Разработка балльной системы оценивания методов определения аллергенов в мясной продукции

Анна Сафиулина

Разработка балльной системы оценивания методов определения аллергенов в мясной продукции

Пищевая аллергия в мясной продукции представляет собой угрозу для общественного здравоохранения и пищевой промышленности, поскольку употребление даже небольшой дозы аллергена человеком, страдающим от аллергии, может нанести серьезный вред здоровью. Для потребителей, страдающих аллергическими реакциями важно, чтобы на маркировке продукции, в том числе и мясной, была указана достоверная информация о наличии аллергенов, что напрямую зависит от степени ответственности. Изготовитель должен знать всю необходимую информацию о риске аллергенов для здоровья потребителя и организовывать надлежащую процедуру управления аллергенами. В настоящее время, для определения наличия аллергенов в мясной промышленности применяются различные методы такие как: метод ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LC-HRMS/MS), протеомный анализ на основе масс-спектрометрии, SPR-биосенсоры, метод, основанный на амплификации нуклеиновый кислот (ДНК)-ПЦР, гистологический метод, иммуноферментный анализ (ИФА)/ELISA, устройство бокового потока (LFD). В выпускной-квалификационной работе определён наиболее эффективный метод обнаружения аллергенов в мясной продукции, согласно разработанной балльной системы: устройство бокового потока (LFD)

Пищевая промышленность

Дипломы

Вуз: Российский университет дружбы народов (РУДН)

ID: 60e84e0de4dde5000173f4b4

UUID: ea068f50-c2e6-0139-3bb9-0242ac180005

Язык: Русский

Опубликовано: больше 3 лет назад

Просмотры: 312

17.24

Анна Сафиулина

Российский университет дружбы народов (РУДН)

Комментировать 1

Рецензировать 0

Скачать - 571,2 КБ

Поделиться работой

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ» Факультет/учебный институт_____________________________ Кафедра/учебный департамент______________________________ «Допустить к защите» Заведующий кафедрой/директор учебного департамента _________________________ (название) ____________________________ _____ (Ф.И.О.) «_____»_________202_ г. Выпускная квалификационная работа бакалавра Направление/Специальность 27.03.01 «Стандартизация и метрология» (шифр направления/специальности) (наименование направления/специальности) профиль/специализация «Стандартизация и метрология» ТЕМА: Разработка балльной системы оценивания методов определения аллергенов в мясной продукции Выполнил студент: Сафиулина Анна Александровна (Фамилия, имя, отчество) Руководитель выпускной квалификационной работы ________________________________ (Ф.И.О., степень, звание, должность) _____________________ (подпись) Автор_____________________ (подпись) Группа: ССМбд-01-17 Студ. билет №1032172982 г. Москва 20___ г.

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................... 3 Глава 1. Аллергия и аллергены в современном мире ................................... 7 1.1 Практика управления аллергенами в пищевой промышленности в РФ и за рубежом .......................................................................................................... 7 1.2 Обзор аллергенов, используемых при производстве мясной продукции в РФ и за рубежом ............................................................................ 11 1.3 Международная практика применения и контроля аллергенов в Австралии и Новой Зеландии ............................................................................. 14 1.4 Причины непреднамеренного включения аллергенов в мясной продукции при производстве в РФ..................................................................... 20 1.5 Обзор существующих методов определения аллергенов в мясной продукции в РФ и за рубежом ............................................................................ 26 Глава 2. Проведение сравнительного анализа методов определения аллергенов в мясной продукции ............................................................................ 37 2.1 Разработка балльной системы оценивания для определения эффективности методов определения аллергенов в мясной продукции. ......... 37 2.2 Оценивание методов определения наличия аллергенов в мясной продукции ............................................................................................................ 40 2.3 Результаты по проведенному сравнительному анализу методов определения аллергенов в мясной продукции................................................... 52 ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................. 55 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ..................................... 57 2

ВВЕДЕНИЕ Пищевая аллергия является серьёзной проблемой общественного здравоохранения во всём мире, потенциально затрагивая до 5% взрослых и 810% детей. Важное значение имеет защита людей, страдающих пищевыми аллергиями, от непреднамеренного употребления продуктов, содержащих ингредиенты, способные вызывать аллергические реакции. [7], [43] Термин «аллергия» был введен австрийским педиатром Кламенсом Пирке в 1906 г для разделения полезных и ошибочных иммунных реакций организма. Он происходит от греческих слов: «аллос» - другой, иной и «эргон» - действие. В мире считается, что аллергия одно из самых распространенных заболеваний, диагностика и лечение которого осложняются множеством индивидуальных форм аллергических проявлений. Понятие об аллергии основано на том, что существуют вещества, которые могут быть восприняты конкретным организмом враждебно, тогда как другой не видит в них угрозу. Аллергия – это повышенная индивидуальная чувствительность иммунитета человека, которая проявляется в выработке организмом антител в ответ на воздействие определенного антигена-раздражителя. Антиген связывается с антителом, образуя реакцию организма, сопровождающуюся общим ухудшением состояния здоровья потребителя. [4], [16] Различают пищевую аллергию, непереносимость и чувствительность, а также непереносимость отдельных видов пищевых продуктов. Пищевая непереносимость, или пищевая гиперчувствительность — это нарушение обычных процессов переваривания и усвоения пищи. Симптомами являются диарея, тошнота, рвота, газообразование, боли в животе. При пищевой непереносимости основным способом профилактики является соблюдение диеты, полностью исключающей вещество, которое не может переварить желудочно-кишечный тракт. Пищевая аллергия - гиперчувствительность, это негативная реакция организма на определенное вещество (или пищевой продукт, содержащий это вещество), нарушающее работу иммунной системы. 3

Пищевые аллергены — это гликопротеины, содержащиеся в пищевых продуктах, реже — полипептиды, гаптены, которые соединяются с белками пищи. Аллергенность протеинов обусловлена наличием эпитопов. Эпитоп – это часть макромолекулы антигена, которая распознаётся иммунной системой (антителами, а именно иммуноглобулинами, B-лимфоцитами, T-лимфоцитами). Существует пять классов антител (IgA, IgG, IgM, IgE, IgD), которые отличаются особенностями структуры и функций. Большинство случае пищевой аллергии являются IgE-обусловленными аллергическими реакциями. [11], [37] Понятие «аллерген» означает вещество, при попадании которого в человеческий организм наблюдается реакция со стороны иммунной системы, который сопутствует выработка специфических антител, имеющих название иммуноглобулин класса E – IgE. Белок, попавший в человеческий организм в первый раз, вызывает выработку защитной реакции иммунной системы организма. В дальнейшем иммунитет запоминает состав данного белка и при повторном его попадании в организм появляется повторная негативная реакция организма. Это может выражаться в таких симптомах, как появление отеков, повышение температуры тела. Помимо этого, могут возникать и более тяжелые реакции на аллергены, такие как астма, крапивница, отек Квинке, анафилактический шок. [4] Количество аллергических реакций, связанных с потреблением пищи, растёт быстро, поэтому пищевую аллергию необходимо рассматривать как одну из основных проблем общественного здравоохранения. Актуальность выпускной квалификационной работы обусловлена необходимостью оценки и сравнения методов определения наличия аллергенов в мясной продукции, и определением наиболее эффективного метода обнаружения аллергенов, который позволит обеспечить безопасной продукцией для потребителей. Целью дипломной работы является определение наиболее эффективного метода обнаружения аллергенов в мясной продукции, согласно разработанной балльной системы. 4

Объектом исследования данной работы являются методы определения аллергенов в мясной продукции в РФ и за рубежом. Для реализации обозначенной цели выпускной квалификационной работы служат следующие задачи: − Изучение аллергенов, используемых в мясной промышленности в РФ и за рубежом; − Изучение нормативно-правовой базы в области управления аллергенами в мясной промышленности в РФ и за рубежом; − Обзор методов обнаружения аллергенов в мясной продукции в РФ и за рубежом; − Определение причин непреднамеренного включения аллергенов в мясную продукцию на производстве; − Определение наиболее эффективного метода обнаружения аллергенов в мясной продукции для разработки балльной системы оценивания методов. Предметом исследования выступили статьи ведущих ученых в сфере обнаружения аллергенов в мясной продукции, а также законы Австралии, Новой Зеландии, РФ, в.т.ч Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 022/2011 «Пищевая продукция в части её маркировки». [1] Теоретическую основу исследования составляют положения и выводы, содержащиеся в трудах таких зарубежных и отечественных ученых, как: Кузлякина Ю.А., Пчёлкина В.А., Хвыля С.В., Линда Монаци, Крюченко Е.В., Замула В.С., Чернуха И.М., Лисицин А.Б., Саймон Брук Тейлор и другие. Нормативной базой дипломной работы явились законы и кодексы Новой Зеландии, Австралии, РФ, директивы и регламенты ЕС, законадательные акты США, технические регламенты Таможенного союза. Работа состоит из введения, двух глав, заключения и списка использованной литературы. Первая глава посвящена обзору аллергенов и методов обнаружения аллергенов в мясной продукции, практике управления аллергенами в пищевой 5

промышленности, практике применения и контроля аллергенов в Австралии и Новой Зеландии, а также причины непреднамеренного включения аллергенов в мясную продукции при производстве. Вторая глава посвящена разработке балльной системы оценивания для определения эффективности методов определения аллергенов в мясной продукции, а также проведение сравнительного анализа. 6

Глава 1. Аллергия и аллергены в современном мире 1.1 Практика управления аллергенами в пищевой промышленности в РФ и за рубежом Аллергические заболевания приобрели огромные масштабы в мире, как в развитых, так и в развивающихся странах. По данным Всемирной организации здравоохранение, количество больных аллергией за последнее десятилетии в России увеличилось на 20%. По прогнозам учёных, это число будет расти, так как большинство факторов, вызывающих аллергические реакции, связаны с современным образом жизни. Численность населения, страдающего пищевой аллергией, различается в разных странах. Например, распространенность пищевой аллергии составляет 4,6% среди населения Испании и 19,1% среди населения Австралии. По разным данным, распространенность пищевой аллергии в Российской Федерации составляет от 30% до 56% среди детей и около 20% среди взрослых, страдающих атопическим дерматитом. [36] В настоящее время не существует доступных методов профилактики или лечения пищевой аллергии. Единственный метод поддержания ремиссии у пациента – это исключить прием пищевого аллергена. В основе развития аллергии у человека в первую очередь лежит нарушение специфической и неспецифической иммунобиологической реактивности организма. Количество людей с пищевой гиперчувствительностью, а именно с пищевыми аллергиями растёт каждый год. Сложность проблемы заключается в том, что непереносимость пищевых продуктов, может быть, обусловлена различными механизмами. Пищевая аллергия может являться результатом сенсибилизации к пищевым аллергенам, добавкам, примесям, приводящей к развитию аллергического воспаления. [36], [12], [48] На сегодняшний день подход к управлению аллергенами в пищевой промышленности во всех странах мира основан на существующей надлежащей производственной практике (GMP), которая обеспечивает разделение производства пищевой продукции, содержащей аллергенные ингредиенты и 7

нанесении предупредительной маркировки о содержании аллергенов в продукции. Многие производители по-разному интерпретируют риски попадания аллергенов в продукцию, так как на данный момент не существует согласованных подходов к оценке рисков в соответствии с единым мировым стандартом. Кроме того, изготовители ввиду отсутствия единого мнения о минимальных дозах аллергенов, вызывающих аллергические реакции, приняли подход использования предупредительной маркировки о возможном содержании аллергенов в продукции. Несмотря на широкое международное научное сотрудничество по вопросам управления аллергенами при производстве пищевой продукции, между нормативной базой разных стран мира существует ряд значительных отличий. Каждая юрисдикция определяет разные приоритетные аллергены, и зачастую неясно, какие критерии использовались при разработке списков приоритетных аллергенов. Анализ этих различий — важный шаг, направленный на защиту потребителей, страдающих от пищевой аллергии, во всём мире. Растущий объём международной торговли пищевой продукцией предполагает, что было бы полезно согласовать перечень основных аллергенов, меры по управлению аллергенами при производстве пищевой продукции, а также тип предупредительной маркировки о содержании основных аллергенов. [9], [12], [57] За рубежом разработаны законодательные требования, в которые включены перечни аллергенов и процессы их контроля: − Директива 2003/89/ЕС в отношении указания ингредиентов в составе пищевых продуктов (Европейский союз); − Регламент (ЕС) 1169/2011 о предоставлении потребителям информации о пищевых продуктах, в Приложении II которого указаны 14 групп пищевых продуктов, вызывающих аллергию, которые обязательно 8

должны быть указаны на этикетке продукта, если они используются в качестве ингредиентов, независимо от количества [29]; − Директива по аллергенам 2005/26/ЕС (Европейский союз); − Федеральное законодательство. Секция 201-210 (США); − Закон о маркировке пищевых аллергенов и защите прав потребителя от 2004 года (Food Allergen Labeling and Consumer Protection Act of 2004); − Продовольственный кодекс. Стандарт 1.2.3 (Австралия/Новая Зеландия). [5] В России перечень наиболее распространенных пищевых аллергенов, употребление которых может вызвать аллергические реакции или противопоказано при отдельных видах заболеваний, указан в Техническом регламенте Таможенного союза «Пищевая продукция в части ее маркировки» (ТР ТС 022/2011). Он полностью соответствует законодательству ЕС и содержит следующие продукты: 1) арахис и продукты его переработки; 2) аспартам и аспартам-ацесульфама соль; 3) горчица и продукты ее переработки; 4) диоксид серы и сульфиты, если их общее содержание составляет более 10 миллиграммов на один килограмм или 10 миллиграммов на один литр в пересчете на диоксид серы; 5) злаки, содержащие глютен, и продукты их переработки; 6) кунжут и продукты его переработки; 7) люпин и продукты его переработки; 8) моллюски и продукты их переработки; 9) молоко и продукты его переработки (в том числе лактоза); 10) орехи и продукты их переработки; 11) ракообразные и продукты их переработки; 12) рыба и продукты ее переработки (кроме рыбного желатина, используемого в качестве основы в препаратах, содержащих витамины и каротиноиды); 9

13) сельдерей и продукты его переработки; 14) соя и продукты ее переработки; 15) яйца и продукты их переработки. [1],[6] Если аллерген-содержащее сырье преднамеренно не использовалось при производстве пищевой продукции, но наличие аллергенов в готовых продуктах полностью исключить невозможно, информация о предполагаемом наличии таких компонентов размещается после указания состава пищевой продукции. Данные меры направлены на обеспечение своевременного информирования потребителей, страдающих пищевыми аллергиями, для правильного составления их рациона. Однако, следует отметить, что маркировка пищевых продуктов, в которых возможно содержание аллергенов существенно отличается в разных странах, что необходимо учитывать при поставках продукции за рубеж. [19] В настоящее время, в Российской Федерации отсутствуют единые установленные значения минимальной концентрации аллергена, способной вызвать аллергическую реакцию, известной как пороговая доза, что может препятствовать достоверному информированию потребителей о содержании аллергенов в пищевом продукте. Отсутствие необходимой маркировки на аллерген-содержащей продукции может привести к тяжелым последствиям. С целью минимизации возможного непредумышленного попадания аллергенов в продукты питания на предприятиях пищевой промышленности разрабатывают и внедряют комплекс мероприятий в рамках «программ управления аллергенами», которые являются частью системы менеджмента безопасности пищевых продуктов. [6], [9] Кроме того, на данный момент отсутствуют стандартизированные руководящие принципы, направленные на управление рисками аллергенов на мясных предприятиях. Нет единого подхода к интерпретации данных о риске присутствия аллергенов. Это означает, что каждый производитель используют разные методы для определения и толкования риска наличия аллергенов. [6] 10

1.2 Обзор аллергенов, используемых при производстве мясной продукции в РФ и за рубежом Мясные продукты многокомпонентные и подвергаются обработке. Они содержат не только воду, жир и мясо, но и широкий спектр других ингредиентов такие как: соль, фосфаты, растительные белки (соя, пшеничная мука), животные белки (яичный белок, молочный белок, плазма крови), гидроколлоиды (желатин, каррагинан, крахмал, декстрины, камедь, пектин, целлюлоза), клетчатка, специи. Некоторые вещества добавляют целенаправленно, поскольку они выполняют технологические функции такие как: конденсация, гелеобразование, эмульгирование. Также введение добавок в мясной продукт направлено не только на повышение характеристик, его пищевой но и на снижение ценности затрат. и органолептических Если на производстве не поддерживаются процедуры Надлежащей производственной практики (GMP) или Надлежащей гигиенической практики (GHP), то добавки могут быть внесены непреднамеренно. Самыми распространенными при производстве мясных продуктов являются соевые бобы, люпин, сельдерей, горчица, злаки, содержащие глютен, яйца и молоко, а также продукты их переработки, вызывающих пищевую аллергию или пищевую непереносимость, включенных в Приложение II Регламента ЕС №1169/2011. В отношении маркировки мясной продукции производитель также обязан предоставить информацию о наличии белков в продукте и их происхождении, то есть в виде животных, от которых они получены, и типе белка (молочный белок, коллагеновый белок). [8], [44] Растительные белки занимают важное место в мясной промышленности из-за их высоких функциональный свойств, положительного влияния на органолептические особенности и биологические характеристики мясного продукта. Во всём мире источниками растительного белка являются: пшеница (26%), кукуруза (18%), рис (15%), соя (15%) и другие растения. [8] Перечень аллергенов, используемый в мясной промышленности: 1) Соя 11

В мясной промышленности широко используются препараты сои (Glycinemax) в форме соевой муки, соевых концентратов и изолятов, а также текстурированной сои. Добавки эмульгируют, желатинируют и стабилизируют структуру продукта, увеличивая способность удерживать влагу. С точки зрения пищевой ценности соевые компоненты являются источниками полноценного белка. Их также многие производители используют в качестве заменителя жира, уменьшая количество калорий в конечном продукте. [8], [43] Такие технологические характеристики, как эмульгирование, гелеобразование, улучшение текстуры делают сою одним из наиболее часто используемых источников растительных белков в мясной промышленности. [50] Соя богата витаминами B и Е, а также минералами (кальций, магний и железо). В некоторых странах существует ограничение на максимальное допустимое содержание её в мясных продуктов. Например, в Испании количество сои не может превышать 30 г/кг (сухой вес) готового продукта. В Португалии сосиски не могут содержать более 50 г/кг сои. Основными белками сои, которые могут вызвать аллергическую реакцию являются белки Gly m Bd 30k (ранее 30кДа Gly m 1), глицинин, бетаконглицинин, а также профилин, ингибитор куниц-трипсина, Gly m 1, Gly m 2 и Bet v 1. [10], [15] 2) Зерновые культуры (белки пшеничной муки) Мука используется в качестве добавок в мясной промышленности. Белки пшеничной (Triticum L.) муки являются соединяющим компонентом и наполнителем для мясных продуктов. Белки содержат глютен, который образует пространственную структуру, взаимодействия с водой. Белок пшеничной муки придаёт продукту эластичность и пластичность, что влияет на его сочность. Однако у людей с пищевой чувствительностью и непереносимостью, при употреблении даже минимального количества глютена могут возникать клинические симптомы такие как: крапивница, диарея и анафилактический шок. Негативное воздействие организма на пшеницу возникает у детей во время прикорма, когда ребенок пробует вкус новой пищи. Причиной развития 12

заболевания может быть не только глютен, но и неправильно выбранная схема прикорма (крахмал, предрасположенность, содержащийся слабый в иммунитет, крупе, выявленные наследственная или скрытые заболевания, недостаток пищеварительных ферментов). [10] В соответствии с постановлением Европейского парламента №41/2009, продукт считается свободным от глютена, если в нем содержится менее 0,02 г/кг белка. [45] 3) Сельдерей и горчица Сельдерей из-за его особенного вкуса добавляют в мясные субпродукты или готовые к употреблению мясные блюда. Однако он содержит вещество, которое может вызывать острые аллергические реакции, такие как Bet-v-1 гомологичный Api g 1, профилин (Api g 4), Api g 5. [26] Экстракт выдержаного сельдерея – это концентрат, приготовленный из сельдерея. Экстракты перетирают в порошок или жидкость. Обычно его используют в качестве консерванта пищи в мясных деликатесах вместо химических нитритов, потому что экстракты сельдерея являются нитритами. Сельдерей является одним из наиболее редких аллергических соединений и может быть найден в качестве скрытого аллергена в различных пищевых продуктах. Как правило, он используется в качестве смеси специй в таких продуктах, как мясные продукты, колбасы, заправки или супы быстрого приготовления. [10], [43] Горчицу добавляют в мясные продукты для усиления вкуса. Она является специей. В белой горчице (Sinapisalba L.) в качестве аллергенных белков выступают альбумин Sin a 1 и глобулин Sin a 2. В бурой горчице (Brassicajuncea) основным аллергеном является Bra j 1, классифицируемый как альбумин. Аллергены в горчице термостойки и устойчивы к ферментам. [31] В результате проведения исследований пищевой продукции часто обнаруживаются незадекларированные следы горчицы. Перекрестное загрязнение является одним из главных источников опасности, которая возникает во время обработки (формирование пыли во время измельчения) или 13

во время упаковки. Таким образом, в рамках управления аллергенами обязательно необходимо соблюдать гигиенический контроль поверхностей в производственной зоне для того, чтобы очистка производственных объектов была полной и достаточной. Экспресс-методы, такие как, например, тесты бокового потока (иммунохроматографические испытательные системы) могут применяться для проверки поверхностей на производственных объектах или в помещениях, где используются аллергены, в рамках концепции HACCP. [8], [10] 4) Белки коровьего молока и яичные белки Молочные и яичные белки также входят в группу продуктов, которые чаще всего вызывают аллергические реакции у потребителей. Молочные белки, добавляемые в мясные продукты, улучшают их сочность и структуру и тонко влияют на вкус готового продукта. Основными аллергенными компонентами коровьего молока являются казеины и сывороточные белки, такие как альфалактальбумин, бета-лактоглобулин, бычий сывороточный альбумин, иммуноглобулин и лактоферрин. Белки коровьего молока и яичные белки влияют на консистенцию конечного продукта, благодаря гелеобразующим, эмульгирующим и стабилизирующим свойствам яичных компонентов. Аллергические реакции в яичном белке чаще всего вызывают овомукоид, овальбумин, овотрансферрин, лизоцим, а в яичном желтке – альфа-ливтин (Gal d 5) и YGP42 (Gal d 6). [10], [31] 1.3 Международная практика применения и контроля аллергенов в Австралии и Новой Зеландии В 2002 году в законодательство Австралии и Новой Зеландии было введено требование, согласно которому производители продуктов питания должны маркировать аллергены, выводя таким образом на передний план различные подходы к предупредительной маркировке аллергенов, внесённых в продукт в результате перекрёстного загрязнения. 14

В 2005 году было основано Бюро по вопросам аллергенов (The Allergen Bureau), как некоммерческая отраслевая организация. Бюро сотрудничает с национальными и промышленности и мультинациональными маркетинга, группами компаниями поставщиков, пищевой импортёров, экспортёров, розничных торговых сетей и потребителей. Основная цель Бюро по вопросам аллергенов заключается не только в обмене информацией и опытом в пищевой промышленности по управлению пищевыми аллергенами, но и в получении актуальной, последовательной и понятной информации о наличии пищевых аллергенов в продуктах.[9] Так как данная информация чрезвычайно важна для потребителей. Вопрос: «Что можно сделать, чтобы начать использовать предупредительную маркировку аллергенов в качестве научно обоснованной оценки рисков, а непросто как возможную защиту для производителей и розничных торговых магазинов?» стал для Бюро по вопросам аллергенов поводом для разработки Программы добровольной маркировки следов случайно введённых аллергенов (VITAL®). Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling (VITAL®) – добровольная маркировка следов стандартизированный случайно процесс введённых оценки аллергенов. риска VITAL® присутствия – это аллергенов, используемый в пищевой промышленности Австралии, Новой Зеландии, а также большого количества компаний других стран. [54] Цель Программы VITAL® состоит в том, чтобы обеспечить безопасность производимых продуктов питания для потребителей, страдающих пищевой аллергией, последовательных которые критериев подавляющего предупредительной позволяют потребителям с путем большинства предоставления маркировки аллергенов, аллергической реакцией избежать приобретения данных продуктов. Таким образом, они работают над сохранением ценности предупредительной маркировки, как инструмента управления риском. [9] 15

