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: почти 3 года назад

Просмотры: 8

18.16

Элина Жирова

Комментировать 0

Рецензировать 2

Скачать - 2,4 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Пущинский государственный естественно-научный институт» Факультет биологии клетки На правах рукописи ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА «Регуляция функций гранулоцитов костного мозга никотиновыми холинорецепторами» Направление подготовки 06.04.01 Биология Профиль «Биология клетки» Выполнил(а) студент(ка) Научный руководитель доцент ПущГЕНИ, к.б.н. Жирова Э.А. Сафронова В.Г. «Работа допущена к защите»: Декан факультета чл.-корр. РАН, профессор Пущино, 2021 г. Е.Е. Фесенко

Содержание Список сокращений………………………………………………………………….4 Введение……………………………………………………………………………...6 Глава 1. Обзор литературы………………………………………………………….8 1.1. Структурно-функциональная организация никотиновых холинорецепторов (нХР)…………………………………………………………8 1.1.1. Структура нХР…………………………………...………………………8 1.1.2. Активация нХР…………………………………………………………12 1.1.3. Фармакологические свойства и специфические антагонисты нХР…14 1.2. Нейроиммунная коммуникация……………………………………………16 1.2.1. Модель «холинергического противовоспалительного пути»…….....16 1.2.2. Альтернативные модели нейроиммунной коммуникации…………..19 1.3. Нейтрофилы в нейроиммунной модуляции……………………………….20 1.3.1. Нейтрофилы как клетки иммунной системы…………………………20 1.3.2. Холинергическая система и типы нХР нейтрофилов………………..23 1.3.3. Роль нейтрофилов в нейроиммунном взаимодействии……………...24 Глава 2. Материалы и методы……………………………………………………..29 2.1. Реактивы……………………………………………………………………..29 2.2. Оборудование……………………………………………………………….30 2.3. Биологический объект………………………………………………………31 2.4. Воспалительная модель…………………………………………………….31 2.5. Выделение гранулоцитов из брюшной полости…………………………..31 2.6. Выделение гранулоцитов из костного мозга мыши………………………32 2.7. Флуоресцентный анализ клеточной популяции…………………………..33 2.8. Фотометрический анализ адгезии нейтрофилов………………………….34 2.9. Хемилюминесцентный анализ …………………………………..………...35 2.10. Цитометрический анализ экспрессии α10 субъединиц нХР……………36 2.11. Статистическая обработка результатов…………………………………..38 Глава 3. Результаты………………………………………………………………...39 3.1. Воспалительная модель…………………………………………………….39 2

3.2. Влияние лигандов нХР на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов……………………………………………………………………...40 3.3. Участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на адгезию нейтрофилов……………………………………………………………………...42 3.4. Участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами……………………………………………………………………45 3.5. Влияние ингибиторов сигнальных молекул на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов………………………………………………………………48 3.6. Роль сигнальных молекул в действии никотина на адгезию нейтрофилов……………………………………………………………………...50 3.7. Роль сигнальных молекул в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами…………………………………………..………………………..54 3.8. Экспрессия α10 субъединицы нХР в нейтрофилах……………………….56 Глава 4. Обсуждения……………………………………………………………….60 4.1. Участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в адгезии и продукции АФК нейтрофилов……………………………………………………………………...60 4.2. Участие сигнальных молекул в адгезии и продукции АФК нейтрофилов……………………………………………………………………...61 4.3. Участие сигнальных молекул в действии никотина на адгезию и продукцию АФК нейтрофилов………………………………………………….64 Заключение………………………………………………………………………….66 Список литературы…………………………………………………………………68 3

Список сокращений нХР – никотиновые холинорецепторы АХ – ацетилхолин α-СТХ – α-кобратоксин РТХ – pertussis toxin, коклюшный токсин ПКС, PKC – протеинкиназа С, protein kinase C РТК – phosphotyrosine kinases, фосфотирозиновые киназы PI3K – phosphatidylinositol-3 kinase, фосфотидилинозитол-3-киназа ROCK – Rho-associated protein kinase, Rho-ассоциированная протеинкиназа Цис-петлевые, или Cys-loop рецепторы – рецепторы с цистеиновой (cysteine) петлей JAK 2 – Janus kinase 2, янус-киназа 2 NF- κB – Nuclear factor κB, ядерный транскрипционный фактор κB а.о. – аминокислотные остатки мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЯСТ – ядро солитарного тракта ДМЯ – дорсальное моторное ядро НЭ – норэпинефрин ФНО-α – фактор некроза опухоли α β2-АР – β2-адренорецептор ICAM – intercellular adhesion molecules, молекулы межклеточной адгезии ИЛ-8 – интерлейкин 8 НАДФ∙Н2 – никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленный) О2¯ – супероксид-анион АФК – активные формы кислорода ХАТ – холинацетилтрансфераза АХЭ – ацетилхолин-эстераза мХР – мускариновые холинорецепторы ЦНС – центральная нервная система 4

ГЭБ – гематоэнцефалический барьер РЕ – phycoerythrin, фикоэритрин усл ед. – условные единицы отн. ед. – относительные единицы IgG – immunoglobulin G, иммуноглобулин G AF488 – Alexa Fluor 488 ФБР, PBS – фосфатно-буферный солевой раствор, phosphate buffered saline ФМЛФ – N-формилметионил-лейцил-фенилаланин WKYMVM – триптофан-лизин-тирозин-метионин-валин-метионин ЭГТА – этилен-гликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N’,N’-тетрауксусная кислота БСА – бычий сывороточный альбумин FPR 2 – formyl peptide receptor 2, формилпептидными рецепторами 2 типа 5

Введение Никотиновые холинорецепторы (нХР) являются типичными рецепторами нейронов и принимают непосредственное участие в передаче нервного импульса, однако в конце XX – начале XXI веков эти рецепторы начали открывать и в других типах клеток, таких как эпителиальные, эндотелиальные и иммунные клетки (Hoover D.B., 2017). Обнаружение физиологической связи между нейронами сформулировать и клетками концепцию иммунной системы «холинергического побудило ученых противовоспалительного пути», которая подробно описана для макрофагов и лимфоцитов, в то время как для других типов иммунных клеток исследований проведено недостаточно, а данная концепция носит гипотетический характер (Fujii T. et al., 2017). Считается, что активированные воспалительным стимулом иммунные клетки способны продуцировать нейротрансмиттеры и цитокины, воздействующие на клетки нервной системы, а те, по принципу отрицательной обратной связи, высвобождают ацетилхолин (АХ), связывающийся с нХР иммунных клеток, что приводит к модуляции их реакций (ReardonC. et al., 2018). Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) первыми среди всех клеток иммунной системы прибывают к месту воспаления по градиенту хемотаксического фактора (Liew P.X., Kubes P., 2019). Несмотря на решающее значение нейтрофилов в начальный период воспаления, вопрос об участии нХР в регуляции активности остается нерешенным и требует дополнительных исследований. Известно, что в нейтрофилах человека и мыши происходит экспрессия генов таких субъединиц нХР, как α2−α7, α9, α10 и β2−β4 на уровне мРНК, а также на уровне мембранных белков обнаружены α7, α3β2 и α3β4 (Safronova V.G. et al., 2021; Kanashiro A. et al., 2020; Reardon C. et al., 2018; Safronova V.G. et al., 2016), однако данных по исследованию функциональной роли нХР различного субъединичного состава получено недостаточно. Данные по влиянию нХР на функциональную активность нейтрофилов носят противоречивый характер, что, возможно, связано с присутствием двух 6

субпопуляций клеток: иммуностимулирующих и иммуносупрессивных, различающихся по фенотипу. Кроме того, при исследовании роли нХР в функционировании иммунных клеток может проявляться двойная природа нХР: кроме ионотропных, существуют и метаботропные рецепторы (Fujii T. et al., 2017). Возможно, изучение роли определенных типов нХР в регуляции функций нейтрофилов и передаче сигнала от нХР внутрь клетки поможет разобраться в противоречивом поведении нейтрофилов, стимулированных агонистами нХР. Цель: исследовать влияние лигандов нХР на функции нейтрофилов костного мозга мыши в модели острого воспаления и оценить роль внутриклеточных сигнальных молекул, как предполагаемых компонентов передачи сигнала от данных рецепторов. Задачи: – оценить изменения количества зрелых гранулоцитов в модели острого воспаления; – определить роль α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мыши; – выявить роль гетеротримерных G-белков, протеинкиназы С (ПКC), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), RhoA-активируемой киназы (ROCK) и тирозиновых протеинкиназ (PTK) в действии никотина на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мыши; – исследовать экспрессию α10 субъединицы нХР в нейтрофилах костного мозга мыши. 7

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Структурно-функциональная организация никотиновых холинорецепторов (нХР) 1.1.1. Структура нХР Никотиновые холинорецепторы (нХР) относятся к семейству рецепторов с цистеиновой петлей (Цис-петлевые, или Cys-loop рецепторы), которые представляют собой встроенные в мембрану лиганд-управляемые ионные каналы (Arias H.R., Bhumireddy P., 2005). Цис-петлевые рецепторы состоят из пяти псевдосимметричных субъединиц, окружающих ион-проводящую пору в мембране (рис. 1) (Gotti C. et al., 2007). Своё название данное семейство получило благодаря наличию во внеклеточном домене петлевой структуры, состоящей из 13 аминокислот и имеющей дисульфидную связь между двумя остатками цистеина (Millar N.S., Harkness P.C., 2008). нХР были первыми открыты среди семейства Cys-loop рецепторов, когда в 1980-х годах их сумели выделить из органов электрического ската рода Torpedo (в основном, изучали T. Marmorata и T. Californica) благодаря высокому содержанию нХР в объекте исследования и способности некоторых нейротоксинов змей (например, α-бунгаротоксина) прочно связываться с этим рецептором (Changeux J.P., Taly A., 2008). В 1983 г. Была впервые определена стехиометрия: нХР формируется 4-мя различными типами субъединиц (α, β, γ и δ), образующими пентамерный рецептор со стехиометрией 2 субъединицы α, по одной – β, γ, δ (Thompson A.J. et al., 2010; Karlin. A. et al., 1983). При дальнейшем изучении рецепторов с цистеиновой петлёй было выяснено, что существуют различные варианты каждого типа субъединиц. Например, нХР человека имеют субъединицы α1-10, β1-4, γ, δ, ε, причем субъединица γ заменяется на субъединицу ε в постэмбриональный период развития человека (Fujii T. et al., 2017). 8

А Б В Г нХР АХ Мышечный тип Рис. 1. Структура никотинового холинорецептора с указанием сайтов связывания агониста. А – пентамерная структура экстраклеточного домена никотинового холинорецептора (нХР) электрического органа ската рода Torpedo (вид сверху); Б – кристаллическая структура ацетилхолин-связывающего белка (гомолог сайта связывания агониста в нХР) в комплексе с никотином, синим пунктиром обозначен карман связывания никотина (вид сбоку); В – образуемый субъединицами нХР ионный канал, β-субъединица удалена (вид сбоку); Г – схема расположения сайтов связывания агонистов нХР различного субъединичного состава (вид сверху). Обозначения: АХ – ацетилхолин. По (Chang Y. et al., 2010). Каждый рецептор имеет внеклеточный домен, содержащий лигандсвязывающие сайты, трансмембранный домен, позволяющий ионам проходить через мембрану, и внутриклеточный домен, который играет роль в проводимости канала и модуляции рецептора (Millar N.S., Gotti C., 2009). С помощью криоэлектронной микроскопии с разрешением 4 ангстрема (0,4 нм) было выявлено, что сайт связывания ацетилхолина (АХ) находится на стыке двух субъединиц, одна из которых является главной, а вторая – дополнительной, или комплементарной (Unwin N., 2005; Brejc K. et al., 2001). Только один или небольшое число аминокислотных остатков петли главной субъединицы принимают участие в образовании кармана для связывания лиганда. Аминокислотные остатки остальной части петли, как предполагают, важны для поддержания каркаса кармана и/или участвуют в конформационных 9

изменениях рецептора, приводящих к открытию ионного канала (Bouzat C. et al., 2004). С внеклеточным доменом Cys-loop рецепторов связываются так называемые вещества-агонисты и –антагонисты. Агонисты – это химические вещества, при связывании с которыми рецептор активируется. Антагонисты – это химические вещества, при связывании с которыми активность рецептора подавляется или полностью блокируется (Кашеверов И.Е. и др., 1999). Взаимодействие разных лигандов с рецептором в сайте связывания приводит к его конформационным изменениям. Известно, что при связывании агониста образуется множество контактов и более закрытая структура, чем при связывании антагониста. Считается, что открытое состояние ионного канала более вероятно при связывании двух молекул агониста, хотя некоторые мутантные рецепторы могут активироваться и при связывании одной молекулы сильного агониста (Bhattacharya A. et al., 2004). Также было выяснено, что чем больше по размеру молекула лиганда, тем прочнее его связь с рецептором. Например, α-бунгаротоксин, антагонист нХР, молекула которого довольно крупная, взаимодействует с гораздо большим репертуаром аминокислотных остатков, чем небольшой антагонист метилликаконитин. Удивительным фактом является то, что один и тот же агонист может взаимодействовать с различным набором аминокислотных остатков сайта связывания лиганда (Thompson A.J. et al., 2010). Трансмембранная часть каждой из пяти субъединиц нХР состоит из четырех α-спиралей (М1 – М4), то есть весь рецептор имеет 20 α-спиралей в мембранной зоне (рис. 2). Ионная пора образуется вторыми α-спиралями – М2 – каждой из пяти субъединиц. Для защиты ионного канала от липидной среды α-спирали М1, М3 и М4 образуют наружное кольцо вокруг М2-спиралей (De Planque M.R. et al., 2004). В результате экспериментов по мутагенезу было выяснено, что именно М1-спираль участвует в передаче сигнала от лиганда к М2-спирали ионного канала посредством конформационных изменений (Unwin N. et al., 2002). Петля М1-М2 принимает участие в селективном 10

пропуске катионов за счет наличия окисленных и восстановленных тиоловых групп аминокислотных остатков (Panicker S. et al., 2002). Петля М2-М3 является частью механизма, передающего энергетические и конформационные изменения от внеклеточного домена к трансмембранному, наряду с петлёй М1М2 (Campos-Caro A. et al., 1996). А Сайт связывания лиганда Б Cys-петля Снаружи Мембрана Внутри Петля М1-М2 Петля М3-М4 Рис. 2. Строение трансмембранного домена нХР: А – расположение α-спиралей М1−М4 пяти субъединиц нХР вокруг ион-проводящей поры; Б – строение субъединицы нХР, встроенной в мембрану. По (Lebbe E.K.M. et al., 2014). М2-спирали образуют пору, сужающуюся по направлению к внутренней поверхности мембраны (Thompson A.J. et al., 2010; Charnet P. et al., 1990). Считается, что центр поры создаётся консервативными последовательностями гидрофобных аминокислотных остатков, которые образуют ворота ионного канала, являющиеся препятствием для катионов, открытие ворот возможно при преодолении определённого энергетического барьера (Tikhonov D.B. et al., 2004). Строение внутриклеточного, или цитоплазматического домена Cys-loop рецепторов изучено меньше всего. Известно, что в его состав входят петли М3М4 каждой из 5-ти субъединиц. Взаимодействие внутриклеточных ионов и белков с цитоплазматическим доменом может модулировать сборку, селективность и активность рецептора. Это может быть как частный механизм для конкретного типа рецептора, так и общий – например, фосфорилирование 11

