Системное воздействие флуоксетина на морфофункциональный статус яичника мыши СТАТУС ЯИЧНИКА МЫШИ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра эмбриологии Гусева Алика Андреевна СИСТЕМНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ФЛУОКСЕТИНА НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС ЯИЧНИКА МЫШИ Выпускная квалификационная работа бакалавра Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации (группа эмбриофизиологии) Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научный руководитель: к.б.н. Никишин Денис Александрович Москва 2021 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..…4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………….5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………...………………………………………………....7 1. Фолликулогенез и сопряженные процессы в яичнике……………….…….7 2. Стероидогенез в яичнике……………………………………………….…...11 3. Канонический WNT сигнальный путь в яичнике..........................................13 4. Серотонинергическая система в яичнике……………...……………..….…15 4.1 Компоненты сертонинергической системы ………….………………..15 4.2 Роль серотонина в организме………………………………….……..….18 4.3 Серотонин в женской репродуктивной системе……………….……....19 5. Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС)...........22 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....………………………………………………….….26 1. Животные…………………………………………………………………….26 2. Введение флуоксетина in vivo………………………………………………26 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией (ВЭЖХ)………………………………………………….……….26 4. Определение активности мембранного транспорта серотонина in vitro...27 5. Морфологический анализ яичников………………………………………..28 6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени………………………28 7. Статистическая обработка данных……………………………………..…..33 РЕЗУЛЬТАТЫ……………………………………………………………………...33 1. Определение концентрации серотонина в крови………………………….33 2. Определение активности мембранного транспортера серотонина в яичнике в эксперименте in vitro……………………………………………...….……33 3. Определение экспрессии гонадотропных гормонов в аденогипофизе.….35 4. Морфологический анализ яичников…………………………..….…….…..36 5. Количественное исследование динамики экспрессии маркерных генов в яичнике…………………………………………………………………….…36 ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………………………………….……….42 2

ВЫВОДЫ…………………………………………………………...………………46 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………….47 3

ВВЕДЕНИЕ Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-НТ) является практически самым известным нейромедиатором, который, к тому же, участвует в регуляции многих физиологических процессов на периферии вне ЦНС. Практически во всех классах животных он осуществляет сигнальную и регуляторную функцию. В репродуктивной системе млекопитающих серотонин принимает участие в регуляции раннего развития, репродуктивных процессов в половых путях, фолликулогенеза и стероидогенеза в яичниках. В тканях яичника не происходит синтеза серотонина, его основным источником является захват из внеклеточной среды с помощью мембранного транспортера Sert. Воздействие серотонина на клетки может происходить путём активации мембранных рецепторов или его захвата внутрь клеток. Sert является специфической мишенью антидепрессантов группы селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС), которые обычно используют для лечения таких психических расстройств как депрессия. Чаще всего в терапевтической практике применяют флуоксетин, так как он обладает наименьшим тератогенным действием. Известно, что ингибирование Sert путём нокаута его гена или применение СИОЗС негативно влияет на синтез эстрадиола у самок мышей. Кроме того, в экспериментах in vitro показано, что функциональная активность фолликулярных клеток зависит от активности Sert в ооцитах. Однако, данных о комплексном влиянии СИОЗС на функционирование и состояние яичников в экспериментах in vivo нет. Представленная работа будет посвящена исследованию этого вопроса на примере флуоксетина. Цель работы: Исследовать влияние флуоксетина на морфо-функциональное состояние яичника на модели системного воздействия флуоксетина на препубертатных мышей. 4

Поставленные задачи: 1. Проанализировать влияние системного введения флуоксетина на концентрацию серотонина в крови. 2. Определить влияние флуоксетина на уровни экспрессии мРНК гонадотропных гормонов в аденогипофизе. 3. Определить изменение активности мембранного транспорта серотонина в яичнике в эксперименте in vitro при воздействии флуоксетина. 4. Проанализировать влияние флуоксетина на морфологический статус овариальной ткани. 5. Выявить влияние флуоксетина на экспрессию мРНК мембранного транспортера серотонина, генов стероидогенеза, маркеров функционального состояния яичника, генов-мишеней Wnt - сигнализации, рецепторов к гонадотропным гормонам. 5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ФСГ - фолликулостимулирующий гормон; ЛГ - лютеинизирующий гормон; ППК – первичная половая клетка; СИОЗС – селективные ингибиторы обратного захвата серотонина; dpc – day post coitum – сутки эмбрионального развития; dpp – day post partum – сутки постнатально развития; 5-НТ - серотонин, 5-гидрокситриптамин; Sert - мембранный транспортер серотонина; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; ЦНС – центральная нервная система; ЖКТ – желудочно-кишечный тракт; цАМФ – циклический аденозинмонофосфат. 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Фолликулогенез Яичник – женская гонада, которая производит женские половые клетки и выполняет гормональную функцию, производя стероидные половые гормоны. На сроке 7.5 dpc (days post coitum) у мыши во внеэмбриональной мезодерме выявляются первичные половые клетки (ППК), предшественники ооцитов и сперматозоидов, они мигрируют в заднюю часть первичной полоски (Ginsburg et al., 1990), а затем в заднюю кишку (Anderson et al., 2000). К 10.5-11.5 dpc ППК мигрируют в половые валики (Molyneaux et al., 2001), образуя там кластеры (цисты) половых клеток, в которых клетки соединены цитоплазматическими мостиками. На следующем этапе определяется развитие бипотенциальной гонады по мужскому (XY) или женскому пути (ХХ). Развитие по мужскому типу определяется экспрессией гена Sry, который активирует Sox9, Fgf9. Fgf9 подавляет экспрессию Wnt4, который определяет развитие по женскому пути. В XX гонаде, в отсутствие Sry, Wnt4 и Rspo1 активируют передачу сигналов через β-катенин (Lin, Capel, 2015). Рис.1. Схема развития женской гонады у мыши (Sarraj et al., 2012). Далее после 14,5 dpc ППК вступают в мейоз до диплотены профазы первого деления, становясь первичными ооцитами (Jagarlamudi, Rajkovic, 2012). В течение этого периода более одной трети ооцитов дегенерируют в результате апоптоза или аутофагии. К 20 dpc - 5 dpp (days postpartum) из цист половых клеток образуются примордиальные фолликулы, которые составляют резерв 7

покоящихся фолликулов яичников (Pepling, Spradling, 2001; Menke et al., 2003). Примордиальный фолликул состоит из ооцита, окруженного плоскими прегранулезными клетками, которые образованием гранулезных клеток. Для примордиальных фолликулов позднее дифференцируются с поддержания состояния покоя необходимы Foxo3a, Lhx8, эффекторы сигнального пути PI3K/AKT, Sohlh1, Sohlh2, Nobox участвуют в активации роста фолликулов (Jagarlamudi, Rajkovic, 2012). Переход от примордиального к первичному фолликулу характеризуется изменением формы клеток гранулёзы из уплощенной в кубовидную. Известно, что активация примордиального фолликула инициируется в уплощенных клетках гранулезы путем активации передачи сигналов mTORC1, которая индуцирует переход гранулезных клеток из уплощенной в кубовидную форму (Zhang et al., 2014), и экспрессии Kitlg, который активирует путь PI3K/AKT в ооците, необходимый для его роста и выживания (Monniaux, 2016). Далее происходит рост первичного фолликула: ооцит растет, фолликулярные клетки пролиферируют, образуется базальная мембрана, окружающая фолликул, вокруг неё формируется слой клеток теки. Рост до вторичного (преантрального) фолликула обеспечивается взаимодействием между ооцитом и гранулезными клетками. Ооцит продуцирует факторы роста, такие как Gdf9, Bmp15, Igf1, Bmp6, которые необходимы для нормального развития фолликула (Sanchez, Smitz, 2012). Igf1 важен для регуляции роста фолликулов, пролиферации гранулезных клеток, клеточной дифференцировки и стероидогенеза (Kwintkiewicz, Giudice, 2009). Действуя синергично с гонадотропными гормонами ФСГ и ЛГ, он усиливает их влияние на яичник. Этот эффект проявляется в увеличении экспрессии 3b-Hsd, Cyp11a1 (Eimerl, Orly, 2002) и Cyp19a1 (Erickson et al., 1989). Gdf9 и Bmp15 активируют сигнальный путь Smad2/3 в клетках гранулезы и поддерживает их пролиферацию и выживание (Dong et al., 1996). Gdf9 также индуцирует образование теки (Liu et al., 2015). Клетки теки регулируют фолликулогенез за счет синтеза андрогенов и факторов роста (Bmp4, Bmp7, Ngf, 8

Fgf7, Egf, Tgf), которые увеличивают пролиферацию клеток гранулезы (Hutt et al., 2006). На данных стадиях рост фолликулов не зависит от гонадотропных гормонов гипофиза, однако ФСГ увеличивает выживаемость и пролиферацию гранулезных клеток, участвует в формировании антральных полостей (Russell et al., 2003). На следующей стадии фолликулогенеза, примерно на сроке 14 dpp, образуются вторичные фолликулы (антральные) с полостями, заполненными фолликулярной жидкостью. Клетки гранулезы в антральном фолликуле разделяются на две популяции - муральная гранулеза, осуществляющая стероидогенез, и клетки, окружающие ооцит - клетки кумулюса. Фолликулогенез на этой стадии зависит от наличия гонадотропинов гипофиза, фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и лютеинизирующего гормона (ЛГ). ФСГ необходим для выживания антральных фолликулов, пролиферации клеток гранулезы, продукции эстрадиола и экспрессии рецептора ЛГ (Edson et al., 2009; Richards and Pangas 2010a). Гонадотропины способны активировать различные сигнальные пути, такие как cAMP/PKA, PI3K/AKT, MAPK3/1 (Gloaguen et al., 2011). В антральных фолликулах ооцитарные факторы Bmp15 и Gdf9 ослабляют эффекты ФСГ и стимулируют пролиферацию и дифференцировку клеток гранулезы и теки, активируя путь Smad2/3 (Mottershead et al., 2015). Кроме того, Bmp15 и Gdf9 способствуют выживанию и метаболизму кумулюсных клеток до преовуляторной стадии (Hussein et al., 2005; Sugiura et al., 2007), экспрессии факторов, участвующих в поддержании целостности кумулюса (Ptx3), дифференцировке (Egfr), росте (Has2, Ptgs2, Ptger2) клеток, и в блокировании мейоза ооцитов (Npr2). Гены Has2 и Ptgs2 являются количественными маркерами степени дифференцировки клеток кумулюса (Zhen et al., 2014). В этих клетках данные гены обеспечивают синтез межклеточного матрикса, нужного для экспансии кумулюса, и функционирование ключевых механизмов межклеточной сигнализации. 9

Возвращаясь к Bmp15 и Gdf9, надо сказать, что эти 2 фактора ингибируют вызванную ФСГ продукцию прогестерона, что может быть важным для предотвращения преждевременной лютеинизации. Было показано, что Ggf9 подавляет стимулированную ФСГ секрецию эстрадиола, репрессируя ароматазу Cyp19a1, а также подавляет индуцированное ФСГ образование рецептора ЛГ Lhcgr в дифференцированных клетках кумулюса. Bmp15 снижает апоптоз кумулюсных клеток и подавляет экспрессию рецептора ФСГ Fshr (Otsuka, 2001, Vitt, 2000). Большинство антральных фолликулов подвергается дегенеративному процессу, атрезии фолликулов, только некоторые из них продолжат развитие до преовуляторной стадии. Муральная гранулеза этих фолликулов экспрессирует большое количество рецепторов к ЛГ, которое увеличивается с ростом фолликула. Перед овуляцией происходит усиление секреции эстрадиола, это вызывает активацию гипоталамуса и высвобождение большого количества ЛГ в кровь, что приводит к овуляции. Происходит возобновление мейоза ооцитов до метафазы II, расширение кумулюса, разрыв фолликула и высвобождение ооциткумулюсного комплекса. Оставшиеся клетки гранулезы и тека преобразуются в лютеоциты желтого тела (Edson et al., 2009). Желтое тело поддерживает ранние этапы беременности путем секреции прогестерона. Если оплодотворения не происходит, желтое тело подвергается дегенерации. Таким образом, на каждом этапе созревания фолликула происходит комплексное взаимодействие нескольких типов клеток с помощью множества регуляторных факторов. В эти регуляторные механизмы может также быть вовлечен серотонин. 10

Рис. 2. Этапы фолликулогенеза в яичнике и основные факторы, участвующие в этом процессе. Фиолетовый цвет – ооциты, синий - клетки гранулёзы, зелёный клетки теки, ППК - первичные половые клетки (Grossman, Shalgi, 2016). 2. Стероидогенез в яичнике Одной из важнейших функций яичника является синтез половых стероидных гормонов. Он происходит в зрелом антральном фолликуле и желтом теле после овуляции и заключается в преобразовании холестерина в 17βэстрадиол и другие половые стероидные гормоны. Стероидные гормоны, вырабатываемые яичником, влияют на все органы репродуктивной системы, участвуют в установлении гормональной среды для овуляции, оплодотворении, имплантации и беременности, в контроле менструального цикла. Кроме этого, они важны для нормальной работы мозга, сердечно-сосудистой системы, жировой ткани, кожи, костей и печени. Стероидогенез начинается с транспорта холестерина в клетки теки через рецепторы липопротеинов либо его синтеза de novo. Затем Star транспортирует холестерол в митохондрии. Там Cyp11a1 превращает холестерол в прегненолон путем расщепления его боковой цепи. Из митохондрий прегненолон диффундирует в гладкий ЭПР, где под действием Hsd3b и Cyp17a1 он превращается в прогестерон или DHEA, соответственно. Затем прогестерон и DHEA превращаются в андростендион с помощью Cyp17a1 и Hsd3b, соответственно. Далее андростендион преобразуется в тестостерон ферментом Hsd17b. Андростендион и тестостерон мигрируют из теки в клетки гранулезы. 11

Андростендион может быть превращен в эстрон ароматазой Cyp19a1. 17bэстрадиол может продуцироваться в клетках гранулезы из тестостерона с помощью Cyp19a1 или эстрона с помощью Hsd17b. Эстрадиол может быть инактивирован и метаболизирован в яичниках до 2- гидроксиэстрадиола через Cyp1a1/2 и Cyp3a4 или до 4-гидроксиэстрадиола через Cyp1b1. Также в клетках гранулезы возможен синтез прегненолона из холестерола с помощью Cyp11a1 и дальнейшее его превращение в прогестерон с помощью Hsd3b (Hannon et al., 2015). Синтез эстрадиола происходит под строгим контролем ФСГ и ЛГ, поэтому стероидогенез в яичнике известен как теория двух клеток и двух гонадотропинов. Клетки теки в раннем антральном фолликуле содержат только рецепторы к ЛГ (Lhcgr), а клетки гранулезы только к ФСГ (Fshr). При связывании соответствующих гормонов с рецепторами через взаимодействие с G-белком происходит активация сигнального пути цАМФ и стимуляция транскрипции генов, участвующих в стероидогенезе. Однако, кроме гонадотропинов на стероидогенез могут влиять и другие сигнальные факторы, активные в яичнике. 12

Рис. 3. Схема стероидогенеза в фолликуле яичника (Mlynarcikova et al., 2014). 3. Канонический WNT сигнальный путь в яичнике Семейство Wnt участвует во множестве клеточных процессов, включая эмбриональную индукцию, спецификацию оси, определение судьбы и дифференцировку клеток. Также он играет важную роль в постнатальном яичнике, обеспечивая его нормальное функционирование. Работа канонического Wnt-сигнального пути начинается со связывания лиганда Wnt с семимембранным рецептором frizzled и корецепторами LRP5 и LRP6. Это приводит к инактивации мультипротеинового деструктивного комплекса, который состоит из Axin, Gsk3β и APC. В отсутствие сигнала Wnt этот комплекс фосфорилирует β-катенин (Ctnnb1), что приводит к последующему убиквитинированию и его деградации протеасомой. Wnt позволяет β-катенину покинуть комплекс в нефосфорилированном состоянии. Он накапливается и затем может перемещаться в ядро, связываться с факторами транскрипции семейства TCF / LEF и активировать экспрессию генов-мишеней (Stapp et al., 2014; Lapointe, Boerboom, 2011). В эмбриогенезе Wnt4 определяет развитие гонад по женскому типу. У взрослых мышей Wnt4 участвует в регуляции генов, важных для фолликулогенеза, таких как Adamts1, Ptgs2, Vegfa, Cdkn1a. Было показано, что в клетках гранулезы с повышенной экспрессией Wnt4 наблюдалась сверхэкспрессия генов Star, Cyp11a1 и Cyp19a1. Нокаут гена Wnt4 приводит к бесплодию и нарушению развития антральных фолликулов (Boyer et al., 2010), а нокаут гена frizzled 4 – к нарушению функций желтого тела и также бесплодию (Hsieh et al., 2003). Интересно, что хорионический гонадотропин человека повышает экспрессию Wnt4, особенно в терминально дифференцированных лютеоцитах (Hsieh et al., 2002). Wnt2 положительно регулирует пролиферацию клеток гранулезы в культуре и может способствовать синтезу ДНК (Wang et al., 2010). 13

Активация сигнального пути Wnt / β-катенина может подавлять рост фолликулов посредством передачи сигналов Foxo3a. Было показано, что активация Wnt пути приводит к увеличению экспрессии генов-мишеней Foxo3a - Bcl2l11 (Bim), Bbc3 (Puma) (факторы проапоптоза) и Cdkn1b (p27) (ингибитор клеточного цикла), подавлению пролиферации и апоптозу гранулезных клеток (Li et al., 2014). Известно, что в фолликулярных клетках антральных и преовуляторных фолликулов β-катенин (Ctnnb1), ключевая молекула канонического пути Wnt, усиливает ФСГ-зависимый рост фолликулов, пролиферацию клеток и уменьшает апоптоз гранулезных клеток (атрезию), усиливает экспрессию генов Cyp19a1, Fshr, Nr5a1, cyclin A. Также на культурах клеток гранулезы крыс было продемонстрировано, что β-катенин усиливает индуцированную ФСГ экспрессию Cyp19a1 путём взаимодействия с транскрипционным фактором Nr5a1 (Parakh et al., 2006). Аналогично, на культурах клеток гранулезы мышей было продемонстрировано, что снижение уровня β-катенина значительно снижает способность ФСГ стимулировать экспрессию Cyp19a1, что приводит к уменьшению синтеза эстрадиола (Gifford, 2009). Однако, в другом исследовании на клетках гранулёзы крыс показали противоположные эффекты Wnt. Там совместная активация путей ФСГ и Wnt приводит к подавлению экспрессии основных стероидогенных ферментов Star, Cyp11a1, Cyp19a1 и факторов дифференцировки яичников Lhcgr и ингибинаальфа Inha. Авторы предполагают, что каноническая передача сигналов Wnt может быть определена как новый тормозной путь для развития фолликулов через отрицательную обратную связь на чувствительных к TCF генах (Stapp et al., 2014). Fan et al. в 2010 году также обнаружили, что β-катенин подавляет ЛГиндуцированное созревание ооцитов, овуляцию, лютеинизацию, синтез прогестерона и экспрессию генов Lhcgr, Star, Cyp11a1, Sfrp4, Ptgs2. Ещё одно исследование по активация пути Wnt / β-катенина в антральных фолликулах 14дневных мышей с помощью LiCl и Wnt3a продемонстрировало, что данное воздействие приводит к повышению уровня β-катенина и, тем самым, 14

увеличивает уровни экспрессии мРНК нижестоящих мишеней - Cyclin D1, Axin2 и Fgf9. Кроме этого, происходит нарушение стероидогенеза, а именно уменьшение уровней экспрессии Cyp19a1, Cyp11a1, Hsd3b, уменьшение концентрации эстрадиола и тестостерона. Ингибирование пути Wnt/β-катенина с помощью Iwr-1 приводит к противоположным эффектам (Li et al., 2014). Таким образом, активация Wnt пути в разных экспериментах оказывает противоположные эффекты на стероидогенез и фолликулогенез. Это может быть связано с различиями в используемых моделях или методиках. Также существует предположение, что передача сигналов Wnt выполняет разные функции в зависимости от времени и типа клеток. Рис. 4. Схема совместной работы сигнальных путей ФСГ и Wnt в клетках гранулезы (Gifford, 2015). 4. Серотонинергическая система в яичнике 4.1. Компоненты серотонинергической системы Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-НТ) является классическим нейромедиатором, который, к тому же, обладает большим спектром функций, не связанных с нервной системой. Практически во всех классах животных он осуществляет сигнальную и регуляторную 15 функции. Компоненты

серотонинергической системы наиболее хорошо изучены на примере нервного синапса, где серотонин выполняет роль нейротрансмиттера (Рис.5). Синтез серотонина происходит в два этапа из незаменимой аминокислоты Lтриптофана. На первом этапе она гидроксилируется до 5-гидрокситриптофана (5-HTP) с помощью фермента триптофан гидроксилазы (Tph). Эта реакция является лимитирующей. Триптофан гидроксилаза имеет две изоформы. Tph1 осуществляет синтез серотонина на периферии, а Tph2 характерна для нейронов ЦНС (Höglund et al., 2019). На втором этапе декарбоксилаза ароматических Lаминокислот (Ddc) декарбоксилирует 5-HTP с образованием 5- гидрокситриптамина (5-HT), серотонина. В нейронах 5-HT собирается в клетке в везикулах с помощью везикулярных переносчиков моноаминов Vmat1 (Slc18a1) и Vmat2 (Slc18a2). При поступлении Ca2+ он высвобождается путем экзоцитоза в межклеточное пространство и действует на свои рецепторы. Рис.5. Серотонинергическая система на примере нервного синапса (David, Gardier, 2016). У млекопитающих существует 7 классов рецепторов к серотонину Htr1 Htr7, которые далее делятся на 14 подтипов от A до F. Все они имеют семь типичных родопсин-подобных трансмембранных доменов и являются метаботропными, то есть ассоциированы с G-белком, за исключением класса Htr3, который представляет собой ионотропный рецептор - лиганд-зависимый катионный канал. При связывании лиганда в клетке запускаются различные молекулярные каскады. Известно, что активация Htr1 и Htr5 вызывает 16

ингибирование активности аденилатциклазы и снижение уровня цАМФ, рецепторы классов Htr4, Htr6 и Htr7 вызывают, наоборот, увеличение уровня цАМФ, а Htr2 вызывает повышение уровня Ca2+ через фосфатидил-инозитол бисфосфатный гидролиз. Htr7 и Htr1 могут действовать как через цАМФ, так и через Ca2+ (Raymond et al., 2001). Большая часть высвобожденного 5-HT захватывается из пресинаптической щели обратно благодаря транспортеру Sert (Mohammad-Zadeh et al., 2008). Повторный захват серотонина происходит в везикулы, или он катаболизируется. Деградация серотонина происходит с помощью моноаминоксидазы (MaoА), которая окисляет серотонин до 5-гидроксииндолуксусного альдегида. Далее он под действием альдегиддегидрогеназы превращается в 5-гидроксидиндол уксусной кислоты (5-HIAA) (David et al., 2016). 5-HIAA может регулировать болевую чувствительность при воспалении и являться показателем меры метаболитической активности в организме (Chen et al., 2011). Эффекты серотонина могут быть опосредованы активацией рецепторов или его поступлением внутрь клетки с помощью Sert. Действуя через мембранный транспортер, серотонин может влиять на такие поведенческие реакции как половое и пищевое поведение, восприятие раздражителей, моторную активность, когнитивные функции и эмоции (Murphy, 2004). Возможно, серотонин принимает участие в регуляции активности белков путем их серотонилирования (Bader, 2019). В ЦНС Sert локализируется в пресинаптических мембранах нервных окончаний рядом с телами серотонинергических нейронов среднего мозга и ядер шва. Там он играет важную роль в регуляции силы и длительности нервных сигналов (Hoffman et al., 1998). Вне ЦНС Sert (Slc6a4) экспрессируется в нейронах периферической нервной системы, в тромбоцитах, кишечнике, плаценте и эпителиальных клетках (Kristensen et al., 2011). Работа Sert регулируется фосфорилированием и ионами Na+, K+, Cl- (Torres et al., 2003). 17

4.2. Роль серотонина в организме. В организмах позвоночных животных только 5% 5-HT синтезируется в головном мозге на уровне ядер шва, а 95% синтезируется на периферии, причем большая часть - в энтерохромаффинных клетках двенадцатиперстной кишки (Voits et al., 2016). Таким образом, формируются 2 пула серотонина, в каждом из которых он выполняет специфические функции, так как не может проходить сквозь гематоэнцефалический барьер (El-Merahbi et al., 2015). Часть серотонина, синтезированного энтерохромаффинными клетками в интерстициальное пространство, остаётся и функционирует в кишечнике: связывается с рецепторами близлежащих нервных волокон или транспортируется с помощью Sert в эпителиальные клетки. Вторая часть попадает в плазму крови, откуда поглощается тромбоцитами также с помощью Sert и накапливается в виде гранул (Mawe, Hoffman, 2013). В головном мозге серотонин действует как нейротрансмиттер и участвует в регуляции высшей нервной деятельности, поведения, настроения, обучения, физиологических процессов (Lesch et al., 2012). В гипоталамусе 5-HT участвует в регуляции секреции гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH), который стимулирует секрецию гонадотропинов, фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и лютеинизирующего гормона (ЛГ) гипофизом. Связывание 5-HT с рецептором Htr2 стимулирует секрецию GnRH и ФСГ, а активация рецепторов Htr1 и Htr2 усиливает секрецию ЛГ (Gouveia, Franci, 2004). На периферии серотонин может действовать как гормон, ауто- и паракринный фактор или внутриклеточная сигнальная молекула. Серотонин выполняет большое количество важных функций во многих системах органов человека. Он стимулирует агрегацию тромбоцитов в крови, вызывает расширение сосудов (Ni, et al., 2006), регулирует работу клапанов, желудочков сердца и электрическую проводимость (Doggrell, 2003). Кроме того, он привлекает нейтрофилы к очагу воспаления (Duerschmied et al., 2013). Серотонин помогает контролировать дыхание, воздействуя на центры в стволе мозга. В скелетных мышцах он стимулирует активность фосфофруктокиназы, усиливая 18

интенсивность гликолиза (Coelho et al., 2007). В ЖКТ серотонин влияет на секреторную функцию и перистальтику (Banskota et al., 2018), в поджелудочной железе он может способствовать секреции инсулина, периферической инсулинорезистенции, может вызывать недостаточность B-клеток при диабете (Maléth et al., 2015). Также, серотонин способствует глюконеогенезу и подавляет поглощение глюкозы в печени (Ruddell et al., 2008). В жировой ткани он регулирует липогенез, в белой жировой ткани способствует липолизу и резистентности к инсулину, подавляет поглощение клетками глюкозы и выработку адипонектина (Oh et al., 2015). В молочной железе серотонин, синтезирующийся под действием пролактина, стимулирует выработку молока (Stull et al., 2007). Также серотонин увеличивает длительность эякуляции и регулирует мочеиспускание. Известно, что 5-НТ регулирует пролиферацию фибробластов, лимфоцитов, регулирует дифференцировку остеобластов, регенерацию печени (Dube, Amireault, 2007). 4.3. Серотонин в женской репродуктивной системе В репродуктивной системе самок млекопитающих серотонин принимает участие в синтезе стероидных гормонов, созревании ооцита и овуляции, регуляции раннего эмбрионального развития (Dube, Amireault, 2007). Серотонин обнаружен в яйцеводах, матке и яичниках различных грызунов. В яичнике серотонин выявляется в ооцитах, клетках кумулюса и фолликулярной жидкости (Amireault, Dubé, 2005). Показано, что в клетках кумулюса экспрессируется Tph1 (Dubé, Amireault, 2007), а в зрелых ооцитах и доимплантационных эмбрионах - Tph2 (Basu et al., 2008), однако, ни в ооцитах, ни в клетках гранулёзы не выявляется Ddc, что говорит о невозможности синтеза серотонина в овариальном фолликуле (Никишин и др., 2018). Предположительно, основным источником серотонина в клетках яичника является его захват из внеклеточной среды с помощью транспортера Sert. Данный ген экспрессируется в ооцитах, фолликулярных клетках и в ранних эмбрионах (Amireault, Dubé, 2005), однако, активность мембранного транспорта 19

выявляется только в ооцитах (Никишин и др., 2018). Точные источники серотонина в яичнике до сих пор не известны, но считается, что ими могут являться тромбоциты в крови, тучные клетки в строме и нервные волокна (Amenta et al., 1992). В фолликулярных клетках преовуляторных фолликулов и желтых телах мыши была показана экспрессия основных компонентов серотонинергической сигнальной системы, таких как Tph, Maoa, транспортеры Sert, Vmat1, Vmat2, рецепторы Htr1b, Htr1d, Htr2a, Htr2b, Htr5b, Htr7. При этом уровни экспрессии Vmat1, рецептора лютеинизирующего гормона Lhcgr и ферментов Cyp11a1 и Cyp19a1 увеличиваются в ходе фолликулярного роста, тогда как уровни экспрессии Vmat2, Htr1b, Htr7, маркера пролиферации Mki67, наоборот, уменьшаются (Никишин и др., 2017). У мышей нокаут по Htr2b приводит к тяжелым аномалиям развития сердца у восьмидневных эмбрионов (Nebigil et al., 2016), нокаут по Htr7 – к нарушениям в терморегуляции (Hedlund et al., 2016). У мышат, чьи матери нокаутированы по гену Tph1, наблюдается отставание в росте эмбрионов на ранних стадиях, позже, когда эмбрион начинает производить собственный серотонин, отставание нивелируется (Côté et al., 2003). Серотонин в качестве донервного трансмиттера контролирует внутриклеточные молекулярные процессы, регулируя раннее эмбриональное развитие и созревание яйцеклеток. Например, он влияет на степень полимеризации тубулина, перестройку цитоскелета. На морских ежах была показана его необходимость для осуществления делений дробления. В этом процессе он может выступать в качестве межклеточного посредника при взаимодействии бластомеров (Buznikov et al., 1981). Также серотонин играет важную роль в регуляции дифференцировки клеток и морфогенетического движения клеток в процессе гаструляции (Smales et al., 1985). У самок млекопитающих периферический серотонин может участвовать в осуществлении нормальной половой функции (Frohlich et al., 2000), регулировать сокращения матки путём взаимодействия с Htr2а рецепторами 20

(Minosyan et al., 2007), способствовать экспрессии коллагеназы в матке (Jeffrey et al., 1991). Интересно, что содержание серотонина в яичнике меняется в течение эстрального цикла (Clausell et al., 1978). Серотонин стимулирует секрецию прогестерона в культуре клеток гранулезы свиньи (Sirotkin, 1995) и в культуре человеческих клеток гранулезы посредством взаимодействия с Htr7 рецептором (Graveleau et al., 2000). Инкубация желтого тела с 5-HT у крупного рогатого скота увеличивает секрецию им прогестерона, возможно, вследствие взаимодействия с рецепторами Htr1 и Htr2 (Battista, Condon, 1986). Также, серотонин стимулирует секрецию эстрадиола и прогестерона в культурах преовуляторных фолликулов хомяка (Terranova et al., 1990) и эстрадиола в культурах фолликулов крысы (Tanaka et al., 1993). Однако, в экспериментах in vivo получены противоположные результаты. Системное введение серотонина (25 мг/кг) 30-дневным самкам крыс вызывает задержку времени открытия влагалища, времени первого эструса, уменьшение числа овулирующих животных и концентраций ФСГ, ЛГ, эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови. Тогда как введение серотонина в сумку яичников не повлияло на начало полового созревания, частоту овуляции, количество яйцеклеток и овулирующих животных, а также концентрации ФСГ, ЛГ и прогестерона. Притом, концентрация эстрадиола уменьшилась и в этом эксперименте (Moran et al, 2013). Показано, что в культуре первичных многослойных фолликулов серотонин увеличивает экспрессию генов-маркеров функциональной активности клеток гранулезы (Ccnd1, Ccnd2, Ccne1, Has2, Ptgs2, Ptgfr, Igfbp и Ihh) и ооцитарного фактора роста Gdf9. Эффект серотонина отменялся добавлением флуоксетина во всех случаях, кроме циклинов. Так как в фолликулярных клетках не активны системы синтеза и захвата серотонина, его влияние на функционирование этих клеток, вероятно, опосредовано влиянием на ооцит (Никишин и др., 2021). В ооцитах и желтом теле из серотонина синтезируется мелатонин (Nацетил-5-метокситриптамин) с помощью ферментов ААНАТ и АСМТ (Emet et 21

al., 2016). Мелатонин может принимать участие в росте и созревании ооцитов (Sakaguchi et al., 2013), уменьшать окислительный стресс в ранних эмбрионах за счет своих антиоксидантных свойств. 5. Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС). Серотонин является важным нейротрансмиттером центральной нервной системы, который регулирует базовые психофизиологические функции. При нарушении функционирования серотонинергической системы в мозге может возникать депрессивное расстройство (Blier, El Mansari, 2013). Для лечения депрессии наиболее широко в терапевтической практике применяют селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС), которые специфически блокируют мембранный транспортер серотонина Sert и повышают синаптические уровни серотонина, что увеличивает активность серотонинергической системы в различных областях переднего мозга, включая гипоталамус. Повышение концентрации серотонина в синаптической щели приводит к активации постсинаптических рецепторов Htr1а, Htr1b, Htr1d, Htr2b и Htr4, что и оказывает антидепрессивный эффект (David, Gardier, 2016). К этой группе антидепрессантов относятся флуоксетин (прозак), пароксетин, венлафаксин, циталопрам, сертралин и флувоксамин, эсциталопрам. Чаще всего для лечения депрессии назначают флуоксетин, так как он обладает наименьшим тератогенным действием (Heikkinen et al., 2003). Помимо ингибирования Sert, флуоксетин также действует как антагонист рецепторов серотонина Htr2 (Laakso et al., 1996). Флуоксетин регулирует множество сигнальных молекул, активированную например, протеинкиназу протеинкиназу (MAPK) и C (PKC), митоген- Ca/кальмодулин-зависимую протеинкиназу II (CaMKII), тем самым контролируя пролиферацию клеток и экспрессию генов (Edgar et al., 1999; Mercier et al., 2004; Cammarota et al., 2008). Ряд исследований говорит о негативных последствиях применения флуоксетина в период беременности для потомства. 22

Употребление флуоксетина матерями во время беременности, возможно, может способствовать появлению у детей врожденных аномалий, таких как пороки сердца, легочная гипертензия, гастрошизис (Reefhuis et al., 2015). Употребление флуоксетина беременными самками крыс в течение 2 недель приводит у их потомков к увеличению продолжительности эстрального цикла, количества фолликулов, овариального апоптоза, а также к повышению экспрессии генов, регулирующих серотониновый сигналинг и биологические ритмы - ERβ, Cry1 и Tph2 (Moore et al., 2015). Кроме того, прием антидепрессантов негативно сказывается на доимплантационном развитии (Kim et al., 2012). Также было показано, что флуоксетин оказывает негативное действие на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток (Kusakawa et al., 2008). Другие исследования демонстрируют негативное действие флуоксетина на женскую репродуктивную систему во взрослом возрасте. Воздействие флуоксетина на самок Danio rerio приводит к уменьшению количества икры, снижению уровня эстрадиола в яичниках, угнетению экспрессии ароматазы Cyp19a1 и мРНК рецепторов к гонадотропным гормонам Fshr и Lhr (Lister et al., 2009). Также, было показано, что длительное пероральное получение пароксетина в концентрации 10 мг/кг/день мышами в возрасте 21 dpp приводит к подавлению экспрессии ароматазы Cyp19a1 в яичниках, снижению уровня циркулирующего 17β-эстрадиола, аномальному накоплению жира, устойчивости к инсулину и непереносимости глюкозы. Аналогичные негативные эффекты наблюдаются у мышей с нокаутом гена Sert (Slc6a4) (Zha et al., 2017). На препубертатных крысах в возрасте 30 дней было показано, что однократное введение флуоксетина (5 мг/кг) приводит к увеличению концентрации эстрадиола через 48 часов (Romero-Reyes et al., 2016). Этот эффект, по мнению авторов, связан со стимуляцией серотониновых рецепторов Htr2а в клетках гранулезы, что приводит к повышению экспрессии ароматазы Cyp19a1 (Klempan, 2011). 23

Результаты ещё одного исследования говорят о том, что флуоксетин в концентрации 6 мкМ нарушает морфогенез эмбриоидных тел P19C5, изменяя уровни экспрессии различных генов-регуляторов развития. Обработка флуоксетином нарушает дифференцировку мезодермы, но является нейтральной для дифференцировки в нейральном направлении. Например, происходит снижение экспрессии гена Brachyury, который, к тому же, является прямой мишенью канонической передачи сигналов Wnt. Было продемонстрировано, что флуоксетин подавляет каноническую передачу сигналов Wnt/ß-катенина в клетках P19C5 независимо от его ингибирующего эффекта на Sert. Это подтверждается тем, что блокирование Sert с помощью других СИОЗС, циталопрама и венлафаксина, не влияет на Wnt сигнализацию (Warkus, Marikawa, 2018). Негативное действие флуоксетина на морофогенез и передачу сигналов Wnt может быть опосредовано его трифторметилфенильным фрагментом. Этот фрагмент также присутствует у другого ингибитора канонического сигнального пути Wnt - XAV939, который является ингибитором танкираз (TNKS), которые, в свою очередь, являются негативными регуляторами Axin (Huang et al., 2009). Таким образом, в присутствии флуоксетина может происходить стабилизация связывания ß-катенина с деструктивным комплексом, содержащим белки APC и Axin (Miyamoto et al., 2017). Известно, что у пациентов с депрессией средние концентрации флуоксетина в плазме крови находятся на уровне 0,31 ± 0,16 мкМ, что значительно ниже концентраций, которые оказывают негативные эффекты в экспериментах на животных (Amsterdam et al., 1997). Однако, флуоксетин обладает тканеспецифическим накоплением, в одном из экспериментов его концентрация в мозге оказалась в 10-20 раз выше, чем в плазме крови (Bolo et al., 2000). Итак, серотонин может оказывать различные эффекты на женскую репродуктивную функцию. Вероятно, синтеза серотонина в яичнике не происходит, и основным механизмом его появления в клетках является захват из 24

внеклеточной среды с помощью Sert. Данная работа посвящена исследованию вопроса о том, как системное воздействие флуоксетина, ингибитора Sert, влияет на функционирование яичников. 25

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Животные Исследование было выполнено на самках мышей линии С57BL/6J (питомник “Столбовая”, РАН). Животные содержались в стандартных условиях вивария с контролируемым режимом освещения и неограниченным доступом к еде и воде. Получали самок с датированным сроком беременности методом определения вагинальных пробок. К самкам в вечернее время подсаживали самцов, утром проверяли вагинальные пробки. День обнаружения вагинальной пробки считали первыми сутками эмбрионального развития - 0,5 dpc (days post coitum – дни после спаривания). День обнаружения потомства считали первыми сутками постнатального развития - 1 dpp (days post partum – дни после рождения). 2. Введение флуоксетина in vivo Использовали самок мышей в возрасте 7 dpp. В опыте животным (N=10) каждый день в течение 7 дней до возраста 14 dpp проводили подкожные инъекции в холку флуоксетина (Sigma, США) в дозировке 25 мг/кг. Контрольным животным (N=10) вводили 0,9% NaCl (Sigma, США) в такой же концентрации. По завершении эксперимента мышей умерщвляли декапитацией, собирали кровь для определения концентрации серотонина в плазме, выделяли аденогипофиз для молекулярно-генетического анализа, яичники для молекулярно-генетического и иммуногистохимического анализа. 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией (ВЭЖХ) Собранную кровь выдерживали при комнатной температуре 20 минут, затем отделяли плазму от форменных элементов центрифугированием (+4°С) при 1000 об/мин в течение 10 минут и добавляли в нее 250 пмоль/мл 3,4дигидроксибензиламин гидробромида (ДГБА) –внутренний стандарт (Sigma, США) в 0,1 н HClO4 (Sigma, США). 26

Концентрацию серотонина в плазме крови определяли при помощи обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Amperometric detector LC 4B, Bioanalytical Systems, США). Разделение проводили на 40-ти сантиметровой колонке ReproSil-Pur с диаметром пор 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, Германия) при температуре +30°С и скорости подвижной фазы 1,2 мл/мин. Состав подвижной фазы: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0,3 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрила, pH 2,8 (все реактивы - Sigma, США). Содержание серотонина рассчитывали методом внутреннего стандарта с помощью программы LabSolutions (Shimadzu, Япония), используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце. 4. Определение активности мембранного транспорта серотонина in vitro Проводили инкубацию яичников самок из контрольной и экспериментальной групп в среде L15 и в среде с добавлением серотонина в концентрации 10-6 М. Инкубирование. Изолированные яичники контрольных и экспериментальных мышей отмывали от крови в среде DMEM/F12 (Панэко), от каждой самки брали половину одного яичника и делили на фрагменты так, чтобы в каждую экспериментальную чашку попало по одному фрагменту яичника каждой самки. В опыте инкубирование образцов проводили в среде L15 (Панэко) с добавлением 10 -6М серотонина (Sigma-Aldrich), в качестве контроля использовали среду L15. Инкубирование проводили в течение 2 ч при 37°C. Фиксация и приготовление криосрезов. Далее фрагменты яичника фиксировали в 4% параформальдегиде (pH 7.5), отмывали при помощи PBST и проводили через 15% и 30% сахарозу. Далее заключали в среду Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek, замораживали при температуре -40°С и хранили при 80°С. Изготавливали криосрезы толщиной 20 мкм на криостате Leica CM1900, монтировали на предметные стекла SuperFrost Plus так, чтобы на одном стекле находились срезы контрольных и опытных яичников, высушивали на воздухе в 27

течение 2 часов. Проводили отмывку материала заливки с помощью PBST 3 раза по 20 мин, затем покрывали блокирующим раствором 1% BSA 0.5% Triton X-100 0.05% азид натрия 0.01M на PBS, pH 7.2-7.4 на 2 часа во влажной камере при комнатной температуре. Иммуногистохимическое окрашивание. Криосрезы окрашивали кроличьими антителами против серотонина (Sigma-Aldrich S5545) в разведении 1:1000 в течение 12 часов при 4°С. Проводили отмывку PBST 5 раз по 15 минут, наносили козьи антитела против IgG кролика, конъюгированные с зеленым флуорофором FITC (Jackson ImmunoResearch 107807) в разведении 1:200 на 1,5 часа. Отмывали срезы PBST 3 раза по 15 минут и заключали в заливочную среду Fluoroshield Mounting Medium (Abcam ab104135). Препараты просматривали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica SP5 (ЦКП ИБР РАН) и регистрировали иммунофлуоресценцию при постоянных параметрах интенсивности лазера и чувствительности детектора. Уровень иммунофлуоресценции на полученных изображениях измеряли в программе ImageJ и статистически обрабатывали в программе GraphPad Prism. 5. Морфологический анализ яичников Для анализа морфологии от каждой самки брали половину одного яичника. Фиксацию и приготовление криосрезов осуществляли по описанному выше протоколу. Получали серийные срезы толщиной 20 мкм, для анализа брали каждый пятый срез из серии. Далее окрашивали срезы LCA-флуоресцеином (ThermoFisher Scientific, Lens Culinaris Agglutinin (LCA), Fluorescein, L32475) в разведении 1:500 в PBS в течение 30 минут. Препараты просматривали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica SP5 (ЦКП ИБР РАН). Морфологические параметры обсчитывались в программе ImageJ. 6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР) Для анализа методом ПЦР в реальном времени брали по 1 яичнику и гипофизу от каждой самки. 28

Выделение тотальной РНК. Выделенные яичники и аденогипофиз отмывали от крови в среде DMEM/F12 (Панэко), затем проводили выделение тотальной РНК гуанидин-изотиоцианатным методом. Пробы гомогенизировали пестиком в 1 мл TRI Reagent (Sigma, США), добавляли 100 мкл 1-бром-3хлорпропанола (Sigma, США), инкубировали 10 мин при комнатной температуре и вортексировании каждые 5 минут, центрифугировали 15 минут при 14000 g и +4°С. Водную фазу собирали в новую пробирку и добавляли 500 мкл изопропанола (Sigma, США), инкубировали 5 мин при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 14000 g. Осажденную РНК отмывали 1 мл 70% этанола 3 раза, высушивали на воздухе, растворяли в воде (Water RNAse free, Fermentas, США). Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (ThermoFisher Scientific, США). Обработка РНК ДНКазой и переосаждение. Чтобы удалить примеси геномной ДНК выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I (Sigma) 100 мкг/мл при 37°C в течение 30 мин в реакционной смеси, содержащей РНК, 1Х буфер (10 мМ Tris-HCl, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мМ CaCl2, pH 7,5), ингибитор РНКаз RiboLock (1 ЕА/мкл) (Fermentas, США), ДНКазу I (1 ЕА на 1 мкг РНК) (Fermentas, США). Реакцию останавливали добавлением EDTA (Fermentas, США) и инкубацией 10 минут при 65ºC. Переосаждение РНК производили добавлением хлорида лития (до конечной концентрации 4 М) (Sigma, США) и инкубацией при –20°C в течение ночи, далее центрифугировали 60 минут при 14000 g. Осадок РНК отмывали в 200 мкл 70% этанола, высушивали на воздухе и растворяли в воде. Обратная транскрипция. Синтез кДНК проводили с помощью набора MMLV RT kit (Евроген) согласно протоколу производителя. Синтез кДНК проводили в реакционной смеси, содержащей РНК, 1Х буфер (70 мМ Tris-HCl, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 7,5 мМ MgCl2, pH 8,3), рандомные гексануклеотиды (10 мкМ), смесь нуклеотидтрифосфатов (0,4 мМ каждого), ингибитор РНКаз RiboLock (1 ЕА/мкл), обратную транскриптазу M-MLV (100 ЕА на 1 мкг РНК) 29

(Fermentas, США). Смесь инкубировали 10 мин при 20ºC, 15 мин при 37ºC, 90 минут при 42ºC. Реакцию останавливали инкубацией при 70ºC в течение 10 мин. ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили в коммерческой реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR+LowROX (Евроген), содержащей 1Х буфер (KCl, Трис-HCl, 3 мМ MgCl2, pH 8,8), смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, глицерин, Tween 20, интеркалирующий краситель SYBR Green I, пассивный референсный краситель ROX, ДНК полимеразу Taq и ингибирующие активность полимеразы антитела, к которой добавляли кДНК и специфические олигонуклеотиды (0,12 мкМ каждого) (Fermentas, США). ПЦР проводили на автоматическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США). Первичную обработку результатов осуществляли с помощью программы 7500 Software (Applied Biosystems, США). Расчет относительной экспрессии гена (RQ) проводили методом ΔΔCt. Исследуемые гены в гипофизе и яичнике представлены в Табл.1. Нормирование проводилось на гены домашнего хозяйства Rps18 и Tbp. Таблица 1. Гены и праймеры для ПЦР в реальном времени. Название NCBI Последовательности гена прямых праймеров (5`→3`) обратных праймеров (5`→3`) Gene Последовательности ID Гены гонадотропных гормонов в гипофизе Fshb 14308 TCGCCCACCCTTGTCCT CTGGCCCTGGCACTCCTA Lhb 16866 TGGCCGCAGAGAATGA TGAGGGCTACAGGAAAG GTT GAGAC Маркеры функционального состояния яичника Star 20845 GCCCACTTTTCTGTCCCT CTGCCCTCGCTCACCTTA TAT 30

Cyp11a1 Cyp17a1 Cyp19a1 Has2 13070 13074 13075 15117 GCCTGGAGCCATCAAGA GAAAAGCGGAATAGGTC ACT ATCACT CGGTGGCCCCCTTGCTC GGCTGGTCCCATTCATTT A TTATCGTG TCTCCTCATCAAACCAA CAGTTGCAAAATCCATAC ACATCTTCT AGTCTTCC GCGGAAGAAGGGACAA TGCGGTGCCACAATACTG CA Ptgs2 Ccnd1 19225 12443 CCCTCCGGTGTTTGTCCT CCTGCAGCATTTTTCATC T TTGTA GACACCAATCTCCTCAA GGCCACGATTTTCCGCAT CGACC G Ооцитарные факторы роста Bmp6 Bmp15 Gdf9 Igf1 12161 12155 14566 16000 ACCGTACTTTGTGGCAG GAAAAGGCAAAGAGCAG AGC AGTTAG GAATCTGATGCCTCTTG ATGGCATGGTTGGGTGAA TCCTT T GCCTCCCCGACCTTTAG TGCCTCAGACTCCACATT A TTC GACCGAGGGGCTTTTAC GGCGCTGGGCACGGATA TTCAACA G Гены рецепторов к гонадотропным гормонам в яичнике Fshr Lhcgr 14309 16867 TGCTACACCCACATCTA GGATCTTGGCCTTGGACA CCTCACA CAGT CTCTCACCTATCTCCCTG TGTAAAAGCACCGGGTTC TCAAAGTAA AATGT Мембранный транспортер серотонина Sert Slc6a4 15567 GGGAGACCTGGGGCAAG CAGGGCGAGCTCCATGTA AAG GAAGA 31

Гены-мишени Wnt/β-catenin сигнального пути Bbc3 Bcl2l11 Cdkn1b Axin2 17077 CCCACCACCATCTCAGG CTAGTGGTCAGGTTTGGC 0 AA TCATA 12125 AGACAGCCAGGGGAGA CAGGCCAAAAGCAAACA TACAA GTC 12576 12006 TAACCCGGGACTTGGAG CGGGGGCCTGTAGTAGA AA AC GAGTAGCGCCGTGTTAG GCTCCCCCAGTCCATCTT TGA Fgf9 14180 GCGGTGGGTTCTTATTG CTCTCCCGCAGCCTCTC ATTA Fzd4 14366 AAGACGGGACAAAGAC GCCCACGAGCAAAGACA AGACAA TAA Референсные гены Rps18 20084 AAGAAAATTCGAGCCCA TAACAGCAAAGGCCCAG TAGAGG TBP 21374 AGACT GTAGCGGTGGCGGGTAT CGTCTTCAATGTTCTGGG CT TTATCT 7. Статистическая обработка данных Статистическая обработка данных производилась в программе GraphPad Prism (GraphPad Software, CША). 32

РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Определение концентрации серотонина в крови После семидневных подкожных инъекций флуоксетина была измерена концентрация серотонина в плазме крови. Результаты анализа показали, концентрация серотонина в крови опытных мышей уменьшилась в 15,5 раз: с 1803,064 нг/мл в контрольных мышах до 115,6029 нг/мл в опытных мышах (Рис.6). 2000 1500 1000 500 0 * Контроль Опыт Рис. 6. Концентрация серотонина в плазме крови. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM), * - p <0,05 по t-критерию Стьюдента. 2. Определение активности мембранного транспортера серотонина в яичнике в эксперименте in vitro Проводили инкубацию яичников самок из контрольной и экспериментальной группы в стандартной среде L15 и в среде L15 с добавлением серотонина в концентрации 10-6 М в течение 2 часов и последующее иммуногистохимическое окрашивание антителами против серотонина (Рис.7). Был проведён количественный анализ интенсивности иммунофлуоресценции на полученных конфокальных изображениях (Рис.8). Иммунореактивность против серотонина выявляется в большинстве ооцитов, в фолликулярных клетках и некоторых клетках стромы. Наибольший уровень накопления серотонина наблюдается в ооцитах. В яичниках контрольной группы интенсивность иммунофлуоресценции ооцитов образцов, инкубировавшихся в среде с серотонином составляет 275% от контроля (Рис. 2 А, Б), в яичниках 33

опытной группы (Flu) интенсивность иммунофлуоресценции ооцитов образцов, инкубировавшихся в среде с серотонином составляет 137% от контроля (Рис. 2 В, Г). При этом уровень иммунофлуоресценции ооцитов яичников экспериментальной группы (Flu), которой проводили инъекции флуоксетина (Рис. 2Г), составила 47% от значений в контрольной группе (Рис. 2Б). Значения интенсивности иммуноокрашивания экспериментальной групп, ооцитов инкубировавшихся яичников контрольной в без среде и добавления серотонина (Рис. 2 А, В), значимо не отличаются. Рис. 7. Иммуногистохимическое выявление активности захвата серотонина ооцитами в эксперименте in vitro. Срезы окрашены антителами против серотонина. А - яичник контрольных мышей, инкубация 2 часа в среде L15, Б яичник контрольных мышей, инкубация 2 часа в среде L15 с добавлением 10 -6М серотонина, В - опытных мышей, которым инъецировали флуоксетин, инкубация 2 часа в среде L15, Г - яичник опытных мышей, инкубация 2 часа в среде L15 с добавлением 10 -6М серотонина. Масштабный отрезок 100 мкм. 34

Рис. 8. Количественный анализ интенсивности иммунофлуоресценции в ооцитах в эксперименте in vitro. L15 контроль - яичник контрольных мышей, инкубация 2 часа в среде L15, 5-HT контроль - яичник контрольных мышей, инкубация 2 часа в среде L15 с добавлением 10 -6М серотонина, L15 Flu – яичник опытных мышей, которым инъецировали флуоксетин, инкубация 2 часа в среде L15, 5-HT Flu - яичник опытных мышей, инкубация 2 часа в среде L15 с добавлением 10 -6М серотонина. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM), * - p <0,05 по критерию Крускала – Уоллиса. 3. Определение экспрессии гонадотропных гормонов в аденогипофизе Для исключения влияния флуоксетина на гонадотропную функцию гипофиза был проведен анализ экспрессии гонадотропных гормонов Fshb и Lhb в аденогипофизе (Рис. 9). Экспрессии транскриптов фолликулостимулирующего (Fshb) и лютеинизирующего (Lhb) гормонов в опыте составили 89% и 92% от контроля, соответственно, и значимо от него не отличаются. Рис. 9. Экспрессия мРНК генов гонадотропных гормонов в гипофизе. 35

Относительная экспрессия генов (NRQ) нормирована на ген Rps18 и контрольную пробу. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM). 4. Морфологический анализ яичников Для выявления влияния системного введения флуоксетина на морфологию яичников на полученных конфокальных изображениях серийных срезов были оценены такие параметры как диаметры фолликулов и ооцитов, относительный объем клеток гранулезы к общему объему яичника (Рис.10). В анализе не учитывали примордиальные фолликулы с одним слоем плоских клеток прегранулезы. Полученные результаты не выявили значимых различий в значениях исследуемых показателей. Рис. 10. Сравнение морфологических показателей яичников. Относительный уровень экспрессии (RQ) нормирован на гены Rps18 и Tbp. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM). 5. Количественное исследование динамики экспрессии маркерных генов в яичнике Для исследования влияния флуоксетина на функциональное состояние 36

яичника было проведено количественное исследование экспрессии маркерных генов методом ПЦР в реальном времени. Исследовали динамику экспрессии мРНК генов-маркеров функциональной активности клеток гранулезы (Рис.11). Экспрессии генов, являющихся показателями зрелости клеток гранулезы и их дифференцировки в направлении кумулюса, гиалуронансинтазы Has2, циклооксигеназы Ptgs2 и циклина Ccnd1 в эксперименте составляют, соответственно, 99%, 144% и 92% от контроля и статистически значимо не изменяются. Has2 0.006 0.004 0.002 0.000 Контроль Опыт Рис. 11. Экспрессия мРНК генов-маркеров функциональной активности клеток гранулезы. Относительный уровень экспрессии (RQ) нормирован на гены Rps18 и Tbp. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM). Результаты исследования динамики экспрессии мРНК генов ооцитарных факторов роста (OGF) представлены на Рис.12. Уровни экспрессии Gdf9 и Bmp6 не меняются, тогда как статистически достоверно повышается экспрессия Bmp15 на 17%, уровень экспрессии Igf1, напротив, снижается на 46%. 37

RQ (RPS18,TBP) Рис. 12. Экспрессия мРНК генов ооцитарных факторов роста (OGF). Относительный уровень экспрессии (RQ) нормирован на гены Rps18 и Tbp. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM), * - p <0,05 по t-критерию Стьюдента. При анализе экспрессии генов ферментов стероидогенеза (Рис.13) выявлено, что уровни экспрессии генов 20,22-десмолазы Cyp11a1, 17-альфагидроксилазы Cyp17a1 и регулятора стероидогенеза Star не меняются в экспериментальных группах относительно контрольных. В то же время, уровень экспрессии гена ароматазы Cyp19a1 значительно увеличивается и составляет 168% от контроля. 38

Star 0.03 0.02 0.01 0.00 Контроль Опыт Рис. 13. Экспрессия мРНК генов ферментов стероидогенеза. Относительный уровень экспрессии (RQ) нормирован на гены Rps18 и Tbp. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM), * - p <0,05 по tкритерию Стьюдента. Согласно полученным данным, для генов-мишеней Wnt сигнального пути Axin, Bcl2l11, Cdkn1b и мембранного рецептора Wnt Fzd4 не наблюдается существенных изменений уровней экспрессии, тогда как уровень экспрессии мРНК Fgf9 статистически достоверно снижается на 25% (Рис.14). 39

Fzd4 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 Контроль Опыт Рис. 14. Экспрессия мРНК генов-мишеней Wnt сигнального пути и мембранного рецептора к Wnt. Относительный уровень экспрессии (RQ) нормирован на гены Rps18 и Tbp. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM), * - p <0,05 по t-критерию Стьюдента. Уровень экспрессии мРНК рецептора к ФСГ Fshr в опыте увеличивается на 20%, что, однако, не является статистически значимым различием. Экспрессия рецептора к ЛГ Lhcgr в опыте превышает контрольные значения на 112%. Значимое изменение уровня экспрессии мембранного транспортера серотонина Sert Slc6a4 в яичнике не выявлено, уровень экспрессии в опыте составляет 92% от контроля (Рис.15). 40

Рис. 15. Экспрессия мРНК генов мембранных рецепторов к гонадотропным гормонам гипофиза и мембранного транспортера серотонина Sert в яичнике. Относительный уровень экспрессии (RQ) нормирован на гены Rps18 и Tbp. На диаграммах отложены стандартные ошибки среднего (MEAN±SEM), * - p <0,05 по t-критерию Стьюдента. 41

ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что периферический серотонин синтезируется в основном энтерохромаффинными клетками кишечника, затем поступает в кровоток и оттуда в тромбоциты (Mawe, Hoffman, 2013). После семидневного системного введения флуоксетина концентрация серотонина в плазме крови сильно уменьшилась. Из этого следует, что флуоксетин повлиял на путь транспортировки серотонина в кровь или его синтез в кишечнике. Учитывая, что серотонин участвует в регуляции физиологических процессов практически во всех системах органов, данный эффект флуоксетина может привести к неочевидным негативным последствиям. В яичнике серотонин возникает вследствие его захвата мембранным переносчиком Sert. Флуоксетин относится к группе СИОЗС, а значит ингибируют этот переносчик, что было показано на изолированных овариальных фолликулах мыши (Никишин и др., 2018). Для того, чтобы подтвердить этот эффект флуоксетина при системном введении, был проведён эксперимент in vitro по инкубации яичников опытных и контрольных мышей в среде с серотонином. Так как известно, что Sert наиболее активен в ооцитах (Никишин и др., 2018), мы оценивали накопление серотонина именно в них. Результаты опыта показали, что в яичниках, к которым был добавлен серотонин, происходит захват серотонина ооцитами, притом уровень накопления серотонина в ооцитах опытных мышей намного ниже, чем в ооцитах контрольных мышей, что подтверждает ингибирование активности Sert флуоксетином. Важными регуляторами функций яичника, в том числе синтеза эстрогенов, являются гонадотропные гормоны, синтезируемые клетками аденогипофиза. Флуоксетин способен проходить через гематоэнцефалический барьер, поэтому он имеет возможность повлиять на гонадотропную функцию гипофиза. Анализ уровней экспрессии мРНК гонадотропных гормонов Fshb и Lhb в аденогипофизе не показал значимых изменений. Это говорит о том, что в данном эксперименте флуоксетин не влияет на функциональную активность яичника опосредованно через гипофизарную систему. 42

Известно, что серотонин влияет на стероидогенез и овуляцию в яичнике (Dube, Amireault, 2007). Вследствие ингибирования механизма захвата серотонина флуоксетином, видимо, происходит снижение концентрации серотонина в клетках. В конце эксперимента мыши достигали возраста 14 dpp, когда в яичнике начинается первая волна фолликулогенеза. В связи с этим, интересно было выяснить, как флуоксетин повлиял на развитие фолликулов и пролиферацию клеток на морфологическом уровне. При анализе серийных срезов учитывались все фолликулы и яйцеклетки на срезе за исключением примордиальных фолликулов, потому что они находятся в состоянии покоя и их анализ не показателен. Полученные результаты показали отсутствие разницы в морфологическом строении опытных и контрольных яичников. Это может означать как отсутствие влияния флуоксетина на морфологический статус овариальной ткани, так и говорить о том, что именно используемое нами воздействие не позволяет его выявить. Функциональный статус фолликулов оценивали с помощью измерения экспрессии маркерных генов методом ПЦР в реальном времени. Has2 и Ptgs2 являются маркерами степени дифференцировки кумулюсных клеток, а циклин Ccnd1 способствует переходу клеток к от G1 фазы к S фазе. В предыдущих экспериментах на культуре овариальных фолликулов было показано, что серотонин стимулирует экспрессию этих генов в клетках гранулезы и этот эффект отменяется флуоксетином (Никишин, 2021). Опираясь на это, можно было ожидать, что воздействие флуоксетина в нашем эксперименте приведёт к снижению экспрессии мРНК этих генов, однако изменений в экспрессии Has2, Ptgs2 и Ccnd1 не было выявлено. Полученный результат можно объяснить тем, что на эффекты флуоксетина в экспериментах in vivo могут влиять различные регуляторные механизмы. В данном случае можно говорить о незначительном влиянии флуоксетина на активность клеток гранулезы. Имея в виду предположение, что влияние серотонина на фолликулярные клетки может быть опосредовано влиянием на ооцит (Никишин и др., 2021), мы 43

исследовали экспрессию таких ооцитарных факторов роста как Gdf9, Bmp6, Bmp15, Igf1. Для Gdf9 и Bmp6 изменений в экспрессии не выявлено. Однако, обнаружено увеличение экспрессии Bmp15 и уменьшение экспрессии Igf1. Из литературных данных известно, что в опытах in vitro Bmp15 ослабляет эффекты ФСГ на фолликулы (Mottershead et al., 2015), а Igf1 усиливает (Eimerl, Orly, 2002), что проявляется в уменьшении или увеличении экспрессии Cyp19a1, соответственно. Забегая вперёд, результаты нашего исследования показали увеличение экспрессии Cyp19a1, что не подтверждает описанные выше эффекты Bmp15 и Igf1, что, вероятно, связано с различными условиями проведения экспериментов. Для выяснения существования механизмов авторегуляции экспрессии Sert его собственной активностью была измерена экспрессия мРНК гена Sert (Slc6a4), но значимых изменений выявлено не было. Результаты анализа экспрессии мРНК основных стероидогенных ферментов показывают, что флуоксетин увеличивает экспрессию Cyp19a1 и не влияет на экспрессию Star, Cyp11a1, Cyp17a1. Однако, ранее, в эксперименте in vivo было продемонстрировано, что приём другого СИОЗС, пароксетина (10 мг/кг), взрослыми мышами так же, как и нокаутирование по гену Sert, приводит к подавлению экспрессии ароматазы Cyp19a1 в яичниках (Zha et al., 2017). Таким образом, мы получили противоположные литературным данным результаты. В то же время, известно, что в эксперименте in vitro ингибирование канонического Wnt/ß-катенин сигнального пути в антральных фолликулах мышей возраста 14 dpp, что соответствует возрасту мышей в нашем эксперименте, привело к увеличению уровня экспрессии Cyp19a1, а также уменьшению экспрессии Fgf9 и Axin2, мишеней β-катенина (Li et al., 2014). При анализе литературы было обнаружено, что флуоксетин способен подавлять каноническую передачу сигналов Wnt/ß-катенина независимо от его ингибирующего эффекта на Sert (Warkus, Marikawa, 2018), что может объяснить полученные нами результаты. 44

Таким образом, было высказано предположение, что увеличение уровня экспрессии Cyp19a1 в нашем эксперименте связано с ингибирующим действием флуоксетина на канонический сигнальный путь Wnt. Для подтверждения или опровержения данной гипотезы был проведён анализ генов-мишеней Wnt, для которых было показано уменьшение экспрессии при ингибировании канонического Wnt пути - Fgf9, Axin2, Bcl2l11 (Bim), Bbc3 (Puma) и Cdkn1b (p27) (Li et al., 2014), а также гена рецептора к Wnt – Fzd4. Анализ показал уменьшение экспрессии Fgf9, тогда как экспрессия остальных генов не изменилась. Это не является бесспорным доказательством нашей гипотезы, однако, говорит в её пользу. Несомненно, этот вопрос требует дополнительных исследований. Так как ФСГ и ЛГ играют ключевую роль в регуляции стероидогенеза, мы провели анализ экспрессии их рецепторов в яичнике. По нашим данным, экспрессия Fshr не изменилась, а экспрессия Lhcgr увеличилась. Было показано, что в клетках гранулёзы активация сигнального пути Wnt/ß-катенин подавляет экспрессию Lhcgr, Star и Cyp11a1 (Stapp et al., 2014; Fan et al., 2010). Предполагая, что наша гипотеза верна и флуоксетин ингибирует Wnt путь, эти литературные данные могут объяснить увеличение экспрессии Lhcgr в нашем эксперименте. Обобщая вышесказанное, мы показали следующее: 1. Системное воздействие флуоксетина на яичник не опосредовано гипофизарными гормонами и реализуется напрямую. 2. Флуоксетин влияет на экспрессию Igf1, Fgf9, Bmp15, Lhcgr, Cyp19a1, причем среди генов, увеличивающих экспрессию - гены-мишени ФСГ (Cyp19a1, Lhcgr). 3. Среди генов, снижающих экспрессию - Fgf9, который является мишенью канонической Wnt-сигнализации, что вместе с предыдущим пунктом говорит в пользу влияния флуоксетина через ингибирование Wnt-пути. 45

ВЫВОДЫ 1. Системное введение флуоксетина (25 мг/кг) препубертатным мышам в течение 7 дней приводит к значительному снижению концентрации серотонина в крови. 2. Флуоксетин не влияет на функциональную активность яичника опосредованно через гипофизарную систему, так как экспрессии мРНК ЛГ и ФСГ в гипофизе не меняются. 3. Флуоксетин ингибирует активность транспортера серотонина Sert в ооцитах. 4. Морфологические показатели фолликулярного роста при системном воздействии флуоксетина не изменяются. 5. При системном воздействии флуоксетина, в яичнике снижается экспрессия мРНК Igf1 и Fgf9, и увеличивается экспрессия мРНК Bmp15, Lhcgr и Cyp19a1, что говорит о функциональной значимости механизма захвата серотонина в регуляции роста и развития овариальных фолликулов. 46

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Никишин Д.А., Алешина Н.М., Семенова М.Л., Шмуклер Ю.Б. Динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы в клетках гранулезы развивающегося овариального фолликула и при лютеинизации // Гены и клетки. 2017. Т. 12. № 4. С. 33–38. 2. Никишин Д.А., Алешина Н.М., Шмуклер Ю.Б. Синтез и мембранный транспорт серотонина в развивающемся овариальном фолликуле мыши // Доклады Академии Наук. 2018. Т. 478. № 1. С. 103–106. 3. Никишин Д.А., Храмова Ю.В., Алешина Н.М., Мальченко Л.А., Шмуклер Ю.Б. Опосредованное ооцитом влияние серотонина на функциональный статус клеток гранулезы // Онтогенез. 2021. Т. 52. № 2. С. 120–128. 4. Amenta F., Vega J.A., Ricci A., Collier W.L. Localization of 5- hydroxytryptamine-like immunoreactive cells and nerve fibers in the rat female reproductive system // The Anatomical Record. 1992. V. 233. № 3. P. 478–484. 5. Amireault P., Dube F. Serotonin and its antidepressant-sensitive transport in mouse cumulus-oocyte complexes and early embryos // Biology of Reproduction. 2005. V. 73. № 2. P. 358–365. 6. Amsterdam J. D., Fawcett J., Quitkin F. M., Reimherr F. W., Rosenbaum J. F., Michelson D., Hornig-Rohan M., Beasley C. M. Fluoxetine and norfluoxetine plasma concentrations in major depression: A multicenter study // American Journal of Psychiatry. 1997. V. 154. P. 963–969. 7. Anderson R., Copeland T.K., Scholer H. The onset of germ cell migration in the mouse embryo // Mechanisms of Development. 2000 V. 91. P. 61–68. 8. Bader M. Serotonylation: Serotonin signaling and epigenetics // Frontiers in Molecular Neuroscience. 2019. V. 12. P. 288. 9. Banskota S., Ghia J.-E., Khan W.I. Serotonin in the gut: Blessing or a curse // Biochimie. 2019. V. 161. P.56-64. 10. Basu B., Desai R., Balaji J., Chaerkady B., Sriram V., Maiti S., Panicker M. M. Serotonin in pre-implantation mouse embryos is localized to the mitochondria and can modulate mitochondrial potential // Reproduction. 2008. V. 135. № 5. P. 657–669. 47

11. Battista P.J., Condon W.A., Serotonin-induced stimulation of progesterone production by cow luteal cells in vitro // Journal of reproduction and fertility. 1986. V. 76. P. 231–238. 12. Blier P, El Mansari M. Serotonin and beyond: therapeutics for major depression // Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2013. V. 368. № 1615. P. 20120536–20120536. 13. Bolo N. R., Hode Y., Nedelec J. F., Laine E., Wagner G., Macher J. P. Brain pharmacokinetics and tissue distribution in vivo of fluvoxamine and fluoxetine by fluorine magnetic resonance spectroscopy // Neuropsychopharmacology. 2000. V. 23. P. 428–438. 14. Boyer A., Lapointe E., Zheng X., Cowan R.G., Li H., Quirk S.M., DeMayo F.J., Richards J.S., Boerboom D. WNT4 is required for normal ovarian follicle development and female fertility // FASEB Journal. 2010. V. 24. P. 3010–3025. 15. Buznikov G.A., Shmukler Y.B. Possible role of prenervous neurotransmitters in cellular interactions of early embryogenesis: A hypothesis // Neurochemical Research. 1981. V. 6. № 1. P. 55–68. 16. Cammarota M., Bevilaqua L.R., Medina J.H., Izquierdo I. ERK1/2 and CaMKIImediated events in memory formation: is 5HT regulation involved? // Behavioural Brain Research. 2008. V. 195. P. 120–128. 17. Chen Y., Palm F., Lesch K. P., Gerlach M., Moessner R., Sommer C. 5Hydroxyindolacetic Acid (5-HIAA), a Main Metabolite of Serotonin, is Responsible for Complete Freund’s Adjuvant-Induced Thermal Hyperalgesia in Mice // Molecular Pain. 2011. V. 7. P. 1744-8069. 18. Childs A.J. Retinoic Acid Signalling and the Control of Meiotic Entry in the Human Fetal Gonad // PLoS One. 2011. V. 6. № 6. P. e20249. 19. Clausell, D.E., Soliman K. Ovarian serotonin content in relation to ovulation // Experientia. 1978. V. 34. P. 410–411. 20. Coelho W.S., Costa K.C., Sola-Penna M. Serotonin stimulates mouse skeletal muscle 6-phosphofructo-1-kinase through tyrosine-phosphorylation of the enzyme 48

altering its intracellular localization // Molecular Genetics and Metabolism. 2007. V. 92. № 4. P. 364–370. 21. Côté F., Thévenot E., Fligny C. Disruption of the nonneuronal Tph1 gene demonstrates the importance of peripheral serotonin in cardiac function. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. V. 100. № 23. P. 13525–13530. 22. David D.J., Gardier A.M. The pharmacological basis of the serotonin system: Application to antidepressant response // Encephale. 2016. V. 42. № 3. P. 255–263. 23. Doggrell S.A. The role of 5-HT on the cardiovascular and renal systems and the clinical potential of 5-HT modulation // Expert Opinion on Investigational Drugs. 2003. V. 12. № 5. P. 805–823. 24. Dong, J., Albertini, D. F., Nishimori, K., Kumar, T. R., Lu, N., Matzuk, M. M. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis // 1996. Nature, V. 383. P. 531–535. 25. Dube F., Amireault P. Local serotonergic signaling in mammalian follicles, oocytes and early embryos // Life Sciences. 2007. V. 81. № 25–26. P. 1627–1637. 26. Duerschmied D., Suidan G. L., Demers M., Herr N., Carbo C., Brill A., Cifuni S. M., Mauler M., Cicko S., Bader M., Idzko M., Bode C., Wagner D. D. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice // Blood. 2013. V. 121. № 6. P. 1008–1015. 27. Edgar V.A., Sterin-Borda L., Cremaschi G.A., Genaro A.M. Role of protein kinase C and cAMP in fluoxetine effects on human T-cell proliferation // European Journal of Pharmacology. 1999. V. 372. P. 65–73. 28. Edson M.A., Nagaraja A.K., Matzuk M.M. The mammalian ovary from genesis to revelation // Endocrine Reviews. 2009. V. 30. P. 624–712. 29. Eimerl S, Orly J. Regulation of steroidogenic genes by insulin-like growth factor1 and follicle-stimulating hormone: differential responses of cytochrome P450 sidechain cleavage, steroidogenic acute regulatory protein, and 3betahydroxysteroid dehydrogenase/isomerase in rat granulosa cells // Biology of Reproduction. 2002. V. 67. № 3. P. 900–910. 49

30. El-Merahbi R., Löffler M., Mayer A., Sumara G. The roles of peripheral serotonin in metabolic homeostasis // FEBS Letters. 2015. V. 589. № 15. P. 1728–1734. 31. Emet M. Ozcan H., Ozel L., Yayla M., Halici Z., Hacimuftuoglu A. A Review of Melatonin, Its Receptors and Drugs. // Eurasian Journal of Medicine. 2016. V. 48. № 2. P. 135–141. 32. Erickson G.F., Garzo V.G., Magoffin D.A. Insulin-like growth factor-I regulates aromatase activity in human granulosa and granulosa luteal cells // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 1989. V. 69. № 4. P. 716–724. 33. Fan H.Y., O’Connor A., Shitanaka M., Shimada M., Liu Z., Richards J.A.S. βcatenin (CTNNB1) promotes preovulatory follicular development but represses LHmediated ovulation and luteinization // Molecular Endocrinology. 2010. V. 24. № 8. P. 1529–1542. 34. Frohlich P., Meston C. Evidence that serotonin affects female sexual functioning via peripheral mechanisms // Physiology & Behavior. 2000. V. 71. № 3–4. P. 383–393. 35. Gifford H.J.A. The role of WNT signaling in adult ovarian folliculogenesis // Reproduction. 2015. V. 150. № 4. P. R137-R148. 36. Gifford H.J.A., Hunzicker-Dunn M..E, Nilson J.H. Conditional deletion of betacatenin mediated by Amhr2cre in mice causes female infertility // Biology of Reproduction/ 2009. V. 80. P. 1282–1292. 37. Ginsburg M., Snow M.H., McLaren A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. // Development. 1990. V. 110. № 2. P. 521–528. 38. Gloaguen P., Crepieux P., Heitzler D., Poupon A., Reiter E. Mapping the folliclestimulating hormone-induced signaling networks // Frontiers in Endocrinology(Lausanne). 2011. V. 2. P. 45. 39. Gouveia E.M., Franci C.R. Involvement of serotonin 5HT1 and 5HT2 receptors and nitric oxide synthase in the medial preoptic area on gonadotropin secretion // Brain Research Bulletin. 2004. V. 63. P. 243–251. 40. Graveleau C., Paust H.J., Schmidt-Grimminger D., Mukhopadhyay A.K., 2000. Presence of a 5-HT7 receptor positively coupled to adenylate cyclase activation in 50

human granulosa-lutein cells // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2000. V. 85. № 3. P. 1277–1286. 41. Grossman H., Shalgi R. Molecular Mechanisms of Cell Differentiation in Gonad Development // Molecular Mechanisms of Cell Differentiation in Gonad Development. 2016. V. 58. P. 309–336. 42. Hannon P.R., Curry T.E. Folliculogenesis // Encyclopedia of Reproduction. 2018. V. 2. № 1. P. 72–79. 43. Hannon P.R., Flaws J.A. The effects of phthalates on the ovary // Frontiers in Endocrinology. 2015. V. 6. № FEB. P. 1–20. 44. Hedlund P.B., Danielson P.E., Thomas E.A. No hypothermic response to serotonin in 5-HT7 receptor knockout mice // 2016. V. 100. № 3. P. 1375–1380. 45. Heikkinen T., Ekblad U., Palo P., Laine K. Pharmacokinetics of fluoxetine and norfluoxetine in pregnancy and lactation // Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2003. V. 73. № 4. P. 330–337. 46. Hoffman B.J., Hansson S. R., Mezey E., Palkovits M. Localization and dynamic regulation of biogenic amine transporters in the mammalian central nervous system // Frontiers in Neuroendocrinology. 1998. V. 19. № 3. P. 187–231. 47. Höglund E., Øverli Ø., Winberg S. Tryptophan Metabolic Pathways and Brain Serotonergic Activity: A Comparative Review // Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 2019. V. 10. № 158. 48. Hsieh M., Johnson M.A., Greenberg N.M., Richards J.S. Regulated expression of Wnts and Frizzleds at specific stages of follicular development in the rodent ovary // Endocrinology. 2002. V. 143. P. 898–908. 49. Hsieh M., Mulders S.M., Friis R.R., Dharmarajan A., Richards J.S. Expression and localization of secreted frizzled-related protein-4 in the rodent ovary: evidence for selective up-regulation in luteinized granulosa cells // Endocrinology. 2003. V. 144. P. 4597–4606. 50. Huang S. M., Mishina Y. M., Liu S., Cheung A., Stegmeier F., Michaud G. A., Charlat O., Wiellette E., Zhang Y., Wiessner S. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signaling // Nature. 2009. V. 461. P. 614–620. 51

51. Hussein T.S., Froiland D.A., Amato F., Thompson J.G., Gilchrist R.B. Oocytes prevent cumulus cell apoptosis by maintaining a morphogenic paracrine gradient of bone morphogenetic proteins // Journal of Cell Science. 2005. V. 118. P. 5257–5268. 52. Hutt K.J., McLaughlin E.A., Holland M.K. Kit ligand and c-Kit have diverse roles during mammalian oogenesis and folliculogenesis // Molecular Human Reproduction. 2006. V. 12. P. 61–69. 53. Jagarlamudi K., Rajkovic A. Molecular and cellular endocrinology oogenesis: transcrip- tional regulators and mouse models // Molecular and Cellular Endocrinology. 2012. V. 356. P. 31–39. 54. Jeffrey J.J., Ehlich L.S., Roswit W.T. Serotonin: An inducer of collagenase in myometrial smooth muscle cells // Journal of Cellular Physiology. 1991. V. 146. № 3. P. 399–406. 55. Kim C-W., Choe C., Kim E-J. Dual effects of fluoxetine on mouse early embryonic development // Toxicology and Applied Pharmacology. 2012. V. 265. № 1. P. 61-72. 56. Klempan T., Hudon-Thibeault A.A., Oufkir T., Vaillancourt C., Sanderson J.T., Stimulation of serotonergic 5-HT2A receptor signaling increases placental aromatase (CYP19) activity and expression in BeWo and JEG-3 human choriocarcinoma cells // Placenta. 2011. V. 32. P. 651–656. 57. Kristensen A.S., Andersen J., Jorgensen T. N., Sorensen L., Eriksen J., Loland C. J., Stromgaard K., Gether U. SLC6 Neurotransmitter Transporters: Structure, Function, and Regulation // Pharmacological Reviews. 2011. V. 63. № 3. P. 585–640. 58. Kusakawa S., Yamauchi J., Miyamoto Y., Sanbe A., Tanoue A. Estimation of embryotoxic effect of fluoxetine using embryonic stem cell differentiation system // Life Sciences. 2008. V. 83. P. 871–877. 59. Kwintkiewicz, J., Giudice, L.The Interplay of Insulin-Like Growth Factors, Gonadotropins, and Endocrine Disruptors in Ovarian Follicular Development and Function // Seminars in Reproductive Medicine. 2009. V. 27. № 1. P. 043–051. 60. Lapointe E., Boerboom D. WNT signaling and the regulation of ovarian steroidogenesis // Frontiers in Bioscience. 2011. V. S3. № 4. P. 276–285. 52

61. Li L., Ji S.Y., Yang J.L., Li X.X., Zhang J., Zhang Y., Hu Z.Y., Liu Y.X. Wnt/βcatenin signaling regulates follicular development by modulating the expression of Foxo3a signaling components // Molecular and Cellular Endocrinology. 2014. V. 382. № 2. P. 915–925. 62. Lin Y.T., Capel B. Cell fate commitment during mammalian sex determination // Current Opinion in Genetics & Development. 2015. V. 32. P. 144–152. 63. Lister A., Regan C., Van Z. J., Van D. K. G. Inhibition of egg production in zebrafish by fluoxetine and municipal effluents: A mechanistic evaluation // Aquatic Toxicology. 2009. V. 95. № 4. P. 320-329. 64. Maléth J., Madácsy T., Pallagi P., Balázs A., Venglovecz V., Rakonczay Z., Hegyi P. Pancreatic epithelial fluid and bicarbonate secretion is significantly elevated in the absence of peripheral serotonin // Gut. 2015. V. 64. № 9. P. 1497–1498. 65. Mawe, G. M., & Hoffman, J. M. Serotonin signalling in the gut—functions, dysfunctions and therapeutic targets // Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2013. V. 10. № 8. P. 473–486. 66. Mercier G., Lennon A.M., Renouf B., Dessouroux A., Ramauge M., Courti, F., Pierre M. MAP kinase activation by fluoxetine and its relation to gene expression in cultured rat astrocytes // Journal of Molecular Neuroscience. 2004. V. 24. P. 207–216. 67. Minosyan T.Y., Lu R., Eghbali M., Toro L., Stefani E. Increased 5-HT contractile response in late pregnant rat myometrium is associated with a higher density of 5-HT 2A receptors // The Journal of Physiology. 2007. V. 581. № 1. P. 91–97. 68. Miyamoto K., Ohkawara B., Ito M., Masuda A., Hirakawa A., Sakai T., Hiraiwa H., Hamada T., Ishiguro N., Ohno K. Fluoxetine ameliorates cartilage degradation in osteo- arthritis by inhibiting Wnt/b-catenin signaling // PLoS One. 2017. V. 12. P. e0184388. 69. Mlynarcikova A., Fickova M., Scsukova S. Impact of endocrine disruptors on ovarian steroidogenesis // Endocrine Regulations. 2014. V. 48. № 4. P. 201–224. 70. Mohammad-Zadeh L.F., Moses L., Gwaltney-Brant S.M. Serotonin: a review. // Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics. 2008. V. 31. № 3. P. 187–199. 53

71. Molyneaux K.A., Stallock J., Schaible K., Wylie C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration // Developmental Biology. 2001. V. 240. P. 488–498. 72. Monniaux D., Michel P., Postel M., Clement F. Multi-scale modelling of ovarian follicular development: from follicular morphogenesis to selection for ovulation // Biology of the Cell. 2016. V 108. № 6. P. 149–160. 73. Moore C.J., DeLong N.E., Chan K.A., Holloway A.C., Petrik J.J., Sloboda D.M. Perinatal Administration of a Selective Serotonin Reuptake Inhibitor Induces Impairments in Reproductive Function and Follicular Dynamics in Female Rat Offspring // Reproductive Sciences. 2015. V. 22. № 10. P. 1297-1311. 74. Moran M.J., Ayala M.E., Gallegos E., Romero J., Chavira R., Damian-Matsumura P. Effects of systemic administration or intrabursal injection of serotonin on puberty, first ovulation and follicular development in rats // Reproduction, Fertility and Development. 2013. V. 25. P. 1105–1114. 75. Mottershead D.G., Sugimura S., Al-Musawi S. L, Li J.J., Richani D., White M.A., Martin G.A., Trotta A.P., Ritter L.J., Shi J., Mueller T.D., Harrison C.A., Gilchrist R.B. Cumulin, an oocyte- secreted heterodimer of the transforming growth factor-beta family, is a potent activator of granulosa cells and improves oocyte quality // Journal of Biological Chemistry. 2015. V. 290. P. 24007–24020. 76. Murphy D.L. Serotonin Transporter: Gene, Genetic Disorders, and Pharmacogenetics // Molecular Interventions. 2004. V. 4. № 2. P. 109–123. 77. Nebigil C., Choi D., Dierich A. Serotonin 2B Receptor Is Required for Heart Development // National Academy of Sciences 2016. V. 97. № 17. P. 9508–9513. 78. Ni W., Watts S.W. 5-hydroxytryptamine in the cardiovascular system: focus on the serotonin transporter (SERT) // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 2006. V. 33. № 7. P. 575–583. 79. Oh C.-M. Regulation of systemic energy homeostasis by serotonin in adipose tissues // Nature Communications. 2015. V. 6. № 1.P. 6794. 80. Otsuka F., Yamamoto S., Erickson G.F., Shimasaki S., Bone morphogenetic protein-15 inhibits follicle-stimulating hormone (FSH) action by suppressing FSH receptor expression // Journal of Biological Chemistry. 2001. V. 276. P. 11387–11392. 54

81. Parakh T. N., Hernandez J. A., Grammer J. C., Weck J., Hunzicker-Dunn M., Zeleznik A. J., Nilson J. H. Follicle-stimulating hormone/cAMP regulation of aromatase gene expression requires beta-catenin // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006. V. 103. № 33. P. 1243512440. 82. Pepling M.E., Spradling A.C.Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed break- down to form primordial follicles // Developmental Biology. 2001. V. 234 № 2. P. 339–351. 83. Raymond J.R., Mukhin Y.V., Gelasco A., Turner J., Collinsworth G., Gettys T.W., Grewal J.S., Garnovskaya M.N. Multiplicity of mechanisms of serotonin receptor signal transduction // Pharmacology and Therapeutics. 2001. V. 92. № 2-3. P. 179– 212. 84. Reefhuis J., Devine O., Friedman J.M., Louik C., Honein M.A. Specific SSRIs and birth defects: Bayesian analysis to interpret new data in the context of previous reports // BMJ. 2015. V. 351. P. 1-8. 85. Ruddell R.G., Mann D.A., Ramm G.A. The function of serotonin within the liver // Journal of Hepatology. 2008. V. 48. № 4. P. 666–675. 86. Russell D.L., Ochsner S.A., Hsieh M., Mulders S., Richards J.S. Hormoneregulated expression and localization of versican in the rodent ovary // Endocrinology. 2003. V. 144. P. 1020–1031. 87. Sakaguchi K., Itoh M. T., Takahashi N., Tarumi W., Ishizuka B. The rat oocyte synthesises melatonin // Reproduction, Fertility and Development. 2013. V. 25. № 4. P. 674. 88. Sanchez F., Smitz J. Molecular control of oogenesis // Biochimica et Biophysica Acta. 2012. V. 1822. № 12. P. 1896-1912. 89. Sirotkin A.V. Serotonin influences hormone and cyclic nucleotide release by granulosa cells isolated from porcine ovaries // Biogenic Amines. 1995. V. 11. № 2. P. 137–146. 90. Smales W.P., Biddulph D.M. Limb development in chick embryos: Cyclic AMPdependent protein kinase activity, cyclic AMP, and prostaglandin concentrations 55

during cytodifferentiation and morphogenesis // Journal of Cellular Physiology. 1985. V. 122. № 2. P. 259–265. 91. Stapp A.D., Gómez B.I., Gifford C.A., Hallford D.M., Hernandez Gifford J.A. Canonical WNT Signaling Inhibits Follicle Stimulating Hormone Mediated Steroidogenesis in Primary Cultures of Rat Granulosa Cells // PLoS ONE. 2014. V. 9. № 1. P. e86432. 92. Stull M.A., Pai V., Vomachka A. J., Marshall A. M., Jacob G. A., Horseman N. D. Mammary gland homeostasis employs serotonergic regulation of epithelial tight junctions // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007. V. 104. № 42. P. 16708–16713. 93. Sugiura K., Su Y.Q., Diaz F.J., Pangas S.A., Sharma S., Wigglesworth K., O’Brien M.J., Matzuk M.M., Shimasaki S., Eppig J.J. Oocyte-derived BMP15 and FGFs cooperate to promote glycolysis in cumulus cells // Development. 2007. V. 134. P. 2593–2603. 94. Tanaka E., Baba N., Toshida K., Suzuki K. Serotonin stimulates steroidogenesis in rat preovulatory follicles: involvement of 5-HT2 receptor // Life Sciences. 1993. T. 53. № 7. P. 563-570. 95. Terranova P.F., Uilenbroek T. J.J., Saville L., Horst D., Nakamura Y. Serotonin enhances oestradiol production by hamster preovulatory follicles in vitro: Effects of experimentally induced atresia // Journal of Endocrinology. 1990. V. 125. № 3. P. 433– 438. 96. Torres G.E., Gainetdinov R.R., Caron M.G. Plasma membrane monoamine transporters: Structure, regulation and function // Nature Reviews Neuroscience. 2003. V. 4. № 1. P. 13–25. 97. Vitt U.A., Hayashi M., Klein C., Hsueh A.J., Growth differentiation factor-9 stimulates proliferation but suppresses the follicle-stimulating hormone-induced differentiation of cultured granulosa cells from small antral and preovulatory rat follicles // Biology of Reproduction. 2000. V. 62. P. 370–377. 98. Voits M., Fink H., Bader M. Synthesis of Serotonin by a Second Tryptophan Hydroxylase Isoform // Science New Series. 2003. V. 299. № 5603. P. 76 56

99. Wang H.X., Li T.Y., Kidder G.M. WNT2 regulates DNA synthesis in mouse granulosa cells through beta-catenin // Biology of Reproduction. 2010. V. 82. P. 865– 875. 100. Zha W., Ho H.T.B., Hu T., Hebert M.F., Wang J. Serotonin transporter deficiency drives estrogen-dependent obesity and glucose intolerance // Scientific Reports. 2017. V. 7. № 1. P. 1–14. 101. Zhang H., Risal S., Gorre N., Busayavalasa K., Li X., Shen Y., Bosbach B., Brannstrom M., Liu K. Somatic cells initiate primordial follicle activation and govern the development of dormant oocytes in mice // Current Biology. 2014. V. 24. № 21. P. 2501–2508. 102. Zhen Y.-H., Wang L., Riaz H. et al. Knockdown of CEBPβ by RNAi in porcine granulosa cells resulted in S phase cell cycle arrest and decreased progesterone and estradi- ol synthesis // The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 2014. V. 143. P. 90–98. 57

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв