РОЛЬ ГАМКВ РЕЦЕПТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЭПИЛЕПТИФОРМНОЙ АКТИВНОСТИ В 4-АМИНОПИРИДИНОВОЙ МОДЕЛИ НА ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗАХ МОЗГА КРЫСЫ

Александра Полякова

РОЛЬ ГАМКВ РЕЦЕПТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЭПИЛЕПТИФОРМНОЙ АКТИВНОСТИ В 4-АМИНОПИРИДИНОВОЙ МОДЕЛИ НА ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗАХ МОЗГА КРЫСЫ

Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний центральной нервной системы, от которого страдают более 50 миллионов людей всех возрастных групп. Более того, в Европе около 30% случаев эпилепсии остаются резистентны к доступным на данный момент фармакологическим противосудорожным препаратам. В связи с этим, проблема лечения эпилепсии и поиск новых фармакологических мишеней являются актуальными задачами для науки и медицины. Патогенез эпилепсии характеризуется дисбалансом между возбуждением и торможением в головном мозге. Главным возбуждающим медиатором в ЦНС является глутамат, тогда как за распространение торможения в головном мозге ответственна преимущественно гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). В данной работе оценивалось влияние ГАМКВ рецепторов на протекание эпилептиформной активности в 4-аминопиридиновой модели in vitro. Для достижения поставленной цели был проведен ряд экспериментов: регистрация эпилептиформной активности, анализ парного отношения вызванных возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ), и миниатюрных событий. Было обнаружено, что активация ГАМКB рецепторов (ГАМКВ-Р) оказывает выраженное противоэпилептическое действие в 4-аминопиридиновой модели in vitro, снижая длительность и частоту иктальных разрядов. Агонист ГАМКВ-Р SKF97541 вызывал уменьшение амплитуды постсинаптических ответов и увеличение значения коэффициента парных импульсов, что свидетельствует о его значительном влиянии на пресинаптически-локализованные рецепторы. При этом тест с парными импульсами не показал достоверных изменений в амплитуде ответов и парном отношении при аппликации блокатора ГАМКВ-Р CGP55845, что говорит о низкой фоновой активности пресинаптических ГАМКВ рецепторов. При записи миниатюрных событий ни агонист, ни антагонист ГАМКВ-Р не изменяли амплитуду, время нарастания и τ спада миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов (мВПСТ). Однако, CGP55845 увеличивал частоту возникновения мВПСТ, а SKF97541 уменьшал её.

Биотехнология

Дипломы

Вуз: Санкт-Петербургский государственный политехнический университет (ФГБОУ ВПО «СПбГПУ»)

ID: 60c882aee4dde500012f2383

UUID: 785289b0-aff3-0139-320f-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 6

10.62

Александра Полякова

Комментировать 1

Рецензировать 0

Скачать - 955,4 КБ

Поделиться работой

Министерство образования и науки Российской Федерации Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого Институт биомедицинских систем и биотехнологий Высшая школа биомедицинских систем и технологий Работа допущена к защите Директор Высшей Школы ___________ О.Л. Власова «___»_____________2021 г. ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА РОЛЬ ГАМКВ РЕЦЕПТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЭПИЛЕПТИФОРМНОЙ АКТИВНОСТИ В 4-АМИНОПИРИДИНОВОЙ МОДЕЛИ НА ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗАХ МОЗГА КРЫСЫ по направлению 16.03.01 «Техническая физика» по образовательной программе 16.03.01_06 «Медицинская и биоинженерная физика» Выполнила: студентка гр. 4731601/70602 А.П. Полякова Руководитель: доц. ВШБСиТ ИБСиБ, к.б.н., доц. Т.Ю. Постникова Консультант: н.с. ФГБУН ИЭФБ РАН, к.б.н. С.Л. Малкин Консультант по нормоконтролю: доц. ВШБСиТ ИБСиБ, к. ф.-м. н. В.П. Октябрьский Санкт-Петербург 2021

РЕФЕРАТ На 42 с., 7 рисунков КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: АМИНОПИРИДИНОВАЯ ВИСОЧНАЯ МОДЕЛЬ ЭПИЛЕПСИЯ; ВИСОЧНОЙ 4- ЭПИЛЕПСИИ; ЭПИЛЕПТИФОРМНАЯ АКТИВНОСТЬ; ПРЕ- И ПОСТСИНАПТИЧЕСКИЕ ГАМКВ РЕЦЕПТОРЫ; ЭНТОРИНАЛЬНАЯ КОРА; ПЕРЕЖИВАЮЩИЕ СРЕЗЫ МОЗГА КРЫСЫ. Тема выпускной квалификационной работы: «Роль ГАМКВ рецепторов в формировании эпилептиформной активности в 4-аминопиридиновой модели на переживающих срезах мозга крысы». В данной работе оценивалось влияние ГАМКВ рецепторов на протекание эпилептиформной активности в 4-аминопиридиновой модели in vitro. Для достижения поставленной цели был проведен ряд экспериментов: регистрация эпилептиформной активности, анализ парного отношения вызванных возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ), и миниатюрных событий. Было обнаружено, что активация ГАМКB рецепторов (ГАМКВ-Р) оказывает выраженное противоэпилептическое действие в 4- аминопиридиновой модели in vitro, снижая длительность и частоту иктальных разрядов. Агонист ГАМКВ-Р SKF97541 вызывал уменьшение амплитуды постсинаптических ответов и увеличение значения коэффициента парных импульсов, что свидетельствует о его значительном влиянии на пресинаптически-локализованные рецепторы. При этом тест с парными импульсами не показал достоверных изменений в амплитуде ответов и парном отношении при аппликации блокатора ГАМКВ-Р CGP55845, что говорит о низкой фоновой активности пресинаптических ГАМКВ рецепторов. При записи миниатюрных событий ни агонист, ни антагонист ГАМК В-Р не изменяли амплитуду, время нарастания и τ спада миниатюрных возбуждающих

постсинаптических токов (мВПСТ). Однако, CGP55845 увеличивал частоту возникновения мВПСТ, а SKF97541 уменьшал её. ABSTRACT 42 pages, 7 figures KEYWORDS: MODEL OF TEMPORAL EPILEPSY; LOBE EPILEPSY; EPILEPTIFORM 4-AMINOPYRIDINE ACTIVITY; PRE- AND POSTSYNAPTIC GABAB RECEPTORS; ENTORHINAL CORTEX; ACUTE RAT`S BRAIN SLICES. The subject of the graduate qualification work is “The role of GABA B receptors in formation of epileptiform activity in 4-aminopyridine model on acute rat`s brain slices”. In this work, the influence of GABAB receptors on the epileptiform activity in a 4-aminopyridine model of epilepsy in vitro was evaluated. To achieve this goal, several experiments were carried out: the registration of the epileptiform activity, paired pulse test, and the miniature events analysis. It was found that the activation of GABAB-receptors (GABAB-R) has a pronounced antiepileptic effect in the 4-aminopyridine model in vitro, reducing the duration and frequency of the ictal discharges. The GABAB-R agonist SKF97541 reduced the amplitude of the postsynaptic responses and increased the paired pulse ratio (PPR), which indicates its significant effect on the presynaptic GABAB receptors. In contrast, the application of the GABAB-R blocker CGP55845 did not affect the paired pulse ratio of the postsynaptic current amplitudes, which suggest the low levels of background activity of the presynaptic GABA B receptors. Miniature event analysis have shown that neither the GABA B-R agonist, nor the antagonist, changed the amplitude, rise time, or decay τ of the miniature excitatory postsynaptic

currents (mEPSC). However, CGP55845 increased the mEPSC frequency, while SKF97541 decreased it.

5 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................. 7 ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................... 8 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................. 12 1.1. Височная эпилепсия................................................................................ 12 1.1.1. Механизмы и причины возникновения эпилепсии ....................... 12 1.2. In vitro модели эпилептиформной активности .................................... 13 1.2.1. 4-аминопиридиновая модель эпилептиформной активности ...... 14 1.3. Энторинальная кора. Строение и роль в эпилептогенезе ................... 15 1.4. ГАМКВ рецепторы. Строение и роль в развитии эпилепсии ............. 16 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................... 19 2.1. Приготовление переживающих срезов мозга крыс ............................. 19 2.2. 4-аминопиридиновая модель эпилептиформной активности ............ 20 2.3. Электрофизиологические методы исследования ................................ 20 2.3.1. Метод локальной фиксации потенциала ........................................ 20 2.3.2. Парная стимуляция ........................................................................... 23 2.3.3. Миниатюрные ответы ...................................................................... 25 2.4. Статистическая обработка данных ....................................................... 26 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ................................................ 27 3.1. Влияние агониста и антагониста ГАМКВ рецепторов на параметры эпилептиформной активности .............................................................................. 27 3.2. Влияние антагониста и агониста ГАМКВ рецепторов на парное отношение ............................................................................................................... 29

6 3.3. Влияние антагониста и агониста ГАМКВ рецепторов на миниатюрные события .......................................................................................... 32 ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................... 37 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................ 38

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЭ – височная эпилепсия ГАМК – гамма-аминомасляная кислота ГАМКА – рецептор гамма-аминомасляной кислота типа А ГАМКВ – рецептор гамма-аминомасляной кислоты типа В ГАМКВ-Р – рецепторы гамма-аминомасляной кислоты типа В ИПСП – ингибирующий постсинаптический потенциал ИР – иктальные разряды ИИР – интериктальные разряды ИСМЖ – искусственная спинномозговая жидкость мВПСТ – миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи ЦНС – центральная нервная система АМРАR – рецепторы α-амино-3-гидрокси-5-метил-4- изоксазолпропионовой кислоты GIRK - G-белок-связанные калиевые каналы внутреннего выпрямления (от G protein-activated inwardly-rectifying K+ channels) NMDAR – N-метил-D-аспартатные рецепторы ТТХ – тетродотоксин (от tetrodotoxin) 4-AP – 4-аминопиридин (от 4-aminopyridine)

8 ВВЕДЕНИЕ Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний центральной нервной системы, от которого страдают более 70 миллионов людей всех возрастных групп [12, 14, 17, 37]. Более того, в Европе около 30% случаев эпилепсии остаются резистентны к доступным на данный момент фармакологическим противосудорожным препаратам [12, 18, 42]. В связи с этим, проблема лечения эпилепсии и поиск новых фармакологических мишеней являются актуальными задачами для науки и медицины, поэтому исследование данного заболевания, его механизмов развития и возникновения на молекулярном уровне было выбрано для выпускной квалификационной работы бакалавра. Удобными для исследования эпилепсии на молекулярном уровне являются in vitro модели эпилепсии [4, 12], благодаря которым с помощью электрофизиологических методов можно получать записи эпилептиформной активности. Такая активность характеризуется наличием коротких интериктальных и длительных (более 30 с) иктальных разрядов. Патогенез эпилепсии характеризуется дисбалансом между возбуждением и торможением в головном мозге [8, 13, 14, 16, 18, 34, 37, 42]. Главным возбуждающим медиатором в ЦНС является глутамат, тогда как за распространение торможения в головном мозге ответственна преимущественно гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). ГАМК распространяет тормозные сигналы в головном мозге, воздействуя на ионотропные ГАМКА и метаботропные ГАМКВ рецепторы [8, 13, 14, 18]. Ионотропные рецепторы ответственны за быстрый ингибирующий постсинаптический потенциал (ИПСП) [13, 14, 20, 23, 27, 36] и расположены в основном на постсинаптической мембране, тогда как ГАМКВ рецепторы регулируют высвобождение нейротрансмиттера, опосредуют более медленный ИПСП, и находятся как на пре-, так и на постсинаптической мембране

9 нейронов соответственно [8, 13, 14, 20, 24, 25, 36]. Традиционно считается, что снижение функции ГАМКА рецепторов способствует нарушению тормозной нейротрансмиссии [14, 18, 27]. Таким образом, антагонисты ГАМКА рецепторов использовались для имитации некоторых характеристик эпилептической активности, а их агонисты являются антиконвульсантами [14, 23]. Однако, нарушение ионного гомеостаза нейронов при эпилепсии может снижать эффективность торможения при активации ГАМКA рецепторов [8], поэтому избирательное воздействие на ГАМКB рецепторы может стать новой фармакологической стратегией для противосудорожной терапии. Кроме того, большое количество работ посвящено связи эпилепсии и ГАМКА рецепторов, тогда как роль ГАМКВ рецепторов в процесс эпилептогенеза изучена в меньшей степени. Таким образом, была поставлена следующая цель: оценить, как активность ГАМКB рецепторов влияет на протекание эпилептиформной активности в 4аминопиридиновой модели in vitro. Задачи, которые были поставлены для достижения цели: 1) Оценить эффект блокады ГАМКВ рецепторов на длительность и частоту возникновения иктальных разрядов. 2) Оценить эффект активации ГАМКВ рецепторов их агонистом на длительность и частоту возникновения иктальных разрядов. 3) Оценить эффект блокады и активации ГАМКВ рецепторов на вероятность выброса глутамата из пресинаптических окончаний в энторинальной коре. Материалы и методы. Для всех экспериментов использовались переживающие гиппокампэнторинальные горизонтальные срезы головного мозга крыс линии Вистар возраста 3-х недель. Для выполнения первых двух задач использовалась 4-

10 аминопиридиновая модель эпилепсии, заключающаяся в увеличении внеклеточной концентрации ионов K+ до 3,5 мМ, снижении концентрации ионов Mg2+ до 0,25 мМ, и добавлении конвульсанта 4-аминопиридина (200 мкМ). Такой раствор приводит к снижению порога возбуждения нейронов в срезе, и короткие интериктальные и длительные (более 30с) иктальные разряды (ИР) начинают генерироваться в нервной ткани [2, 4, 22]. Для регистрации эпилептиформной активности на одиночных нейронах энторинальной коры использовался метод локальной фиксации потенциала при -20 мВ. Для блокады ГАМКВ рецепторов использовался их селективный антагонист CGP55845 (5 мкМ), а для их активации - специфический агонист SKF-97541 (5 мкM). Контрольные записи в эпилептическом растворе длились от 60 минут. Перед добавлением в раствор блокатора или агониста, регистрировалась эпилептиформная активность клетки в контроле в течение 20–30 минут, затем после аппликации SKF-97541 или CGP55845 та же клетка регистрировалась ещё 30–45 минут. Оценивались частота и длительность иктальных разрядов в контроле и после добавления препаратов. Для достижения третьей задачи были использованы два экспериментальных подхода: метод парной стимуляции и анализ миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов (мВПСТ). Для выполнения парной стимуляции биполярный вольфрамовый электрод помещался в глубокие слои энторинальной коры, и через него подавались импульсы тока, длящиеся 0,1 мс, с интервалом 50 мс между ними. При этом на расстоянии 20–30 мкм от стимулирующего электрода производилась регистрация ответов с помощью метода локальной фиксации потенциала при -80 мВ в течение 5 минут. Зарегистрированные ответы представляли собой постсинаптические возбуждающие токи, опосредованные AMPA рецепторами глутамата. В экспериментах сравнивались коэффициенты парных импульсов и амплитуда ответов в контроле и при добавлении агониста или антагониста ГАМКВ-Р. Для регистрации мВПСТ, в циркулирующий раствор добавлялся блокатор

11 потенциалзависимых Na+ каналов тетродотоксин (0,5 мкМ), который подавлял генерацию потенциалов действия в нейронах. В результате, с помощью метода локальной фиксации потенциала при -80 мВ регистрировались миниатюрные события клетки на протяжении 5 минут. В экспериментах сравнивались изменения в частоте возникновения, амплитуде, времени нарастания, и τ спада мВПСТ в контроле и при аппликации блокатора или агониста ГАМКВ рецепторов. Статистическую обработку данных производили с помощью пакета SciPy (https://scipy.org/) для языка программирования Python. Научная новизна. Был проведен ряд экспериментов, чтобы не только оценить эффект блокады и активации ГАМКВ-Р на генерацию эпилептиформной активности, но и понять какова локализация рецепторов, опосредующих наблюдаемые эффекты. Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть учтены при разработке новых противосудорожных препаратов. Работа выполнена на базе Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М. Сеченова Российской Академии Наук (ИЭФБ РАН), в лаборатории молекулярных механизмов нейронных взаимодействий. Заведующий лабораторией А.В. Зайцев. Апробация результатов По теме работы были опубликованы тезисы в XXIV Международной медико-биологической научной конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2021).

12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Височная эпилепсия Эпилепсия – это патология центральной нервной системы (ЦНС), которая оказывает существенное влияние на жизнедеятельность больных, так как наличие судорог, сопутствующие психические расстройства и когнитивные нарушения, побочные эффекты лекарств, могут снижать качество жизни людей, страдающих данным заболеванием [9, 10, 15, 17, 39, 41]. При этом, височная эпилепсия (ВЭ) является наиболее распространенной формой рефрактерной фокальной эпилепсии (40% пациентов имеют данную форму заболевания) [15, 30, 35]. Эпилептическая активность при ВЭ возникает в структурах лобной доли: гиппокампе, миндалине, энторинальной коре, субикулуме [41]. 1.1.1. Механизмы и причины возникновения эпилепсии Эпилепсия характеризуется возникновением повторяющихся спонтанных эпилептических припадков, при которых развивается чрезмерная, синхронная нейрональная активность в головном мозге [5, 37]. При формировании такой активности в одной или нескольких локализованных областях, начало эпилептического приступа называется очаговым. Если же аномальная нейрональная активность развивается, имея широкое распространения в обоих полушариях, то в таком случае начало приступа является генерализованным [37]. Конкретные механизмы возникновения патологической синхронизированной нейрональной активности на данный момент изучены не полностью. Однако, одной из популярных и очевидных гипотез на данный момент является нарушение баланса между возбуждением и торможением в головном мозге [8, 14, 16, 18, 34, 37, 42]. Главным возбуждающим медиатором в ЦНС является глутамат, тогда как за распространение торможения в головном мозге ответственна преимущественно гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). Таким образом, к сверхактивации нервных клеток могут привести: 1)

13 чрезмерная активация глутаматергической передачи и/или 2) ослабление ГАМКергической нейротрасмиссии [18]. В первом случае могут наблюдаться следующие явления: повышенная продукция глутамата, избыточное его выделение в синаптическую щель, повышение внеклеточной концентрации возбуждающего медиатора, и повышение чувствительности глутаматных рецепторов. Во втором случае имеет место противоположная ситуация: сниженный синтез тормозных медиаторов, недостаточное поступление ГАМК в синаптическую щель, чрезмерно быстрое эффективности работы ГАМК-рецепторов её [5, удаление, 8, 34, 42]. снижение Причины вышеперечисленных нарушений обусловлены в большей степени генетически (65,5%), также большое влияние оказывают поражения сосудистой системы в головном мозге (10,9%), черепно-мозговые травмы, нейроинфекции, опухоли мозга, и т. д. [3]. 1.2. In vitro модели эпилептиформной активности В настоящее время для изучения механизмов аномальной синхронизации нейрональных сетей при судорогах часто применяются in vitro модели эпилептиформной активности, т. к. при их использовании удобно вызывать эпилептические разряды и следить за их развитием, влияя на патологическую активность фармакологически. In vitro модели судорожной активности имеют следующие преимущества: у исследователя имеется контроль над внеклеточным раствором, также при данной модели возможно получать стабильные электрофизиологические записи, что позволяет исследовать эпилепсию на молекулярном уровне, для исследования становятся доступными зоны головного мозга, расположенные вблизи основания черепа [4, 12]. Для того, чтобы вызвать эпилептическую активность в in vitro модели можно использовать различные методы [4], например: 1 вещества, вызывающие эпилепсию (бикукуллин – блокатор ГАМКА рецепторов, 4-аминопиридин – блокатор К+ каналов);

14 2 нарушенный ионный состав внеклеточного раствора (пониженная или нулевая концентрация ионов магния, повышенная концентрация ионов калия); 3 электрическая стимуляция 4 гипоксический эффект. 1.2.1. 4-аминопиридиновая модель эпилептиформной активности 4-аминопиридин (4-AP) является хемоконвульсантом, ускоряющим развитие эпилептоподобного состояния [2]. Данное вещество является блокатором калиевых каналов и может вызывать интериктальную активность в гиппокампе и иктальную активность в энторинальной коре [31]. До конца механизм эпилептогенного действия 4-АР не изучен, однако можно предположить, что при блокаде тока ионов калия через потенциалзависимые каналы происходит продление потенциала действия в окончании аксона, что приводит к усилению поступления ионов Ca2+ в пресинаптический бутон, и, следовательно, к более интенсивному выбросу нейромедиатора в синаптическую щель [4, 31]. Однако, для получения более стабильных и длительных электрофизиологических записей с регулярно генерирующимися иктальными разрядами, а также для исследования перехода между интериктальной и иктальной активностью, помимо аппликации 4-АР, изменяют ионный состав внеклеточного раствора [4]. Например, используют повышенное содержание ионов калия и пониженную концентрацию ионов магния [4]. Эффект, наблюдаемый при снижении [Mg2+], связан с наличием магниевого блока NMDA-рецепторов, который предотвращает их спонтанную активацию. При дефиците ионов магния риск спонтанного открытия ионных каналов NMDAрецепторов повышается даже в отсутствии глутамата [4, 12]. При повышенной концентрации ионов К+ во внеклеточном растворе происходит сдвиг равновесного потенциала, и, как следствие, так же активация NMDAрецепторов [4].

15 При использовании такой модели можно регистрировать следующие виды синхронизованной нейрональной активности [4, 22]: • интериктальные разряды, опосредованные ГАМК (тормозные разряды), • интериктальные разряды, опосредованные глутаматными рецепторами (возбуждающие разряды), • иктальные разряды. В in vitro моделях интериктальные разряды – это короткие события, длящиеся до 10 секунд. Подобные разряды обычно не вызывают поведенческих нарушений при их возникновении in vivo. С другой стороны, иктальная активность вследствие своей длительности (десятки секунд) в целом организме обычно способна вызвать судорожный припадок [30, 31]. Иктальная активность возникает в энторинальной коре и распространяется в гиппокамп, поэтому для её возникновения в срезах мозга необходимо сохранение непрерывной связи между энторинальной корой и гиппокампом [22]. 1.3. Энторинальная кора. Строение и роль в эпилептогенезе Чаще всего в исследованиях эпилептиформной активности in vitro используют переживающие срезы мозга грызунов, содержащие гиппокамп и энторинальную кору (ЭК), так как именно эти зоны головного мозга зачастую являются источниками паталогической нейрональной активности при височной эпилепсии [1, 30, 33, 40]. Это объясняется тем, что эти части гиппокампальной формации, которая включает в себя гиппокамп, зубчатую извилину, субикулум, и энторинальную кору, связаны между собой, и взаимодействуют друг с другом через двусторонние связи [11, 32, 33], что способствует синхронизации активности. Энторинальная кора располагается в парагиппокампальной извилине [6]. Энторинальная кора представляет собой связующие звено между неокортексом и гиппокампом, обеспечивая передачу информации, процессы консолидации

16 памяти [6, 7]. Информация из неокортекса поступает во II и III слои ЭК, далее импульсы могут по аксонам, образующим перфорантный путь (перфорирует субикулум), распространиться в зубчатую извилину на зернистые нейроны, аксоны которых формируют мшистые волокна, идущие к нейронам поля СА3 гиппокампа. От нейронов поля СА3 информация по коллатералям Шаффера поступает в поля СА2 и СА1. Аксоны нейронов поля СА1 напрямую или через субикулум передают информацию обратно в энторинальную кору, откуда она возвращается в неокортекс [6, 7]. Также, из энторинальной коры импульсы, минуя зубчатую извилину и поле СА3, могут напрямую передаваться нейронам поля СА1 гиппокампа [6]. Во многих исследованиях было показано, что в эпилептическом растворе в срезах гиппокампа с перерезанным перфорантным путём можно наблюдать только интериктальные разряды, тогда как на гиппокампально-энторинальных срезах, или срезах, содержащих только энторинальную кору, чередуются интериктальная и иктальная активность [30, 33]. Таким образом, инициация иктальных разрядов начинается именно в энторинальной коре, и затем она распространяется в гиппокамп [30, 33]. 1.4. ГАМКВ рецепторы. Строение и роль в развитии эпилепсии ГАМКВ-рецепторы являются метаботропными рецепторами гамма- аминомасляной кислоты (ГАМК). Они относятся к С классу связанных с Gбелками рецепторов [36]. По своему строению ГАМКВ-рецептор является гетеродимером, то есть, состоит из двух субъединиц ГАМКВ1 и ГАМКВ2. Обе субъединицы имеют N-концевой внеклеточный домен, С-концевой внутриклеточный домен – цитоплазматический хвост, которым субъединицы соединяются друг с другом, и семиспиральный трансмембранный домен [8, 20, 36]. Субъединицы ГАМКВ-рецептора выполняют разные функции: ГАМКВ1 необходима для связывания с ГАМК, а ГАМКВ2 отвечает за локализацию рецептора на мембране его связь с G-белком [8, 20]. Субъединица ГАМКВ1, в свою очередь, может быть представлена в двух видах: ГАМКВ1а или ГАМКВ1b.

17 Рецепторы, содержащие ГАМКВ1а и ГАМКВ2, расположены преимущественно пресинаптически, а постсинаптическую локализацию имеют рецепторы с ГАМКВ1b и ГАМКВ2 субъединицами [20, 36]. ГАМКВ-рецепторы создают ингибирующий эффект через: инактивацию потенциал-зависимых Са2+-каналов, активацию G-белок-связанных калиевых каналов внутреннего выпрямления (GIRK - G protein-activated inwardlyrectifying K+ channels), и ингибирование аденилатциклазы [20, 36]. ГАМКВ-Р — это G-белок-связанные метаботропные рецепторы, относящиеся к семейству Gi/o. После активации ГАМКВ-рецептора, субъединицы Gα и Gβγ диссоциируют. Субъединицы Gαi/o ингибируют аденилатциклазу, уменьшая количество циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), тогда как Gβγ субъединицы ингибируют Са2+-каналы и активируют GIRK каналы [36]. Активация пре- и постсинаптических рецепторов имеет различные эффекты. Так, активация пресинаптических рецепторов снижает выброс нейромедиатора в синаптическую щель [8, 26]. Нейромедиатором может быть, как ГАМК в тормозных синапсах, так и глутамат в возбуждающих. Это достигается благодаря тому, что пресинаптические ГАМКВ-рецепторы через Gβγ субъединицы ингибируют потенциалзависимые Са2+-каналы на мембране, вследствие чего уменьшается поступление ионов кальция в клетку, и выброс нейромедиатора в синаптическую щель замедляется. Эффект активации постсинаптических рецепторов связан с длительной гиперполяризацией, наступающей после быстрого тормозного компонента, связанного с ГАМКАрецепторами. Это происходит из-за инициируемого постсинаптическими ГАМКВ-рецепторами, а конкретнее - Gβγ субъединицами, открытия GIRK каналов, вызывающих приток ионов К+ в клетку [8, 24, 26, 36]. В результате возникает медленный и длительный ингибирующий постсинаптический потенциал. Роль ГАМКВ рецепторов в патогенезе эпилепсии ещё не достаточно известна [8, 26, 29]. Показано, что агонисты ГАМКВ рецепторов ингибируют

18 выброс нейромедиаторов (ГАМК и глутамата), а при модели хронической височной эпилепсии было обнаружено снижение ингибирубщего воздействия пресинаптических ГАМКВ-Р на выброс как глутамта, так и ГАМК [38]. Однако, в настоящее время мы не знаем, является ли снижение эффективности пресинаптических ГАМКB-Р причинным фактором при хронической эпилепсии, или её следствием [38]. Однако, роль ГАМКВ-рецепторов в процессе возбуждения при эпилепсии может быть двояка. Так, активация ГАМКВ-Р может ослаблять возбудимость за счет вовлечения пре- и постсинаптических ГАМКВ гетерорецепторов на глутаматергических нейронах, в то же время активация пресинаптических ГАМКВ ауторецепторов на интернейронах может способствовать возбудимости за счет растормаживания возбуждающих нейронов [21]. Также, была выявлена важная роль работы ГАМКВ-Р при кортико-таламических припадках, особенно в их остановке [28]. В работах, посвященных эпилепсии у молодых крыс возраста 12, 18 и 25 дней, была показана важная роль ГАМКВ-рецепторов в процессе ингибирования нейрональной активности, а аппликация антагонистов ГАМКВ-Р имела проконвульсантный эффект [29]. Также, у молодых крыс агонист ГАМКВ-Р SKF97541 проявляет противосудорожные свойства [19]. Таким образом, можно предположить, что потеря ингибирующего контроля над высвобождением глутамата может привести к усилению передачи возбуждения и повышению возбудимости сети, что приводит к эпилептогенезу [38]. В то время, как использование аллостерических модуляторов ГАМКВ рецепторов на постсинаптических мембранах может быть перспективно в качестве для лечения случаев рефрактерной детской эпилепсии [26].

19 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Приготовление переживающих срезов мозга крыс Для исследования использовались крысы линии Вистар возраста от 20 до 22 дней, которые содержались при комнатной температуре в нормальных условиях. Эксперименты выполнялись в соответствии с международными нормами и стандартами, регламентирующими правила работы с лабораторными животными. В течение исследования были приложены все усилия для минимизации количества используемых животных и их страданий. Крыс декапитировали на пластиковом холодном контейнере, содержащем хладагент, после чего делался продольный разрез кожи головы для того, чтобы оголить область черепа. Кости черепа разрезались по саггитальному и венечным швам и раздвигались в стороны, делая доступным мозг для последующих манипуляций. От мозга отрезались мозжечок, часть лобных долей, и часть дорсальной поверхности. В течение всей операции мозг капельно омывался холодной (0 оС) искусственной спинномозговой жидкостью (ИСМЖ). Затем срезанной дорсальной частью мозг фиксировали с помощью клея на предметном магнитном столике вибратома Microm HM 650 V. С помощью лезвия вибратома изготавливались срезы мозга толщиной 350 мкм, при этом мозг находился в холодной ИСМЖ, аэрируемой карбогеном (95 % О 2 / 5 % СО2). ИСМЖ изготавливали перед операцией в соответствии с составом (в мМ) 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 24 NaHCO3, и 20 Dсахарозы, и затем замораживали до состояния «шуги». Готовые срезы, содержащие гиппокамп и энторинальную кору, помещали в специальные лунки, закрепленные на стакане, в котором также находилась ИСМЖ при комнатной температуре, аэрируемая карбогеном. Стакан со срезами помещали для инкубации на водяную баню при температуре +35 оС на 40–45 минут. По истечении этого времени срезы находились при комнатной температуре.

20 Обычно от одной крысы использовалось от двух до восьми срезов в разных экспериментах. 2.2. 4-аминопиридиновая модель эпилептиформной активности В ванночку, расположенную под микроскопом в patch clamp установке, помещался срез, омываемый специальным проэпилептическим раствором, содержащим хемоконвульсант 4-АР (блокатор калиевых каналов). Этот раствор содержал (в мМ): 125 NaCl, 3,5 KCl, 1,25 NaH2PO4(*2H2O), 0,25 MgSO4(*7H2O), 2 CaCl2, 24 NaHCO3, 13,32 D-сахарозы, 0,1 4АР. Модель эпилептиформной активности с таким составом внеклеточного раствора называется 4- аминопиридиновой моделью с повышенной концентрацией ионов К+ и пониженной концентрацией ионов Mg2+. Эпилептиформная активность в этом растворе развивается в энторинальной коре в течение 5 минут и затем по проводящим путям распространяется в поля гиппокампа. Таким образом, на пирамидных нейронах энторинальной коры и гиппокампа с помощью метода локальной фиксации потенциала можно регистрировать длительные, длящиеся десятки секунд, иктальные разряды, и короткие интериктальные разряды, опосредованные как глутаматом, так и ГАМК. 2.3. Электрофизиологические методы исследования 2.3.1. Метод локальной фиксации потенциала Для визуализации эпилептиформной активности на пирамидных одиночных нейронах энторинальной коры использовался метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) в конфигурации «целая клетка» (рис. 2.1). Напряжение на мембране фиксировалось на -20 мВ, что позволяло наблюдать как ГАМК-, так и глутамат-опосредованные ответы.

21 Рис. 2.1. Схема метода локальной фиксации потенциала в режиме «целая клетка» Для изготовления стеклянных patch-пипеток использовался пуллер, SUTTER INSTRUMENT MODEL P-1000, и трубочки из боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,86 мм, диаметр кончика patch-пипеток подбирался таким образом, чтобы сопротивление микроэлектрода было от 2 до 3 МОм. В эти patch-пипетки перед началом работы помещался внутриклеточный раствор, содержащий (в мМ) цезий-метансульфонат (CsMeSO4) 127, NaCl 10, EGTA 5, HEPES 10, QX314,6, АТФ-Mg 4, ГТФ положительное визуализировать 0,3. На давление. клетки внутренний С и объём помощью микроэлектрод электрода микроскопа на экране, подавалось можно а было благодаря

22 микроманипулятору Sutter MP-225 можно было перемещать стеклянный микроэлектрод. После введения микроэлектрода в раствор, необходимо было потенциал на электроде скомпенсировать до 0. У клеток, с которых производилась регистрация, ядро не должно было наблюдаться, а их форма должна была быть не расплывчатой. После выбора нужной клетки в энторинальной коре, электрод аккуратно подводился к поверхности её мембраны (рис. 2.2). В момент, когда около кончика стеклянного микроэлектрода можно было наблюдать появляющееся тёмное пятно, открытием клапана сбрасывалось положительное давление на микроэлектроде, и усилитель переводился в режим Voltage clamp. С помощью отрицательного давления облегчалось присоединение к мембране. При достижении сопротивления выше 1 ГОм, можно было прорывать мембрану резким подтягиванием воздуха. По достижении конфигурации «целая клетка», начинали регистрацию активности на нейроне. Регистрация эпилептиформной активности пирамидных, одиночных клеток энторинальной коры производилась по-разному: 1 В обычном эпилептическом растворе клетки регистрировались от 60 минут (контроль); 2 Сначала регистрация производилась в эпилептическом растворе в течение 20–30 минут (контроль), после чего запись прекращалась. Затем в наружный раствор добавлялся блокатор ГАМКВ-Р CGP55845 (5 мкМ), и снова включалась запись той же клетки, длящаяся от 30 до 50 минут. 3 Сначала регистрация производилась в эпилептическом растворе в течение 20–30 минут (контроль), после чего запись прекращалась. Затем в наружный раствор добавлялся агонист ГАМКВ-Р SKF-97541 (5 мкM), и снова включалась запись той же клетки, длящаяся от 30 до 50 минут.

23 Рис. 2.2. Схема расположения регистрирующего микроэлектрода 2.3.2. Парная стимуляция Для теста с парной стимуляцией необходимо было использовать два электрода – стимулирующий и регистрирующий (рис. 2.3). Стимулирующий электрод изготовлен из двух скрученных нихромовых проволок, а регистрирующий электрод аналогичен тому, который описывался в пункте 2.3.1, и представляет собой стеклянный микроэлектрод, только заполненный раствором отличного от описанного ранее состава (в мМ: 135 K-Glu, 10 NaCl, 10 HEPES, 5 EGTA, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP, pH 7,25). Оба электрода

24 управляются микроманипуляторами для их помещения в гиппокампальноэнторинальный срез мозга крысы. Рис. 2.3. Схема расположения стимулирующего и регистрирующего электродов Стимуляция и регистрация ответов также производилась в энторинальной коре. Стимулирующий биполярный электрод помещался в глубокие слои энторинальной коры, на расстоянии 20–30 мкм от него выбиралась клетка для подведения к ней регистрирующего стеклянного микроэлектрода и осуществления на ней метода локальной фиксации потенциала при -80 мВ. Через стимулирующий электрод подавался ток двумя импульсами, длительностью 0,1 мс каждый, интервал между импульсами был 20 мс, амплитуда тока подстраивалась в зависимости от величины получаемого ответа

25 на выбранной пирамидной клетке, и находилась в интервале от 50 до 470 мкА. Ответы, получаемые при стимуляции – это возбуждающие токи, опосредованные глутаматом, а именно работой AMPA-рецепторов. Проводилось два независимых эксперимента. В одном, протокол парной стимуляции, длящийся 5 минут, регистрировал ответы клетки в контроле, то есть когда внеклеточный раствор представлял собой просто ИСМЖ, по окончании записи циркулирующий раствор заменялся на тот, в который был добавлен блокатор ГАМКВ-Р CGP55845 (5 мкМ), и протокол включался вновь два раза подряд, при этом в течение этих манипуляций одна и та же пирамидная клетка оставалось зафиксированной с помощью метода локальной фиксации потенциала. Другой эксперимент проводился аналогично, за исключением того, что второй используемый раствор содержал агонист ГАМКВ-Р SKF-97541 (5 мкМ). В эксперименте анализировали изменения коэффициента парных импульсов и амплитуды ответов, возникающих после парной стимуции. Коэффициент парных импульсов рассчитывался как отношение амплитуд ответов (второй / первый), зарегистрированных при удерживающем потенциале -80 мВ в контроле и при аппликации агониста или антагониста ГАМКВ-Р. 2.3.3. Миниатюрные ответы Для регистрации миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов (мВПСТ), опосредованных глутаматом, с помощью метода локальной фиксации потенциала в конфигурации «целая клетка» (см. п. 2.3.1) в раствор ИСМЖ, циркулирующий по камере со срезом, добавлялся тетродотоксин (TTX) в концентрации 0,5 мкМ. ТТХ – яд нервно-паралитического действия, механизм действия которого – блокада потенциалзависимых Na+ каналов. Перед тем, как приступить к записи миниатюрных событий, клетка регистрировалась в режиме фиксации тока, чтобы оценить эффект действия тетродотоксина и подтвердить отсутствие возникновения спайков при подаче

26 ступенек тока разной амплитуды. После этого выставлялся вновь режим фиксации потенциала на -80 мВ, и записывалась спонтанная активность клетки, а именно миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи. Сначала регистрировалась активность клетки в контроле, то есть внеклеточная жидкость представляла собой ИСМЖ и ТТХ, в течение 5 минут. Затем трубочки, через которые циркулирует внеклеточный раствор, перекладывались в емкость, куда помимо ТТХ был добавлен блокатор ГАМКВ-Р CGP55845 (5 мкМ), и в таком растворе активность той же клетки записывалась два раза по 5 минут. Аналогичный эксперимент так же проводился и с агонистом ГАМКВ-Р SKF97541 (5 мкМ). Целью эксперимента являлось отслеживание изменений кинетики мВПСТ, поэтому в данном эксперименте сравнивалась частота генерации мВПСТ и их амплитуда в контроле и при добавлении в наружный раствор блокатора ГАМКВ-Р (CGP55845 5 мкМ) или агониста этих рецепторов (SKF-97541 5 мкМ). 2.4. Статистическая обработка данных Статистическую обработку данных производили с помощью пакета SciPy (https://scipy.org/) для языка программирования Python. Для сравнения зависимых выборок использовался парный t-тест Стьюдента. Различия считались статистически значимыми в случае, если значение p было меньше 0.05. Все данные приведены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

27 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Влияние агониста и антагониста ГАМКВ рецепторов на параметры эпилептиформной активности В данном эксперименте мы хотели оценить влияние блокады и активации ГАМКВ-Р на эпилептиформную активность, а именно на частоту возникновения и длительность иктальных разрядов. Для этого использовались гиппокампально-энторинальные горизонтальные переживающие срезы мозга крыс возраста трёх недель. Эпилептиформная активность вызывалась в срезах проэпилептическим раствором с повышенным содержанием ионов калия, пониженным содержанием ионов магния, и добавлением 4-аминопиридина. Регистрация активности производилась на пирамидных нейронах энторинальной коры методом локальной фиксации потенциала. В течение этого эксперимента были получены записи трёх типов. Вопервых, была записана эпилептиформная активность нейронов энторинальной коры в контроле, то есть, в проэпилептическом растворе без аппликации агонистов или антагонистов ГАМКB-рецепторов. Контрольные записи длились от 50 минут. Во-вторых, регистрировалась активность клеток при добавлении в проэпилептический раствор антагониста ГАМКВ-Р CGP55845, причём сначала клетка регистрировалась 15–30 минут (время в течение которого развивалось 5 иктальных разрядов) в контроле, и лишь затем добавлялся препарат, и запись следующих 5-ти иктальных разрядов запускалась вновь (ещё 20–40 минут) (рис. 3.1 Б). И, наконец, третья группа записей создавалась аналогично вышеописанным, только вместо антагониста апплицировался агонист ГАМК В-Р SKF97541 (рис. 3.1 А). В записях с блокатором и агонистом наблюдали за изменением длительности и частоты вохникновения ИР. Между собой сравнивались записи до и после добавления CGP55845 или SKF97541 для каждой клетки.

28 Рис. 3.1. А – пример записи эпилептиформной активности в контроле и после аппликации SKF97541; Б – пример записи эпилептиформной активности в контроле и после аппликации CGP55845; В – изменение длительности иктальных разрядов после аппликации SKF975414; Г – изменение частоты иктальных разрядов после аппликации SKF975414; Д – изменение длительности иктальных разрядов после аппликации CGP55845; Е – изменение частоты иктальных разрядов после аппликации CGP55845. * - р < 0,05; *** - p < 0,001 Контрольные записи, сделанные целиком без аппликации агонистов и антагонистов ГАМКB рецепторов, показали, что ИР в данной модели генерируются стабильно, и их частота и длительность не меняются в течение времени эксперимента. Блокада ГАМКB рецепторов приводила к снижению продолжительности ИР (Контроль: 1,3 ± 0,13 с; CGP55845: 0,9 ± 0,15 с;

29 p<<0.001; n=16; рис. 3.1 Д) и увеличению их частоты (Контроль: 3,7 ± 0,37 мГц; CGP55845: 4,4 ± 0,46 мГц; p=0,01; n=16; рис. 3.1 Е). При добавлении во внеклеточный раствор агониста ГАМКB рецепторов также наблюдалось снижение длительности ИР (Контроль: 1,3 ± 0,18 с; SKF975414: 1,0 ± 0,11 с; p=0,01; n=12; рис. 3.1 В), однако в этом случае их частота тоже снижалась (Контроль: 3,5 ± 0,27 мГц; SKF975414: 2,1 ± 0,12 мГц; p < 0,001; n=12; рис. 3.1 Г), и дополнительно наблюдалось практически полное исчезновение интериктальных разрядов. Таким образом, можно наблюдать, что активация ГАМКB рецепторов оказывает выраженное противоэпилептическое действие в 4- аминопиридиновой модели in vitro. В то время, как блокада ГАМКB рецепторов снижает длительность иктальных разрядов, но увеличивает их частоту. 3.2. Влияние антагониста и агониста ГАМКВ рецепторов на парное отношение Известно, что ГАМКВ-Р могут быть как пре-, так и постсинаптическими, поэтому, чтобы понять, где локализованы рецепторы, опосредующие изменения параметров иктальной активности, описанные в пункте 3.1, был проведён тест с парной стимуляцией. Суть данного метода состоит в том, что синаптическая передача стимулируется быстрой последовательностью двух коротких импульсов. В результате регистрируются два постсинаптических ответа, а отношение амплитуды второго ответа к амплитуде первого называется парным отношением (PPR – paired pulse ratio). PPR зависит от вероятности высвобождения везикул в синапсе и его изменение свидетельствует об изменении вероятности высвобождения нейротрансмиттера из пресинаптического окончания. Если блокатор ГАМКВ-Р CGP55845 действует на пресинаптические рецепторы, то ослабнет ингибирование потенциал-зависимых Са2+-каналов, и

30 соответственно, везикулы будут высвобождаться интенсивнее. Если же агонист ГАМКВ-Р SKF97541 действует на пресинаптические рецепторы, то можно ожидать, что выброс нейромедиатора, напротив, будет ингибирован. Итак, проведенный на гиппокампально-энторинальных срезах тест с парными импульсами показал, что антагонист ГАМКВ-Р CGP55845 не вызывал достоверных изменений амплитуды постсинаптических ответов (Контроль: 356 ± 37 пА (первый ответ) и 497 ± 46 пА (второй ответ); CGP55845: 328 ± 49 пА (первый ответ) и 455 ± 53 пА (второй ответ); р (первый ответ) = 0,4 и р (второй ответ) = 0,27; n=11; рис. 3.2 Б) и коэффициента парных импульсов (Контроль: 1,44 ± 0,08; CGP55845: 1,49 ± 0,11; р = 0,4; n = 11; рис. 3.2 В). С другой стороны, при аппликации агониста ГАМК В-Р SKF97541 мы получили значительное уменьшение в амплитуде постсинаптических ответов (Контроль: 374 ± 46 пА (первый ответ) и 557 ± 47 пА (второй ответ); SKF97541: 49 ± 7 пА (первый ответ) и 113 ± 16 пА (второй ответ); р (первый ответ) < 0,001 и р (второй ответ) < 0,001; n=12; рис. 3.2 Д), и увеличение в значении PPR (Контроль: 1,49 ± 0,10; SKF97541: 2,28 ± 0,15; р < 0,001; n = 12; рис. 3.2 Е).

31 Рис. 3.2. А – постсинаптические ответы, вызванные парной стимуляцией в контроле (черный) и в присутствии CGP55845 (оранжевый); Б – изменение амплитуды постсинаптических ответов после аппликации CGP55845; В – изменение значения коэффициента парных импульсов после аппликации CGP55845; Г – постсинаптические ответы, вызванные парной стимуляцией в контроле (черный) и в присутствии SKF97541(розовый); Д – изменение амплитуды постсинаптических ответов после аппликации SKF97541; Е – изменение значения коэффициента парных импульсов после аппликации SKF97541. *** - р < 0,001

32 Таким образом, на основании полученных в эксперименте данных можно сделать вывод о том, фоновая активность пресинаптических ГАМКВ-Р в глутаматергических синапсах невысока, поэтому их блокатор CGP55845 не оказывает заметного действия на вероятность выброса глутамата. Напротив, агонист ГАМКВ-Р SKF97541 вызывает значительную активацию пресинаптических ГАМКВ-рецепторов, что приводит к снижению вероятности выброса глутамата, и соответствующему уменьшению амплитуды вызванных синаптических ответов почти в восемь раз для первого ответа и примерно в пять раз для второго (рис. 3.2 Г, Д). Также, при добавлении SKF97541 значительно увеличилось парное отношение, т. е. увеличилась разница между амплитудой первых и вторых ответов. Это объясняется так же действием агониста на пресинаптические ГАМКВ-Р: вероятность высвобождения везикул во время первого ответа сильно снижена из-за ингибирования потенциалзависимых Ca2+-каналов, поэтому его амплитуда значительно снижается. Во время второго пресинаптическом импульса происходит окончании, и накопление вероятность ионов Ca2+ высвобождения в везикул становится выше, при этом амплитуда синаптического ответа всё же снижена по сравнению с контролем. 3.3. Влияние антагониста и агониста ГАМКВ рецепторов на миниатюрные события Тест с парными импульсами показал, что SKF97541 оказывает сильное воздействие на вероятность выброса глутамата, тогда как аппликация CGP55845 не вызвала достоверных изменений в этом эксперименте. Поэтому следующим шагом стала оценка влияния блокады и активации ГАМКВ-Р на характеристики миниатюрных событий. Чтобы регистрировать миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи (мВПСТ) на пирамидных нейронах энторинальной коры, необходимо заблокировать ток ионов через Na+-каналы с помощью тетродотоксина. В таких условиях происходит спонтанное высвобождение одиночных везикул с глутаматом из пресинаптических

33 окончаний, и по частоте подобных событий можно судить о вероятности выброса нейромедиатора во всей популяции активных синапсов нейрона. Также, амплитуда и кинетика мВПСТ являются важными показателями, определяющими параметры синаптической передачи. В данном эксперименте сравнивались записи в контроле (в ИСМЖ + ТТХ) и при добавлении агониста / блокатора ГАМКВ-Р по следующим параметрам: амплитуда, время нарастания, τ спада мВПСТ, и частота их генерации. Было обнаружено, что при добавлении в наружный раствор CGP55845 (рис. 3.3) амплитуда (Контроль: 12,5 ± 0,57 пА; CGP55845: 11,4 ± 1,12 пА; р = 0,26; n = 7; рис. 3.3 Б), время нарастания (Контроль: 1,3 ± 0,14 мс; CGP55845: 1,5 ± 0,25 мс; р = 0,45; n = 7; рис. 3.3 В) и τ спада мВПСТ (Контроль: 5,0 ± 0,55 мс; CGP55845: 4,5 ± 0,42 мс; р = 0,28; n = 7; рис. 3.3 Г) не изменялись. При этом, частота возникновения мВПСТ после аппликации блокатора ГАМКВ-Р увеличилась (Контроль: 2,1 ± 0,40 Гц; CGP55845: 3,0 ± 0,73 Гц; р < 0,05; n = 7; рис. 3.3 Д).

34 Рис. 3.3. А – запись мВПСТ (звёздочки) в контроле (чёрный) и с CGP55845 (оранжевый); Б – изменение амплитуды мВПСТ после аппликации CGP55845; В – изменение времени нарастания мВПСТ после аппликации CGP55845; Г – изменение τ спада мВПСТ после аппликации CGP55845; Д – изменение частоты мВПСТ после аппликации CGP55845. * - р < 0,05. В эксперименте с агонистом ГАМКВ-Р SKF97541 (рис. 3.4) также не наблюдалось изменений амплитуды (Контроль: 14,1 ± 1,3 пА; SKF97541: 13,3 ± 1,6 пА; р = 0,34; n = 13; рис. 3.4 Б), время нарастания (Контроль: 1,2 ± 0,18 мс; SKF97541: 1,5 ± 0,24 мс; р = 0,08; n = 13; рис. 3.4 В), и τ спада мВПСТ (Контроль: 4,5 ± 0,52 мс; SKF97541: 4,8 ± 0,62 мс; р = 0,36; n = 13; рис. 3.4 Г). Однако, частота генерации мВПСТ значительно уменьшилась под действием

35 агониста (Контроль: 2,4 ± 0,25 Гц; SKF97541: 1,7 ± 0,19 Гц; р < 0,01; n = 13; рис. 3.4 Д). Рис. 3.4. А – запись мВПСТ (звёздочки) в контроле (чёрный) и с SKF97541 (розовый); Б – изменение амплитуды мВПСТ после аппликации SKF97541; В – изменение времени нарастания мВПСТ после аппликации SKF97541; Г – изменение τ спада мВПСТ после аппликации SKF97541; Д – изменение частоты мВПСТ после аппликации SKF97541. ** - р < 0,01 Итак, в ходе данного эксперимента мы обнаружили, что амплитуда и кинетика мВПСТ не меняются при воздействии на ГАМКB-рецепторы, что хорошо соотносится с литературными данными. При этом оба вещества противоположно воздействуют на частоту возникновения мВПСТ.

36 CGP55845 увеличивает частоту возникновения миниатюрных событий. При этом, в пункте 3.2 мы не обнаружили эффектов данного антагониста на парное отношение, поэтому можно предположить, что изменение вероятности выброса глутамата наблюдается не во всех синапсах, поэтому надёжно выявляется только при анализе миниатюрных событий, но не парного отношения в отдельных синаптических входах. SKF97541, как было показано ранее в пункте 3.2, активирует пресинаптические ГАМКВ-Р, и снижает вероятность высвобождения везикул из пресинаптического окончания, что проявляется и в снижении частоты миниатюрных ответов.

37 ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1 Блокада ГАМКB рецепторов приводила к снижению продолжительности иктальных разрядов и увеличению их частоты. 2 Активация ГАМКB рецепторов снижала как длительность, так и частоту иктальных разрядов. 3 Антагонист ГАМКВ рецепторов CGP55845 не вызывал достоверных изменений амплитуды постсинаптических ответов и парного отношения. 4 Агонист ГАМКВ-Р SKF97541 вызывал уменьшение амплитуды постсинаптических ответов и увеличение парного отношения. 5 Аппликация CGP55845 не влияла на амплитуду, время нарастания и τ спада мВПСТ, но увеличивала их частоту. 6 Аппликация SKF97541 также не изменяла амплитуду, время нарастания и τ спада мВПСТ, но приводила к снижению частоты их генерации. На основании проделанных экспериментов и полученных результатов, можно отметить, что активация ГАМКB рецепторов оказывает выраженное противоэпилептическое действие в 4-аминопиридиновой модели in vitro. При этом, агонист ГАМКВ рецепторов SKF97541 оказывает значительное влияние на пресинаптические рецепторы, через которые он и осуществляет свою противоэпилептическую функцию, ингибируя выброс медиаторов в синаптическую щель и дальнейшее распространение активности. Блокатор ГАМКВ-Р CGP55845 не оказывает антиконвульсантного действия, а, наоборот, увеличивает частоту генерации иктальных разрядов, однако его действие, повидимому, изменяет вероятность выброса глутамата лишь в определённой доле синапсов в энторинальной коре.

38 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Амахин Д. В., Соболева Е. Б., Ергина Ю. Л. Синаптические и ионные механизмы генерации эпилептоподобной активности в энторинальной коре // Актуальные проблемы биомедицины. 2020. C. 218–219. 2. Амахин Д. В., Соболева Е. Б., Зайцев А. В. Методика Оценки Вклада Различных Типов Ионотропных Рецепторов В Постсинаптический Ответ В Ходе Эпилептоподобных Разрядов in Vitro // Российский Физиологический Журнал Им. И.М. Сеченова. 2019. № 7 (105). C. 812–831. 3. Евстигнеев В. В., Кистень О. В. Базовые механизмы эпилептогенеза и эпилепсии 2011. C. 106–114. 4. Ергина Ю. Л., Смирнова Е. Ю. In vitro модели эпилептиформной активности // Российский Физиологический Журнал Им. И.М. Сеченова. 2019. № 8 (105). C. 954–965. 5. Зайцев А. В. Роль гамкергических интернейронов коры и гиппокампа при развитии эпилепсии // Российский Физиологический Журнал Им. И.М. Сеченова. 2016. № 5 (102). C. 513–528. 6. Зиматкин С. М., Бонь Е. И. Строение и развитие коры головного мозга крысы / С. М. Зиматкин, Е. И. Бонь, 2019. 7. Зосимовский возвращающаяся в В. А., Коршунов гиппокамп через В. А. Волна энторинальную возбуждения, кору, может реактивировать популяции «обученных» нейронов поля СА1 в периоды глубокого сна // Журнал высшей нервной деятельности. 2010. № 5 (60). C. 568– 581. 8. Карпова М. Н., Кузнецова Л. В., Клишина Н. Ю. ГАМК и её рецепторы в патогенезе эпилепсии // Успехи физиологических наук. 2015. № 3 (46). C. 46– 59.

39 9. Киссин М. Я. [и др.]. Особенности нейроморфологии тревожных и депрессивных расстройств при височной эпилепсии // Обозрение психиатрии и медицинской психологии. 2012. (2). 10. Кистень О. В., Евстигнеев В. В., Сакович Р. А. Психоэмоциональные нарушения у пациентов с височной эпилепсией и их морфологическое обоснование // Международный неврологический журнал. 2014. № 7 (69). C. 9– 13. 11. Мальков А. Е. [и др.]. Ритмическая активность гиппокампа и энторинальной коры нарушается на модели каинатной нейротоксичности у крыс в свободном поведении // Журнал высшей нервной деятельности. 2020. № 3 (70). C. 394–410. 12. Мелик-Касумов Т. Б. Исследование эпилептиформной активности пирамидальных нейроноисследованиев гиппокампа in vitro и её зависимости от паттерна импульсации нейрона // Новости медико-биологических наук. 2017. № 1 (15). C. 25–31. 13. Семьянов А. В. ГАМК-эргическое торможение в ЦНС: типы ГАМКрецепторов и механизмы тонического ГАМК-опосредованного тормозного действия // Нейрофизиология. 2002. № 1 (34). C. 82–92. 14. Akyuz E. [и др.]. Revisiting the role of neurotransmitters in epilepsy: An updated review // Life Sciences. 2021. (265). C. 118826. 15. Allone C. [и др.]. Neuroimaging and cognitive functions in temporal lobe epilepsy: A review of the literature // Journal of the Neurological Sciences. 2017. (381). C. 7–15. 16. Codadu N. K. [и др.]. Divergent paths to seizure-like events // Physiol Rep. 2019. № 19 (7). 17. Devinsky O. [и др.]. Epilepsy // Nature reviews Disease Primers. 2018. (3). 18. Dinuzzo M. [и др.]. Physiological bases of the K + and the

40 glutamate/GABA hypotheses of epilepsy // Epilepsy Research. 2016. № 6 (108). C. 995–1012. 19. Fábera P., Mareš P. Effect of GABAB receptor agonist SKF97541 on cortical and hippocampal epileptic afterdischarges // Physiological Research. 2014. № 4 (63). C. 529–534. 20. Frangaj A., Fan Q. R. Structural biology of GABAВ receptor // Neuropharmacology. 2018. C. 68–79. 21. Gerrard L. B., Tantirigama M. L. S., Bekkers J. M. Pre- and postsynaptic activation of GABAB receptors modulates principal cell excitation in the piriform cortex // Frontiers in Cellular Neuroscience. 2018. (12). 22. Gonzalez-Sulser A. [и др.]. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array // Neuropharmacology. 2011. № 7–8 (60). C. 1142–1153. 23. Hales T. G. [и др.]. The epilepsy mutation, γ2(R43Q) disrupts a highly conserved inter-subunit contact site, perturbing the biogenesis of GABAA receptors // Molecular and Cellular Neuroscience. 2005. № 1 (29). C. 120–127. 24. Kantamneni S. Cross-talk and regulation between glutamate and GABAB receptors // Frontiers in Cellular Neuroscience. 2015. (9). 25. Khazipov R. GABAergic Synchronization in Epilepsy // Cold Spring Harb Perspect Med. 2016. 26. Levinson S. [и др.]. Paroxysmal Discharges in Tissue Slices From Pediatric Epilepsy Surgery Patients: Critical Role of GABAB Receptors in the Generation of Ictal Activity // Frontiers in Cellular Neuroscience. 2020. (14). 27. Macdonald R. L., Kang J.-Q., Gallagher M. J. Mutations in GABA A receptor subunits associated with genetic epilepsies // The Journal of Physiology. 2010. № 11 (588). C. 1861–1869.

41 28. Mareš P. [и др.]. An Antagonist of GABA-B Receptors Potentiates Activity of Cortical Epileptic Foci // Physiological Research. 2012. (61). C. 325–329. 29. Mareš P. Proconvulsant Action Of Two GABAB Receptor Antagonists Is Age-Dependent // Physiological Research. 2013. (62). C. 109–114. 30. Ren H. [и др.]. The role of the entorhinal cortex in epileptiform activities of the hippocampus. 2014. 31. Salah A., Perkins K. L. Persistent ictal-like activity in rat entorhinal/perirhinal cortex following washout of 4-aminopyridine // Epilepsy Research. 2011. № 3 (94). C. 163–176. 32. Schultz C., Engelhardt M. Anatomy of the hippocampal formation // The Hippocampus in Clinical Neuroscience. 2014. (34). C. 6–17. 33. Shi Y.-J. [и др.]. Effect of the Entorhinal Cortex on Ictal Discharges in LowMg 2+-Induced Epileptic Hippocampal Slice Models // neural plasticity. 2014. 34. Staley K. Molecular mechanisms of epilepsy // Nature Neuroscience. 2015. № 3 (18). C. 367–372. 35. Tatum W. O. Mesial temporal lobe epilepsy // Journal of Clinical Neurophysiology. 2012. № 5 (29). C. 356–365. 36. Terunuma M. Diversity of structure and function of GABA B receptors: a complexity of GABA B-mediated signaling // The Japan Academy. 2018. № 10 (94). C. 390–411. 37. Thijs R. D. [и др.]. Epilepsy in adults // The Lancet. 2019. № 10172 (393). C. 689–701. 38. Thompson S. E. [и др.]. Depression of glutamate and GABA release by presynaptic GABA B receptors in the entorhinal cortex in normal and chronically epileptic rats // Neurosignals. 2007. (15). C. 202–215. 39. Tramoni-Negre E. [и др.]. Long-term memory deficits in temporal lobe

42 epilepsy // Revue Neurologique. 2017. № 7–8 (173). C. 490–497. 40. Vismer M. S. [и др.]. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation // Frontiers in Neural Circuits. 2015. Т. 9. № May. 41. Vrinda M. [и др.]. Temporal lobe epilepsy-induced neurodegeneration and cognitive deficits: Implications for aging // Journal of Chemical Neuroanatomy. 2019. (95). C. 146–153. 42. Zabrodskaya Y. M., Bazhanova E. D. Functional Imbalance of Glutamateand GABAergic Neuronal Systems in the Pathogenesis of Focal Drug-Resistant Epilepsy in Humans Pathogenesis of structural epilepsy View project Photodynamic therapy of glioma View project // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2020. № 4 (168). C. 529–532.

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

10.62

Александра Полякова

Эпилепсия является одним из самых распространенных заболеваний ЦНС. Несмотря на то, что эпилепсия часто характеризуется дисбалансом между возбуждением и торможением, патогенез заболевания может быть различным. Тема данной ВКР актуальна в связи с наличием большого количества резистентных форм эпилепсии, и поэтому изучение роли ГАМКВ рецепторов в развитии данного патологического состояния может стать стимулом к появлению новых фармакологических мишеней для антиконвульсантов. Эта тема ВКР была доверена Поляковой Александре Павловне, потому что у нее был опыт использования различных методов исследования, необходимых для данной работы, и ее собственное желание посвятить ВКР проблеме эпилепсии. За время научно-исследовательской работы Полякова А.П. освоила 4-аминопиридиновую модель эпилепсии in vitro, методику приготовления переживающих горизонтальных срезов мозга крыс, метод локальной фиксации потенциала, применяемый в данной ВКР для теста с парными импульсами, регистрации эпилептиформной активности и миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов. Александра Павловна выполнила все поставленные задачи в полном объеме и проделала все необходимые эксперименты аккуратно и на высоком уровне. В ходе работы Александра Павловна проявляла самостоятельность, заинтересованность и усидчивость. Основные положения работы были опубликованы в материалах XXIV Международной медико-биологической научной конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 24 апреля 2021 г.). Выпускная квалификационная работа Поляковой А.П. по теме «Роль ГАМКВ рецепторов в формировании эпилептиформной активности в 4-аминопиридиновой модели на переживающих срезах мозга крысы» отвечает основным требованиям, предъявляемым к квалификационным работам выпускника университета по направлению 16.03.01 «Техническая физика», образовательная программа 16.03.01_06 «Медицинская и биоинженерная физика» и может быть рекомендована к защите. Работу Поляковой А.П. оцениваю на «отлично». При успешной защите выпускной квалификационной работы ей может быть присвоена квалификация бакалавра. Следует отметить склонность Поляковой Александры Павловны к научной работе. Рекомендую Полякову А.П. к продолжению обучения в магистратуре. Руководитель ВКР: доцент ВШБСиТ ИБСиБ к.б.н., доцент Постникова Т.Ю. Консультант: н.с. ИЭФБ РАН к.б.н. Малкин С.Л.