Ключевыми инструментами для VITAL® является [54]: − Руководство пищевой промышленности VITAL® программе [21]; − VITAL® жизненно важных решений, которые помогают пользователю продвигаться через всеобъемлющую обработку и учет ингредиентов, необходимых при реализации VITAL®; − Калькулятор VITAL®, который является вспомогательным инструментом, позволяющим сообщать и хранить информацию об оценке рисков; [23] − VITAL® Руководство по маркировке наилучшей практики для Австралии и Новой Зеландии; [22] − Неожиданные аллергены в пище. [20] VITAL® инструменты помогают пользователю определить, требуется ли предупредительная маркировка аллергенов для перекрестных контактных аллергенов. Оценка риска надежна лишь настолько, насколько надежна информация, используемая для получения результата. Чем больше деталей всеобъемлющими являются фиксируется записи, в оценке риска, тем демонстрирующие более должную осмотрительность. Прежде чем внедрять продуманную программу предусматривает VITAL®, управления дополнение этой необходимо ввести аллергенами. программой в действие Разработка VITAL® существующих систем обеспечения безопасности пищевых продуктов, основывающихся на Системе анализа опасных факторов и контроля критических контрольных точек (Hazard Analysis and Critical Control Points (НАССР)). [9] VITAL® предназначен для использования производителями пищевых продуктов и представляет собой формализованный подход к рассмотрению воздействия непреднамеренного включения аллергенов как их ингредиентов, так и их переработки в ингредиент. Использование VITAL® обеспечивает дополнительную направленность и поддержку для определения аллергенного статуса входящих ингредиентов, 16

включая наличие каких-либо аллергенов, которые могут быть непреднамеренно добавлены через цепочку поставок посредством совместного сбора, хранения и переработки. VITAL® может выделить любую недостающую или неполную информацию при поиске потенциальных ситуаций, в которых аллергены могут быть непреднамеренно добавлены в процессе производства из-за совместного хранения или обработки. Использование VITAL также дает возможность записывать информацию об оценке риска аллергенов последовательным и формальным образом.[54] Сравнивая рассчитанными результаты согласно аналитического теста с концентрациями, оценке рисков VITAL®, важно гарантировать сравнимость измеряемых единиц. По шкале пороговых значений VITAL® используется концентрация (мг/кг) общего белка. Однако аналитические результаты могут выражаться в широком диапазоне единиц измерения и калибраторов. Используемые методы должны быть продуманными, надёжными, воспроизводимыми, чувствительным. Чрезвычайно важно иметь также надлежащий план выборки. Количественная оценка наличия аллергенов, внесённых в продукцию путём перекрёстного загрязнения, должна принимать во внимание спорадическую природу таких аллергенов и применять режим комплексных испытаний. Можно использовать анализ наличия аллергенов при помощи программы VITAL® для валидации предположений, сделанных для программы управления аллергенами. [9] Применение программы VITAL® может быть полезным в нескольких ключевых сферах: верификация заявлений об аллергенных ингредиентах, верификация аллергенного профиля сырья и потенциального перекрёстного заражения сырья, оценке эффективности очистки и валидации процесса очистки, подтверждение предположений, сделанных во время процесса оценки риска, мониторинг критических изменений и валидация оценки риска VITAL®. 17

Оценка рисков в соответствии с Программой VITAL® состоит из следующих ключевых элементов: − определение важных аллергенов, подлежащих рассмотрению (согласно указанию в нормативных положениях); − идентификация намеренно введенных аллергенов; − идентификация и количественное определение аллергенов, полученных в результате перекрёстного заражения из-за отдельных ингредиентов; − идентификация и количественное определение аллергенов, полученных в результате перекрестного заражения во время переработки; − расчёт общего содержания аллергенов, полученных в результате перекрёстного заражения, в готовом продукте; − определение пороговых значений; − рассмотрение рекомендаций по маркировке и источников перекрестного заражения; − регистрация предположений; − валидация оценки VITAL®; − постоянный мониторинг. [54] Бюро по вопросам аллергенов сотрудничает с Советом научных экспертов VITAL®, промышленностью и группами исследователей, а также постоянно пересматривает информацию о пороговых значениях аллергенов. На сегодняшний день действует обновлённая версия Программы VITAL® 3.0. Изменения доз аллергена, способных вызвать аллергическую реакцию у чувствительных людей в новой версии Программы VITAL® 3.0. по сравнению с версией 2.0 приведены в Таблице №1. Таблица №1. Изменения доз аллергена, способных вызвать аллергическую реакцию у чувствительных людей в новой версии Программы VITAL® 3.0. по сравнению с версией 2.0. [9] Сводная таблица изменений референтных доз в VITAL® Online Аллерген Эталонная доза (мг белка) VITAL 2.0 18 VITAL 3.0

Референтная доза уменьшилась Злаки, содержащие глютен 1,0 0,7 Соя 1,0 0,5 Люпин 4,0 2,6 Кешью и фисташки 0,1 0,05 Пекан и грецкий орех 0,1 0,03 Яйцо 0,03 0,2 Молоко 0,1 0,2 Рыба 0,1 1,3 Ракообразные 10 25 - 0,05 0,2 0,2 Миндаль, бразильские орехи, фундук, 0,1 0,1 Контрольная доза увеличилась Новая эталонная доза Сельдерей Референтная доза в неизмененном виде Арахис макадамия Горчица Задействовав 0,05 Программу обоснованные процессы VITAL® и 0,05 используя другие научно оценки риска наличия аллергенов в пищевой продукции, можно решить проблему недопонимания и недоверия со стороны потребителей предупредительной маркировке содержания аллергенов в настоящее время. Вместо того, чтобы отвечать интересам производителей и розничных торговых сетей, предупредительная маркировка должна стать заслуживающим доверия методом, который позволит потребителям, страдающим от аллергии, выбирать безопасную для них пищу и при этом не ограничивая их выбор. [33] 19

1.4 Причины непреднамеренного включения аллергенов в мясной продукции при производстве в РФ Когда возникает проблема безопасности мясной продукции, связанная с неправильным обращением с аллергенными ингредиентами, под угрозой оказывается не только здоровье потребителей, но и репутация и экономическая устойчивость предприятий мясной отрасли. Специалистам мясоперерабатывающих предприятий, во избежание рисков, необходимо проанализировать причины непреднамеренного попадания аллергенов в мясные продукты при их производстве, а также оценить каждый технологический этап, поддерживающий процесс, на котором возможна реализация риска наличия незаявленного аллергена в мясных продуктах, и проанализировать информацию, касающуюся непреднамеренного включения аллергенов в продукты при их переработке. [19] В результате анализа вероятности появления аллергена можно выделить следующие причины непреднамеренного включения аллергенов в мясные продукты, которые указаны в таблице №2. Таблица №2. Причины непреднамеренного включения аллергенов в мясные продукты Процессы жизненного Причины непреднамеренного включения аллергенов цикла, вспомогательные процессы, Процессы управления Закупка сырья, спецификации (входной контроль) − отсутствие процедур оценки поставщиков; − сопроводительные документы не анализируются при поступлении сырья на предмет получения соответствующей информации об аллергенах или какихлибо изменениях; − отсутствие информации о паспорте каждого поддона/коробки/пакета о наличии аллергена (предприятия могут использовать цветовую кодировку, маркировку или другие средства идентификации аллергенных ингредиентов); − неправильное обращение с поврежденными контейнерами, коробками, пакетами с аллергенами, что приводит к перекрестному заражению; − отсутствие информации о ГМО ингредиентах; 20

− совместное хранение и передача на предприятии ингредиентов, содержащих и не содержащих аллергенов; производства − неиспользование четкого обозначения зон разделения промежуточного хранения и перевалки; − отсутствие физических преград; − неиспользование специальных лотков, тары и техники; − аллергенные ингредиенты не идентифицируются маркировкой или цветовым кодированием; − закрытые ёмкости не используются; − процедуры очистки от пролитой или поврежденной тары с аллергенами не используются и не документируются; − преемственность производства аллергенной продукции после безаллергенной продукции не планируется; − риск миграции аллергенной пыли при переработке не оценивается; − отсутствие контроля за повторным включением продукта в процесс. Санитария − график санитарной обработки не составляется; − отсутствие инструкции по чистке оборудования; − отсутствие очистки оборудование сразу после изготовления пищевых продуктов не контролируется; − отсутствие выделенных инструментов для уборки; − отсутствие задокументированных правил очистки пролива; − отсутствие документально оформленных правил разборки; оборудования при очистке. Обучение и инструктаж − отсутствие обучения по программе управления аллергенами и контроля персонала в соответствии с их должностными персонала обязанностями; − мытье рук не контролируется; − спецодежда не выделяется и своевременность её замены не контролируется; − контроль доработки продукции отсутствует; − контроль отходов отсутствует; − контроль использования техники отсутствие. Упаковка и маркировка − отсутствие контроля упаковки; − смена упаковочных линий не контролируется; − высокий уровень проблем с неправильной маркировкой. Система безопасности − один из видов опасности (аллерген) не учитывался при анализе вероятности реализации фактора опасности и пищевых продуктов тяжести его последствий; − несоблюдение решений, принятых в ходе анализа опасностей; − невозможность оценить вероятность реализации фактора опасности и тяжесть его последствий; − неспособность реализовать эффективные средства контроля для поддержки решений, принятых в ходе анализа опасностей Планирование 21

Для минимизации возможного непреднамеренного попадания аллергенов в продукты питания предприятия пищевой промышленности разрабатывают и внедряют комплекс мероприятий в рамках программ управления аллергенами. Передовые компании, которые годами работают в соответствии с международными стандартами безопасности и качества пищевых продуктов, много лет назад определили пути развития в отношении разработки программ управления аллергенами. [36] Введение управления аллергенами следует рассматривать как расширение существующей системы управления безопасностью пищевых продуктов. На начальном этапе работы в этом направлении целесообразно проанализировать следующие факторы: − общее количество спровоцировать относительны, используемых реакцию так как у аллергенов, чувствительных люди могут иметь которые могут людей (данные разный уровень чувствительности, а чувствительность человека может различаться в разных обстоятельствах); − насколько часто население, потребляющее аллерген-содержащие пищевые продукты, имеет общие побочные реакции; есть ли какиелибо подгруппы населения, которые находятся в зоне особого риска (младенцы и дети). Данные подгруппы включают людей, которые ограничивают выбор продуктов питания из-за диет; − относительная аллергенность используемого компонента (если продукт был переработан, соответствующий белок может отсутствовать, и, следовательно, он не будет представлять риска перекрестного заражения аллергеном); − происхождение конкретных ингредиентов, их географическое положение и среда производства. [49] Затем оценивается вероятность перекрестного заражения на каждой стадии процесса производства пищевых продуктов, начиная с входного контроля пищевого сырья и заканчивая транспортированием до места реализации. 22

При выявлении неприемлемого риска заражения необходимо принять меры, направленные на максимального уменьшение непреднамеренного присутствия аллергенов в продукте. С этой целью успешно используются принципы надлежащей производственной практики (GMP) в рамках организации производственного процесса. Для обеспечения безопасности пищевых продуктов GMP требует соблюдения строгой дисциплины со стороны всего персонала. Ключевые аспекты управления аллергенами при производстве мясных продуктов представлены на Рисунке 1. [6] Рисунок 1. Основные моменты, которые следует учитывать при создании системы управления аллергенами Производитель должен знать о наличии аллергенов во всем используемом сырье и вспомогательных материалах, что достигается путем выбора и оценки поставщиков и налаженной системе входного контроля. На этапе входного контроля основного сырья и вспомогательных материалов аллергены проверяются на соответствие нормативно-технической документации. Осуществляется обучение ответственных сотрудников осведомленности об аллергенах и их контроль в соответствии с должностными 23

обязанностями, а также контроль соответствующих входящих документов, идентификация поступающего сырья и других материалов на соответствие предоставляемой информации, а также визуальная оценка. Изготовитель обязан запрашивать у поставщиков информацию о содержании пищевых аллергенов в сырье и вспомогательных материалах в виде: 1. Основных компонентов, указанных в составе (соевый растительный белок в составе комплексной пищевой добавки); 2. Вспомогательных компонентов (например, пищевая добавка, полученная из аллергенного источника, например амилаза из пшеницы); 3. Незаявленные компоненты, внесенные из-за перекрестного заражения аллергеном при производстве. Поставщики, в свою очередь, должны знать о рисках, которые могут возникнуть в результате загрязнения продукта аллергенами и предоставить соответствующую информацию. Компоненты должны быть полностью описаны на этикетке и в спецификациях. Недопустимо использование обобщенных названий используемых ингредиентов, таких как «растительные масла и жиры». [36] После входного контроля на этапе хранения необходимо идентифицировать сырье и вспомогательные материалы, содержащие аллергены на складе четкой маркировкой, указывающей на наличие потенциального аллергена (может использоваться цветовая кодировка или другие средства для идентификации аллергенных ингредиентов). Целесообразно предоставить отдельное хранение таких ингредиентов. Следует отметить, что единственным подходом к полному исключению перекрестного заражения аллергенами при производстве является использование отдельных производственных площадей, однако зачастую это невозможно. Существуют и другие меры по предотвращению перекрестной контаминации продукции свободной от аллергенов: 1. Разделение производства на зоны, установление физических барьеров между производственными линиями; 24

2. Предоставление выделенного оборудования, приспособлений и контейнеров; 3. Минимизация ненужного материала, правильное планирование производственных циклов, включая очистку оборудования между производственными циклами; 4. Организация индивидуальной подачи воздуха. [36] На этапе планирования необходимо разделить зоны хранения, производства основного сырья, вспомогательных материалов с аллергенами и без них, однако, если такой возможности нет, то используются другие методы, например, подготавливаются и устанавливаются зоны для хранения аллергенов, используются специальные транспортные контейнеры (с маркировкой или цветовой кодировкой), аллергенное сырье размещается в выделенной и обозначенной складской зоне отдельно от сырья без каких-либо аллергенов; используются физические барьеры. Также разрабатываются рабочие инструкции по предотвращению перекрестного загрязнения, которые обязательно должны быть доступны на местах выполнения операций. При транспортировке аллергенного сырья со склада в зону приготовления специй используется специальная маркированная закрытая тара. [6], [36] Предприятия мясной промышленности несут большую ответственность при производстве продукции в части соответствия требованиям законодательства и в отношении здоровья потребителей. В связи с этим необходимо разработать, внедрить и поддерживать программу управления аллергенами, анализировать причины реализации аллергенов и организовать управление ресурсами, чтобы свести к минимуму непреднамеренное включение аллергенов в готовую продукцию. Для контроля аллергенов необходимы современные методы обнаружения аллергенов. 25

1.5 Обзор существующих методов определения аллергенов в мясной продукции в РФ и за рубежом Наличие точных и чувствительных методов обнаружения пищевых аллергенов имеет решающее значение на предприятиях пищевой промышленности для проверки и контроля производственных процессов, а также для обеспечения правильной маркировки пищевых продуктов. Данные методы также необходимы государственным регулирующим органам для обеспечения соблюдения законодательства и потребителям, страдающим от аллергии, здоровье которых находится под угрозой. [7], [27] За последнее время развитие молекулярной биологии и иммунологии привело к появлению новых методов, которые позволили усовершенствовать традиционные методы в области пищевой аллергии. Они значительно облегчают не только идентификацию, характеристику и количественное определение пищевого аллергена, но и приводят к улучшению диагностики и терапии пищевых аллергических заболеваний. Многообразие методов обусловлено разнообразием технологий производства пищевых продуктов, содержащих аллергены и спецификой структуры аллергена, что должно учитываться при подборе надлежащего метода. [39] Методы обнаружения аллергенов в мясной продукции: 1. Иммуноаналитические методы Иммуноаналитические специфических и методы полагаются высокородственных антител на для использование обнаружения белковых/пептидных биомаркеров, указывающих на наличие аллергенных ингредиентов в образцах пищевых продуктов. Антитела могут быть либо поликлональными либо моноклональными, в зависимости от их способности связывать более одного эпитопа. Выбор того или иного типа во многом зависит от желаемого формата анализа, и моноклональные антитела часто используются в конкурентных анализах, с сочетанием поликлональных и моноклональных антител в сэндвич-анализах. К иммуноаналитическим методам относятся иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунохроматографический анализ (ИХА). 26

Иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay -ELISA), является методом, который чаще всего используется в пищевой промышленности и официальных агентствах по контролю пищевых продуктов. Метод позволяет определить наличие (скрытых) аллергенных белков в пищевых продуктах, которые могут быть обнаружены колориметрической реакцией. Стандартная кривая, полученная с использованием образцов, содержащих очищенный эталонный аллерген известных концентраций, позволяет определять количество аллергенов в пищевых продуктах. [7], [58] Из современных методов обнаружения ELISA является наиболее широко распространенным и стандартным методом для обнаружения аллергенных ингредиентов в различных матрицах образца как в исследованиях, так и в производстве продуктов питания. Причиной этого является его выдающаяся аналитическая чувствительность и простота. Анализ основан на функционализации пластины с реагентами захвата и использовании ферментных антител в качестве детекторных реагентов. Наиболее широко используемыми ферментами в ELISA являются пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза (ALP). Работа ELISA основана на обнаружении изменения цвета при добавлении выделенного субстрата, который катализируется с ферментом. [46] Таким образом, интенсивность цвета может быть легко связана с концентрацией целевого анализа, который обычно квантован спектрофотометром, предназначенным непосредственно для расчета пластины, содержащей анализы, разработанные в лунках. Для обнаружения пищевых аллергенов используются два типа ИФА: конкурентный иммуноферментный анализ и «сэндвич»-метод иммуноферментного анализа. [35] «Сэндвич»-метод иммуноферментного анализа был разработан для обнаружения нескольких различных групп пищевых аллергенов, и в последнее десятилетие стали доступны многочисленные коммерческие тест-наборы. является наиболее распространенным типом иммуноферментного анализа. Суть метода заключается в том, что к носителю с иммобилизованными антителами 27

добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. Специфические (аллергенные) белки захватываются антителом и обнаруживаются вторым белково-специфическим антителом, которое мечено ферментом, способным облегчать колориметрическую реакцию. Концентрация антигена/аллергена пропорциональна интенсивности цвета, которую можно измерить на спектрофотометре. В «сэндвич»-методе цвет, флуоресценция или интенсивность люминесценции напрямую связаны с количеством целевого аллергена, присутствуют в извлеченном образце пищи. В последние годы метод был применен для обнаружения многих различных пищевых белковых аллергенов. Конкурентный иммуноферментный анализ ИФА часто является предпочтительным форматом для обнаружения относительно небольшого количества аллергенных белков. Данный тип иммуноферментного анализа использует иммобилизованный антиген в отличие от «Сэндвич»-метода иммуноферментного анализа, при котором используется иммобилизованное антитело. Антитела добавляют к экстрактам образца, что приводит к образованию комплексов антитело-антиген. Предварительно инкубированные образцы добавляют к твердой фазе с иммобилизованным антигеном. Если образец не содержит визуализируемое антигена, высокой наблюдается абсорбцией оптимальное окрашенного связывание, продукта реакции. Антигены, присутствующие в образце, ингибируют это связывание, что приводит к снижению абсорбции. Поэтому оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации антигена в образце. Конкурентный тип ИФА могут быть использованы для обнаружения нескольких видов пищевых аллергенов. [7], [58] Иммунохроматографический анализ (ИХА) может служить чрезвычайно быстрым методом обнаружения пищевых аллергенов. Этот метод также основан на иммунологическом обнаружении белков из потенциально аллергенных пищевых продуктов. Иммунохроматография сочетает в себе преимущества гомо-и гетерогенных аналитических методов. Он сочетает гомогенный иммуноанализ с 28

разделением активных и неотредактированных соединений различными гетерогенными методами. Еще одним преимуществом иммунохроматографии является то, что жидкость, протекающая через носитель (например, сорбент и мембрану), способна отделять прореагировавшие продукты от неотредактированных без необходимости дополнительного осаждения или промывки содой. В случае если аллергенные белки присутствуют в тестовом образце, они захватываются специфическими антителами, которые конъюгированы с окрашенными частицами. Комплекс антитело-антиген протекает вдоль тестполоски и захватывается зоной антител, специфичных для антигена. Захват комплекса приводит к появлению видимой линии на тест-полоске. Для качественных коррелирует методов используются с концентрацией щупы, антигена в но интенсивность образце, что полосы предполагает ограниченный потенциал для (полу-) количественного определения. [30] Тесты для иммунохроматографического анализа с щупами недорогие, быстрые, портативные, не требуют контрольно-измерительных приборов и просты в применении. Чувствительность щупов выше, но близка к той, которая достигается с помощью тест-наборов ИФА/ELISA. [7] К примеру, иммуноанализа устройство (LFD) бокового является простой потока и (LFD). Боковой экономически поток эффективной платформой, которая была применена в последнее десятилетие для определения на месте пищевых аллергенов. Этот метод предназначен для обнаружения присутствия целевого вещества в жидкой пробе без необходимости в специализированном и дорогостоящем оборудовании. LFD состоит из полосы материала такого как: нитроцеллюлоза, нейлон и материалов, которые поддерживают капиллярный поток с различными отсеками от зоны нанесения образца на одном конце до зоны впитывания на другом конце. Устройство бокового потока может быть использовано для проверки входящих ингредиентов на предмет целевых аллергенов, для оценки продукции. [25] 2. Гистологический метод обнаружения аллергенов 29

Соевые белковые компоненты, используемые в мясной промышленности, в зависимости от содержания белка, жира и углеводов подразделяют на соевую муку, соевый концентрат и соевый изолят. Кроме того, используют текстурированные соевые белки. При переработке питательная ценность и химическая структура белка сои не изменяется, а изменяется лишь физическая форма. Выявление соевых белковых продуктов, дифференциация по технологическим вариантам и определение характеристик их качества могут осуществляться на базе разработанного ГОСТ 31474-2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок». [2], [14] При проведении микроструктурных исследований мясных продуктов в соответствии с действующими стандартами применяют такие гистологические красители, как гематоксилин и эозин, позволяющие выявить основные тканевые и клеточные структурные особенности. Метод гистологического анализа – прямой метод определения состояния сырья и продукции, их истинного состава. [17], [18] Использование традиционных гистологических методов для выявления таких белков не всегда может дать достоверную информацию об их содержании в составе продукта. Ни один из специальных методов окрашивания белковых добавок растительного происхождения не обладает высокой специфичностью, поскольку они в значительной степени основаны на обнаружении полисахаридных структур растительных клеток. Использование различных растительных белков в относительно небольших количествах в составе одного продукта может также осложнить оценку. Иммуногистохимические объединяют преимущества методы являются высокоспецифичными традиционных гистологических методов и с чувствительностью иммунологических. Эти методы основаны на обработке гистологических срезов маркированными специфическими антителами к выявляемому веществу, которое в данной ситуации служит антигеном. Окраске подвергается только выявляемый компонент, а фоновое контрастирование среза 30

можно проводить различными методами, что дает возможность широкого применения системы анализа изображения для более детального изучения гистологического препарата и проведения морфометрического анализа. За рубежом иммуногистохимические методы стали очень популярны для обнаружения небольших количеств аллергенов в составе пищевых продуктов. [14] 3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) Метод, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), характеризуются амплификацией участков ДНК. ДНК-мишень, как правило, является видоспецифичной и функционирует в качестве маркера присутствия определенного пищевого ингредиента. используется для обнаружения Этот метод в настоящее время микробных патогенов, генетически модифицированных сельскохозяйственных культур в пищевых продуктах и пищевых аллергенов в пищевых продуктах, например, в мясной продукции. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Для эффективного проведения ПЦР необходимы набор олигонуклеотидов или праймеров. Ферментная полимераза может добавлять дополнительные нуклеотиды к праймеру, используя геномную ДНК в качестве матрицы. Последующая тепловая денатурация и отжиг второго праймера для вновь синтезированной одноцепочечной ДНК позволяет синтезировать комплементарную цепь ДНК. Метод ПЦР строго следует оптимизированному температурному профилю повторяющихся циклов плавления ДНК (обычно при 95 °C), отжига праймеров (обычно от 55 до 65 °C) и полимеризации ДНК (обычно от 60 до 72 °C). Несколько циклов денатурации — отжига — удлинения приводят к амплификации целевого фрагмента ДНК, который ограничен праймерами, используемыми в реакции ПЦР. Продукт амплификации можно визуализировать путем окрашивания после гель- электрофореза. [7], [28] 31

Для обнаружения аллергенных пищевых продуктов обычно применяют три последовательных рабочих этапа: 1. Выделение и очистка амплифицируемой ДНК из репрезентативной выборки исследуемого продукта; 2. Амплификация целевой аллерген-специфической последовательности ДНК; 3. Обнаружение полученного продукта ПЦР. Методы ПЦР известны своей потенциальной способностью улавливать низкие уровни целевой ДНК, что во многих случаях приводит к высокой чувствительности мишени. За последние 15 лет методология ПЦР и базовая технология необходимых инструментов претерпели колоссальное развитие, в том числе: одновременное обнаружение нескольких аналитов. ПЦР может применяться к большинству аллергенов, требующих обязательной маркировки, например, в соответствии с приложением Европейской директивы 2003/89/ EC. [34] 4. Метод с применением биосенсоров. Биосенсоры (чипы) обеспечивают новый подход к анализу пищевых продуктов и обнаружению пищевых аллергенов. Биосенсорные инструменты позволяют в реальном времени обнаруживать соединения, взаимодействующие с иммобилизованной молекулой-мишенью. Эта молекула может представлять собой антитело против аллергена или одноцепочечной молекулы ДНК, способной гибридизоваться с аллерген-специфическим фрагментом ДНК. Такие молекулы прикрепляются к поверхности сенсорного чипа, и связывание образцов соединений (аллергенов / ДНК из аллергенных пищевых продуктов) с иммобилизованными молекулами может быть обнаружено и количественно определено путем измерения изменений показателя преломления. Преимуществами этой технологии являются короткое время анализа и высокая степень автоматизации. Чувствительность этого метода во многом зависит от характеристик сенсорного чипа. Пределы обнаружения в диапазоне от 0,45 до 2,0 были описаны для обнаружения молочных белков в пищевых продуктах. 32

Биосенсоры могут использоваться для различения интактного и деградировавшего белка/аллергена. [7], [55] Биосенсоры могут быть классифицированы по их режимам трансдукции как оптические, электромеханические и электрохимические типы. Большинство биосенсоров, предназначенных для обнаружения пищевых аллергенов, являются оптические. Оптические биосенсоры сочетают в себе свойства оптоэлектронных и микроэлектронных технологий для аналитического применения обнаружения пищевых аллергенов. Оптические биосенсоры основаны на методике резонанса поверхностного плазмона (SPR). Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) можно сочетать с наноматериалами и иммуномагнитными анализами для качественного и количественного выявления пищевого аллергена. [42] Биосенсоры SPR для обнаружения пищевых аллергенов включают: − волокно оптический поверхностный плазмонный резонанс (FOSPR); − изображение поверхностного плазмонного резонанса (SPRI); − поверхностный плазмонный резонанс пропускания (TSPR); − локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR). [55] FOSPR подходит для дальнего и в режиме реального времени обнаружения пищевых аллергенов из-за его небольшого размера и гибкой конструкции. Биосенсор LSPR может быть разработан как мультиплексный биосенсор для обнаружения пищевых аллергенов в режиме реального времени в одном или нескольких образцах продуктов питания. Биосенсор SPRI может быть соединен с LSPR и TSPR, чтобы обеспечить точный, быстрый, недорогой и очень чувствительный метод мониторинга сотен пищевых аллергенов в одном или несколько матриц пищи. [59] 5. Протеомный анализ Протеом представляет собой совокупность всех белковых компонентов, присутствующих в сложной системе. Поскольку геном живых организмов стабилен, вариабельные уровни транскрипции генов приводят к более высокой сложности транскриптома. Гораздо 33 более высокая степень сложности

наблюдается для протеома. Это вызвано изменением относительного количества отдельных белков, а также посттранскрипционными процессами, такими как модификация белка и ассоциация с другими белками или молекулами различных типов. Протеомные методы, которые позволяют изучать протеом, в настоящее время применяются для обнаружения белков, имеющих отношение к питанию, и ожидается, что протеомика окажет серьезное влияние на науку о питании. Большинство пищевых аллергенов являются компонентами протеома, и, поскольку они обычно являются гликопротеинами, посттрансляционная обработка, такая как гликозилирование, действительно влияет на протеом аллергена. Протеомные исследования обычно основаны на двух компонентах: первый — это разделение белков, а второй — идентификация отдельных белков. Несмотря на необходимость использования дорогостоящего специализированного оборудования, этот метод популярен, поскольку он может обеспечить однозначную идентификацию аллергенных белков, присутствующих в пищевом продукте. Это является основным преимуществом по сравнению с методами, основанными на иммунологических методах (косвенная идентификация, которая может быть затруднена перекрестной реактивностью антител) или методами, основанными на ДНК (идентификация ДНК-маркеров вместо аллергенов). В последнее время применяется метод протеомного исследования на основе масс-спектрометрии, что позволяет провести глубокие исследования пищевого аллергена. [7], [38] Масс-спектрометрия протеомного анализа: позволяет успешно идентификация решать белков, основные определение задачи первичной аминокислотной последовательности белка, выявление посттрансляционных модификаций и количественный анализ белков. На сегодняшний день имеются обнаружения аллергенов на основе MS: 34 два методологических варианта

1) обнаружение нетронутого белка представителя аллергенного ингредиента, который, как правило, наиболее распространенным в протеомном профиле; 2) обнаружение целевых аналитов, а именно маркеров, которые являются подписными пептидами, правильно подобранными, в результате энзиматического пищеварения всего аллергенного ингредиента. В обоих случаях выборка является важным шагом для обеспечения надлежащей репрезентативности анализа, и для точной абсолютной количественной оценки содержание белка/пептида должно относиться к содержанию подходящего всего белка, либо полученного пептида. [41] При идентификации белков различают два подхода: top-down (сверхувниз) — получение информации на основе масс-спектрометрического анализа целых, неповрежденных белковых молекул и bottom-up (снизу-вверх) — восстановление информации о белках за счет анализа отдельных пептидов этих белков. Наиболее распространенным является подход bоttom-uр (снизу-вверх), который представляет собой предварительное энзиматическое расщепление белка на более мелкие фрагменты, быструю очистку полученного образца от низкомолекулярных примесей и масс-спектрометрический анализ смеси пептидов. [13], [40] 6. Хроматографические методы. Жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения (LC-HRMS/MS) используется для выявления аллергенов в пищевых продуктах. Данный метод достаточно надежен и точен при обнаружении в пищевой продукции следующих аллергенов: продуктов переработки рыбы в концентрации не превышающей 5 мкг/г –1 и молока, яиц, сои иракообразных в концентрации не превышающей 10 мкг/г –1. [7], [51] В LC-HRMS/MS методах пептиды используются в качестве биомаркеров для обнаружения и количественной оценки аллергенов. Выбор хороших пептидов биомаркеров имеет большое значение для разработки специфического, 35

универсального и чувствительного метода. Биомаркеры должны быть надежными для пищевой промышленности. [56] 7. Масс-спектрометрия. Метод позволяет определять качественный и количественный состав многокомпонентных преимуществ таких белково-пептидных как: высокая смесей. Метод обладает рядом чувствительность, экспрессность, информативность. Масс-спектрометрия, проводящая мониторинг реакции пептидов, возникает в результате ферментативного переваривания белков. Идентификация и количественная оценка белка с помощью дробовика и целевого белка с помощью MS успешно применяются для анализа аллергенов в матрицах обработанных пищевых продуктов. Протеомика дробовика, также известная как протеомика «снизу-вверх», относится к характеристике белков путем анализа пептидов, высвобождаемых (или «расщепленных») протеолитическим расщеплением интактных белков. Протеомика дробовика предоставляет информацию о структуре белков/ пептидов и о происходящих химических/термических модификациях во время обработки пищевых продуктов. У масс-спектрометрического анализа ряд преимуществ для обнаружения белковых аллергенов в пищевых матрицах. Вопервых, строгая специфичность, необходимая для подтверждения присутствия интересующих аналитов путем мониторинга конкретных пептидов особенно при использовании экспериментов по мониторингу выбранных реакций (SRM) на тройном квадрупольном приборе. Во-вторых, широкий динамический диапазон и высокая чувствительность может быть достигнута при правильной пробоподготовке. В-третьих, подготовка образца и метод могут быть разработаны для нацеливания на конкретный класс молекул. [33] 36

Глава 2. Проведение сравнительного анализа методов определения аллергенов в мясной продукции 2.1 Разработка балльной системы оценивания для определения эффективности методов определения аллергенов в мясной продукции. Сравнительный анализ методов определения аллергенов в мясной продукции включает в себя несколько последовательных этапов. На первом этапе из методов определения аллергенов в мясной продукции были исключены те, по которым не было обнаружено данных по их использованию для определения аллергенов в мясной продукции. В результате был сформирован следующий перечень (Таблица №3) потенциально эффективных методов исследований, которые могут помочь определить наличие аллергенов в мясной продукции. Таблица №3. Перечень потенциально эффективных методов исследований для определения наличия аллергенов в мясной продукции. № Название метода 1. Иммуноферментный Суть метода метод Метод позволяет определить наличие (ИФА) - ELISA (скрытных) аллергенных белков в мясной продукции 2. Иммунохроматографический Устройство бокового потока (LFD) метод (ИХА) – устройство представляют собой тест-полоски бокового потока (LFD) Метод основан (экспресс-тест). иммунохроматографическом на подходе, при котором использование образца и последующее взаимодействие с антителами конъюгируют одновременно и удерживаются в течение короткой однофазной фазы 3. Метод, основанный на Метод характеризируется амплификацией амплификации нуклеиновых участков ДНК. ДНК-ПЦР-анализ можно кислот (ДНК) – ПЦР рассматривать как серию процедурных

шагов: отбор образцов, образцов, подготовка выделение ДНК, количественное титрование, определение настройка оборудования, ДНК, ПЦР, анализ работа программного обеспечения, ручной анализ. 4. Протеомный анализ на основе Метод масс-спектрометрии позволяет идентификацию проводить белков, первичные определить аминокислотные последовательности белка, выявлять посттрансляционные модификации и количественный анализ белков в мясной продукции. 5. Гистологический метод Метод основан растительных происхождения на идентификации компонентов в белкового различных видах мясных сырья и продуктов в соответствии с их микроструктурными особенностями с использованием гистологических препаратов. 6. Хроматографический метод Метод напрямую пептидные анализируют ВЭЖХ-масс-спектрометрия расщепленные фрагменты (LS-HRMS/MS) аллергенных белков в мясной продукции, используя их различные молекулярные массы 7. SPR-биосенсоры SPR-биосенсоры позволяют в реальном времени 38 обнаруживать соединения,

взаимодействующие с иммобилизованной молекулой-мишенью. может представлять Эта молекула собой антитело против аллергена в мясной продукции или одноцепочечной молекулы ДНК способной гибридизоваться с аллергенспецифическим фрагментом ДНК. На втором этапе была разработана балльная система оценивания эффективности методов определения аллергенов в мясной продукции. Согласно данной системе, оцениваются определённые характеристики метода, и, согласно результату, начисляются баллы. Описание балльной системы оценивания методов определения аллергенов в мясной продукции для определения их эффективности приведено ниже. 1. Оценивается новизна метода. Метод используется менее 5 лет – 1 балл. Метод используется от 5 до 20 лет – 2 балла. Метод используется более 21 года – 3 балла. 2. Оценивается стандартизация метода: Нет стандартов на метод – 0 баллов; Утверждена методика (МУК, МР) в РФ – 1 балл; Утвержден национальный стандарт (ГОСТ Р) на метод – 2 балла; Утвержден межгосударственный стандарт (ГОСТ) на метод – 3 балла; Утвержден международный стандарт (ISO) на метод – 5 баллов; 3. Оценивается объективность метода: Результаты анализа полностью зависят от человеческого фактора – 1 баллов; Результаты анализа частично зависят от человеческого фактора – 2 балла; Результаты практически не зависят от человеческого фактора – 3 баллов; 4. Оценивается сходимость результатов: Найден единственный литературный источник – 1 баллов; 39

Данные разных авторов не сходятся – 2 балла; Данные разных авторов сходятся – 3 баллов; 5. Оценивается необходимость приобретения дорогостоящего оборудования для использования метода: Высокая необходимость приобретения дорогостоящего оборудования – 0 баллов; Необходимость приобретения дорогостоящего оборудования отсутствует – 5 баллов; 6. Оценивается необходимость высококвалифицированных специалистов для использования метода: Высокая необходимость высококвалифицированных специалистов – 1 баллов; Средняя необходимость высококвалифицированных специалистов – 2 балла; Низкая необходимость высококвалифицированных специалистов – 3 баллов; 7. Длительность проведения анализа по методу: Для проведения анализа требуется длительное время – 1 баллов; Для проведения анализа не требуется длительное время – 2 балла; Экспресс-метод – 3 баллов; 8. Оценивается возможность проведения анализа на месте: Нет возможности проведения анализа на месте – 0 баллов. Есть возможность проведения анализа на месте – 5 баллов; 2.2 Оценивание методов определения наличия аллергенов в мясной продукции На следующем этапе проводится оценка потенциально эффективных методов для определения наличия аллергенов в мясной продукции, за каждый положительный ответ начисляются баллы, согласно разработанной балльной системе оценивания методов. При оценивании характеристики, выбирается ответ, который будет утвердительным для рассматриваемого метода, баллы вносятся в таблицу. 40

Метод, который будет рассмотрен первым – определение наличия аллергенов в мясной продукции гистологическими методами. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции гистологическими методами приведены в таблице №1. Таблица №1. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции гистологическими методами. Определение наличия аллергенов в мясной продукции гистологическими методами Оцениваемая характеристика Описание Баллы Новизна метода От 5 до 20 лет 2 Стандартизация метода Утвержден межгосударственный 2 стандарт ГОСТ 31474-2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок» на сою и пшеничный текстурат Объективность метода Результаты частично зависят от 2 Данные разных авторов сходятся 3 человеческого фактора Сходимость результатов Необходимость приобретения Высокая необходимость дорогостоящего приобретения дорогостоящего оборудования для оборудования 0 использования метода Необходимость Средняя необходимость 2 высококвалифицированных специалистов для использования метода Длительность проведения Требуется длительное время анализа 41 1

Возможность проведения Нет анализа на месте возможности проведения 0 анализа на месте Итого: 12 Гистологические методы имеют ряд достоинств, они многие годы являются эффективными методами определения наличия аллергенов в мясной промышленности, однако для их осуществления требуется дорогое оборудование, высокая квалификация персонала, длительность проведения анализа. Также в РФ существует только один межгосударственный стандарт ГОСТ 31474-2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок» на сою и пшеничный текстурат, но на все остальные аллергены из перечня ТР ТС 022/2011 стандарта нет. [14], [17] Следующим был оценен метод, основанный на амплификации нуклеиновых кислот (ДНК) - ПЦР. Результаты оценки определения наличия аллергенов в мясной продукции методом, основанным на амплификации нуклеиновых кислот (ДНК) - ПЦР приведены в таблице №2. Таблица №2. Результаты оценки определения наличия аллергенов в мясной продукции методом, основанным на амплификации нуклеиновых кислот (ДНК) - ПЦР. Определение наличия аллергенов в мясной продукции методом, основанным на амплификации нуклеиновых кислот (ДНК) - ПЦР Оцениваемая характеристика Описание Баллы Новизна метода От 5 до 20 лет 2 Стандартизация метода Утверждён межгосударственный 3 стандарт: ГОСТ 31719-2012 «Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод 42

определения сырьевого состава (молекулярный) [3] Объективность метода Результаты частично зависят от 2 Данные разных авторов сходятся 3 человеческого фактора Сходимость результатов Необходимость приобретения Высокая необходимость 0 дорогостоящего приобретения дорогостоящего оборудования для оборудования использования метода Необходимость Высокая необходимость 1 высококвалифицированных специалистов для использования метода Длительность проведения Требуется длительное время 1 анализа Возможность анализа на месте проведения Нет возможности проведения 0 анализа на месте Итого: 12 Наиболее часто применяемый метод определения аллергенных веществ на основе нуклеиновых кислот – это полимеразная цепная реакция (ПЦР). Общий принцип ПЦР - последовательная и экспоненциальная амплификация целевой ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. ПЦР может применяться к большинству аллергенов, требующих обязательной маркировки, например, в соответствии с приложением 3a Европейской директивы 2003/89 / EC. Методология ПЦР для обнаружения и количественной оценки аллергенов претерпела значительные изменения за последнее десятилетие. Метод сочетает в себе несколько характеристик, важных для обнаружения аллергена. Его непревзойденная специфика позволяет в большинстве случаев однозначно идентифицировать источник аллергенов, что делает его важным 43

аналитическим инструментом. Кроме того, его высокая специфичность позволяет проверять результаты, полученные с помощью ELISA, которые по своей природе, основанной на антителах, не могут быть абсолютно конкретными. Более того, ПЦР способна отличить несколько мишеней аллергенов, которые не были успешно отделены от других пищевых компонентов с помощью ELISA. Для ПЦР требуется специальное лабораторное помещение и обученный персонал. [34], [50], [24] Следующим был оценен метод иммуноферментного анализа (ИФА) / ELISA. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции иммуноферментным анализом (ИФА) / ELISA приведены в таблице №3. Таблица №3. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции иммуноферментным анализом (ИФА) / ELISA. Определение наличия аллергенов в мясной продукции иммуноферментным анализом (ИФА) / ELISA Оцениваемая характеристика Описание Баллы Новизна метода От 5 до 20 лет 2 Стандартизация метода Нет стандартов на метод 0 Объективность метода Результаты частично зависят от 2 человеческого фактора Сходимость результатов Данные авторов сходятся Необходимость приобретения Необходимость приобретения дорогостоящего дорогостоящего оборудования оборудования для отсутствует 3 5 использования метода Необходимость Средняя необходимость высококвалифицированных 44 2

специалистов для использования метода Длительность проведения Не требуется длительное время 2 анализа Возможность проведения Нет анализа на месте возможности проведения 0 анализа на месте Итого: 16 Иммуноферментный анализ (ИФА) / ELISA обладает высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл, возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала, простотой проведения реакции, низкой стоимостью диагностических наборов. Тест-наборы ELISA для пищевых аллергенов в мясной продукции могут определять целевой белок из высоко обработанной пищи. ELISA остается наиболее широко используемым методом обнаружения аллергенов и количественной оценки. Одной из причин этого является то, что ELISA нацелена на белки, из которых подмножество аллергенных белков являются основными источниками аллергии на пищу. ELISA является относительно простым и может выполняться квалифицированным персоналом лаборатории с использованием относительно недорогого оборудования. Анализ может быть завершен в течение нескольких часов. Тест-наборы ИФА (ELISA) позволяют определить наличие глютена, люпина, сои. Утверждённых стандартов на наличие аллергенов в мясной продукции по методу ИФА (ELISA) нет на данный момент. [33], [35], [47], [52] Следующим был оценен иммунохроматографический метод (ИХА) – устройство бокового потока для обнаружения аллергенов в мясной продукции (LFD). Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции устройством бокового потока (LFD) приведены в таблице №4. 45

Таблица №4. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции устройством бокового потока (LFD) Определение наличия аллергенов в мясной продукции устройством бокового потока (LFD) Оцениваемая характеристика Описание Баллы Новизна метода От 5 до 20 лет 2 Стандартизация метода Нет стандартов на метод 0 Объективность метода Результаты частично зависят от 2 Данные разных авторов сходятся 3 человеческого фактора Сходимость результатов Необходимость приобретения Необходимость приобретения 5 дорогостоящего дорогостоящего оборудования – оборудования для отсутствует использования метода Необходимость Средняя необходимость 2 высококвалифицированных специалистов для использования метода Длительность проведения Экспресс-метод 3 анализа Возможность анализа на месте проведения Нет возможности проведения 0 анализа на месте Итого: 17 Ключевым преимуществом иммунохроматографический метода (ИХА) – устройство бокового потока для обнаружения аллергенов в мясной продукции (LFD) по сравнению с другими иммуноанализами является простота теста, обычно требующего небольшого количества проб или подготовки реагентов или совсем без них. LFD существуют уже много лет, хотя их применение в анализе 46

пищевых аллергенов всего 15–20 лет. Огромным преимуществом является то, что для метода не требуется дорогое оборудование. Также устройство бокового потока является экспресс-методом определения наличия аллергенов в мясной продукции таких как: люпин, соя, горчица, сельдерей, пшеничный текстурат. [25], [32] Определить наличие аллергенов в мясной продукции можно с помощью хроматографического метода ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LCHRMS/MS). Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции методом ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LC-HRMS/MS) приведены в таблице №5. Таблица №5. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции методом ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LCHRMS/MS). Определение наличия аллергенов в мясной продукции методом ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LS-HRMS/MS). Оцениваемая характеристика Описание Баллы Новизна метода Более 21 года 3 Стандартизация метода Метод не стандартизирован 0 Объективность метода Результаты частично зависят от 2 человеческого фактора Сходимость результатов Данные разных авторов не сходятся Необходимость приобретения Высокая необходимость дорогостоящего приобретения дорогостоящего оборудования для оборудования 2 0 использования метода Необходимость Высокая высококвалифицированных высококвалифицированных специалистов 47 необходимость 1

специалистов для использования метода Длительность проведения Требуется длительное время 1 анализа Возможность проведения Нет анализа на месте возможности проведения 0 анализа на месте Итого: 9 Метод ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LC-HRMS/MS) это метод аналитической химии, сочетающий в себе возможности физического разделения жидкостной хроматографии (или ВЭЖХ) с возможностями масс-анализа массспектрометрии (МС). Преимущество LC-HRMS/MS метода заключается в том, что он способен определять наличие нескольких аллергенов в мясной продукции. Однако метод имеет значительные недостатки: необходимость приобретения дорогостоящего оборудования, сложность и длительность проведения анализа. Эти недостатки обуславливают сложность определения аллергенов в мясной продукции в условиях производственного контроля на предприятиях мясной промышленности. [51], [53] Следующий определения метод, оценка аллергенов в которого была произведена мясной продукции протеомным – метод анализом (протеомика) на основе масс-спектрометрии. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции протеомным анализом на основе масс-спектрометрии приведены в таблице №6. Таблица №6. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции протеомным анализом на основе масс-спектрометрии. Определение наличия аллергенов в мясной продукции протеомным анализом на основе масс-спектрометрии. Оцениваемая характеристика Описание 48 Баллы

Новизна метода От 5 до 20 лет 2 Стандартизация метода Метод не стандартизирован 0 Объективность метода Результаты частично зависят от 2 Данные разных авторов сходятся 3 человеческого фактора Сходимость результатов Необходимость приобретения Высокая необходимость 0 дорогостоящего приобретения дорогостоящего оборудования для оборудования использования метода Необходимость Высокая высококвалифицированных высококвалифицированных специалистов необходимость 1 для специалистов использования метода Длительность проведения Не требуется длительное время 2 анализа Возможность анализа на месте проведения Нет возможности проведения 0 анализа на месте Итого: 10 Метод протеомного анализа вкупе с масс-спектрометрией является новой технологией, способной проводить глубокие исследования пищевого аллергена в мясной продукции. Преимущество данного метода заключается в его способности однозначно определить множественного количество аллергенов в мясной продукции. Однако для проведения такого исследования требуется дорогостоящее оборудование и высококвалифицированные специалисты. [38], [40], [41] Следующий метод, который будет рассмотрен – это определение аллергенов в мясной продукции с помощью SPR-биосенсоров. 49

Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции с помощью SPR-биосенсоров приведены в таблице №7. Таблица №7. Результаты оценки метода определения наличия аллергенов в мясной продукции SPR-биосенсорами. Определение наличия аллергенов в мясной продукции SPR-биосенсорами. Оцениваемая характеристика Описание Баллы Новизна метода От 5 до 20 лет 2 Стандартизация метода Метод не стандартизирован 0 Объективность метода Результаты частично зависят от 2 Данные разных авторов сходятся 3 человеческого фактора Сходимость результатов Необходимость приобретения Высокая необходимость 0 дорогостоящего приобретения дорогостоящего оборудования для оборудования использования метода Необходимость Средняя высококвалифицированных высококвалифицированных специалистов необходимость 2 для специалистов использования метода Длительность проведения Не требуется длительное время 2 анализа Возможность анализа на месте проведения Нет возможности проведения 0 анализа на месте Итого: 11 Преимущество SPR-биосенсоров по сравнению с другими методами определения аллергенов в мясной продукции заключается в том, что он позволяет обнаруживать аллергены в реальном времени, без маркировки. Основные недостатки: оборудование для обнаружения аллергенов в мясной 50

продукции с помощью SPR-биосенсоров дорогое и занимает много места в лаборатории, трудно одновременно проанализировать множественные аллергены в образцах мясной продукции. Биосенсоры SPR имеют большой потенциал на будущее для производителей и отделов контроля безопасности при обнаружении аллергенов в мясной продукции. [59], [42], [55] 51

2.3 Результаты по проведенному сравнительному анализу методов определения аллергенов в мясной продукции. После проведения оценки методов определения аллергенов в мясной продукции по необходимым критериям, каждый метод получил определенное количество баллов. Сводные данные по оценке методов приведены в таблице №8. Таблица №8. Сводные данные по оценке определения аллергенов в мясной продукции. № Метод Баллы 1. Гистологический метод 2. Метод, основанный на амплификации нуклеиновых кислот 12 12 (ДНК)-ПЦР 3. Иммуноферментный анализ (ИФА)/ELISA 16 4. Устройство бокового потока (LFD)/ИХА 17 5. Метод ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LC- 9 HRMS/MS) 6. Протеомный анализ на основе масс-спектрометрии 10 7 SPR-биосенсоры 11 Наименьшее количество баллов присвоено хроматографическому методу ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (LS-HRMS/MS), так как он сложен и длителен в проведении. Для него необходимо дорогостоящее и большое оборудование и, соответственно, высококвалифицированные специалисты. В условиях производственного контроля на предприятиях мясной промышленности эти недостатки обуславливают сложность определения наличия аллергенов. Однако метод также демонстрирует высокий потенциал для будущих улучшений благодаря своей надежности, чувствительности и специфичности. Протеомный анализ на основе масс-спектрометрии является достаточно новым методом обнаружения аллергенов в мясной промышленности по 52

сравнению с другими методами. Протеомный анализ на основе массспектрометрии способен доставить как качественную, так и количественную информацию об аллергенных белках в мясной продукции. Основными преимуществами анализа являются высокая пропускная способность и мультиплексирование. Однако для метода требуется дорогое и большое оборудование и, соответственно, обученный персонал. Метод требует длительного время для обнаружения аллергенов и зачастую результаты бывают недостоверными. SPR-биосенсоры являются не распространенным методом обнаружения аллергенов в мясной продукции в РФ. Они способны обнаружить аллергены на ранней стадии развития и появления аллергена. SPR-биосенсоры являются дорогими и коммерчески недоступными для потребителей. Платформы SPR имеют высокий портативные потенциал для и мультиплексные дальнейшего развития: эффективные устройства для обнаружения пищевых аллергенов (3D-печать аллергена в мясной продукции, умные телефоны с определенными приложениями). Гистологический нуклеиновых кислот метод и метод, (ДНК)-ПЦР основанный являются на амплификации достоверными методами обнаружения аллергенов в мясной промышленности. Они оба имеют ряд достоинств: многие годы являются эффективными методами определения наличия аллергенов в мясной промышленности, однако для их осуществления требуется дорогое оборудование, высококвалифицированные специалисты, длительность проведения анализа. Одним из главных преимуществ является то, что у обоих методов есть межгосударственный стандарт. Главным недостатком данных методов является не только длительность проведения анализа, но и отсутствие проведение метода по обнаружению аллергенов на месте. Также многие методы используются от 5 до 20 лет, но на них нет до сих пор утвержденных стандартов кроме гистологического метода и ПЦР. 53

Метод определения наличия аллергенов в мясной продукции (ИФА)/ELISA используется регулярно как в РФ, так и за рубежом. Проанализировав относительно различные простой, литературные быстрый, высококвалифицированных недорогой специалистов. источники, анализ, Анализ ИФА/ELISA не требующий позволяет обнаружить аллергены (соевый текстурат, пшеничный текстурат, сельдерей, горчицу, люпин и.т.д) в мясной продукции. Иммуноферментный метод ELISA удобен в использовании на предприятии. Иммуноанализы (ELISA, LFD) обнаруживают присутствие белка аллергена с помощью специфические антитела без необходимости стадии разделения. Однако метод не стандартизирован и не является экспресс-методом, как устройство бокового потока (LFD). Методу определению наличия аллергенов в мясной продукции устройством бокового потока (LFD) было присвоено самое больше количество баллов по разработанной балльной системе оценивания для определения эффективности методов определения аллергенов. Огромное преимущество метода заключается в том, что он является экспресс-методом, что сокращает время определения аллергена в продукте на производстве. Проведения анализа не требует дорого оборудования и высококвалифицированных специалистов. Устройство позволяет обнаружить такие аллергены в мясной продукции, как соя, глютен, сельдерей. Таким образом, согласно разработанной балльной системы оценивания методов, для определения наличия аллергенов в мясной промышленности, больше всего подходит устройство бокового потока (LFD). 54

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Пищевые аллергены в мясной продукции представляют собой угрозу для общественного здравоохранения и пищевой промышленности, поскольку употребление даже небольшой дозы аллергена человеком, страдающим от аллергии, может нанести серьезный вред здоровью. Для потребителей, страдающих аллергическими реакциями важно, чтобы на маркировке продукции, в том числе и мясной, была указана достоверная информация о наличии аллергенов, что напрямую зависит от степени ответственности. Изготовитель, который в рамках своей деятельности должен знать всю необходимую информацию о риске аллергенов для здоровья потребителя и организовывать надлежащую процедуру управления аллергенами с регулярной оценкой её эффективности. В данной работе определен наиболее эффективный метод обнаружения аллергенов в мясной продукции, согласно разработанной балльной системы: устройство бокового потока (LFD) – 17 баллов. Преимущество метода: a) Экспресс-метод позволяет сократить время обнаружения аллергена в мясной промышленности; b) Для обнаружения аллергена в мясном продукте не требуется дорогостоящее оборудование и высококвалифицированные специалисты; c) Простота использования устройства бокового потока (LFD). При этом в настоящее время нет достоверного метода определения аллергенов, способного распознать все группы аллергенов одновременно. В выпускной-квалификационной работе: − Изучены аллергены, используемые в мясной промышленности в РФ и за рубежом; − Изучена нормативно-правовая база в области управления аллергенами в мясной промышленности в РФ и за рубежом; − Изучены методы обнаружения аллергенов в мясной продукции в РФ и за рубежом; 55

− Определены причины непреднамеренного включения аллергенов в мясную продукцию на производстве; − Определен наиболее эффективный метод обнаружения аллергенов в мясной продукции для разработки балльной системы оценивания методов. Практическая значимость выпускной квалификационной работы: выпускная квалификационная работа выполнялась в ФГБНУ «ФНЦ ПИЩЕВЫХ СИСТЕМ им. В.М. Горбатова» РАН и полученные данные могут быть получены для дальнейшего изучения аллергенов в мясной продукции. 56

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Технический регламент Таможенного союза "Пищевая продукция в части ее маркировки " (ТР ТС 022/2011). 2. ГОСТ 31474-2012 Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок. 3. ГОСТ 31719-2012 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный). 4. Беркетова Л.В., Христинина Е.В. Аллергены в продуктах питания/ Беркетова Л.В., Христинина Е.В. // Бюллетень науки и практики. – 2018. – Т.4. - №12. – С.197-207. 5. Контроль аллергенов. [Электронный ресурс]. http://fskntraining.org/sites/default/files/russian/09_Allergens_RUS.pdf URL: (дата обращения 23.04.2021). 6. Крюченко Е.В. Некоторые теоретические и практические аспекты разработки системы управления аллергенами на предприятиях мясоперерабатывающей отрасли/ Е.В. Крюченко., И.М. Чернуха// Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции «Пищевые ингредиенты России 2019». – 2019. – C.52-57. 7. Крюченко Е.В., Замула В.С., Кузлякина Ю.А., Чернуха И.М. Обзор современных методов обнаружения аллергенов в пищевой продукции / Е.В. Крюченко, В.С. Замула, Ю.А. Кузлякина, И.М. Чернуха// Всё о мясе. – 2020. - №5S. – С.169-172. 8. Крюченко Е.В., Кузлякина Ю.А. Белки и аллергены, используемые в мясной промышленности: обзор аспектов технологического применения и безопасности/ Ю.А. исследования и Кузлякина, новые подходы Е.В. к Крюченко// производству Перспективные и переработке сельскохозяйственного сырья и продуктов питания. Сборник научных трудов XIII Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов организаций в сфере сельскохозяйственных наук. – 2019. – С.166-170. 57

9. Крюченко Е.В., Международная Кузлякина практика Ю.А., Замула управления В.С., аллергенами Чернуха в И.М. пищевой промышленности/ Е.В. Крюченко, Ю.А. Кузлякина, В.С. Замула, И.М. Чернуха// Всё о мясе. – 2020. - №6. – С.4-13. 10. Крюченко Е.В., Чернуха И.М., Юрчак З.А., Кузлякина Ю.А. Управление применением белков-аллергенов в мясной промышленности/ Е.В. Крюченко, И.М. Чернуха, З.А. Юрчак, Ю.А. Кузлякина// Контроль качество продукции. – 2019. - №11. – С.14-18. 11. Лисицин А.Б. Пищевая гиперчувствительность и продукты из сырья животного происхождения / А.Б. Лисицин, И.М Чернуха, О.И. Лунина// Теория и практика переработки мяса. – 2017. – № 2. – С. 23-36. 12. Лусс, Л.В. Пищевые аллергены и пищевые добавки: роль в формировании пищевой аллергии и пищевой непереносимости / Л.В. Лусс // Эффективная фармакотерапия. — 2014. — № 33. — С. 12–19. 13.Полунина Т.А. Протеомные методы разделения и анализа белков/ Т.А.Полунина, Ю.С.Варшавская, Г.В.Григорьева, Я.М.Краснов// Журнал микробиологии. – 2014. - №3. – С.107-114. 14.Пчелкина В.А. Гистологические методы выявления растительных белков – аллергенов в мясных продуктах // Всё о мясе – 2016. – №1 (26). – С. 50-52; 15.Устинова А.В. Использование соевых белков в мясных продуктах для детского и функционального питания/ А.В. Устинова,О.В. Зернова, А.П. Попова, В.Н. Щипцов// Пищевая промышленность. – 2011. - №3. – С.18-20. 16. Харитонов В.Д. К вопросу о перспективных направлениях борьбы с аллергией/ В.Г. Будрик, Е.Ю. Агаркова, С.Г. Ботина, К.А. Березкина, А.Г. Кручинин, А.Н. Пономарев, Е.И. Мельникова // Техника и технология пищевых производств. – 2012. – Т.4. – № 27. – С. 3-6. 17. Хвыля С.И. Применение гистологического анализа при исследовании мясного сырья и готовых продуктов / С.И. Хвыля, В.А. Пчелкина, С.С. Бурлакова // Техника и технология пищевых производств. – 2012. – №3 (26). – С. 132-138. 58

18. Хвыля С.И. Стандартизированные гистологические методы оценки мяса и мясных продуктов / С.И. Хвыля, В.А. Пчелкина, С.С. Бурлакова // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – №6. – С. 32-35. 19. Юрчак З.А., Кузнецова О.А., Старчикова Д. Предотвращение и минимизация перекрёстной контаминации продукции пищевыми аллергенами // Всё о мясе. – 2015. – № 5. – С. 19-21. 20. Allergen Bureau (2011) Unexpected Allergens in Food, Version 1 – [Дата обращения: 27.03.2021]. 21. Allergen Bureau (2012) Food Industry Guide to the Voluntary Incidental Trace Allergen Labelling (VITAL) Program, Version 2.0 – [Дата обращения: 27.03.2021]. 22. Allergen Bureau (2016) VITAL Best Practice Labelling Guide: For Australia And New Zealand, UR – [Дата обращения: 27.03.2021]. 23. Allergen Bureau (2017) VITAL – [Дата обращения: 27.03.2021]. 24. Antonio, M. Development of a real-time PCR method for the simultaneous detection of soya and lupin mitochondrial DNA as markers for the presence of allergens in processed food/ M. Antonio, G. Galan, M. Brohée // Food Chemistry. — 2011. — V. 127. — P. 834-841. 25.Baumert, J.L. Lateral flow devices for detecting allergens in food/ J.L. Baumert, D.H. Tran. // Handbook of Food Allergen Detection and Control. — 2015. — P. 219-228. 26. Besler, M. Stability of food allergens and allergenicity of processed foods/ M. Besler, H. Paschke A. // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. —2001. —V.756. -№1. – P. 207–228. 27.Bucchini, L Analysis and critical comparison of food allergen recalls from the European Union, USA, Canada, Hong Kong, Australia and New Zealand / L. Bucchini, A. Guzzon, R. Poms, H. Senyuva // Food Additives & Contaminants: Part A. — 2016. —V. 33. -№ 5. — P. 760–771. 28. Cheng, F. Development and inter-laboratory transfer of a decaplex polymerase chain reaction assay combined with capillary electrophoresis for the 59

simultaneous detection of ten food allergens / F. Cheng, J. Wu, J. Zhang, A. Pan, S. Quan, D. Zhang, H.Y. Kim, X. Li, S. Zhou, L. Yang // Food Chemistry. — 2016. — V.199. — P. 799–808. 29. De la Cruz S, González I., García T., Martín R. Alergias alimentarias: Importancia del control de alérgenos en alimentos // Nutrición clínica y dietética hospitalaria. – 2018. – № 38(1). – P. 142-148. 30. Dzantiev, B.B. Immunochromatographic methods in food analysis / B.B. Dzantiev, N.A. Byzova, A.E. Urusov, A.V. Zherdev // TrAC Trends in Analytical Chemistry. — 2014. — V. 55. — P. 81–93. 31. EFSA (European Food Safety Authority). Scientific opinion on the evaluation of allergenic food ingredients for labelling purposes. The EFSA Journal. — 2014. — P. 1-286. 32. Herwijnen, R.V. The use of lateral flow devices to detect food allergens/ R.V. Herwijnen, S.Baumgartner // Detecting Allergens in Food. — 2006. — P. 175181. 33. Holzhauser, T. Are current analytical methods suitable to verify VITAL® 2.0/3.0 allergen reference doses for EU allergens in foods? / T. Holzhauser, P. Johnson, J.P. Hindley, G. O’Connor, Chun-Han Chan, J. Costa, C. K. Fæste, B.J. Hirst, F. Lambertini, M. Miani, Marie-Claude Robert, M. Roder, S. Ronsmans, S. D. Flanagan// Food and Chemical Toxicology. – 2020. – V.145. – P.111709. 34. Holzhauser, T. Polymerase chain reaction (PCR) methods for detecting allergens in foods/ T. Holzhauser, M. Röder. // Handbook of Food Allergen Detection and Control. — 2015. — V. 145. — P. 245-263. 35. Koeberl, M. Lupine allergen detecting capability and cross-reactivity of related legumes by ELISA / M. Koeberl, M.F. Sharp, R. Tian, S. Buddhadasa, D. Clarke, J. Roberts // Food Chemistry. — 2018. — V. 256. — P. 105–112. 36.Kryuchenko, E.V. Allergenomics and analysis of causes of unintentional incorporation of substances capable of causing IgE‑mediated food allergy into meat products/ E.V Kryuchenko, Y.A. Kuzlyakina, V.S. Zamula, I.M. 60

Chernukha// Theory and practice of meat processing. – 2020. – V.5. - №3. – P.411. 37. Lisitsyn, A. B. Food Hypersensitivity and products of animal origin resources/ A. B Lisitsyn, I. M. Chernukha, O. I. Lunina// Theory and practice of meat processing. – 2017. – V.2. - №2. – C.23-36. 38. Marzano, V. Perusal of food allergens analysis by mass spectrometry-based proteomics / V. Marzano, B. Tilocca, A.G. Fiocchi, P. Vernocchi, S.L. Mortera, A. Urbani, P. Roncada, L. Putignani // Journal of Proteomics. — 2020. — V.215. —P. 103636. 39. Mattarozzi, M. The role of incurred materials in method development and validation to account for food processing effects in food allergen analysis / M. Mattarozzi, M. Careri // Analytical and Bioanalytical Chemistry. —2019. — V. 411. -№ 19. —P. 4465–4480. 40. Monaci L. Mass spectrometry-based proteomics methods for analysis of food allergens/ L. Monaci, A.Visconti// Trends in Analytical Chemistry. – 2009. – V.28. - №5. – P.581-591. 41. Monaci, L. Comprehensive overview and recent advances in proteomics MS based methods for food allergens analysis / L. Monaci, E. De Angelis, N. Montemurro, R. Pilolli // Trends in Analytical Chemistry — 2018. — V.106. — P.21-36. 42. Neethirajan, S. Nano-biosensor platforms for detecting food allergens – New trends / S. Neethirajan, X. Weng, A. Tah, J.O. Cordero, K.V. Ragavan // Sensing and Bio-Sensing Research. — 2018. — V. 18. — P. 13-30. 43. Poms, R.E. Methods for allergen analysis in food: a review / R. E. Poms, C. L. Klein, E. Anklam // Food Additives and Contaminants. — 2004. — V. 21. - №1. — P.1-31. 44. Regulation № 1169/2011 of the European Parliament and the Council of 25 October 2011 on the provision of food the consumers. Official Journal of the European Union, L304/18-L304/63 (2011). 61

45. Regulation №41/2009 of the European Parliament and the Council of 20 January 2009 concerning the composition and labelling of foodstuff suitable for people intolerant to gluten. Official Journal of the European Union, L 16/3 – L 16/5. – 2009. 46. Schubert-Ullrich, P. Commercialized rapid immunoanalytical tests for determination of allergenic food proteins: an overview/ P. Schubert-Ullrich, J. Rudolf, P. Ansari, B. Galler, M. Führer, A. Molinelli, S. Baumgartner// Anal Bioanal Chem. — 2009. — V. 395. — P. 69-81. 47. Segura-Gila, I. Development of sandwich and competitive ELISA formats to determine β-conglycinin: Evaluation of their performance to detect soy in processed food/ I. Segura-Gila A. Blázquez-Soroa, P. Galán-Malob, L. Matab, A.P. Tobajasa, L. Sánchez // Food Control. – 2019. – V. 103. – P. 78–85. 48. Seitz, C.S. Food Allergy in Adults: An Over- or Underrated Problem? / C.S.Seitz, P. Pfeuffer, P. Raith, E.-B. Bröcker, A. Trautmann. // Deutsches Ärzteblatt International. — 2008. — V.105(42). — P. 715–723. 49. Sikora, E., Górna, J. The Practical Aspects of Aller- gen Management in Meat Manufacturing in the United Kingtom // Studia oeconomica posnaniensia. — 2017. —V.5(7). – P.162–176. 50. Soares, S. Quantitative detection of soybean in meat products by a TaqMan realtime PCR assay/ S. Soares, J.S. Amaral, M. Beatriz // Meat Science. — 2014. — V. 98. — P. 41-46. 51. Stella, R. LC-HRMS/MS for the simultaneous determination of four allergens in fish and swine food products / R. Stella, G. Sette, A. Moressa, A. Gallina, A.M. Aloisi, R. Angeletti, G. Biancotto // Food Chemistry. — 2020. — V.331. — P. 127276. 52. Sun, P., Development of monoclonal antibodies and a competitive ELISA detection method for glycinin, an allergen in soybean / P.Sun , P.He, P. Han, J. Wang, S. Qiao, D. Li // Food Chemistry. — 2010. — V. 121. — P. 546-551. 62

53. Sun, L. Simultaneous Analysis of Multiple Allergens in Food Products by LCMS/MS / L. Sun, A. Schreiber, J. Stahl-Zeng, H.F. Li // AOAC INTERNATIONAL. — 2018. — V.101. - №1. — P.132-145. 54. Taylor, S. B. The Allergen Bureau VITAL Program/ S.B. Taylor, G. Christensen, K. Grinter, R. Sherlock, L. Warren// Journal of AOAC International. — 2018. — V. 101. - №1. — P. 77-82. 55. Vasilescu, A. Bioassays and biosensors for food analysis / A. Vasilescu, C. Polonschii, A.M. Titoiu, R. Mishra, S. Peteu, J.-L. Marty // Book Chapter in Commercial Biosensors and Their Applications. — 2020. — P. 217–258. 56. Vlierberghe, K.V. Selection of universal peptide biomarkers for the detection of the allergen hazelnut in food trough a comprehensive, high resolution mass spectrometric (HRMS) based approach / K.V. Vlierberghe, M. Gavage, M. Dieu, P. Renard, T. Arnould, N. Gillard, K. Coudijzer, Marc De Loose, K. Gevaert, C. Van Pouck// Food Chemistry. – 2020. — V. 309. — P.125679. 57. Warren, C. Prevalence, severity, and distribution of adult-onset food allergy / C. Warren, C. Stankey, J. Jiang, J. Blumenstock, B. Smith, R. Gupta // Annals of Allergy, Asthma & Immunology. —2018. —V.121. -№5. 58. Zhang, M. Advanced DNA-based Methods for the Detection of Peanut Allergens in Processed Food / M. Zhang, P. Wu, J. Wu, J. Ping, J. Wu // TrAC Trends in Analytical Chemistry. — 2019. — V.14. — P. 278–292. 59. Zhou, J. Surface plasmon resonance (SPR) biosensors for food allergen detection in food matrices / J. Zhoua, Q. Qia, C. Wanga, Y. Qiana, G. Liub, Y. Wanga, L. Fu // Biosensors and Bioelectronics. —2019. —V.142. – P. 111449. 63

Рецензии:

Авторизуйтесь, чтобы добавить рецензию

- у работы пока нет рецензий -

Отзывы:

Авторизуйтесь, чтобы оставить отзыв

12.28

Нуриманшина Гузель

Вопросы в пищевой промышленности как никогда актуальны, в особенности вопросы, связанные с определением аллергенов. Очень полная и интересная работа