Сравнительная оценка методов видовой идентификации микроорганизмов на основе биохимических тестов

Kristina Lychagina

Сравнительная оценка методов видовой идентификации микроорганизмов на основе биохимических тестов

Выпускная квалификационная работа посвящена сравнительной оценке методов видовой идентификации микроорганизмов на основе субстратной специфичности бактерий. Цель работы была достигнута благодаря применению следующих методов: бактериологический метод – выделение чистой культуры микроорганизмов, посев на дифференциально-диагностические среды, применение автоматизированной системы идентификации микроорганизмов.

Биология

Дипломы

Вуз: Оренбургский государственный университет

ID: 5ea1af24ca23590001c77b75

UUID: 0ae017d0-67a2-0138-31af-0242ac180006

Язык: Русский

Опубликовано: около 4 лет назад

Просмотры: 100

12.2

Kristina Lychagina

Оренбургский государственный университет

Комментировать 15

Рецензировать 0

Скачать - 3,8 МБ

Поделиться работой

Аннотация Выпускная квалификационная работа посвящена сравнительной оценке методов видовой идентификации микроорганизмов на основе субстратной специфичности бактерий. Цель работы была достигнута благодаря применению следующих методов: бактериологический метод – выделение чистой культуры микроорганизмов, посев на дифференциально-диагностические среды, применение автоматизированной системы идентификации микроорганизмов. Первая глава посвящена ферментативной активности бактерий и методам изучения биохимических свойств микроорганизмов по литературным данным. Во второй главе подробно освящаются этапы исследования: приготовление питательных сред, получение чистой культуры микроорганизмов, посев полученных культур на питательные среды, работа на автоматическом биохимическом анализаторе. В третьей главе приводятся результаты исследования и соответствующие выводы по проведенный работе. Работа содержит 67 листов текста, 12 рисунков, 7 таблиц, 1 приложение. Annotation The final qualifying paper is devoted to the comparative assessment of the methods of species identification of microorganisms based on the substrate specificity of bacteria. The aim of the work was achieved through the use of the following methods: bacteriological method - the selection of a pure culture of microorganisms, seeding on differential diagnostic media, the use of an automated system for identifying microorganisms. The first chapter is devoted to the enzymatic activity of bacteria and methods for studying the biochemical properties of microorganisms according to the literature data. In the second chapter, the stages of research are described in detail: preparation of nutrient media, obtaining a pure culture of microorganisms, seeding the cultures obtained on nutrient media, working on an automatic biochemical analyzer. The third chapter presents the results of the study and the relevant conclusions on the work carried out. The work contains 67 sheets of text, 12 figures, 7 tables, 1annexe. 3

Содержание Введение……………………………………………………………………... 1 Литературный обзор……………………...………………………………. 1.1Питательные субстраты микроорганизмов…………………………..... 1.2 Ферментативная активность микроорганизмов……………………... 1.3 Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов……... 2 Материалы и методы……………………………………………………... 2.1 Приготовление питательных сред……………………………………. 2.2 Получение чистой культуры………………………………………….. 2.3 Посев на дифференциально-диагностические среды…...…………... 2.4 Проведение испытания на микробиологическом анализаторе……... 3 Результаты и обсуждение………………………………………………… Заключение………………………………………………………………….. Список использованных источников……………………………………… Приложение А (справочное) Определение биохимических свойств микроорганизмов…………………………………………………………… . 4 5 7 7 26 29 43 43 45 46 48 52 57 59 65

Введение Современная микробиологическая диагностика имеет широкое поле возможностей идентификации микроорганизмов. Все шире используются методы, которые в короткие сроки позволяют получить окончательный результат исследования, и характеризующиеся высокой воспроизводимостью, точностью и приемлемой стоимостью. Идентификация – это определение систематического положения организма на основе данных фенотипической, биохимической, молекулярногенетической и серологической диагностики. Задачам ускорения, упрощения и удешевления идентификации служат широко распространенные в настоящее время автоматизированные системы для идентификации, выпускаемые как за рубежом, так и в нашей стране, а также методы молекулярно-генетической идентификации, однако культуральные методы не потеряли своей актуальности в лабораторной диагностике. Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации и определения вида бактерий. Идентификация микроорганизмов с использованием бактериологических методов сложна в силу полиморфизма фенотипических признаков, к тому же требует высоких трудозатрат. В настоящее время в диагностических лабораториях используются автоматические системы бактериального анализа,основанные насопоставлении биохимических свойств исследуемыхштаммов с имеющейся базой данных, содержащейинформацию о типичных биохимических профилях всехвходящих в нее видов микроорганизмов, однако, использование таких анализаторов становится затруднительным в связи с высокими финансовыми затратами. При идентификации микроорганизмов нет необходимости изучать все свойства. Более того, с экономической точки зрения важно, чтобы круг испытанных тестов был не большим, чем это необходимо; желательно также использовать простые (но надежные) тесты, доступные широкому кругу лабораторий. Традиционным биохимическим методом дифференциации микроорганизмов является оценка биохимических признаков, основанная на детекциисахаролитической активности, для чего используются субстраты, метаболиты которых дают цветную окраску среды. Цель работы – провести сравнение методов видовой идентификации микроорганизмов на основе сахаролитической и протеолитической активности. Для достижения цели работы поставлены следующие задачи: 1) выделить чистые культуры микроорганизмов с последующим посевом на дифференциально-диагностические питательные среды; 5

2) определить видовую принадлежность исследуемых культур микроорганизмов на основании ферментативной активности с использованием культурального метода и автоматизированной системы идентификации микроорганизмов; 3) провести сравнительный анализ эффективности методов исследования, используемых для видовой идентификации микроорганизмов. 6

1 Литературный обзор 1.1 Питательные субстраты микроорганизмов Источниками питания микроорганизмов могут служить всевозможные вещества – одни бактерии способны синтезировать вещества, которые необходимы для построения их организма, из диоксида углерода, воды и других минеральных веществ (некоторые почвенные бактерии), другие требуют для своего развития наличия в среде органических соединений (белков, углеводов, жиров). 1.1.1 Типы питания По способности выполнять определенные функции микроорганизмы делятся на физиологические группы. Функциональные возможности конкретного микроорганизма зависят от наличия у него набора метаболических (катаболических и анаболических) реакций. Способы питания микроорганизмов весьма разнообразны. Для сравнения функциональных возможностей микробных культур, в качестве базовых признаков при определении типа питания в принято характеризовать источники энергии и углерода, а также донор электронов, то есть окисляемое вещество [8]. Источниками энергии для бактерий могут служить свет или восстановленные химические соединения. Микроорганизмы, которые живут за счет энергии фотонов (света) и преобразующие ее в макроэргические связи молекул АТФ(аденозинтрифосфорной кислоты), называются фототрофами. А сам процесс называется фотосинтезом. Хемотрофы используют для синтеза аденозинтрифосфата энергию химических связей, данный процесс называют хемосинтезом. Термины «фотосинтез» и «хемосинтез» обозначают только процессы образования соединений, имеющих высокоэнергетические связи (АТФ), однако часто их применяют в более широком смысле, имея в виду еще и последующее использование аденозинтрифосфатас целью построения органических соединений из диоксида углерода(СО 2). Органотрофные микроорганизмы в качестве донора электронов используют органическое вещество, а литотрофные– неорганическое. Микроорганизмы, использующие в качестве источника углерода углерод углекислого газа, называются автотрофами, а использующие готовые органические вещества – гетеротрофами. Углекислый газ они используют как дополнительный источник углерода при фиксации СО2, но осуществлять биосинтезы только за счет этого процесса гетеротрофы не способны[8, 6]. Обычно гетеротрофная фиксация углекислого газа поставляет до 10% от всего ассимилированного 7

углерода. Для более полного обозначения типа обмена веществ применяют сложносоставныеопределения, первая часть которых обозначает природу источника энергии (фото- или хемо-), вторая указывает на донора электронов (лито- или органо-), а третья говорит об источнике углерода для конструктивного обмена (авто- либо гетеро-). Комбинация этих признаков дает восемь вариантов типов питания (таблица 1)[3]. Таблица 1 – Типы питания Среди всех типов питания наиболее распространеннымиявляются хемоорганогетеротрофия и фотолитоавтотрофия. При хемоорганогетеротрофии готовые органические вещества окисляются для получения энергии и используются как источник углерода в конструктивном метаболизме. Таким типом питания обладают все животные и микроорганизмы-деструкторы, ответственные за разрушение сложных веществ. Фотолитоавтотрофы образуют органические вещества из углекислого газа за счет использования энергии фотонов и неорганических соединений как доноров электронов. Такой тип питания присущ высшим растениям, водорослям и цианобактериям, у которых донором электронов при фотосинтезе служит вода. Пурпурные и зеленые серные бактерии относятся к группе фотолигоавтотрофов, в качестве донора электронов ониспособны использовать восстановленные неорганические соединения серыи железа[53]. Фотолитогетеротрофия характерна для некоторых зеленых бактерий и гелиобактерий, нуждающихся в органических веществах для конструктивного обмена, а энергию для роста получают в процессе фотосинтеза с неорганическими донорами электронов. Хемолитогетеротрофы получают энергию и электроны при окислении неорганических веществ (например, молекулярного водородаH2), а для построения структур клетки требуют наличия готовых органических соединений,данную группу образуют многие сульфатредукторы[53, 26]. 8

Несерные пурпурные бактерииявляются фотоорганогетеротрофами, поскольку они осуществляют фотосинтез с органическими веществами в качестве доноров электронов и используют готовые органические соединения для биосинтеза. Только для прокариот характернахемолитоавтотрофия, при которой энергию и электроны бактерии получают при окислении неорганических соединений, идущие далее на синтез органических веществ из оксида углерода. Способностью к хемолитоавтотрофии обладают тионовые, нитрифицирующие бактерии и железобактерии. Наиболее редкими типами питания являютсяхемоорганоавтотрофия и фотоорганоавтотрофия. В этих случаях при хемосинтезе или фотосинтезе окисляются органические соединения, не используемые в конструктивном метаболизме, обычно они представленыксенобиотиками, то есть чужеродными организму веществами или неусваиваемымисоединениями. По этой причине микроорганизмамтребуется осуществлять энергозатратные реакции восстановления углерода углекислого газа до уровня органического вещества и использовать в реакциях анаболизма вновь синтезированное вещество[44]. Приведенная выше классификация не полным образом отражаетвсе многообразие способов метаболизма микроорганизмов. Во-первых, она принимает во вниманиеисточник только одного из биогенных элементов – углерода, игнорируя остальные биогенные элементы. Во-вторых, перечисленные типы трофии могут осуществляться как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В-третьих, бактериимогут использовать разнообразные акцепторы электронов. Ими могут быть кромеатмосферного кислорода окисленные формы неорганических и органических соединений, в том числе ионы трехвалентного железаFe3+, углекислый газ, сера, нитраты, сульфаты, фумараты[25]. Регулирование поступления веществ в клетку осуществляет цитоплазматическая мембрана. Существует несколько механизмов поступления веществ в клетку: – пассивная диффузия –осуществляется по градиенту концентрации, энергонезатратный процесс, не имеющий субстратной специфичности; – облегченная диффузия – осуществляется по градиенту концентрации, субстратспецифичный и энергонезатратный процесс, осуществляеный при участии пермеаз; – активный транспорт – идёт против градиента концентрации, субстратспецифичен благодаря специальным связывающим белкам в комплексе с пермеазами, энергозатратный процесс, осуществляется за счет АТФ, вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде; –транслокация, или перенос групп – осуществляется против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратный вид транспорта, вещества поступают в клетку в форфорилированном виде. 9

1.1.2 Питательные среды Питательные среды – это питательные субстраты, которые используются для культивирования в искусственно созданных условиях различных групп микроорганизмов. Питательные среды широко применяют в клинической лабораторной микробиологической практике для постановки диагноза инфекционных заболеваний, для выделения бактерий из различных патологических и загрязненных материаловдля выяснения источников заражения, а также они находят применение при санитарноэпидемиологическом обследовании людей и животных для выяснения носительства возбудителей заболеваний. Кроме того, в практике среды применяют для получения микробных масс, которые используются при изготовлении вакцин и диагностических антигенов [35]. Поскольку физиология микроорганизмов чрезвычайноразнообразна, а, следовательно, так же многообразны их характерные потребности в питательных веществах, для культивирования микроорганизмов были предложены множество различающихся по составу питательных сред. Качественный диапазон питательных сред весьма широк – от растворов минеральных солей, на которых способны расти автотрофы, до сложных, состоящих из мясных гидролизатов, они могут быть обогащены кровью или сывороткой и использоваться для выделения и культивирования особо требовательных микроорганизмов, например, патогенных, типа стрептококков, легионелл, микоплазм и других[22]. Питательные среды для культивирования микроорганизмов должны содержать в себе все химические элементы, которые необходимы для их роста и размножения, в установленных концентрациях, определенной химической форме и в той количественнойпропорции, в которой они находятся в клетках. Основной качественно-количественный состав сред обычно определяется с учетом химического состава биомассы бактерий, который в общих чертах схож у всех организмов. Как следует из химического состава бактерий, представленного на примере бактериальной культуры E.coli (таблица 2), важнейшими элементами являются: углеродC, кислородO, водородH, азотN, фосфорP, сераS, на долю которых приходится до 96% от массы сухих клеток. Таблица 2 – Элементный состав микробной клетки E. Coli[62] Элемент Углерод Кислород Азот Водород Содержание, % от сухого вещества 50 20 14 8 10

Фосфор Продолжение таблицы 2 Сера Калий Натрий Кальций Магний Хлор Железо Все остальные элементы 3 1 1 1 0,5 0,5 0,5 0,2 0,3 Чтобы ориентироваться в таком разнообразии сред их классифицируют с различных позиций, например, по физическому состоянию, составу, по предназначению (для культивирования бактерий, изоляции, идентификации, хранения определенных видов микроорганизмов) и по другим позициям. Многие из питательных сред стали «классическими», посколькуих преимущества были подтверждены в результате длительного и повсеместного использования в разных областях микробиологии. К таким средам, например, относятся питательные среды ΜакКонки и Πлоскирева, которые сочетаютв себе селективные и дифференциально-диагностические свойства при исследовании содержимого кишечника; питательную средуКитта-Тароцци используют для анаэробных микроорганизмов, в первую очередь патогенных клостридий, питательная среда Блауроккаприменяется для бифидобактерий, питательные среды Чапека и Сабуро – для культивирования мицелиальных грибов[45]. Вопреки существующемумногообразие питательных средпроводят исследования по их оптимизации и созданию новых на основе современных представлений о метаболизме отдельных групп (видов) микроорганизмов. Универсальных сред, которые одинаково пригодны для разных групп микроорганизмов, не существует. Количественно-качественный состав сред раньше подбиралсяопытным путем, без обоснования применения тех или иных ингредиентов, однако в настоящее время эта проблема решается, главным образом, на базе современного уровня знаний омикробном метаболизме. Питательная среда, которая предназначена для культивирования микроорганизмов, должна сочетать в себе всеподходящие условия для их жизнедеятельности. С этой целью при создании питательных сред предусматривают обязательное наличие в них таких соединений, которые служат источниками азота, углерода и водорода, а также набор микроэлементов в виде неорганических солей. Часто в среду добавляют так называемые факторы роста, то есть соединения, не синтезируемые культивируемым микробом. Но присутствие в среде перечисленных компонентов еще не может создатьидеальные условия для роста и 11

размножения микробов, поскольку эти процессы зависят также от физикохимических свойств среды. К таким свойствам питательной среды относятся: рН, окислительно-восстановительный потенциал, вязкость, влажность и осмотические свойства[16]. Помимовыше перечисленных требований, которые являются общими для всех сред, имеются и другие требования, которые касаются тех свойств питательной среды, которые могут сделать некорректными визуальный контроль за процессами жизнедеятельности микроорганизмов (например, цветность, прозрачность, консистенция и другие свойства) [52]. Если среда отвечает всем биологическим и физиологическим особенностям микроорганизма и обеспечивает его рост и размножение, то такуюсредухарактеризуют как полноценную, если же в ней не хватает какого-либо вещества, необходимого для нормальной жизнедеятельностимикроорганизма, то такую среду называют дефицитной. Поскольку различные виды бактерий и даже штаммы, принадлежащие к одному виду, могут существенно отличаться друг от друга по физиологии и характеру метаболизма, то для их культивирования используют различные питательные среды со специфическим составом. В зависимости от свойств, состава и назначения среды делят на различные группы, например, по консистенции – твердые, полужидкие и жидкие, простые и сложные а также по другим физико-химическим показателям. Примером твердых сред являются 2% агаровые среды (например, мясопептонныйагар, агарХоттингера), питательная желатина, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок, картофель и другие. Для приготовления твердых питательных сред наиболее часто используют агар-агар, который получают из бурых водорослей. Агар-агар является веществом полисахаридной природы, образует студень, разжижается при температуре от от70°Сдо 100 °С и застывает при температуреот 40 °С до 50°С[9]. К жидким средам относят бульон мясо-пептонный, пептонную воду сахарный бульон, бульон Хоттингера, представляющий собой мясной бульон, подвергшийся ферментативному гидролизу панкреатином и содержащий от 0,5 % до 1% поваренной соли. К простым однокомпонентным средам относятсяпептонная вода, мясопептонный бульон, мясо-пептонныйагар и питательная желатина, на базетаких сред готовят сложнокомпонентные (мясо-пептонный сахарный бульон, кровяной агар, асцит-агар и другие). Сложнокомпонентность той или иной среды находится в зависимости от биологических особенностей выращиваемых культур и от целей исследования. Например, для выращивания гемоглобинофильных бактерий используют сложную среду Борде-Жангу, в которой дефибринированную кровь добавляют к картофельно-глицериновому агару. Многие сложные питательные среды применяютпри выявлении у исследуемогомикроорганизмахарактерных свойств, выражающихся в определенной морфологии колоний, характере 12

роста или в особенностях метаболизма. Питательные среды, позволяющие установить специфические особенности микроба, называют дифференциально-диагностическими. Например, для выявления способности у бактерий расщеплять глюкозу с выделением ацетилметилкарбинола (ацетоина) (реакция Фогеса-Проскауэра) используют среду Кларка, в которой содержатся пептон, глюкоза, гидрофосфат калия и щелочь. Ацетоин в присутствии щелочи и кислорода окисляется в диацетил, который, соединяясь с гуанидином дает красное окрашивание[9, 43]. Особую группу образуют так называемые селективные среды, они создаютидеальные условия для культивированияконкретного вида бактерий и неблагоприятные для других видов, например, среды Мюллера, Кауфмана, Лифсона, Шустовой для выделения бактерий группы кишечной палочки, щелочной агар– это селективная среда для холерного и холероподобных вибрионов, среды с антибиотиками дают возможность селекционироватьантибиотикорезистентныхмикроорганизмов от чувствительных. Средивыше перечисленных питательных сред широкое применениенаходит среда Кауфмана, которая используется в качестве накопительной среды для бактерий группы сальмонелл и брюшного тифа. Главнымикомпонентами среды Кауфмана являются гипосульфитный бульон, бриллиантгрюн и желчь. Селективность для анаэробных микроорганизмов создается из-за снижения в среде концентрации кислорода. Одной из распространенных питательных сред, которые используются для выращивания анаэробных бактерий, является среда Китта-Тароцци, в которой роль адсорбента кислорода и редуцирующего фактора играет говяжья печень[6, 10]. Кроме того, к сложным средам относят синтетические среды. Уникальностьтаких средпроявляется в том, что все их компоненты являются химически чистыми соединениями, в отличие от ранее описанных питательных сред, содержащих в качестве питательных субстратов продукты натурального естественного происхождения (пептоны, кровь, асцитическая жидкость и пр.). Минимальные синтетические питательные среды содержат набор солей, в качестве источника энергии применяется глюкоза или молочная кислота, источником азота служат аммонийные соли. Эти среды пригодны для выращивания прототрофныхбактерий. Ауксотрофные микробы, которые не способны синтезировать какое-либо существенных соединений (аминокислоту, витамины, пуриновое или пиримидиновое основание), культивируют на средах, которые содержит тот или иной дополнительный ингредиент, по которому данный микроб ауксотрофен. В частности, если культивируемые микроорганизмы не могут синтезировать триптофан или другую аминокислоту, то к солевой минимальной среде добавляют соответствующую аминокислоту. Обычно L-аминокислоты вносят в концентрации 20 мкг/мл, а D,L-аминокислоты – 50 мкг/мл. Синтетические питательные среды используют для изучения физиологии бактерий, в частности обмена веществ, и особенно при изучении некоторых 13

проблем биохимической генетики. Синтетические питательные среды применяют и в селекции микробов для отбора ауксотрофных или прототрофных штаммов[61]. В лабораторных условиях для приготовления, хранения и розлива сред используют пробирки, плоскодонные колбы, флаконы и другую лабораторную посуду. Для агаровых твердых сред используют чашки Петри. В крупном микробиологическом производстве бактериальные культуры выращивают в металлических котлах (реакторы) большой емкости (500 – 1000 л). В посуде, которую используют для питательных сред, нельзя хранить дезинфицирующие вещества, антибиотики, так как их малейшие следы делают питательную среду непригодной для культивированиямикроорганизмов. Перед использованием лабораторную посуду тщательно моют и высушивают. Новую посуду предварительно кипятят в 1 % растворе соляной кислоты и промывают в дистиллированной воде. Питательные среды обычно должны быть прозрачными, поэтому их до употребления фильтруют. Отстоявшиеся расплавленные агаровые среды фильтруют через ватно-марлевый фильтр (при фильтровании через вату качество среды может снизиться за счет адсорбции на ней соединений среды, стимулирующих рост микроба). Жидкие среды фильтруют через фильтровальную бумагу илифильтрованое полотно. Если агар после фильтрования или отстаивания остается мутным, то его осветляют, добавляя яичный белок или сыворотку из расчета на 1 л среды одно куриное яйцо или около 25 мл сыворотки. Добавленные белки свертываются, адсорбируют взвешенные частицы и, оседая, просветляют среду. Готовые питательные среды разливают в соответствующую стерильную посуду и стерилизуют[12]. Необходимо отметить, что иногда рост колоний отсутствует при посеве на питательную среду, которая считается удовлетворительной, например, на питательный бульон. Причины этого явления по большей части остаются неизвестными, обнаружены только некоторые ингибиторы, к которым относятся жирные кислоты и перекиси. Жирные кислоты содержатся практически во всех материалах, которые используются в микробиологической практике– в пептоне, агаре, казеине, вате и др. В составе сред они ингибируют или ограничивают рост некоторых видов микроорганизмов, вкючая патогенные, например, Mycobacteriumtuberculosis, Haemophilusinfluenzae, Neisseriagonorrhосае и др. Для удаления жирных кислот в среду добавляют вещество, связывающее жирные кислоты, например, 0,5 % активированного угля, 0,15 % растворимого крахмала либо 10 % сыворотки[5]. Перекиси были оюнаружены в средах, которые были подвергнутыУФоблучению или находящихся на свету, и в некоторых случаях после автоклавирования. Содержание перекисей в питательных средах различно, из-за чего в некоторых случаях наблюдается ингибирование штаммов, не содержащих 14

каталазу, тогда как в других не растут даже штаммы, продуцирующие ее. Ингибиторы роста микроорганизмов могут образовываться под действием различных, часто неизвестных факторов в процессе приготовления и нагревания сред. Значительным подавляющим эффектом обладают глюкозофосфаты, которые образуются в процессе термического воздействия на среды; комплекс, содержащий медь и пептон и другие компоненты. Все среды вне зависимости от их назначения разливают в чистую стеклянную посуду и стерилизуют. Большую часть питательных сред стерилизуют автоклавированием, но при разных режимах в зависимости от их состава. Для контроля стерильности среды после автоклавирования помещают в термостат при 37°С на 24 ч. По прошествии суток жидкие среды должны оставаться прозрачными, на поверхности плотной среды и в толще питательных сред не должны появляться признаки роста (помутнение, образование колоний). Помимо контроля стерильности, производят также химический контроль готовых сред, который заключается в определении рН, концентрации общего и аминного азота и хлоридов. Проводят также биологический контроль сред. При этом виде контроля несколько образцов среды засевают культурой того микроорганизма, для которого приготовлена среда, и затем изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали все виды контроля, их можно использовать по назначению. Итак, для культивирования микроорганизмов необходимы следующие условия: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще 24 часа). 1.1.3 Физико-химические показатели питательных сред Важнойхарактеристикой питательных сред, которое влияет нажизнедеятельность микроорганизмов, является их кислотность (щелочность), представляющая собой отрицательный логарифм концентрации водородных ионов –рН. рН имеет влияние на процессы распада кислот и оснований в среде, растворимость питательных веществ, проникновениевеществ в клетку, на активность энзимов и другие метаболические процессы, определяя тем самым потенциал роста микроорганизмов на оптимальной по составу среде. 15

Для большинства микроорганизмов нейтральная реакция среды (рН 7,0  0,5)является благоприятной для развития, однако процессы роста и размноженияс различной степенью интенсивности могут проходить и в широком диапазоне значений pH. Так, для некоторых сапрофитов оптимумрН лежит в щелочном диапазоне 8,2 – 8,5, для других представителей сапрофитов оптимум рН 4,0 – 5,0 (кислая среда) [16, 27].Мицелиальные грибы и дрожжи представляют собой ацидофильные организмы и предпочитают реакцию среды при слабокислых значениях рН – 4,0 – 6,0. Значение рН следует проверять не только после приготовления питательной среды и ее стерилизации, но такжеперед использованием, поскольку уровень водородного показателя среды может измениться в процессе ее хранения. До нужного значения этот фактор доводят с использованием растворов кислот (соляной, серой, фосфорной), щелочей (едкий натр, гидроксид калия) или солей, имеющих щелочную реакцию(бикарбонат натрия, гидрокарбонат натрия[66]). Так как в процессе жизнедеятельностибактерий в среду выделяютсякислые или щелочныепродукты обмена, которые способны изменить рН, в состав питательных сред добавляют буферные смеси, в основном фосфатные буферы, которые обладают максимальной буферной емкостью в нейтральном диапазоне рН. Буферными свойствами могут обладать некоторые вещества οрганического происхождения – аминокислοты, пοлипептиды, белки, так как они представляют собой амфοтерные соединениям и способны реагировать как с кислотами, так и со щелочами, способствуя их нейтрализации. Значимость рН для роста и размножениямикроοрганизмов определяется и его влиянием на уровень второго важного показателя питательной среды – οкислительно-восстановительного потенциала. Окислительнο-восстановительный потенциал (ОВП) –это показатель способности вещества принимать электроны(степень окисленности) или отдавать (степень восстановленности), который устанавливается благодаря присутствию окислителей, восстановителей и действию свободного кислорода[18]. Данный показатель лежит в основе разделения микроорганизмов на две группы – аэробные и анаэробные. Зависимость процессов жизнедеятельности микроорганизмов от наличия свободного кислорода определяется не только прямым его действием на бактериальные клетки, но и косвенным, а конкретноувеличением степени окисления среды (уровня окислительновосстановительного потенциала). Процессы жизнедеятельности микроорганизмов основаны на совокупности последовательно протекающих ферментативных реакций, для 16

каждой из которых необходим свой уровеньокислительновосстановительного потенциала. Для каждой группы микроорганизмовхарактерна своя зона окислительно-восстановительного потенциала, в которой возможен его рост, аналогично тому, как есть свой оптимальный диапазон уровня водородного показателя. Величину окислительно-восстановительного потенциала определяют электрометрическии выражают в вольтах (В) или милливольтах (мВ) и обозначают символом Eh. При определении окислительно-восстановительного потенциала необходимо принимать во внимание, что он зависит и от рН среды – в кислой среде ОВП выше, чем в средах при нейтральном и щелочном значении рН. Из этого следует заключить, что окислительно-восстановительное состояние сред можно характеризовать только по двум показателям – Eh и рН, которые необходимо определять одновременно. Поэтому при установленииОВПчасто используют другой символ – rН 2, который объединяет величины Eh и рН, связанные следующим соотношением: Прежде чем получить значение rН2, необходимо определить Eh и рН в исследуемой пробе. На основании полученных данных вычисляют rН 2. Данный символ удобен в работе, но его использование вноситпогрешность в результаты измерения. От уровня окислительно-восстановительного потенциала среды зависит рост и аэробов, и анаэробов, однако у аэробов эта зависимость не так заметна, поскольку на среде, полностью не изолированной от воздуха (в сосудах, пробирках с ватно-марлевыми пробками, в чашках Петри), уровень этого фактора соответствует уровню, который необходим для их роста[39]. Подавление роста может наблюдаться только при избыточной аэрации, и, соответственно, при чрезмерно высоком значении ОВП. Вероятность такого ингибирования в особенности велика при высокой интенсивности аэрирования солевых питательных сред, имеющих небольшую буферную емкость. Облигатные анаэробы выражаютвысокую чувствительность к этому условию в среде и перестают размножаться при Eh выше – 0,1В. Создание или поддержание Eh среды на заданном уровне представляет собой задачу сложнее, чем регуляция и корректировка рН. В случае, еслинужно повысить значениеEh, в питательную среду добавляют один из окислителей – К 3Fe(CN)6, K2Cr2O7, KMnO4, H2O2 и др. либо увеличивают поступление в нее кислорода воздуха (в зависимости от способа культивирования). 17

Для понижения значенияEh питательной среды используют следующиеметоды[20]:  загустение среды, для затруднения диффузии кислорода из воздуха в среду;  удалениевоздуха из питательной среды кипячением или инертными газами –аргоном, азотом, гелием;  добавка к питательной среде органических и неорганических восстановителей, то есть редуцирующих веществ. Органические восстановители в основном представлены следующими веществами: цистеин, аскорбиновая кислота, тиогликолят натрия, L-тирозин, глютатион. В некоторые среды для анаэробных организмов добавляют измельченное мясо, которое содержит восстановители. Из неорганических восстановителей наиболее широкое применение находят: гидросульфит натрия, гексацианоферроат калия, различные сульфиды. В зависимости от степени восприимчивости анаэробной культуры к кислороду используют тот или иной метод, или сочетание нескольких. При выборе окислителей или восстановителей для регуляции значенияEh питательной среды необходимо учитывать их возможное действие, как компонента среды, на свойства культуры микроорганизма[7]. 1.1.4Пептοны в питательных средах Истοчникамиуглерοда в средах служат οрганические сοединения – углеводы, спирты и некοторыеοрганическиекислοты, источником азота – минеральные или органические соединения. Весьма широко используют пептоны – это продукты ферментативнοго или кислотного гидролиза белков различного происхождения и представляющие собой смесь аминокислот и полипептидов разной сложности. Отличия в аминокислотном и пептидном составе пептонов находятся в зависимости от свойств исходного белка и степени его расщепления. Кроме того, пептоны содержат жиры, металлы, соли, витамины и другие органические и минеральных вещества[21]. По большей части применяются пептοны, которые получают с помощью пепсина, панкреатина, трипсина, используемых в виде частично очищенных, а также в виде «сырых» препаратов. К числу второго вида препаратов относятся измельченные ткани желудков свиней и поджелудочных желез свиней и крупного рогатого скота. Под действием пепсина, панкреатина и трипсина образуются пептοны, пοлипептиды различной степени сложности и свободные аминοкислоты, но необходимо учитывать, что пептοны, полученные с использованием препаратов, содержащих пепсин и панкреатин, различаются по глубине гидролиза белков. 18

Пепсинные пептоны имеют в большом количестве высокомолекулярные полипептиды, то есть продукты неглубокого гидролиза белков. Панкреатические пептοны представляют собой набор продуктов более глубокого гидрοлиза – то есть простых пοлипептидов, пептοнова также большого количества свободных аминокислот, о чем говоритповышенное содержаниеаминногоазοта[32, 46]. Известно очень много способов получения пептοнов и пепсиннοго, и панкреатического происхождения, которые используются для культивирования различных видов микроοрганизмов, с учетом их характерных особенностей. Пептοны выпускают в основном в сухом виде – в виде желто-бежевого или серого порошка. Пептοны характеризуются очень высокой питательной ценностью для микроорганизмов, но одновременно обладают и значительным недостатком, а конкретно – нестандартностью. Высокая вариабельность пептοнов по составу и питательной ценности οбуславливается не только нестандартностью исходного сырья – мяса, но ивариабельностью источников ферментов, на которую влияет состояние животного органа, то есть желудка или поджелудочной железы. В качестве питательных компонентов многих питательных сред как агаров, так и бульонов, могут применяться не только гидролизаты мяса, но также и гидрοлизаты других белковых субстратов – казеина, рыбных продуктов, растительных белков. Рыбные продукты успешно используют для получения сред для микроорганизмов, поскольку по химическому составу мясо животных почти не отличается от мяса рыб. В России выпускаются в виде сухого порошка и широко применяются в лабораторной практике общеупотребительные питательные среды на основе панкреатического гидрοлизата кильки[42]. Казеин – это фосфорсодержащий белок, который получают из обезжиренного молока и являющийся наиболее полноценным компонентом сырья для питательных сред. Казеин от других источников белка отличается постоянством состава, он содержит все аминοкислоты и некоторые витамины.Высушенный казеин представляет собой белый порошок без вкуса и запаха. Панкреатический гидрοлизат казеина– это продукт, получаемый с использованием ферментов поджелудочной железы, пептический – с использованием пепсина. Ферментативные гидрοлизаты казеина имеют в своем составе низкомолекулярные пептиды, аминοкислоты, в том числе и триптофан, соотношение которых в составе гидрοлизатовразлично в зависимости от способа их получения. 19

Кислотные гидролизаты казеина получают благодаря использованию высоких температур (более 110оС) и концентрированной соляной кислоты, при этом достигается практически полный гидролиз до аминокислот. Но при этом разрушаются углевοды, триптοфан, цистин и частично треοнин и серин, а содержание соли увеличивается до 40%. Ферментативные и кислотные гидрοлизаты казеина выпускаются в виде мелкодисперсных сухих порошков светло-желтого, бежевого, серого цвета[4]. Кроме того, в качестве источника углерода, азота и других компонентов для многих общеупотребительных и специальных сред используются продукты, получаемые из дрожжей, такие как дрожжевая вода, дрожжевой настой, дрожжевой автοлизат, дрожжевой экстракт, кислотные и ферментативные гидрοлизаты дрожжей. Для получения этих продуктов используют преимущественно хлебопекарные дрожжи рода Saccharοmyces и кормовые дрожжи родов Candida и Torulopsis. Дрожжи содержат до 50% белка, от 25 % до 40% углеводов и являются богатым источником витаминов группы В, кальциферола пуриновых и пиримидиновых оснований. Среди витаминов группы В лидирующую позицию занимает никотинοвая кислота (68 мг/100г), пантатенοвая кислота (30 %), рибοфлавин (до 12 %).Белок дрожжей сбалансирован по аминокислотному составу и по этому показателю близок к животному белку. Значительное количество среди всех аминокислот занимает глутаминοвая кислота (до 12 %), аспарагинοвая кислота (8 %), лизин (до 7 %), аланин (5,6 %), остальных аминοкислоты представлены в меньших количествах. Дрожжевой автοлизат. Дрожжевые клетки содержат большое количество различных протеолитических ферментοв (пепсиназа, триптаза, эритаза и другие), под действием которых в определенных условиях происходит автолиз клеток и высвобождение из них белков в виде пептонов, альбумοз, а также аминокислот, нуклеиновых кислот и другие. Данные компоненты и определяют состав автοлизата, который сопоставим с триптическимгидролизатοм других белков, в том числе и по содержанию аминного азота. Содержание аминногο азота дрожжевого автοлизата достигает до 1200 мг[37]. Гидролизаты дрожжей получают с помощью ферментов или кислот. Ферментативные гидролизаты получают с применением поджелудочной железы или панкреатина, кислотные – с применением фосфорной или соляной кислот. По основному химическому составу, а конкретно содержанию общего и аминного азота, пептонов, триптофана, дрожжевые гидролизаты сходны с мясными гидролизатами, кроме того количество пептонов в дрожжевых гидролизатах больше, чем в мясных. В качестве основы для питательных сред применяют продукты, получаемые из растительного сырья и, в основном, из соевых бобов, богатых белком, витаминами, минеральными веществами. Из преобладающего числа 20

таких продуктов основное использование в практике изготовления питательных сред нашли ферментативные и кислотные гидролизаты сои (пептоны). Ферментативный гидролиз осуществляют с использованием пепсина, папаина, панкреатина, а кислотный с использованием соляной кислоты[25]. Высокая питательная ценность пептонов подтверждается тем, что, например, на средах с папаиновымгидролизатом сои и без добавления сыворотки и факторов роста, хорошо проявляют рост стрептококки, гонококки и другие требовательные бактерии. Соевый бульон в некоторых случаях можно заменить на мясной бульон. Из этого следует, что все вышеуказанные продукты обработки мяса животных, рыбы, казеина, дрожжей, растительного сырья представляют собой органические источники углерода и азота. Но для многих бактерий легкоусвояемым источником азота является аммοнийный азот различных аммонийных солей [1, 25]. 1.1.5 Источники минеральных элементов, факторы роста Источниками фосфора (P) – биогенного элемента служат по большей части неорганические фосфаты калия и натрия, а среди органических соединений – это пуриновые и пиримидиновые основания. Источниками серы(S) для одних групп микроорганизмов могут служить сульфаты металлов (окисленная форма серы), а для других – тиосульфаты (восстановленная форма серы). Основным органическим источником серы являются серосодержащие аминокислоты, такие как цистеин, метионин. Металлы, например, калий(K), магний(Mg), натрий(Na), железо(Fe) (макроэлементы) микроорганизмы получают в виде катионов неорганических солей. Другие микроэлементы – кобальт (Co), марганец (Mn), молибден (Mo), медь (Cu), цинк (Zn)в среды не добавляют, поскольку они в достаточном для микроорганизмов количестве присутствуют в виде примесей к макроэлементам в средах и в воде. Кислород(O) и водород (H)–это наиболее доступные для микроорганизмов элементы, так как они входят в состав воды, солей и органических веществ. Но многим микроорганизмам и, в первую очередь, аэробам, нужени атмосферный кислород О2. Для роста, размножения, нормального протекания метаболических процессов микроорганизмов, помимо источников углерода, энергии и минеральных элементов, необходимы факторы роста, или ростовые вещества. К таким веществам относятся аминокислоты, витамины, пуриновые и пиримидиновые основания. Они необходимы всем 21

микроорганизмам, но многие бактерии, такие как прототрофы, синтезируют их сами, другие (ауксотрофы) не способны к синтезу рстовых факторов и для обеспечения их роста недостающее соединение должно быть внесено в среду[2]. Так, не все микроорганизмы могут синтезировать ряд аминокислот и синтезируют свои белки только тогда, когда эти недостающие аминокислоты содержатся в среде. В зависимости от метаболических особенностей микроорганизмов количество незаменимых для них аминокислот отличается. Для палочек тифа и ботулизма необходима всего одна аминокислота – этотриптофан, для золотистого стрептококка две аминокислоты – это триптофан и цистеин, для молочнокислых – 16, а для гемолитического стрептококка – 17[63]. Парааминобензойная кислотаC₇H₇NO₂ является ростовым фактором для многих патогенных бактерий, например, для пневмококков, гонококков, возбудителей дизентерии, а никотинамид– для золотистого стафилококка и др. Факторы роста нужны микроорганизмам в очень малых дозах: аминокислоты – 10 мкг/мл, пурины и пиримидины – 10 мкг/мл, витамины – 1 мкг/мл среды. Ростовые вещества в питательную среду можно вносить в виде самостоятельных веществ, однако, часто для этого используют дрожжевую воду, дрожжевые экстракты и автолизаты, гидролизаты мяса, казеина. Использовать эти сложные по составу источники факторов роста особенно удобно тогда, когда не известна потребность культуры в какомлибо конкретном факторе или ей необходимонесколько факторов одновременно [63]. 1.1.6 Особенности микробного роста на плотной питательной среде Для изучения характеристиккультуры микроорганизмы культивируют на питательных средах в чашках Петри либо в пробирках. При посеве исследуемого материала необходимо получить изолированный рост колоний. Сначала чашки с посевом рассматривают невооруженным глазом, затем и микроскопируют колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения. В выросшей колонии отмечают величину, форму, контур края, рельеф, а также структуру ицвет[7].. Величину колонии определяют ее диаметром: – точечные (диаметр не более 1 мм), – мелкие (диаметр от 1до2 мм), – средние (диаметр от 2до4 мм), – крупные (диаметр не менее4 мм) 22

Формы колоний бывает следующими:круглая, амебовидная, ризоидная, или корневидная, которая напоминает корни деревьев. Характер контура края определяется при микроскопировании колонии с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные края. Неровные делят на: 1) фестончатый край, он состоит из крупных, округлых зубцов правильной формы; 2) волнистый край, отличающийся от фестончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко; 3) эрозированный, или зазубренный, край состоит из острых зубцов разной величины и формы; 4) бахромчатый край, который имеет нежные ворсинки. В некоторых случаях отсутствует четко выраженная линия, которая ограничивает колонию от поверхности среды, такой край колонии называется расплывчатым. Рельеф колонии характеризуют приподнятостью ее над поверхностью среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом при рассматривании сверху и сбоку[30]. Различают следующие виды колоний: 1) каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различнойстепенью выраженности выпуклости, представляющие собой в вертикальном разрезе сегмент шара и отличаются только длиной радиуса. Колонии слабовыпуклые имеют большую длину радиуса, в то время как куполообразные – меньшую; 2) колонии плоско-выпуклые с плоским верхом, имеющие в вертикальном разрезе трапециевиднуюформу; 3) колонии конусообразные, которые имеют в вертикальном разрезе треугольнуюформу: 4) колонии с приподнятой в виде пика серединой и валиком по периферии; 5) колонии с вогнутым центром; 6) колонии плоские, стелящиеся по поверхности среды. Поверхность исследуемой колонии микроскопируют при малом увеличении. Поверхность колоний может быть матовая или, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (англ. smooth– гладкий), шероховатые – буквой R (англ. rough – шероховатый). Механизм образования гладких и шероховатых форм колоний обуславливается различием процессов клеточного деления. Микробные клетки в колониях S-форм располагаются, соприкасаясь друг с другом своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, образуют цепочки, которые, накладываясь друг на друга, образуют шероховатую поверхность и неровный край колонии[41]. 23

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссоциации, этоявление у патогенных микроорганизмов наблюдается под действием антибиотикотерапии и химиотерапии, факторов специфического иммунитета, которые формируются в течение инфекционного процесса, и факторов внешней среды. Среди R-форм колоний различают: складчатые, гирозные, по виду напоминающие исчерченную извилинами поверхность мозга; бородавчатые, концентрически или радиально исчерченныер; шагреневые, то есть мелкозернистые. Цвет колонии обусловливается пигментом, образуемый культуроймикроорганизмов. Преобладающее количество патогенных бактерий пигмента не образуют, поэтому колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени выглядят прозрачными. Пигментообразующие виды микроорганизмов дают колонии разнообразных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и другие[11]. Структура колоний бактерий определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженой диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментированных колоний микроорганизмов и колоний, не пропускающих света, структура не определяется. По характеру структуры колонии различают следующие виды: 1) гиалиновые – это бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры колонии; 2) зернистые колонии, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелкозернистые и грубозернистые; 3) нитевидные или волокнистые колонии, которые характеризуются наличием длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии. Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение однородных одинаково во всех частях, у неоднородных колоний центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение неодинаковое по сравнению с остальной массой. Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, определяютпутем прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии делят на следующие: 1) пастообразные колонии, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла; 2) вязкие или слизистые колонии, прилипающие и тянущиеся за петлей; 3) волокнистые или кожистые колонии, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки; 4) хрупкие, сухие колонии, рассыпающиеся при прикосновении петли[13, 36]. 24

1.1.7 Особенности микробного роста на жидких питательных средах На жидких питательных средах характер роста микроорганизмовне так разнообразен, как на плотных питательных средах. Однако и здесь естьспецифические формы роста бактерий. Рост бактерий с равномерным помутнением средысоответствует многим патогенным бактериям, которые относятся к группе факультативных анаэробов. Цвет среды остается таким же или изменяется в соответствии с цветом пигмента, образующегося в исследуемой культуре. Придонный рост культуры характеризуется образованием осадка на дне пробирки с жидкой средой. Осадок может бытьскудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев.По консистенции осадок бывает вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной либо мутной. Цвет осадка и среды определяется наличием пигмента, который выделяется культурой бактерий. Если культура не образует пигмент, то цвет среды не изменяется, а осадок приобретает серовато-желтый или бежевый цвет. Придонный рост в основномсвойственен для микроорганизмов с анаэробным типом дыхания[23]. Пристеночный рост культурыхарактеризуетсятем, что среда в пробирке остается совершенно прозрачной. Микроорганизмы растут с образованием более или менее крупных рыхлых хлопьев или, наоборот, компактныхзерен, прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда, с которых может сниматься легко или с трудом. Поверхностный рост культурывыражаетсяпри появлении на поверхности жидкой питательной среды пленки, проявление которой может сопровождаться следующими характеристиками:  пленка тонкая, нежная, бесцветная, с едва заметным налетом, исчезающим при встряхивании пробирки и взбалтывании среды;  пленка влажная, толстая, хорошо видимая простым глазом, слизистой консистенции, прилипает к петле и тянется за ней;  пленка плотная, сухая, при попытке взятия из нее материала снимается целиком в виде круглого диска, соответствующего диаметру пробирки:  пленка плотная, сухая, со сморщенной поверхностью, краями прикрепленная к стенкам сосуда; при взбалтывании жидкости или прикосновении бактериальной петли разбивается на кусочки, погружающиеся в глубь жидкости. Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмента, продуцируемого растущей культурой [14]. 25

1.1.8 Особенности микробного роста на полужидких питательных средах Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде изучаемую культуру засевают в столбик высотой около 5 см0,5% полужидкого агара. С целью, чтобы особенности роста культуры проявлялись наиболее четко, прокол среды делают ближе к стенке пробирки. Посев, произведенный данным образом, дает возможность выявить подвижные расы микроорганизмов и отличить их от неподвижных. Подвижные колонии в столбике полужидкого агара вызывают выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толщине среды. Неподвижные формы колоний растут только по ходу прокола среды, напоминая сосульки цилиндрической или конической формы, при этом окружающая среда остается совершенно прозрачной[68]. 1.2 Ферментативная активность микроорганизмов Микробная клетка, также как и клетки высших организмов, обладаетдовольно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов имеюттакие же свойства и функции, что и ферменты высших организмов. Вещества, имеющие ферментативную природу, обладают несколькими общими особенностями: 1)малое количество катализатора способно обеспечить превращение большого количества субстрата (одна часть химозина способна свернуть 12 млн частей молока), оставаясь при этом в свободном состоянии; 2) для ферментов свойственная высокая специфичность действия (например, лактазагидролизует только лактозу и не действует на родственные сахара); 3) ферменты, которые синтезируются микробной клеткой, способны действоватьдаже выделенными из нее[15]. По международной биохимической классификации ферментов, в зависимости от катализируемой реакции выделяют 6 классов, таких какоксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Представители каждого класса ферментов имеют обязательно систематическое название, традиционное (тривиальное) название, а также четырехуровневый числовой код, отражающий класс, подкласс, подподкласс,а также серийный номер фермента в под-подклассе. Помимо систематического названия ферменты микроорганизмов имеют традиционные названия, полученные в зависимости от субстратной специфичности. Традиционно ферменты микроорганизмов классифицируют 26

на сахаролитические, протеолитические, липолитические, окислительновосстановительные ферменты, а также ферменты-токсины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов (приложение А). В микробной клетке находится большое количество ферментов, благодаря чему микроорганизмы могут осуществлять одновременно ряд разнообразных реакций. В наибольшей степени высокой ферментативной активностью обладают сапрофиты; и напротив, меньше это свойство выражено у патогенных бактерий. Изучение ферментов патогенных микроорганизмов имеет исключительно важное значение, поскольку на основании определения ферментативной активности микробов можно дифференцировать различные виды и определять природу того или иного возбудителя заболеваний. Наряду с этим ферментативная активность бактерий определяет патогенез и клиническую картину инфекционного заболевания[38]. Вопреки малым размерамбактериальной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ распределены в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового биосинтеза связаны с рибосомами. Некоторые ферменты не связаны с определенными структурами клетки и находятся в цитоплазме в растворенном виде. Ферменты бактерий подразделяются на экзоферменты и эндоферменты. Эндоферментыдействуют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена, к таким ферментам относятся: –гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту; –дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток; – фибринолизин – расщепляет коллаген; –плазмокоагулаза – свертывает плазму крови; – нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту; –лецитовителлаза – расщепляет лецитин. Экзоферментыспособны выделяться клеткой в среду и катализировать реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, которые могут быть доступны для ассимиляции микробной клеткой. К таким ферментам относятся гидролитические ферменты, выполняющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов[24]: а) пищеварительные ферменты, расщепляющие сложные питательные вещества до более простых; б) защитные ферменты, например, пенициллиназа, защищающая клеточную стенку от действия пенициллина; в) ферменты агрессии – это факторы вирулентности патогенных микроорганизмов; По другому признаку различают уже конститутивные и индуцибельные ферменты. Конститутивные ферменты синтезируются клеткой постоянно, вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде. Индуцибельные 27

или адаптивные ферменты синтезируются лишь при наличии в питательной среде субстрата определенного фермента. Например, E.coli на среде с глюкозой почти не образует Р-галактозидазу, однако резко увеличивает ее синтез при выращивании на среде с лактозой или другим Р-галактозидом[67]. Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткань и клетки, обусловливая широкое распространение токсинов микроорганизмов в инфицированной ткани. К такой группе ферментов относятсягиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза, лецитовителлаза и др. В частности, гиалуронидаза стрептококковпри расщеплении гиалуроновой кислоты соединительной ткани способствует распространению стрептококков и их токсинов[31]. Ферментативную активность бактерий и грибов широко применяют в промышленности при получении органических кислот, например, уксусной, молочной, щавелевой, лимонной, приготовления молочных продуктов,таких как сыр, ацидофилин, кумыс, в виноделии, пивоварении и других отраслях промышленности. Кроме того, посредством микробного синтеза получают также же амилазы для гидролиза крахмала, протеиназы для обработки кож, пектиназы для осветления фруктовых соков [48, 60]. Скорость образования и распада ферментов нходится в зависимости от условий жизнедеятельности микроорганизмов, их физиологического состояния и определяется скоростью поступления в клетку веществ, которые ингибируют и активируют биохимические процессы. Гидролазы, фосфатазы, протеиназы, трансферазы и другие ферменты проставлены изоферментами, есть множественными формами ферментов, которые оказывают одинаковое воздействие на субстрат, но отличаются по электрофоретической подвижности и некоторым кинетическим характеристикам. Присутствие изоферментов в клетке связано с дифференциацией клеточной структуры в разных условиях среды. При этом бактериальные клетки синтезируют ферментоы, действие которых проявляется, например, при щелочной или кислой реакции среды. Гидролазы. Гидролазы способны катализировать расщепление водородных связей между атомами с помощью молекулы воды [33]. Протеазы. Среди бактериальных протеаз смешанных микробных ценозовприсутствуютпротеиназы, пептидазы и эластазы. Активность ферментов увеличивается в присутствии ионов Fe 2+ и особенно ионов Mg2+, которые содержатся в зольной части осадков и илов. Оптимум pH этих ферментов находится в пределах 7 – 8. Бактериальные эластазы катализируют окисление парафиновых углеводородов. Штаммы Ps. aeruginosa, продуцирующие эластазы, ассимилируют парафины с числом углеродных атомов 12 – 16 [9]. Трансферазы. Ферменты этой группы катализируют передачу определенных радикалов от одной молекулы к другой. Трансферазную активностьимеютнекоторые специализированные физиологические группы микроорганизмов, окисляющих парафины, циклоалканы и арены [47]. 28

Оксидазы. Оксидазы в клетке активируют различные реакции окисления. Различные группы бактерий существенно отличаются по оксидазной активности; это же относится ко времени оксидазной адаптации при окислении аренов и поверхностно-активных веществ (ПАВ). В частности, бактерии, окисляющие арены, не способны развиваться в среде, содержащей ПАВ, из-за отсутствия у них соответствующей адаптивной ферментной системы [19, 40]. Гидрогеназы. С помощью гидрогеназ водородные микроорганизмы активируют молекулярный водород и используют его для получения энергии и восстановления никотинамидадениндинуклеитида. Водород образуется при бактериальном брожении благодаря расщеплению р-кетокарбоновых кислот под действием фермента ферредоксин-гидрогеназа. У большинства штаммов сульфатредуцирующих бактерий присутствует конститутивная гидрогеназа, с помощью которой в дыхательную цепь включается молекулярный водород. В качестве доноров водорода сульфатредуцирующие бактерии используют органические кислоты, спирты и молекулярный водород [65]. Дегидрогеназы. Аэробные дегидрогеназымикроорганизмов катализируют «удаление» из субстрата водорода под действием кислорода. Все группы бактерий, которые способны окислять углеводороды, обладают высокой дегидрогеназной активностью, за исключением составляют специфические группы, окисляющие моноциклические и бициклические циклоалканы и арены. У многих штаммов Actinomyces, окисляющих ароматические углеводороды, дегидрогеназная активность отсутствует. Жирные кислоты, этилформиат, диэтиловый эфир не подавляют активности аэробных дегидрогеназ. Тетраэтиленгликоль даже способен стимулирует их активность в белковом обмене клетки [34]. Каталазы. Каталазы способны регулировать расщепление перекиси водорода и образование молекулярного кислорода. Наибольшейкаталазной активностью отличаются окислители алифатических спиртов и алифатических карбоновых кислот. Пероксидазы. Ферменты класса пероксидаз катализируют окисление субстратов за счет перекиси водорода. Причем их деятельность обратимо тормозится сероводородом, аренсульфонатами (особенно третбутилбензолсульфонатом) илаурилсульфатом [23]. Бактериальные биоценозы выделяют большое количество разнообразных типов внеклеточных (гидролитических и негидролитических) ферментов. В процессе их деятельности большая часть, а иногда и все количество того или иного высокомолекулярного соединения гидролизуется вне клетки, хотя микроорганизмы используют лишь малую часть продуктов такого гидролиза [65]. 1.3 Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов 29

Методов, применяемых для идентификации микроорганизмов, большое количество, но на практике применяют не все. Большинство способов базируется на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы. Дифференциально-диагностические среды – это специальные смеси питательных веществ, применяемые для определения видовой принадлежности микробов и изучения их свойств. При росте микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах протекают химические процессы, которые обусловлены наличием у микробной клетки различных ферментов. Одни ферменты способны расщеплять белки, другие – углеводы, третьи могут вызывать реакции окисления и восстановления и т.д. Благодаря действию ферментов в дифференциально-диагностической среде происходят соответствующие реакции[3]. 1.3.1 Получение чистой бактериальной культуры Чтобы из смешанной элективной культуры получить необходимый микроорганизм в виде чистой культуры, нужно добиться разобщения клеток, после этого обеспечить условия, в которых образуется их потомство. Чистой культурой называют популяцию, которая представляет собой потомство одной клетки, споры или вирусной частицы. Существуют такие методы, как прямого выделения одной клетки при микроскопировании (их обычно применяют для относительно крупных организмов) и косвенные методы, они основаны на разобщении клеток на плотных средах с последующим формированием колонийили в жидких средах с последующим формированием суспензий. Для получения чистых культур путём разобщения клеток в питательных средах наиболее простым и чаще других используемым способом является чашечный метод Коха, состоящий в физическом разобщении клеток на плотной среде, в результате чего одна клетка формирует одну колонию, состоящую из генетически однородных особей – потомков единственной клетки. Для разобщения клеток аэробных микроорганизмов используют разные методы [49]: 1. Посев методом Коха на поверхность плотной среды в одной чашке Петри. Для получения изолированных колоний исследуемую культуру следует развести. При этом бывает сложно предсказать относительное содержание в суспензии требуемых микроорганизмов, и поэтому обычно делают высевы из нескольких серийных разведений, обычно из разведений 10-4 – 10-6; 30

2. Посев методом Коха на плотные среды в трёх чашках Петри. Такой способ обычно даёт лучшие результаты при посеве смешанных культур, иными словами позволяет выявить наибольшее разнообразие морфологических типов колоний; 3. Посев истощающим штрихом. Этот метод выбирают тогда, когда есть уверенность, что искомый организм находится в элективной культуре в достаточно высокой концентрации. Для получения изолированных колоний анаэробов выбираютдругие методы [11, 50]: 1. Глубинный посев. В этом методе также требуется произвести разведения элективной культуры, как и при посеве на поверхность плотной среды в одной чашке Петри; 2. Разведение суспензий в плотных питательных средах. Этот метод в основном используют для облигатных анаэробов. Суть метода состоит в том, что в пробирки для разведения культуры вместо физиологического раствора вносят расплавленную агаризованную питательную среду, охлаждают её до 45оС, после этого совершают все те манипуляции по разведению суспензии. Делают 7– 10 последовательных разведений с шагом 10. Затем среду в пробирках доводят до комнатной и затем заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла для защиты среды от проникновения воздуха. Для некоторых анаэробов можно применять все способы получения изолирования колоний на поверхности плотной среды, как и для аэробов, но после посева культивирование следует проводить в анаэростате. Для выделения чистых культур бактерий, не способных формировать колонии на плотной среде, применяют метод предельных разведений в жидкой среде, применяют метод предельных разведений в жидкой среде. Такой способ удаётся реализовать лишь в том случае, когда требуемаякультура преобладает в смешанной популяции. Разведение культуры следует производить с таким расчётом, чтобы при внесении аликвот в серию пробирок с питательной средой среднее число клеток составляло бы не более 0,05 на пробирку. Этогоможно достичь при инокуляции аликвот по 1 мл в 100 пробирок из 100 мл суспензии, содержащей всего 5 клеток. В таком случае вероятность того, что пробирки, в которых наблюдается рост микроорганизмов, попала всего одна клетка, равна 0,975 [23, 51]. Капельный метод Линдера позволяет выделять крупные клетки таких микроорганизмов, какцианобактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, водорослей, простейших. Суть метода состоит в следующем. Разводят элективную культуру в питательной среде с таким расчётом, чтобы в малом объёме среды содержались одиночные клетки (обычно получают разведения 10-6 – 10-8). На поверхность стерильных покровных стёкол бактериологической петлёй наносят капли разведённой суспензии при соблюдении правил асептики. 31

Готовят препараты «висячая капля» и микроскопируют. Затем отбирают такие препараты, в которых присутствует по одной клетке, и инкубируют их во влажных камерах, то есть помещают в чашки Петри с увлажнённой фильтровальной бумагой на 24 ч. Затем вновь просматривают под микроскопом и растущие культуры микробиологической петлёй переносят в жидкиепитательные средыили на плотные среды[64]. Выделение клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор – это устройство, которым оснащают микроскоп, позволяющее с помощью специальной микропетли или микропипетки извлекать из суспензии одну клетку [54]. Определение степени «чистоты» выделенной культуры. Получив при высеве элективной культуры на плотную среду изолированные колонии, нельзя быть уверенным в их однородности. Обычно в составе колоний, сформированных при первичном высеве элективной культуры, обнаруживаются также представители разных видов. Такое явление объясняется тем, что представители смешанных популяций на среде определённого составе могут расти медленно или не расти вовсе, но и не гибнуть [16, 29]. Следующей обязательной процедурой получения чистой культуры является «расчистка», она проходит следующим образом: одну типичную колонию рассеивают методом истощающего штриха (для аэробов) или глубинным посевом (для анаэробов) на соответствующей по составу плотной питательной среде. При глубинном посеве одну колонию выделяют из толщи среды петлёй или вырезают стерильным скальпелем маленький фрагмент среды с изолированной колонией, помещают в пробирку с 1 мл физиологического раствора, тщательно ресуспендируют и разводят перед высевом в 100 раз. Полученные таким образом изолированные колонии анализируют по морфологическим признакам и снова одну типичную колонию рассевают таким же образом [20]. После «расчистки» обязательно нужно убедиться в степени однородности полученной культуры. С этой целью можно воспользоваться визуальным методом, микроскопическим контролем или высевом на ряд питательных сред. При визуальном методе просматривают рост микроорганизмов по штриху и сравнивают морфологию полученных колоний – они должны быть однородными. Чистая культура большинства микроорганизмов обычно морфологически однородна; допустимо лишь незначительное колебание размеров клеток. Однако этот метод не применяется для полиморфных микроорганизмов (коринеформных бактерий, микобактерий, актиномицетов и другие). Высев на ряд разнообразных по составу полноценных питательных сред (мясопептонный агар, питательный агар, сусловый агар, картофельный агар и так далее) помогает выявить присутствие в составе культуры микроорганизмов спутников, образующих на каких-либо из этих сред собственные колонии [31, 55]. 32

1.3.2 Сахаролитические свойства микроорганизмов Способность расщеплять углеводы и высокоатомные спирты до альдегидов и кислот под действиемсахаролитических ферментов характернодля многих патогенныхмикроорганизмов. Конечными продуктами их распада являются газообразные вещества – это углекислый газ и водород. Необходимо отметить, что различные виды микроорганизмовпроявляют разную ферментативную активностьпо отношению к одним и тем же сахарам. В частности, одни бактерии, ферментируя лактозу, остаются нейтральными в отношении глюкозы, другие, напротив, сбраживают глюкозу, а третьи, наиболее активные, вызывают ферментацию и глюкозы, и лактозы. Реакции для обнаружения сахаролитической активности описаны в таблице 3. Таблица 3 – Реакции обнаружения сахаролитической активности ферментов Фермент Среда для детекции Реакция Амилаза Крахмальный агар При нанесении раствора йода на (агар с 0,2% среду с 18 – 24 часовой культурой крахмала) и раствор микроорганизмов, вокруг колоний с Люголя. амилазной активностью образуется светлый неокрашенный ореол, в то время как остальная среда приобретает сине-фиолетовый цвет из-за присутствия в ней крахмала. Карбогидразы Дифференциальнодиагностические среды для энтеробактерий (Эндо, Левина, Плоскирева и др.); содержат лактозу, анилиновые красители. Лактозопозитивныеэнтеробактерии (Escherichia coli,Klebsiella oxytoca, K.pneumonia), образуют ярко окрашенные колонии, лактозонегнативныеэнтеробактерии (Salmonella, Shigella) – бледнорозовые или бесцветные колоний. Полиуглеводные При разложении глюкозы желтеет среды (Клиглера, столбик среды, при разложении Олькеницкого и др.). лактозы желтеет скошенная часть 33

Среда Клиглера имеет малиново-красный цвет и содержит: 0,1% глюкозы, 1% лактозы, соли Fe 2+, феноловый красный (индикатор рН). среды, при разложении углеводов с образованием CO2 в среде также появляются газовые пузырьки или разрыв столбика; при образовании H2S наблюдается почернение по ходу укола. Продолжение таблицы 3 Продукция ацетилметилкарбинола Жидкие или полужидкие моноуглеводные среды Гисса; содержат один из углеводов, индикатор рН. Для выявления газообразования в жидкие среды вносят поплавок. При разложении углеводов образуются кислые продукты, снижающие рН среды, в результате чего индикатор рН изменяет цвет. Газообразование на жидких средах приводит к накоплению газа в поплавке, в полужидких – появлению разрывов или газовых пузырьков в среде. Выявляют с помощью реакции ФогесПроскауэра, используют 10% КОН или 20% КОН. После добавления к культуре равного объёма 10% или 20% КОН и инкубации 4 – 24 часа при 37 0С в случае образования ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет с жёлтым оттенком; в случае образования ацетоина и 2,3бутиленгликоля окраска не изменяется. Сахаролитические свойства, то есть способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты либо кислоты и газа изучают на жидких и полужидких средах Гисса, содержащих тот или иной углевод и индикатор, среды Гисса называют также «пестрым» рядом. «Пестрый» ряд 34

Гисса содержит минимум 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При более углубленном изучении биохимических свойств выделеннойкультуры ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой, а также при необходимости и другими сахарами. Иначе говорят, различают «большой» и «малый» «пестрый ряд», или дифференциально-диагностический.Под действием кислоты, которая образуется при расщеплении углевода, индикатор изменяет окраску среды, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Бактерии, не ферментирующие конкретный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Образование газа устанавливают по наличию пузырьков в средах сагаром или по скоплению его в поплавкев жидких средах. Среды с индикатором, например, позволяют идентифицировать патогенные бактерии от кишечной палочки –E. coli. Кишечная палочка способна расщеплять лактозу, поскольку имеет фермент галактозидазу [56]. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора вследствие сдвига pH. Поэтому кишечная палочкаобразует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо– красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазы, они не расщепляют лактозу, и соответственно цвет среды не изменяется. Вследствие этого сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии [11].Говоря о потребности микроорганизмов в органических источниках углерода необходимо отметить, что наибольшая степень гетеротрофности присуща патогенным микроорганизмамиз-за приспособлености к жизни в организме человека и животных. Для установления способности бактерий ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в пробирки со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), которые всплывают после наполнения их газом. Так, при изучении сахаролитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию (изменению pH), но и глубину ферментативного процесса по образованию в питательной среде газообразных продуктов. 1.3.3 Протеолитические свойства микрорганизмов Некоторые микроорганизмы проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, которые катализируют расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада, такие как пептоны, альбумозы и 35

полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны расщепляются на полипептиды, то есть соединения двух или нескольких аминокислот, и отдельные аминокислоты (таблица 4). Таблица 4 – Реакции обнаружения протеолитической активности ферментов Фермент Среда для детекции Реакция Протеазы и 5% обезжиренное Происходит свёртывание с пептидазы молоко. образованием сгустков казеина и пептонизация с лизисом казеина, при которой молоко становится прозрачным. Обе реакции могут происходить последовательно или одновременно. Свёрнутая сыворотка. Происходит разжижение. Столбик желатина. Происходит разжижение (желатину разжижают Proteusvulgaris, Bacill usanthracis). Молочный агар в Появляются зоны просветления чашках Петри имеет вокруг колоний на фоне мутномутно-белый цвет. белой среды. Дезаминазы Среда с одной аминоаминокислот кислот индикатором рН; рН среды (7,2±0,2). Декарбоксилазы из Образуется аммиак, приводящий к и защелачиванию среды и изменению цвета индикатора. Среда с одной из При наличии декарбоксилазной основных аминокислот активности среда 36

(аргинином, лизином, подщелачивается за счёт орнитином, образования диаминов, вызывая гистидином, изменение цвета индикатора. тирозином, глутамином) и индикатором рН. Триптофаназа Мясо-пептонный бульон или среда с аминокислотой триптофаном, а также индикаторная бумажка, смоченная щавелевой кислотой и закреплённая под пробкой над питательной средой. Образуется индол, который приводит к покраснению бумажки, смоченной щавелевой кислотой. Продолжение таблицы 4 ДесульфуСреды с цистеином, разы метионином и (цистиназы) качественным реактивом на H2S – солями железа, свинца, висмута. Образуется H2S, который 2+ 2+ взаимодействует с Fe (Pb , Vi2+) с образованием сульфида железа черного цвета, что вызывает почернение среды. Уреаза Образуется аммиак, и окраска среды из красно-оранжевой переходит в малиново-лиловую за счёт сдвига рН в щелочную сторону. Среда с мочевиной и индикатором рН  феноловым красным, рН среды устанавливают (6,8 ± 0,2). У некоторых бактерий (например, холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т.д.) протеолитический фермент выявляется путем разжижения желатины, также используют лошадиную сыворотку. Также протеолитические свойства изучают по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индолC₈H₇N, сероводород Н2S, аммиак NH3 [57]. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяется при посеве уколом в питательную среду. При положительном результате наблюдается разжижение в виде воронки или послойно сверху вниз. Способность к ферментации белков и аминокислот можно оценивать по 37

изменению окраски среды, потому что образующиеся продукты – аммиак, индол и сероводород – сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение цвета индикатора. Для определения способности к образованию аммиака проводят посев в мясо-пептонный бульон, и между его поверхностью и пробкой закрепляют лакмусовую бумагу. При положительном результате бумажка обретает синий цвет. Индол образуется при расщеплении триптофана.Сероводород является конечным продуктом распада серосодержащих аминокислот: цистина, цистеина и метионина.Часто для определения способности к образованию индола и сероводорода проводят посев вмясо-пептонныйбульон, между стенкой пробирки и пробкой закрепляют фильтровальную бумагу: в первом случае пропитанную раствором щавелевой кислоты (при образовании индола бумага краснеет), во втором случае– раствором ацетата свинца (при образовании сероводородабумага чернеет). Кроме того, используют специальные среды, которые содержат индикаторы (например, среда Клиглера), или их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий. Окончательное заключение по результатам образования индола и сероводорода проводят на 7день после посева, поскольку процесс ферментативного расщепления белка и образования конечных продуктов распада происходит иногда в течение длительного времени. Протеолитическая активность одного и того же микроорганизма при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, это обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микроорганизмов рекомендуют среды определенного состава[40]. 1.3.4 Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов Изучение сахаролитических и протеолитических ферментов микроорганизмов обычно оказывается достаточным для определения вида, но возникают случаи, когданеобходимо включать в исследование другие ферменты, например, уреазу, каталазу, цитохромоксидазу, нитратредуктазу и другие. В культуре микроорганизмов могут обнаруживатьсяокислительновосстановительные ферменты, связанные по большей части с дыхательной функцией микроорганизма. Процесс окисления субстрата может происходить путем присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз либо в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидрогеназ. Для такого типа реакции свойственно то, что окисление какого-либо 38

органического вещества сопровождается восстановлением, то есть редукцией, другого вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называется донором, а то вещество, к которому он присоединяется, – акцептором. Акцептором водорода обычно является кислород воздуха, но ещеакцептором могут быть представлены многие органические соединения, которые способны легко окисляться и восстанавливаться. Для выявления ферментов дегидрогеназ и определения их активности в практике микробиологических лабораторных исследований был предложен метод, который основан на введении в питательную среду органическогоиндикатора, выполняющего роль акцептора водорода. В результате реакции присоединения водорода краситель восстанавливается и превращается в бесцветное соединение, которое называетсялейкобазой. При достаточном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет[25]. Реакции обнаружения окислительно-восстановительной способности бактериальных ферментов описаны в таблице 5. Таблица 5 – Реакции обнаружения окислительно-восстановительной способности ферментов Фермент Среда для детекции Реакция Оксидаза Фильтровальная бумага, смоченная свежеприготовленным 1% раствором тетраметилпарафенилен-диамина (реактив на оксидазу). При нанесении бакпетлей 18 – 24 часовой культуры на поверхность фильтровальной бумаги в течение 1 мин появляется пурпурнофиолетовое окрашивание; используют для дифференциацииPseudomonasspр. (оксидазопозитивные) и энтеробактерий (оксидазонегативные). Каталаза 3% раствор Н2О2; присутствие каталазы определяют у микроорганизмов, выращенных на любой питательной среде, кроме кровяных сред. При нанесении на колонию перекиси водорода, либо при внесении культуры в каплю перекиси на предметном стекле появляются пузырьки газа; используют для дифференциации Streptococcus spр. (каталазопозитивные)иStaphylococcu s spp.(каталазонегативные). 39

Дегидразы Сахарный полужидкий агар (донор водорода) с 1% метиленовым синим (акцептор водорода). Дегидразы способны восстанавливать некоторые органические красители, поэтому метиленовый синий обесцвечивается. Используют для определения бактериальной обсеменённости молока: подкрасив молоко метиленовой синькой, определяют время его обесцвечивания. Чем оно меньше, тем более обсеменено молоко. Качественное молоко долго остаётся синим. Продолжение таблицы 5 Пероксидаза Используют бензидиновый тест: на предметное стекло наносят 4 – 6 капель суточной бактериальной культуры добавляют по 1 – 3 капли 2 % раствора метилпарааминофенол сульфата и 3% раствора Н2О2. В течение 5 – 10 мин бесцветная среда приобретает розовую или вишнёво-красную окраску. Положительная реакция характерна для Staphylococcusspp.,отрицат ельная – Pseudomonasspp.,Escherichia spp. В качестве акцептора водорода используют такие индикаторы как метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индигокармин, нейтральный красный и другие С целью выявления редуцирующих свойств бактерий указанные красители добавляют к обычным питательным средам,например, мясопептонному бульону, мясо-пептонномуагару, молоку. Один и тот же вид микроорганизмов ведет себя по-разному по отношению к красителям разного состава. Это свойство микроорганизмовиспользуется в микробиологической лабораторной практике в качестве дифференциального признака. В частности, бактерии брюшного тифа редуцируют метиленовый синий, но не редуцируют лакмус и 40

не изменяют нейтральный красный в противоположность кишечной палочке, остающейся нейтральной в отношении метиленового синего, однако восстанавливающей лакмус и нейтральный красный. Некоторые виды бактерий, который принадлежат к группе аэробов, в процессе дыхания образуют перекись водородаH₂O₂, являющую ся клеточным ядом. Количество H₂O₂ в колонии не достигает высоких концентраций, так как по мере образования перекись водорода расщепляется на воду и молекулярный кислород ферментом каталаза[59]. Реакции обнаружения липолитических ферментов и ферментовтоксинов, не рассматриваемых подробно в данной работе, описаны в приложении А. 1.3.5 Система индикаторных бумажек Система индикаторных бумажек (СИБ) позволяет выявлять различные ферменты микроорганизмов. Это бумажные диски, которые пропитаныразными субстратами, например, индикатором, углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и другими веществами. Ферментация вещества приводит к изменению рН среды, соответственно и изменению цвета индикатора. Существуют наборы, содержащие до тридцати тест-бумажек. Такие тесты можно вносить в пробирки с суспензией бактерий или предварительно внести в лунки пластиковых планшетов, куда будут помещены исследуемые культуры и через несколько инкубации в термостате можно судить о разложении веществ по изменению цвета диска. В лабораторной практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceaelll и Minitek Neisseriaдля дифференциальной диагностики энтеробактерий (в него входит четырнадцать субстратов) и нейссерий (входит четыре субстрата), такие наборы позволяютучесть результаты через 4 ч инкубации при 37 оС. Например, система индикаторных дисков для идентификации вибрионов иэнтеробактерий (Россия)[58]. 1.3.6 Микро-тест-системы для биохимической идентификации культур В современное времяпомимо классических биохимических тестов для идентификации и дифференциации выделенных колониймикроорганизмов применяют микро-тест-системы, повышающие точность результатов за счет стандартизации и увеличения количества тестов (до 30), они менее трудоемки и, соответственно, сокращают время исследования.В наборы мультитестоввходят пластиковые планшеты, в лунках которых находятся 41

различные субстраты и индикаторы. Суспензию исследуемой культуры вносят в лунки и инкубируют при 37°. Тест-системы делятся на две группы в зависимости от содержания субстрата: – системы, в которых субстрат и индикатор находятся в питательной среде; – системы, где субстрат и индикатор содержатся в носителе-шаблоне, например, в бумажных дисках либо на полимерном шаблоне-носителе. Тест-системы первой группы представляют собой полистироловые пластины с микрообъемными лунками, в которых содержатся обезвоженные дифференциально-диагностические среды. Для небольших лабораторий выпускаются индивидуальные тест-системы, идентифицирующие одну культуру. В лунки вносят суспензию исследуемой культуры, учет проводят после 24 часовой инкубации. Примерами таких тест-систем являются ПБДЭ и ПБДС («Диагностические системы», Россия), семейство систем API (BioMerieux, Франция), Enterotube П (BectonDickinson, США) и другие. Для крупных лабораторий с большим количеством исследуемого материалапредлагаются коммерческие тест-системы из многорядных планшетов на 12 культур, такие тест-системы содержат до 96 лунок, например: ММТ F1 и ММТ Е2 («Аллерген», Россия), ЭНТЕРО-тест 1 и 2 (Lachema, Чехия) [14]. Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в термостатируемых устройствах, такие устройства часто входят в комплект автоматизированных систем, где учет результатов и их интерпретация происходит автоматически с помощью компьютера (Vitek, BioMerieux, Франция). Для тест-систем второй группы исследуемую культуру выращивают в жидких питательных средах, в среды помещают шаблон-носитель, который содержит субстрат и индикатор к изучаемому ферменту. Примером такой тест-системы является Micro-ID (OrganonTeknika, США). Фирмы, производящие микро-тест-системы обычно предлагают к тестам программное обеспечение для компьютерной обработки результатов. 42

2 Материалы и методы Для проведения исследования из патологического материала были выделены чистые колонии, идентификацию которых проводили с помощью посева на дифференциально-диагностические среды («пестрый» ряд) и на анализаторе VITEK 2 Compact. 2.1 Приготовление питательных сред Мясо-пептонныйагар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ) готовили из сухих коммерческих препаратов производства ООО «Биотехновация» г. Москва в соответствии с инструкцией. Приготовление мясо-пептонногоагара: 40 г препарата развести в 1 л воды дистиллированной, кипятить до полного расплавления агара, профильтровать через ватно-марлевый фильтр. Разлить среду в пробирки по 5 мл. Стерилизовать при температуре 121 °С в течение 15 минут. Среду скосить со столбиком 1 см в штативе для скашивания сред. Приготовление мясо-пептонного бульона: 29 г препарата развести в 1 л воды дистиллированной, кипятить 1 – 3 мин, профильтровать через ватно-марлевый фильтр. Разлить в пробирки по 5 мл. Стерилизовать при температуре 121 °С в течение 15 мин. Среды Гисса, фенилаланин-агар, среду Симмонса готовили из сухих коммерческих препаратов производства ФБУН ГНЦ ПМБ г. Оболенск в соответствии с инструкцией. Приготовление сред Гисса: 17,8 г препарата развести в 1 л воды дистиллированной, кипятить 3 мин до полного расплавления агара, профильтровать через ватно-марлевый фильтр, разлить по 5 мл в стерильные пробирки, стерилизовать при температуре 112 °С в течение 20 мин. Приготовление фенилаланин-агара: 20 г сухой среды развести в 1 л дистиллированной воды, кипятить 1 – 3 мин, при необходимости профильтровать через ватно-марлевый фильтр и разлить в пробирки по 5 мл, автоклавировать 20 минут при температуре 121°C, скосить без столбика. Приготоление среды Симмонса: 18 г препарата развести в 1 л очищенной воды, кипятить 1 – 3 мин, при необходимости профильтровать через ватно-марлевый фильтр, разлить в пробирки по 7 мл, автоклавировать в течение 20 мин при температуре 112°С. Расплавленную среду скосить без столбика. 43

Полужидкий агар (ПЖА) и МПБ с мочевиной готовили в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе (с Изменением N 1)[23]. Приготовление полужидкого агара: Размешать 10 г пептона, 4 г микробиологического агара и 5 г хлорида натрия в 1 л дистиллированной воды. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Разлить по 8 мл в пробирки. Стерилизоватьавтоклавированием при 121°С в течение 15 мин. Остудить пробирки в вертикальном положении. Приготовление мясо-пептонного бульона с мочевиной: В готовый МПБ на 1 л добавить 10 г мочевины и 2 мл спиртового раствора крезолового красного. Разлить по 2 – 3 мл в стерильные пробирки, стерилизовать текучим паром 10 мин. В состав питательных сред входили следующие компоненты: 1) МПА: гидролизатфермативный панкреатический, пептон ферментативный сухой, экстракт автолизированных дрожжей осветленный, натрий хлористый, агар микробиологический; 2) МПБ: гидролизатфермативный белковый, сухой, пептон ферментативный сухой, экстракт автолизированных дрожжей осветленный, натрий хлористый, натрий углекислый; 3) среда Гисса с глюкозой – определение способности утилизировать глюкозу: панкреатический гидролизат рыбной муки, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, бромтимоловый синий, агар, глюкоза; 4) среда Гисса с лактозой – определение способности утилизировать лактозу: панкреатический гидролизат рыбной муки, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, бромтимоловый синий, агар, лактоза; 5) среда Гисса с сахарозой – определение способности утилизировать сахарозу: панкреатический гидролизат рыбной муки, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, бромтимоловый синий, агар, лактоза; 6) среда Гисса с маннитом – определение способности утилизировать маннит: панкреатический гидролизат рыбной муки, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, бромтимоловый синий, агар, маннит; 7) среда Гисса с мальтозой – определение способности утилизировать мальтозу: панкреатический гидролизат рыбной муки, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, бромтимоловый синий, агар, мальтоза; 8) фенилаланин-агар – определение способности дезаминированияфенилаланина: агар микробиологический, натрий 44

хлористый, экстракт дрожжей, L-фенилаланин, натрий фосфорнокислый двузамещенный; 9) полужидкий агар – определение подвижности бактерий: пептон, мясная вода, натрий хлористый, агар микробиологический; 10) среда Симмонса – определение способности утилизировать цитраты: аммоний фосфорнокислый, калия фосфат однозамещенный, магний сернокислый 7-водный, натрий лимоннокислый трехзамещенный 5,5-водный, агар микробиологический, бромтимоловый синий; 11) мясо-пептонный бульон с мочевиной – определение способности утилизировать мочевину (уреазная активность): мясо-пептонный бульон, карбамид, крезоловый красный; 12) для обнаружения индола, который образуется при расщеплении триптофана, культуру засевали в мясо-пептонный бульон и под пробку помещали фильтровальную бумагу, пропитанную щавелевой кислотой; 13) для обнаружения сероводорода, который является конечным продуктом расщепления серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина и метионина), культуру засевали в мясо-пептонный бульон и под пробку помещали фильтровальную бумагу, пропитанную ацетатом свинца. 2.2 Получение чистой культуры Получение чистой культуры производили из патологического материала в две стадии: 1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой культуры. Накопительную культуру получали следующим образом: суспензию из патологического материала наносили на мясо-пептонныйагар, инкубировали в термостате течение 24 ч при температуре 37 оС. Чистые культуры получали путем метода истощающего штриха, то есть с помощью бактериологической петли.Для маркировки на обратной стороне чашки Петри нанесли букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Петлей с культурой зигзагом наносили штрихи на поверхности агара в верхнем секторе (1). Для этого крышку чашки сначала приподнимали, а после нанесения штриха сразу закрывали. Петлю стерилизовали в пламени и остужали о поверхность агара. Проводили петлей по поверхности среды в верхнем секторе и затем немедленно наносили ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Снова прогревали петлю в пламени и давали ей остыть. Проводили петлей по поверхности среды в секторе 2 и затем наносили ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3. Инкубировали опрокинутые вверх дном чашки для того, чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 45

1 выросло большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появились отдельные хорошо изолированные колонии. 2.3 Посев на дифференциально-диагностические среды «Пестрый» ряд включал в себя посев трех культур на перечисленные выше среды. Пробирки инкубировались в термостате течение 24 ч при температуре о 37 С. Изменение цвета питательных сред после инкубации культуры № 1 отражено на рисунке № 1. Рисунок 1 – Посев на среды культуры №1 46

Изменение цвета питательных сред после инкубации культуры № 2 отражено на рисунке № 2. Рисунок 2 – Посев на среды культуры №2 Изменение цвета питательных сред после инкубации культуры № 3 отражено на рисунке № 3. Рисунок 3 – Посев на среды культуры №3 47

2.4 Проведение испытания на микробиологическом анализаторе Работуна анализаторе VITEK 2 Compactнеобходимо проводить с чистыми культурами микроорганизмов. В качестве расходных материалов используются пластиковыеID-карты, которые содержат биохимические субстраты. ID-карты под создаваемым в камере анализаторавакуумом заполняются суспензией чистой культуры микроорганизмов, запаиваются и помещаются в инкубационную камеру, где они инкубируются и черезкаждые 15 минутсчитываются оптической системой анализатора. При сканировании карт используется колориметрический метод (анализатор содержит 2 оптических модуля и использует волны 660, 428 и 568 нм). Результаты сканирования подвергаются обработке в программном обеспечении. По окончании идентификации анализатор находит в базе данных соответствие исследуемому микроорганизму. Проведение испытания: 1. Приготовление суспензии: чистая культура с помощью бактериологической петли вносится в пластиковую пробирку с суспензиальным раствором (рисунок 4) и гомогенизируется до достижения необходимой плотности бактериальной суспензии: от 0,5до 0,63 McF (рисунок 5). Рисунок 4 – Приготовление бактериальной суспензии 48

Рисунок 5 – Определение плотности бактериальной суспензии 2. Пробирки с бактериальными суспензиями устанавливаются в кассету, напротив них в слоты устанавливаются ID-карты таким образом, чтобы относящаяся к карте пластиковая трубочка была погружена в пробирку (рисунок 6). Рисунок 6 – Установка бактериальной суспензии к ID-картам 3. Далее необходимо загрузить кассеты с картами в вакуумную камеру анализатора (рисунок 7). 49

Рисунок 7 – Загрузка образцов в вакуумную камеру анализатора 4. В вакуумной камере происходит заполнение ID-карт бактериальной суспензией, далее кассету с картами помещают в загрузочный модуль (рисунок 8). Рисунок 8 – Загрузка образцов в загрузочный модуль анализатора 50

5. После сканирования карт полученные результаты анализируются программным обеспечением (рисунок 9). Рисунок 9 – Анализ полученных результатов в программном обеспечении 51

3 Результаты и обсуждение Результаты, полученные с помощью классического дифференциального ряда, отражены в таблице 6. Положительная реакция проявлялась изменением окраски индикатора и газообразованием, как так происходила ферментация углеводов, при отрицательной реакции изменений среды не наблюдалось. Таблица 6 – Результаты, полученные с помощью классического дифференциально-диагностического ряда Тест Глюкоза Лактоза Сахароза Маннит Мальтоза Фенилаланин Подвижность Цитраты Мочевина Индол Сероводород Культура № 1 Культура № 2 Культура № 3 + + – + + – + – – + – + – – + + – + + – – + + – – + – – – – – + – П р и м е ч а н и е – знаком «+» отмечена положительная реакция, знаком «–» – отрицательная реакция. Полученные результаты свидетельствуют о том, что культура № 1 представляет собой культуру Escherichia coli, культура № 2 – Salmonella typhimurium, культура № 3 – Shigella flexneri. ОтличительнойособенностьюEscherichia coli является способность расщеплять лактозу, благодаря наличию галактозидазы (лактазы), а также образовыватьиндол при расщеплении триптофана ферментом триптофаназой. Salmonella typhimurium отличается от других культур образованием сероводорода, который образуется при расщеплении серосодержащего белка ферментом трассульфуразой. Необходимо отметить способность продуцировать фермент цитратазу. Shigella flexneri в данном ряду способна ферментировать лишь глюкозу, маннит и образовывать индол. Результаты, полученные с помощью автоматического анализатора отражены на рисунках 10 – 14. 52

В лабораторном отчете анализатора указывается время анализа, вероятность, достоверность, необходимость проведения дополнительных тестов, нетипичные результаты теста. Лабораторный отчет № 1: время анализа – 4,00 часов, микроорганизм Escherichia coli, вероятность 99 %, достоверность – отличная дискриминация,подробная биохимическая информация отражена в таблице отчета(рисунок 10). Рисунок 10 – Результат анализа культуры № 1 Лабораторный отчет № 2: время анализа – 6,00 часов, микроорганизм – Salmonellatyphimurium, вероятность – 99 %, достоверность – отличная дискриминация, рекомендация – провести серологические тесты для 53

подтверждения,подробная биохимическая информация отражена в отчете (рисунок 11). Рисунок11 – Результат анализа культуры № 2 Лабораторный отчет № 3: время анализа – 10,25 часов, микроорганизм – Shigellaflexneri, вероятность – 93 %, достоверность – низкая дискриминация, рекомендация – провести серологические тесты для подтверждения, нетипичные результаты возникли по показателям D-сорбит, 54

тирозинариламидаза, β-галактозидаза, информация отражена в отчете (рисунок 12) подробная Рисунок 12 – Отчет анализа культуры № 3 55 биохимическая

Сравнительная характеристика представлена в таблице 6. методов видовой идентификации Таблица 6 – Сравнение методов идентификации Метод Бактериологический метод Недостатки – большая длительность проведения исследований, достигающая 24 ч, – большая номенклатура препаратов, используемых при исследовании, –трудоемкость, – возможность контаминации исследуемого материала. Автоматизированный – дорогие расходные метод материалы, – идентификация возможна для микроорганизмов, имеющих клиническое значение. 56 Преимущества – быстрота и дешевизна при малых объемах исследования. – большое количество тестов в картах для идентификации, – высокий процент правильных результатов, – закрытая система реактивов обеспечивает надежность результата, – полная автоматизация процесса.

Заключение Цель идентификации микроорганизмов – определение принадлежности отдельных их популяций к тем или иным видам, родам, семействам и т.д. Процесс идентификации микроорганизмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований. В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и – в некоторых случаях – для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред. Данная работа посвящена сравнительной характеристике методов видовой идентификации микроорганизмов с применением бактериологического метода путем посева на дифферениальнодиагностические среды, а также с помощью автоматической системы идентификации микроорганизмов VitekCompact 2. Оба метода основаны на изменении цвета субстрата в результате сдвига pH благодаря метаболической (ферментативной) активности бактерий. Задачи, поставленные для достижения цели, объединяют два направления – микробиологию и биохимию. При решении поставленных задач были сделаны соответствующие выводы, которые описаны ниже. В процессе работы было выделено 3 чистые культуры микроорганизмов из патологического материала, с дальнейшим посевом на дифференциально-диагностический ряд, содержащий питательные среды с набором различных углеводов, аминокислоты фенилаланин, кислот (цитраты, мочевина), индикаторов, улавливающих разложение аминокислоты триптофана и белка. А также чистые культуры были необходимы для получения суспензии, которую вносили в тест-карты анализатора VitekCompact 2, содержащие 64 теста (субстрата). В результате идентификации были выделены 3 вида микроорганизмов – Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri и определена их ферментативная активность: E. coli ферментируют углеводы (глюкозу, мальтозу, маннит и лактозу) с выделением кислоты и газа, восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют индол. S. typhimuriumферментирует углеводы (глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, маннозу) с образованием кислоты и газа, утилизируют цитраты, при расщеплении белков образуют сероводород. 57

S. flexneriферментирует углеводы (глюкозу, маннит, сорбит, маннозу, трегалозу) до кислот без газа, продуцируют индол. Наиболее достоверный метод – исследование на микробиологическом анализаторе VITEC 2 Compact; экономичный – посев на дифференциальный ряд. Практичность определяется количеством исследуемых проб: при большом количестве более рационально использовать микробиологический анализатор; при количестве проб от 1 до 3 целесообразно применять посев на среды. Необходимо отметить, что в лабораторном отчете анализатор выдает точность идентификации микроорганизма и достоверность дискриминации. Результаты исследования дополняют и систематизируют имеющуюся информацию по субстратной специфичности микроорганизмов, а также по составу и функциональности питательных сред. Работа была выполнена на базе ГБУ «Оренбургская областная ветеринарная лаборатория» в отделе бактериологии и паразитологии. По итогам работы приняла участие в Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум 2019» и в международной научно-практической конференции НИЦ «Поволжская научная корпорация»[18, 20, 28]. 58

Списокиспользованных источников 1 Акопян, К. Изменение рН и окислительно-восстановительного потенциала среды в процессе роста молочнокислых бактерий: влияние окислителей и восстановителей / Акопян К., Согомонян Д., Трчунян А. // Биологические мембраны: журнал мембранной и клеточной биологии.– М.: РАН, 2008. – № 1. – С. 23 – 27. – ISSN: 0233-4755. 2 Артюхин, В.И. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред: Производство и применение продуктов микробиологических производств / 41 Артюхин В.И., Шепелин А.П., Киселева Н.В. – М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1990. – 52 с. 3Безбородов, А.М. Секреция ферментов у микроорганизмов / Безбородов А.М., Астапович Н.И. – М.: Наука, 1994. – 164 с. – ISBN 374-59206985-1-0. 4Безбородов, А.М. Ферменты микроорганизмов, их ингибиторы и биокаталитические процессы в биотехнологии / А.М. Безбородов // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. – Т. 31, №1. – С. 21 – 26.– ISSN0555-1099. 5 Белковые гидролизаты в качестве основы питательных сред / А.Н. Децина [и др.] – М.: ВНИИСЭНТИ, 1995. – 68 с. – ISBN: 5-67317-167-4. 6Белясова, Н.А. Микробиология / Н.А. Белясова. – Минск: БГТУ, 2007. –160 с.– ISBN: 5-02-025864-4. 7Бондарь, Т.Н. Восстановление органических гидропероксидовглутатионпероксидазой и глутатион-S-трансферазой: влияние структуры субстрата / Бондарь Т.Н., Ланкин В.З., Антоновский В.Л. // Доклады АН СССР. – 1989. – Т. 304. – № 1. – С. 217 – 220. 8Варфоломеев, С.Д. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов / С.Д. Варфоломеев, С.В. Калюжный. – М.: Высш. шк., 1990. – 296 с. – ISBN 5-06-000645-X. 9Васильев,Д.А. Методы общей бактериологии / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин,А.А. Щербаков, Л.В.Карпунина. – Ульяновск, 2003. – 69 с. 10 Влияние реагента эллмана и других тиоловых реагентов на транспорт ионов и АТР-азную активность у анаэробно выращенных клеток Escherichiacoli/ А. Поладян [и др.] // Биологические мембраны: журнал мембранной и клеточной биологии. – М.: РАН, 2008. – № 1. – С. 3 – 10. – ISSN: 0233-4755. 11Галынкин, В.А. Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов / В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, В.И. Кочеровец и др. – СПб.: Проспект науки, 2006. – 336 с. – ISBN: 5-16-002933-8. 12Галынкин, В.А. Санитарномикробиологическийконтрольвпищевойифармацевтическойпромышленности / В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, К.А. Каграманова и др. – Санкт-Петербург, 2004. – 248 с. – ISBN 978-5-88504-099-0. 59

13Гуревич, В.Л. Безопасность пищевых продуктов и продовольственного сырья: обзор европейского законодательства/ В.Л. Гуревич, Л.И. Григорьева // Новости. Стандартизацияисертификация. – 2005. – № 3. – С. 20 – 23. – ISSN 0038-9692. 14ГОСТ 10444.1-84. Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе (с Изменением N 1).– Введ. 1985-07-01. – М.: Стандартинформ, 2010. – 11 с. 15ГОСТ Р 50480-93. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Sаlmоnеllа. – Введ. 1994-01-01. – М.: ИПК Издательство стандартов, 2004. – 9 с. 16Грачева, И. М. Глюкоамилаза микроорганизмов / И. М. Грачева, М. В. Гернет // Успехи микробиологии. 1999. – № 14. – С. 81 – 105. – ISSN 14551189. 17Егоров, Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Н.С. Егоров.– М.: изд-во МГУ, 1995. – 224 с.– ISBN: 5-16002933-8. 18 Егорова, К.И. Сравнительная характеристика методов видовой идентификации микроорганизмов на основе биохимических тестов /К.И. Егорова, Е.С. Барышева, А.В. Ефремова // Материалы Международной научно-практической конференции «Научная мысль XXI века: результаты фундаментальных и прикладных исследований». – Самара: ООО НИЦ «Поволжская научная корпорация», 2018. – С. 156 – 160. – ISBN 978-56040741-9-0. 19Елинов, Н.П.Методические рекомендации по молекулярногенетическим основам микробиологии / Н.П. Елинов, Н.А. Заикина. – Л.: ЛХФИ, 1992. – 436 с. 20 Ефремова, А.В. Зональная характеристика энергетической питательности кормов сельскохозяйственных животных на территории Оренбургской области / А.В. Ефремова, Е.С. Барышева, К.И. Лычагина // Материалы XI Международной студенческой научной конференции «Студенческий научный форум – 2019». – М.: Евроазиатская научнопромышленная палата, 2019. – С. 18 – 20. 21Жарикова,Г.Г.Микробиологияпроизводственных товаров/ Г.Г.Жарикова // Санитария и гигиена. – М.: ACADEMA, 2005. – 297 с. – ISBN: 5-7695-1403-5. 22Захарова,И.Я. Литическиеферментымикроорганизмов / ЗахароваИ.Я., ПавловаИ.Н.– Киев: Наукова думка, 1985. – 215 с. 23 Лабинская, А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований/ А.С. Лабинская, Л.П. Блинкова, А.С. Ещина. – М. : Медицина, 2004. – 576 с. – ISBN: 5-87317-067-3. 24 Козлов, Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии / Ю.А. Козлов. – М: Мед-гиз, 1990. – 265 с. 60

25Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. – СПб.: СпецЛит, 2008. – 767 с. – ISBN 274-9-9266955-5-0. 26Костеневич, А.А. Бактериальные β-галактозидазы: биохимическое и генетическое разнообразие / А.А. Костеневич, Л.И. Сапунова. Минск: Труды БГУ Обзоры, 2013. – Том 8, №1.– С. 52 – 63. – ISSN: 4231-4459. 27Ленинджер,А. Основы биохимии: В 3-х томах. Том 1 / А. Ленинджер. – Москва: Мир, 1985. – 367 с. 28Лычагина, К.И. Ферментативная активность бактерий / К.И. Лычагина, А.В. Ефремова //Материалы XI Международной студенческой научной конференции «Студенческий научный форум – 2019». – Режим доступа: https://scienceforum.ru/2019/article/2018011520. 29Меджидов, М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам / М.М. Меджидов. – М.: Медицина, 2003. – 208 с. – ISBN: 5-22504763-7. 30Меньшиков, В.В. Клиническая лабораторная аналитика. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. / В.В. Меньшиков. – М.: Лабинформ-РАМЛД, 1999. – 352 с. – ISBN 678-5-87504-029-0. 31Методы контроля бактериологических питательных сред: Метод, указ. МУК 4.2.2316-08. – М: Роспотребнадзор, 2008. – С. 39 – 41. 32Мосолов, В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов. – М.: Наука,1981. – 404 с. 33 МР 02.032-08. Идентификация микроорганизмов и определение их чув- ствительности к антибиотикам с применением автоматического микробиологического анализатора Vitek 2 Compact. – Введ. 2008-06-30. – Москва, 2008. – 16 с. 34Мямин, В.Е. Биохимия и физиология микроорганизмов / В.Е. Мямин. – Минск: БГУ, 2009. – 56 с. 35 Неклюдов, А.Д. Получение белковых гидролизатов сзаданными свойствами / А.Д. Неклюдов, С.М. Навашин// Прикладная биохимия и микробиология. Москва,1995. – Т.21. – № 1. – С. З – 17.– ISSN: 0041-3771. 36Нетрусов, А.И. Микобиология / А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. – М.: Издательскийцентр «Академия», 2012. – 384 с. – ISBN 978-5-94836-236-6. 37Номенклатура ферментов. Рекомендации Международного биохимического союза по номенклатуре и классификации ферментов, а также по единицам ферментов и символам кинетики ферментативных реакций; ред.: А.Е. Браунштейн. – М.: ВИНИТИ, 1979. – 320 с. 38 Особенности идентификации микроорганизмов комплекса Burkholderiacepacia и рода Pseudomonas с помощью биохимического автоматического анализатора Vitek 2 / А.В. Незнамова [и др.] // Волгоград: Вестник волгоградского государственного медицинского университета, 2016. – № 3. – С. 109 – 112. – ISSN: 1994-9480. 39 Особенности идентификации Burkholderiamallei и Burkholderiapseudomallei с помощью микробиологического анализатора Vitek 61

2 Compact 30 / Е.В. Молчанова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций, 2016. – Т. 28. – № 3. – С. 83 – 89. – ISSN 0044-5134. 40 Першин, Г.Н. Влияние химиотерапевтических веществ на бактериальные ферменты / Г.Н. Першин. – М.: Государственное издательство медицинской литературы, 2016. – 230 c. – ISBN 974-6-9305985-2-0. 41 Поляк, М.С. Питательные среды для медицинской микробиологии / М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич. – НИЦФ, Санкт-Петербург, 2002 г. – 80 с. 42 Приказ министерства здравоохранения СССР от 22.04.85 n 535 об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений 43 Применение автоматизированных систем идентификации микроорганизмов для верификации таксономической принадлежности коллекционных штаммов патогенных бактерий / А.В. Осин [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. – Т. 14. – № 9. – С. 113 – 117. – ISSN 0044-5134. 44Прозоркина, Н.В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии / Н.В. Прозоркина. – Ростов-на-Дону: Феникс, 2002. – 416 с. – ISBN: 5-7695-1403-5. 45Прунтова, О.В. Курс лекций по общей микробиологии и основам вирусологии / О.В. Прунтова, О.Н. Сахно, М.А. Мазиров. – Владимир: Издво Владим. гос. ун-та, 2006. – 192 с. – ISBN: 5-89816-009-4. 46Семанин, А.Г. Разработка параметров идентификации / А.Г. Семанин, Д.Г. Сверкалова, А.Г. Шестаков. – Владимир: ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 2016. – С. 149 – 154. – ISSN 0044-5134. 47Стукалин, Г.С. ТермостабильнаяосахаривающаяаамилазаизштаммаBacillussubtilis. Очистка и некоторые свойства / Г. С. Стукалин, Ю. Е. Козловский, Ю. Ф. Василяускас // Биотехнология. 1998. – № 3. – С. 31 – 313. –ISSN 1355-1729. 48Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии: учебное пособие для вузов / Е.З. Теппер. В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с. 49Тимощенко, Л.В. Основы микробиологии и биотехнологии /Тимощенко Л.В., Чубик М.В. – Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2009. – 194 с. – ISBN: 5-4387-0072-2 / 5438700722. 50 Фенотипические признаки в идентификации некоторых видов рода Pseudomonas / Киприанова Е.А [и др.] // Микробиол. журн., 1976. – Т. 38. – № 4. – С. 420 – 428. – ISSN: 0021-9533. 51 Шепелин, И.А. Питательные среды: справочник бактериолога / И.А. Шепелин, А.Ю. Миронов, К.А. Шепелин. – М: Эпидбиомед-диагностика, 2014. – 151 с. – ISBN 978-5-9905485-1-0. 52 Brisse, S. ComparativeevaluationoftheBDPhoenixandVITEK 2 automatedinstrumentsforidentificationofisolatesoftheBurkholderiacepaciacomplex 62

/ BrisseS., StefaniS., VerhoefJ. et al. // J. Clin. Microbiol., 2002. – Vol. 40 (5). – Р 1743. – ISSN: 0022-3921. 53Brot, N. Biochemistry and physiological role of methioninesulfoxide residues in proteins / Brot N., Weissbach H. // Arch. Biochem. Biophys., 1993. – V. 223, № 1. – P. 271 – 281. – ISSN: 0302-766X. 54Fernandes, S. Beta-galactosidase from a cold-adapted bacterium: purification, characterization and application for lactose hydrolysis / Fernandes S. [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – Vol. 58, № 3. – P. 313–321. – ISSN: 0364-4785. 55Heaton, J. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review / Heaton J.C, Jones K.J. – Appl. Microbiol., 2008. – № 104 (3).– P. 613—26. – ISS 2972-8622. 56Hudault, S. Escherichia coli strains colonising the gastrointestinal tract protect germfree mice against Salmonella typhimurium infection / Hudault S, Guignot J, Servin AL, 2001. – № 49. P. 47 – 55. – ISSN 0044-5134. 57 Iverson, T. M. Structure of the Escherichia coli fumarate reductase respiratory complex / Iverson T. M., Luna-Chavez C., Cecchini G., Rees D. C. // Science (NewYork, N.Y.), 1999. – Vol. 284, no. 5422. – P. 1961 – 1966. – ISSN: 0041-3771. 58 Jaswal, A.S. Amino acid hydrolysate from crab processing waste / Jaswal A.S. // J.Food Sci., 1990. – V.55. –№2. – P.379 – 386. – ISSN 1055-7903. 59Johnson, D.R. TheHumanImmuneResponsetoStreptococcalExtracellularAntigens: Clinical, Diagnostic, andPotentialPathogeneticImplications / Johnson, DwightR.; Kurlan, Rogeretal. Clinical Infectious Diseases, 2010. – № 50 (4). – P. 481—490. – ISSN 1058-4838. 60Lee, SY.High cell-density culture of Escherichia coli / SY Lee. – Trends Biotechnol., 1996. – №14 (3). – P. 98 –105. – ISSN: 0167-7799. 61Lopez-Beniti, M.Metodes de extracción de proteinadepatexo (Polybinshenslowy Leach) / Lopez-Beniti M., Pastoriza L., Sampedro G. // Inf.tech.Inst.invest.pesq., 1994. – №118. –P.3 – 16. – ISSN: 0065-2911. 62Ritohie, А.Н. Preparation of fish protein hydrolysates / Ritohie А.Н., Mackie I.M. // Animal.FeedSci.Technol., 1992. – V. 7. – № 2. – P. 125 – 133. – ISSN: 0302-766X. 63Sabin, R. Spinach E. coli linked to cattle; Manure on pasture had same strain as bacteria in outbreak / R. Sabin. – San Francisco Chronicle, 2006.– P. 21. – ISS 1932-8672. 64Torres, D.P.M. Gal-oligosaccharides: production, properties, applications, and significance as prebiotics / D.P.M. Torres [et al.] // Compr. Rev. Food. Sci. Food Saf. – 2010. – Vol. 9, № 5. – P. 438–454. – ISSN: 0163-4745. 65 WHO Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by neisseriameningitidis, streptococcus pneumoniae, and haemophilusinfluenzae : WHO manual., 2011. – 323 p. 63

66Wright, H.T. Nonenzymaticdeamidation of asparagil and glutaminyl residues inproteins / Wright H.T. //Crit. Rev. Biochem. Mol.Biol.,1991. – V.26, № 1. – P. 1 – 52. – ISSN: 0021-9533. 67Yuriev, A. MethodsinMolecularBiology/A. Yuriev. – NewJersey: HumanaPress-Totowa, 2003. – 416 р. – ISSN: 1064-3745. 68Zumft, W.G. Cell biology and molecular basis of denitrification / W.G. Zumft// Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. – Vol 61, № 4. – P. 533 – 616. – ISSN 0044-5134. 64

ПриложениеА (справочное) Определение биохимических свойств микроорганизмов Таблица А.1 – Реакции для обнаружения ферментативной активности Фермент Среда для детекции Реакция Липолитические ферменты Липаза Желточный агар или Липазы гидролизуют жиры на среда с твином-80. глицерин и свободные жирные кислоты. Вокруг колоний в проходящем свете на поверхности среды видна радужная пленка (похожа на бензиновую пленку на поверхности воды). Лецитиназа Желточный агар (к 300 мл стерильного МПА, расплавленного и охлажденного до 45 – 50оС, добавляют источник лецитина  желток куриного яйца). Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид, и вокруг колоний появляются опалесцирующие зоны, или «венчики помутнения»; лецитиназа есть у Staphylococcus aureus, клостридий, фузобактерий. Ферменты-токсины Гемолизины 510% кровяной агар. -гемолизины приводят к неполному гемолизу с образованием вокруг колоний зоны неполного просветления среды, которая в течение 2 – 5 суток приобретает зеленовато-бурый оттенок. -гемолизины вызывают полный гемолиз с образованием прозрачной зоны вокруг колоний. -гемолизины не дают видимого глазом гемолиза. 65

Продолжение таблицы А1 О-стрептолизин В пробирки с двукратными разведениями гемолитических стрептококков добавляют равный объем 5% эритроцитов кролика, инкубируют при о 37 С 1 час; параллельно ставят контроль из взвеси эритроцитов в питательном бульоне. В положительных случаях происходит гемолиз (лаковая кровь), в отрицательных случаях образуется осадок из эритроцитов. Определяют титр О-стрептолизина наибольшее разведение микробной культуры при котором наблюдается гемолиз. Плазмокоагулаза Стерильная цитратная плазма крови, разлитая по 0,4 мл в пробирки. После внесения суточной агаровой культуры и инкубации посевов 25 часов при 370С происходит свёртывание плазмы и утрата ею текучести. Гиалуронидаза Побирка с гиалуроновой кислотой и уксусная кислота; при добавлении к гиалуроновой кислоте уксусной кислоты образуется сгусток муцина. Если тест-культура образует гиалуронидазу, то после 15 мин инкубации культуры бактерий при 370С в пробирке с гиалуроновой кислотой и добавления 23 капель уксусной кислоты образуется сгусток муцина. Нуклеазы МПА с ДНК, среда Через 1824 часа культивирования на опалесцирует среде после нанесения на ее (полупрозрачна). поверхность 0,1% H2SO4 из-за деполимеризации ДНК и РНК вокруг колоний образуется прозрачный ореол  «венчик просветления». 66

Продолжение таблицы А1 Фибринолизин Сгустки фибрина. Растворение сгустков фибрина. Цитотоксины Культура эпителиальных клеток или др. и токсин, выделенный путем фильтрования культуральной жидкости с использованием бактериальных фильтров. При культивировании культуры клеток с безмикробным фильтратом токсина культура клеток утрачивает типичную тканевую морфологию: округляется, ядра пикнотизируются. Летучие жирные кислоты Газо-жидкостная хроматография кислото-эфирного экстракта ЛЖК из биологического материала или культуральной жидкости, содержащей анаэробы. На хроматограмме появляются пики в зависимости от массы и полярности вещества: чем легче вещество, тем раньше появляется пик на хроматограмме, поэтому ЛЖК выходят в следующей последовательности: уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая. Изомасляная, изовалериановая, изокапроновая кислоты выходят раньше соответствующей кислоты. 67

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

6315.12

Игорь Маслеников

Проныра, озорник, Любитель книг, Ловкач, игрок, Жизнь между строк. И потому Открыт ему Незримый путь В любую суть. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Подсыпать в душу яд Всегда он рад Всего за час Прочтёт он вас. Он волен взять И поменять Строку и с ней Смысл темы всей.Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Открыт роман Читатель пьян Разлив вино - Шагнул в окно. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения. Танец злобного гения На страницах произведения Это игра без сомнения Обречённый ждёт поражения.

6315.12

Игорь Маслеников

Танец Злобного Гения КиШ

6315.12

Игорь Маслеников

А теперь я скину тексты своих любимых песен для этого:)

6315.12

Игорь Маслеников

и хорошего настроения

6315.12

Игорь Маслеников

удачи