петли М3-М4 нХР, которое осуществляется такими киназами, как казеинкиназа II, тирозинкиназа, протеинкиназа А и протеинкиназа С (Thompson A.J. et al., 2010). 1.1.2. Активация нХР Наиболее изученной является структурно-функциональная организация нейрональных нХР, поскольку в нейронах эти рецепторы были открыты первыми, и их содержание в нервных клетках намного выше, чем в других типах клеток (Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., 2009). Нейрональные нХР принимают участие в передаче нервного импульса (рис. 3). Этот процесс происходит в химическом синапсе, который образуется примыкающими друг к другу мембранами соседних нейронов или между нейроном и эффекторной клеткой, между мембранами находится синаптическая щель. Продуцируемый пресинаптическим нейроном АХ взаимодействует с нХР принимающего сигнал нейрона или эффекторной клетки (Покровский В.М., Коротько Г.Ф., 2007). Рис. 3. Схема передачи сигнала в химическом синапсе (Tortora G.J. et al., 2008). 12

Непосредственно активация нХР запускается связыванием двух молекул агониста (АХ) с двумя комплементарными центрами на субъединицах рецептора во внеклеточном домене, в результате чего происходит изменение конформации этого домена. Это, в свою очередь, приводит в движение петли М2-М3, которые передают конформационное возмущение соответствующим М2-спиралям, в результате чего ионный канал открывается. Петли М2-М3 дестабилизируют гидрофобный пояс канала, открывая доступ селективным ионам к внутреннему кольцу полярных групп аминокислотных остатков канала. Вход Na+ и Са2+ обеспечивает деполяризацию мембраны нейрона (Lee W.Y. et al., 2009; Unwin N. et al., 2002). Мутации в аминокислотных остатках воротного механизма влияют на ионную проводимость, повышая вероятность открытия канала и его медленную десенсибилизацию (Filatov G.N., White M.M., 1995). Помимо ионотропных нХР, в нейронах и других типах клеток могут встречаться метаботропные нХР, однако о них известно мало (Fujii T. et al., 2017). Например, двойная природа описана для α7 нХР иммунных клеток. Связывание АХ или никотина с ионотропными α7 нХР вызывает кратковременный вход Са2+ в клетку, причем десенсибилизация рецепторного канала в иммунных клетках происходит быстрее, чем в нейронах. Са2+ активирует протеинкиназу С (ПКC), которая индуцирует PI3K/Аkt путь (фосфатидилинозитол-3-киназа, phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K; белки семейства Akt). Это способствует транслокации в ядро ядерного фактора, связанного с эритроидом 2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2), что индуцирует экспрессию гемоксигеназы 1. Это приводит к сильным противовоспалительным эффектам (Corradi J., Bouzat C., 2016). При активации метаботропных α7 нХР происходит взаимодействие их внутриклеточного домена в сайтах петли М3-М4 с G-белками, находящимися в несвязанном виде в цитоплазме. Данное внутриклеточного взаимодействие пула с вызывает последующими выброс Са2+ из краткосрочными противовоспалительными эффектами, либо активация киназы JAK 2 (янускиназа 2, Janus kinase 2), которая 13 взаимодействует с ядерным

транскрипционным фактором κB (Nuclear factor κB, NF-κB), что приводит к появлению долгосрочных эффектов (Razani-Boroujerdi S. et al., 2007). Но двойная природа нХР до сих пор является спорным и обсуждаемым вопросом и однозначно требует дополнительных исследований (Fujii T. et al., 2017). 1.1.3. Фармакологические свойства и специфические антагонисты нХР Помимо нейронов центральной и периферической нервной системы нХР были найдены на мембране мышечных клеток, эпителиоцитов кожи, клеток легочной ткани, а также клеток иммунной системы (Hoover D.B., 2017). В процессе изучения нХР стало очевидно, что благодаря различным комбинациям субъединиц формируются рецепторы, различающиеся по фармакологическим свойствам. Этим можно объяснить, почему в клетках разных тканей экспрессируются определённые по субъединичному составу типы рецепторов, специфическим образом влияющие на выполнение клетками и тканями своих функций (Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., 2009). В целом, нХР делятся на 3 основные подгруппы: 1) нХР с высоким сродством к никотину, включающие α4 субъединицу; 2) рецепторы с сайтом связывания α-бунгаротоксина, состоящие из α7 субъединиц; 3) нХР вегетативной нервной системы, состоящие из субъединиц α3/β4 (Hogg R.C. et al., 2003). При этом нХР, состоящие из пяти α7 субъединиц, обладают уникальной проницаемостью для ионов Са2+ и Na+ в соотношении 10:1. Таким образом, активация α7 нХР приводит в действие Са2+-зависимые механизмы регуляции метаболизма клеток. Предполагается, что в клетках нервной системы этот механизм необходим для предотвращения драматического эффекта постоянной активации/десенситизации нХР других типов, например при нейродегенеративных патологиях и воспалении (Gahring L.C., Rogers S.W., 2006). Однако, в отличие от α7 нХР, большинство других типов данных рецепторов состоит из комбинации субъединиц α и β. Среди них выделяют 14

рецепторы, состоящие, как минимум, из субъединиц α4 и β2 и обладающие высоким сродством к никотину, который при его хроническом потреблении вызывает у курильщиков увеличение числа сайтов связывания данного лиганда. Механизм, лежащий в основе этого явления, не раскрыт, но выяснено, что данный эффект наблюдается лишь у некоторых типов нХР и приводит к развитию зависимости организма от никотина (Henderson B.J., Lester H.A., 2015; Lindstrom J., 1996). Для изучения структурно-функциональных свойств нХР исследователи используют α-нейротоксины из ядов змей и α-конотоксины из яда морских улиток семейства Conus. Обе группы токсинов являются конкурентными антагонистами определенных типов нХР, то есть взаимодействуют с сайтом связывания агониста, в результате чего предотвращают активацию рецептора (Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., 2009). Часто используемым для изучения нХР змеиным α-нейротоксином является α-кобратоксин – белок, состоящий из 71 аминокислотного остатка имеющий 5 дисульфидных связей. Этот токсин выделяют из яда Кобры моноклевой (Naja kaouthia). Он селективно взаимодействует с α7 нХР (Кашеверов И.Е. и др., 1999). Поскольку не для всех типов нХР существуют селективные αнейротоксины из яда змей и некоторые из них обладают специфичностью к нескольким типам нХР, выделенные в 1980-х годах из яда моллюсков Conus высокоселективные к разным типам нХР α-конотоксины сегодня являются важным объектом исследования (Norton R.S., Olivera B.M., 2006). Практически все α-конотоксины имеют схожую структуру: состоят из 12-20 аминокислотных остатков, (а.о.) и имеют 2 дисульфидных связи с характерным расположением цистеинов вдоль аминокислотной цепи (С1С2—С3—С4) и их замыканием по схеме С1—С3 и С2—С4 (Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., 2009). Выделенный из яда улитки Conus magus в 1996 г. Α-конотоксин MII – это пептид, состоящий из 16 а.о., С-конец которого амидирован в результате посттрансляционной модификации. 15 Он является сильным и

высокоспецифичным блокатором α3β2 нХР и менее специфичным – α7 нХР и α6-содержащих нХР (McIntosh J.M. et al., 2002). Примером α-конотоксина, синтез которого происходит с помощью молекулярно-биологических методов с амидированием С-конца, является GIC, пептид, состоящий из 16 а.о. Кодирующая GIC мРНК была выделена из яда улитки Conus geographus, а пептид синтезирован в 2002 г. GIC эффективно блокирует α3β2 нХР со сродством не менее, чем на 2 порядка превышающим данный показатель в отношении антагонистов других типов нХР (Chi S-W. et al., 2004). RgIA – это пептид, состоящий из 32 а.о. Синтезирован в 2006 г. На основе мРНК из яда улитки Conus regius. Является маркерным высокоактивным антагонистом α9 и α10 субъединиц нХР (Ellison M. et al., 2006). Vc1.1 – это пептидная цепочка из 16 а.о. с амидированным С-концом. Синтезирован в 2003 г. На основе мРНК из яда улитки Conus vicrotiae. Связывается со многими типами нХР, например α3β4 и α3(α5)β2, но основной мишенью является α9 гомомер или гетеромер α9α10 (Vincler M. et al., 2006). 1.2. Нейроиммунная коммуникация 1.2.1. Модель «холинергического противовоспалительного пути» Ацетилхолин (АХ) является одним из первых идентифицированных нейротрансмиттеров центральной и периферической нервной системы. Впервые он был синтезирован в 1867 г. Фон Байером, который провел ацилирование холина с использованием ацетилхлорида. В течение последующих нескольких десятилетий АХ оставался в списке химических веществ без исследования его биологической активности (Burgen A.S., 1995). В 1929 г. Дейл и Дадли успешно выделили АХ из селезенки быка и лошади, то есть впервые изолировали АХ из животного органа. На основании предыдущих и собственных исследований, а также в связи со сходством между эффектами симпатических нервов и адреналина 16 Дейл предложил термины

«холинергический» для описания нервов, которые передают свое действие через высвобождение АХ, и «адренергический» для нервов, использующих вещество, по структуре напоминающее адреналин (Fujii T. et al., 2017). Общепринято, что селезенка иннервируется симпатической нервной системой, а не парасимпатической (Kawashima K., Fujii T., 2003). Присутствие АХ в селезенке оставалось загадочным явлением, пока АХ не обнаружили во фракции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, в основном, в лимфоцитах и небольшом количестве моноцитов (Kawashima K. et al., 1993). Позднее присутствие АХ было подтверждено в различных линиях лейкозных клеток человека (Fujii T. et al., 1996) и в лимфоцитах крысы, включая Т- и В-клетки (Rinner I. et al., 1998). Поскольку селезенка является вторичным органом иммунной системы, в белой пульпе которого происходит созревание лимфоцитов, данные результаты позволили объяснить открытие Дейла и Дадли, заключающееся в обнаружении АХ в данном органе (Fujii T. et al., 2017). В дальнейшем происхождения и нейротрансмиттеры было выявлено, продуцируемые способны что продукты иммунными активировать бактериального клетками цитокины афферентные и нейроны периферической нервной системы, причем наибольшее количество результатов касалось стимуляции блуждающего нерва (лат. Nervus vagus). В то же время активация эфферентных нейронов блуждающего нерва угнетала функциональную активность иммунных клеток (Abe C. et al., 2017). Также было обнаружено, что ваготомия (хирургическое рассечение блуждающего нерва) приводила к потере противовоспалительного эффекта со стороны нервной системы при развитии эндотоксемии и сепсиса (Borovikova L.V. et al., 2000). На основании данных результатов была сформулирована концепция «холинергического противовоспалительного пути», которая основывается на коммуникации между нервной и иммунной системами. Согласно данной концепции центральным звеном коммуникации является селезенка (Reardon C. et al., 2018). Поскольку в селезенке присутствует только симпатическая 17

иннервация, а блуждающий нерв относится к парасимпатической нервной системе, были разработаны концепции для преодоления данного противоречия (Hoover D.B., 2017). ЯСТ ДМЯ Спинной мозг Селезенка Ганглий сипатической нервной системы Очаг воспаления: НЭ Цитокины Патогенные агенты β2-АР ФНО-α АХ α7 нХР Макрофаг Рис. 4. Модель «холинергического противовоспалительного пути» (Pavlov V.A., Tracey K.J., 2005). Обозначения: ЯСТ – ядро солитарного тракта, ДМЯ – дорсальное моторное ядро, НЭ – норэпинефрин, АХ – ацетилхолин, ФНО-α – фактор некроза опухоли α, β2-АР – β2адренорецептор, α7 нХР – α7 никотиновый холинорецептор. Идея основной блуждающего нерва концепции к заключается иммунным клеткам в передаче посредством сигнала от элементов симпатической нервной системы (рис. 4). Патогенные агенты или цитокины активируют афферентные нейроны блуждающего нерва в очаге воспаления. Сигнал передается в ядро солитарного тракта в головном мозге, что затем стимулирует блуждающий нерв, который оканчивается своими эфферентными нейронами в чревном сплетении. Там происходит передача сигнала на постганглионарный симпатический селезеночный нерв, где продуцируется 18

норадренилин, связывающийся с β2-адренорецепторами Т-лимфоцитов. Это стимулирует продукцию и высвобождение АХ из Т-клеток с последующей активацией α7 нХР макрофагов, что приводит к ингибированию синтеза провоспалительных цитокинов, в том числе ФНО-α (Reardon C. et al., 2018). 1.2.2. Альтернативные модели нейроиммунной коммуникации Кроме модели «холинергического противовоспалительного пути», существуют и другие модели нейроиммунной коммуникации. Например, желудочно-кишечный тракт содержит большое количество иммунных клеток в непосредственной близости от нервных окончаний энтеральной нервной системы. Иммунная система в слизистой оболочке толстого кишечника обладает толерантностью к нормальной микрофлоре организма, то есть не вызывает локального нормофлоры, но при и системного этом воспалительного защищает организм ответа от антигены болезнетворных биологических агентов (Giovangiulio D.M. et al., 2016). Кроме того, развитие иммунной толерантности важно при приеме пищи. Исследования показали, что ваготомия нарушает развитие толерантного состояния у регуляторных Т-клеток и резидентных макрофагов кишечника на безвредные антигены (например, овальбумин) при их пероральном введении, что свидетельствует о регуляторной роли блуждающего нерва в поддержании здоровья и гомеостаза организма (Pabst O., Mowat A.M., 2012). В экспериментальной мышиной модели ишемической болезни почек с развитием реперфузионного синдрома, при котором наблюдается инфильтрация иммунных клеток из кровотока в почку, предотвратить повреждение здоровых тканей вследствие излишней цитотоксичности иммунных клеток и физиологическую дисфункцию почек помогала активация блуждающего и симпатических почечных нервов. Причем было замечено, что стимуляция блуждающего нерва является необязательной (Inoue T. et al., 2016). 19

Большинство исследований взаимодействия между нервной и иммунной системами проводится на моноцитах/макрофагах и T- и B-лимфоцитах, в то время как роль других иммунных клеток в нейроиммунной коммуникации остается непонятной. Несмотря на короткую продолжительность жизни, нейтрофилы вносят огромный вклад в развитие воспалительного процесса, особенно на первых стадиях заболевания, пока специфический иммунитет к конкретным антигенам еще не сформировался. Изучение участия нХР в регуляции функциональной активности нейтрофилов может быть перспективным направлением для понимания механизмов модуляции как системного, так и локального иммунного ответа при воспалении (Kanashiro A. et al., 2020). 1.3. Нейтрофилы в нейроиммунной модуляции 1.3.1. Нейтрофилы как клетки иммунной системы Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты, или нейтрофилы – это короткоживущие клетки диаметром 9–12 мкм, характеризующиеся наличием сегментированного ядра (3–5 сегментов) и нейтральных гранул с эффекторными молекулами (Черешнев В.А., Шмагель К.В., 2014). Нейтрофилы, как и остальные клетки иммунной системы, образуются из стволовых клеток в костном мозге. Среди клеток костного мозга человека нейтрофилы составляют 52.7–68.9%, в то время как доли эозинофильных и базофильных гранулоцитов составляют 0.5–5.8% и 0–0.5%, соответственно, что в сумме не превышает 7% в норме. Таким образом большую часть пунктата костного мозга человека составляет фракция гранулоцитов, причем около 90% приходится на нейтрофильные гранулоциты (Пендель А.А., 2014). Прежде чем миелобласты дифференцируются в зрелые сегментноядерные нейтрофилы, проходит около 2 недель, после чего нейтрофилы мигрируют в кровь. Находясь в кровотоке, нейтрофилы могут подвергаться действию хемоаттрактантов и под их влиянием 20 направленно мигрировать по

кровеносному руслу к очагу воспаления (хемотаксис), а затем проникать через стенки капилляров Хемоаттрактантами в ткань могут к быть месту как инфекции патогенные или повреждения. агенты чужеродных организмов, например пептид бактериальной клеточной стенки N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (ФМЛФ) или митохондрий разрушенных клеток организма, так и вещества, продуцируемые клетками организма, например интерлейкин-8 (ИЛ-8), продукт резидентных тканевых макрофагов (Nauseef W.M., Borregaard N., 2014). Взаимодействие нейтрофилов с хемотаксическими веществами способствует последовательной активации защитных функций данных клеток. Антигены и цитокинов в низких концентрациях (около 10-9 М) стимулируют сборку полимерного F-актина из мономерного G-актина. Это способствует образованию ламелл, мембранные адгезивные молекулы (L-селектины) которых взаимодействуют с рецепторами эндотелиальных клеток. Эти процессы обеспечивают перекатывание нейтрофилов по стенке сосуда (роллинг) в место наибольшей концентрации хемоаттрактанта в крови (10 -8–10-7 М), где происходит прикрепление (адгезия) нейтрофилов к эндотелиальным клеткам с помощью мембранных β2-интегринов. Рецепторами на мембране эндотелиоцитов для адгезии служат молекулы межклеточной адгезии (intercellular adhesion molecules, ICAM). Затем нейтрофилы перемещаются через стенку кровеносного сосуда в ткань (диаперез) и мигрируют к очагу воспаления (Черешнев В.А., Шмагель К.В., 2014). В месте инфекции и/или повреждения тканей организма концентрация биологически активных агентов, стимулирующих защитные функции нейтрофилов, достигает 10-7–10-6 М. Данные условия способствуют секреторной дегрануляции первичных, или азурофильных гранул, а также вторичных, или специфических гранул, в результате чего в межклеточное пространство попадают гидро- и протеолитические ферменты, нарушающие структурную целостность чужеродных организмов. Кроме того, активируются такие 21

функции воспаления, как фагоцитоз, респираторный взрыв и апоптоз нейтрофилов (Kanashiro A. et al., 2020). Нейтрофилы, как клетки врожденного иммунитета, не имеют специфических рецепторов для распознавания чужеродных веществ, поэтому они опознают объект как чужеродный, только если тот находится в комплексе с соответствующим опсонином. Опсонины – это собственными универсальными гуморальными продуктами организма, выступающими в роли посредников между мембранными рецепторами фагоцитов и поверхностными структурами чужеродного объекта. После того, как опсонины связались с чужеродными микроорганизмами или продуктами их жизнедеятельности, нейтрофилы фагоцитируют данные болезнетворные агенты (Новиков В.В. и др., 2004). За развитие респираторного (дыхательного) взрыва отвечает мембранный фермент НАДФН-оксидаза, который катализирует перенос электронов от внутриклеточного НАДФН2 на молекулу кислорода с образованием супероксид-анион а (О2¯ ), предшественника других активных форм кислорода (АФК). Активированный фермент вызывает уменьшение концентрации НАДФ∙Н2 в клетке, в результате чего индуцируется окисление глюкозы через гексозомонофосфатный шунт как основной поставщик НАДФ∙Н2 в нейтрофилах (Nessel C.C. et al., 1999). Кроме того, респираторный взрыв может провоцировать высвобождение ферментов (эластаза, миелопероксидаза) из азурофильных гранул, что способствует деконденсации хроматина с последующим лизисом нейтрофилов и выходом ДНК в межклеточное пространство с образованием ДНК-сетей (Kanashiro A. et al., 2020). При физиологической норме после выполнения своих защитных функций нейтрофилы погибают либо путем индукции апоптоза (запрограммированная клеточная гибель), либо в результате фагоцитирования макрофагами. Оба варианта представляют собой безопасное удаление нейтрофилов, при котором не повреждаются здоровые ткани организма. Но различные патологии могут приводить к излишней цитотоксичности нейтрофилов, когда, например, адгезия нейтрофилов сопровождается секреторной дегрануляцией протеолитических 22

ферментов, в результате которой повреждаются кровеносные сосуды. Или, напротив, иммунодефицитные состояния могут сопровождаться недостаточным провоспалительным потенциалом нейтрофилов, что приводит к развитию оппортунистических инфекций (Nauseef W.M., Borregaard N., 2014). Изучение роли разных типов нХР в регуляции функциональной активности нейтрофилов и понимание внутриклеточных механизмов передачи сигнала от нХР к молекулам, связывающим активацию нХР с модуляцией определенной функции нейтрофилов, может способствовать разработке новых подходов к лечению воспалительных заболеваний. Адгезия, как одна из первых функций нейтрофилов, которая активируется при развитии воспаления, и респираторный взрыв, как функция терминальной стадии воспалительного процесса, представляют собой перспективные направления исследования модуляции работы нейтрофилов (Kanashiro A. et al., 2020). 1.3.2. Холинергическая система и типы нХР нейтрофилов Впервые сайты связывания никотина в нейтрофилах периферической крови человека были обнаружены Lebargy F. с соавторами в 1996. В 2000 г. Benhammou K. с соавторами показали присутствие α7 и α3β4 нХР в нейтрофилах периферической крови человека. Недавно была проанализирована экспрессия генов субъединиц нХР на уровне мРНК и обнаружено присутствие α2–9 и β2–4 в вызванных нейтрофилах перитонеальной полости мыши (Safronova V.G. et al., 2016). Наличие других типов нХР и мРНК их субъединиц, а также присутствие их в нейтрофилах из разных источников (кровь, очаг воспаления, костный мозг) и при различных патологиях организма нуждаются в дополнительных исследованиях (Reardon C. et al., 2018). Известно, что нейтрофилы, как и другие иммунные клетки, обладают всеми необходимыми компонентами холинергической системы, подобно нейронам. В моноцитах/макрофагах, Т- и В-лимфоцитах, дендритных клетках и нейтрофилах обнаружены холинацетилтрансфераза 23 (ХАТ, КФ 2.3.2.6),

ацетилхолин-эстераза (АХЭ, КФ 3.1.1.7), а также мускариновые (мХР) и никотиновые холинорецепторы. ХАТ катализирует реакцию синтеза АХ из холина и кофермента А, в то время как АХЭ катализирует реакцию деградации АХ с образованием холина и уксусной кислоты. Также известно, что продуцируемый нейтрофилом АХ может связываться с мХР и нХР той же клетки по аутокринному механизму. Таким образом, нейтрофилы могут обладать саморегуляцией своих защитных функций наряду с холинергической регуляцией со стороны нервной системы (Kawashima K., Fujii T., 2003). Противоречивые результаты исследований участия нейтрофилов в различных инфекционных и нейродегенеративных заболеваниях привели к разделению популяции нейтрофилов, по крайней мере, на две отдельные субпопуляции: N1, обладающие иммуностимулирующим потенциалом, и N2, обладающие иммуносупрессивным потенциалом. Однако до сих пор не обнаружено конкретных молекулярных маркеров, на основе которых это разделение можно было бы провести и объяснить. Дальнейшее изучение влияния конкретных типов нХР, наряду с другими сигналами микросреды в очаге воспаления, на деятельность нейтрофилов позволит понять механизмы взаимодействие между нейтрофилами и нейронами (Kanashiro A. et al., 2020). 1.3.3. Роль нейтрофилов в нейроиммунном взаимодействии Нейтрофилы в течение 30 минут после проникновения чужеродных агентов в организм прибывают к месту воспаления, опережая все остальные клетки иммунной системы. Но, несмотря на ключевую роль нейтрофилов в воспалении, исследований их участия во взаимодействии с нейронами проведено мало, что связано, вероятно, с короткой продолжительностью этих клеток. Период полувыведения нейтрофилов из крови составляет 10–19 ч у мыши и человека. Более того, зрелые нейтрофилы обнаруживаются только в костном мозге, кровотоке и воспаленной ткани, но не во вторичных лимфоидных органах. Центральным звеном основной модели нейроиммунного 24

взаимодействия, модели «холинергического противовоспалительного пути», является селезенка, однако сведений о присутствии нейтрофилов в данном органе нет, поэтому необходимы новые исследования, которые либо обнаружат миграцию нейтрофилов в селезенку (рис. 5), либо представят альтернативные способы холинергической регуляции нейтрофилов (Sonego F. et al., 2016). Рис. 5. Модель взаимодействия нейтрофилов с нервной системой (Kanashiro A. et al., 2020) Исследования влияния никотина на функциональную активность нейтрофилов человека показали, что никотин способствует снижению экспрессии генов молекул адгезии (CD11b и L-селектин), подавляет хемотаксис, фагоцитоз, не влияет на продукцию О2¯, усиливает высвобождение эластазы из азурофильных гранул и образование эйкозаноидов (Speer P. et al., 2002; Seow W.K. et al., 1994). Однако исследования, проведенные на воспалительных моделях и, соответственно, стимулированных нейтрофилах могут давать противоположные результаты. Например, лечение никотином пародонтита останавливает секреторную дегрануляцию и производство АФК, но не влияет на фагоцитоз нейтрофилов (Pabst M.J. et al., 1995). Различия в 25

результатах данных исследований могут быть связаны с продолжительностью инкубации нейтрофилов, концентрацией никотина, источником нейтрофилов, составом среды, а также специфичностью и особенностями используемых методов анализа (Kanashiro A. et al., 2020). Изучение влияния никотина на миграцию нейтрофилов из кровотока в очаг воспаления также приводит к неоднозначным выводам. Индуцированная ЛПС инфильтрация нейтрофилов в легкие мыши ингибировалась никотином, что приводило к уменьшению повреждения легких (Ni Y.F. et al., 2011). Однако при экспериментальном перитоните, вызванном Escherichia coli, стимуляция блуждающего нерва останавливала миграцию нейтрофилов в брюшную полость мышей, что приводило к увеличению времени лечения и очищения организма от патогенных бактерий (Westerloo D.J. et al., 2005). Как показало исследование артрита у крыс, введение в организм никотина до индукции артрита усугубляло симптомы болезни, а терапевтическое использование никотина (после индукции артрита) приводило к улучшению клинических признаков болезни. То есть несоответствия между провоспалительным и противовоспалительным эффектами никотина могут быть связаны с моментом его попадания в организм (Yu H. et al., 2011). Хроническое воздействие никотина, наблюдаемое у курильщиков, усиливает продукцию ИЛ-8 нейтрофилами за счет активации NF-κB и, соответственно, повышения экспрессии гена ИЛ-8 (Iho S. et al., 2003). Также хроническая активация α7 нХР нейтрофилов у курильщиков повышает высвобождение нитей ДНК для образования ДНК-сетей против болезнетворных микроорганизмов, происходит это через активацию Akt-пути в нейтрофилах. Как предполагают исследователи, эти данные могут помочь понять, почему хроническое курение сигарет предрасполагает к развитию ревматоидного артрита, что было замечено в эпидемиологических исследованиях (Hosseinzadeh A. et al., 2016). Помимо реализации своих защитных функций, нейтрофилы могут способствовать возникновению невропатической боли, то есть боли, вызванной 26

активацией сенсорных нейронов (рис. 6). Например, генетическое устранение медиаторов или рецепторов, опосредующих адгезию и миграцию нейтрофилов, улучшает механическую гипералгезию (аномальная чувствительность к болевым ощущениям) при экспериментальной невропатической боли (Cao L., Malon J.T., 2018). Нейтрофилы в месте поражения выделяют цитокины, которые стимулируют хемотаксис других иммунных клеток, а также простагландин Е2, АФК, симпатические амины, протоны и металлопротеазы, то есть медиаторы, модулирующие ноцицептивную активность и стимулирующие возникновение боли (Steen K.H. et al., 1992). Рис. 6. Модель двунаправленной регуляции нейрон-нейтрофильного взаимодействия (Kanashiro A. et al., 2020) Активированные ноцицепторы продуцируют медиаторы «нейрогенного воспаления», подобно клеткам врожденного иммунитета, что, в свою очередь, может повлиять на нейтрофилы. Например, пептид, связанный с геном кальцитонина сенсорными (Calcitonin нейронами gene-related во время peptide, инфекции, CGRP), снижает высвобождаемый инфильтрацию нейтрофилов в очаг воспаления и их микробицидную активность (Pinho-Ribeiro 27

F.A. et al., 2018). Хотя в большинстве исследований предполагается косвенный вклад нейтрофилов в возникновение невропатической боли, использование лекарств, направленных на снижение миграции нейтрофилов в очаг воспаления, можно было бы рассматривать как потенциальную стратегию против хронической воспалительной боли (Kanashiro A. et al., 2020). Раньше считалось, что центральная нервная система (ЦНС) является «иммунопривилегированной» гематоэнцефалического областью барьера (ГЭБ) организма и из-за отсутствия наличия в ней антигенпрезентирующих клеток и лимфатической сети (Wilson E.H. et al., 2010). Однако за последние несколько лет эта концепция была изменена. Было обнаружено, что при различных расстройствах ЦНС нарушается ГЭБ и возникает двунаправленная связь между периферическими иммунными клетками и нейронами мозга (Galea I. et al., 2007). При физиологических условиях в паренхиме ЦНС нейтрофилы практически отсутствуют, однако их небольшое количество содержится в мозговых оболочках и спинномозговой жидкости. При развитии инфекционного процесса в ЦНС или при черепномозговых травмах нейтрофилы под действием хемоаттрактантов мигрируют в мозговую ткань. Предотвращение инфильтрации нейтрофилов в ЦНС способствует остановке процессов демиелинизации нейронов и потери их аксонов, однако существует риск развития оппортунистических инфекций (Navarini A.A. et al., 2009). Кроме того, нейтрофилы могут способствовать развитию нейродегенеративных расстройств, например болезни Альцгеймера, вирусных инфекций, фебрильных судорог и болезни Энтеро-Бехчета. Однако для описания механизмов влияния нейтрофилов на данные воспалительные процессы требуются дополнительные исследования (Ohtsuka T., 2014). Новые исследования коммуникации между нейтрофилами и нейронами, в частности влияние нХР на деятельность нейтрофилов, могут позволить разобраться в механизмах модуляции процесса воспаления, разработать новые методы лечения различных воспалительных заболеваний и предотвратить системную иммуносупрессию организма (Kanashiro A. et al., 2020). 28

Глава 2. Материалы и методы 2.1. Реактивы В работе были использованы следующие реактивы: 1) агонист нХР: никотина битартрат (Sigma, США); 2) антагонисты нХР: селективный к α7 нХР α-кобратоксин (α-CTX), селективный к α7/α3β2 нХР α-конотоксин МII, селективный к α3β2 нХР αконотоксин GIC, селективные к α9α10 нХР α-конотоксины RgIA и Vc1.1. Антагонисты нХР были любезно предоставлены Уткиным Ю.Н. и Кашеверовым И.Е. (ИБХ РАН, Россия); 3) ингибиторы внутриклеточных сигнальных систем: коклюшный токсин, Pertussis toxin, PTX (гетеротримерные G-белки); стауроспорин (протеинкиназа С, ПКС); тирфостин 51 (тирозиновые протеинкиназы, ТПК); вортманнин (фосфотидилинозитол-3-киназы, phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K); Y27632 (Rho-ассоциированная протеинкиназа, Rho-associated protein kinase, ROCK). Все ингибиторы производства Sigma (США); 4) антитела и конъюгаты антител с флуоресцентными красителями: меченое фикоэритрином (phycoerythrin, PE) первичное моноклональное (клон RB6-8C5) антитело Ly-6G/Ly-6C (Gr-1); меченый PE IgG2b (клон RTK4530) в качестве изотипического контроля (BioLegend, США); первичное поликлональное антитело IgG кролика против α10 нХР (клон ab234767, Abcam, Великобритания); вторичное поликлональное антитело IgG козы, меченное AlexaFluor 488, или AF488-IgG (клон A11034, ThermoFisher, США); 5) красители: трипановый синий, флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый (Sigma-Aldrich, США); краситель Романовского-Гимза (МиниМед, Россия); 6) питательные среды: RPMI 1640, DMEM/F12 (Sigma-Aldrich, США); 7) буферные растворы: фосфатно-буферный солевой раствор (ФБР; phosphate buffered saline, PBS), сбалансированный солевой раствор Хэнкса (Sigma-Aldrich, США); 29

8) зимозан, перколл, люминол (5-амино-2,3-дигодро-1,4-фталазиндион), N- формилметионил-лейцил-фенилаланин (ФМЛФ), пептид WKYMVM (триптофан-лизин-тирозин-метионин-валин-метионин), цитохалазин D, азид натрия (NaN3), ЭГТА (этилен-гликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N’,N’тетрауксусная кислота), пероксидаза хрена IV типа (все Sigma-Aldrich, США); 9) бычий сывороточный альбумин, БСА (MP Biomedicals, Франция); 10) этиловый спирт (Эпифань, Россия); изопропиловый спирт (Компонент- Реактив, Россия). 2.2. Оборудование В работе было использовано следующее лабораторное оборудование: 1) автоматические пипеточные одноканальные дозаторы Eppendorf Research (Германия) с переменным объемом дозирования в пределах 0,1−2,5 мкл, 0,5−10 мкл, 2−10 мкл, 10−100 мкл, 20−200 мкл, 100−1000 мкл, 500−5000 мкл; 2) автоматические пипеточные восьмиканальные дозаторы "Discovery Comfort" (Польша) с переменным объемом дозирования в пределах 5−50 мкл, 50−300 мкл; 3) степпер механический Eppendorf Multipette M4 (Германия) объемом 1 мкл−10 мкл; 4) стационарный рН-метр HANNA HI 8313 (HANNA Instruments, США); 5) промыватель планшетов автоматический ПРОПЛАН (ЗАО ПИКОН, Россия); 6) центрифуга Allegra X-22R (Beckman Coulter, США); 7) флуоресцентный микроскоп LEICADM 2500 (LEICA, Германия); 8) анализатор микропланшетный иммуноферментный Infinite F50 (Tecan, Австрия); 9) хемилюминометр Хемилюм-12 (ИБК РАН, Россия); 10) проточный цитометр CytoFLEX (Beckman Coulter, США). 30 автоматический

2.3. Биологический объект Работа проведена на клетках мышей-самцов линии BALB/c массой 20– 22 г. Манипуляции с мышами проводили в соответствии с протоколом Комиссии по уходу и использованию животных №12306 от 2006 года (Институт биофизики клетки РАН, Россия). Мыши линии BALB/c имеют высокую возбудимость нервной системы и, соответственно, обладают повышенным уровнем экспрессии генов, кодирующих субъединицы холинорецепторов, по сравнению с мышами других линий (например, СВА и С57BL/6), что обуславливает выбор данной линии мышей для исследований в области нейробиологии (Hilgers J., 1985). 2.4. Воспалительная модель Острое воспаление мышей моделировалось путем инъекции суспензии зимозана (5 мг/мл, 150 мкл) в брюшную полость (опытная группа мышей), мышам контрольной группы вводили по 150 мкл растворителя (раствор Хэнкса без Ca2+) (Safronova V.G. et al., 2016). Раствор Хэнкса без Ca2+ (рН=7,34÷7,38) имел состав: 138 мМ NaCl, 6 мМ KCl, 1 мМ MgSO4, 1 мМ Na2HPO4, 5 мМ NaHCO3, 5,5 мМ глюкозы, 10 мМ Hepes, бидистиллированная вода. Через 15 ч после инъекций мышей обездвиживали методом цервикальной дислокации и выделяли клетки из брюшной полости и костного мозга. 2.5. Выделение гранулоцитов из брюшной полости С помощью шприца вводили 3 мл раствора Хэнкса без Са 2+ в брюшную полость обездвиженной мыши, массировали зону введения раствора в течение 1 мин, затем извлекали суспензию клеток из брюшной полости. Клетки осаждали центрифугированием (500 g, 8 мин), добавляли к осадку раствор Хэнкса без 31

Са2+. Считали количество клеток в суспензии после их окрашивания трипановым синим (0,5% раствор красителя в растворе NaCl) и доводили концентрацию клеток до 107 клеток/мл. Доля живых клеток в суспензии составляла около 95%. Процентное содержание гранулоцитов в суспензии определяли после их окрашивания акридиновым оранжевым по форме ядра с помощью флуоресцентной микроскопии. 2.6. Выделение гранулоцитов из костного мозга мыши Выделение гранулоцитов из костного мозга мыши проводили по протоколу (Boxio R. et al., 2004) с модификациями (Filina et al., 2014). У обездвиженной мыши отделяли передние и задние конечности без кожи и помещали в среду RPMI 1640 (либо DMEM/F12). Очищали конечности от мышц и сухожилий, отделяли бедренные, большие берцовые, плечевые кости от суставов и помещали их в 70% этиловый спирт на 1 мин, затем в свежую среду RPMI 1640 (или DMEM/F12). Срезали эпифизы кости, диафиз промывали RРMI 1640 (DMEM/F12) с помощью шприца на 5 мл с инъекционной иглой 0,3×13 мм (SFM Hospital Products GmbH, Германия). Затрата среды на промывание всех костей составляла около 5 мл. Суспензию клеток помещали в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугировали суспензию в бакет-роторе (500g, 10 мин, 7°C, ускорение разгона и торможения 9g). Затем удаляли надосадочную жидкость, к осадку клеток добавляли 5 мл RРMI 1640, ресуспендировали, оставляли во льду. Метод разделения суспензии клеток на популяции полиморфноядерных гранулоцитов и мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты) основан на центрифугировании в градиенте плотности, поскольку клетки имеют разную плотность: гранулоциты мыши – около 1,119 г/см3, мононуклеарные клетки – около 1,077 г/см3. Для выделения популяции гранулоцитов готовили градиент плотности перколла. Первоначально готовили базовый раствор перколла, 32

смешивая перколл с ФБР (×10) в пропорции 9:1 (об/об), из которого готовили растворы с концентрациями 55, 62,5 и 78%, смешивая с ФБР в нужной пропорции. Градиент готовили в центрифужной пробирке объемом 15 мл с коническим дном, наслаивая приготовленные растворы перколла, начиная с наиболее плотного (78%, 62,5% и 55%) по 1,5 мл раствора каждой концентрации. Затем наслаивали суспензию клеток. Пробирки уравновешивали и центрифугировали ( 1500g, 35 мин, 7°C, с ускорение разгона и торможения 3g). После центрифугирования было видно три кольца клеток на границе раздела фаз с разной плотностью, эритроциты оседали на дно пробирки. Отбирали клетки на границе 62,5/78% и ниже границы 55/62,5% и трижды отмывали их от перколла. Первая отмывка: к отобранным клеткам добавляли в пробирку 14 мл среды, центрифугировали (500g, 20 мин, 7°C, ускорение разгона и торможения 9g. Сливали надосадочную жидкость, к осадку добавляли примерно 14 мл раствора ФБР, пипетировали и центрифугировали (500g,10 ми,7°C, ускорениеразгона и торможения 9g). После последней отмывки осадок ресуспендировали в растворе Хэнкса без Са2+ и доводили концентрацию клеток в суспензии до 107 клеток/мл. 2.7. Флуоресцентный анализ клеточной популяции На предметное стекло помещали по 10 мкл суспензии клеток в концентрации 107 кл/мл, добавляли 1 мкл акридинового оранжевого, накрывали покровным стеклом и оставляли на 1-2 мин. При связывании с ДНК акридиновый оранжевый флуоресцирует в зеленом спектре, при связывании с РНК – в красном спектре. Оптимальная длина волны возбуждения красителя в комплексе с ДНК составляет 460 нм, а длина волны излучения − 650 нм. Оптимальная длина волны возбуждения красителя в комплексе с РНК составляет 502 нм, а длина волны излучения − 536 нм. По форме ядра, 33

окрашенного флуорофором, в каждой пробе в нескольких разных полях проводили подсчет количества полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЛ, клетки, имеющие сегментированное ядро), и мононуклеарных клеток с округлыми мономерными ядрами. Рассчитывали среднее количество клеток каждого типа и процентное содержание ПМЛ в каждой пробе. Зрелые нейтрофилы в суспензии составляли 70-80%. 2.8. Фотометрический анализ адгезии нейтрофилов Патогенные агенты, цитокины и другие медиаторы воспаления из очага повреждения способствуют активации прилипания (адгезии) нейтрофилов к эндотелию кровеносных сосудов и их миграции в ткани для реализации своих защитных функций (Черешнев В.А., Шмагель К.В., 2014). Тест на адгезию проводится для оценки способности гранулоцитов взаимодействовать с поверхностью, по которой они могут мигрировать. В работе использовали плоскодонные 96-луночные планшеты Corning (США) или Eppendorf (Германия) из полистирола, к которому клетки способны прилипать за счет гидрофобного взаимодействия. В каждую лунку планшета добавляли 270 мкл раствора Хэнкса, содержащего1 мМ Са2+, вещества, действие которых исследовали, а затем 30 мкл суспензии клеток (3×105 клеток в лунке). Инкубировали 30 мин в СО2инкубаторе при 37°C. Для исследования влияния коклюшного токсина (Pertussis toxin, РТХ) на действие никотина в адгезии нейтрофилов мы увеличили время инкубации клеток до 2 часов, чтобы РТХ проявил свое действие на клетки. После инкубации надосадочную жидкость удаляли, добавляли по 30 мкл 96% этилового спирта, фиксировали клетки в течение 3 ч при 21-23ºС, после удаления спирта сушили планшет при 37°C в течение 1516 ч. Затем окрашивали прикрепленные клетки красителем РомановскогоГимза, разведенным в 10 раз в ФБР (по100 мкл в ячейку, 40 мин при 21-23ºС). 34

Удаляли краситель, планшет промывали трижды (по 300 мкл ФБР в лунку при каждой промывке) с помощью промывателя планшетов ПРОПЛАН (ЗАО ПИКОН, Россия). Затем в лунки добавляли по 250 мкл подкисленного HCl изопропилового спирта (рН≈5), чтобы лизировать прикрепленные нейтрофилы. Количество прикрепленных клеток оценивали фотометрическим методом по поглощению света при длине волны 492 нм (максимум поглощения света азур-эозином) с помощью фотометра Infinite F50 (Tecan, Австрия), оснащенного программой Magellan, в которой результаты представляются в единицах оптической плотности D (ед. опт. плотности). Дальнейшую обработку результатов проводили в программе Microsoft Office Exel и Sigma Plot. Эффект влияния никотина и антагонистов нХР оценивали по отношению параметра, полученного на клетках, обработанных каким-либо из веществ, к параметру клеток в отсутствие данного вещества, принятому за 100%. 2.9. Хемилюминесцентный анализ Хемилюминесцентный анализ с применением специфических зондов является высокочувствительным методом (предел чувствительности равен 10 -12 г/мл вещества в пробе) для определения уровня АФК в биологических жидкостях и кинетики их продукции клетками. Метод позволяет оценивать функциональное состояние клеток и исследовать регуляцию со стороны рецепторов и внутриклеточных сигнальных систем (Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., 2009). Хемилюминометр Хемилюм-12 − прибор для регистрации хемилюминесценции в суспензиях клеток и биологических жидкостях, разработанный в лаборатории клеточной нейробиологии ИБК РАН. Измерения проводили в полипропиленовых ячейках. Общий объем каждой из 12 проб составлял 200 мкл: 169 мкл раствора Хэнкса, содержащего 1 мМ Са2+; 7 мкл раствора люминола (20 мкМ); 20 мкл суспензии нейтрофилов 35

(конечная концентрация 106 клеток/мл); 2 мкл раствора пероксидазы хрена (1 ед/мл); 2 мкл NaN3 (10 мкМ); 2 мкл праймирующего агента ФМЛФ (50 нМ); 2 мкл цитохалазина D (1 мкМ ); также добавляли по 2 мкл веществ, действие которых исследовали. Клетки инкубировали при 37°C в течение 20 мин в СО2инкубаторе, затем ячейки помещали в прибор Хемилюм-12, записывали базовый уровень интенсивности хемилюминесценции в течение 250 с, затем активировали респираторный взрыв 1 мкМ WKYMVM. Первичную обработку данных, получаемых от хемилюминометра ХЕМИЛЮМ 12 (ИБК РАН), проводили с помощью программы ANALIZ, приложенной к данному прибору. Для каждого условия инкубации клеток с исследуемыми веществами было по 3 повтора. Всего в приборе помещалось 12 ячеек. Таким образом, за одно измерение с помощью прибора мы могли проанализировать 4 условия. В программе ANALIZ повторы усреднялись, и мы получали первичный график влияния исследуемых веществ на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши. Дальнейшую обработку результатов проводили в программе Microsoft Office Exel и Sigma Plot. Эффект исследуемых веществ рассчитывали по отношению параметра, полученного на клетках, обработанных каким-либо из веществ, к параметру клеток в отсутствие данного вещества, принятому за 100%. 2.10. Цитометрический анализ экспрессии α10 субъединиц нХР Проточная цитометрия – это метод изучения популяций клеток, отдельных органелл и процессов в клетках, основанный на анализе элементов дисперсионной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции в режиме поштучного анализа (Хайдуков С.В., Зурочка А.В., 2007). Для определения нужной популяции (зрелые нейтрофилы) использовали меченое фикоэритрином (phycoerythrin, PE) первичное моноклональное антитело Ly6G/Ly-6C (Gr-1) против Gr-1, уровень экспрессии которого коррелирует с уровнем дифференцировки нейтрофилов. Экспрессию α10 субъединиц нХР в 36

зрелых нейтрофилах определяли с помощью первичного поликлонального антитела IgG кролика против α10 нХР, к нему использовали вторичное поликлональное антитело AF488-IgG (IgG козы, меченый Alexa Fluor 488). Фиксацию и окрашивание клеток проводили в соответствии с протоколом производителя Abcam (Великобритания) для подготовки проб к проточной цитометрии. Чтобы фиксировать клетки, к 100 мкл суспензии (107 клеток/мл) добавляли 100 мкл формальдегида (8%), оставляли клетки на 15 мин в темноте при 4ºС. Затем добавляли 1 мл ФБР, центрифугировали пробы при 500g в течение 8 мин при 7°C, ускорение разгона и остановки – 9g. Отбирали супернатант. Процедуру повторяли еще два раза, чтобы очистить суспензию клеток от формальдегида. Затем к осадку добавляли 100 мкл БСА(1% раствор в ФБР) и оставляли на 30 мин на льду для исключения неспецифического связывания. Для идентификации зрелых нейтрофилов добавляли 1 мкл антитела Ly6G/Ly-6C и оставляли на 1 ч на льду в темноте. Для определения экспрессии α10 субъединиц нХР добавляли 1 мкл первичных IgG против α10 нХР и оставляли на 1 ч на льду в темноте. Пробы трижды отмывали от несвязавшихся антител 1 мл ФБР при центрифугировании (500g, 8 мин, 7°C, ускорение разгона и торможения 9g). К пробам с первичными IgG против α10 нХР добавляли 100 мкл БСА (1%) и 1 мкл AF488-IgG, оставляли на 30 мин в темноте. Проводили отмывку 1 мл ФБР путем центрифугирования (500g, 8 мин, 7°C, ускорение разгона и торможения 9g). Готовые пробы клеток загружали в проточный цитометр CytoFLEX (Beckman Coulter, США). В соответствии с максимумами длин волн возбуждения и эмиссии флуорохромов настраивали программу цитометра CytExpert: для PE-Gr-1 эти показатели равны 490 и 578 нм, соответственно, а для AF488-IgG – 495 ложноположительные и 519 нм, соответственно. Чтобы исключить результаты, проверяли 37 уровень флуоресценции

неокрашенных клеток, флуоресценцию изотипического контроля (неспецифическое связывание флуоресцентно меченых антител к нецелевой мишени) и сравнивали эти показатели с уровнем флуоресценции целевой мишени. Первичные графики и таблицы статистического анализа, сделанные в программе CytExpert, в дальнейшем обрабатывали в программе Flowing Software (Beckman Coulter, кат. № B67284AG, 2019). Окончательно данные представляли в виде графиков типа Box-whisker plot (по медиане) в программе Sigma Plot. Эта часть работы выполнена совместно с сотрудниками ИБК РАН Афанасьевым В.Н. и Серовым Д.А. 2.11. Статистическая обработка результатов Статистический анализ результатов проводили в программе Sigma Plot. Разброс выборки оценивали с помощью показателя стандартного отклонения. Отличия от показателя, принятого за 100%, внутри одной группы мышей оценивали с помощью теста One Way ANOVA. Различия между показателями контрольной и опытной групп оценивали с помощью RankSum теста. 38

Глава 3. Результаты 3.1. Воспалительная модель Внутрибрюшинная инъекция зимозана, полисахаридного компонента клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, широко используется в качестве индуктора острого воспаления у мышей. Пик воспаления наблюдается в период от 4 до 15 часов после инъекции зимозана и исчезает через 48–72 часов (Mullaly S.C., Kubes P., 2007). Мы оценивали реализацию модели острого воспаления по количеству гранулоцитов, выделенных из перитонеальной полости мышей опытной группы, и сравнивали с таковым у мышей контрольной группы. Также было сравнено количество гранулоцитов, выделенных из костного мозга мышей. Рис. 7. Количество гранулоцитов, выделенных из брюшной полости и костного мозга мышей контрольной и опытной групп. Контрольная группа (Контроль) – зеленые столбцы; опытная группа (Воспаление) – коричневые столбцы. Показаны средние значения и стандартная ошибка по результатам указанного числа экспериментов. – статистически значимые отличия между группами, р<0.05. В группе мышей с острым воспалением обнаружено статистически значимое (р=0.001) увеличение количества гранулоцитов, выделенных из 39

перитонеальной полости, по сравнению с таковым у мышей контрольной группы (рис. 7). В то же время из костного мозга мышей опытной группы было выделено значительно меньшее количество гранулоцитов, чем из костного мозга мышей контрольной группы. Это позволяет предположить, что в ответ на введение зимозана значительная часть зрелых гранулоцитов из костного мозга мигрировала в кровеносное русло, а затем в брюшную полость (очаг воспаления). Адгезия нейтрофилов к эндотелиальным клеткам кровеносных сосудов на начальной стадии воспаления и респираторный взрыв нейтрофилов при развитии и завершении воспаления являются важными для реализации их защитных функций. Модуляция этих функций может иметь решающее значение в исходе воспалительного процесса (Liew P.X., Kubes P., 2019). 3.2. Влияние лигандов нХР на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов Одной из первых функций, которые активируются у нейтрофилов при развитии воспалительного процесса, является адгезия к эндотелию кровеносных сосудов. Это обеспечивает миграцию нейтрофилов в ткани к месту поражения. Генерация АФК при индукции респираторного взрыва происходит в очаге воспаления или повреждения. Его интенсивность строго контролируется рецепторами разного типа, в том числе нХР (Safronova V.G. et al., 2016, 2021). Отсутствие специфичности АФК к мишеням является причиной цитотоксического действия нейтрофилов не только на чужеродные биологические агенты, но и на здоровые клетки организма. Изучение участия нХР в регуляции адгезии и генерации АФК в нейтрофилах костного мозга мыши мы проводили с использованием агониста нХР никотина. Участие в данных процессах α7, α3β2 и α9α10 нХР мы изучали с использованием селективных антагонистов нХР: α-СТХ (α7), α-конотоксины MII (α7 и α3β2), GIC (α3β2), RgIA (α9α10) и Vc1.1 (α9α10). 40

Таблица 1. Влияние никотина и антагонистов нХР на адгезию и продукцию АФК нейтрофилов костного мозга мышей контрольной и «воспалительной» групп Адгезия (n=4) Контроль, % Продукция АФК (n=4) Воспаление, % p(#) Контроль, % Воспаление, % p(#) Интактные 100 100 100 100 клетки Никотин, 128.6±9.6* 163.7±5.65*# 104.1±6.3 0.7 0.032 101.1±4.0 0.01 М Никотин, 147.3±9.9* 173.4±12.0* 0.31 114.7±7* 106.6±2.5* 0.7 1 М Никотин, 146.4±8.5* 154.9±11.5* 0.85 81.6±13.0* 82.7±2.4* 0.793 100 М MII, 5 нМ 106.7±10.8 65.1±5.3*# 0.1 0.029 108.9±2.0* 92.0±2.7* (α3β2) MII, 200 нМ 177.7±7.03* 88.8±1.1*# 0.092 0.029 111.8±7.0* 110.7±6.3 (α3β2 и α7) α-СТХ, 140.1±9.3* 147.5±13.0* 0.686 95.5±12.5 105.2±4.2 1.0 10 нМ(α7) GIC, 10 нМ 121.3± 6.1 * 121±3.3* 0.857 104.7±6.9 99.1±21.1 1.0 (α3β2) RgIA, 10 нМ 179.7± 2.6 * 138.1± 1.5 *# 93.2±2.4* 0.029 107.2±3.4 0.039 (α9α10) Vc1.1, 50 нМ 257.8± 5.2 * 114.2± 5 *# 104.6±3.8 1.0 0.029 108.7±4.2 (α9α10) * – отличия от показателя интактных клеток, принятого за 100%, # – отличия между группами, р<0.05. Обнаружено, что никотин в концентрациях 0.01 μМ, 1 μМ и 100 μМ усиливал адгезию нейтрофилов костного мозга мышей контрольной и опытной групп по сравнению с адгезией интактных клеток, причем ответ на 0.01 μМ никотин клеток мышей с воспалением был значительно выше, чем клеток мышей контрольной группы (табл. 1). В обеих группах действие 10 нМ α-СТХ и 10 нМ GIC приводило к усилению адгезии нейтрофилов по сравнению с адгезией интактных клеток, однако различий между группами не обнаружено. Влияние MII значительно различалось в контроле и при воспалении: 5 нМ MII не влиял на адгезию в контроле, но понижал ее при воспалении, в то время как 200 нМ MII также понижал адгезию в воспалительной группе мышей, но повышал в контрольной. α-Конотоксины RgIA (10 нМ) и Vc1.1 (50 нМ) значительно усиливали адгезию в обеих группах мышей по сравнению с 41

показателем интактных клеток, при этом в группе мышей с воспалением эффект был значительно ниже, чем в контрольной группе. При изучении влияния никотина на респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мыши было выяснено, что в низкой концентрации (0.01 μМ) никотин не влиял на индуцированную 1 μМ WKYMVM продукцию АФК. При действии 1 μМ никотина наблюдалось небольшое увеличение (менее 15%), а в высокой концентрации (100 μМ) никотина – понижение данного показателя в обеих группах мышей. Небольшое повышение продукции АФК наблюдалось в контрольной группе мышей при действии 5 нМ и 200 нМ MII, в то время как в группе мышей с воспалением наблюдалось понижение показателя при действии 5 нМ MII и 10 нМ RgIA. Не обнаружено влияние на респираторный взрыв нейтрофилов 10 нМ α-СТХ, 10 нМ GIC и 50 нМ Vc1.1 в обеих группах мышей, 10 нМ RgIA в контроле и 200 нМ MII при воспалении. Выявленные различия между контрольной и опытной группами в действии 0.01 μМ никотина, 5 нМ и 200 нМ MII, 10 нМ RgIA и 50 нМ Vc1.1 на адгезию, а также 10 нМ RgIA на продукцию АФК могут свидетельствовать о влиянии воспаления на метаболические процессы нейтрофилов, опосредующие модулирующее действие нХР на функции данных клеток. 3.3. Участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на адгезию нейтрофилов Роль α3β2 нХР в регуляции адгезии нейтрофилов костного мозга мыши исследовали с помощью 5 нМ MII (рис. 8 А, Б), а также 10 нМ GIC (рис. 9). Было обнаружено статистически значимое понижение уровня адгезии нейтрофилов при действии никотина в присутствии 5 нМ MII по сравнению с одиночным действием 100 нМ или 100 μМ никотина в контрольной группе мышей, а также по сравнению с одиночным действием 1 нМ никотина в группе мышей с воспалением. При совместном действии 10 нМ GIC и 100 μМ никотина обнаружено повышение адгезии по сравнению с одиночным 42

действием никотина в контрольной группе мышей, в то время как в группе с воспалением отличий не было, но между двумя группами животных наблюдались статистически значимые отличия. Таким образом, α3β2 нХР участвуют в регуляции адгезии нейтрофилов костного мозга мыши в физиологически нормальном состоянии и при развитии воспаления, однако, вероятно, существует зависимость между концентрацией лигандов нХР, их сайтами связывания в рецепторе и регулирующем влиянии на функциональную активность данных клеток. А 180 Воспаление Никотин (n=4) Никотин + MII 5 нМ (n=4) 180 * * & * & * 120 * * * & 140 * 120 100 100 80 80 0 0.01 0.1 100 0 0.01 Никотин, мкМ В Г Контроль 180 Воспаление 180 * * & & * Эффект, % 140 120 & 100 *# 160 * 140 100 Никотин (n=4) Никотин + MII 200 нМ (n=4) * 160 0.1 Никотин, мкМ Никотин (n=4) Никотин + MII 200 нМ (n=4) Эффект, % * 160 * * 140 *# Эффект, % 160 Эффект, % Б Контроль Никотин (n=4) Никотин + MII 5 нМ (n=4) 120 100 & 80 80 & 60 * 60 * 40 40 0 0.01 0.1 100 0 Никотин, мкМ 0.01 0.1 100 Никотин, мкМ Рис. 8. Влияние никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши в присутствии 5 нМ и 200 нМ MII * – отличия от показателя, принятого за 100%, # – отличия между группами, &– отличия эффекта никотина в присутствии MII от одиночного действия никотина на интактные клетки, р<0.05 43

Участие α7 нХР в регуляции адгезии нейтрофилов исследовали с помощью 10 нМ α-СТХ (рис. 9), а также 200 нМ MII, который проявляет селективность в данной концентрации не только к α3β2, но и к α7 нХР (рис. 8 В, Г). Было выявлено, что в обеих группах мышей никотин (10 нМ, 100 нМ и 100 μМ) в присутствии 200 нМ MII перестает влиять на адгезию, если сравнивать с одиночным действием никотина, при котором наблюдалось усиление адгезии. В присутствии 10 нМ α-СТХ 100 μМ никотин понижал адгезию нейтрофилов по сравнению с одиночным действием никотина в обеих группах мышей, причем при воспалении эффект был статистически значимо более низким, чем в контроле. Эти данные свидетельствуют об участии α7 нХР в действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мышей контрольной группы и группы с воспалением. Контроль (n=4) Воспаление (n=4) & 200 & * 180 160 * * * # Эффект, % 140 * * 120 # # 100 *# 80 * 60 40 20 0 Интактные клетки + а-СТХ, 10 нМ + GIC, 10 нМ + RgIA, 10 нМ + Vc1.1, 50 нМ + Никотин, 100 мкМ Рис. 9. Влияние никотина на адгезию нейтрофилов в присутствии антагонистов нХР. * – отличия от показателя, принятого за 100%, # – отличия между группами, &– отличия от одиночного действия никотина на интактные клетки, р<0.05 Для изучения участия α9α10 нХР в действии никотина на адгезию нейтрофилов мы использовали 10 нМ RgIA и 50 нМ Vc1.1 (рис. 9). Мы 44

обнаружили, что в группе мышей с воспалением в присутствии 10 нМ RgIA действие 100 μМ никотина на адгезию снижается по сравнению с влиянием никотина на интактные клетки. В то же время в контрольной группе мышей 10 нМ RgIA не влиял на действие никотина, причем между контролем и воспалением наблюдались статистически значимые отличия. В присутствии 50 нМ Vc1.1 100 μМ никотин понижал адгезию по сравнению с одиночным действием никотина в обеих группах мышей, причем при воспалении эффект был статистически значимо более высоким, чем в контроле. Эти данные указывают на участие α9α10 нХР в действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мышей контрольной группы и группы с воспалением. 3.4. Изучение участия α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами Для изучения участия α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши мы использовали α-СТХ (10 нМ), GIC (10 нМ), MII (5 нМ и 200 нМ), RgIA (10 нМ) и Vc1.1 (50 нМ). На рисунке интенсивности 10 приведен пример люминол-зависимой экспериментальной хемилюминесценции, записи вызванной продукцией АФК нейтрофилами контрольной группы, находящимися в разных условиях инкубации. Можно заметить, что никотин (100 μМ) вызвал понижение ответа по сравнению с интактными клетками (контроль), в то время как 10 нМ α-СТХ, не влиял на продукцию АФК. Также заметно, что в присутствии 10 нМ α-СТХ действие 100 μМ никотина не изменилось по сравнению с одиночным действием никотина. На основании этих данных можно сделать предварительный вывод, что α7 нХР, антагонистом которого является α-СТХ, не участвует в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилов костного мозга мыши контрольной группы. 45

Интенсивность хемилюминесценции, отн. ед. контроль + никотин, 100 µМ + никотин, 100 µМ; + α-СТХ, 10 нМ + α-СТХ, 10 нМ + WKYMVM, 1 µМ 0 25 50 75 100 125 150 175 t, секунды Рис. 10. Пример экспериментальной записи интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции, вызванной продукцией АФК нейтрофилами в ответ на WKYMVM. Исследование действия 100 μМ никотина в присутствии антагонистов α7 нХР (10 нМ α-СТХ и 200 нМ MII) на продукцию АФК нейтрофилами показало отсутствие статистически значимых отличий от одиночного действия никотина в обеих группах мышей (рис. 11). Кроме того, показатель совместного действия данных антагонистов с никотином был статистически значимо ниже, чем одиночное действие антагонистов, принятое за 100%. Различий между контрольной группой мышей и группой с воспалением обнаружено не было. Данные результаты свидетельствуют об отсутствии участия α7 нХР в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши. Результаты воздействия на продукцию АФК нейтрофилов 100 μМ никотина в присутствии 5 нМ MII, антагониста α3β2 нХР, не отличались от результатов его воздействия на интактные клетки, но оказались статистически значимо ниже уровня продукции АФК под действием 5 нМ MII без никотина в обеих группах мышей. При этом в группе мышей с воспалением действие 100 μМ никотина в присутствии 5 нМ MII был статистически значимо слабее, чем в контрольной группе мышей. Данная тенденция наблюдалась и для GIC 46

(10 нМ), который также является антагонистом α3β2 нХР: отличий действия 100 μМ никотина в присутствии 10 нМ GIC от одиночного действия никотина выявлено не было, но можно заметить тенденцию к ослаблению эффекта никотина в опытной группе. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии участия α3β2 нХР в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши. Контроль (n=4) Воспаление (n=4) 120 Эффект, % 100 80 * * * * * * # * * * * * * * 60 40 20 0 Интактные клетки + а-СТХ, 10 нМ + GIC, 10 нМ + MII, 5 нМ + MII, 200 нМ + RgIA, 10 нМ + Vc1.1, 50 нМ + Никотин, 100 мкМ Рис. 11. Влияние никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши в присутствии антагонистов нХР в сравнении с одиночным действием никотина (интактные клетки). * – отличия от показателя, принятого за 100%, # – отличия между группами, р<0.05 При исследовании влияния антагонистов α9α10 нХР (10 нМ RgIA и 50 нМ Vc1.1) на действие 100 μМ никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши не было выявлено статистически значимых отличий от одиночного действия никотина. Кроме того, отличий между контрольной группой мышей и группой мышей с воспалением не наблюдалось. Эти данные указывают на отсутствие участия α9α10 нХР в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами. Такой же вывод можно сделать при сравнении эффекта, полученного после инкубации клеток с антагонистом в присутствии никотина, с эффектом, полученным после инкубации клеток с антагонистом без никотина. Действие 10 нМ RgIA совместно с 100 μМ никотином на продукцию АФК нейтрофилами по сравнению с влиянием RgIA на интактные клетки 47

оказалось ниже в обеих группах мышей. Это свидетельствует о том, что антагонист не нивелирует действие никотина. Та же закономерность прослеживается при действии 50 нМ Vc1.1 совместно с 100 μМ никотином: происходит понижение продукции АФК нейтрофилами мышей обеих групп по сравнению с одиночным действием 50 нМ Vc1.1. Полученные данные не позволили выявить участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина, модулирующего продукцию АФК нейтрофилами. 3.5. Влияние ингибиторов сигнальных молекул на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов Литературные данные свидетельствуют о двойной природе нХР в клетках иммунной системы. Помимо ионотропных нХР, есть данные о метаботропных нХР (Fujii T. et al., 2017). Внутриклеточные события, следующие за активацией метаботропных нХР в иммунных клетках, изучены мало. В Т-лимфоцитах активированные нХР связываются с G-белками, что запускает сигнальный путь с участием JAK 2 и NF-κB (Razani-Boroujerdi S. et al., 2007). В нейтрофилах периферической крови человека обнаружено участие NF-κB в действии никотина на липополисахарид-индуцированную продукцию ИЛ-8 (Iho S. et al., 2003). Для исследования участия сигнальных молекул в действии никотина на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мыши мы использовали следующие ингибиторы: коклюшный токсин (Pertussis toxin, PTX) – ингибитор гетеротримерных G-белков; стауроспорин – ингибитор протеинкиназы С (ПКС), тирфостин 51 – ингибитор тирозиновых протеинкиназ (PTK), вортманнин – ингибитор фосфотидилинозитол-3-киназы (phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K), Y27632 – ингибитор Rho-ассоциированной протеинкиназы (Rho-associated protein kinase, ROCK). 48

Таблица 2. Влияние ингибиторов сигнальных молекул на адгезию и продукцию АФК нейтрофилов костного мозга мышей контрольной и «воспалительной» групп Адгезия (n=5) Контроль, % Продукция АФК (n=5) Воспаление, % p(#) Контроль, % Воспаление, % Интактные 100 100 100 100 клетки PTX, 300 нг/мл 111.9±6.3 * 97.03±6.3 0.116 (G-белки) Стауроспорин, 157.0±5.0 * 137.0±15.0 * 0.571 110.7±4.8 96.7±10.2 10 нМ (ПКС) Вортманнин, 183.5±12. * 118.9±11.0 # 0.016 3.54±0.57* 38.9±4.25*# 10 нМ (PI3K) Y27632, 140 нМ 204.8±13. * 115.8±11.6 # 0.016 86.6±5.4 * 110.9±7.0 # (ROCK) Тирфостин, 102.9±4.0 105.1±6.0 0.886 86.3±3.35 * 64.1±1.6 *# 50 нМ (PTK) * – отличия от показателя, принятого за 100%, # – отличия между группами, р<0.05 p(#) 0.4 0.029 0.029 0.016 Сначала мы оценили непосредственное влияние данных ингибиторов на адгезию нейтрофилов костного мозга. В контрольной группе мышей 300 нг/мл РТХ, 10 нМ стауроспорин, 10 нМ вортманнин и 140 нМ Y27632 вызывали повышение уровня адгезии по сравнению с адгезией интактных клеток (табл. 2). Это свидетельствует об участии G-белков, ПКС, PI3K и ROCK в активации неспецифической адгезии, причем эти сигнальные молекулы участвуют в регуляции адгезии с отрицательным знаком в контрольной группе животных. В группе мышей с воспалением к повышению уровня адгезии приводила инкубация нейтрофилов с 10 нМ стауроспорина. Таким образом, участие ПКС как отрицательного регулятора адгезии нейтрофилов костного мозга наблюдается в обеих группах животных. Влияния 50 нМ тирфостина в обеих группах, а также 300 нг/мл РТХ, 10 нМ вортманнина, 140 нМ Y27632 в группе мышей с воспалением на адгезию нейтрофилов выявлено не было. Кроме того, были обнаружены статистически значимые отличия в действии 10 нМ вортманнина и 140 нМ Y27632 на клетки животных контрольной и опытной 49

групп, что говорит об изменении роли PI3K и ROCK в регуляции адгезии нейтрофилов костного мозга мыши при воспалении. Основываясь на литературных данных, согласно которым гетеротримерные G-белки являются первым звеном в передаче сигнала от FPR2 (Ciz M. et al., 2012), мы не исследовали действие РТХ на продукцию АФК, так как для активации дыхательного взрыва был использован пептид WKYMVM, действующий через FPR2. По сравнению с интактными нейтрофилами, резкое понижение уровня продукции АФК наблюдалось при инкубации клеток с 10 нМ вортманнина, причем в группе с воспалением наблюдался статистически значимый более слабый эффект, чем в контрольной группе. Также понижение уровня продукции АФК было обнаружено при действии 50 нМ тирфостина на 14% в контроле и на 36% при воспалении, при этом между группами наблюдались статистически значимые отличия. Снижение показателя респираторного взрыва по сравнению с интактными клетками также наблюдалось при инкубации нейтрофилов с 140 нМ Y27632 в контроле, в то время как при воспалении данного эффекта не наблюдалось (табл. 2). Не было выявлено влияние 10 нМ стауроспорина на продукцию АФК нейтрофилами в обеих группах мышей. Таким образом, в регуляции продукции АФК нейтрофилами участвуют PI3K и РТК в обеих группах мышей, а также ROCK в контрольной группе мышей. 3.6. Роль сигнальных молекул в действии никотина на адгезию нейтрофилов При инкубации нейтрофилов в течение 2 ч с 10 μМ и 100 μМ никотином в контрольной группе мышей было обнаружено повышение адгезии клеток, а в группе мышей с воспалением, наоборот, понижение уровня адгезии по сравнению с интактными клетками, причем между двумя группами мышей наблюдались статистически значимые отличия (рис. 12). 50

Контроль (n=4) Воспаление (n=4) 160 р=0.511 140 Эффект, % 120 р=0.816 * * * * # 100 * # # * 80 60 40 20 0 Никотин, 10 µМ + + + + + Никотин, 100 µМ + + РТХ, 300 нг/мл + + + Рис. 12. Влияние никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши в отсутствии и присутствии коклюшного токсина (Pertussis toxin, PTX) * – отличия от показателя интактных клеток, принятого за 100%, # – отличия между группами, р<0.05 Инкубация нейтрофилов с 300 нг/мл РТХ привела к повышению уровня адгезии по сравнению с показателем интактных клеток у контрольных животных, в то время как в воспалении РТХ не действовал, однако достоверных различий между группами не обнаружено (рис. 12). Инкубация клеток с 10 μМ никотином в присутствии 300 нг/мл РТХ не приводила к изменению адгезии клеток по сравнению с одиночным действием РТХ в обеих группах мышей. Это указывает на то, что в присутствии РТХ, который блокирует G-белки, никотин не действует, что свидетельствует об участии гетеротримерных G-белков в модифицирующем действии никотина на адгезию. Сравнение действия 100 μМ никотина в присутствии 10 нМ стауроспорина с одиночным действием никотина (рис. 13) показало понижение уровня адгезии нейтрофилов костного мозга в контрольной группе мышей и группе с воспалением (различий между группами не обнаружено). Таким образом, стауроспорин ингибировал 51 действие никотина на адгезию

нейтрофилов, что указывает на участие ПКС в передаче сигнала от нХР внутрь клетки. Контроль (n=5) 200 Воспаление (n=5) * Эффект, % 150 * * # * & & & & 100 50 0 + Стауроспорин, 10 нМ + Тирфостин, 50 нМ + Вортманнин, 10 нМ + Y27632, 140 нМ + Никотин, 100 µМ Рис. 13. Влияние никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши в отсутствии и присутствии стауроспорина, тирфостина 51, вортманнина и Y27632. * – отличия от показателя, принятого за 100%, # – отличия между группами, &– отличия от одиночного действия никотина на интактные клетки, р<0.05 Уровень адгезии нейтрофилов в обеих группах мышей после инкубации клеток с 100 μМ никотином в присутствии 50 нМ тирфостина 51 не отличался от уровня адгезии, который наблюдался в результате одиночного действия никотина (рис. 13). Это говорит об отсутствии участия РТК в действии никотина на адгезию. Кроме того, в контрольной и опытной группе эффект совместного действия никотина и тирфостина 51 на адгезию нейтрофилов статистически значимо выше одиночного действия ингибитора, эффект которого принимали за 100%. То есть никотин продолжал влиять на адгезию клеток, что подтверждает отсутствие участия РТК. При этом в группе мышей с воспалением был обнаружен статистически значимый более низкий эффект 100 μМ никотина в присутствии 50 нМ тирфостина 51 на адгезию нейтрофилов, чем 52

в контрольной группе. Это может быть связано с влиянием воспаления на РТК, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала от интегринов, запускающих адгезию нейтрофилов. Результаты воздействия на адгезию нейтрофилов 100 μМ никотина в присутствии 10 нМ вортманнина не отличались от действия никотина на адгезию клеток в отсутствии ингибитора (различий между контролем и воспалением не наблюдалось). Это свидетельствует о том, что PI3K не участвуют в модулирующем воздействии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши. В обеих группах мышей при инкубации клеток с 100 μМ никотином в присутствии 140 нМ Y27632 адгезия нейтрофилов понижалась по сравнению с действием никотина в отсутствии данного ингибитора (различий между группами не наблюдалось). Это доказывает участие ROCK в действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мышей, находящихся в нормальном физиологическом состоянии, и мышей с воспалением. Таким образом, можно сделать вывод об участии в действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши таких сигнальных молекул, как гетеротримерные G-белки, ПКС и ROCK, причем это относится как к мышам из контрольной группы, так и к мышам с воспалением. В то же время развитие воспаления в организме мышей не приводило к модуляции роли данных сигнальных молекул в регуляции адгезии нейтрофилов костного мозга. Кроме того, в группе мышей с воспалением было обнаружено, что короткая инкубация клеток (30 минут) с 100 μМ никотином приводила к повышению уровня адгезии нейтрофилов по сравнению с адгезией интактных клеток, в то время как длительная инкубация клеток (2 часа) с 100 μМ никотином приводила к понижению уровня адгезии нейтрофилов. Поскольку у нейтрофилов нет ферментов для деградации никотина, на основе полученных данных можно выявить временную зависимость ответа нейтрофилов на никотин: короткий стимул (30 минут) приводит к повышению уровня адгезии, длительный стимул 53

(2 часа) приводит к понижению уровня адгезии, то есть модуляция ответа в зависимости от времени происходит непосредственно внутри клеток. 3.7. Роль сигнальных молекул в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами Для исследования роли ПКС, РТК, PI3K и ROCK в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши клетки инкубировали со 100 μМ никотина в присутствии 10 нМ стауроспорина, 50 нМ тирфостина 51, 10 нМ вортманнина или 140 нМ Y27632 соответственно и сравнивали данные ответы с одиночным действием никотина (рис. 14). Сравнение действия 100 μМ никотина в присутствии 10 нМ стауроспорина с одиночным действием никотина показало повышение уровня продукции АФК нейтрофилами костного мозга в контрольной группе мышей, в то время как в группе мышей с воспалением отличий от показателя одиночного действия никотина не наблюдалось (различий между группами не обнаружено). Это свидетельствует об участии ПКС в действии никотина на респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мышей, находящихся в нормальном физиологическом состоянии. Развитие воспаления в организме мышей приводит к изменению роли ПКС в регуляции продукции АФК никотином. Уровень продукции АФК нейтрофилами мышей группы с воспалением после инкубации клеток с 100 μМ никотином в присутствии 50 нМ тирфостина 51 был статистически значимо выше, чем уровень ответа, который наблюдался в результате одиночного действия никотина. В контрольной группе мышей отличий от действия никотина на интактные клетки не наблюдалось. Тогда как в «воспалительной группе» влияние никотина в присутствии 50 нМ тирфостина на продукцию АФК отсутствовало, что значительно отличалось от его действия на интактные клетки животных этой группы и клетки мышей контрольной группы. Это говорит о том, что развитие воспаления способствует изменению 54

роли РТК в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши. Контроль (n=5) 140 Воспаление (n=5) & 120 100 Эффект, % & # * * * * & & & * 80 60 40 20 0 + Стауроспорин, 10 нМ + Тирфостин, 50 нМ + Вортманнин, 10 нМ + Y27632, 140 нМ + Никотин, 100 µМ Рис. 14. Влияние никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши в отсутствии и присутствии стауроспорина, тирфостина 51, вортманнина и Y27632 * – отличия от показателя, принятого за 100%, # – отличия между группами, &– отличия от одиночного действия никотина на интактные клетки, р<0.05 В группе мышей с воспалением при инкубации клеток с 100 μМ никотином в присутствии 10 нМ вортманнина продукция АФК не изменялась по сравнению с таковым показателем при действии только 10 нМ вортманнина, что отличалось от действия никотина на интактные клетки. Различий между группами не наблюдалось. В контрольной группе мышей отличий совместного действия никотина и вортманнина от действия никотина на интактные клетки не наблюдалось. Статистически значимых различий между группами не обнаружено. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при развитии воспаления PI3K участвует во внутриклеточной передаче сигнала от нХР в нейтрофилах костного мозга мыши, тогда как у контрольных животных ее роль незначительна. 55

В обеих группах мышей при инкубации клеток с 100 μМ никотином в присутствии 140 нМ Y27632 уровень продукции АФК нейтрофилами не изменялся относительно показателя при действии одного ингибитора, то есть эффект никотина отсутствовал, что отличается от действия никотина на интактные клетки (рис. 14). Различий между группами не наблюдалось. Это доказывает участие ROCK в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мышей, находящихся в нормальном физиологическом состоянии, и мышей с воспалением. Таким образом, можно сделать вывод, что в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши участвуют такие сигнальные молекулы, как ПКС, РТК, PI3K и ROCK. При этом участие ROCK в данном процессе обнаружено как в группе мышей, находящихся в нормальном физиологическом состоянии, так и в группе с воспалением, что свидетельствует об отсутствии влияния воспаления на роль ROCK. 3.8. Экспрессия α10 субъединицы нХР в нейтрофилах Выявленная с помощью флуоресценции популяция Gr-1+ нейтрофилов совпадала с популяцией нейтрофилов, которая обозначалась в точечной диаграмме прямого и бокового светорассеяния (длинное овальное пятно точек в верхней правой области, если сравнивать с другими точками, на рисунке 15 А). Уровень флуоресценции фикоэритрина (PE) достигал 105–106 условных единиц (усл. ед.), то есть в шкале от 101 до 107 усл. ед. это соответствует высокому уровню флуоресценции (рис. 15 Б). В выбранной популяции нейтрофилов мы анализировали флуоресценцию Alexa Fluor 488 (AF488), связанных с α10 субъединицами нХР. Для нейтрофилов костного мозга мышей контрольной группы мы обнаружили высокий уровень флуоресценции AF в пределах от 105до 107 усл. ед. (рис. 15 В). 56

Рис. 15. Пример экспериментальной записи флуоресценции красителей, конъюгированных с антителами, связавшимися с мишенями в нейтрофилах костного мозга мыши контрольной группы: А – диаграмма прямого и бокового рассеяния света от клеток (сектором выделена популяция нейтрофилов); Б – диаграмма интенсивности флуоресценции, зарегистрированной в канале фикоэритрина (phycoerythrin, PE); В – диаграмма интенсивности флуоресценции, зарегистрированной в канале для AlexaFluor 488, или AF(канал FITC); Г – диаграмма интенсивности флуоресценции для двух каналов регистрации (PE и AF/FITC), нужная популяция с высоким уровнем флуоресценции обоих красителей находится в верхнем правом углу; Д – наложение сигнала от AF на сигнал от PE с выделением нужной популяции клеток (фиолетовый цвет), предварительно произведена компенсация сигнала; Е – выделение ворот для регистрации сигнала от AF (синий цвет), оранжевым цветом показан сигнал от РЕ Помимо зрелых нейтрофилов, экспрессия α10 субъединицы нХР обнаруживалась в другой неидентифицированной популяции, уровень флуоресценции которой мы не учитывали (рис. 15 Г, Д). На рисунке 15 Г 57

нужная популяция (Gr-1+ и α10 нХР+) находится в правом верхнем секторе, она обозначена синим цветом. На рисунке 15 Д фиолетовым цветом обозначена популяция нейтрофилов Gr-1+ и α10 нХР+ после компенсации сигналов РЕ и AF488, которая необходима для предотвращения попадания флуоресценции от одного красителя в канал регистрации другого красителя. Анализ компенсации сигнала относительно показателей по медиане для РЕ показал значение, равное 2.85%, а для AF компенсация сигнала составляла 6.86%. Эти значения учитывались при анализе результатов измерений в программе CytExpert. Рис. 16. Интенсивность флуоресценции (по медиане) AlexaFluor 488, которым были мечены α10 субъединицы нХР нейтрофилов, в разных группах клеток # – отличия от контрольной группы мышей, р<0.05 На основе обработанных данных мы выявили статистически значимое повышение уровня экспрессии α10 субъединицы нХР в нейтрофилах костного мозга (р=0.026) и нейтрофилах перитонеальной полости (р=0.01) мышей с воспалением по сравнению с нейтрофилами 58 костного мозга мышей

контрольной группы. Это свидетельствует о влиянии воспаления на количество α10 нХР в нейтрофилах. Возможно, экспрессия α10 нХР необходима для регуляции защитных функций нейтрофилов при развитии воспаления. 59

Глава 4. Обсуждение 4.1. Участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в адгезии и продукции АФК нейтрофилов Развитие воспаления у мышей, вызванное инъекцией суспензии зимозана в брюшную полость, приводит к уменьшению количества гранулоцитов в костном мозге и увеличению – в очаге воспаления (перитонеальная полость), по сравнению с показателями контрольной группы мышей, которым в брюшную полость вводили физраствор. Можно предположить, что развитие воспаления приводит к миграции гранулоцитов из костного мозга в кровеносное русло, а затем в брюшную полость, к месту повреждения. Рис. 17. Схема участия α7, α3β2 и α9α10 нХР в адгезии и продукции АФК нейтрофилов костного мозга мыши, стрелками указаны полученные для данных типов нХР результаты (рисунок составлен на основе статей: Zouridakis M. et al., 2019; Fujii T. et al., 2017; Sambasivarao S.V. et al., 2014). 60

Никотин (0.01–100 μМ), экзогенный природный агонист нХР, способствует повышению уровня адгезии нейтрофилов костного мозга мышей, находящихся в нормальном физиологическом состоянии, и мышей с воспалением, по сравнению с уровнем адгезии интактных клеток. Причем при низкой концентрации никотина (0.01 μМ) наблюдались статистически значимые отличия между двумя группами мышей, что свидетельствует о влиянии воспаления на метаболизм нейтрофилов, регулирующий экспрессию нХР. В действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши было обнаружено участие α7, α3β2 и α9α10 нХР как в контрольной группе, так и в группе с воспалением (рис. 17, красные стрелки). Были выявлены статистически значимые отличия между группами мышей в действии никотина в присутствии соответствующих антагонистов. Эти данные также подтверждают модулирующее влияние воспаления на содержание данных типов нХР в нейтрофилах костного мозга мыши. В низкой концентрации (0.01 μМ) никотин не влияет на продукцию АФК нейтрофилов костного мозга мыши, в более высокой (1 μМ) – незначительно повышает (менее 15%), а при действии 100 μМ никотина показатель становится ниже уровня продукции АФК интактными клетками. Статистически значимых отличий между контрольной и «воспалительной» группами мышей обнаружено не было. Полученные данные о влиянии исследуемых антагонистов на действие никотина, модулирующего продукцию АФК нейтрофилами, не позволяют выявить участие в этом процессе α7, α3β2 и α9α10 нХР (рис. 17, перечеркнутые черные стрелки). 4.2. Участие сигнальных молекул в адгезии и продукции АФК нейтрофилов Для изучения участия G-белков, ПКС, PI3K, ROCK и РТК в действии никотина на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мыши мы использовали специфические ингибиторы (РТХ, стауроспорин, 61

вортманнин, Y27632 и тирфостин соответственно). Сначала было оценено непосредственное влияние данных ингибиторов на исследуемые функции нейтрофилов. Было обнаружено, что гетеротримерные G-белки, ПКС, PI3K и ROCK участвуют в регуляции неспецифической адгезии нейтрофилов костного мозга мышей контрольной группы с отрицательным знаком, так как их ингибирование приводило к усилению адгезии (рис. 18). Полученные результаты об участии G-белков, ПКС, PI3K и ROCK в адгезии нейтрофилов согласуются с данными литературы (Bouti P. et al., 2021; Lorusso G. et al., 2020; Barber T. et al., 2014; Lee S. et al, 2014; Huveneers S., Danen E.H.J., 2009; Parsons J.T., 2003). Кроме того, участие ПКС наблюдалось и в группе мышей с воспалением, но статистически значимых различий между группами не обнаружено. Также было выявлено отсутствие влияния G-белков, ПКС, PI3K и ROCK на адгезию нейтрофилов группы мышей с воспалением может свидетельствовать. Рис. 18. Общая схема внутриклеточных сигнальных путей от интегринов при реализации клеточной адгезии, цветом обозначены компоненты, которые в соответствии с полученными результатами участвуют в регуляции адгезии нейтрофилов костного мозга мыши (рисунок подготовлен на основе статей: Bouti P. et al., 2021; Lorusso G. et al., 2020; Barber T. et al., 2014; Lee S. et al, 2014; Huveneers S., Danen E.H.J., 2009; Parsons J.T., 2003) 62

Было выявлено, что в нейтрофилах костного мозга мышей обеих групп PI3K и РТК участвуют в регуляции продукции АФК, инициированной активацией FPR2 с помощью WKYMVM. Так как ингибиторы данных сигнальных молекул вызывали понижение уровня продукции АФК нейтрофилами по сравнению с интактными клетками (рис. 19), то можно сделать вывод, что PI3K и РТК осуществляют положительную регуляцию продукцию АФК нейтрофилами. Кроме того, в контрольной группе мышей было обнаружено участие ROCK в качестве положительного регулятора активности НАДФН-оксидазы нейтрофилов костного мозга, в то время как в группе мышей с воспалением участия ROCK выявлено не было. Это свидетельствует о том, что воспаление приводит к ингибированию ROCK, участвующей в регуляции продукции АФК нейтрофилами костного мозга мыши. Рис. 19. Общая схема внутриклеточных сигнальных путей от формилпептидного рецептора 2 типа при реализации респираторного взрыва нейтрофилов. Цветом обозначены сигнальные компоненты, участвующие в регуляции дыхательного взрыва нейтрофилов костного мозга мыши, в соответствии с полученными результатами (рисунок подготовлен на основе статей: Cattaneo M. et al., 2013; Ciz M. et al., 2012). Полученные результаты по участию PI3K в регуляции продукции АФК нейтрофилами костного мозга мыши показаны впервые, в то время как 63

результаты по РТК и ROCK согласуются с данными литературы (Сattaneo M. et al., 2013; Ciz M. et al., 2012). 4.3. Участие сигнальных молекул в действии никотина на адгезию и продукцию АФК нейтрофилов. В действии никотина на адгезию и продукцию АФК нейтрофилов костного мозга мышей контрольной и «воспалительной групп» было обнаружено участие ROCK (рис. 20). Кроме того, в обеих группах мышей было выявлено участие гетеротримерных G-белков и ПКС в действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга. В действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга в контрольной группе мышей было найдено участие ПКС и ROCK, а в группе мышей с воспалением – РТК, ROCK и PI3K. Рис. 20. Общая схема сигнальных путей от нХР в клетках нервной системы. Цветом показаны сигнальные компоненты, участвующие в модифицирующем действии никотина на функции нейтрофилов костного мозга мыши согласно полученным результатам (рисунок подготовлен на основе литературных данных: Akaike A. et al., 2018; Cuoko J.A. et al., 2016; Wu С.H. et al, 2011). 64

Таким образом, впервые было обнаружено, что в сигнализации от нХР нейтрофилов костного мозга участвуют такие сигнальные молекулы, как гетеротримерные G-белки, ПКС и ROCK в обеих группах мышей, а также PI3K и РТК в группе мышей с воспалением (рис. 20). 65

Заключение Как показано в более ранних исследованиях, функциональная активность нейтрофилов модулируется активацией нХР (Safronova V.G. et al., 2021; Kanashiro A. et al., 2020; Reardon C. et al., 2018; Fujii T. et al., 2017; Safronova V.G. et al., 2016). В ходе нашей работы было выявлено, что никотин, агонист нХР, усиливает адгезию и понижает продукцию АФК нейтрофилов костного мозга мыши, если сравнивать с показателями интактных клеток. Статистически значимые отличия между контрольной и опытной группой свидетельствовали о влиянии системного воспалительного процесса в организме мышей на опосредованную нХР активность нейтрофилов. С помощью антагонистов, специфичных к определенным типам нХР, мы исследовали участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в действии никотина на адгезию и респираторный взрыв нейтрофилов костного мозга мыши. Для исследования роли сигнальных молекул в действии никотина на защитные функции нейтрофилов использовали селективные ингибиторы. Кроме того, мы оценили экспрессию гена субъединицы α10 нХР на уровне белка с помощью первичных антител, специфичных к α10 субъединице нХР, и вторичных антител, меченных флуоресцентным красителем, сигнал от которого регистрировали методом проточной цитометрии. В результате исследований были сделаны следующие выводы: 1) показано участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в регуляции адгезии нейтрофилов костного мозга мышей, находящихся в нормальном физиологическом состоянии, и мышей с воспалением; 2) участие α7, α3β2 и α9α10 нХР в продукции АФК нейтрофилами костного мозга мышей обеих групп выявлено не было; 3) показано присутствие α10 субъединиц нХР в нейтрофилах костного мозга мышей контрольной и опытной групп, а также в нейтрофилах брюшной полости мышей опытной группы; 4) выявлено участие гетеротримерных G-белков, ПКС и ROCK в действии никотина на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши; 66

5) обнаружено участие ПКС, РТК, PI3K и ROCK в действии никотина на продукцию АФК нейтрофилами костного мозга мыши. Полученные результаты могут помочь в объяснении двойного потенциала нейтрофилов, стимулированных агонистами нХР: возможно, определенная функция нейтрофилов регулируется конкретным набором типов нХР, и это приводит к иммуностимуляции или иммуносупрессии активности клеток. Например, в нашем исследовании на адгезию нейтрофилов костного мозга мыши влияют α7, α3β2 и α9α10 нХР, однако в продукции АФК участия данных типов нХР выявлено не было. Возможно, в продукции АФК нейтрофилами участвуют другие типы нХР, изучением влияния которых предстоит заняться в дальнейшем. Как показали наши исследования, механизм действия никотина на функциональную активность нейтрофилов может опосредоваться такими сигнальными молекулами, как гетеротримерные G-белки, ПКС, РТК, PI3K и ROCK, причем развитие воспаления у мышей влияет на регуляторную роль данных молекул. Дальнейшее изучение закономерностей и механизмов участия определенных типов нХР в регуляции функций нейтрофилов может помочь в разработке новых подходов к лечению воспалительных заболеваний и развитию терапевтических стратегий против иммунопатологий, связанных с нарушениями активности нейтрофилов. 67

Список литературы 1. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. 2009. Т. 49. С. 341–388. 2. Инструкция по использованию проточного цитометра на платформе CytoFLEX. Beckman Coulter, Inc. США. Кат. № B67284AG. 2019 . С. 642. 3. Кашеверов И.Е., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. α-нейротоксины и α- конотоксины − блокаторы никотиновых холинорецепторов // Биоорганическая химия. 1999. Т. 25. C. 310. 4. Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Никотин и его рецепторы − о вредном и полезном // Природа. 2012. Т. 4. С. 23–30. 5. Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. α-конотоксины в исследовании структуры и функций никотиновых рецепторов // Успехи биологической химии. 2009. Т. 49. С. 275–318. 6. Новиков В.В., Добротина Н.А., Бабаев А.А. Иммунология: учебное пособие. Нижний Новгород: ННГУ, 2004. 212 с. 7. Пендель А.А. Большой справочник анализов. Изд. КСД: Харьков. 2014. С. 480. 8. Покровский В.М., Коротько Г.Ф. Физиология человека: учебник, 2-е изд., перераб. и доп. Москва: изд. Медицина. 2007. С. 656. 9. Протокол Комиссии по уходу и использованию животных. Пущино: ИБК РАН, 2006. Рег. №12306. С. 12. 10. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине. Медицинская Иммунология: СПб РО РААКИ. 2007. Т. 9. № 4-5. С. 373–378. 11. Черешнев В.А., Шмагель К.В. Иммунология: учебник. 4-е изд., перераб. и доп. Москва: НП «Центр стратегического партнерства». 2014. С. 520. 12. Abe C. et al. C1 neurons mediate a stress-induced anti-inflammatory reflex in mice // Nat Neurosci. 2017. V. 20. № 5. P. 700–707. 13. Akaike A., Shimohama S., Misu Y. Nicotinic Acetylcholine Receptor Signaling in Neuroprotection. Springer Nature. 2018. P. 196. 68

14. Arias H. R., Bhumireddy P. Anesthetics as chemical tools to study the structure and function of nicotinic acetylcholine receptors // Curr Protein Pept Sci. 2005. V. 6. № 5. P. 451–472. 15. Barber T. et al. Vitamin a deficiency and alterations in the extracellular matrix // Nutrients. 2014. V. 6. № 11. P. 4984–5017. 16. Benhammou K. et al. [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is correlated with the number of cigarettes smoked per day // Neuropharmacology. 2000. V. 39. № 13. P. 2818–2829. 17. Bhattacharya A. et al. Uropathic observations in mice expressing a constitutively active point mutation in the 5-HT3A receptor subunit // J Neurosci. 2004. V. 24. № 24. P. 5537–5548. 18. Borovikova L. V. et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin // Nature. 2000. V. 405. № 6785. P. 458–462. 19. Bouti P. et al. β2 Integrin Signaling Cascade in Neutrophils: More Than a Single Function // Front Immunol. 2020. V. 11. P. 619925. 20. Bouzat C. et al. Coupling of agonist binding to channel gating in an ACh- binding protein linked to an ion channel // Nature. 2004. V. 430. № 7002. P. 896– 900. 21. Boxio R. et al. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils // J Leukoc Biol. 2004. V. 75. № 4. P. 604–611. 22. Brejc K. et al. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand- binding domain of nicotinic receptors // Nature. 2001. V. 411. № 6835. P. 269–276. 23. Burgen A. S. The background of the muscarinic system // Life Sci. 1995. V. 56. № 11–12. P. 801–806. 24. Campos-Caro A. et al. A single residue in the M2-M3 loop is a major determinant of coupling between binding and gating in neuronal nicotinic receptors // Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. V. 93. № 12. P. 6118–6123. 25. Cao L., Malon J. T. Anti-nociceptive Role of CXCL1 in a Murine Model of Peripheral Nerve Injury-induced Neuropathic Pain // Neuroscience. 2018. V. 372. P. 225–236. 69

26. Cash J. L., White G. E., Greaves D. R. Chapter 17. Zymosan-induced peritonitis as a simple experimental system for the study of inflammation // Methods Enzymol. 2009. V. 461. P. 379–396. 27. Cattaneo F., Parisi M., Ammendola R. Distinct signaling cascades elicited by different formyl peptide receptor 2 (FPR2) agonists // Int J Mol Sci. 2013. V. 14. № 4. P. 7193–7230. 28. Chang Y., Huang Y., Whiteaker P. Mechanism of Allosteric Modulation of the Cys-loop Receptors // Pharmaceuticals (Basel). 2010. V. 3. № 8. P. 2592–2609. 29. Changeux J.P., Taly A. Nicotinic receptors, allosteric proteins and medicine // Trends Mol. Med. 2008. V.14. P.93–102. 30. Charnet P. et al. An open-channel blocker interacts with adjacent turns of alpha-helices in the nicotinic acetylcholine receptor // Neuron. 1990. V. 4. № 1. P. 87–95. 31. Chi S.-W. et al. Solution conformation of alpha-conotoxin GIC, a novel potent antagonist of alpha3beta2 nicotinic acetylcholine receptors // Biochem J. 2004. V. 380. № Pt 2. P. 347–352. 32. Ciz M. et al. Flavonoids inhibit the respiratory burst of neutrophils in mammals // Oxid Med Cell Longev. 2012. V. 2012. P. 181295. 33. Corradi J., Bouzat C. Understanding the Bases of Function and Modulation of α7 Nicotinic Receptors: Implications for Drug Discovery // Mol Pharmacol. 2016. V. 90. № 3. P. 288–299. 34. Cuoco J.A., Fennie C.N., Cheriyan G.K. The Cholinergic Anti-Inflammatory Pathway: A Novel Paradigm for Translational Research in Neuroimmunology // J. of Neurol. and Neurosci. 2016. V. 7. P. 1–7. 35. Giovangiulio M. et al. Vagotomy affects the development of oral tolerance and increases susceptibility to develop colitis independently of the alpha-7 nicotinic receptor // Mol Med. 2016. V. 22. P. 464–476. 36. De Planque M. R. R. et al. The alphaM1 transmembrane segment of the nicotinic acetylcholine receptor interacts strongly with model membranes // Magn Reson Chem. 2004. V. 42. № 2. P. 148–154. 70

37. Ellison M. et al. Alpha-RgIA: a novel conotoxin that specifically and potently blocks the alpha9alpha10 nAChR // Biochemistry. 2006. V. 45. № 5. P. 1511–1517. 38. Filatov G. N., White M. M. The role of conserved leucines in the M2 domain of the acetylcholine receptor in channel gating // Mol Pharmacol. 1995. V. 48. № 3. P. 379–384. 39. Filina J. V., Gabdoulkhakova A. G., Safronova V. G. RhoA/ROCK downregulates FPR2-mediated NADPH oxidase activation in mouse bone marrow granulocytes // Cell Signal. 2014. V. 26. № 10. P. 2138–2146. 40. Fujii T. et al. Localization and synthesis of acetylcholine in human leukemic T cell lines // J Neurosci Res. 1996. V. 44. № 1. P. 66–72. 41. Fujii T. et al. Expression and Function of the Cholinergic System in Immune Cells // Front Immunol. 2017. V. 8. P. 1085. 42. Gahring L. C., Rogers S. W. Neuronal nicotinic acetylcholine receptor expression and function on nonneuronal cells // AAPS J. 2006. V. 7. № 4. P. E885894. 43. Galea I., Bechmann I., Perry V. H. What is immune privilege (not)? // Trends Immunol. 2007. V. 28. № 1. P. 12–18. 44. Gotti C. et al. Heterogeneity and complexity of native brain nicotinic receptors // Biochem Pharmacol. 2007. V. 74. № 8. P. 1102–1111. 45. Henderson B.J., Lester H.A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs // Neuropharmacol. 2015. V. 96. P. 178–193. 46. Hilgers J. et al. Genetic differences in BALB/c sublines // Curr Top Microbiol Immunol. 1985. V. 122. P. 19–30. 47. Hogg R. C., Raggenbass M., Bertrand D. Nicotinic acetylcholine receptors: from structure to brain function // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003. V. 147. P. 1–46. 48. Hoover D. B. Cholinergic modulation of the immune system presents new approaches for treating inflammation // Pharmacol Ther. 2017. V. 179. P. 1–16. 49. Hosseinzadeh A. et al. Nicotine induces neutrophil extracellular traps // J Leukoc Biol. 2016. V. 100. № 5. P. 1105–1112. 71

50. Huveneers S., Danen E. H. J. Adhesion signaling - crosstalk between integrins, Src and Rho // J Cell Sci. 2009. V. 122. № Pt 8. P. 1059–1069. 51. Iho S. et al. Nicotine induces human neutrophils to produce IL-8 through the generation of peroxynitrite and subsequent activation of NF-kappaB // J Leukoc Biol. 2003. V. 74. № 5. P. 942–951. 52. Inoue T. et al. Vagus nerve stimulation mediates protection from kidney ischemia-reperfusion injury through α7nAChR+ splenocytes // J Clin Invest. 2016. V. 126. № 5. P. 1939–1952. 53. Kanashiro A. et al. The role of neutrophils in neuro-immune modulation // Pharmacol Res. 2020. V. 151. P. 104580. 54. Karlin A. et al. The arrangement of the subunits of the acetylcholine receptor of Torpedo californica // J Biol Chem. 1983. V. 258. № 11. P. 6678–6681. 55. Kawashima K., Fujii T. The lymphocytic cholinergic system and its biological function // Life Sci. 2003. V. 72. № 18–19. P. 2101–2109. 56. Kawashima K. et al. Presence of acetylcholine in human blood and its localization in circulating mononuclear leukocytes // Biog Amines. 1993. V. 9. P. 251–258 57. Lebargy F. et al. Tobacco smoking induces expression of very-high-affinity nicotine binding sites on blood polymorphonuclear cells // Am J Respir Crit Care Med. 1996. V. 153. № 3. P. 1056–1063. 58. Lebbe E. K. M. et al. Conotoxins targeting nicotinic acetylcholine receptors: an overview // Mar Drugs. 2014. V. 12. № 5. P. 2970–3004. 59. Lee S. et al. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: a prerequisite for cell therapy // Oxid Med Cell Longev. 2015. V. 2015. P. 632902. 60. Lee W. Y., Free C. R., Sine S. M. Binding to gating transduction in nicotinic receptors: Cys-loop energetically couples to pre-M1 and M2-M3 regions // J Neurosci. 2009. V. 29. № 10. P. 3189–3199. 61. Liew P. X., Kubes P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease // Physiol Rev. 2019. V. 99. № 2. P. 1223–1248. 72

62. Lindstrom J. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors // Ion Channels. 1996. V. 4. P. 377–450. 63. Lorusso G., Rüegg C., Kuonen F. Targeting the Extra-Cellular Matrix-Tumor Cell Crosstalk for Anti-Cancer Therapy: Emerging Alternatives to Integrin Inhibitors // Front Oncol. 2020. V. 10. P. 1231. 64. McIntosh J. M. et al. Alpha-conotoxin GIC from Conus geographus, a novel peptide antagonist of nicotinic acetylcholine receptors // J Biol Chem. 2002. V. 277. № 37. P. 33610–33615. 65. Millar N. S., Gotti C. Diversity of vertebrate nicotinic acetylcholine receptors // Neuropharmacology. 2009. V. 56. № 1. P. 237–246. 66. Millar N. S., Harkness P. C. Assembly and trafficking of nicotinic acetylcholine receptors (Review) // Mol Membr Biol. 2008. V. 25. № 4. P. 279–292. 67. Mullaly S. C., Kubes P. Mast cell-expressed complement receptor, not TLR2, is the main detector of zymosan in peritonitis // Eur J Immunol. 2007. V. 37. № 1. P. 224–234. 68. Nauseef W. M., Borregaard N. Neutrophils at work // Nat Immunol. 2014. V. 15. № 7. P. 602–611. 69. Navarini A. A. et al. Innate immune-induced depletion of bone marrow neutrophils aggravates systemic bacterial infections // Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. V. 106. № 17. P. 7107–7112. 70. Nessel C. C. et al. Vestigial respiratory burst activity in wound macrophages // Am J Physiol. 1999. V. 276. № 6. P. R1587-1594. 71. Ni Y. F. et al. Protective effect of nicotine on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice // Respiration. 2011. V. 81. № 1. P. 39–46. 72. Norton R. S., Olivera B. M. Conotoxins down under // Toxicon. 2006. V. 48. № 7. P. 780–798. 73. Ohtsuka T. Entero-Behçet’s disease coexisting with long-term epilepsy and schizophrenia-like symptoms // J Dermatol. 2014. V. 41. № 5. P. 424–426. 74. Pabst M. J. et al. Inhibition of neutrophil and monocyte defensive functions by nicotine // J Periodontol. 1995. V. 66. № 12. P. 1047–1055. 73

75. Pabst O., Mowat A. M. Oral tolerance to food protein // Mucosal Immunol. 2012. V. 5. № 3. P. 232–239. 76. Panicker S. et al. Evidence for a centrally located gate in the pore of a serotonin-gated ion channel // J Neurosci. 2002. V. 22. № 5. P. 1629–1639. 77. Parsons J. T. Focal adhesion kinase: the first ten years // J Cell Sci. 2003. V. 116. № Pt 8. P. 1409–1416. 78. Pavlov V. A., Tracey K. J. The cholinergic anti-inflammatory pathway // Brain Behav Immun. 2005. V. 19. № 6. P. 493–499. 79. Pinho-Ribeiro F. A. et al. Blocking Neuronal Signaling to Immune Cells Treats Streptococcal Invasive Infection // Cell. 2018. V. 173. № 5. P. 1083- 1097. 80. Razani-Boroujerdi S. et al. T cells express alpha7-nicotinic acetylcholine receptor subunits that require a functional TCR and leukocyte-specific protein tyrosine kinase for nicotine-induced Ca2+ response // J Immunol. 2007. V. 179. № 5. P. 2889–2898. 81. Reardon C., Murray K., Lomax A. E. Neuroimmune Communication in Health and Disease // Physiol Rev. 2018. V. 98. № 4. P. 2287–2316. 82. Rinner I., Kawashima K., Schauenstein K. Rat lymphocytes produce and secrete acetylcholine in dependence of differentiation and activation // J Neuroimmunol. 1998. V. 81. № 1–2. P. 31–37. 83. Safronova V. G. et al. Nicotinic receptor involvement in regulation of functions of mouse neutrophils from inflammatory site // Immunobiology. 2016. V. 221. № 7. P. 761–772. 84. Safronova V. G. et al. α9α10 nicotinic acetylcholine receptors regulate murine bone marrow granulocyte functions // Immunobiology. 2021. V. 226. № 1. P. 152047. 85. Sambasivarao S. V. et al. Acetylcholine promotes binding of α-conotoxin MII at α3 β2 nicotinic acetylcholine receptors // Chembiochem. 2014. V. 15. № 3. P. 413– 424. 86. Seow W. K. et al. Nicotine-induced release of elastase and eicosanoids by human neutrophils // Inflammation. 1994. V. 18. № 2. P. 119–127. 74

87. Sônego F. et al. Paradoxical Roles of the Neutrophil in Sepsis: Protective and Deleterious // Front Immunol. 2016. V. 7. P. 155. 88. Speer P. et al. Effects of nicotine on intercellular adhesion molecule expression in endothelial cells and integrin expression in neutrophils in vitro // Am J Obstet Gynecol. 2002. V. 186. № 3. P. 551–556. 89. Steen K. H. et al. Protons selectively induce lasting excitation and sensitization to mechanical stimulation of nociceptors in rat skin, in vitro // J Neurosci. 1992. V. 12. № 1. P. 86–95. 90. Thompson A. J., Lester H. A., Lummis S. C. R. The structural basis of function in Cys-loop receptors // Q Rev Biophys. 2010. V. 43. № 4. P. 449–499. 91. Tikhonov D. B., Mellor I. R., Usherwood P. N. R. Modeling noncompetitive antagonism of a nicotinic acetylcholine receptor // Biophys J. 2004. V. 87. № 1. P. 159–170. 92. Tortora G.J., Derrickson B.H., Derrickson B. Principles of Anatomy ana Physiology // John Wiley&SonsInc. 2008. P. –1281. 93. Unwin N. et al. Activation of the nicotinic acetylcholine receptor involves a switch in conformation of the alpha subunits // J Mol Biol. 2002. V. 319. № 5. P. 1165–1176. 94. Unwin N. Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A resolution // J Mol Biol. 2005. V. 346. № 4. P. 967–989. 95. Vincler M. et al. Molecular mechanism for analgesia involving specific antagonism of alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103. № 47. P. 17880–17884. 96. Westerloo D. J. van et al. The cholinergic anti-inflammatory pathway regulates the host response during septic peritonitis // J Infect Dis. 2005. V. 191. № 12. P. 2138–2148. 97. Wilson E. H., Weninger W., Hunter C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system // J Clin Invest. 2010. V. 120. № 5. P. 1368–1379. 98. Wu. C.H., Lee C.H., Ho Y.S. Nicotinic Acetylcholine Receptor-Based Blockade: Applications of Molecular Targets for Cancer Therapy // Clin. Cancer Res. 75

V. 17. P. 3533–3541. 99. Yu H. et al. Nicotine-induced differential modulation of autoimmune arthritis in the Lewis rat involves changes in interleukin-17 and anti-cyclic citrullinated peptide antibodies // Arthritis Rheum. 2011. V. 63. № 4. P. 981–991. 100. Zouridakis M. et al. Crystal Structure of the Monomeric Extracellular Domain of α9 Nicotinic Receptor Subunit in Complex With α-Conotoxin RgIA: Molecular Dynamics Insights Into RgIA Binding to α9α10 Nicotinic Receptors // Front Pharmacol. 2019. V. 10. P. 474. 76

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Элина Жирова

Отзыв научного руководителя, в.н.с., к.б.н. Сафроновой Валентины Григорьевны, о научной работе Жировой Элины Андреевны, магистранта ПущГЕНИ.

почти 3 года назад

Рецензия от Элина Жирова

Рецензия к.б.н. Авхачевой Надежды Владимировны, старшего инспектора по кадрам Института биологического приборостроения РАН, на магистерскую диссертацию Жировой Элины Андреевны на тему "Регуляция функций гранулоцитов никотиновыми холинорецепторыми".

почти 3 года назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв