Воздействие относительно низких доз ионизирующего излучения на лимфоциты человека

Виктория Рыбачук

Воздействие относительно низких доз ионизирующего излучения на лимфоциты человека

В данной выпускной квалификационной работе выдвинута гипотеза об эффективности совместного применения сопроводительной иммунотерапии активированными лимфоцитами in vitro на фоне лучевой терапии. Объектом исследования являются лимфоциты человека до и после активации, а также после облучения электронами в дозе от 1 до 8 Гр. Предмет исследования - воздействие ионизирующего излучения на периферическую кровь человека. Цель работы – изучить влияние ионизирующего излучения в дозах от 1 до 8 Гр на лимфоциты человека после активации in vitro. Практическая значимость результатов состоит в том, что для повышения эффективности лечения онкологических заболеваний и уменьшения риска негативного влияния ионизирующего излучения на иммунитет пациентов на фоне лучевой терапии, целесообразно проведение сопроводительной иммунотерапии активированными лимфоцитами, так как, возможно, что после проведения курса иммунотерапии у онкологических больных на фоне радиотерапии не будут нарушаться функции иммунной системы, будет отсутствовать иммуносупрессия и снижение числа лимфоцитов.

Биология

Дипломы

Вуз: Обнинский институт атомной энергетики - филиал Национального исследовательского ядерного университета "МИФИ" (ИАТЭ)

ID: 60e0bdeae4dde500019215d5

UUID: e3198e00-be64-0139-39a7-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: почти 3 года назад

Просмотры: 12

-65.76

Виктория Рыбачук

Обнинский институт атомной энергетики - филиал Национального исследовательского ядерного университета "МИФИ" (ИАТЭ)

Комментировать 0

Рецензировать 1

Скачать - 1,8 МБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ» Обнинский институт атомной энергетики – филиал федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ» (ИАТЭ НИЯУ МИФИ) Отделение биотехнологий Выпускная квалификационная работа бакалаврская работа по направлению подготовки: 06.03.01 Биология профиль: Радиобиология «Воздействие относительно низких доз ионизирующего излучения на лимфоциты человека» Выполнил: студент гр. БИО-Б17 Рыбачук В.А. (подпись, дата) Руководитель ВКР, профессор, д.м.н. Абакушина Е.В. (подпись, дата) Нормоконтроль Ляпунова Е.Р. (подпись, дата) Выпускная квалификационная работа допущена к защите Руководитель образовательной программы 06.03.01 Биология (№ протокола, дата заседания комиссии) Комарова Л.Н. (подпись, дата) Обнинск, 2021 г

СОДЕРЖАНИЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ...................................................................... 4 ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 7 1.1 Применение ионизирующего излучения в медицине ................................ 7 1.2 Иммунная система. Функции и компоненты.............................................. 7 1.3 Роль лимфоцитов в организме и их реакция на ионизирующее излучение ........................................................................................................... 9 1.4 Активация лимфоцитов ............................................................................. 11 1.5 Иммунотерапия. Эффекты воздействия на организм .............................. 12 1.6 Пути миграции активированных лимфоцитов при иммунотерапии ....... 15 1.7 Иммунотерапия при лучевой терапии ...................................................... 16 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................ 19 2.1 Объект исследования ................................................................................. 19 2.2 Растворы и среды ....................................................................................... 19 2.3 Оборудование и материалы ....................................................................... 19 2.4 Метод разделения клеточных элементов крови in vitro ........................... 20 2.5 Активация и культивирование лимфоцитов ............................................. 22 2.6 Подсчет клеток с помощью счетной камеры............................................ 23 2.7 Оценка жизнеспособности лимфоцитов ................................................... 25 2.8 Проточная цитометрия .............................................................................. 26 2.9 Облучение клеток ...................................................................................... 27 2.11 Схема проведения эксперимента .......................................................... 30 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ...................................................... 31 3.1 Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности лимфоцитов после активации in vitro. ..................................................................................... 31 3.2. Подбор условий облучения клеток относительно низкими дозами ионизирующего излучения ................................................................................. 33 3.2.1 Подбор условий облучения для не активированных лимфоцитов .... 34 2

3.2.2 Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности активированных лимфоцитов в разные сроки после облучения .................. 36 3.2.3 Взаимосвязь между чувствительностью активированных и не активированных лимфоцитов к ионизирующему излучению. ..................... 39 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................... 41 ВЫВОДЫ................................................................................................................ 43 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ ................................................... 44 3

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ АПК – антигенпрезентирующие клетки ДК – дендритные клетки ДЛТ – дистанционно лучевая терапия ДНК – дезоксирибонуклеиновой кислоты ИТ – иммунотерапия ИКК – иммунокомпетентными клетками ЛАК – лимфокин-активированные киллеры ЦИК – цитокин-индуцированные киллеры ПМК – периферические мононуклеарные клетки РМЖ – рак молочной железы ЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоциты BCR – антигенпрезентирующий рецептор В-лимфоцитов CTLA-4 – антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов FBS – фетальная телячья сыворотка Flt3 – FMS-подобная тирозинкиназа 3 IL-2; IL-3; IL-12 – интерлейкин-2, интерлейкин-3; интерлейкин-12 rhIL-15 – человеческий рекомбинантных интерлейкин-15 MHC – главный комплекс гистосовместимости NK – натуральные киллеры PBS – фосфатно-солевой буфер PI – пропидия йодид SD – стандартное отклонение TCR – антигенпрезентирующий рецептор Т-лимфоцитов Th1; Th2 – субпопуляции Т-хелперов TNF-α – фактор некроза опухоли-α 4

ВВЕДЕНИЕ В последнее время по статистическим данным наблюдается рост онкологических заболеваний. При этом нередко отсутствуют эффективные лечебные мероприятия. Эталонные подходы для лечения неоплазий в настоящее время нередко идут рука об руку с развитием нежелательных побочных эффектов и осложнений, которые провоцируют появление иммунодефицитных состояний, то есть к таким состояниям, когда иммунная система организма дает сбой в силу различных обстоятельств. За предыдущие несколько лет результаты многих исследований доказывают способность новообразований привлекать клетки иммунной системы и создавать вокруг себя иммуносупрессивный фон. Выдвинутый аспект препятствует возникновению адекватного клеточного иммунного ответа. Следовательно, необходим поиск ранее не известных, эффективных и неопасных методов терапии злокачественных заболеваний и усовершенствование уже существующих методик. Актуальность работы. Изучение влияния терапевтических разовых доз на лимфоциты периферической крови человека и возможности устранения негативного воздействия ионизирующего излучения за счет применения технологии активации лимфоцитов является актуальной научно-практической задачей. Практическая значимость работы. Для повышения эффективности лечения онкологических заболеваний и уменьшения риска негативного влияния ионизирующего излучения на иммунитет пациентов на фоне лучевой терапии, целесообразно проведение сопроводительной иммунотерапии активированными лимфоцитами, так как при облучении органа-мишени, т.е. места локализации патологического очага, помимо самой опухоли и окружающих её здоровых тканей воздействию ионизирующего излучения подвергаются кровеносные и лимфатические сосуды. Во время проведения иммунотерапии, активированные in vitro лимфоциты мигрируют во вторичные 5

лимфоидные органы – лимфоузлы, что свидетельствует об активации противоопухолевого иммунного ответа, также применение технологии активации лимфоцитов устраняет негативные воздействия радиации на организм больного. Таким образом, проведение сопроводительной иммунотерапии активированными in vitro лимфоцитами на фоне лучевой терапии может улучшить результаты лечения и привести к стабилизации болезни. Целью исследования является изучение влияния ионизирующего излучения в дозах от 1 до 8 Гр на лимфоциты человека после активации in vitro. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1) Оценить жизнеспособность и пролиферативную активность лимфоцитов после активации in vitro; 2) Подобрать условия облучения клеток относительно низкими дозами ионизирующего излучения; 3) Оценить жизнеспособность и пролиферативную активность лимфоцитов в разные сроки после облучения относительно низкими дозами ионизирующего излучения; 4) Выявить взаимосвязь влияния ионизирующего излучения на активированные и не активированные лимфоциты. 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Применение ионизирующего излучения в медицине Под медицинским облучением подразумевают облучение, которому подвергаются пациенты в целях проведения диагностических процедур для установки или подтверждения диагноза, в профилактических целях, а также при проведении лучевой терапии опухолевых и неопухолевых заболеваний [35]. Такое облучение является масштабным фактором воздействия ионизирующего излучения на человека. Медицинское облучение обладает некоторыми отличительными особенностями, например, высокой дозой облучения, а также воздействием на ослабленный организм и на радиочувствительные органы [12]. Опасность такого вида облучения заключается в высокой вероятности возникновения у пациентов радиационно-индуцированных заболеваний, в том числе злокачественных новообразований, в том числе может стать причиной генетических нарушений у потомков. Патологические процессы через иммунную систему вовлекают в ответ на радиационное воздействие различные системы и органы человека [21]. 1.2 Иммунная система. Функции и компоненты Иммунная система организма человека состоит из комплекса органов, тканей и клеток. Имеющийся комплект относят к этой системе по функциональному и анатомо-физиологическому принципу. Все компоненты иммунной систему классифицируют на центральные и периферические органы. Центральными органами принято считать красный костный мозг и тимус, а к периферическим относят неинкапсулированную Иммунокомпетентными лимфу, лимфоидную клетками ткань, (ИКК) составляющие иммунной системы. 7 лимфатическую печень, выделяют, систему, селезенку, как кровь. отдельное

Иммунокомпетентные клетки взаимодействуют друг с другом в ходе гуморального иммунного ответа (Рис. 1). Источник: [21] Рисунок 1 – Взаимодействие клеток в ходе иммунного ответа ИКК являются T- и В- лимфоциты, натуральные киллеры (NK-клетки), антигенпрезентирующие клетки (АПК), которые захватывают, процессируют и презентируют антиген T-хелперам. T-лимфоциты реализуют специфический клеточный иммунитет. При контакте с АПК T-хелперы определяют принадлежность антигенов и вырабатывают биологически активные вещества – цитокины. B-лимфоциты осуществляют специфический гуморальный иммунитет зачёт выработки антител [21]. NK-клетки по своей природе лишены антигенраспознающего рецептора T-лимфоцитов (TCR) и антигенраспознающего рецептора В-лимфоцитов (BCR). Данные клетки принимают участие во врожденном иммунитете, уничтожают трасформированне, опухолевые и инфицированные клетки [4]. 8

1.3 Роль лимфоцитов в организме и их реакция на ионизирующее излучение Почти 100 лет назад Эрлих и Лазарус установили, что лимфоциты маленькие «круглые клетки». С тех пор было накоплено много информации об их функциях и биологической роли. Лимфоциты играют ключевую роль в иммунитете человека, а аберрантная функция лимфоцитов способствует патогенезу таких состояний, как иммунодефицитные состояния, отторжение пересаженных органов, аутоиммунные заболевания и лимфоплазмоцитарные новообразования. Лимфоциты были разделены на две группы, Т и В, в зависимости от пути их дифференцировки. Оба типа возникают из общих стволовых клеток костного мозга. Во время эмбриологического развития Т (происходящие из тимуса) стволовые клетки мигрируют в вилочковую железу, где влияние окружающей среды вызывает пролиферацию и дальнейшее созревание тимоцитов. Затем эти клетки мигрируют из тимуса и созревают в определенных областях лимфатических узлов и селезенки. Субпопуляция незрелых Тлимфоцитов действует как Т-стволовые клетки в этих периферических тканях, чтобы сохранить линию Т-лимфоцитов, когда во взрослой жизни происходит инволюция тимуса. Т-лимфоциты отвечают за клеточный иммунитет против микроорганизмов. Они инициируют реакции трансплантат против хозяина, вызывая пролиферативные и цитотоксические ответы на аллоантигены. Более того, они усиливают, помогают или подавляют В-лимфоциты. B (производные бурсы) – лимфоциты названы так потому, что у кур они происходят из органа задней кишки, называемого бурса Фабрициуса. Остается выяснить, существует ли аналогичный орган у человека. После дифференциации из лимфоидных стволовых клеток костного мозга B-клетки, не имевшие ранее контакта с антигеном, мигрируют к ним, эти клетки пролиферируют в области лимфатических узлов и селезенки. Основная 9

функция В-лимфоцитов и плазматических клеток заключается в синтезе и выведение иммуноглобулинов (антител). В литературе описано, что доза ионизирующей радиации от 0,15 до 0,20 Гр подавляет функциональную активность лимфоцитов, искажая иммунный ответ. Таким образом, для лимфоцитов свойственна утрата клеточных рецепторов, которые предназначены для распознавания антигенов [37]. Наблюдается снижение пролиферативной активности. В результате воздействия ионизирующего излучения нарушается баланс Т-клеток, что приводит к развитию иммунопатологий. В связи с нарушением количественного содержания Th1 и Th2 лимфоцитов, происходит подавление специфического клеточного иммунитета, а в последующем подавляется противоопухолевый иммунитет [36]. Под воздействием ионизирующего излучения в высоких дозах нарушается механизм, ответственного за распознавание антигена. Клетки тимуса, ответственные за отбор тимоцитов, выходящих в кровоток, отличаются друг от друга разной чувствительностью к воздействию ионизирующего излучения. Эпителиальные клетки или так называемые «клетки-няньки» устойчивы к радиации в дозах до 8-10 Гр, в отличие от дендритных клеток, которые погибают при облучении в дозах 2-4 Гр. Через длительное время после облучения дендритные жизнеспособными, что и эпителиальные связано с клетки становятся утратой менее относительной радиочувствительности их предшественников в дозах от 2,5 до 3,7 Гр. В результате чего количество дифференцированных Т-лимфоцитов снижается, следовательно, повышается риск развития аутоиммунных и опухолевых процессов [6; 36]. Таким образом, из всего вышеперечисленного можно сделать вывод о том, что воздействие ионизирующего излучения значительно влияет на иммунную систему, вызывая большой спектр изменений [17]. 10

1.4 Активация лимфоцитов В терапии злокачественных новообразований в последние годы активно развиваются методы клеточной иммунотерапии, которые направлены на усиление противоопухолевой защиты организма, а также на активацию эффекторов врожденного иммунитета. Один из подходов к иммунотерапии включает в себя использование собственных клеток иммунной системы человека, распознающие и атакующие злокачественные клетки неоплазий. Применение противоопухолевой адоптивной (от англ. adopt – принимать, усыновлять) иммунотерапии на основе активированных in vitro лимфоцитов становиться наиболее актуальным в лечении онкологических заболеваний. Проведенная ранее работа показала, что после активации лимфоциты сохраняют морфологию больших гранулярных лимфоцитов на протяжении всего периода культивирования [2]. На третьи сутки культивирования часть лимфоцитов адгезируют к пластику флакона, увеличиваются в размерах, изменяют форму и начинают активно делиться и в процессе пролиферации формируют группы (Рис. 2). Рисунок 2 – Морфология лимфоцитов на 3 день культивирования. Без окраски. Ув.: х400. Примечание: НЛ – не активированный лимфоцит. 11

В некоторых случаях при длительном культивировании клетки теряют способность спонтанно склеиваться, что свидетельствует о завершении процесса активации (Рис. 3). Обычно данное явление фиксируется на седьмые сутки культивирования. Рисунок 3 – Морфология лимфоцитов на 10 день культивирования. Без окраски. Ув.: х400. Примечание: НЛ – не активированный лимфоцит; АЛ – активированный лимфоцит. Добавление интерлейкина-2 (IL-2) в культуральную среду повышает пролиферативную и функциональную противоопухолевую активность лимфоцитов, влияющих на выработку цитокинов и увеличение маркеров активации лимфоцитов [2]. 1.5 Иммунотерапия. Эффекты воздействия на организм Рак занимает второе место по значимости причины смерти в промышленно развитом мире. Большинство онкологических заболеваний лечат комбинацией хирургического вмешательства, лучевой терапии и/или химиотерапии. В то время как первичную опухоль в большинстве случаев можно эффективно лечить с помощью комбинации этих стандартных методов 12

лечения, предотвращение метастатического распространения болезни через диссеминированные опухолевые клетки часто неэффективно. Таким образом, ликвидация диссеминированных опухолевых клеток, присутствующих в кровотоке, и микрометастазов в отдаленных органах представляет собой еще один многообещающий подход в иммунотерапии рака. Иммунотерапия (ИТ) является методом лечения опухолевых заболеваний, основанным на активизации собственной иммунной системы человека. За последние несколько лет ИТ рака добилась значительных успехов благодаря лучшему пониманию основополагающих принципов биологии и иммунологии опухолей. Иммунотерапия объединяет в себе различные способы и методы воздействия на систему иммунитета с целью подавления патологического процесса в организме. Основные стратегии ИТ новообразований направлены на использование терапевтического потенциала опухолеспецифических антител и эффекторных механизмов противоопухолевого клеточного иммунитета иммунитета. осуществляется Активация цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) и NK-клетками. Попытки использовать иммунологические манипуляции для борьбы с ростом опухолью можно логически разделить на пассивные и активные категории, а также на адоптивную ИТ. Пассивная ИТ относится к подходам, при которых иммунологические реагенты, такие как сыворотка, клетки или клеточные продукты, которые, как считается, обладают противоопухолевой активностью, вводятся несущему опухоль хозяину [13]. Активная ИТ относится к ситуациям, в которых хозяин стимулируется для выработки иммунного ответа, который прямо или косвенно вызывает гибель опухолевых клеток. Выделяют два класса активной ИТ – это специфическая и иммунотерапия определяется направленных неспецифическая против как антигенов, ИТ. Специфическая стимуляция иммунных ассоциированных 13 с активная реакций, опухолью, а

неспецифическая активная иммунотерапия – это общая стимуляция иммунных реакций хозяина «адъювантами» иммунитета. В отдельных случаях вакцинотерапия не дает желаемых результатов, что может свидетельствовать о неосуществимости в достаточном количестве индуцировать эффекторные клетки, сопряженных к опухолевому антигену [38]. Для решения этой проблемы была разработана адоптивная клеточная иммунотерапия (АИТ) активированными ex vivo Т-лимфоцитами, специфически распознающие опухолевые процессы в организме. Данный метод лечения высокоэффективен при меланоме, когда иммунные клетки культивируют ex vivo и наращивают количество активированных эффекторных клеток [27; 39]. Адоптивная Т-клеточная терапия направлена на терапевтическую передачу пациенту определенного Т-клеточного иммунитета для активации противоопухолевого иммунного ответа за счет внесения дендритных клеток (ДК), ЦТЛ, ЛАК, цитокин-индуцированных киллеров (ЦИК), NK-клеток [28; 33]. Натуральные представляют или собой характеризующуюся естественные киллерные узкоспециализированную сильной клетки лимфоидную цитотоксической (NK-клеток) популяцию, активностью против опухолевых или инфицированных вирусом клеток. Их функция точно регулируется рядом ингибирующих или активирующих рецепторов. Ингибирующие рецепторы, специфичные для молекул класса I главного комплекса гистосовместимости (MHC), позволяют NK-клеткам различать нормальные клетки и клетки, утратившие экспрессию MHC класса I (например, опухолевые клетки) [4]. В связи с данным аспектом NK-клетки играю важную роль в АИТ. Разработка методов иммуннотерапии злокачественных новообразований на основе применения NK-клеток является перспективным направлением [4]. Существующие данные говорят, что увеличение содержания натуральных 14

киллеров, инфильтрирующих различные типы опухолей, способствует задержке развития неоплазий [25; 30]. 1.6 Пути миграции активированных лимфоцитов при иммунотерапии Иммунная система нашего организма может считаться уникальной, поскольку составляющие ее клетки не ограничены одним органом, а находятся в непрерывной циркуляции по всему телу. Только лимфоциты, являющиеся подвижными клетками, среди всех белых кровяных телец не только покидают кровь и попадают в ткани, но и постоянно рециркулируют обратно в кровь через лимфатические сосуды in vivo. [29]. Эта рециркуляция обеспечивает поддержание иммунологического надзора и является средством распространения иммунологической памяти по всему телу. На данный момент иммуннотерапия на базе NK-клеток и Т-лимфоцитов, является перспективным направлением в связи с тем, что терапевтический противоопухолевый потенциал этих клеток усиливается за счет процесса активации лимфоцитов комбинацией цитокинов (IL-2 и rhIL-15) in vitro. Тем не менее при внутрикожной инъекции активированных лимфоцитов поднимаются вопросы о том куда, как мигрируют клетки, а также какое количество клеток надлежит вводить больному для полной эффективности терапии. В работе [15] было установлено, что после инъекции меченых активированных лимфоцитов клетки оказываются как минимум в двух локализациях, непосредственно в самом месте введения клеточной суспензии и в лимфатических узлах различного местонахождения. При анализе результатов исследования [15] была отмечена общая закономерность, которая гласит о том, что меченые активированные лимфоидные инъекции клетки из мест внутрикожной мигрируют в лимфатические узлы, часть из которых расположена рядом с областью первичной опухоли. Этот феномен позволяет говорить о том, что достигнута 15

основная цель адоптивной клеточной иммунотерапии, т.е. о достижении активации специфического противоопухолевого иммунного ответа. 1.7 Иммунотерапия при лучевой терапии В последнее время активно изучается действие лучевой терапии на иммунную систему. В основе такого взаимодействия лежит способность ионизирующего излучения уничтожать злокачественные клетки, обнаруживать опухолевые антигены для функциональных клеток, а также активировать противоопухолевый иммунитет. Активация иммунного ответа на неоплазию ведет к уменьшению опухолевой массы. Данный эффект наблюдается, как в зоне облучения, так и в отдалении от нее. Этот феномен получил название «абскопального эффекта» [10]. Совместное применение лучевой и иммунной терапии позволит добиться эффективного регрессионного воздействия на опухоль. В перспективе такая методика может превратить радиационную терапию в метод системного лечения онкологических заболеваний. Абскопальный эффект лучевой терапии представляет собой нецелевой эффект излучения, предполагающий передачу сигналов излучения от облученных к необлученным клеткам. Несколько иная интерпретация этого термина предполагает регресс удаленных участков опухоли после локализованного облучения [11; 20]. Поскольку радиационно-индуцированная гибель клеток является иммунологически активным процессом, многие исследователи пытались усилить эффекты радиации, иммунотерапевтическими комбинируя стратегиями. ее Например, с различными доклинические исследования, сочетающие использование дендритных клеток с лучевой терапией, показали увеличение опухолеспецифических клеток и улучшение противоопухолевых ответов по сравнению с облучением [34; 40]. 16

Другие доклинические исследования показали, улучшенный контроль опухоли и выживаемости за счет комбинации излучения с иммуномодуляторами, такими как антитела анти CTLA-4 [26], переноса генов IL-2 [31], IL-12 [33; 40], IL-3 [23], лиганд Flt3 [26] и TNF-α [41]. Важной клинической проблемой радиотерапии рака является безопасное увеличение дозы облучения для эффективного уничтожения злокачественных клеток. Однако облучение можно рассматривать в качестве таргетной терапии для улучшения опухолеспецифических иммунных ответов. Сублетальные дозы радиации вызывают значительные изменения в экспрессии белков клеточной поверхности. Молекулы, включая главный комплекс гистосовместимости (MHC) [16], делают опухолевые клетки более восприимчивыми к иммунному распознаванию и усиливают противоопухолевый иммунитет. Лучевая терапия повышает экспрессию MHC. Механизмы, вовлеченные в этот процесс, включают деградацию белков, поврежденных радиацией, повышенное производство пептидов, улучшенную презентацию антигена и распознавание ЦТЛ облученных клеток [38]. Позднее в исследованиях изучалось использование более высоких доз радиации для выявления изменений в иммунном ответе. Мыши с перевитой экспериментальной моделью карциномы легких Льюис подверглись фракционированному облучению, получив суммарно 60 Гр за 3 фракции [24]. После облучения наблюдалось значительное снижение инфильтрирующих опухоль клеток, однако к 7 дню фракция клеток в неоплазии имела активированный фенотип. В другом исследовании [32] для лечения меланомы с помощью дозы в 20 Гр использовали мышиную модель in vivo. Было обнаружено, что значительная регрессию опухоли присутствует только у иммунокомпетентных мышей. Описанные выше работы были сосредоточены на изменениях в иммунной системе после дистанционной лучевой терапии (ДЛТ). Другие доклинические исследования продемонстрировали, что доставка излучения в различных 17

формах может модулировать фенотип опухоли и усиливать опосредованное уничтожение Т-клетками. В одном исследовании линию опухолевых клеток человека, подвергали воздействию 153 Sm. Происходила активация молекул, участвующих в инициации противоопухолевых иммунных ответов [24]. Эти изменения впоследствии сделали опухолевые клетки более восприимчивыми к ЦТЛ. Выше упомянутые исследования демонстрируют способность лучевой терапии и иммунотерапии усиливать опухолеспецифический иммунный ответ и иммуноопосредованное уничтожение неоплазий, а также обосновывают их совместное использование в клинике. 18

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объект исследования Объектом исследования являются лимфоциты человека до и после активации в условиях in vitro, а также после облучения в дозах от 1 до 8 Гр. Лимфоциты выделяли из периферической крови доноров, которые письменно подтвердили свое желание участвовать в эксперименте. После чего клетки облучали в разных дозах, либо первоначально культивировали с добавлением цитокинов для получения активированных лимфоцитов и после проводили облучение. Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии, расположенной на территории медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. 2.2 Растворы и среды 1. Хлорид натрия 0,9%; 2. Histopague-1077 (SigmaAldrich, Великобритания) ; 3. Фосфатно-солевый буфер (PBS) (Gibco by life technologies, Великобритания); 4. Полная питательная среда RPMI-1640 c глутамином (GlutaMAX-1); 5. Фетальная телячья сыворотка (FBS) (Gibco by life technologies, Великобритания); 6. IL-2 / rhIL-15 (ронколейкин, Биотех, Россия и SciStore Lab., Россия). 2.3 Оборудование и материалы 1. Ламинарный бокс (safe FAST Elite 212 S, Ferrara, Italy); 19

2. Микроскоп (ECLIPSE Е100, Nikon, Japan); 3. СО2-инкубатор (Galaxy, Eppendorf, USA); 4. Проточный цитофлуориметр BD FACSCanto™ II (Amersham Biosciences Corp, США); 5. Ускоритель Philips SL-20; 6. Центрифуги (Eppendorf, USA, Биосан, Латвия); 7. Спирт 70%; 8. Марлевые салфетки; 9. Одноразовые медицинские перчатки; 10. Полуавтоматические дозаторы объемом 2-20 мкл и 100-1000 мкл (Thermo Scientific, USA); 11. Пипетки Пастера; 12. Пробирки объемом 15 и 50 мл (Costar, USA); 13. Чашки Петри (Thermo Scientific, USA); 14. Стерильные пластиковые флаконы. 2.4 Метод разделения клеточных элементов крови in vitro Лимфоциты выделяли по стандартной методике из гепаринизированной венозной крови на градиенте плотности Histopague-1077 (SigmaAldrich, Великобритания) [1]. Метод разделения клеточных элементов крови в градиенте плотности основан на разности центрифугировании плотностей. периферические В градиентном мононуклеарные растворе клетки при (ПМК) передвигаются в объеме пробирке до того момента, когда их плавучая плотность не станет равной плотности среды. Для получения интерфазного кольца ПМК человека можно использовать Histopague-1077 (Sigma Aldrich, Великобритания) с градиентом плотности, равным 1,077 г/см3. В процессе седиментации периферическое кольцо будет располагаться над градиентом, а эритроциты и гранулоциты из-за высокой 20

плотности будут опускаться на дно пробирки проходя через градиентный раствор. Протокол выделения клеток: 1) Гепаринизированную венозную кровь сливают из четырех вакуумных пробирок для забора крови в одну центрифужную пробирку объемом 50 мл и разбавляют в 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS) (Gibco by lifete chnologies, Великобритания); 2) На раствор фиколла (Hystopague-1077) плотностью 1,077 г/см3 наслаивают гепаринизированную разведенную венозную кровь до 12 мл; 3) Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин; 4) В результате центрифугирования разведенная венозная кровь разделяется на 4 отдельные фракции (Рис. 4): Рисунок 4 – Схема разделения форменных элементов крови на градиенте плотности фиколла. Обозначения: А – содержимое пробирки до центрифугирования: 1 – Раствор фиколла; 2 – разведенная венозная кровь. В – содержимое после центрифугирования: 1 – Раствор фиколла; 3 – эритроциты и гранулоциты; 4 – интерфазное кольцо ПМК; 5 – плазма крови с тромбоцитами. 21

5) Из центрифужных пробирок убирают плазму; 6) Интерфазное кольцо ПМК собирают пипеткой по всей площади сечения пробирку; 7) Двукратно отмывают центрифугированием в 10-кратном объеме PBS при 1500 об/мин. 2.5 Активация и культивирование лимфоцитов Активацию и культивирование ПМК проводим в полной питательной среде RPMI-1640 c L-глутамином, с добавлением гентамицина 10 мг/мл, пирувата натрия, IL-2, рекомбинантного человеческого интерлейкина-15 (rhIL15) и 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS). Приготовление питательной среды для культивирования: 1) К 250 мл среды RPMI-1640 (Рис. 5) добавляем 25 мл FBS; Источник: paneco-ltd.ru Рисунок 5 – Питательная среда RPMI-1640 c L-глутамином 2) К раствору добавляем необходимые компоненты – активаторы, которые перечислены выше. 22

Протокол культивирования ПМК: 1) Выделенные ПМК подсчитываем в камере Горяева; 2) Ресуспендируем в концентрации 1-2×106кл/мл в питательной среде RPMI- 1640 c L-глутамином; 3) Помещаем в пластиковые флаконы с вентилируемой крышкой в СО2-инкубатор при 37°C (Рис. 6); Рисунок 6 – Пластиковые флаконы с вентилируемой крышкой, содержащие ПМК, в СО 2инкубаторе 4) Для поддержания жизнеспособности активированных цитотоксических лимфоцитов на протяжении 10-14 дней через каждые 48-72 часа обновляем половину объема питательной среды RPMI-1640 c Lглутамином; 5) На 3, 6, 10 и 14 день культивирования оцениваем жизнеспособность клеток, а также пролиферативную и цитотоксическую активность. 2.6 Подсчет клеток с помощью счетной камеры Подсчет клеток проводили с помощью камеры Горяева на микроскопе ECLIPSE Е100 Nikon, Japan. Камера Горяева состоит из сетки, сетка в свою очередь включает в себя 225 больших квадратов. Эти квадраты состоят из 25 23

квадратов, дробленные на 16 малых (Рис. 7). Подсчитывали лимфоидные клетки в 20 больших квадратах камеры Горяева по диагонали (Рис. 8). Рисунок 7 – Большой (1) и малый (2) квадраты сетки счётной камеры Горяева Рисунок 8 – Камера Горяева, в которой производился подсчет клеток. Ув.: х400 В квадрате считаются только те клетки, которые лежат внутри или лимфоциты, соприкасающиеся с левой верхней границей. Клетки, лежащие на правой нижней границы, не подсчитываю. 24

Количество клеток (1 млн/мл среды RPMI-1640) определяли по формуле (1): 𝑁= 𝑎 80∗𝑏 , (1) где 𝑎 – количество клеток в пяти больших квадратах, 𝑏 – разведение. 2.7 Оценка жизнеспособности лимфоцитов Для определения жизнеспособности культивируемых лимфоцитов использовали 0,4% краситель трипановый синий (Bio-Rad, Великобритания). Выбор данного красителя обоснован тем, что он не способен проникнуть в клетку через неповрежденную клеточную мембрану, следовательно, живые клетки им не окрашиваются. Краситель смешиваем в равных объемах с клеточной суспензией в 96луночном планшете. Для этого в одной лунке планшета разводим 10 мкл клеточной суспензии и 10 мкл трипанового синего в концентрации 0,4%. Переносим содержимое лунки в камеру Горяева. Выполняем подсчет окрашенных в синий цвет лимфоцитов (погибшие) и неокрашенных (живые) в камера Горяева. Долю жизнеспособных клеток (N) определяем по формуле (2): 𝑤 𝑁 = ( − 1) ∗ 100% + 100, 𝑎 где 𝑤 – количество неокрашенных клеток в пяти больших квадратах, 𝑎 – общее количество клеток. 25 (2)

2.8 Проточная цитометрия Основная идея метода проточной цитометрия заключается в индивидуальном анализе каждой клетки в потоке, проходящий с большой скоростью через прибор. На проточном цитофлуориметре BD FACSCanto™ II (Amersham Biosciences Corp, США) проводили оценку количества живых, апоптотических и некротических клеток метод проточной цитометрии, основанный на двойном флуоресцентном окрашивании клеток Аннексином V-AF488 и пропидия иодидом (PI) (Рис. 9). Рисунок 9 – Анализ выживаемости лимфоцитов методом проточной цитометрии по флуоресценции Аннексина V-AF488 и PI Оценка доли апоптотических клеток основана на специфическом связывании Аннексина V-AF488 с фосфатидилсерином, в связи с тем, что на ранних стадиях запрограммированной клеточной смерти молекулы фосфатидилсерина передвигаются на внешнюю клеточную мембрану, что делает их доступными для связывания с Аннексином V-AF488 (Рис. 10). 26

Рисунок 10 – Схема окрашивания клеток Аннексином V-AF488 и PI PI проникает в клетки с повреждённой мембраной. Некротические клетки окрашиваются обоим красителями. 2.9 Облучение клеток Лимфоциты облучали на 3 день культивирования. Для облучения клетки, вместе с питательной средой, в концентрации 1-2 млн/мл, перенесли в чашки Петри диаметром 35 мм. Первую чашку не облучали, а использовали в качестве контроля. Другие четыре чашки с лимфоцитами облучали электронами в дозе 1 Гр, 2 Гр, 4 Гр и 8 Гр (Рис. 11). Рисунок 11 – Одноразовые чашки Петри с лимфоцитами для облучения Облучение клеток проводили на линейном ускорителе электронов Philips SL-20 в пучке электронов энергией 6 МэВ с применением полеобразующего аппликатора 10*10 см., мощность дозы в изоцентре – 4,2 Гр/мин (Рис.12). 27

Расчёт мониторных единиц для ускорителя проводили в планирующей системе ROCS (Рис. 13). Рисунок 12 – Установка Philips SL-20 Рисунок 13 – Расчёт дозного распределения Во время облучения одноразовые чашки Петри с клетками переносились на специальный столик, состоящий из плитки-фиксатора, в центре которой было создано центральное углубление (Рис. 14). 28

Рисунок 14 – Установка Philips SL-20, столик с плиткой-фиксатором Поместив чашку на столик, проводили облучение лимфоцитов в дозе 1 Гр в течение 25 секунд. После чашку меняли и облучали в большей дозе, а именно 2 Гр в течение 50 секунд, 4 Гр в течении 100 секунд, 8 Гр в течении 200 секунд. После облучения клетки отмывали в PBS центрифугированием и добавляли новую питательную среду к клеткам в концентрации 1–2 млн/мл. Облученные лимфоциты помещали в инкубатор при температуре 37 oС. Через сутки, на 3, и на 7 день подсчитывали количество клеток и анализировали их жизнеспособность методом окрашивания лимфоцитов трипановым синим или методом проточной цитофлуометрии. 2.10 Статистический анализ данных Достоверность полученных экспериментальных данных определяли при помощи программы Microsoft Excel 2019. Данные представлены, как среднее по каждой группе ± стандартное отклонение (SD). Обработку результатов проводили методами вариационной статистики с соответствующими расчетами среднего арифметического и стандартной ошибки среднего. Различия считали значимыми при P <0,05. 29

2.11 Схема проведения эксперимента Забор крови Облучение в дозе 1, 2, 4 и 8 Гр Выделение ПМК Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности лимфоцитов Подготовка клеток к облучению Генерация лимфоцитов ex vivo 30

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1 Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности лимфоцитов после активации in vitro. На основе исследования [3] был усовершенствована методика получения активированных лимфоцитов периферической крови человека. Для активации лимфоцитов в культуральную среду добавляли комбинацию цитокинов IL-2 и rhIL-15. Из получившихся результатов было установлено, что rhIL-15 в большей степени влияет на пролиферативный потенциал лимфоцитов при их культивировании в среде с добавлением цитокинов IL-2 и rhIL-15. В исследовании было показано, что лимфоциты периферической крови человека высокоэффективно уничтожают клеточные мишени, например, трансформированные видоизменением клетки. морфологии Это явление уместно гармонирует активированных лимфоцитов, а также с с повышением пролиферативной активности клеток [8]. При оценке морфологии клеток в среде было обращено внимание на то, что спустя 24-48 ч культивирования с IL-2 и rhIL-15 лимфоциты реконструируют свою конфигурацию и увеличиваются в размерах на протяжении всего периода культивирования (Рис. 15). Через 48-72 ч часть лимфоидных клеток прилипают ко дну культурального флакона и адгезируются, т.е. образуют скопления в рамках роста. Жизнеспособность лимфоцитов после выделения из периферической гепаринизированной крови человека составляла 100%. На третьи сутки после активации лимфоцитов in vitro количество жизнеспособных клеток сохранялась до 98%. 31

а б Рисунок 15 – Морфология лимфоцитов через 5 дней (а) и 10 дней (б) культивирования в среде с IL-2 и rhIL-15. Без окраски. Ув.: х400 Пролиферативная активность лимфоцитов на третьи сутки культивирования в среде с добавлением в среду rhIL-15 достоверно выше, чем при добавлении IL-2 (Рис. 16). На 3 день после активации пролиферативная активность увеличивалась в среднем на 20%. К 14 дню выращивания в среде, где добавлен rhIL-15, количество клеток увеличилось в два раза, т.е. произошло удвоение популяции. Источник: [3]. Рисунок 16 – Влияние IL-2 и rhIL-15 на пролиферацию лимфоцитов 32

Было показано, что процент жизнеспособных клеток в среде с добавление цитокинов IL-2 и rhIL-15 во всех исследуемых образцах составил 93-98%. На 10 сутки выживаемость лимфоцитов достигала 97%. На 14 день была не менее 95%. Выявлено, что показатель жизнеспособности лимфоцитов в среде с одним IL-2 был снижен. Из этого следует, что количество живых клеток на 3 сутки в среднем составляла 98±1,5%, на 7 день понижалась до показателя 93±2%, на 10 и 14 сутки планомерно снижалась [3]. Таким образом, добавление комбинации цитокинов в среду для культивирования клеток позволяет получить большое количество активированных лимфоцитов с высокой жизнеспособностью, цитотоксической и функциональной активностью. 3.2. Подбор условий облучения клеток относительно низкими дозами ионизирующего излучения Исследование включало в себя два эксперимента. В первом эксперименте оценивалась реакция не активированных лимфоцитов периферической крови человека на действие ионизирующего излучения относительно низкими дозами. Во втором наблюдении оценивали жизнеспособность и пролиферативную активность активированных лимфоцитов после воздействия ионизирующей радиации в разный временной промежуток. Каждый эксперимент повторяли три раза. Облученные и необлученные лимфоциты культивировали в концентрации 1-2х106 кл/мл в среде на основе RPMI-1640 в условиях CO2инкубатора при 37°С в течение 7-ми дней. После инкубации подсчитывали количество клеток и анализировали их жизнеспособность методом окрашивания лимфоцитов трипановым синим на первые, третьи и седьмые сутки после воздействия ионизирующего излучения. Подсчет клеток проводили в камере Горяева на микроскопе ECLIPSE T100 Nikon, Japan. 33

В результате проведенных исследований установлено, что количество активированных и не активированных лимфоцитов после воздействия ионизирующего излучения снижается по сравнению с контрольной группой. 3.2.1 Подбор условий облучения для не активированных лимфоцитов На графике (Рис. 17) представлены результаты облучения не активированных лимфоцитов при воздействии ионизирующего излучения в диапазоне доз от 1 до 8 Гр. Определение жизнеспособности клеток проводили с помощью окрашивания лимфоцитов трипановым синим в камере Горяева. 25 * Жизнеспособность, % 20 * 15 10 * * * 5 0 Контроль 1 Гр 2 Гр 4 Гр 8 Гр Доза ионизирующего излучения, Гр Рисунок 17 – Выживаемость лимфоцитов в контроле и после действия ионизирующего излучения в разных дозах. * – значимые различия между группами по отношению к контролю (р <0,05). Из результатов видно, что в контрольной группе жизнеспособность клеток составила 20%. Полученный результат можно объяснить тем, что в 34

среде для культивирования лимфоцитов отсутствовала комбинация цитокинов (IL-2 и rhIL-15), которая повышает устойчивость клеток к действию ионизирующей радиации, увеличению жизнеспособности и дифференцировке клеток [9]. После облучения не активированных лимфоцитов дозой 1 Гр их жизнеспособность через 24 часа снижалась до 15%. При воздействии дозой в 2 Гр отмечается достоверное снижение количества жизнеспособных клеток, доля живых клеток уменьшается еще на 7%. При облучении лимфоцитов дозой 4 и 8 Гр резких скачков выживаемости клеток не наблюдается и при 8 Гр количество жизнеспособных клеток планомерно снижается. Полученные результаты говорят о том, что не активированные лимфоциты менее устойчивы к воздействию ионизирующего излучения и в процессе облучения количество жизнеспособных клеток уменьшается по сравнению с контролем. По экспериментальным данным некоторых исследователей [7] было показано, что не активированные лимфоциты крови больных раком молочной железы (РМЖ) после облучения in vitro характеризуются повышенным повреждением дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), а также повышенным количеством разрывов ДНК. Данное явление свидетельствует о нарушениях в работе ряда систем, ответственных за защиту клеток от повреждений ДНК. Кроме того, в облученных лимфоцитах при РМЖ отмечается большим количеством повреждений ДНК сразу после облучения и высокой частой хромосомных аберраций [36]. Результаты исследований [7; 8] говорят о том, что в не активированных лимфоцитах пациентов с диагнозом РМЖ наблюдается сниженная эффективность репарационных систем ДНК, фиксированных через 4 часа после облучения, что подтверждает гипотезу об уменьшении числа жизнеспособных лимфоцитов после воздействия радиации. 35

3.2.2 Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности активированных лимфоцитов в разные сроки после облучения Во второй серии экспериментов облучали активированные лимфоциты в дозах от 1 до 8 Гр на 3-й день культивирования на установке Philips SL-20 с энергией электронного пучка 6 МэВ. После облучения клетки отмывали в фосфатно-солевым буфером (PBS) центрифугированием. После осаждения и отмывки клеток добавляли новую среду на основе полной питательной среды RPMI-1640 с глутамином. Из полученных результатов наблюдается равномерное снижение количества жизнеспособных активированных лимфоцитов по сравнению с контролем (Рис. 18). 100 95 Жизнеспособность, % 90 85 Контроль 80 1 Гр 75 2 Гр 70 4 Гр 65 8 Гр 60 55 50 45 0 1 2 3 4 5 6 7 Дни наблюдения Рисунок 18 – График временной зависимости выживаемости (%) от дозы облучения (Гр). Из графика средней выживаемости лимфоцитов (Рис. 19) видно, что на 1, 3 и 7-й день после облучения выживаемость активированных лимфоцитов отличается от контрольной группы. Количество жизнеспособных клеток в 36

дозах 1, 2, 4 и 8 Гр снижается и на 0, 1, 3 и 7 день составило 89±3%, 88±3%, 75±6%, 71±3%, соответственно. Выживаемость клеток после воздействия ионизирующего излучения в дозе 1 Гр на 1, 3 и 7 день различается. После облучения количество живых активированных лимфоцитов через 24 часа составило 85±4%, на третьи и на седьмые сутки процент жизнеспособных клеток снижался и составил 76±4%, 57±3%, соответственно. При их облучении дозой 2 Гр жизнеспособность на первые сутки составила 84±7%. На третий и на седьмой день количество живых клеток уменьшалось. При воздействии ионизирующего излучения в дозе 4 Гр процент жизнеспособных клеток снижалась до 76±3%, а при действии радиации в дозе равной 8 Гр процент выживаемости уменьшался до 73±6%. На третьи и седьмые сутки количество живых клеток планомерно снижалось (Рис. 19). 110 105 100 Жизнеспособность, % 95 90 Контроль 85 1 Гр 80 2 Гр 75 4 Гр 70 8 Гр 65 60 * 55 50 45 40 0 1 3 7 Дни наблюдения Рисунок 19 – Средняя выживаемость лимфоцитов в контроле и после действия ионизирующего излучения в разных дозах. * – значимые различия между группами по отношению к контролю (р < 0,05) 37

В исследованиях Сколожабского А. А. [18; 19] было установлено, что у лабораторных мышей, подвергшихся тотальному облучению в дозах 5,8-6 Гр, с шестых до десятых суток после воздействия радиации отмечалось более стойкое падение числа нейтрофилов, Т-лимфоцитов. Эти данные совпадают с работами других авторов, подтверждающих присутствие прогрессирующего иммунодефицитного состояния после лучевого повреждения. На третий и на седьмой день после воздействия излучения пролиферативная активность облученных активированных лимфоцитов в дозах 1, 2, 4 и 8 Гр планомерно снижалась по сравнению с контролем (Рис. 20). Количество клеток 1.0 * * * Контроль 1 Гр 2 Гр 4 Гр 8 Гр 0.5 0 1 2 3 4 5 6 7 Дни наблюдения Рисунок 20 – График временной зависимости пролиферативной активности лимфоцитов (млн/мл) от дозы облучения (Гр). * – значимые различия между группами по отношению к контролю (р <0,05). Из результатов эксперимента выявлено, что присутствие в среде комбинации цитокинов IL-2 и rhIL-15 влияет на пролиферативную активность лимфоцитов и существенно снижает чувствительность клеток к действию ионизирующего излучения. 38

3.2.3 Взаимосвязь между чувствительностью активированных и не активированных лимфоцитов к ионизирующему излучению. В представленных выше данных наблюдаются значимые отличия в радиочувствительности нативных и активированных лимфоцитов, которые отличаются приблизительно на 75%. Из графика (Рис. 21) видно, что более устойчивыми к радиационному воздействию ионизирующего излучения являются активированные лимфоциты, их жизнеспособность объективно выше, чем не активированных клеток. 100 90 Жизнеспособность, % 80 70 60 50 40 Не активированные 30 20 * Активированные * * 10 * * 0 Контроль 1 Гр 2 Гр 4 Гр 8 Гр Доза ионизирующего излучения, Гр Рисунок 21 – Отличие выживаемости активированных и не активированных лимфоцитов. * – значимые различия между группами активированных и не активированных лимфоцитов (р <0,05) Показано, что лимфоциты хорошо пролиферируют и активируются in vitro в полной питательной среде на основе RPMI-1640 с добавлением комбинации цитокинов – IL-2 и rhIL-15. Из этого следует, что данные 39

цитокины положительно влияют на жизнеспособность и пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови человека. Таким образом можно предположить, что низкие концентрации IL-2 в комбинации с rhIL-15 в полной питательной среде для активации лимфоцитов позволяют увеличить их радиорезистентность к действию ионизирующего излучения. Метод активации лимфоцитов человека даст возможность проводить лучевую терапию без лучевой нагрузки на лимфоциты. Показано, что активированные лимфоциты менее чувствительны к лучевым воздействиям и ионизирующему облучению, в связи с этим больным перед курсом и во время проведения лучевой терапией можно рекомендовать проводить иммунотерапию активированными лимфоцитами, которая позволит онкологическим больным проходить курсы радиотерапии без нарушения функции иммунной системы. Более того, адоптивная иммунотерапия считается безвредным методом лечения первичных опухолевых процессов зачёт применения не токсичной и оптимальной дозы цитокинов IL-2 и rhIL-15 для процесса активации клеток [3]. К наиболее чувствительным клеткам иммунитета относят Т- и Влимфоциты, которые погибают в первые часы после воздействия облучения. Покоящиеся клетки умирают в результате апоптоза, а клетки, вступившие в иммунные, гибнут в процессе деления. После острого облучения проявляется радиационная гибель клеток, а также повышается риск резкого понижения количества циркулирующих лимфоцитов в организме. Исследования [14; 17] утверждают, что для В-лимфоцитов предел радиочувствительности достигает от 1,2 до 1,8 Гр, что выражаться в увеличении содержания Т-клеток после общего облучения. Также было необходимо подобрать дозу для восстановления лимфоцитов после культивирования в присутствии цитокинов при которой более 50% клеток выживают. Оптимальной дозой для активированных и культивированных in vitro лимфоцитов периферической крови являлась доза в 2 Гр, а для не активированных лимфоцитов доза не менее 1 Гр. 40

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате работы была изучена чувствительность активированных лимфоцитов человека к действию ионизирующего излучения в дозах от 1 до 8 Гр. Оценена жизнеспособность и пролиферативная активность лимфоцитов после активации in vitro. Было показано, что комбинация IL-2 с rhIL-15 в большей степени влияет на выживаемость и пролиферативную активность лимфоидных клеток. IL-2 выполняет ряд функций, например, повышает активность лизиса натуральных киллеров против клеток-мишеней, стимулирует клетки системы ЛАК (лимфокин-активированные киллеры), но главная задача IL-2 заключается в реализации механизмов противоопухолево иммунного ответа. К причинам гибели клеточной популяции нельзя относить лишь воздействие ионизирующей радиации. Немаловажную роль выполняют сбои в процессе образования лимфоцитов и прямое воздействие излучения на жизнеспособные клетки. Например, в лимфоидных клетках при облучении в дозе 2 Гр угнетается функции Т-хелперов и их предшественников [5]. Вдобавок нарушаются свойства лимфоцитов к миграции. Радиация тормозит вторичное перемещение лимфоцитов в лимфатические узлы. Такой сбой весьма устойчив, а, следовательно, при однократном воздействии дозы в 4 Гр сохраняется более одного месяца, что оказывается первостепенной причиной развития иммунодепрессивных состояний в отдаленном периоде после облучения. Иммунный процесс в разных иммунокомпетентных органах угнетается неравномерно: миграция лимфоцитов в селезенку подавляется меньше, чем в лимфатические узлы. Восстановление иммунной системы после действия радиации происходит через 5-7 дней. Возможно, что после проведения иммунотерапии онкологическим больным на фоне лучевой терапии не будет нарушаться иммуносупрессия и функция снижение иммунной числа 41 системы, лимфоцитов. обнаруживаться Очевидно, что

иммунотерапия может являться протективной опцией для больных онкологическими заболеваниями. Изложенное рассмотрения выше вопроса подчеркивает о более необходимость детальном обстоятельного исследовании действия ионизирующего излучения на активированные лимфоциты периферической крови человека. Вместе с тем следует подчеркнуть, что при уменьшении чувствительности лимфоцитов к воздействию ионизирующего излучения, иммунотерапия будет эффективна как самостоятельный метод терапии неоплазий, так и в качестве дополнения к лучевой терапии. 42

ВЫВОДЫ Результаты проведенного исследования позволяют сделать следующие выводы: 1) После активации in vitro жизнеспособность и пролиферативная активность лимфоцитов увеличивается в среднем на 20%. Количество жизнеспособных клеток при комбинированном добавлении IL-2 и rhIL-15 в полную питательную среду, на 14 день культивирования лимфоцитов, составляет не менее 95%. 2) При подборе условий облучения относительно низкими дозами ионизирующего излучения, было выявлено, что для активированных in vitro лимфоцитов доза, при которой выживает более 50% клеток, составляет 2 Гр, а для не активированных лимфоцитов в два раза меньше - 1 Гр. 3) Оценена жизнеспособность и пролиферативная активность активированных лимфоцитов в разные сроки после облучения до 7 суток. Показано, что через 24 часа после облучения в дозе выше 2 Гр жизнеспособность лимфоцитов уменьшается. 4) Пролиферативная активность активированных лимфоцитов на 1-й день после облучения в дозе 1, 4 и 8 Гр снижается по сравнению с контролем. При воздействии дозы в 2 Гр пролиферативная активность клеток несколько выше, чем в контроле. 5) излучения После воздействия относительно низкими дозами ионизирующего активированные лимфоциты человека становятся менее чувствительными к действию радиации, чем не активированные лимфоциты. Благодаря чему может возрастать их радиорезистентность. 43

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Абакушина, Е. В. Метод проточной цитометрии для оценки NK- клеток и их активности / Е. В. Абакушина // Клиническая лабораторная диагностика. – 2015. – №11. – С. 37-44. 2. Абакушина, Е. В. Морфофункциональная характеристика лимфоцитов человека после активации in vitro / Е. В. Абакушина, Ю. В. Маризина, А. Д. Каприн // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2016. – № 25, т. 161. – С. 678-683. 3. Абакушина, Е. В. Эффективность совместного применения IL-2 и IL-15 для активации цитотоксических лимфоцитов in vitro / Е. В. Абакушина, Ю. В. Маризина, Г. С. Неприна // Гены & клетки. – 2015. – № 2, т. X. – С. 7885. 4. Абакушина, Е. В. Основные свойства и функции NK-клеток человека / Е. В. Абакушина, Е. Г. Кузьмина, Е. И. Коваленко // Иммунология. – 2012. – №4, т. 33 – С. 220-224. 5. Абакушина, Е. В. и др. Противоопухолевый иммунный ответ и фотодинамическая терапия / Е. В. Абакушина и др. // Радиация и риск. – 2014. – №4, т.2. – С. 92-98. 6. Александров, Ю. А. Основы радиационной экологии: Учебное пособие / Ю. А. Александров. – Йошкар-Ола: Мар. гос. ун-т, 2007. – 268 с. 7. Воробьева, Н. Ю. Особенности реакции лимфоцитов крови больных раком молочной железы на облучение in vitro / Н. Ю. Воробьева, А. В. Антоненко, А. Н. Осипов // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2011. – №4, т. 51. – С. 451-456. 8. Гельм, Ю. В. Активация лимфоцитов in vitro для иммунотерапии онкологических больных / Ю. В. Гельм, И. А. Пасова, Е. В. Абакушина // Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины: Сборник материалов конгресса молодых ученых, Томск, Национальный исследовательский Томский государственный университет. – 2018. – С. 198-200 44

9. Гельм, Ю. В. Функциональная активность лимфоцитов здоровых доноров и онкологических больных при культивировании в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-15 / Ю. В. Гельм, Е. Г. Кузьмина, Е. В. Абакушина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2019. – №4, т. 167. – С. 471-477. 10. Деньгина, Н. В. Лучевая терапия: NOTABENE для практического онколога / Н. В. Деньгина, Т. В. Митин // Практическая онкология. – 2017 – № 4, т. 18. – С. 343-354. 11. Деньгина, Н. В. и др. Стереотаксическая лучевая терапия экстракраниальных метастазов почечно-клеточного рака в комбинации с ингибиторами тирозинкиназы и иммунотерапией: первые результаты клинического исследования Ib фазы (volga study) / Н. В. Деньгина и др. // Злокачественные опухоли. – 2019. – №3, т. 9. – С. 57-64. 12. Кальницкий, С. А. Современное медицинское облучение населения / С. А. Кальницкий, Н. М. Вишнякова, М. М. Власова // Биотехносфера. – 2010. – №4. – С. 3-8. 13. Козлов, В. А. Современные проблемы иммунотерапии в онкологии / В. А. Козлов, Е. Р. Черных // Бюллетень СО РАМН. – 2004. – №2. – С. 13-19. 14. Коляда, Т. И. и др. Некоторые особенности иммунного ответа под влиянием различных доз ионизирующего облучения у животных и человека / Т. И. Коляда и др. // Annals of Mechnicov Institute. – 2007. – №3. – С. 17-18. 15. Михайловский, Н. В. и др. Оценка миграции активированных лимфоцитов у онкологических больных при проведении иммунотерапии / Н. В. Михайловский и др. // Гены и клетки. – 2019. – №5, т.14. – С. 155. 16. Пелевина, И. И. и др. Изменение свойств лимфоцитов периферической крови доноров и больных раком предстательной железы: реакция лимфоцитов на облучение in vitro / И. И. Пелевина и др. // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2015. – №5, т. 55. – С. 485. 17. Синельщикова, О. А. и др. Радиочувствительность отдельных субпопуляций лимфоцитов / О. А. Синельщикова и др. // XXI всероссийская 45

научно-практическая конференция «Дни науки – 2021». Посвящается году науки и технологий: Материалы конференции. – 2021. – №21. – С. 97-100. 18. Сколожабский, А. А. Селективное культивирование гемопоэтических стволовых клеток / А. А. Сколожабский, В. Н. Лесовой // Экспериментальная и клиническая медицина. – 2006. – №4. – С. 4-11. 19. Сколожабский, А. А. Использование аллогенных стволовых клеток при лучевом поражении в єксперименте / А. А. Сколожабский, В. Н. Лесовой, Е. М. Мамотюк // Експериментальна і клінічна медицина. – 2006. – №3. – С. 6265. 20. Узбеков, Д. Е. и др. Влияние радиационного излучения на иммунную систему (обзор литературы) / Д. Е. Узбеков и др. // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – №8. – С. 538541. 21. Хаитов, Р. М. Иммунология: Учебник / Р. М. Хаитов. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. – 528 с. 22. Юнусова, Н. В. и др. Абскопальный эффект радиотерапии и гипертермии: роль внеклеточных везикул / Н. В. Юнусова и др. // Сибирский онкологический журнал. – 2020. – №19. – С. 108-115. 23. Chiang, C. S. et al. Combining radiation therapy with interleukin-3 gene immunotherapy / C. S. Chiang et al. // Cancer Gene Therapy. – 2000. – №7. – С. 1172-1178. 24. Crittenden, M. American Society for Therapeutic Radiology and Oncology, Annual Meeting. – 2008. – №4. – С. 112-118. 25. Dahlberg, C. I. M. et al. Natural Killer Cell-Based Therapies Targeting Cancer: Possible Strategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity / C. I. M. Dahlberg et al. // Front Immunol. – 2000. – №30. – С. 605. 26. Demaria, S. et al. Ionizing radiation inhibition of distant untreated tumors (abscopal effect) is immune mediated / S. Demaria et al. // International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics. – 2004. – №58. – С. 862-870. 46

27. Dudley, M. et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens / M. Dudley et al. // J. Clin. Oncol. – 2008. – №32. – С. 5233-5239. 28. Forget, M. A. et al. Activation and propagation of tumor infiltrating lymphocytes on clinical-grade designer artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy of melanoma / M. A. Forget et al. // Journal of Immunotherapy. – 2014. – №9, Vol. 37 – С. 448-460. 29. Gowans, J. L. The effect of the continuous re-infusion of lymph and lymphocytes on the output of lymphocytes from the thoracic duct of unanaesthetized rats. / J. L. Gowans // Br J Exp Pathol. – 1957. – №38. – С. 67-78. 30. Knorr, D. et al. Clinical utility of natural killer cells in cancer therapy and transplantation / D. Knorr et al. // Semin Immunol. – 2014. – №26. – С. 161-172. 31. Lee, J. et al. Alteration of tumour response to radiation by interleukin-2 gene transfer / J. Lee et al. // British journal of cancer. – 2000. – №82. – С. 937-944. 32. Lee, Y. et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment / Y. Lee et al. // Blood. – 2009. – №114. – С. 589-595. 33. Lohr, F. et al. Combination treatment of murine tumors by adenovirus- mediated local B7/IL12 immunotherapy and radiotherapy / F. Lohr et al. // Mol. Ther. – 2000. – № 2. – С. 195-203. 34. Navarro, G. A. Therapeutic potential and challenges of natural killer cells in treatment of solid tumors / G. A. Navarro, A. T. Björklund, M. Chekenya // Front Immunol. – 2015. – № 6. – С. 1-18. 35. Sources and effects of ionizing radiation. United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation. UNSCEAR 2000 Report to the General Assembly. Vol. I. UN. - New York, 2000. 36. Poggioli, T. et al. G0 and G2 Chromosomal Assays in the Evaluation of Radiosensitivity in a Cohort of Italian Breast Cancer Patients / T. Poggioli et al. // Journal of radiation research. – 2010. – №5, Vol. 51 – С. 615-619. 47

37. Pecaut, M. J. Dose and dose rate effects of whole-body gamma- irradiation: I. Lymphocytes and lymphoid organs / M. J. Pecaut, G. A. Nelson, D. S. Gridley // In Vivo. – 2001. – №15. – С. 195-208. 38. Reits, E. A. et al. Radiation modulates the peptide repertoire, enhances MHC class I expression, and induces successful antitumor immunotherapy / E. A. Reits et al. // J. Exp. Med. 203. – 2006. – №203. – С. 1259-1271. 39. Rosenberg, S. A. Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer – what clinicians need to know / S. A. Rosenberg // Nat. Rev. Clin.Oncol. – 2011. – №10. – С. 577-585. 40. Seetharam, S. et al. Enhanced eradication of local and distant tumors by genetically produced interleukin-12 and radiation / S. Seetharam et al. // Int J Oncol. – 1999. – №15 – С. 769–773. 41. Yamini, B. et al. Adenovirally delivered tumor necrosis factor-alpha improves the antiglioma efficacy of concomitant radiation and temozolomide therapy / B. Yamini et al. // Clin. Cancer Res. – 2007. – №13 – С. 6217–6223. 48

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

Рецензия от Виктория Рыбачук

Актуальность работы обусловлена необходимостью изучения воздействия ионизирующего излучения на организм человека, в частности на клетки иммунной системы - лимфоциты. Также исследование направлено на процесс совершенствования терапии онкологических заболеваний за счет применения клеточной иммунотерапии активированными лимфоцитами. От правильного выбора лечебных манипуляций зависит успех комбинир...

почти 3 года назад

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв